JP3060010B2

JP3060010B2 - 氷核活性細菌およびその使用

Info

Publication number: JP3060010B2
Application number: JP28423098A
Authority: JP
Inventors: 守佐藤; 賢司渡部; 益裕塚田
Original assignee: 農林水産省蚕糸・昆虫農業技術研究所長
Priority date: 1998-10-06
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2000-07-04
Anticipated expiration: 2018-10-06
Also published as: JP2000106868A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、−６℃〜０℃の比
較的高温度領域で氷核機能を有することが可能な氷核活
性細菌、ならびにその使用、特に生体高分子物質からの
該氷核活性細菌を利用したゲル状、多孔質等の形態の物
質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】水溶液は、溶液中に氷結を起こす核があ
ると０℃以下付近の比較的高温度で凍結する。凍結の核
となる氷晶核としては、従来沃化銀（ＡｇＩ）結晶が知
られており、これは−８℃で凍結を開始させる。一方、
氷結の核となる物質を含まない水は、１気圧下において
０℃では凍ることはなく、純粋な微水滴は−３９℃でも
凍結しない程である。

【０００３】ところで、農作物の凍霜害を誘起する有害
な微生物として氷核活性細菌が知られているが、この細
胞の表層には強い氷核があるため水を凍結させてしまう
という性質がある。たとえばエルウィニィア（以下Ｅｒ
ｗｉｎｉａと記述する）属またはシュードモナス（以下
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓと記述する）属由来の細菌のな
かには、氷核活性機能をもつものが知られている（Ｌｉ
ｎｄｏｗ，Ｓ．Ｅ．，ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰ
ｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，21巻，363-384頁，1982
年；佐藤守，遺伝42巻，30-34頁，1988年）。

【０００４】このため、近年、氷核活性細菌のもつ優れ
た氷核活性機能を有効に利活用しようという研究が進め
られつつある。たとえば、特開昭６１−１８７７５６号
公報には、氷核活性細菌を食品に用いて特殊な組織構造
をもつ素材の製造法が開示されている。具体的には、蛋
白質および／または多糖類を主要成分とする水分ゾル、
ゲルまたはペースト状物質に氷核活性細菌を加えて凍結
することで、方向性に優れた繊維状構造を有する食品を
製造するというものである。また、氷核細菌は、凍結に
よる食品の保存にも利用することができ、食品を凍結す
ることで食品中の氷を析出させ食品組織を変えたり、貯
蔵中の食品を安定化させることができる（特開昭６１−
１８７７５６号公報；Ｓ．ＡｒａｉａｎｄＭ．Ｗａｔａ
ｎａｂｅ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，50巻，
169頁，1986年）。たとえば、卵白、分離大豆タンパク
質、豆腐に氷核細菌を混ぜ凍結させて凍結組織化すると
フレーク状の組織が得られる。一方氷核細菌を用いない
とスポンジ状の組織となる。

【０００５】さらに、氷核活性細菌をアルギン酸ナトリ
ウムなどの天然高分子に内包させることで生体に与える
害を少しでも取り除こうとする技術が特開平０１−２６
６１８５号公報に開示されている。この方法では、アル
ギン酸ナトリウム水溶液に氷核活性細菌の懸濁液を加え
て混合し、凝固作用のある溶液中に滴下することで氷核
活性細菌を内包するマイクロカプセルを製造することが
できる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のとおり、氷核活
性細菌の氷核機能を利用した応用例は主に食品分野に限
られているため、今後、食品素材だけでなく工業資材に
まで氷核活性細菌の広い利用技術の開発が望まれてい
る。また、産業上利用可能な氷核活性細菌の菌種が限ら
れており、細菌の機能を広く利活用するためには、氷核
活性細菌が低濃度で十分な氷核活性を示すもので且つ０
℃付近の高温度域で水の凍結（氷結とも言う）を可能に
する氷核活性細菌を探索して、氷核活性細菌の種類を増
やしておく必要がある。

【０００７】このような状況において、本発明の目的
は、低濃度で十分な氷核活性を示すもので且つ０℃付近
の高温度域で氷核機能を有する新規の氷核活性細菌を提
供することである。本発明の別の目的は、そのような氷
核活性細菌を用いて高分子物質を利用性の高い形態に変
換することである。本発明のさらに別の目的は、氷核活
性細菌の氷核活性を増強する方法を提供することであ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、氷核活性
細菌を培養する際に氷核活性を増強する方法、氷核活性
機能をもつ新菌種の同定・分離方法、ならびに氷核活性
細菌を用いた新しい利用法に関して鋭意検討した結果、
クワ等の葉面から分離された優れた氷核活性を有する新
菌種を含む氷核活性細菌が氷点下の極近傍で水を容易に
凍らせてしまうことを見出し、さらに、これらの氷核活
性細菌の懸濁液を生体高分子物質水溶液に加え、これを
減圧下で凍結乾燥することで元の高分子物質と異なる形
態の物質が得られることを見出し、本発明を完成するに
至った。

【０００９】すなわち、本発明は、−６℃〜０℃の温度
域で氷核機能を有することが可能なＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓｓｙｒｉｎｇａｅまたはＥｒｗｉｎｉａａｎａ
ｎａｓから選択される氷核活性細菌を提供する。ここ
で、「可能な」という表現は、本発明の氷核活性細菌が
−６℃〜０℃の温度範囲に限定されずに−６℃より低い
温度であっても氷核機能をもち得ることを意味してい
る。したがって、本細菌を利用する方法においては、凍
結温度は特に限定されないものとする。また、「氷核機
能」とは、水を凍結または氷結させる機能を意味する。

【００１０】本発明の実施態様において、該細菌にはＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅＳＥＩ−１
株、Ｎｉ２３株またはＭｅｉ４０株、あるいはＥｒｗｉ
ｎｉａａｎａｎａｓＴＭ２株またはＭｅｉ７株が含まれ
る。また、該細菌は氷核機能を有する死菌であってもよ
く、この場合、紫外線またはガンマ線照射で菌を死滅さ
せることが好ましい。本発明はまた、高分子物質の水溶
液に上記の氷核活性細菌またはそれと同等の氷核機能を
有する他の氷核活性細菌を加え、高分子物質の水溶液を
一旦凍結させた後、減圧下で凍結乾燥することを含む、
多孔質または粉末状形態をもつ物質の製造方法を提供す
る。

【００１１】本発明はさらに、高分子物質の水溶液に請
求項１〜４のいずれかに記載の氷核活性細菌を加え、必
要に応じて支持体上に適用し、次いで水分を蒸発させる
ことを含む、膜状、粉末状またはブロック状形態をもつ
物質の製造方法を提供する。本明細書中、支持体は、天
然若しくは合成ポリマー（樹脂含む）、金属、木材、紙
などの適する全ての材質から選択可能であり、また目的
に応じて任意の形状のものを使用できるものとする。

