CN111330079B - 一种人工硬脑膜复合补片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人工硬脑膜复合补片及其制备方法，这类复合补片至少含有T层和D层，D层与脑软组织直接接触，T层与脑颅骨直接接触；T和D层都是由结缔组织去细胞、去抗原后加工而成；源自幼畜的D层含有更多生物活性因子，诱导组织再生能力强，且该层柔和度好，能与柔嫩脑软组织面更好吻合；T层可以源自种畜ECM，有优异的天然交联度，具备更好的生物力学性能（韧性好）。这类补片既有良好促组织再生功能，又具有良好力学性能，防脑积液渗漏；同时完全降解吸收，D层先快降解，T层后慢降解，符合硬膜组织再生的自然规律，降解产物无任何毒副作用，属于升级版的硬脑膜补片产品；本发明的硬脑膜复合补片，制备方法简单又实用，能够快速地推广与普及，满足临床上的急需。

Description

一种人工硬脑膜复合补片

技术领域

本发明属于硬脑膜补片领域，尤其涉及一种可降解人工硬脑膜生物复合补片及其制备方法。

背景技术

硬脑膜（Dura, Dura Mater）是一厚而坚韧的双层膜；外层是颅骨内面的骨膜，仅疏松地附于颅盖，特别是在枕部与颞部附着更疏松，称为骨膜层。但在颅的缝和颅底则附着更牢固，很难分离。颅内无硬膜内腔。硬脑膜内层较外层厚而坚韧，与硬脊膜在枕骨大孔处续连，称为脑膜层;主要作用是保护大脑；创伤或颅脑手术可造成硬脑膜缺损，需要通过手术，采用硬膜补片来修补硬脑膜，封闭硬脑膜下腔，这样可明显减少或预防脑脊液漏、颅内感染等并发症。

理想硬脑膜补片应具备下列条件：①具有安全性，无毒性，无感染性，②组织相容性好，无免疫排斥反应。③致密性好，无渗透性，能防止脑脊液漏，保护脑组织。④具有韧性，易牢固缝合。⑤能促使硬脑膜再生，不发生粘连。⑥使用方便，手术简单，易于消毒灭菌。⑦取材广泛，价格低廉。⑧具有稳定生物学特性，不引起急慢性炎症反应。

目前应用较多的硬脑膜修补材料主要是异种去细胞基质，这类天然生物补片，也称为去细胞组织补片，补片初始原料主要来源于动物小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜、腹膜及真皮等组织；通过一系列加工处理，包含重要工艺，如去细胞、去DNA，去α-Gal抗原等免疫原成分。这种方法获得的去细胞基质材料，一方面能够保留三维立体结构，同时也含有一些重要活性成份。由去细胞基质制备而成的理想生物补片，应具有良好的生物适应性，可降解性、可吸收性；力学强度适宜性，无毒性，无免疫性；能够为宿主细胞的趋化、附着、增殖、分化提供理想的空间支架和适宜的微（营养）环境，有利于靶组织的结构修复和功能重建。

关于补片的力学性能，临床上多使用源自商品肉畜的心包、腹膜或胸膜、肌腱、小肠系膜等作为硬膜生物补片的最初原料。实际应用中，这类补片在力学性能上，常达不到硬膜补片的力学要求；因此在制备硬膜补片过程中，常采用以下二种方法来增强补片力学性能，达到韧性好、拉伸强度高的要求。

一是：化学（生化）方法，使用环氧化物或戊二醛等化学交联剂，以提高补片的生物力学特性。如公开的CN108261565和CN105999411的专利，这两篇专利为了达到补片在力学上的要求，都使用了交联剂；其缺点是交联程度很难控制，残留的交联剂有潜在的细胞毒性，且这类交联型补片通常力学性能好，抵抗力强，不易降解或降解缓慢，降解与组织再生不能同步匹配，易导致纤维化、慢性炎症等不良反应；广东某公司的硬脑膜补片，采用心包膜或胸膜经环氧交联处理等加工而成，补片力学强度够，但降解较慢，可导致纤维化、慢性炎症反应、存在与颅骨或脑组织粘连等风险；且因其较硬，无法与脑组织表面完美贴合。

二是：物理方法，如将单层片横向或纵向，多层交叉部分重叠放置，如CN106039404A和CN109248339A的专利文献，其创新点是将补片原料制成细条状后捻成线，再通过编织的方式制成补片；经编织而制成的补片，其拉抻强度得到提高，但是此步骤需要先将补片原料制成细条，再通过编织方式制备，技术上有点难度，步骤上有点复杂。

专利CN201910805146.6，一种硬脑膜生物补片及其制备方法，采用种畜组织作为去细胞的原料，成功地制备了力学性能较好的硬脑膜补片，但是这类硬脑膜补片，由于具有良好的天然交联度，相对来讲，其降解速度会较慢，特别是手术后的第一时间或康复早期，这类补片难以有效降解，一方面，补片中的各类细胞活性因子（VEGF，FGF）以及有效活性成份（GAGS等），难以及时有效的释放出来，从而尽早起到应有的诱导细胞趋化、分化和生长的作用；另一方面，这类补片无法及时有效地提供富有价值的次级代谢产物（胶原降解后的各类活性肽），不利于快速地新陈代谢和受伤组织的再生；最后，由于这类硬脑膜补片，通常难以快速降解或分解，进而导致宿主细胞，也就无法在脑部原位进行快速、有效地生长、增殖和复制；从而难以促进、受损硬脑膜组织的修复与再生，这对病人开颅手术后的脑膜修复与脑部功能康复，以及身体全面恢复，并不具有积极作用。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有硬脑膜补片中的一些不足和缺陷，进行仔细分析，根据多年工作经验，将理论与实践密切结合，出人意料但又在情理之中，巧妙又方便地解决了现有硬脑膜补片的不足。

本发明的第一目的是，提供一种硬脑膜复合补片，这类补片能较快有效释放细胞活性因子（成纤维细胞生长因子(FGF-2)，转化生长因子（TGF-β）和血管内皮细胞生长因子(VEGF)，以及有效活性成份（GAGS，如硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸等），同时补片仍具有良好的生物力学性能。

