CN103333508A - 一种注射用胶原蛋白水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种注射用胶原蛋白水凝胶及其制备方法。现有胶原蛋白交联技术往往会引入或残留有机溶剂、有机灭菌剂等,产品安全性和生物相容性较差。本发明以胶原蛋白为原料,使用交联剂使原料分子间或分子内发生交联反应形成的水凝胶;选用酶或环氧类化合物作为交联剂,通过清洗或灭活的方式减轻或消除产物中残留交联剂对产物性能的影响。本发明的产物无生物学毒性,降低了产品对人体的损害;同时由于发生分子内或分子间的交联,降低了胶原蛋白的降解速率,提高其在体内的存留时间,并且水凝胶中胶原蛋白本身具有的良好的促新细胞形成和生长的性能没有受到影响。
Description
技术领域
本发明涉及一种水凝胶,具体涉及一种注射用胶原蛋白水凝胶及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是一种生物高分子物质,广泛存在于哺乳动物体内,是结缔组织中非常重要的一类结构蛋白,也是细胞外基质的主要成分。胶原蛋白具有一般蛋白质的化学性质,可以发生氨基反应、羧基反应、羟基反应、显色反应、交联反应等,自身具有特定的等电点。而且由于胶原蛋白分子表面有许多极性侧基,因此它的吸水性能非常良好,可以结合自身质量10倍以上的水,而其本身不溶于水。
类人胶原蛋白(Human-like Collagen)是将人体胶原蛋白的mRNA逆转录成cDNA,经酶切后的一段基因重组于E.coli(大肠杆菌)内,经过高密度发酵、分离、复性、纯化工艺生产的一种高分子生物蛋白。类人胶原蛋白具有良好的生物吸收性、生物兼容性、细胞粘附性、促新细胞形成和促上皮细胞形成的功能。并且类人胶原蛋白易溶于水,该特性也极大的扩宽了其应用范围。同时,类人胶原蛋白与动物胶原不同,其pH为6.5-7.5,接近人体生理酸碱度,不会对人体酸碱平衡造成影响,也不会破坏细胞生长与粘附。虽然类人胶原蛋白作为组织填充材料不会引起明显的炎症反应,但是未经交联的胶原蛋白在体内的降解速度较快,存留时间比较短,因此也限制了它在填充材料方向的应用。
关于胶原蛋白技术的交联技术已经有公开专利。CN101005865A 中公开了一种胶原蛋白海绵的制备方法,以戊二醛进行交联,但产品中会有高浓度的戊二醛残留,会引起强烈的生物毒性从而危害人体健康。
专利CN101864178A公开了一种采用辣根过氧化物酶作为交联剂交联含有酚羟基基团的天然或合成蛋白质/多肽,生理条件下可快速形成化学交联的可注射水凝胶的方法。该水凝胶生物相容性好、可降解,且降解产物人体也可吸收,可广泛应用于医学领域。但该方法中交联反应必须有过氧化物的存在,而过氧化物会对人体造成一定的损害。
专利CN101234216B公开了一种胶原基冷冻凝胶的制备方法,利用醛化多糖与胶原蛋白上的氨基反应生成希夫碱的反应,低温条件下,使胶原与醛化多糖交联反应一段时间,而后再解冻形成醛化多糖-胶原基多孔凝胶。但醛化多糖如双醛淀粉、双醛硫酸软骨素等在常温下不易溶解,同时存在一定的细胞毒性,而且该方法低温下反应时间为1-7天,之后要将产物解冻,较为耗时,生产效率比较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种保留时间较长、无生物学毒性的注射用胶原蛋白水凝胶及其制备方法。
本发明所采用的技术方案是:
一种注射用胶原蛋白水凝胶,其特征在于:
是以胶原蛋白为原料,使用交联剂使原料分子间或分子内发生交联反应形成的水凝胶。
所述的胶原蛋白选自从动物组织中提取的全长胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶;
或采用基因工程方法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白;
所述的交联剂选自1,4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油基醚、1,2,7,8- 二环氧辛烷、碳化二亚胺;
或谷氨酰胺转移酶。
一种注射用胶原蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:将胶原蛋白溶解于碱性溶液中,制备得到胶原蛋白质量浓度为5%-20%的溶液;
步骤二:加入环氧类化合物作交联剂,添加量为溶液质量的0.5%-10%,反应温度35-55℃,反应时间10-48小时,放置冷却;
