CN102924731A - 一种三重交联的胶原蛋白及制造方法和用途 - Google Patents

Abstract

一种三重交联胶原蛋白的制造方法，包括：提供一可溶性的胶原蛋白样品；混合该胶原蛋白样品与一第一交联剂，以形成一重交联的胶原蛋白；混合该一重交联的胶原蛋白与一第二交联剂，以形成二重交联的胶原蛋白；以及混合该二重交联的胶原蛋白与一第三交联剂，以形成三重交联的胶原蛋白。其中，第一交联剂、第二交联剂、及第三交联剂分别选自由：醛类交联剂、亚胺类交联剂及环氧化物交联剂所组成的群组，且第一交联剂异于第二交联剂，第三交联剂异于第一交联剂及第二交联剂。

Description

一种三重交联的胶原蛋白及制造方法和用途

技术领域

本发明主要是关于一种三重交联的胶原蛋白的制造方法，尤其指一种适用于制造高熔点、低酵素降解率、及高稳定性的三重交联的胶原蛋白，并将此三重交联的胶原蛋白应用于需长期植入胶原蛋白的医学治疗。

背景技术

胶原蛋白存在于人体结缔组织中，是构成骨骼、软骨、肌腱、韧带、血管、眼角膜、基底膜、及皮肤等组织器官的结构基质。由于胶原蛋白具备有低免疫反应的特性，因此，经常被应用于医疗及组织工程上，以补强或保护人体组织。

然而，以胶原蛋白为主要组成的相关医疗材料，通常植入人体后，即会于很短时间内被体内酵素降解而代谢消失，因此大多应用于医疗材料的胶原蛋白需要先经过交联反应后，以形成结构较为稳定的胶原蛋白，才能进行人体植入。

目前，大多胶原蛋白的交联反应可分为物理交联法或化学交联法。其中，物理交联法是以放射性同位素、紫外线、或脱水加热法等进行交联反应，然而，物理交联法容易对胶原蛋白产生一定程度的破坏，而导致胶原蛋白变性或产生降解，故物理交联法较不适合用应用于制造医疗材料的交联胶原蛋白。另外，化学交联法是以化学交联剂进行交联反应，然而，以公知的化学交联剂进行交联反应后的胶原蛋白，不但部份会对人体产生毒性，亦无法大幅改善胶原蛋白的熔点及酵素降解率，故仅能将其暂时的植入人体或是限制其于医疗的应用。事实上，大多胶原蛋白的交联反应仅进行胶原蛋白分子间及/或及分子内的胺基与胺基共价交联，然而，胶原蛋白除了具有胺基官能基之外，亦有羧基官能基。因此，若仅进行胺基与胺基的交联，则容易产生交联不均且低交联度的胶原蛋白纤维，使其抗酵素分解性无法达到预期。

有鉴于此，提供一种可制造出高交联度胶原蛋白的方法，不但可降低胶原蛋白被酵素降解的速率，亦可增加其稳定度，以提供医疗材料界更多的选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三重交联的胶原蛋白的制造方法，以使胶原蛋白产生高度交联，以提升其熔点及降低其酵素降解率，并增强其稳定性。

本发明的另一目的在于提供一种包含三重交联的胶原蛋白的组合物，以利用其高稳定性、高熔点及低酵素降解率的特性，以应用于高稳定性需求的医疗材料。

为实现上述目的，本发明提供有三重交联的胶原蛋白的制造方法，包括：

提供一可溶性的胶原蛋白样品；

混合该胶原蛋白样品与一第一交联剂，以形成一重交联的胶原蛋白，其中，该第一交联剂为一选自由：醛类交联剂、亚胺类交联剂及环氧化物交联剂所组成的群组；

混合该一重交联的胶原蛋白与一第二交联剂，以形成二重交联的胶原蛋白，其中，该第二交联剂为一选自由：醛类交联剂、亚胺类交联剂及环氧化物交联剂所组成的群组，且该第二交联剂是异于该第一交联剂；以及

混合该二重交联的胶原蛋白与一第三交联剂，以形成三重交联的胶原蛋白，其中，该第三交联剂为一选自由：醛类交联剂、亚胺类交联剂及环氧化物交联剂所组成的群组，且该第三交联剂是异于该第一交联剂以及该第二交联剂。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，于形成该三重交联的胶原蛋白后，包括有一步骤：

混合该三重交联的胶原蛋白于过量的甘胺酸(glycine)溶液中，另以磷酸缓冲溶液清洗并中和该三重交联的胶原蛋白。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该胶原蛋白样品包含一胶原蛋白纤维，且该胶原蛋白样品至少一选自由：牛源胶原蛋白、猪源胶原蛋白、羊源胶原蛋白、马源胶原蛋白、鱼源胶原蛋白及人类胶原蛋白所组成的群组。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该胶原蛋白样品为至少一选自由：第一型胶原蛋白、第二型胶原蛋白、第三型胶原蛋白、第四型胶原蛋白及第五型胶原蛋白所组成的群组。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该胶原蛋白样品为第一型胶原蛋白。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该胶原蛋白样品包含一重组的胶原蛋白纤维。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该醛类交联剂至少一选自由：甲醛、乙二醛及戊二醛所组成的群组。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该醛类交联剂为戊二醛。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该醛类交联剂是于pH 6至pH 9，且反应温度为20℃至50℃的反应条件中进行交联反应。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该醛类交联剂的反应浓度为15ppm至70ppm。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该亚胺类交联剂至少一选自由：1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC))、1-环己基-3-(2-码咻代乙基)碳化二亚胺(1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide(CMC))、二环己基碳化二亚胺(dicyclohexyl carbodiimide(DCC))及二异丙基碳化二亚胺(diisopropyl carbodiimide(DIC))所组成的群组。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该亚胺类交联剂为1-乙基-3-3-二甲基胺丙基-碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该亚胺类交联剂包括N-羟基-丁二酸亚酰胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)，以形成亚胺类交联剂混合物。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该亚胺类交联剂是于pH4至pH 6，且反应温度为30℃至50℃的反应条件中进行交联反应。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该亚胺类交联剂的体积百分浓度为1％至4％。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该环氧化物交联剂至少一选自由：1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether，EGDGE)、缩水甘油醚(glycerol polyglycidyl ether)、及二缩水甘油醚(diglycerol polyglycidyl ether)所组成的群组。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该环氧化物交联剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该环氧化物交联剂是于pH 3至pH 5，且反应温度为30℃至50℃的反应条件中进行交联反应。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该环氧化物交联剂的体积百分浓度为0.5％至4％。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该第一交联剂为醛类交联剂。