本发明的第二目的是，提供一种硬脑膜复合补片，不仅具有良好的力学性能；而且这类补片能较快地被宿主降解或分解，在术后第一时间里，就能提供富有价值的次级代谢产物，如胶原蛋白降解后的各类活性肽（如含GRD）；有利于宿主原位组织，快速地新陈代谢和组织的重建与再生；同时因为补片快速降解或分解，进而便于宿主细胞在脑部原位进行快速、有效地生长、增殖和复制；有助于受损硬脑膜组织的修复与再生，这对病人开颅手术后的脑膜修复与脑部功能康复，以及身体全面恢复，并不具有积极作用。

为了实现本发明目的，发明人的发明构思是制备一种硬脑膜复合补片，异构补片，至少由二层构成（D层和T层）；D层代表离地近的一层，在本专利中指的是，硬脑膜补片中，与蛛网膜、软脑膜等组织处接触的一层，其主要起诱导组织再生、新血管生成，促进成膜组织细胞生长的作用；所述D层，其原料来源是幼畜动物的结缔组织。

T层，代表离天近的一层，在本专利中指的是，与脑颅骨、与脑骨膜接触的一层，其主要作用是作为力学支撑，起防止脑积液渗漏的作用；可以是具有良好力学性能的天然生物可降解材料、合成生物可降解材料之一或其组合，所述合成生物可降解材料为聚氨基酸、聚己内酯，聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚乙二醇、聚氨基酸之一或其组合物。所述天然生物可降解材料是种畜动物的结缔组织。

本发明产品的第一创新点，就在于复合补片中D层，其去细胞的动物组织，不是常规的来自屠宰场的商品级肉畜，而是直接在养殖场里选用幼畜，如选择新生犊牛（出生体重15--40公斤）、断奶后已饲养1-8周的仔猪，此时仔猪生长速度很快，消化吸收能力强、可塑性大、饲料利用率高；这提示幼畜组织的细胞生长因子和生物活性成份（如HA）相对含量（按干物质百分比计算），要比已达出栏重的商品肉畜或高许多；同时幼畜其组织再生能力强，损伤愈合时间短，创面愈合率高，这也可以充分佐证幼龄动物组织中的细胞生长因子和生物活性成份含量高或活性强；

去细胞的幼畜组织为，断奶仔猪的小肠粘膜下层（SIS）、膀胱（UBM）、胃粘膜下层、真皮、心包膜、脑膜、腹膜、筋膜及实质脏器膜中的一种或多种组合；并且采用温和的方式去细胞，如植物源性去细胞试验，这类去细胞基质，能够保留较完整的ECM立体结构和ECM中较多的有效活性成分（如HA），这类嫩组织非常敏感，对去细胞试剂的要求很高，不仅要考虑试剂类型，工作浓度，作用时的温度，处理的时间长短；总之条件要温和，方法要恰当，可以获得较完好的天然立体三维结构和保留更多的活性成份。

本发明的灵感是来自，发明人对幼龄动物组织生长速度特别快，这一特点或优越性能的充分认识；在幼龄阶段，其各组织的生长速度正处于一生中的旺盛阶段；这一公认的事实，足以直接提醒我们在幼龄动物的各组织中，其细胞生长因子和生物活性成份（（如透明质酸HA和纤连蛋白FN）相对含量（按干物质百分比计算）或有效活性，明显比已达到成年的或者是已初步发育好的相应动物组织高许多，多一倍或数倍，且的确已有国外相关文献报道（Breen,M.,Weinstein, H.G.,Blacik, L.J.,Borcherding, M.S., and Sittig,R.A. Microanaly and characterization of glycosaminoglycans from human tissuevia zone electrophore. In Whistler, R.L., and BeMiller, J.N.,eds. Methods inCarbohydrate Chemistry, Vol 7. New York: Academic Press,pp.101-115）。幼畜其组织再生能力强，损伤愈合时间短，创面愈合率高，这也可以充分佐证幼龄动物组织中的细胞生长因子和生物活性成份含量高或活性强。

优选幼畜组织，特别是仔猪的小肠粘膜下层作为，制备去细胞复合补片中D层，其优势主要体现在以下几点：

一：幼畜组织中，含有丰富的胶原蛋白和透明质酸；这对新血管和基膜的形成具有明显的促进作用；无论是什么原因造成的伤口或破损，都能够更好地促进受损处的组织修复；幼畜组织再生能力强，含有更高含量的生物活性成份和细胞生长因子，如透明质酸HA（按干物质计算）；更有利于组织的快速再生和创面的迅速愈合；暴露在外的组织损伤，若不能及时愈合创面，则更易发生感染和炎症，进而更加难以愈合和功能的全面恢复。

二：因为新生幼畜有一种现象fetal maternal microchimerism，即母畜怀孕时，通过胎盘，母亲的细胞向胎儿转移，胎儿的细胞向母体转移的现象。现有研究表明这种现象有助于创面的愈合。详见Dany Nassar, Kiarash Khosrotehrani and Selim Aractingi2012年发表的文章《Fetal microchimerism in skin wound healing》以及，其他人2014年发表的文章《Microchimeric fetal cells play a role in maternal wound healingafter pregnancy》。新生幼畜体内组织中，含有母畜产生的外泌体(Exosome)一种由细胞（免疫细胞、神经细胞、干细胞）分泌而来的微小囊泡；母畜通过血液、唾液、母乳等体液中，将外泌体传至新生幼畜体内，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，外泌体可通过细胞膜受体，直接激活受体细胞，也可运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，甚至细胞器进入受体细胞，参与细胞间通讯。外泌体在免疫应答、炎症反应、血管生成、凋亡、凝血等生理过程发挥关键作用，不同细胞来源的exosome所含有的RNA和蛋白成分不尽相同。