【００１２】上記の２つの方法において、高分子物質
は、天然蛋白質、ビニル系重合体、アクリル系重合体、
アミド系重合体、セルロース誘導体などから選択され、
本発明の実施態様において、高分子物質は絹蛋白質（例
えば、絹フィブロイン）またはケラチン（例えば、羊毛
ケラチン）である。すなわち、絹蛋白質またはケラチン
等の生体高分子物質の水溶液に上記の氷核活性細菌を加
え、凍結させた後、減圧下で乾燥することを含む、多孔
質形態の物質の製造方法も本発明に包含される。

【００１３】本発明はさらに、凍結速度制御物質として
の上記の氷核活性細菌の使用を提供する。本発明はま
た、芯物質として上記の氷核活性細菌を内包する高分子
物質よりなる氷核形成物質を提供する。本発明はさら
に、高分子物質（例えば、絹フィブロイン）マトリック
スに上記の氷核活性細菌を含む膜状、多孔質状、ゲル
状、ブロック状または粉末状の物質を提供する。

【００１４】本発明はさらにまた、上記の氷核活性細菌
またはそれと同等の氷核機能を有する他の氷核活性細菌
を含む培地に、糖類またはグリセロールを含ませること
により、氷核活性を増強する方法を提供する。本発明の
実施態様において、糖類はシュークロースまたはガラク
トースである。本発明はまた、有用蛋白質を含む水溶液
に上記の氷核活性細菌を加え、凍結させ、その後解凍す
ることにより有用蛋白質と水分とを分離させ、該蛋白質
を回収することを含む、蛋白質の濃縮・回収方法を提供
する。

【００１５】なお、本明細書中、「氷核活性細菌」と
は、その表層に氷晶核が存在することにより氷核機能を
有する細菌を意味する。また、「それと同等の氷核機能
を有する他の氷核活性細菌」とは、本発明のＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅまたはＥｒｗｉｎｉａ
ａｎａｎａｓ氷核活性細菌と同等の前記氷核機能をも
つ任意の他の属若しくは種からなる氷核活性細菌（公知
の細菌を包含する）を指す。

【００１６】

【発明の実施の形態】クワ葉面から今回新たに分離した
氷核活性細菌としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙ
ｒｉｎｇａｅＮｉ２３株およびＥｒｗｉｎｉａａｎ
ａｎａｓＴＭ２株、また昆虫のクワノメイガ体内から
分離したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ
Ｍｅｉ４０株およびＥｒｗｉｎｉａａｎａｎａｓＭ
ｅｉ７株、セイタカアワダチソウの新病原細菌Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅＳＥＩ−１株が例
示できる。なお、これらの菌株はいずれも植物に対して
病原性を有する細菌であるため、通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所（茨城県、つくば市）への寄託
は受け入れらず、その代わり自己寄託が認められた。

【００１７】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａ
ｅには、約５０の亜種に相当する病原型（ｐａｔｈｏｖ
ａｒ）がある。病原型は、植物に対する寄生性の差異で
分けることができる。例えばクワに病原性のあるものは
ｐｖ．ｍｏｒｉ，タバコの病原細菌はｐｖ．ｔａｂ
ａｃｉという具合である。このうち特定の病原型（例え
ばｐｖ．ｍｏｒｉ）が氷核活性機能を持つことが知ら
れている。

【００１８】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａ
ｅについては、基本的な菌学的性質のほか、５つの主要
性質で同定するＬＯＰＡＴ法（Ｌｅｌｌｉｏｔｔら，
Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔ．，29巻，470-489頁，1966
年）、Ｅｒｗｉｎｉａａｎａｎａｓについては、腸内
細菌同定キットＡＰＩ２０Ｅ（フランス国、ＢｉｏＭｅ
ｒｉｅｕｘ社製）および主要糖類分解能検定（Ｄｙｅ，
Ｄ．Ｗ．（１９８３）：Ｅｒｗｉｎｉａ：Ｔｈｅ“Ａｍ
ｙｌｏｖｏｒａ" ａｎｄ“Ｈｅｒｂｉｃｏｌａ" ｇｒｏ
ｕｐｓ．ＰｌａｎｔＢａｃｔｅｒｉａｌＤｉｓｅａｓｅ
ｓ（Ｆａｈｙ，Ｐ．Ｃ．ａｎｄＰｅｒｓｌｅｙ，Ｇ．
Ｊ．Ｅｄ．）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，67-86頁）
等により同定が可能である。

【００１９】セイタカアワダチソウから分離した新規細
菌ＳＥＩ−１株はグラム陰性菌であり、極べん毛をもつ
桿菌で運動性のあるのが特徴である。キングＢ培地（栄
研化学製、商品名）で黄緑色蛍光色素を産生するのでＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に所属することが容易に確かめ
られる。さらに、植物病原細菌の簡易同定ＬＯＰＡＴ法
では、レバン産生（−），オキシダーゼ活性（−），ジ
ャガイモ塊茎腐敗（−），アルギニン加水分解（−），
タバコ過敏反応（＋）を示し、ＬＯＰＡＴ；Ｉｂ群に属
する。ここで、例えばレバン産生（−）とはレバン活性
をもたないことを意味する。従って、本菌株は、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅと同定される。本
菌株は、セイタカアワダチソウに病原性を有する。同植
物に病原性を示すＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎ
ｇａｅはこれまで全く発見されていなかったため、新し
い病原型と見なすことができる。菌学的性質のうち、特
徴的な性質は、本菌株がＬＯＰＡＴ法に対する極めて特
異的反応を示す点である。なお、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓｓｙｒｉｎｇａｅの５０近くの病原型間では細菌学的
性質では区別できないが特定の植物に対する病原性の有
無のみで区別できるという点を特記するに値する。該細
菌はこれまで未報告のセイタカアワダチソウに対して病
原性をもつという特徴を有する。