所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该第一交联剂的作用为胺基与胺基间的共价交联反应。

本发明提供的三重交联的胶原蛋白组合物，包括：

如上述中任一项所述的三重交联的胶原蛋白的制造方法所制得的该三重交联的胶原蛋白；以及

一载剂，其中，该三重交联的胶原蛋白的交联度为70-90％，熔点为80-95％，且酵素降解率小于10％。

所述三重交联的胶原蛋白组合物，其中，包括：一抗氧化剂、一增黏剂、一安定剂、一赋形剂、一界面活性剂或其组合。

本发明的三重交联的胶原蛋白组合物，可应用于牙科、骨科、皮肤科、神经外科、整形外科、或医药的载体上，以成为例如微整形医学美容植入剂、骨修补材、人造真皮、真皮填补、软骨组织增大、或药物控制释放的医药载体等用途。

附图说明

图1是比较例1的一重交联的胶原蛋白结构示意图。

图2是比较例7的二重交联的胶原蛋白结构示意图。

图3是本发明三重交联的胶原蛋白结构示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种三重交联的胶原蛋白的制造方法，包括：首先，提供一可溶性的胶原蛋白样品；混合此胶原蛋白样品与一第一交联剂，以形成一重交联的胶原蛋白；再则，混合此一重交联的胶原蛋白与一第二交联剂，以形成二重交联的胶原蛋白；最后，混合其二重交联的胶原蛋白与一第三交联剂，以形成三重交联的胶原蛋白。其中，上述的第一交联剂为一选自由：醛类交联剂、亚胺类交联剂、及环氧化物交联剂所组成的群组；而上述的第二交联剂为一选自由：醛类交联剂、亚胺类交联剂、及环氧化物交联剂所组成的群组，且此第二交联剂是异于上述的第一交联剂；另外，第三交联剂为一选自由：醛类交联剂、亚胺类交联剂、及环氧化物交联剂所组成的群组，且此第三交联剂是异于第一交联剂以及第二交联剂。因此，上述的第一交联剂、第二交联剂及第三交联剂分别为不同类的交联剂。

另外，于上述三重交联的胶原蛋白的制造方法中，在形成三重交联的胶原蛋白后，可还包括有一步骤：混合其三重交联的胶原蛋白于过量的甘胺酸(glycine)溶液中，另以中性的磷酸缓冲溶液清洗并中和此三重交联的胶原蛋白。

而以上述本发明的制造方法所形成的三重交联蛋白，其交联度可达70-90％，熔点可达80-95℃，另外，酵素降解率可小于10％。

上述的醛类交联剂无特别限制，较佳地至少一选自由：甲醛、乙二醛、及戊二醛所组成的群组，最佳地为戊二醛。此外，本发明所使用的醛类交联剂，其交联反应为胺基与胺基间的共价交联反应，因此，醛类交联剂能使胶原蛋白分子间及分子内的胺基与胺基间，进行交联反应。而于醛类交联剂的交联反应条件中，酸碱值可为偏中性，较佳地是介于约pH 6至pH 9之间，更佳地是介于pH 6.5至pH 7.5之间，最佳地是介于pH 6.8至pH 7.3之间。另外，醛类交联剂的反应温度无特别限制，只要不使胶原蛋白样品变性即可，较佳地是介于20℃至50℃之间，更佳地是介于25℃至40℃之间，最佳地是介于28℃至35℃之间。再则，于反应浓度上，亦无特别限制，只要能于胶原蛋白分子间及/或分子内进行胺基与胺基的交联反应即可，较佳的反应浓度介于15ppm至70ppm之间，更佳地是介于25ppm至50ppm之间，最佳地是介于30ppm至40ppm之间。

而上述的亚胺类交联剂无特别限制，较佳地是至少一选自由：1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC))、1-环己基-3-(2-码咻代乙基)碳化二亚胺(1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide(CMC))、二环己基碳化二亚胺(dicyclohexyl carbodiimide(DCC))、及二异丙基碳化二亚胺(diisopropyl carbodiimide(DIC))。最佳为1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC))。此外，本发明所使用的亚胺类交联剂，其交联反应为胺基与羧基间的共价交联反应，因此，亚胺类交联剂能使胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与羧基进行交联反应。另外，本发明所使用的亚胺类交联剂可包括N-羟基-丁二酸亚酰胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)，将亚胺类交联剂与N-羟基-丁二酸亚酰胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)混合，以形成本发明另可使用的亚胺类交联剂混合物(EDC/NHS)。其中，亚胺类交联剂与N-羟基-丁二酸亚酰胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)混合摩尔比无特别限制，较佳地约为1∶1、2∶1、5∶1、及5∶2，更佳地约为2∶1、5∶1、及5∶2，最佳地为5∶1。而于亚胺类交联剂的交联反应条件中，酸碱值可为偏酸性酸碱值，较佳地是介于pH 4至pH 6之间，更佳地是介于pH 4.5至pH 5.8之间，最佳地是介于pH 5.2至pH5.7之间。另外，亚胺类交联剂的反应温度无别限制，只要不使胶原蛋白样品变性即可，较佳地是介于30℃至50℃之间，更佳地是介于35℃至45℃之间，最佳地是介于38℃至42℃之间。再则，于反应浓度上，亦无特别限制，只要能于胶原蛋白分子间及/或分子内进行胺基与羧基的交联反应即可，较佳的体积百分浓度是介于0.5％至5％之间，更佳地是介于1％至4％之间，最佳地是介于1％至3％之间。