步骤三:将所得产物进行粉碎;
步骤四:将得到的颗粒产物置于其体积10-50倍的缓冲液中清洗1-2天;
步骤五:离心除去缓冲液,收集沉淀得到颗粒状凝胶。
步骤一中,胶原蛋白选自从动物组织中提取的全长胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶,或采用基因工程方法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白;
碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠溶液,摩尔体积浓度为0.05-0.5mol/L;
步骤二中,环氧类化合物选自1,4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油基醚、1,2,7,8- 二环氧辛烷、碳化二亚胺;
步骤三中,粉碎方式选自挤压、研磨、切割;
步骤四中,缓冲液为磷酸盐缓冲液,摩尔体积浓度为0.01-0.05 mol/L,pH值为6-7。
一种注射用胶原蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:将胶原蛋白溶解于去离子水中,制备得到胶原蛋白质量浓度为5%-20%的溶液;
步骤二:调节溶液pH值至5-7;
步骤三:加入谷氨酰胺转移酶,加入谷氨酰胺转移酶与胶原蛋白的比例为2-15U/g,反应温度30-55℃,反应时间1-6小时,放置冷却;
步骤四:90℃下将酶灭活5min;
步骤五:将所得产物进行粉碎。
步骤一中,胶原蛋白选自从动物组织中提取的全长胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶,或采用基因工程方法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白;
步骤二中,pH值调节剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠溶液,摩尔体积浓度为0.01-1mol/L;
或选自盐酸、硫酸、磷酸溶液,摩尔体积浓度为0.01-1mol/L;
步骤五中,粉碎方式选自挤压、研磨、切割。
本发明具有以下优点:
本发明的胶原蛋白水凝胶,利用酶或环氧化合物作为交联剂,产物无生物学毒性,从而降低了产品对注射部位及人体的损害。同时由于发生分子内或分子间的交联,从而降低了胶原蛋白的降解速率,提高其在体内的存留时间,并且水凝胶中类人胶原蛋白本身所具有的良好的促新细胞形成和生长的性能以及其优良的生物学相容性并未受到明显影响。因此,本发明的类人胶原蛋白水凝胶可作为组织填充材料,用于医疗和整形行业中。
附图说明
图1为水凝胶分别在体外培养1、3、5天后的相对细胞存活率对比。
图2为水凝胶机械强度测试结果。
图3为水凝胶的体外胰蛋白酶的酶解曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明所涉及的一种注射用胶原蛋白水凝胶,是以胶原蛋白为原料,使用交联剂使原料分子间或分子内发生交联反应形成的水凝胶。
其中,胶原蛋白选自从动物组织中提取的全长胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶;或采用基因工程方法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白。
交联剂选自环氧类化合物中的1,4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油基醚、1,2,7,8- 二环氧辛烷、碳化二亚胺;或谷氨酰胺转移酶。
环氧类化合物中的环氧基团可以在碱性条件下与胶原蛋白中的氨基和酪氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸等上的羟基反应形成仲胺键和醚键,从而可以使蛋白发生分子间或分子内交联形成具有三维网状结构的凝胶,并且环氧类化合物可以很容易通过清洗去除,以达到减小或消除其生物学毒性的目的,从而使得到的产物具有良好的生物学性能。