【００２０】新規細菌ＳＥＩ−１株は、過冷却点（ＳＣ
Ｐ（Ｓｕｐｅｒｃｏｏｌｉｎｇｐｏｉｎｔ），氷核開
始温度）は−１．８℃であり、従来の氷核活性細菌の中
にあって氷核活性が最も優れていることが判明した。こ
うした優れた氷核活性細菌の氷核活性は、培地および培
養温度などの特定の培養条件下で細菌を培養するときに
は、特異的に増強できる。すなわち、最適な培養条件で
培養した氷核活性細菌の氷核活性は、通常の培地で培養
したときの１０倍以上も増強できる。ＳＥＩ−１株で
は、凍結可能最低濃度は１０³／ｍｌという低濃度であ
っても優れた氷核活性を発現する。氷核活性細菌の活性
を増強するのに好都合の培地としては、ペプトン２０
ｇ，Ｋ７２ＨＰＯ７４１．５ｇ，ＭｇＳＯ７４・７Ｈ７
２Ｏ１．５ｇ，グリセリン１０ｇ，寒天１５ｇ，蒸留水
１Ｌの混合組成物から構成するキングＢ培地が好ましく
用いられる。また、シュークロース添加ＬＢ培地（ペプ
トン１０ｇ，酵母エキス５ｇ，食塩１０ｇ，寒天１５
ｇ，シュークロース５０ｇ，蒸留水１Ｌ）も同様に氷核
活性を増強するのに好都合の培地である。氷核活性を増
強するには培養温度も重要であり、培養温度として好ま
しくは１８〜２２℃である。培養温度が低いと目的とす
る細菌量を得るのに長時間を要するという問題点があ
り、また高すぎると細菌表層の氷核活性蛋白が変性し氷
核能力が低下する。なお、このような氷核活性を増強す
るための条件は、本発明の氷核活性細菌のいずれにも適
用可能である。

【００２１】また、本発明の他の特定の氷核活性細菌で
あるＰｓｅｕｓｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅＮｉ
２３株、ＥｒｗｉｎｉａａｎａｎａｓＴＭ２株、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅＭｅｉ４０
株およびＥｒｗｉｎｉａａｎａｎａｓＭｅｉ７株の
特徴的な菌学的性質は以下のとおりである。Ｐｓｅｕｓ
ｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅＮｉ２３株は、グラ
ム陰性細菌で、極鞭毛を有する桿菌で運動性がある。キ
ングＢ培地で黄緑色蛍光色素を産生する。また、レバン
産生（−）、オキシダーゼ活性（−）、ジャガイモ塊茎
腐敗（−）、アルギニン加水分解（−）、タバコ過敏感
反応（＋）の特性を有する。

【００２２】ＥｒｗｉｎｉａａｎａｎａｓＴＭ２株
は、グラム陰性細菌で、周毛を有する桿菌で運動性があ
る。多くの増殖用培地で黄色の集落を形成する。内生胞
子、気中菌糸を形成しない。硝酸塩を還元しない。イノ
シトール、ラフィノース、セルビオース、メリビオー
ス、グリセロールを利用する。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｙｒｉｎｇａｅＭｅｉ４０株は、グラム陰性細菌
で、極鞭毛を有する桿菌で運動性がある。キングＢ培地
で黄緑色蛍光色素を産生する。また、レバン産生
（−）、オキシダーゼ活性（−）、ジャガイモ塊茎腐敗
（−）、アルギニン加水分解（−）、タバコ過敏感反応
（＋）の特性を有する。

【００２３】ＥｒｗｉｎｉａａｎａｎａｓＭｅｉ７
株は、グラム陰性細菌で、周毛を有する桿菌で運動性が
ある。多くの増殖用培地で黄色の集落を形成する。キン
グＢ培地で黄緑色蛍光色素を産生しない。好気的、嫌気
的生育をする。内生胞子、気中菌糸を形成しない。硝酸
塩を還元しない。イノシトール、ラフィノース、セルビ
オース、メリビオース、グリセロールを利用する。

【００２４】本発明においては、水溶性高分子物質と氷
核活性細菌を水媒体中で混合し、これを一旦凍結させる
ことでハイドロゲル状物質、多孔質体等の種々の形態と
することができる。すなわち、水溶性高分子物質と氷核
活性細菌とからなる混合液を氷核活性細菌の氷結温度付
近で凍結させることでゲル化させたり、あるいは、凍結
させた後、これを真空下で乾燥（すなわち、凍結乾燥）
したり、あるいは、該混合液から水分を蒸発させること
で、膜状、多孔質、ブロック状、粉末状、ゲル状等のよ
うな種々の形態を有する高分子物質を得ることができ
る。凍結は本細菌が氷核機能を発揮できるいずれの温度
であってもよく、言うまでもなく、本細菌の特徴により
−６℃〜０℃の温度範囲であっても凍結が可能である。
蒸発は自然乾燥、加熱、減圧等のいずれの手段でも行な
い得る。上記の種々の形態とする際に、水溶性高分子物
質の濃度が高いときには多孔質体又はブロック状、ある
いは高分子物質の濃度が低いときには粉末状となる。ま
た、高分子物質の水溶液を支持体の上に広げ室温付近で
静かに蒸発すると膜状物質になる。さらに、高分子物質
と氷核活性細菌の水媒体中の混合液に有機酸（例えば、
酢酸）等の酸を加えて酸性化することにより凝固させる
とゲル状物質が得られる。

【００２５】本発明で用いられる水溶性高分子物質とし
ては、従来公知のものはいずれも使用できる。例えば、
カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロ
ース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロー
ス、ポリビニルアルコールおよびその変性物またはその
誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリエチレオキサイ
ド、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸またはその
塩、ポリ酢酸ビニル等、ならびに絹蛋白質（絹セリシ
ン、絹フィブロイン）、ケラチン蛋白質等が挙げられ、
好ましくは、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミ
ド、ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリ酢酸
ビニル、絹蛋白質、およびケラチン蛋白質、さらに好ま
しくは、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、
ポリアクリル酸、絹フィブロイン、およびケラチン蛋白
質が挙げられる。これらの水溶性高分子物質は単独で用
いてもまたは組み合わせて用いてもよい。なお、天然蛋
白質の羊毛ケラチン、絹フィブロイン等は、下記に述べ
るように、水溶性高分子物質として特に好ましい。

【００２６】絹蛋白質繊維から絹フィブロイン水溶液を
調製するための原料としては、家蚕または野蚕由来の絹
糸が用いられる。組成の均一な抗菌性ブレンド塊状物を
製造するには家蚕由来の蛋白質が好ましい。例えば、家
蚕生糸を炭酸ナトリウム等のアルカリ水溶液で煮沸し、
絹糸表面にある膠状の接着物質セリシンを除去して調製
できる絹フィブロイン繊維を中性塩で溶解し、セルロー
ス製の透析膜で十分に透析することにより純粋な絹フィ
ブロイン水溶液を調製できる。このとき、絹フィブロイ
ン繊維を溶解するには、塩化カルシウム、硝酸カルシウ
ム、臭化リチウムなど一般的に知られた中性塩が利用で
きる。絹糸の溶解性を高め、未変性状態に近い高分子状
態の絹フィブロインを製造するためには、溶解性の高い
リチウムイオンを含む中性塩が望ましく、臭化リチウム
などが特に好ましく用いられる。