另外，上述的环氧化物交联剂无特别限制，较佳地是至少一选自由：1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether，EGDGE)、缩水甘油醚(glycerolpolyglycidyl ether)、及二缩水甘油醚(diglycerol polyglycidyl ether)所组成的群组，更佳地为1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether，EGDGE)，最佳地为1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)。此外，本发明所使用的环氧化物交联剂，于碱性反应条件下，其交联反应为胺基与胺基间的共价交联反应；而于酸性反应条件下，其交联反应为羧基与羧基间的共价交联反应。因此，环氧化物交联剂于碱性反应条件下，能使胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与胺基间，进行交联反应；而于酸性反应条件下，能使胶原蛋白分子间及/或分子内的羧基与羧基间，进行交联反应。于本发明环氧化物交联剂的反应条件中，酸碱值为偏酸性，较佳地是介于pH 3至pH 5之间，更佳地是介于pH 4至pH 4.8之间，最佳地是介于pH 4.3至pH 4.7之间。另外，环氧化物交联剂的反应温度无别限制，只要不使胶原蛋白样品变性即可，较佳地是介于30℃至50℃之间，更佳地是介于35℃至45℃之间，最佳地是介于38℃至43℃之间。再则，于反应浓度上，亦无特别限制，只要能于胶原蛋白分子间及/或分子内进行羧基与羧基的交联反应即可，较佳的体积百分浓度是介于0.5％至4％之间，更佳地是介于1％至3％之间，最佳地是介于1％至2.5％之间。

于上述本发明中，较佳的第一交联剂可进行胺基与胺基间的共价交联反应。因此，较佳的第一交联剂为醛类交联剂、或碱性条件下的环氧化物交联剂，更佳地为醛类交联剂，最佳地为醛类交联剂的戊二醛。

上述本发明的胶原蛋白样品包含一胶原蛋白纤维，且本发明的胶原蛋白样品的物种来源并无限制，较佳地至少一选自由：牛源胶原蛋白、猪源胶原蛋白、羊源胶原蛋白、马源胶原蛋白、鱼源胶原蛋白、及人类胶原蛋白所组成的群组，更佳地为牛源胶原蛋白、猪源胶原蛋白、鱼源胶原蛋白、及人类胶原蛋白。此外，本发明的胶原蛋白样品可为至少一选自由：第一型胶原蛋白、第二型胶原蛋白、第三型胶原蛋白、第四型胶原蛋白及第五型胶原蛋白所组成的群组，较佳地为第一型胶原蛋白、第二型胶原蛋白，更佳地为第一型胶原蛋白。再则，本发明所使用的胶原蛋白样品除了上述之外，亦可为上述胶原蛋白的重组胶原蛋白纤维，以利胶原蛋白的共价交联反应进行。

本发明另提供一种三重交联的胶原蛋白的组合物，包括：以上述三重交联的胶原蛋白的制造方法所制得的三重交联的胶原蛋白，以及一载剂。其中，此三重交联的胶原蛋白的交联度可为70-90％，熔点可为80-95℃，且酵素降解率可小于10％。另外，载剂可包含甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素纤维素乙酸酯邻苯二甲酸酯、羟丙基纤维素与羟丙基甲基纤维素的纤维素化合物、聚乙烯氯、聚乙烯咯烷酮、硬脂醇、单硬脂酸甘油酯、聚异丁烯酸酯、异丁烯酸甲酯、聚乙二醇、以及亲水性胶等。

此外，上述本发明另提供的一种三重交联的胶原蛋白组合物，其中，还可包括一抗氧化剂、一增黏剂、一安定剂、一赋形剂、一界面活性剂、或其组合，以形成一种低生物排斥性且可长时间植入的胶原蛋白医材。其应用的范围并无限制，可应用于牙科、骨科、皮肤科、神经外科、整形外科、或医药的载体上，以成为例如微整形医学美容植入剂、骨修补材、人造真皮、真皮填补、软骨组织增大、或药物控制释放的医药载体等用途。

以下由具体实施例说明本发明的实施方式，熟习此技艺的人士可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。此外，本发明亦可由其它不同具体实施例加以施行或应用，在不悖离本发明的精神下进行各种修饰与变更。

实施例1

1-1胶原蛋白纤维重组

由猪皮萃取出猪源的胶原蛋白溶液，将此胶原蛋白溶液与0.2M，pH11.2的磷酸缓冲溶液以体积比9∶1的比例混合，并于25℃中，缓慢搅拌6小时，以进行胶原蛋白的胶原蛋白纤维重组。接着，以离心方式收集重组后的胶原蛋白纤维，并将其分散于20mM，pH7的磷酸缓冲溶液中，得浓度约为2.7mg/mL的重组胶原蛋白纤维溶液。