谷氨酰胺转移酶是一种广泛存在于人体、高级动物、植物和微生物中,能够催化蛋白质分子之间或之内的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺残基的水解的酶。它以肽键中谷氨酰胺残基的γ一羧酰胺基作为酰基的供体,以多肽链中赖氨酰残基于氨基作为酰基的受体,形成蛋白质分子内和分子间的ε-γ(-谷氨酰)赖氨酸异肽键,使蛋白质分子发生交联并且谷氨酰胺转移酶并不存在生物毒性,因此可用作胶原蛋白交联的一种有效的交联剂。
采用环氧类化合物作交联剂的水凝胶制备方法,由以下步骤实现:
步骤一:将胶原蛋白溶解于碱性溶液中,制备得到胶原蛋白质量浓度为5%-20%的溶液。
胶原蛋白选自从动物组织中提取的全长胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶,或采用基因工程方法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白。
碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠溶液,摩尔体积浓度为0.05-0.5mol/L。
步骤二:加入环氧类化合物作交联剂,添加量为溶液质量的0.5%-10%,反应温度35-55℃,反应时间10-48小时,放置冷却。
环氧类化合物选自1,4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油基醚、1,2,7,8- 二环氧辛烷、碳化二亚胺。
步骤三:将所得产物进行粉碎。
粉碎方式选自挤压、研磨、切割。
步骤四:将得到的颗粒产物置于其体积10-50倍的缓冲液中清洗1-2天。
缓冲液为磷酸盐缓冲液,摩尔体积浓度为0.01-0.05 mol/L,pH值为6-7。
步骤五:离心除去缓冲液,收集沉淀得到颗粒状凝胶。
实施例1:
步骤一:将胶原蛋白溶解于碱性溶液中,制备得到胶原蛋白质量浓度为5%的溶液。
胶原蛋白选取从动物组织中提取的全长胶原蛋白。
碱性溶液选取氢氧化钠溶液,摩尔体积浓度为0.05mol/L。
步骤二:加入环氧类化合物作交联剂,添加量为溶液质量的0.5%,反应温度35℃,反应时间10小时,放置冷却。
环氧类化合物选取1,4-丁二醇二缩水甘油基醚。
步骤三:将所得产物进行粉碎。
粉碎方式选取挤压。
步骤四:将得到的颗粒产物置于其体积10倍的缓冲液中清洗1天。
缓冲液为磷酸盐缓冲液,摩尔体积浓度为0.01 mol/L,pH值为6。
步骤五:离心除去缓冲液,收集沉淀得到颗粒状凝胶。
实施例2:
步骤一:将胶原蛋白溶解于碱性溶液中,制备得到胶原蛋白质量浓度为5%的溶液。
胶原蛋白选取从动物组织中提取的胶原蛋白多肽。
碱性溶液选取氢氧化钠溶液,摩尔体积浓度为0.1mol/L。
步骤二:加入环氧类化合物作交联剂,添加量为溶液质量的2%,反应温度40℃,反应时间10小时,放置冷却。
环氧类化合物选取乙二醇二缩水甘油基醚。
步骤三:将所得产物进行粉碎。
粉碎方式选取挤压。
步骤四:将得到的颗粒产物置于其体积20倍的缓冲液中清洗1天。
缓冲液为磷酸盐缓冲液,摩尔体积浓度为0.02 mol/L,pH值为6。
步骤五:离心除去缓冲液,收集沉淀得到颗粒状凝胶。
实施例3:
步骤一:将胶原蛋白溶解于碱性溶液中,制备得到胶原蛋白质量浓度为10%的溶液。
胶原蛋白选取从动物组织中提取的明胶。
碱性溶液选取氢氧化钾溶液,摩尔体积浓度为0.2mol/L。
步骤二:加入环氧类化合物作交联剂,添加量为溶液质量的4%,反应温度45℃,反应时间20小时,放置冷却。
环氧类化合物选取1,6-己二醇二缩水甘油醚。
步骤三:将所得产物进行粉碎。
粉碎方式选取研磨。
步骤四:将得到的颗粒产物置于其体积30倍的缓冲液中清洗1天。
缓冲液为磷酸盐缓冲液,摩尔体积浓度为0.03 mol/L,pH值为6。
步骤五:离心除去缓冲液,收集沉淀得到颗粒状凝胶。
实施例4:
步骤一:将胶原蛋白溶解于碱性溶液中,制备得到胶原蛋白质量浓度为15%的溶液。
胶原蛋白选取采用基因工程方法生产的重组胶原蛋白。
碱性溶液选取氢氧化钾溶液,摩尔体积浓度为0.3mol/L。
步骤二:加入环氧类化合物作交联剂,添加量为溶液质量的6%,反应温度50℃,反应时间30小时,放置冷却。
环氧类化合物选取聚乙二醇二缩水甘油基醚。
步骤三:将所得产物进行粉碎。
粉碎方式选取研磨。
步骤四:将得到的颗粒产物置于其体积40倍的缓冲液中清洗2天。
缓冲液为磷酸盐缓冲液,摩尔体积浓度为0.04 mol/L,pH值为7。
步骤五:离心除去缓冲液,收集沉淀得到颗粒状凝胶。
实施例5:
步骤一:将胶原蛋白溶解于碱性溶液中,制备得到胶原蛋白质量浓度为20%的溶液。
胶原蛋白选取采用基因工程方法生产的类人胶原蛋白。
碱性溶液选取碳酸钠溶液,摩尔体积浓度为0.4mol/L。
步骤二:加入环氧类化合物作交联剂,添加量为溶液质量的8%,反应温度55℃,反应时间40小时,放置冷却。
环氧类化合物选取1,2,7,8- 二环氧辛烷。
步骤三:将所得产物进行粉碎。
粉碎方式选取切割。
步骤四:将得到的颗粒产物置于其体积50倍的缓冲液中清洗2天。
缓冲液为磷酸盐缓冲液,摩尔体积浓度为0.05 mol/L,pH值为7。
步骤五:离心除去缓冲液,收集沉淀得到颗粒状凝胶。
实施例6:
步骤一:将胶原蛋白溶解于碱性溶液中,制备得到胶原蛋白质量浓度为20%的溶液。
胶原蛋白选取采用基因工程方法生产的类人胶原蛋白。
碱性溶液选取碳酸钠溶液,摩尔体积浓度为0.5mol/L。
步骤二:加入环氧类化合物作交联剂,添加量为溶液质量的10%,反应温度55℃,反应时间48小时,放置冷却。
环氧类化合物选取碳化二亚胺。
步骤三:将所得产物进行粉碎。
粉碎方式选取切割。
步骤四:将得到的颗粒产物置于其体积50倍的缓冲液中清洗2天。
缓冲液为磷酸盐缓冲液,摩尔体积浓度为0.05 mol/L,pH值为7。
步骤五:离心除去缓冲液,收集沉淀得到颗粒状凝胶。
采用酶作交联剂的水凝胶制备方法,由以下步骤实现:
步骤一:将胶原蛋白溶解于去离子水中,制备得到胶原蛋白质量浓度为5%-20%的溶液。
胶原蛋白为动物组织提取的全长胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶,或采用基因工程方法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白。
步骤二:调节溶液pH值至5-7。
pH值调节剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠溶液,摩尔体积浓度为0.01-1mol/L;或选自盐酸、硫酸、磷酸溶液,摩尔体积浓度为0.01-1mol/L。
步骤三:加入谷氨酰胺转移酶,加入谷氨酰胺转移酶与胶原蛋白的比例为2-15U/g,反应温度30-55℃,反应时间1-6小时,放置冷却;
步骤四:90℃下将酶灭活5min;
步骤五:将所得产物进行粉碎。
粉碎方式选自挤压、研磨、切割。
实施例1:
步骤一:将胶原蛋白溶解于去离子水中,制备得到胶原蛋白质量浓度为5%的溶液。
胶原蛋白选取从动物组织提取的全长胶原蛋白。
步骤二:调节溶液pH值至5。
pH值调节剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠溶液,摩尔体积浓度为0.01mol/L。
步骤三:加入谷氨酰胺转移酶,加入谷氨酰胺转移酶与胶原蛋白的比例为2U/g,反应温度30℃,反应时间1小时,放置冷却;
步骤四:90℃下将酶灭活5min;
步骤五:将所得产物进行粉碎。
粉碎方式选取挤压。
实施例2:
步骤一:将胶原蛋白溶解于去离子水中,制备得到胶原蛋白质量浓度为10%的溶液。
胶原蛋白选取从动物组织提取的胶原蛋白多肽。
步骤二:调节溶液pH值至6。
pH值调节剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠溶液,摩尔体积浓度为1mol/L。
步骤三:加入谷氨酰胺转移酶,加入谷氨酰胺转移酶与胶原蛋白的比例为5U/g,反应温度40℃,反应时间2小时,放置冷却;
步骤四:90℃下将酶灭活5min;
步骤五:将所得产物进行粉碎。
粉碎方式选取研磨。
实施例3:
步骤一:将胶原蛋白溶解于去离子水中,制备得到胶原蛋白质量浓度为15%的溶液。
胶原蛋白选取从动物组织提取的明胶。
步骤二:调节溶液pH值至7。
pH值调节剂选自盐酸、硫酸、磷酸溶液,摩尔体积浓度为0.01mol/L。
步骤三:加入谷氨酰胺转移酶,加入谷氨酰胺转移酶与胶原蛋白的比例为10U/g,反应温度50℃,反应时间4小时,放置冷却;
步骤四:90℃下将酶灭活5min;
步骤五:将所得产物进行粉碎。
粉碎方式选取切割。
实施例4:
步骤一:将胶原蛋白溶解于去离子水中,制备得到胶原蛋白质量浓度为20%的溶液。
胶原蛋白选取采用基因工程方法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白。
步骤二:调节溶液pH值至7。
