CN104117096A - 一种新型复合生物硬脑膜 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型复合生物硬脑膜，该硬脑膜是将SIS与胶原蛋白海绵复合进行脑硬膜替代物制备，使其与天然脑硬膜更加接近，具有可降解、可塑性、可修饰的特性，且不需要缝合。产品性能、力学强度和安全性都有较大改善；创新交联方式使本产品降解时间与新生组织生长时间一致，优于临床上同类品种；创新根据人体脑硬膜不同部位厚度的差异设计人工硬脑膜补片的形态，有效解决了现有临床硬脑膜产品的缺陷。

Description

一种新型复合生物硬脑膜

技术领域

本发明涉及一种新型复合生物硬脑膜，特别是具有胶原和SIS膜双层复合结构的硬脑膜及其应用。

背景技术

硬脑膜是保护脑组织的一道重要屏障，对于维护神经系统的结构及功能活动意义重大。创伤或颅脑手术可造成硬脑膜缺损，如不进行修补，易导致伤口不愈合，并出现皮下积液、脑脊液漏、颅内感染等并发症；头皮或肌层的渗血可弥散到蛛网膜下隙刺激脑组织，引起发热、头痛、无菌性炎症或脑膜刺激征；脑组织与头皮直接粘连愈合，增加了癫痫发生机会。手术修补硬脑膜，封闭硬脑膜下腔，可明显减少或预防脑脊液漏、颅内感染、癫痫等并发症，这在神经外科界已达成共识，但硬脑膜修复材料甚多，疗效不一。随着医学和组织工程技术发展，各种生物材料、合成材料相继出现。

理想的硬脑膜修补的材料应具备下列条件：①具有稳定的生物学惰性的，不引起急慢性炎症反应。②具有安全性，无毒性，无致癌、致畸作用，对生物膜型的人工脑膜要求不能传播潜在的已知或未知感染。③组织相容性好，无排斥反应。④致密性好，无渗透性，防止脑脊液漏，保护脑组织。⑤具有韧性，能够承受缝合。⑥能促使脑膜再生，不发生脑膜脑粘连。⑦使用方便，手术简单，易予消毒灭菌。⑧取材广泛，价格低廉。

硬脑膜缺损修复材料根据来源和性能，目前研究应用的硬脑膜修补材料有4类：自体组织修补材料、同种异体材料、异种生物材料和人工合成材料。然而人工合成材料可引起严重的排异反应，且由于局部组织的反应，可造成对脑组织的刺激，形成瘢痕或包裹反应、脑膜炎症状或出血等严重并发症，而且目前中国人工合成硬脑膜修复材料大都依赖进口，价格昂贵致使难于在临床中推广；自体组织修补材料虽然生物相容性好，免疫反应低，但是容易增加手术和治疗的时间，现已经逐渐被异种材料所取代；异种生物材料具有良好的生物适应性，国内临床上常使用牛心包、羊心包、牛腹膜、猪腹膜、肠系膜等，但是由于其通常采用戊二醛或环氧化合物等方式交联，容易引发细胞毒性，其安全性问题仍是一个问题。

胶原是哺乳动物中含量最丰富的蛋白质，约占蛋白质总质量的25％-30％，是腱，软骨、皮肤和血管等结缔组织的主要成分。天然胶原是一类具有重复序列的纤维状蛋白，并具有独特的三股螺旋结构，在生物体中彼此排列成机械强度高的原纤维。从动物组织中提取得到的胶原蛋白(胶原及其水解产物)分子量在几万到几十万之间，具有天然胶原的骨架结构和活性基团，因此可用来合成人造蛋白质纤维。胶原蛋白用用的优势在于它来源广泛，成本较低，特别是具有良好的生物相容性，生物可降解和低免疫原型，因此已已应用与生物医用材料这样高附加值领域。