三：小肠粘膜下层（SIS）的成份构成，以I型纤维胶原蛋白为主，同时还含有III、IV、VI型胶原蛋白，特别是其中含有重要的IV型胶原蛋白，对新血管和基膜的形成具有明显的促进作用；同时依据美国STEPHEN F. BADYLAK的多篇文章表明SIS补片的降解产物具有较强的抗菌活性，有类似于猪防御素（porcine defensin, pBD-1）的功能；以及GeorgeS.Hussey 2018年的文章《Extracellular Matrix Bioscaffolds for BuildingGastrointestinal Tissue》报道SIS补片降解产物还具有诱导细胞趋化和有丝分裂的作用。

本发明产品的第二个创新点，就在于去细胞复合补片中T层，其动物组织原料的选择，不是现在大家使用的商品级肉畜，而是选用种畜，优选的是因繁殖性能有所下降，从而被淘汰的健康种母畜和种公畜，特优选淘汰的母畜；例如去细胞的真皮、腹膜和SIS膜，种猪源的膜都要比商品肉猪源的膜，其生物力学性能要好得多，韧性也更好；这个在专利CN201910805146.6中，已有明确叙述，源自经产母猪和商品肉猪所制备的同类组织的两种去细胞膜或补片，这两类材料的力学性能，有较大的明显差异，经产母猪源去细胞膜，其力学性能，要比商品肉猪源去细胞膜要强许多。

发明原理：

本发明的复合补片D层原料来源是幼畜，主要原因有以下二点：

一：幼畜组织生长速度特别快，其各组织的生长速度正处于一生中的旺盛阶段；这提示幼畜组织的细胞生长因子和生物活性成份（如HA和FN）相对含量（按干物质百分比计算），要比已达出栏重的商品肉畜或已初步发育好的肉畜高许多；幼畜其组织再生能力强，损伤愈合时间短，创面愈合率高，这也可以充分佐证幼龄动物组织中的细胞生长因子和生物活性成份含量高或活性强；

二：幼畜组织及其制备的生物材料，因其先天固有的结构特性（如天然交联程度低，结构较疏松）和发育特点，相对要比已达到出栏重的肉畜组织源其生物材料，其结构相对疏松，幼嫩，从而更有利于宿主成纤维细胞的浸入、生长和繁殖；更容易被降解与吸收，更有利于创面组织中新生血管的形成和肉芽组织的生成。

另外，在本发明中，去细胞试剂之所以选用植物源皂素，主要是因为这是一类天然的非离子型表面活性剂，其去细胞的方式针对性强，主要是通过破坏脂质细胞膜和细胞器膜，正因为作用方式针对性强，对其他成份几无破坏，不会影响功能蛋白的活性发挥和结构蛋白的稳定性，对ECM结构无损伤无破坏；这对组织的良好修复非常关键；而原料在采用植物皂素去细胞后，所留下来的ECM立体结构，正好可以成为组织修复所期盼的支架；同时采用温和的植物源皂素去细胞，不会引起ECM中有效成份（如透明质酸HA等）和细胞生长因子（如成纤维细胞生长因子FGF）等的流失和破坏；相比于其他化工类或半合成类去污剂而言，同样都能达到有效地去净细胞及细胞残留物的效果，但植物源皂素作用方式独特且温和，使用这类植物源皂素去细胞，能保存较完好ECM空间立体结构和保留更多ECM中的有效成份，例如透明质酸；采用本发明方法中的去细胞试剂，要明显与化工类去污剂去细胞，能保留更多的细胞生长因子和生物活性成份，含量更高，活性更强。

本发明的方法中，去细胞试剂选用植物源非离子型表面活性剂，优选植物源皂素，这类试剂去细胞的方式针对性强，主要是通过破坏脂质细胞膜和细胞器膜，作用方式针对性强，对ECM结构无损伤，不会引起ECM中有效成份（如糖胺聚糖）的流失；相比于其他化工类或半合成类去污剂而言，都是去细胞效果彻底，但植物源皂素作用方式独特且温和，使用这类植物源皂素去细胞，能保留更多ECM中有效成份；如采用本发明方法制备的生物膜，与化工类去污剂去细胞制备的生物膜相比，其生物膜中生物活性成份（如HA）含量要高。

本发明的复合补片T层，其原料来源是种畜，如已产过几胎的母猪，饲养时长通常超过24个月；正常，母猪每年产2--2.3胎，母猪妊娠期平均是114天,空怀期为10--15天,哺乳天数为21—28天；淘汰母猪主要是因为繁殖性能下降，如产仔数少，产弱仔多，难配种或者奶水少，断奶窝重轻等因素，通常淘汰母猪，其饲养月龄达到40个月以上；相对于商品肉猪而言，经产母猪各方面的组织和器官发育都很完全，在亚器官水平和结构、介观和微观性能、组织学强度等指标上实现了真正意义上，充分且全面地成熟；进一步从分子水平和分子结构上来讲，可能胶原蛋白羟基化程度高，三螺旋结构稳定性更好，胶原间天然交联度高，稳定性较好，耐酶降解能力强，同时也具有更好的韧性；而现在的膜原料来源都是商品肉畜如肉猪，其通常饲养周期短，只有5-6个月时间，其出栏体重90—120公斤，相对于经产母猪（包括淘汰母猪180--200公斤）的体重和大小而言，商品肉猪的体重是明显偏轻的，其体积是偏小的；而且商品肉猪在屠宰出栏时，其饲养时长只有5--6个月，而经产母猪的饲养时长达至少在12个月以上（按只生了一胎仔窝计算），淘汰母猪则会达到40个月；饲养时长是出栏重商品肉猪（体重90—120公斤）的2到8倍；同时商品肉猪的各组织器官，相对经产母猪而言，只是表面初具规模，框架结构成形，但实际上其内部结构、微观性能、组织学强度等指标，并没有真正彻底地充分且全面地成熟，进一步从分子水平和分子结构上来讲，可能胶原蛋白羟基化程度低，三螺旋结构稳定性差，胶原间天然交联度低，不能有效抵抗（胶原）酶的降解；稳定性也相对较差。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

1.本发明的硬脑膜复合补片中其D层，其为去细胞的幼畜组织源膜，含有更高含量的透明质酸HA和细胞生长因子，并且更易从补片中释放出来、能明显促进凝血、促进创面组织相关细胞的再生；