1-2第一重交联反应

以属于醛类交联剂的戊二醛作为本实施例的一重交联剂。将上述浓度约为2.7mg/mL的重组胶原蛋白纤维溶液加入戊二醛，戊二醛最终浓度为35ppm。接着，于30℃，pH7.2下，缓慢搅拌16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与胺基共价交联反应，待交联反应结束后，以离心收集此第一重交联反应所形成的一重交联的胶原蛋白纤维。

1-3第二重交联反应

以属于环氧化物交联剂的1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanedioldiglycidyl ether，BDDE)作为本实施例的第二交联剂。将一重交联的胶原蛋白纤维分散至20mM，pH4.5的磷酸缓冲液中，得浓度约为2.7mg/mL的一重交联的胶原蛋白纤维溶液。接着，于一重交联的胶原蛋白纤维溶液中加入第二交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)，BDDE最终体积百分浓度为1％，再于40℃，pH4.5下，缓慢搅拌16小时，待交联反应结束后，以离心收集此第二重交联反应所形成的二重交联的胶原蛋白纤维。

于本实施例的第二重交联反应中，其第二交联剂是于酸性条件下进行交联反应，因此，本实施例的第二重交联反应，是于一重交联的重组胶原蛋白纤维的分子间及/或分子内，进行羧基与羧基间的共价交联反应。

1-4第三重交联反应

以属于亚胺类交联剂1-乙基-3-3-二甲基胺丙基-碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)作为本实施例的第三交联剂。此外，本实施例的第三交联剂还包括N-羟基-丁二酸亚酰胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)。将EDC与NHS以摩尔比5∶1进行混合，以形成本实施例的第三交联剂混合物(EDC/NHS)。

将二重交联的胶原蛋白纤维分散于0.1M 2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液中(pH 5.5)，得浓度约为2.7mg/mL的二重交联胶原蛋白纤维溶液，接着，加入第三交联剂EDC/NHS(摩尔比(molar ratio)5∶1)，EDC最终浓度为1％，并于40℃，pH 5.5下，搅拌反应16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与羧基共价交联反应，待反应结束后，以离心收集第三重交联反应后的胶原蛋白纤维产物(即三重交联的胶原蛋白纤维)。接着，加入第三次交联胶原蛋白纤维10倍体积的0.1M甘胺酸(glycine)溶液搅拌6小时后，再以离心收集三重交联的胶原蛋白纤维。

再以10mM磷酸缓冲溶液(pH 7.0)以10倍体积比例，清洗3次，再离心收集三重交联的胶原蛋白纤维。

实验例1

1-1交联度测试

本实验例是以三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulphonate，TNBS)试剂进行三重交联的胶原蛋白纤维的交联度分析。

<实验组1>

将4mg经冻结干燥后的三重交联的胶原蛋白纤维加入1ml，0.1M，pH8.5的碳酸氢钠溶液(sodium bicarbonate solution)，再加入1ml，体积百分浓度为0.5％的TNBS溶液，于40℃下，反应2小时。于反应结束后，再加入3ml，6N的盐酸(HCl)，并于60℃下，反应1.5小时。反应结束待反应溶液冷却至室温后，再加入去离子水5ml，均匀混合。取出5ml的该混合液于螺旋试管中，并加入10ml的乙醚，均匀震荡后静置，待液体分层，再将上层乙醚取出。接着，再加入10ml的乙醚，重复三次上述的步骤。待反应溶液中的乙醚完全挥发后，取400μl的反应溶液，并加入800μl的去离子水(即反应溶液体积比∶去离子水体积比＝1∶2)均匀混合。最后于波长345nm下，侦测其吸光值，并套用下式计算交联度。

<实验组2>

实验组2的步骤与上述实验组1的步骤相同，差别仅在于实验组2所使用的样品为无进行交联反应的冻结干燥胶原蛋白纤维。

<对照组>

对照组的步骤与上述的实验组1的步骤相同，差别仅在于不加入任何试样。

交联度计算式：

其中，A为实验组2的吸光值扣除对照组的吸光值。而B为实验组1的吸光值扣除对照组的吸光值。

1-2酵素降解度测试

将1g经冻结干燥的三重交联的胶原蛋白纤维置于0.1ml的胶原蛋白酶溶液中(0.5单位/ml，50mM TES+0.36mM CaCl₂.2H₂O，pH7.4)，并于37℃下反应24小时。待反应结束后，以10000rpm离心10分钟，取上清液0.2ml，加入茚三酮(Ninhydrin)1ml，于100℃反应20分钟后，将反应液冷却至室温，于光波长570nm下，侦测其吸光值。

最后，本实施例1的结果如表1及图3本发明三重交联蛋白的结构示意图所示。由实施例1所制得的三重交联的胶原蛋白纤维，其产率为83％，交联度为75.62％，熔点为82.18℃，酵素降解率系为9.17％。

实施例2

2-1胶原蛋白纤维重组

与实施例1的胶原蛋白纤维重组步骤相同。

2-2第一重交联反应

与实施例1的第一重交联反应步骤相同。

2-3第二重交联反应

本实施例的第二重交联反应是以属于亚胺类交联剂1-乙基-3-3-二甲基胺丙基-碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride，EDC)作为本实施例的第二交联剂，且亦以摩尔比5∶1的比例，将EDC与N-羟基-丁二酸亚酰胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)混合，以形成本实施例的第二交联剂混合物(EDC/NHS)。将离心收集的第一重交联胶原蛋白分散于0.1M 2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液中(pH 5.5)，得浓度约为2.7mg/mL的一重交联胶原蛋白纤维溶液，接着加入第二交联剂EDC/NHS，EDC最终浓度为1％，接着于40℃，pH 5.5下，搅拌反应16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与羧基共价交联反应，待反应结束后，以离心收集第二重交联反应后的胶原蛋白纤维产物，以形成本实施例的二重交联的胶原蛋白纤维。