pH值调节剂选自盐酸、硫酸、磷酸溶液,摩尔体积浓度为1mol/L。
步骤三:加入谷氨酰胺转移酶,加入谷氨酰胺转移酶与胶原蛋白的比例为15U/g,反应温度55℃,反应时间6小时,放置冷却;
步骤四:90℃下将酶灭活5min;
步骤五:将所得产物进行粉碎。
粉碎方式选取切割。
以下为本发明所涉及的注射水凝胶的相关性能测试:
1、材料的细胞毒性检测
材料对BHK细胞的生长和增殖的影响通过新型细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(cck-8)来分析。它的基本原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8)还原为水溶性的黄色的甲臢产物,细胞增殖越快越多,颜色越深,细胞毒性越大,颜色越浅,颜色的深浅与活细胞的数量成正比,从而可以得到细胞的增殖情况。
将贴壁细胞用胰蛋白酶消化后,用培养液制成细胞悬浮液,按照每孔103-104个细胞接种于96孔板中,每孔100μL,并将孔板置于细胞培养箱,培养1d使细胞贴壁。
将材料浸泡在培养液中于37℃下浸提72h后,用浸提液培养贴壁细胞,以加入正常培养液的孔作为对照。分别于1,3,5d后,每孔加入10μL cck-8,继续培养4小时后,使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
各组OD值取均值后,计算细胞相对存活率如下:
具体结果参见图1所示。
根据ISO10993-1.1997及国家标准GB/T16886.5-2003,胶原蛋白凝胶的细胞毒性等级为0级,我们可以看出:两种材料的对细胞生长及增殖有明显的促进作用。因此,实验证明两种水凝胶的浸提液对细胞的生长都有促进作用,使得细胞的相对存活率随培养时间而增加,说明该水凝胶无明显的细胞毒性,并且具有良好的生物相容性,符合生物材料应用的要求。
2、酶法交联凝胶的机械强度
采用先进仪器电子万能材料试验机(Electronic Universal Testing Machine)来测量水凝胶的压缩载荷和弹性模量。首先将凝胶用刀片切成长为6.79mm,直径为14mm的圆柱状凝胶块进行抗压试验。打开万能试验压缩机,调节相关参数:主要有起始抗压盘高度为6.79mm,最终抗压盘高度为4.79mm,抗压盘形状为圆形,直径为14mm,抗压速度为2 mm/min,横坐标设为压缩位移,纵坐标设为压缩载荷。然后将切好的凝胶块放于抗压盘上,开始试验,当抗压盘高度为4.79mm时停止试验。结果参见图2。
水凝胶机械强度越大,说明水凝胶抗压承受能力比较强,是作为理想的可注射式填充材料的重要指标之一,因此要对其机械性能进行改良,如图所示,随着压缩位移的增加,压缩载荷逐渐增加,形成一个半双曲线的趋势,压缩位移为2mm时,其压缩载荷可以达到20kPa,其弹性模量可以达到0.13MPa,从而说明该凝胶较强的机械强度,可以满足医用生物材料的基本要求。
3、凝胶的降解时间
配制胰蛋白酶:用pH为7.4的PBS溶液配制0.25%的胰蛋白酶溶液,过滤除菌后放于4℃备用。
通过干燥后的水凝胶材料称重()后用60Co照射,在无菌操作条件下分别置于相同体积的酶液中,用封口膜封住瓶口。放于37℃细胞培养箱中,分别在1、2、3、4、5、6、7d取样,用超纯水冲洗三次,然后用真空冷冻干燥机干燥后称重()。降解率()的计算公式如下:
具体结果参见图3。
对于可注射的软组织填充材料注射于人体内后,一方面会随着炎症细胞的吞噬而降解,一方面会被人体皮肤内产生的酶液而降解。因此,通过酶液降解数据显示:这两种水凝胶都是可降解的,而且降解速率和降解时间也比较相近。说明交联胶原蛋白水凝胶的抗酶解性能较好,有利于其在体内存留较长时间。
4、酶法交联凝胶交联度测定
样品交联度采用三硝基苯磺酸测定。样品冻干后,悬浮在1%的SDS溶液中(1:50),2000g离心20分钟,取0.25mL上清液与2mL 100mM pH为8.0的磷酸盐缓冲液混合,然后加入2mL0.1%的三硝基苯磺酸,50℃水浴振荡1h,然后加入4mL 0.1M 盐酸终止反应,样品冷却至室温后,测定其在340nm波长下的吸光度,交联度的计算公式如下:
结果见下表1。
表1 不同酶添加量对凝胶交联度的影响
凝胶的交联度对其降解性能、热稳定性都有重要的影响,交联度越高,形成的网状结构越致密,可以有效的阻止酶进入到凝胶内部使其结构崩溃,因此可以明显延长其降解时间。由表中数据可以看出,凝胶的交联度随着酶添加量的增加而增加,但是当酶的含量高于6U/g时,交联度没有明显的提升,在此基础上提高酶的含量,对凝胶的性能没有大的影响。