【００２７】天然生体高分子物質である絹フィブロイン
は、手術用縫合絹糸の例からも明らかなように、生体内
に埋め込んでも抗原抗体反応に基くアレルギー反応の起
こり方が軽微である点において生体組織との生体適合性
が良いため、本発明で得られる高分子物質の多孔質、膜
状、ブロック状、ゲル状物は優れた生体適合性を持ち、
このブレンド塊状物は体内埋め込み用材料として利用す
ることができるだろう。また、絹フィブロイン水溶液と
氷核活性細菌を組合わせて用いることによって、該細菌
を含む絹フィブロイン膜、粉末、ゲルおよび多孔質体を
調製することができる。

【００２８】本発明は絹フィブロイン等の高分子物質マ
トリックスに氷核活性細菌を含む膜状、ゲル状、ブロッ
ク状または粉末状の物質も提供する。この場合、高分子
物質マトリックスに生菌若しくは死菌の氷核活性細菌が
物理的または化学的な結合を介して混入する形で含まれ
ることが可能である。このような物質は、例えば以下の
ようにして調製することができる。氷核活性細菌の懸濁
液を含んだ高分子物質溶液を所定の支持体表面にスプレ
ーし、乾燥固化することにより氷核活性細菌を含んだ高
分子膜を形成することができる。また、支持体表面上に
水溶性高分子物質と氷核活性細菌とからなる混合懸濁水
を広げ、水分を蒸発させ、乾燥固化させると氷核活性細
菌を含んだ皮膜状の高分子塊状物を形成することができ
る。さらに、氷核活性細菌と高濃度の高分子物質を含む
混合懸濁液を用いれば抗菌性を持つ厚い板状若しくはブ
ロック状のブレンド塊状物を製造できる。このように成
型性のよいのが本発明の特徴である。

【００２９】また、本発明においては、氷核活性細菌を
芯物質として高分子物質に内包した氷核形成物質も包含
する。高分子物質としては、ポリアクリルアミド、アル
ギン酸ナトリウムなどが挙げられる。このような内包体
または固定化物は例えば通常の微生物固定化法、例えば
福井三郎ら共著、酵素工学（1984年）東京化学同人に記
載の方法によって製造しうる。

【００３０】本発明の氷核活性細菌は凍結速度制御物質
として使用することも可能である。凍結により食品を保
存する際には、食品の組織が変わることがあるが、この
とき氷の結晶の大きさや分布、氷の結晶の量が問題とな
る。氷晶の大きさは凍結の速度により大きく影響を受け
る。本発明の氷核活性細菌はそのような凍結速度を制御
するのに有効に使用することができる。凍結の速度が緩
慢であると氷は大きく成長する。

【００３１】本発明の方法および使用には、本発明で同
定した新菌種の氷核活性細菌はもとより、同様の効果が
得られるならば他の属または種の細菌、例えば、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍａｎａｓ属に属するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｓ，Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ，Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｆ
ｌａｖａなど、Ｅｒｗｉｎｉａ属に属するＥ．ｈｅｒｂ
ｉｃｏｌａ，Ｅ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ，Ｅ．ｕｒｅｄｏ
ｖｏｒａ，Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に属するＸ．ｃａ
ｍｐｅｓｔｒｉｓなども利用できる。本発明のＳＥＩ−
１のようにシュードモナス属の新菌種の氷核活性細菌
は、水溶性高分子物質の極めて低濃度の領域において
も、優れた氷結機能を示すため、高分子物質水溶液を効
率的に凍結させる能力を有する。

【００３２】本発明で使用できる氷核活性細菌は、加熱
やアルコール添加により変性し氷結能力を失ったもので
なければ、滅菌しても氷核細菌の氷核形成能力は保持で
きる。また、一旦低温度で凍結した細菌を解凍させ室温
に戻しても氷結能力は保持している。氷核活性細菌を食
品業界で利用するには無毒化した物を使用することが好
ましいが、このときガンマー線、紫外線などのエネルギ
ー線を照射して氷核細菌を死滅させても、氷核活性が消
滅することはない。

【００３３】氷核能力を増強した活性細菌を培養するに
は、従来の培地中に２％〜１０％、たとえば５％程度の
糖類またはグリセロールを加えるとよい。糖類の添加量
が２％未満であると、培養できる氷核活性細菌の氷核活
性の増強は現れないし、糖類を高濃度（１０％超）添加
するとかえって細菌の増殖を阻害するという問題があ
る。糖類としては、シュークロース、グリセロール、グ
ルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトースが
例示できる。これらの物質は、糖類の添加が細胞膜上の
氷核蛋白の形成量を増加させるものと考えられる。培養
温度は１８〜２６℃が望ましく、２０〜２３℃が特に好
ましい。培養温度が低いと短時間で目的とする量の細菌
を得ることが難しく、高すぎると氷核蛋白の構造が変化
し、安定的な氷核能力の発現ができなくなる欠点が生ず
る。

【００３４】本発明で使用する凍結機能を持つ氷核形成
能力を考える上で、氷核活性を発現させる有効な氷核活
性細菌濃度がある。通常の条件下で氷核活性を示す氷核
細菌濃度は氷核細菌種によっても異なるが、一般には１
０⁴〜１０⁵／ｍＬ以上、好ましくは１０⁶／ｍＬ以上で
ある。１０⁴／ｍＬ以下の時は、優れた氷核細菌を用い
ても氷結機能が発揮できないが、上記の糖類、多糖類ま
たはグリセロールを添加することにより１０³／ｍＬの
濃度であっても氷核活性が得られることがある。１０⁸
／ｍＬを超えても氷核活性が得られるが、より高濃度に
なるほど取り扱いが不便となり、また効率的でない欠点
が生じる。

【００３５】本発明の氷核活性細菌はまた、有用蛋白質
の濃縮・回収に使用することができる。具体的には、有
用蛋白質と氷核活性細菌の水媒体中の混合液を氷晶核形
成温度付近で凍結させ、その後、温度を高めて解凍する
ことにより蛋白質と水分を分離し、これにより有用蛋白
質を濃縮することができる（例えば、後記の実施例15参
照）。また、食品工場からは、動物性蛋白質などの資源
が廃水に混じって廃棄されている。この中に含まれる有
用蛋白質を含んだ産業廃水から有用蛋白質を回収するに
は本発明の氷核活性細菌が用いることができる。すなわ
ち、蛋白質を多量に含んだ産業廃水に石炭や高分子凝集
剤などの脱水助剤を加えて、遠心脱水する。次に氷核活
性細菌を加え、例えば−６〜０℃の温度で氷結させる。
これを常温に戻すと固形物と汚泥に含まれていた水分と
が分離するため含水率の少ないケーキが得られる。通
常、生活廃水からケーキ状固形物を得る過程では熱エネ
ルギーを消費するが、氷核活性細菌を用いることで汚泥
の水分除去が効率的に行えるのでエネルギーの大幅減少
に役立つ。