2.本发明的硬脑膜复合补片中的D层，其为去细胞的幼畜组织源膜，相对质地较为疏松多孔，各类细胞容易长入，也相对较容易降解，这也就叫意味着更容易吸收和有效利用，优先降解，尽早发挥促再生作用；

3.本发明的硬脑膜复合补片中T层，可以为去细胞的种畜组织，而不是源自商品肉畜，具有更好的天然交联度，有更好的力学性能，可以更有效地防止脑积液渗漏；同时T层降解慢，后期也有活性代谢产物不断释放，与期望的持久发挥作用相吻合；有利于新脑膜组织的充足再生；

4.本发明的技术方案中，可以没有使用蛋白消化酶及化工去污剂，使用温和的植物皂素去细胞，不会对ECM中胶原蛋白结构和生物活性因子产生明显损伤和破坏，能够保留较完整的细胞外基质三维立体结构；特别是D层具有更好的诱导宿主细胞长入功能，在新组织长入的同时，D层膜自身随之降解并被吸收；

5.本发明的技术方案，可采用植物皂素作为去细胞试剂，不使用合成类试剂去细胞，无化学残留，安全无副作用；

6.本发明的硬脑膜复合补片，没有使用任何的交联剂和合成类去污剂残留，不会有潜在细胞毒性，不会导致纤维化、慢性炎症；

7.本发明的硬脑膜复合补片中的D层和T层，都可以完全降解吸收，D层降解较快，能第一时间就促进血管化、以及成硬脑膜组织细胞的生长，有助于脑膜组织的再生。T层降解较缓慢，能持久不断地发挥作用，能让新生组织安心地、高质量地生长，以充分保障，再生脑膜的坚固性和稳定性。

为了实现本发明的目的，发明人提供了一种用于硬脑膜复合补片，这类复合补片至少含有两层（T和D层），D层与脑软组织直接接触，T层与脑颅骨直接接触；T和D层都是由结缔组织去细胞、去抗原后加工而成；源自幼畜的D层含有更多生物活性因子,诱导组织再生能力强，且该层柔和度好，能与柔嫩脑软组织面更好吻合；源自种畜的T层有优异的天然交联度，具备更好的生物力学性能（韧性好）。这类补片既有良好促组织再生功能，又具有良好力学性能，防脑积液渗漏；同时完全降解吸收，D层先快降解，T层后慢降解，符合硬膜组织再生的自然规律，降解产物无任何毒副作用。

本发明具体是通过以下技术方案来实现的；先分别制备D层和T层，所述D和T层都是对新鲜动物源组织，先进行预处理、然后采用包括脱细胞等在内的去抗原工艺处理加工，然后将制备的D和T层，按需要层数进行复合，再干燥、灭菌、包装而成。

制备D层，其去细胞的动物组织原料，是源自幼畜，而不是选用已达到出栏重的商品肉畜。

进一步的，所述幼畜包括未出生但足月的胎畜，足月的、刚出生的、吃奶阶段的，以及断奶后进入保育阶段的幼龄哺乳动物；所述哺乳动物为猪、牛、羊、马，骆驼、驴、犬、兔。

进一步的，优选幼畜为断奶后饲养2--8周的猪、牛、羊、马、骆驼、驴、犬、兔；优选10—30公斤的保育猪。

进一步的，所述去细胞的组织原料，包括小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、心包膜、脑膜、羊膜、腹膜、真皮、肌腱、韧带、筋膜、骨膜中的一种或其组合。

进一步的，优选的幼畜组织为保育猪小肠粘膜下层、新生犊牛真皮之一或其组合。

进一步的，所述D层膜是经清洗、去杂、消毒、脱脂、去细胞、去DNA，以及进一步定型、干燥、灭菌等步骤加工而成。

其中，制备T层，T层由天然生物可降解材料、合成生物可降解材料之一或其组合，所述合成生物可降解材料为聚氨基酸、聚己内酯，聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚乙二醇、聚氨基酸之一或其组合物。

进一步的，所述的天然生物可降解材料，为含有去细胞的成年种畜组织，而不是源自已达到出栏重的商品肉畜。

进一步的，所述成年种畜包括种猪、种牛、种羊、种马、种驴、种骆驼、种犬、种兔等。

进一步的，优选成年种畜为经产的母猪、母牛、母羊、母马、母驴、母驼、母犬、母兔等。

进一步的，优选成年种畜为因繁殖性能下降而被淘汰的母猪、母牛、母羊、母马等。

进一步的，所述去细胞硬脑膜复合补片的原料，包括小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、心包膜、脑膜、羊膜、腹膜、真皮、肌腱、韧带中的一种或多种原料的组合。

进一步的，优选的动物组织原料为淘汰母猪的腹膜、真皮或小肠粘膜下层中的一种或多种原料的组合。

进一步的，所述T层膜是经清洗、去杂、消毒、去脂、去细胞、去DNA、以及还可以定型、干燥等步骤加工而成。

最后将已制备好的D和T层，按实际各自需要的层数，进行复合，再进行干燥、灭菌、包装而成。

另外，如果需要的话，可视情况，为了提高复合补片中的活性成份的含量或者是为了达到医学上预防或治疗的目的，可以在补片上，额外加载相应的各类药物，如生物活性因子、抗生素、抗癌药、消炎药。

另外，还可以选择的是，在此复合补片的基础上，采用非醛类试剂如植物源试剂（如单宁等）和或其他物理方法，对D层和或T层进行交联方法处理。

本发明的硬脑膜复合补片的D层和T层的详细制备方法，进一步还包括如下步骤：

1)预处理：取相应动物的结缔组织，充分洗净；机械刮除其中非结缔组织，并扔弃；将靶组织冲洗干净，置于弱酸溶液中浸泡，得到预处理待用膜原料；

2)预消毒：用含过氧乙酸和乙醇的混合溶液，在超声及室温条件下，浸泡膜原料，进行消毒；再用纯化水超声清洗；

3) 去脂：使用乙醇溶液，在超声、常温条件下浸泡膜原料，之后用注射用水超声清洗；

4) 去细胞：用含植物源非离子表面活性剂溶液，在低温和超声下浸泡膜原料；

5)去DNA：含DNA酶的水溶液浸泡膜原料，浸泡温度为36℃，浸泡时间为15--40分钟；清洗后，还可以使用含α-半乳糖苷酶溶液，浸泡膜原料，时间为15--40分钟；