本发明的内容不限于实施例所列举,本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换,均为本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.一种注射用胶原蛋白水凝胶,其特征在于:
是以胶原蛋白为原料,使用交联剂使原料分子间或分子内发生交联反应形成的水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种注射用胶原蛋白水凝胶,其特征在于:
所述的胶原蛋白选自从动物组织中提取的全长胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶;
或采用基因工程方法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白;
所述的交联剂选自1,4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油基醚、1,2,7,8- 二环氧辛烷、碳化二亚胺;
或谷氨酰胺转移酶。
3.一种注射用胶原蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:将胶原蛋白溶解于碱性溶液中,制备得到胶原蛋白质量浓度为5%-20%的溶液;
步骤二:加入环氧类化合物作交联剂,添加量为溶液质量的0.5%-10%,反应温度35-55℃,反应时间10-48小时,放置冷却;
步骤三:将所得产物进行粉碎;
步骤四:将得到的颗粒产物置于其体积10-50倍的缓冲液中清洗1-2天;
步骤五:离心除去缓冲液,收集沉淀得到颗粒状凝胶。
4.根据权利要求3所述的一种注射用胶原蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于:
步骤一中,胶原蛋白选自从动物组织中提取的全长胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶,或采用基因工程方法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白;
碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠溶液,摩尔体积浓度为0.05-0.5mol/L;
步骤二中,环氧类化合物选自1,4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油基醚、1,2,7,8- 二环氧辛烷、碳化二亚胺;
步骤三中,粉碎方式选自挤压、研磨、切割;
步骤四中,缓冲液为磷酸盐缓冲液,摩尔体积浓度为0.01-0.05 mol/L,pH值为6-7。
5.一种注射用胶原蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:将胶原蛋白溶解于去离子水中,制备得到胶原蛋白质量浓度为5%-20%的溶液;
步骤二:调节溶液pH值至5-7;
步骤三:加入谷氨酰胺转移酶,加入谷氨酰胺转移酶与胶原蛋白的比例为2-15U/g,反应温度30-55℃,反应时间1-6小时,放置冷却;
步骤四:90℃下将酶灭活5min;
步骤五:将所得产物进行粉碎。
6.根据权利要求5所述的一种注射用胶原蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于:
步骤一中,胶原蛋白选自从动物组织中提取的全长胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶,或采用基因工程方法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白;
步骤二中,pH值调节剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠溶液,摩尔体积浓度为0.01-1mol/L;
或选自盐酸、硫酸、磷酸溶液,摩尔体积浓度为0.01-1mol/L;
步骤五中,粉碎方式选自挤压、研磨、切割。
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