2-4第三重交联反应

本实施例的第三交联剂是以属于环氧化物交联剂的1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)。将上述离心收集的二重交联胶原蛋白纤维分散至20mM，pH 4.5的磷酸缓冲液中，得浓度约为2.7mg/mL的二重交联的胶原蛋白纤维溶液，接着加入第三交联剂BDDE＝BDDE最终体积百分浓度为1％，再于40℃，pH 4.5中，缓慢搅拌16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的羧基与羧基共价交联反应，反应结束后，再以离心收集三重交联的胶原蛋白纤维，以形成本实施例的三重交联的胶原蛋白纤维。接着，加入离心后的交联胶原蛋白纤维10倍体积的0.1M甘胺酸(glycine)溶液搅拌6小时后，再以离心收集三重交联的胶原蛋白纤维。

再以10mM磷酸缓冲溶液(pH 7.0)以10倍体积比例，清洗3次，再离心收集三重交联的胶原蛋白纤维。

最后，本实施例的结果同样如表1所示。由本实施例方法所制得的三重交联胶原蛋白，其产率为77％，交联度为76.61％，熔点为84.53℃，酵素降解率为8.34％。

实施例3

3-1胶原蛋白纤维重组

由猪皮萃取出猪源的胶原蛋白溶液，将此胶原蛋白溶液与0.2M，pH11.2的磷酸缓冲溶液以体积比9∶1的比例混合，并于25℃中，缓慢搅拌6小时，以进行胶原蛋白的胶原蛋白纤维重组。接着，以离心方式收集重组后的胶原蛋白纤维，再将离心收集的胶原蛋白纤维分散于0.1M 2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液中(pH 5.5)，得浓度约为2.7mg/mL的重组胶原蛋白纤维溶液。

3-2第一重交联反应

以属于亚胺类交联剂1-乙基-3-3-二甲基胺丙基-碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)作为本实施例的第一交联剂。此外，本实施例的第一交联剂还包括N-羟基-丁二酸亚酰胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)。将EDC与NHS以摩尔比5∶1进行混合，以形成本实施例的第一交联剂混合物(EDC/NHS)。

将第一交联剂EDC/NHS(摩尔比(molar ratio)5∶1)加入已分散于0.1MMES缓冲液(pH 5.5)的重组胶原蛋白纤维溶液中，EDC最终浓度为1％，并于40℃，pH 5.5下，搅拌反应16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与羧基共价交联反应，待反应结束后，以离心收集第一重交联反应后的胶原蛋白纤维产物。

接着将离心收集第一重交联反应后的胶原蛋白纤维产物分散于20mM，pH 7的磷酸缓冲溶液中，得浓度约为2.7mg/mL的一重交联胶原蛋白纤维溶液。

3-3第二重交联反应

以属于醛类交联剂的戊二醛作为本实施例的第二交联剂。将上述浓度约为2.7mg/mL的一重交联胶原蛋白纤维溶液加入戊二醛，戊二醛最终浓度为35ppm。接着，于30℃，pH 7.2下，缓慢搅拌16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与胺基共价交联反应，待交联反应结束后，以离心收集此第二重交联反应所形成的二重交联的胶原蛋白纤维。

3-4第三重交联反应

以属于环氧化物交联剂的1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanedioldiglycidyl ether，BDDE)作为本实施例的第三交联剂。将二重交联的胶原蛋白纤维分散至20mM，pH 4.5的磷酸缓冲液中，得浓度约为2.7mg/mL的二重交联的胶原蛋白纤维溶液。接着，将此二重交联的胶原蛋白纤维溶液加入1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)的第三交联剂，BDDE最终体积百分浓度为1％，再于40℃，pH 4.5下，缓慢搅拌16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的羧基与羧基共价交联反应，待交联反应结束后，以离心收集此第三重交联反应所形成的三重交联的胶原蛋白纤维。

接着，加入第三次交联胶原蛋白纤维10倍体积的0.1M甘胺酸(glycine)溶液搅拌6小时后，再以离心收集三重交联的胶原蛋白纤维。

再以10mM磷酸缓冲溶液(pH 7.0)以10倍体积比例，清洗3次，再离心收集三重交联的胶原蛋白纤维。

最后，本实施例的结果同样如表1所示。由本实施例方法所制得的三重交联胶原蛋白，其产率为73.8％，交联度为76.43％，熔点为81.75℃，酵素降解率为8.11％。

比较例1

1-1胶原蛋白纤维重组

由猪皮萃取出猪源的胶原蛋白溶液，将此胶原蛋白溶液与0.2M，pH11.2的磷酸缓冲溶液以体积比9∶1的比例混合，并于25℃中，缓慢搅拌6小时，以进行胶原蛋白纤维重组。接着，以离心方式收集重组的胶原蛋白纤维，并将其分散于20mM，pH 7的磷酸缓冲溶液中，得浓度约为2.7mg/mL的重组胶原蛋白纤维溶液。

1-2一重交联反应

以属于醛类交联剂的戊二醛作为本比较例的一重交联剂。将上述浓度约为2.7mg/mL的重组胶原蛋白纤维溶液加入戊二醛，戊二醛最终浓度为35ppm。接着，于30℃，pH7.2下，缓慢搅拌16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与胺基共价交联反应，待交联反应结束后，即离心收集本比较例的一重交联的胶原蛋白纤维。