6)进一步，还可以使用弱碱水溶液，常温超声条件下，浸泡膜原料；再用PBS清洗直至中性；待进一步加工处理。

进一步具体操作方法是：

1.预处理：分别取幼畜小肠粘膜下层、新生犊牛真皮（制备D层用），种畜真皮、小肠粘膜下层（制备T层用），充分洗净；机械刮除除去非需要的组织，主要留下胶原结缔组织，置于醋酸溶液中浸泡，浸泡时间30--120分钟，小肠粘膜下层与醋酸溶液的比例为1:5--1:10；得到预处理待用膜原料；

2.预消毒：用含有过氧乙酸和乙醇的混合溶液，在超声及室温条件下，浸泡D层或T层膜原料，进行消毒；过氧乙酸浓度为0.5-1.5％，乙醇浓度为15-25％，D层或T层膜原料与混合水溶液的比例为1:5--1：10，浸泡时间为30--120分钟；再用纯化水超声清洗；

3.去脂：使用乙醇溶液，在超声、常温条件下浸泡D层或T层膜原料，乙醇浓度为90-100%，D层或T层膜原料与乙醇比例为1:5--1:10，常温浸泡时间为0.5--6h；之后使用注射用水超声清洗；

4.去细胞：使用含植物源皂素溶液，在4-15℃和超声下浸泡D层或T层膜原料10—60分钟；D层或T层膜原料与溶液的比例为1:10（W/V）；之后用同浓度新鲜皂素溶液对D层或T层膜原料浸泡5--60分钟；接着用PBS-EDTA进行浸泡10--60分钟；重复去细胞1-5次；

5.去DNA：含DNA酶的水溶液浸泡D层或T层膜原料，浸泡温度为36℃，浸泡时间为15--40分钟；若是猪源组织，还可以选择，在清洗后再用含α-半乳糖苷酶的水溶液，浸泡D层或T层膜原料，浸泡时间为15--40分钟；

6.使用10mM NaOH水溶液，常温、超声条件下，浸泡D层或T层膜原料；再用PBS超声清洗直至中性；

进一步的，在去细胞工艺（步骤4）中，优选以下技术参数：

皂素溶液中有效皂素的含量为0.05---1%（W/W），D层或T层膜原料与植物源皂素溶液的比例为1:5---1:10，在超声条件下，于低温4—10℃条件下浸泡20--60分钟；然后用同浓度的新鲜皂素溶液对再D层或T层膜原料浸泡5--45分钟；接着用PBS-EDTA进行浸泡10--45分钟；重复去细胞1-2次。

进一步的，在去细胞工艺（步骤4）中，更优选，以下技术参数：皂素溶液中有效皂素的含量为0.25--0.5%（W/W），D层或T层膜原料与植物源皂素溶液的比例为1:10，在超声条件下，于低温4℃条件下浸泡20--40分钟；

进一步的，植物源表面活性剂是指植物源三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其组合物；

进一步的，植物源三萜烯皂素是Quil-A来源、茶皂素之一或其组合物；

最后一步，将1、2、3、4、5层的半成品D与1、2、3、4、5层的半成品T，按所需层数和大小，如将1、2、3、4层D与4层T重叠组合DT34，按3cm*6cm 、4cm*6cm 、5cm*6cm大小进行裁切加工，接着固定于模具上，再干燥、包装、辐照灭菌，可得成品，硬脑膜复合补片。同时，在D和T层之间，还可以按需要，配置1-5层相同大小的其他可降解生物材料，如提纯的胶原膜，静电纺膜等。

中英文术语/名词

在本专利中所涉及的中英文名词术语中，除非已经在公知常识中，得到大家普通认可、毫无异议、已完全达成高度共认的内容之外，术语及其衍生物的含义内容，首选按下列文字说明来理解和解释，并可作适当扩张性解释与说明除非另有详细说明，其他名词术语按本领域普通技术人员水平来理解其含义。

特别注明，自定义术语D层和T层。

D层：代表离地近的一层，在本专利中指的是，硬脑膜复合补片中，与蛛网膜、软脑膜等组织接触的一层，其主要起诱导血管生成，促进成硬脑膜组织细胞生长的作用，为去细胞的幼畜组织。

T层：代表离天近的一层，在本专利中指的是，与脑颅骨、与脑骨膜接触的一层，其主要作用是作为力学支撑，起防止脑积液渗漏的作用，为去细胞的种畜组织。

第一部位：与硬脑膜相关的名词。

1.脑膜(Meninges)：指的是颅骨与脑间有三层膜，由外向内，依次为硬脑膜、蛛网膜和软脑膜，三层膜合在一起，称脑膜。

2.硬脑膜（Dural Mater）：是一厚而坚韧的双层膜，硬脑膜的外层，是颅骨内面的骨膜，仅疏松地附于颅盖，特别是在枕部与颞部附着更疏松，称为骨膜层，硬脑膜的骨内膜层，经颅缝和孔与骨外膜相续，并经眶上裂与眶骨膜相延续；硬脑膜的内层，较外层厚而坚韧，与硬脊膜在枕骨大孔处续连，称为脑膜层，硬脑膜的脑膜层向内褶叠形成4个隔，把颅腔不完全地分隔为相通的间隙以容纳脑的各部；主要作用是保护大脑软组织的作用。硬脑膜的外面粗糙并有纤维，而其内面光滑。

3.硬脊膜（Meningeal）：由致密结缔组织构成，厚而坚韧，形成一长筒状硬脊膜囊；上方附于枕骨大孔边缘，与硬脑膜相续，向下在平第2骶椎高度形成一盲端，并借终丝附于尾骨。硬脊膜囊内有脑脊液，脊髓和31对脊神经根，每对脊神经根穿硬脊膜囊时，被包被形成神经外膜，并与椎间孔周围的结缔组织紧密相连，起固定作用。