【００３６】

【実施例】次に本発明を実施例および比較例により更に
詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるも
のではない。＜実施例１＞クワおよびクワノメイガからの氷核活性
細菌の分離クワ植物の葉または昆虫クワノメイガを乳鉢に入れ、適
当量の殺菌水を加え十分に摩砕し、それを希釈平板法に
より、ＬＢ培地を用いて２８℃で培養する。３日間培養
して得られる単一のコロニーを、更に純粋培養して分離
菌株とする。これらの菌株の氷核活性の有無は次の方法
で検定する。すなわち、菌株をＬＢ平板培地法で２２℃
で１〜２日間培養して、菌体を殺菌水に１０⁸／ｍＬ程
度に懸濁して、供試液とする。その約１ｍＬを栄研製の
試験管（減菌Ｆスピッツ、１０ｍＬ容）に取り、−５℃
の不凍液中に３０分程度浸漬して、細菌懸濁液の凍結の
有無により氷核活性の有無を目視で判定する。氷核活性
を示した菌株は、スキムミルク培地（スキムミルク１０
ｇ，グルタミン酸ソーダ１．５ｇ，１００ｍＬ）
に混ぜ、−３０℃で保存する。再度使用する時は、それ
を溶解してＬＢ培地で培養する。

【００３７】上記の方法により、クワ葉面から分離され
た氷核活性細菌をＰｓｅｕｓｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎ
ｇａｅＮｉ２３、ＥｒｗｉｎｉａａｎａｎａｓＴ
Ｍ２と命名し、またクワノメイガ体内から分離された氷
核活性細菌をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａ
ｅＭｅｉ４０、ＥｒｗｉｎｉａａｎａｎａｓＭｅ
ｉ７と命名した。

【００３８】＜実施例２＞セイダカアワダチソウから
の氷核活性細菌の分離セイダカワダチソウから氷核活性細菌を次の方法で分離
した。１９９８年５月、茨城県つくば市の農道に繁茂す
るセイダカアワダチソウの葉身に細菌病と判定できる黒
褐色の病斑を見付けた。同植物の細菌病の発生の記載は
全くなく新菌種の可能性があるため、細菌を分離するこ
とにした。分離細菌は、健全なセイダカアワダチソウに
有傷、無傷接種法のいずれでも、明瞭な病原性を示し新
病原細菌であることが確定した。

【００３９】分離細菌は、グラム陰性であり、極べん毛
を持つ桿菌で運動性を示す。キングＢ培地（栄研化学
製）で黄緑色蛍光色素が産生するので、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ属に属することが確認できた。更に、植物病原
細菌の簡易同定ＬＯＰＡＴ法では、レバン産生（−），
オキシダーゼ活性（−），ジャガイモ塊茎腐敗（−），
アルギニン加水分解（−），タバコ過敏感反応（＋）を
示し、ＬＯＰＡＴ；Ｉｂ群に属するものと断定できるた
め、本菌株は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇ
ａｅと同定された。本菌株は、セイタカアワダチソウに
病原性を有する。同植物に病原性を示すＰｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅは全く知られていないた
め、新病原型すなわち新菌種であると同定しＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅＳＥＩ−１と命名した。

【００４０】＜実施例３＞新規氷核活性細菌の氷核活
性本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａ
ｅＳＥＩ−１、Ｎｉ２３、およびＭｅｉ４０株、Ｅｒｗ
ｉｎｉａａｎａｎａｓＴＭ２およびＭｅｉ７株と、公知
の非氷核活性細菌との氷核活性を比較した。１０⁸／ｍ
Ｌ程度の細菌懸濁液における過冷却温度（氷核活性開始
温度）および、−５℃〜−６℃における氷核形成最小濃
度の２つの要因について評価することにした。すなわ
ち、過冷却温度が高いほど、また、氷核形成最小濃度が
低いほど、氷核能力が高いと判定できる。前者は、試作
装置としてデザインした過冷却温度測定器により測定し
た。サンプル量２０μｌ，冷却速度、１℃／分の条件下
であった。後者は測定しようとする細菌懸濁液を通常１
０倍段階希釈により、段階的な細菌濃度検定液を１ｍＬ
の量で試験管内に作製する。これを上述の温度により３
０分程度空冷あるいは不凍液中に保ち、どの濃度の懸濁
液まで氷結したかを調査する。ここにおいて、または後
記において、空冷による方法とは、一定の温度（−６℃
〜０℃）の恒温度室内に氷核活性細菌の入った試験管を
置いて30分後に試料の氷核形成状態を調べる方法を意味
する。また、不凍液中での方法とはエチレングリコール
を冷媒として一定温度に保冷した冷媒中に氷核活性細菌
の入った試験管を入れて経時変化を調べる方法を意味す
る。同時に各希釈液中の細菌数（生菌数）を調べる。細
菌濃度は、１ｍＬ当たりの生菌数で表示する。各種氷核
活性細菌の氷核能力を氷核形成温度（過冷却点）と氷核
形成最小濃度（ＣＦＵ／ｍＬ）の特性を調べた。結果を
表１にまとめた。

【００４１】

【表１】

【００４２】表から明らかなように、本発明で用いた５
菌株はいずれも強い氷核活性を示した。とりわけ新菌種
ＳＥＩ−１株は氷核形成温度−１．８℃、氷核を誘導す
るための最小濃度１０⁴／ｍＬと最も優れた氷核能力を
示し、かつ安定していた。一方、Ｎｉ２３，Ｍｅｉ４
０，ＴＭ２は最小濃度が１０⁴〜１０⁶／ｍＬとなり、Ｓ
ＥＩ−１株よりは氷核活性が幾分低い。

【００４３】＜実施例４＞氷核形成能力を増強する方
法シュークロース（ＳＵＣ）、ガラクトース（ＧＡＬ）、
グリセロール（ＧＬＹ）をそれぞれ５ｗｔ％含有する従
来公知のＬＢ培地あるいはグリセロール液（１％）を含
むキングＢ培地（ＫｉｎｇＢと略記）で培養したときの
各種氷核活性細菌の氷核活性能力の変化を評価した。供
試菌株は、ＳＥＩ−１株を用いた。各種氷核活性細菌の
懸濁液の水溶液を−６℃で凍結させ、氷結状態を目視で
評価した。なお、氷核形成能力の増強因子を加えない対
照区をＬＢ区とした。結果を表２に示す。

【００４４】

【表２】

【００４５】培地中にシュークロース、グリセロール、
ガラクトースを含有させることで氷核活性細菌の氷核活
性を１０倍以上増強させることができるため、シューク
ロース、グリセロール、ガラクトースが氷核活性を増強
する因子であることが明らかとなった。