接着，加入一次交联胶原蛋白纤维10倍体积的0.1M甘胺酸(glycine)溶液搅拌6小时后，再以离心收集一重交联的胶原蛋白纤维。

再以10mM磷酸缓冲溶液(pH 7.0)以10倍体积比例，清洗3次，再离心收集本比较例的一重交联胶原蛋白纤维。

将本比较例冻结干燥后的一重交联的胶原蛋白纤维进行如实验例1的交联度及酵素降解率测试，其结果如表1及图1比较例1的一重交联的胶原蛋白结构示意图所示。本比较例的产率虽为91.2％，然而，交联度却仅为32.88％，熔点仅为68.33℃，而酵素降解率为100％。由此显示，以本比较例的方法所制得的一重交联的胶原蛋白纤维，其交联度低且酵素降解率高。

比较例2

2-1胶原蛋白纤维重组

由猪皮萃取出猪源的胶原蛋白溶液，将此胶原蛋白溶液与0.2M，pH11.2的磷酸缓冲溶液以体积比9∶1的比例混合，并于25℃中，缓慢搅拌6小时，以进行胶原蛋白纤维重组。接着，以离心方式收集重组的胶原蛋白纤维，并将其分散于20mM，pH 4.5的磷酸缓冲溶液中，得浓度约为2.7mg/mL的重组胶原蛋白纤维溶液。

2-2一重交联反应

以属于环氧化物交联剂的1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanedioldiglycidyl ether，BDDE)作为本比较例的一重交联剂。将上述的2.7mg/mL的重组胶原蛋白纤维溶液加入BDDE，BDDE最终体积百分浓度为1％，接着于40℃，pH 4.5下，缓慢搅拌16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的羧基与羧基共价交联反应，待交联反应结束后，即离心收集本比较例的一重交联的胶原蛋白纤维。

接着，加入交联胶原蛋白纤维10倍体积的0.1M甘胺酸(glycine)溶液搅拌6小时后，再以离心收集交联的胶原蛋白纤维。

再以10mM磷酸缓冲溶液(pH 7.0)以10倍体积比例，清洗3次，再离心收集本比较例的一重交联胶原蛋白纤维。

将本比较例冻结干燥的一重交联的胶原蛋白纤维进行如实验例1的交联度及酵素降解度测试，其结果如表1所示。本比较例的产率为38.5％，交联度为8.5％，熔点为50.33℃，而酵素降解率为34％。由此显示，以本比较例的方法所制得的一重交联的胶原蛋白纤维，无论其产率、交联度、熔点、及酵素降解率皆较实施例1至3不佳。

比较例3

3-1胶原蛋白纤维重组

由猪皮萃取出猪源的胶原蛋白溶液，将此胶原蛋白溶液与0.2M，pH11.2的磷酸缓冲溶液以体积比9∶1的比例混合，并于25℃中，缓慢搅拌6小时，以进行胶原蛋白纤维重组。接着，以离心方式收集重组的胶原蛋白纤维，并将其分散于20mM，pH9.5的磷酸缓冲溶液中，得浓度约为2.7mg/mL的重组胶原蛋白纤维溶液。

3-2一重交联反应

以属于环氧化物交联剂的1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanedioldiglycidyl ether，BDDE)作为本比较例的一重交联剂。于上述浓度为2.7mg/mL的重组胶原蛋白纤维溶液中加入BDDE，BDDE最终体积百分浓度为1％，再于40℃，pH 9.5下，缓慢搅拌16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与胺基共价交联反应，待交联反应结束后，即离心收集本比较例的一重交联的胶原蛋白纤维。

接着，加入一重交联胶原蛋白纤维10倍体积的0.1M甘胺酸(glycine)溶液搅拌6小时后，再以离心收集一重交联的胶原蛋白纤维。

再以10mM磷酸缓冲溶液(pH 7.0)以10倍体积比例，清洗3次，再离心收集本比较例的一重交联的胶原蛋白纤维。

将本比较例冻结干燥的一重交联的胶原蛋白纤维进行如实验例1的交联度及酵素降解度测试，其结果如表1所示。本比较例的产率为30％，交联度为50％，熔点为62℃，而酵素降解率为20％。由此显示，以本比较例的方法所制得的一重交联的胶原蛋白纤维，同样无论其产率、交联度、熔点、及酵素降解率皆明显较实施例1至3不佳。

比较例4

4-1胶原蛋白纤维重组

由猪皮萃取出猪源的胶原蛋白溶液，将此胶原蛋白溶液与0.2M，pH11.2的磷酸缓冲溶液以体积比9∶1的比例混合，并于25℃中，缓慢搅拌6小时，以进行胶原蛋白纤维重组。接着，以离心方式收集重组的胶原蛋白纤维，再分散于0.1M 2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液中(pH 5.5)，得浓度约为2.7mg/mL的重组胶原蛋白纤维溶液。

4-2一重交联反应

以属于亚胺类交联剂1-乙基-3-3-二甲基胺丙基-碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)作为本比较例的一重交联剂。此外，本比较例的一重交联剂还包括N-羟基-丁二酸亚酰胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)。将EDC与NHS以摩尔比5∶1进行混合，以形成本比较例的一重交联剂混合物(EDC/NHS)。

于上述浓度为2.7mg/mL的重组胶原蛋白纤维溶液中加入EDC/NHS，EDC最终体积百分浓度为1％，于40℃且pH 5.5的条件下，缓慢搅拌反应16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与羧基共价交联反应，待交联反应结束后，即离心收集本比较例的一重交联的胶原蛋白纤维。