小肠粘膜下层(SIS)是一种不含细胞的细胞外基质材料，其结构接近天然结缔组织，不仅可起支架作用，而且具有特殊的生理功能，各种基质成分之间相互关系密切，与细胞亲和力良好，可以更有效地传递分子和细胞信息，引导组织重建、塑性。目前，SIS和胶原均已成功的用于再生医学领域的工程支架，创伤修复，组织再生等方面的研究，但受各自的结构，组成以及应用形式等因素的限制，仅能在一定程度上促进愈合速度，提高愈合质量，而难以达到功能零号的仿生型再生修复效果。本发明首次将SIS与胶原蛋白海绵复合进行脑硬膜替代物制备，使其与天然脑硬膜更加接近，具有可降解、可塑性、可修饰的特性，且不需要缝合。产品性能、力学强度和安全性都有较大改善；创新交联方式使本产品降解时间与新生组织生长时间一致，优于临床上同类品种；创新根据人体脑硬膜不同部位厚度的差异设计人工硬脑膜补片的形态，有效解决了现有临床硬脑膜产品的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复合生物硬脑膜补片，该生物硬脑补片是由两种动物来源的成分复合而成的具有双层结构的生物膜；

其中，该双层生物膜是由指SIS膜与胶原蛋白海绵膜复合而成；

本发明所述的胶原蛋白海绵是一种网状纤维结构的单层膜，该膜有助于成纤维细胞的生长，同时保证了其成纤维细胞生长的速度与膜体内降解的速度一致。

本发明所述的胶原蛋白海绵还具有另外一个特征，在于其具有完整三螺旋结构的活性I型胶原蛋白，纯度在99％以上；

本发明所述的SIS膜是一种低免疫原型的生物膜，该SIS膜具有完整的结构且具有多种主动修复的细胞因子，易于人自体新生组织的爬行替代，并能在自体膜修复完成后自动降解。

本发明还提供了一种制备该双层复合生物膜的方法，

该方法分为三个步骤：

步骤一，胶原的提取、重建与冻干；

步骤二，低免疫原性SIS的制备；

步骤三，SIS膜和胶原海绵的复合；

步骤四，灭菌

本发明所述步骤一中涉及的提取胶原的制备，其特征在于通过具体为：

a.将I型胶原蛋白按600ml冰醋酸水溶液含干胶原蛋白3-5g的用量溶解在PH为2.5-5.0的冰醋酸水溶液中。

b.将所述步骤1)配制的溶液搅拌1-2小时，得到浆液；

c.将搅拌好的浆液抽真空后进行冷冻干燥。

本发明所述步骤二中涉及的提取SIS膜的制备，其特征在于通过具体为：将动物小肠经物理处理、化学处理以及脱细胞处理后，得到动物小肠粘膜下层即SIS膜。

更为具体的是将猪小肠，刮出肌肉、浆膜等冗余组织，去离子水冲洗干净，EDTA(100mmol/L)/NaOH(10mmol/l)溶液浸泡16h，去离子水冲洗后置于pH值为3-4的盐酸/PBS溶液处理6-8h，去离子水冲洗出去残余的酸溶液，磷酸盐缓冲液PBS浸泡16-18h，去离子水反复冲洗。0.1％的过氧乙酸/20％乙醇溶液浸泡8h，再置0.05％叠氮化钠/PBS溶液中清洗2h，即得SIS膜。

本发明所述步骤三中涉及的复合方式是通过生物胶粘合的方式将获得

本发明所述步骤四中涉及的灭菌方式是通过辐照灭菌方式来实现。

进一步地，其辐照灭菌的剂量为完全杀菌的辐照剂量为25～50kGy，优选30-40kGy。

本发明的胶原海绵因其特有的网状海绵状结构使它具有能吸收脑脊液而体积不增加，对神经组织有营养保护作用，网状海绵状结构不对神经组织产生机械性损伤，胶原海绵把神经组织与周围组织分开，减少了硬膜外瘢痕组织与神经粘连，它的胶原特性还具有促进成纤维细胞活动，加速硬膜再生的功能。胶原海绵与SIS膜复合，利用SIS膜上特有的细胞生长因子促使自体组织的生长，且该复合膜复合材料能被逐渐吸收，以防长期全内异物存留给身心带来不良影响。该硬膜修补方法简单易行，效果满意，不增加术后感染率，不失为一种有效的硬脑膜补片。