【００４６】＜実施例５＞絹フィブロイン水溶液の温度
と空冷処理時の経過時間０．４％絹フィブロイン水溶液０．６ｍｌを１ｍｌの試
験管に入れ、これを−６℃に調節した恒温室に放置す
る。放置直後から、経時的に試料水溶液の温度を（株）
カスタム製デジタルサーモメーター（ＣＴ−１２００）
により測定した。なお用いたセンサプローブはＬＫ−７
００型式のものであった。また氷核活性細菌Ｎｉ２３を
１０⁷／ｍｌ加えた絹フィブロイン水溶液の温度変化も
併せて検討した。得られた結果を図１に示す。

【００４７】Ｎｉ２３懸濁液を含まない絹フィブロイン
水溶液の温度は、放置後、経過時間４〜５分まではＮｉ
２３含有の絹フィブロイン水溶液温度の変化と同様、経
過時間につれて低下するが、５分以降は、Ｎｉ２３を含
有する試料水溶液の温度低下の割合よりもやや増加し−
６℃に収斂する。しかし、Ｎｉ２３懸濁液を含む絹フィ
ブロイン水溶液の温度は、次第に低下割合が緩慢とな
り、経過時間２０分で−３℃に達してから突然０．５℃
に跳ね上がった。氷核活性細菌の有無が絹フィブロイン
液の温度の変化にも現れていることが確かめられた。こ
れは、氷結が−３℃で起こったことを示している。

【００４８】＜実施例６＞氷核活性細菌の絹フィブロ
インおよびポリビニルアルコールの凍結誘導能力エッペンドルフ社製チューブ（１．５ｍＬ容）に４５μ
Ｌの絹フィブロイン（ＳＦ）またはポリビニルアルコー
ル（ＰＶＡ）水溶液を入れ、それに５μＬの各濃度の細
菌懸濁液を加え、空冷法（−６℃）で氷結の有無を調べ
た。結果を表３に示す。

【００４９】

【表３】

【００５０】ＳＥＩ−１株、Ｎｉ２３株で濃度別に詳細
に調べた結果、ＳＦ水溶液中１０⁶／ｍＬの最低細菌濃
度まで、ＰＶＡ水溶液中では１０⁵／ｍＬの最低細菌濃
度まで凍結した。それ以外の菌株でも同様にＳＦ、ＰＶ
Ａ水溶液を凍結誘導した。なお、細菌懸濁液を含まない
ＳＦ、ＰＶＡ水溶液は全く凍結しなかった。

【００５１】＜実施例７＞氷核活性細菌の殺菌と活性
の維持紫外線ランプ（松下電工（株）、ＧＬ−１５）による照
射を用い、ランプより３０ｃｍ下方の距離に、１０⁹／
ｍＬの細菌懸濁液１ｍｌを入れた直径９ｃｍのプラスチ
ック製シャーレを置き１５分間照射した。熱処理につい
ては、トミー製オートクレーブＳＦ−２４０型を用い細
菌を殺菌した。なお、気圧は２気圧、１２０℃で２０分
の熱処理条件下であった。２種類の殺菌処理後、氷核形
成細菌（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅＮｉ２３，Ｅ．
ａｎａｎａｓＭｅｉ７）の生存と氷核活性の有無を調
べた。結果を表４に示す。

【００５２】

【表４】

【００５３】氷核活性細菌は紫外線照射処理のみで完全
に殺菌できるが氷核活性機能は消滅しない。しかし、熱
処理で殺菌すると細菌は死滅し、氷核活性機能は完全に
消滅する。ＵＶ照射処理により、氷核活性を保持したま
ま氷核活性細菌を死滅させることができる。ＵＶ照射に
代えて、ガンマ線照射の場合にも、氷核活性機能を維持
したまま細菌を死滅させることができる。

【００５４】＜実施例８＞培養温度と氷核活性の有無氷核活性細菌（Ｎｉ２７）を各種の温度で培養した際の
氷核活性を変化を調べた。得られた結果を表５に示す。
ただし、氷核活性の評価は目視により次の三段階で評価
した。

【００５５】

【表５】

【００５６】但し、Ｘは、一旦３０℃で培養し氷核活性
が消滅した細菌を２３℃に戻した実験区を意味する。培
養温度が２３℃では安定に氷核活性が発現するが、２６
℃を超えると不安定な結果となる。

【００５７】＜実施例９＞氷核活性細菌の氷結濃度（１）２ｇの絹フィブロイン（ＳＦ）繊維を６０℃の
８Ｍ臭化リチウム水溶液５ｍｌに溶解し、セルロース系
の透析膜中で純水と５日間置換しながら透析することで
０．５％絹フィブロイン水溶液を調製した。（２）和光純薬工業製のポリビニルアルコール（ＰＶ
Ａ）（カタログ番号１６７−０３０６５、ＬｏｔＮ
ｏ、ＴＪ０９６４）２．１ｇを４０ｍＬの水に入れ、湯
せん鍋に入れて時間をかけて濃度０．５ｗｔ％の均一な
ＰＶＡ水溶液を調製する。

【００５８】（３）次に、絹フィブロイン水溶液１部
とＰＶＡ水溶液１部とを当量宛混合して混合水溶液を調
製した。これら３種類の水溶液に濃度の異なる氷核活性
細菌水溶液を加え、富士医科社製の氷核活性検定装置を
用い，ナイブライン（日曹丸善ケミカル社製）を不凍液
にして、−５℃で各サンプルの凍結状態を調べ、Ｎｉ２
３の懸濁液の濃度と氷核能力との関係を調べた。使用し
た氷核活性細菌，Ｎｉ２３は、２２℃４８時間ＬＢ培養
し、殺菌水で希釈したものである。

【００５９】０．５ｍＬ用のエッペンドルフチューブに
２０μｌのＳＦ，ＰＶＡ，ＳＦ／ＰＶＡの各サンプル水
溶液に２μＬの氷核活性細菌液（１０⁹〜１０⁷／ｍｌ）
を加え良く混ぜ、それを不凍液（−５℃）に３０分ある
いは１時間浸漬し、氷結の有無から氷核活性細菌による
氷結濃度を調べた。氷晶核形成の実験をした後、２０℃
の室温に各サンプルをもどして同温度で１２時間放置し
サンプルの形状を調べた。最後に氷晶核形成微生物の生
存の有無を確かめるために再度−５℃にもどしてサンプ
ル性状を評価した。得られた結果を表６に示す。

【００６０】

【表６】

【００６１】＜実施例１０＞ −１５℃での氷核活性細
菌の氷核活性５ｗｔ％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液に
異なる濃度の氷核活性細菌、Ｎｉ２３株の懸濁液を入れ
−１５℃で氷結能力の有無を評価した。結果を表７に示
す。