第二部位：与硬脑膜复合补片产品，相关的名词和技术名称。

1)组织复合补片、组织再生材料、生物生物膜、生物修生物膜、生物支架、可降解生物膜、可吸收生物膜Bio-Mesh、Bio-Patch、Patch、Bioscaffold，ECM膜，这些个中英文名词或术语，表面上虽有不同，但其目的和用途基本是一样的；除非有特殊的具体说明，否则上述几个名词的内涵，在实质上是等同的。

2)细胞外基质ECM（Extracellular Matrix）：是存在于所有组织和器官中的非细胞成分，其不仅对细胞组织提供必需的物理支撑，为各种细胞的正常生理活动，提供适宜的场所及微环境；而且对组织的形态发生、细胞的趋化和分化，以及重要的生理生化和生物力学等方面，起到重要的杠杆调节作用，从而影响或调控组织和器官的功能。细胞50%的功能是由细胞外基质所营造的外部微环境所决定的。

3)组织衍生细胞外基质材料(extracellular matrix，ECM)是由同种异体或异种的组织经过脱细胞技术的处理而获得，其基础与应用研究在组织工程与再生医学的研究领域已逐渐成为研究热点。脱细胞组织的细胞外基质支架材料是在有效去除天然组织中具有免疫原性的细胞成分的基础上，最大限度地保留了其天然发生的内部三维支架结构以及结构中的结构蛋白成分(包括胶原蛋白、弹性蛋白等)、特殊蛋白成分(包括纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤蛋白等)、蛋白聚糖成分(包括糖胺多糖、硫酸肝素、软骨素)和各种各样的生长因子成分，这些组织特有的内部结构和天然成分都是人工合成材料所无法完美复制的。

4)细胞外基质的物质组成：是以结构蛋白，如胶原蛋白（Collagen）、弹性蛋白(Elastins)、纤丝蛋白等大分子成份为主要框架结构，并附着了一些功能蛋白如纤连蛋白FN(Fibronectins)、层连蛋白LN (Laminins)等；同时其中还携带有各类细胞生长因子(如成纤维细胞因子FGF、转化生长因子TGF、血管内皮生长因子VEGF；可能也含有极少量但很重要的表皮生长因子EGF和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)另外细胞外基质中还含有糖胺聚糖（GAGs）类、蛋白聚糖等活性成分。

5)硬脑膜复合补片、硬脑膜再生补片、硬脑膜胶原膜、硬脑膜生物修复片、硬脑膜天然生物膜、人工硬脑膜修复材料，可降解硬脑膜生物膜，可吸收硬脑膜、硬脑膜再生材料、硬膜（简称），前述这些术语或名词，在本专利中，除非另有详细的说明与解释之外，可以理解为实质相同或等同，其主要成份都是胶原蛋白（大于50%以上），统一归口属于硬脑膜补片。

6)硬脑（脊）膜补片是指用于硬脑膜和/或硬脊膜缺损、暂时或永久性修补的片状材料类产品。材质涵盖聚四氟乙烯/聚氨基甲酸酯类等不可吸收合成材料、合成生物可降解材料（如聚乳酸/聚己内酯等可吸收合成材料）以及天然生物可降解材料，包括提纯胶原蛋白质类材料、脱细胞（动物源性组织）ECM材料二类，其进一步ECM材料，包括同种异体、同种同体，异种动物等不同来源。

7)硬脑膜胶原膜类产品，按成分或工艺分为三类：①脱细胞基质膜（ECM膜）、②非脱细胞基质膜（非ECM膜）、③混合型膜（结构组成上，既有ECM，又有非ECM膜）；非ECM膜又可分为二类，一类是纯化后的胶原膜（以I型胶原蛋白为主），这些多是取自动物的肌腱、真皮、腹膜、小肠粘膜下层等结缔组织，通过特定的处理技术提取出纯I 型和或III型胶原蛋白，再通过冷冻干燥等制成一定结构的膜片；另一个类是非纯化胶原蛋白膜，这些胶原膜，可以复合其他物质，包括不限于，可降解的聚合物或高分子物质，如聚乳酸类、壳聚糖类等，以及采用其他方法制备（如静电纺丝等），并且可以使用其他添加物（添加交联剂，改性剂、保护剂，抗菌剂、无机矿物质等，以赋予或增强口膜材料一定的性能；通常胶原蛋白主要是I型胶原蛋白、III型胶原蛋白或其混合物；胶原蛋白还可以包括一定比例的II型、IV型、VI型或VIII型胶原蛋白或其任何组合或任何胶原蛋白类型。

8)脱细胞ECM组织原料：包括但不限于来自，如猪、牛、马、羊、驴、驼、犬、兔等养殖的哺乳动物，取其小肠粘膜下层(SIS)、腹膜、心包膜、羊膜、真皮、韧带、肌腱、SIS、膈肌(胸膈)、网膜、肌肉或器官的筋膜；通过成熟工艺去脂、去抗原、去DNA，所获得的生物材料，主要含有I型胶原蛋白，同时来自部份组织的，ECM也可以含有小于50%弹性蛋白。

9)小肠粘膜下层SIS（Small Intestinal Submucosa)，小肠组织包括空肠和回肠部分，在除去小肠粘膜层、肌层、浆膜层后所剩余的部分，以胶原蛋白为主要成份，约占80%以上。

10)糖胺聚糖GAGs（Glycosaminoglycan）：也称粘多糖，为杂多糖的一种，主要存在于动物结缔组织中，是参与组织及软组织组织等正常生理活动的重要原料；按单糖残基、残基间连键的类型以及硫酸基的数目和位置，糖胺聚糖可分为5个主要类别，透明质酸（HA)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)、硫酸乙酰肝素和肝素(HP)。糖胺聚糖在调节细胞生长因子的稳定性、活性等方面发挥重要作用；糖胺聚糖具有粘滞性，单独或与蛋白结合后，对细胞/组织具有良好的润滑和保护作用；糖胺聚糖具有抗血凝功效，也具有促进创伤愈合的作用；糖胺聚糖中肝素能抑制血小板聚集和血小板生长因子的释放，抑制血栓和瘢痕组织的过度形成；糖胺聚糖可调节阳离子在组织中的分布，使基质发挥持正常的生理功能。