接着，加入交联胶原蛋白纤维10倍体积的0.1M甘胺酸(glycine)溶液搅拌6小时后，再以离心收集一重交联的胶原蛋白纤维。

再以10mM磷酸缓冲溶液(pH 7.0)以10倍体积比例，清洗3次，再离心收集本比较例的一重交联的胶原蛋白纤维。

将本比较例冻结干燥的一重交联的胶原蛋白纤维进行如实验例1的交联度及酵素降解度测试，其结果如表1所示。本比较例的产率为72.1％，交联度为74.44％，熔点为78℃，而酵素降解率为32％。由此显示，以本比较例的方法所制得的一重交联的胶原蛋白纤维，同样无论其产率、交联度、熔点、及酵素降解率皆较实施例1至3不佳。

比较例5

5-1胶原蛋白纤维重组

与比较例1的胶原蛋白纤维重组步骤相同。

5-2第一重交联反应

与比较例1的第一重交联反应步骤相同。

5-3第二重交联反应

以属于环氧化物交联剂的1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanedioldiglycidyl ether，BDDE)作为本比较例的第二交联剂。将本比较例的一重交联的胶原蛋白纤维，分散至20mM，pH 4.5的酸性磷酸缓冲液中，得浓度约为2.7mg/mL的一重交联的胶原蛋白纤维。接着，加入第二交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)，BDDE最终体积百分浓度为1％，再于40℃且pH 4.5下，缓慢搅拌16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的羧基与羧基共价交联反应，待交联反应结束后，即离心收集本比较例的二重交联的胶原蛋白纤维。

接着，加入二重交联胶原蛋白纤维10倍体积的0.1M甘胺酸(glycine)溶液搅拌6小时后，再以离心收集二重交联的胶原蛋白纤维。

再以10mM磷酸缓冲溶液(pH 7.0)以10倍体积比例，清洗3次，再离心收集本比较例的二重交联的胶原蛋白纤维。

将本比较例冻结干燥的二重交联的胶原蛋白纤维进行如实验例1的交联度及酵素降解度测试，其结果如表1所示。本比较例的产率虽为90％，然而，交联度为36.94％，熔点为68.33℃，而酵素降解率为17.4％。由此显示，本比较例虽酵素降解率有部份改善，然而，交联度、及熔点却仍较本实施例1至3不佳。

比较例6

6-1胶原蛋白纤维重组

与比较例1的胶原蛋白纤维重组步骤相同。

6-2第一重交联反应

与比较例1的第一重交联反应步骤相同。最后将一重交联的胶原蛋白纤维分散于0.1M 2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液中(pH 5.5)，得浓度约为2.7mg/mL的一重交联的胶原蛋白纤维溶液。

6-3第二重交联反应

以属于亚胺类交联剂1-乙基-3-3-二甲基胺丙基-碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)作为本比较例的第二交联剂。此外，本比较例的第二交联剂更包括N-羟基-丁二酸亚酰胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)。将EDC与NHS以摩尔比5∶1进行混合，以形成本比较例的第二交联剂混合物(EDC/NHS)。

于上述浓度为2.7mg/mL的一重交联的胶原蛋白纤维溶液中加入EDC/NHS，EDC最终体积百分浓度为1％，再于40℃且pH 5.5下，缓慢搅拌反应16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与羧基共价交联反应，待交联反应结束后，即离心收集本比较例的二重交联的胶原蛋白纤维。

接着，加入二重交联胶原蛋白纤维10倍体积的0.1M甘胺酸(glycine)溶液搅拌6小时后，以离心收集二重交联的胶原蛋白纤维。

再以10mM磷酸缓冲溶液(pH 7.0)以10倍体积比例，清洗3次，再离心收集本比较例的二重交联的胶原蛋白纤维。

将本比较例冻结干燥的二重交联的胶原蛋白纤维进行如实验例1的交联度及酵素降解度测试，其结果如表1所示。本比较例的产率虽为78.7％，交联度为76.74％，熔点为82.57℃，而酵素降解率为22％。由此显示，虽然本比较例的熔点及交联度有部份改善，然而，产率及酵素降解率却较本实施例1至3不佳。

比较例7

7-1胶原蛋白纤维重组

与比较例1的胶原蛋白纤维重组步骤相同。

7-2第一重交联反应

与比较例1的第一重交联反应步骤相同。最后将一重交联的胶原蛋白纤维分散于20mM，pH 9.5的磷酸缓冲溶液中，得浓度约为2.7mg/mL的一重交联的胶原蛋白纤维溶液。

7-3第二重交联反应

以属于环氧化物交联剂的1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanedioldiglycidyl ether，BDDE)作为本比较例的第二交联剂。于上述浓度为2.7mg/mL一重交联的胶原蛋白纤维溶液中加入第二交联剂BDDE，BDDE最终体积百分浓度为1％，再于40℃且pH 9.5下，缓慢搅拌16小时，以进行胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与胺基共价交联反应，待交联反应结束后，即离心收集本比较例的二重交联的胶原蛋白纤维。

接着，加入二重交联胶原蛋白纤维10倍体积的0.1M甘胺酸(glycine)溶液搅拌6小时后，再以离心收集二重交联的胶原蛋白纤维。

再以10mM磷酸缓冲溶液(pH 7.0)以10倍体积比例，清洗3次，再离心收集本比较例的二重交联的胶原蛋白纤维。

将本比较例冻结干燥的二重交联的胶原蛋白纤维进行如实验例1的交联度及酵素降解度测试，其结果如表1及图2比较例7的二重交联的胶原蛋白结构示意图所示。本比较例的产率虽为80％，交联度为71％，熔点为73℃，而酵素降解率为15.3％。由此显示，虽然本比较例的产率有部份改善，然而，交联度、熔点及酵素降解率却仍较本实施例1至3不佳。