【００６２】

【表７】

【００６３】−１５℃処理では、−５℃処理（表６）と
は異なる反応を示した。ＰＶＡのみでも３０分処理で凍
結したが、氷核活性細菌処理区では、10分間で凍結が誘
導された。また、一端融解後の反応は極めて特異的であ
った。

【００６４】＜実施例１１＞高分子物質の調製条件４％絹フィブロイン水溶液１部と４％ＰＶＡ水溶液１部
とからなる等量混合水溶液に氷核活性細胞懸濁液を入れ
て−５℃と−１５℃とで氷結させた。サンプルの調製条
件を表８にまとめた。なお用いた氷核活性細菌はＮｉ２
３であり、懸濁液濃度は１０⁸／ｍｌであった。

【００６５】

【表８】

【００６６】表８に示した一部のサンプルを用いて次の
方法で多孔質体を調製した。凍結状態にあるサンプルを
凍結状態のまま、減圧雰囲気下で乾燥させ水分を除去す
ることでスポンジ状で葉が積み重なったような積層構造
の多孔質体が製造できた。多孔質体の形状、物性、断面
形態を調べた。得られた結果を表９に示す。

【００６７】

【表９】

【００６８】＜実施例１２＞絹フィブロイン膜およびゲ
ルの調製柞蚕絹糸の表面にはタンニンが付着し、蛋白質を強く不
溶化させているので、これを除去するには、柞蚕繭糸を
繭糸重量に対して５０倍量の０．１％過酸化ナトリウム
水溶液に浸漬し、９８℃で１時間処理してセリシンを予
め除去しておく必要がある。セリシンを除去した柞蚕絹
フィブロイン繊維をチオシアン酸リチウム等の溶解性の
高い中性塩で溶解し、さらにセルロース製透析膜に入れ
て純水で透析することで柞蚕絹フィブロイン水溶液が調
製できる。これをビーカーに入れ送風乾燥することで濃
度０．５ｗｔ％の柞蚕絹フィブロイン水溶液を調製し
た。３ｍＬの柞蚕絹フィブロイン水溶液にＮｉ２３を１
０⁷／ｍＬ加え、ガラス棒で静かに攪拌し、これをポリ
エチレン膜上に広げ１２時間かけて水溶液を蒸発乾燥固
化させてＮｉ２３氷核活性細菌を含む厚さ３０μｍの柞
蚕絹フィブロイン膜を調製した。この柞蚕フィブロン膜
は氷核活性を持つことが確認できた。

【００６９】上記の方法で調製しＮｉ２３細菌懸濁液を
含む柞蚕絹フィブロイン水溶液をセルロースチューブに
入れ，酢酸水溶液でｐＨ３．０に調整した水溶液でｐＨ
を調整することで酢酸絹フィブロインをゲル化させるこ
とで、Ｎｉ２３を含む柞蚕絹フィブロインゲルを調製し
た。

【００７０】＜実施例１３＞氷核活性細菌を含む羊毛ケ
ラチンの調製氷核活性細菌を含む羊毛ケラチンを次のようにして調製
した。羊毛繊維を溶解するには、まず、分子間のＣｙｓ
結合を窒素雰囲気下、メルカプトエタノールまたはチオ
グリコール酸等の還元剤を用いて切断し、ケラチン分子
を還元して可溶化する必要がある。メルカプトエタノー
ルを用いる場合には、尿素溶液中で還元処理を行うとよ
い。尿素の濃度は一般に７．５〜８．８Ｍ、好ましくは
７．８〜８Ｍである。チオグリコール酸を用いる場合に
は、１〜４％のＮａＣｌを添加するとよい。

【００７１】還元剤として、例えば、メルカプトエタノ
ールを用いる場合、羊毛繊維を上記濃度の尿素水溶液に
浸漬し、脱気後、窒素雰囲気下、４５℃以下、望ましく
は２０〜２５℃の温度で、メルカプトエタノールを１０
ｇの羊毛繊維に対し３〜５ｍｌ加え、さらに約３時間攪
拌する。こうしてケラチン分子が還元されて、分子間の
ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）が還元され、ＳＨ
となったケラテインが得られる。純水を用いて透析し、
尿素、過剰のメルカプトエタノールを除去するとケラチ
ン水溶液が得られる。これは、本発明における水溶性高
分子として利用できる。このようにして還元したＳＨ基
を有するケラテインをさらにアルキル化剤、例えば（置
換）アルキルハライドと反応させてＳ−（置換）アルキ
ルケラテインとしても使用することができる。アルキル
化は公知の方法に従って行えばよい。一例としてアルキ
ル化剤としてヨード酢酸を用いた場合について説明す
る。上記の還元ケラテインは、窒素雰囲気下、２０〜２
５℃の温度で、攪拌しながら、１０ｇの羊毛繊維に対し
て１０〜１７ｇのヨード酢酸（分子量１８５．９５）を
加え、反応させる。１〜２時間後、ｐＨを８．５に調整
し、純水を用いて透析することによって過剰のヨード酢
酸を除いてＳ−カルボキシメチルケラテイン水溶液を得
る。この水溶液が、本発明における水溶性高分子物質と
して使用される。

【００７２】こうして得られたＳ−カルボキシメチルケ
ラテイン水溶液濃度を０．５％に調整し、これを１ｍｌ
の試験管に入れ、更にＮｉ２３株の細菌懸濁液を１０⁷
／ｍｌ加え、−５℃の不凍液中に30分浸漬することで氷
核活性細菌を含むゲル状の羊毛ケラチンを得た。また、
これを凍結乾燥することで氷核活性細菌を包括する粉末
状の羊毛ケラチンを得た。

【００７３】＜実施例１４＞氷核活性細菌を固定化し
た絹フィブロイン膜２ｇの絹フィブロイン繊維を６０℃の８Ｍ臭化リチウム
水溶液５ｍｌに溶解し、セルロース系の透析膜中で純水
と５日間置換しながら透析することで０．５％絹フィブ
ロイン水溶液を調製した。０．５ｗｔ％の絹フィブロイ
ン水溶液２ｍｌに１０⁸／ｍｌの氷核活性細菌Ｎｉ２３
の懸濁液を２ｍｌを加えた。この混合溶液をポリエチレ
ン膜上に広げ、２０時間かけて水溶液を蒸発させること
で氷核活性細菌を含有し、透明性の絹フィブロイン膜を
調製した。

【００７４】また、Ｎｉ２３の懸濁液を含む絹フィブ
ロイン水溶液を−２０℃で凍結させ、さらに減圧下で凍
結乾燥することにより氷結活性細菌を含んだ絹フィブロ
イン粉末を調製した。更に、またＮｉ２３の懸濁液を含
む絹フィブロイン水溶液を−２０℃で一旦凍結させた
後、減圧下で凍結乾燥させることで氷核活性細菌を含む
家蚕絹フィブロインの粉末を調製した。