11)透明质酸(HA)：也有学者称为玻尿酸（Hyaluronan），又称糖醛酸、一种天然的线性多糖，是由葡萄糖醛酸和N-乙酞氨基葡萄糖的二糖单位反复交替连接而成的直链均聚糖，为阴离子型聚合物，与其它粘多糖不同，它不含硫。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进细胞增殖、促进组织再生、创伤愈合；在全身所有的组织和体液中均含有透明质酸，是细胞外基质中非常重要的活性成份。

12)去细胞基质ACTM（Acellular Tissue Matrix）或无细胞组织基质：是指采用特定的试剂和处理方式，将动物器官或组织中的细胞、病毒、DNA等会产生免疫排斥反应的成分充分地去除或灭活，最大限度地保留原有天然立体结构的完整性，以及尽量保留原有基质中的细胞生长因子和活性功能成份；脱细胞基质由于其天然立体三维（3-D）结构、含有生物活性因子、能够被受体降解、易诱导受体干细胞移（易）位分化等特点，被广泛应用于临床中，用于组织的修复和再生（先天缺损和后天创伤）；脱细胞基质是新型的组织再生补片，具有良好的生物支架性能。

第三部位：与动物及动物组织相关的名词和技术名称。

(一) 种畜：是针对商品肉畜而言的；饲养的主要目的是用来繁育幼畜的，而不是作为商品肉畜来短期饲养的；饲养商品肉畜主要目的是用于长肉，以供人食用，以提供动物源蛋白质；本专利中的种畜，包括猪、牛、羊、马、驴、驼、犬、兔；所述种畜都是成年的，能繁能育的；例如种猪包括母猪和公猪，这里的母猪是指能繁殖的成年母猪，不包括年轻的后备母猪。

(二) 经产母畜：属于种畜的一部分，是至少生过一胎的母畜；是相对于后备母畜而言的，后备母畜主要是指因为年龄或月龄还没有到，还没有怀过孕的的年轻母畜。

(三) 淘汰母畜：本属于种畜的一部分；在养殖场里，管理者考虑到，当母畜繁殖性能下降到一定程度，如产仔数少，泌乳量低，断奶窝重轻，以及综合考虑母畜栏的利用率、淘汰母猪的价格等多种因素；从经济学角度来判断分析，认为继续饲养该母畜所获得的价值已显著降低，淘汰这类母畜会更加划算；每个养殖场对淘汰母畜的评判标准存在一定的差异；例如通常母猪在分娩8胎之后会渐渐地被淘汰；不同品种的猪之间略有差异。

(四) 幼畜：指通常指包括刚出生，吃奶、断奶、以及未到初情期之前的家畜，幼畜正处于发育阶段，其生长发育十分迅速，从生理机能到体况都与成年家畜有着很大的不同，幼畜包括已经断奶但未尚未发育的家畜，还包括处于吃奶阶段的和刚出生的家畜；不包括已经发育成熟或发育快结束的家畜。

(五) 保育猪：是指仔猪断奶后（4周左右断奶）至70日龄左右的仔猪；商品肉猪的饲养分三个阶段，即1、哺乳仔猪（产房内），2、保育猪（保育舍内,断奶到70日龄），3、生长肥育阶段（70日龄到肉猪出栏，此时日龄达到160--180日龄，毛重约100公斤左右）。

除非上下文有清楚的说明，本说明书和所附权利要求中用到的单数形式“一个和“该”包括复数含义。因此，例如，“该方法”包括一或多种方法，和/或步骤，它们属于本文所述类型和/或是本领域技术人员阅读了本文后很明显能认识到的。术语“约”或“接近”是指统计学意义上的范围值，范围可以是在一个数量级之内，通常在指定数值或范围的50％以内，进一步指在20％以内，还更通常在10％以内，甚至更通常在5％以内。术语“约”或“接近”所涵盖的能允许的变化取决于研究的具体体系，是本领域技术人员可以很容易地认识到的。

下面结合具体实施例，以进一步描述本发明的原理和方案；应当理解，这些实施例只是为了举例说明和方便理解本发明的思想，但不能局限于此；实施例并非以任何方式来限制本发明范围，以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

具体实施方式

实施例一：D层制备，脱细胞SIS（保育期结束的仔猪）

具体步骤如下：

1.取材和预处理；挑选保育期结束仔猪（日龄为60天，体重约22公斤），将其屠宰，选取的原材为新鲜小肠中的空肠段，使用机械刮除法除去小肠空肠的粘膜层、肌层、浆膜层、淋巴结等，得到小肠粘膜下层（SIS）；将分离出的SIS，置于0.8%醋酸溶液浸泡25分钟，幼猪SIS与醋酸溶液的比例为1:6，再使用纯化水浸泡，得到D层膜原料；

2.消毒：使用含有1.0％过氧乙酸和15％乙醇的混合水溶液，D层材料与混合水溶液的比例为1:10，超声条件下，室温浸泡100分钟，进行消毒。之后使用纯化水超声清洗3遍；

3.脱脂：使用浓度为90%的乙醇，D层材料与乙醇的比例为1:10，超声条件下，常温浸泡2h；之后使用注射用水超声清洗3遍；

4.去细胞：使用含0.4%皂素的溶液，在4℃和超声条件下浸泡D层膜原料30分钟；之后用同样浓度0.5%皂素溶液对D层原料进行冲洗10分钟；接着再用PBS-EDTA溶液对生物膜浸泡20分钟；可重复前述去细胞步骤一次；

5.去DNA：使用含5U/mlDNA 酶的水溶液，D层材料与DNA酶溶液的比例为1:6，超声条件下，于37℃条件下浸泡20分钟；之后使用PBS冲洗3遍；使用含5U/ml 的水溶液，D层材料与α-半乳糖苷酶溶液比例为1:6，超声条件下，于30℃条件下浸泡20分钟；之后使用PBS溶液冲洗；