表1

综合上述，由表1结果配合图1比较例1的一重交联的胶原蛋白结构示意图、图2比较例7的二重交联的胶原蛋白结构示意图、以及图3本发明三重交联的胶原蛋白结构示意图所示。经由本发明三重交联方法所制得的三重交联的胶原蛋白，其产率不但保持一定水平，且其高交联度的结果亦显示了本发明的三重交联方法可使胶原蛋白分子间及/或分子内的胺基与胺基、胺基与羧基及羧基与羧基等官能基进行充分的共价交联。再则，比较实施例与比较例，由本发明三重交联方法所制得的三重交联的胶原蛋白，其交联度大幅提升，且熔点亦明显上升，更甚者，其酵素降解率明显降低。由此可见，以本发明三重交联方法所制得的三重交联的胶原蛋白，其稳定性相较于比较例中的一重交联及二重交联的胶原蛋白明显提升，故相较于习知以一重交联方法及二重交联方法所制得的交联性胶原蛋白，以本发明三重交联方法所制得的三重交联的胶原蛋白，其更适合应用于牙科、骨科、神经外科、整型外科、或医药载体的医疗材料。

上述实验例仅是为了方便说明而举例而已，本发明所主张的权利范围自应以申请专的权利要求范围所述为准，而非仅限于上述实施例。

Claims (24)

1.一种三重交联的胶原蛋白的制造方法，包括：

提供一可溶性的胶原蛋白样品；

混合该胶原蛋白样品与一第一交联剂，以形成一重交联的胶原蛋白，其中，该第一交联剂为一选自由：醛类交联剂、亚胺类交联剂及环氧化物交联剂所组成的群组；

混合该一重交联的胶原蛋白与一第二交联剂，以形成二重交联的胶原蛋白，其中，该第二交联剂为一选自由：醛类交联剂、亚胺类交联剂及环氧化物交联剂所组成的群组，且该第二交联剂是异于该第一交联剂；以及

混合该二重交联的胶原蛋白与一第三交联剂，以形成三重交联的胶原蛋白，其中，该第三交联剂为一选自由：醛类交联剂、亚胺类交联剂及环氧化物交联剂所组成的群组，且该第三交联剂是异于该第一交联剂以及该第二交联剂。

2.如权利要求1所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，于形成该三重交联的胶原蛋白后，包括有一步骤：

混合该三重交联的胶原蛋白于过量的甘胺酸溶液中，另以磷酸缓冲溶液清洗并中和该三重交联的胶原蛋白。

3.如权利要求1所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该胶原蛋白样品包含一胶原蛋白纤维，且该胶原蛋白样品至少一选自由：牛源胶原蛋白、猪源胶原蛋白、羊源胶原蛋白、马源胶原蛋白、鱼源胶原蛋白及人类胶原蛋白所组成的群组。

4.如权利要求3所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该胶原蛋白样品为至少一选自由：第一型胶原蛋白、第二型胶原蛋白、第三型胶原蛋白、第四型胶原蛋白及第五型胶原蛋白所组成的群组。

5.如权利要求3所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该胶原蛋白样品为第一型胶原蛋白。

6.如权利要求1所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该胶原蛋白样品包含一重组的胶原蛋白纤维。

7.如权利要求1所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该醛类交联剂至少一选自由：甲醛、乙二醛及戊二醛所组成的群组。

8.如权利要求1所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该醛类交联剂为戊二醛。

9.如权利要求7所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该醛类交联剂是于pH 6至pH 9，且反应温度为20℃至50℃的反应条件中进行交联反应。

10.如权利要求7所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该醛类交联剂的反应浓度为15ppm至70ppm。

11.如权利要求1所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该亚胺类交联剂至少一选自由：1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺、1-环己基-3-(2-码咻代乙基)碳化二亚胺、二环己基碳化二亚胺及二异丙基碳化二亚胺所组成的群组。

12.如权利要求1所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该亚胺类交联剂为1-乙基-3-3-二甲基胺丙基-碳化二亚胺。

13.如权利要求1所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该亚胺类交联剂包括N-羟基-丁二酸亚酰胺，以形成亚胺类交联剂混合物。

14.如权利要求11所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该亚胺类交联剂是于pH 4至pH 6，且反应温度为30℃至50℃的反应条件中进行交联反应。

15.如权利要求11所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该亚胺类交联剂的体积百分浓度为1％至4％。

16.如权利要求1所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该环氧化物交联剂至少一选自由：1，4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、缩水甘油醚及二缩水甘油醚所组成的群组。

17.如权利要求1所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该环氧化物交联剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

18.如权利要求16所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该环氧化物交联剂是于pH 3至pH 5，且反应温度为30℃至50℃的反应条件中进行交联反应。

19.如权利要求16所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该环氧化物交联剂的体积百分浓度为0.5％至4％。

20.如权利要求1所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该第一交联剂为醛类交联剂。

21.如权利要求1所述三重交联的胶原蛋白的制造方法，其中，该第一交联剂的作用为胺基与胺基间的共价交联反应。

22.一种三重交联的胶原蛋白组合物，包括：

如权利要求1至21中任一项所述的三重交联的胶原蛋白的制造方法所制得的该三重交联的胶原蛋白；以及

一载剂，

其中，该三重交联的胶原蛋白的交联度为70-90％，熔点为80-95％，且酵素降解率小于10％。

23.如权利要求22所述三重交联的胶原蛋白组合物，其中，包括：一抗氧化剂、一增黏剂、一安定剂、一赋形剂、一界面活性剂或其组合。

24.如权利要求22所述三重交联的胶原蛋白组合物，其中，使用于牙科、骨科、神经外科、整形外科或医药的载体。

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