【００７５】＜実施例１５＞タンパク質の濃縮０．４％絹フィブロイン水溶液に氷核活性細菌（Ｎｉ２
３）を１０⁷／ｍｌを加え、−６℃で一昼夜保存し、溶
液全体を氷結させゲル状の白濁したサンプルを調製し
た。２５℃の室温にもどし一昼夜経過させることで絹フ
ィブロインゲルから水が弾き出された。具体的には、
０．４％絹フィブロイン水溶液を０．６２０９ｇを秤量
した後、Ｎｉ２３を添加しエッペンドルフの遠心管に入
れ−５℃で凍結する。完全に凍結した後、２５℃の室温
に戻して解凍する。Ｎｉ２３を全く含まないものを対照
区として用いた。Ｎｉ２３氷核活性細菌を含んだ絹フィ
ブロインでは、絹フィブロインゲルと０．３７ｇの水と
が既にこの際に分離し、絹フィブロインの回収利用に有
効であった。このように、絹フィブロインゲルから水が
弾き出されるため、ゲル濃度を高めることが可能となっ
た。ゲル化後の対象区の重量：１．８７２７ｇであり、
ゲル化後のＮｉ２３：放出水量０．３７ｇ、ゲル物１．
５８３５ｇ、全体で１．９５３５ｇである。

【００７６】

【発明の効果】本発明におけるＰｓｅｄｏｍｏｎａｓ属
の新菌種ＳＥＩ−１株は−１．８℃という極めて高温度
で氷結する機能をもっているので食品分野を始め各種の
産業分野で利用可能な氷核活性細菌である。従来の氷核
活性細菌及び新菌種の氷核活性細菌の氷核活性機能を増
強するには該細菌の培養時に従来の培地を用いる場合に
おいて、培地に糖類を添加し、通常の方法で培養するだ
けで氷核活性細菌の氷核機能は１０〜１００倍に増強で
きる。しかも、氷核機能を増強した細菌は、１０³／ｍ
Ｌの極めて低濃度であっても氷結する機能を十分に持ち
合わせており、氷核機能を増強する前に比べて１０倍以
上の機能増強が可能となった。

【００７７】本発明によれば、氷核形成能力に優れた氷
核活性細菌を用いているので、高分子物質水溶液に添加
し、氷核形成温度付近で処理するだけで高分子物質水溶
液がゲル化したり、あるいはその水溶液を一旦凍結させ
た後、凍結乾燥したり、あるいは、混合水溶液から水分
を蒸発させることなどにより、膜状、多孔質状、ブロッ
ク状、粉末状、ゲル状等のようなもとの高分子物質とは
異なる形態をもつ物質が提供できる。

【００７８】また、昆虫生体高分子物質（例えば絹蛋白
質）の水溶液またはケラチン（例えば羊毛ケラチン）水
溶液に氷核活性細菌の懸濁液を加えた場合、調製できる
氷核活性細菌を固定化した蛋白質膜が製造できる。この
ような蛋白質の塊状物は、透明性に優れ、機械的強度も
特に良好となる。また、透明で強度的にも優れ、生体適
合性も良好であるので、医療分野を中心とした生体用材
料として利用できる。さらに、本発明の氷核細菌を固定
化した高分子膜は、所望により水に対する溶解性を簡単
に制御することが可能であり、膜状、多孔質状、ブロッ
ク状、粉末状、ゲル状等の形態で形成することができ
る。所望により、氷核細菌の懸濁液と水溶性高分子との
混合液を支持体の表面上にスプレーし、乾燥固化してで
きる薄膜を不溶化させれば、耐久性に富んだ素材が製造
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】この図は、氷核活性細菌の有無における絹フィ
ブロイン水溶液の温度と空冷処理時の経過時間との関係
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:18） (56)参考文献特開平７−322876（ＪＰ，Ａ) 特開平３−160986（ＪＰ，Ａ) 特開平６−181729（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/00 C07K 1/14 C09K 3/24

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】シュウドモナス・シリンガエＳＥＩ−１
株、シュウドモナス・シリンガエＮｉ２３株、シュウド
モナス・シリンガエＭｅｉ４０株、エルウィニィア・ア
ナナスＴＭ２株、およびエルウィニィア・アナナスＭｅ
ｉ７株、ならびに前記菌株を糖類またはグリセロールの
存在下で培養して得られる氷核活性が増強された菌株か
らなる群から選択される氷核活性細菌。
【請求項２】氷核機能を有するが死菌であることを特
徴とする請求項１に記載の氷核活性細菌。
【請求項３】紫外線またはガンマ線照射によって死菌
とされていることを特徴とする請求項２に記載の氷核活
性細菌。
【請求項４】凍結速度制御物質としての、請求項１〜
３のいずれかに記載の氷核活性細菌の使用。
【請求項５】芯物質として請求項１〜３のいずれかに
記載の氷核活性細菌を内包する高分子物質よりなる氷核
形成物質。
【請求項６】高分子物質マトリックスに請求項１〜３
のいずれかに記載の氷核活性細菌を含む膜状、多孔質
状、ゲル状、ブロック状または粉末状の物質。
【請求項７】有用蛋白質を含む水溶液に請求項１〜３
のいずれかに記載の氷核活性細菌を加え、凍結させ、そ
の後解凍することにより有用蛋白質と水分とを分離さ
せ、該蛋白質を回収することを含む、蛋白質の濃縮・回
収方法。
【請求項８】絹蛋白質、ケラチン、ビニル系重合体、
アクリル系重合体、アミド系重合体およびセルロース誘
導体からなる群から選択される高分子物質の水溶液に、
請求項１〜３のいずれかに記載の氷核活性細菌を加え、
必要に応じて支持体上に適用し、次いで水分を蒸発させ
ることを含む、膜状、粉末状、多孔質またはブロック状
形態をもつ物質の製造方法。
【請求項９】絹蛋白質、ケラチン、ビニル系重合体、
アクリル系重合体、アミド系重合体およびセルロース誘
導体からなる群から選択される高分子物質の水溶液に、
請求項１〜３のいずれかに記載の氷核活性細菌を加え、
該高分子物質の水溶液を一旦凍結させた後、減圧下で凍
結乾燥することを含む、多孔質または粉末状形態をもつ
物質の製造方法。
【請求項１０】絹蛋白質またはケラチンからなる生体
高分子物質の水溶液に、請求項１〜３のいずれかに記載
の氷核活性細菌を加え、凍結させた後、減圧下で乾燥す
ることを含む、多孔質形態の物質の製造方法。