6.使用浓度为15mM 的NaOH溶液浸泡，之后使用PBS清洗直至中性；待后续加工之用。

实施例二：D层制备，脱细胞真皮（新生犊牛）

步骤基本同实施例一，区别点之一：本实施例是取新生犊牛，所取部位腹部中间皮肤，充分清洗，机械去除内表层的脂肪和外表层，用去离子水冲洗干净，用取皮机取0.15mm厚度的真皮组织；

区别点之二：原料预处理时，使用2.0%醋酸浓度代替0.8%醋酸，其余未说明步骤和试剂完全同实施例一。

实施例三：T层制备，脱细胞SIS（淘汰母猪）

步骤基本同实施例一，唯一区别点是，选择淘汰母猪（胎龄8胎以上,饲养超过40个月,体重200公斤左右，空怀），使用机械刮除法，除去小肠空肠的粘膜层、肌层、浆膜层、淋巴结等，得到T层小肠粘膜下层（SIS）原料。

实施例四（对照组）：脱细胞SIS（正常出栏重的商品肉猪）

步骤基本同实施例三，区别点只在原料猪的年龄，例三是淘汰母猪，本实施例是普通出栏商品肉猪（175天左右，100公斤毛重）。

实施例五：硬脑膜复合补片的制备（成品生产）

将实施例一、二中去细胞膜制成的D层片状原料，与实施例三中去细胞制成的T层片状原料，进行复合，按所需层数和大小进行组合；例如将1片、2片、3片、4片、5片的D层原料，分别与1片、2片、3片、4片、5片的T层原料，进行各种重叠组合，获得产品编码，例如DT22，DT32，DT23，DT33，DT24，DT34,DT44,DT55（DT后面的二个数字分别代表D层和T层的片数）；接着按所需大小或定制规格进行相应的裁切，如按照3cm*4cm、4cm*6cm，5cm*8cm等进行裁切加工，再接着固定于模具上，进行定型干燥、包装、辐照灭菌，可得本发明的产品成品，即硬脑膜复合补片；

同时，在D和T层之间，也可以配置1-5层相同大小的其他可降解生物材料，如提纯的胶原膜，静电纺膜等。

实施例六：硬脑膜复合补片中，T层原料的生物力学性能检测

分别取实施例三制备的T层原料四片重叠一起（T4），和实施例四加工获得的SIS片状材料四片重叠一起（普通商品肉猪SIS），进行干燥，获得产品，测其生物力学性能。具体方法是：将待检样品沿两个方向分别裁剪为宽度为10mm形状；裁剪后在相对湿度40%-60%、温度22±2℃环境内放置2小时后进行试验。夹具间距为25mm，将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上，以100mm/分钟的速度拉伸，记录断裂时的最大力值，结果如下：

T层 拉伸强度（N）

实施例三 T4 淘汰母猪SIS 45

实施例四 普通出栏商品肉猪SIS 32

实施例七：硬脑膜复合补片中,D层中的生物活性因子含量的检测

对实施例1、2、4制备得到的膜（片）样品在干燥后，进行生物活性因子的检测；采用商业化试剂盒对活性成份透明质酸（HA）的含量进行检测；样品预处理方式是采用低温研磨法进行处理，检测结果如下表：

组别	动物及组织来源	透明质酸HA（ug/mg）
			实施例一	D层 断奶后仔猪SIS	2.49
实施例二	D层 新生犊牛真皮	2.65
			实施例四	普通出栏商品肉猪SIS	1.81

本领域中普通技术人员可根据上述说明，对本发明做出多种简单的变化或调整或组合；因而，在不违反本发明的权利要求宗旨的前提下，实施例中的某些细节，不应构成对本发明的限定，本发明将以所附权利要求书界定的范围作为保护范围。

Claims (9)

1.一种人工硬脑膜复合补片，至少由T层和D层构成， D层与脑软组织接触， T层与脑颅骨接触，其特征在于，所述D层，是去细胞的幼畜组织ECM；所述T层由天然生物可降解材料、合成生物可降解材料或其组合组成。

2.根据权利要求1中所述的人工硬脑膜复合补片，其特征在于，所述幼畜，是指刚出生的、吃奶阶段的，以及保育阶段的猪、牛、羊、马，骆驼、驴、犬、兔。

3.根据权利要求1中所述的人工硬脑膜复合补片，其特征在于，所述幼畜，是指保育猪、新生犊牛之一或其组合。

4.根据权利要求1中所述的人工硬脑膜复合补片，其特征在于，所述幼畜组织，是指小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、心包膜、脑膜、羊膜、腹膜、真皮、肌腱、韧带、筋膜、骨膜的一种或其组合。

5.根据权利要求1所述的人工硬脑膜复合补片，其特征在于，所述幼畜组织，指保育猪小肠粘膜下层、新生犊牛真皮之一或其组合。

6.根据权利要求1中所述的人工硬脑膜复合补片，其特征在于，所述天然生物可降解材料，为含有去细胞的种畜组织，所述种畜为经产母猪、母牛、母羊、母马、母驴、母驼、母兔，所述组织，是指腹膜、真皮、小肠粘膜下层、骨膜、心包膜、筋膜中的一种或其组合；所述合成生物可降解材料为聚氨基酸、聚己内酯，聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇之一或其组合物。

7.根据权利要求6中所述人工硬脑膜复合补片，其特征在于，所述种畜组织为淘汰母猪的小肠粘膜下层。

8.根据权利要求1或6中所述的人工硬脑膜复合补片，其特征在于，所述去细胞，为使用物理方法、化学方法、生物学方法之一或其组合，所述物理方法为中压、高压渗透法，所述化学方法为表面活性剂处理，所述生物学方法为蛋白酶消化；所述蛋白酶为胰蛋白酶，所述表面活性剂处理为植物源五环三萜烯皂素、类固醇皂素之一或其组合物；所述皂素的有效工作浓度，重量比为0.05-1%。

9.一种人工硬脑膜复合补片的制备方法，其特征在于，与脑软组织接触的D层为幼畜组织ECM，所述幼畜组织ECM经过以植物源非离子表面活性试剂为主的脱细胞处理。