具体实施方式

实施例1

1.I型胶原蛋白纤维硬脑膜的制备

一)胶原的提取、重建和冻干

1.1原料解冻：

胶原蛋白自冷冻室取出，根据含水量计算出当批使用量，置于灭菌平皿中，室温解冻后使用。

1.2配制计算方法：

0.05M，600ml冰醋酸溶液含干胶原蛋白3-5g

1.3I型胶原蛋白溶液制备，将解冻后的胶原蛋白根据含水量称取9.1-15.2g胶原放入搅拌罐中，加入600-800ml的0.05M冰醋酸，搅拌1-2小时。

1.4冷冻干燥：将1.3中所属的溶液装盘，根据临床的需要倒入不同厚度的I型胶原蛋白溶液，按照如下的程序进行冷冻干燥：

步骤号	控制过程	板层控制温度	控制真空	过程时间min
					1	预冻	3	-	5
2	冷冻	-20	-	60
					3	冷冻	-40	-	160
4	抽空	-	0.2	-
					5	干燥	-20	0.2	20
6	干燥	-20	0.2	300
					7	干燥	-15	0.2	10
8	干燥	-15	0.2	360
					9	干燥	-10	0.2	300
10	干燥	0	0.2	20
					11	干燥	0	0.2	30
12	干燥	20	0.2	60

13	干燥	20	0.2	60
					14	干燥	20	0.2	30

二)SIS膜脱细胞处理

猪小肠，刮出肌肉、浆膜等冗余组织，去离子水冲洗干净，EDTA(100mmol/L)/NaOH(10mmol/l)溶液浸泡16h，去离子水冲洗后置于pH值为3-4的盐酸/PBS溶液处理6-8h，去离子水冲洗出去残余的酸溶液，磷酸盐缓冲液PBS浸泡16-18h，去离子水反复冲洗。0.1％的过氧乙酸/20％乙醇溶液浸泡8h，再置0.05％叠氮化钠/PBS溶液中清洗2h，即得SIS膜。

三)复合双层膜

将上述步骤1中的胶原冻干膜均匀涂布上生物蛋白胶，然后将SIS膜平铺于涂有生物蛋白胶的胶原蛋白膜面，压紧使其结合紧密，干燥即得双层胶原膜。

四)辐照灭菌：将冻干I型胶原蛋白纤维膜材料分别放入剂量为25kGy，30kGy；40kGy；50kGy辐照装置内，动态辐照72h后取出室温保存、备用。

实施例2孔隙测定

采用实施例1的方法制备4种不同辐照强度的产品，采用电镜测其结构中孔隙大小分别为345um，220um；227um，183um，其中辐照剂量为30-40kGy组I型胶原蛋白纤维膜孔径最适应成纤维细胞的生长。

实施例3胶原酶酶解时间的测定

用自制打孔器将4种不同辐照时间的硬脑膜替代材料制成直径5mm的圆片各10片，再将小圆片和酶解缓冲液以及酶活力单位为357U/mL胶原酶液加入小试管中，37℃恒温酶解至小圆片分解所需的时间，即为酶解时间(min)。测得其酶解时间分别为：25.3min，23.6min，27.6min，51.1min.当辐照剂量在25-40KGy其I型胶原蛋白纤维膜的酶解时间差异性不大，证明其对胶原的交联度影响不大。

Claims (9)

1.一种复合生物膜，其特征在于该双层生物膜是由SIS膜与胶原蛋白海绵膜复合而成具有双层结构的生物膜。

2.根据权利要求1所述的胶原蛋白，其特征在于来源于哺乳动物跟腱。

3.根据权利要求2所述的哺乳动物跟腱，其特征在于是猪、牛、马跟腱中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的胶原蛋白，其特征在于是纯度在99％以上。

5.根据权利要求1，4所述的胶原蛋白海绵，其特征在于是通过冷冻干燥工艺获得。

6.一种复合双层生物膜，其特征在于是通过辐照工艺灭菌获得无菌产品。

7.根据权利要求6所述的辐照灭菌工艺，其特征在于辐照灭菌的剂量为25～50kGy，优选30-40kGy。

8.一种复合生物膜，其特征在于是通过以下四个步骤制备获得：

步骤一，胶原的提取、重建与冻干；

步骤二，低免疫原性SIS的制备；

步骤三，SIS膜和胶原海绵的复合；

步骤四，灭菌。

9.一种复合双层生物硬脑膜，其特征在于可作为硬脑膜的修复材料。