CN109498841A - 一种生物型骨膜修复材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物型骨膜修复材料及其制备方法，具体涉及一种脱细胞基质材料及其制备方法和在骨膜修复中的应用。该制备方法包括：(1)取猪小肠空肠段，清洗，径向切开，去除粘膜层、肌膜层、浆膜层，获得猪小肠粘膜下层组织膜；(2)将步骤(1)所得猪小肠粘膜下层组织膜依次进行如下处理：先置于过氧乙酸溶液中浸泡，清洗；再置于氢氧化钠溶液中浸泡，清洗；最后再置于丙酮溶液中浸泡，清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质。本发明生物安全性高，免疫原性和细胞毒性低；生物相容性好，能促进黏附其上的细胞的增殖，适于用作生物修复材料，特别适合用于骨膜修复。

Description

一种生物型骨膜修复材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及组织修复材料技术领域，涉及一种生物型骨膜修复材料及其制备方法，特别是涉及一种脱细胞基质材料及其制备方法和在骨膜修复中的应用。

背景技术

骨膜是由微血管化的致密结缔组织组成的，它通过夏贝氏纤维(Sharpey’sfibers)紧紧地覆盖在皮质骨外表面，形成一层薄而坚韧的膜。骨膜是高度血管化的组织，其中含有成骨和成软骨祖细胞以及其他相关的生物活性因子，而被描述成血管化较好的“骨/软骨器官”，它为骨提供血液循环，被认为是骨的“脐带”，骨膜剥落通常会破坏骨的动脉营养供应。从组织结构上讲，骨膜被分成不同的两层:由成纤维细胞和夏贝氏纤维组成的外层纤维层，以及含有多能间充质干细胞和骨母细胞的内层生发层，这些细胞有助于正常骨的生长、愈合和再生。近年来，随着社会工业化程度提高，由创伤、肿瘤切除、病理变性等原因造成的骨损伤和骨膜缺损日益增多。就传统的骨移植手术治疗骨缺损而言，存在着诸多问题。同时自体和异体骨膜移植已经用于各种尺寸的骨缺损修复，但是骨膜移植仍然存在供体不足、供区并发症和免疫学问题，就骨的生理机能而言，除了其他重要因素的参与，骨膜在骨形成和缺损治疗中起到了决定性的作用。如何能够更好地解决骨膜缺损修复是一个临床难题。

细胞外基质(ECM)是围绕身体几乎所有组织中的细胞结构和功能性物质，属于天然的生物材料，ECM经过机械法、化学法、酶法等方法，除去原组织中的DNA及细胞，再通过交联、消毒等处理后制备而成，它是一种具有一定的机械强度、低免疫原性的动物源性生物材料。其中，胶原蛋白是天然活组织中的主要结构框架，是ECM中最丰富的蛋白质。ECM被视为一种支持结构，细胞在其上对其他细胞进行定向和移动。ECM还提供了组织修复所需的微孔结构和环境。由于ECM是组织维持所必需的，它在组织修复中也起着重要作用。没有功能性ECM，修复就会停止，因为ECM不再能够支持正常的细胞过程。

ECM已经广泛应用于现代生物医学领域，如肌腱重建、下泌尿道重建、硬脑膜修补、血管重建、修复部分或全层皮肤损伤、生物疝修补，抗粘连和骨修复引导膜等方面。

例如；有一些研究者制备了人工骨膜，如，Clavin N等人采用人脱细胞真皮和成骨细胞/间充质干细胞(MSCs)合成了骨膜样材料。Hoffman等人利用可降解的水凝胶将间充质干细胞传递和集中到异体移植物表面来制备骨膜类似物。但是这些研究尚处于早期研究阶段，且没有过多考虑到生物安全性与实用性的问题。

目前，鉴于骨膜在骨修复中的重要作用，并且，尚无有效针对修复骨膜来达到治疗骨缺损的产品。因此，亟待提供一种生物相容性好的脱细胞基质材料作为生物骨膜来治疗骨缺损。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种生物型骨膜修复材料及其制备方法。该制备方法所得脱细胞基质材料具有非常好的生物相容性，特别是能够很好的促进黏附其上的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖，所以非常适合用于骨膜修复。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种脱细胞基质材料的制备方法，所述的制备方法包括：

(1)取猪小肠空肠段，清洗，径向切开，去除粘膜层、肌膜层、浆膜层，获得猪小肠粘膜下层组织膜；

(2)将步骤(1)所得猪小肠粘膜下层组织膜依次进行如下处理：

先置于过氧乙酸溶液中浸泡，再置于氢氧化钠溶液中浸泡，最后再置于丙酮溶液中浸泡，清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质。

在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述的过氧乙酸溶液的质量浓度为0.15％～0.25％，所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.15％～0.25％，所述的丙酮溶液的质量浓度为75％～85％。

在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述的过氧乙酸溶液的质量浓度为0.18％，所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.18％，所述的丙酮溶液的质量浓度为80％。

在其中一些实施例中，步骤(1)中，去除粘膜层的方式为采用木质刮板均匀刮除。

在其中一些实施例中，步骤(1)中，去除肌膜层、浆膜层的方式为采用木质刮板、手术刀刮除。

在其中一些实施例中，步骤(1)、步骤(2)中，所述的清洗采用磷酸缓冲盐溶液。

本发明的另一目的是提供一种上述的制备方法获得的脱细胞基质材料。

本发明的又一目的是提供一种上述脱细胞基质材料作为修复材料在修复骨膜中的应用。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明从猪小肠组织中挑选猪小肠粘膜下层组织膜，并依次采用过氧乙酸溶液、氢氧化钠溶液、丙酮溶液浸泡的方式去除猪小肠粘膜下层组织膜中的DNA等从而制备猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质，从而获得脱细胞基质材料。本发明挑选猪小肠粘膜下层组织膜作为脱细胞基质来源，生物安全性得到了提高，免疫原性降到了可以接受的范围，同时避免了交联剂增强物理性能带来的细胞毒性；重要的是，该脱细胞基质材料具有很好的生物相容性，能够很好的促进黏附其上的细胞的增殖，非常适于用作生物修复材料，尤其是能够很好的促进黏附其上的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖，特别适合用于骨膜修复。

附图说明

图1为BMSCs在实施例1脱细胞基质材料、SIS膜上的增殖情况图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

本实施例提供一种猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：

步骤1、取猪小肠空肠段，清洗并径向剪开，并使用PBS溶液反复冲洗以去除污染物。

步骤2、物理去除粘膜，使用木质刮板，小心均匀地刮去SIS膜内层的粘膜层。

步骤3、物理去除肌膜和浆膜，木质刮板和手术刀配合使用，去除SIS膜外层的肌膜和浆膜。

步骤4、配置0.18％(质量分数)的过氧乙酸溶液、0.18％的(质量分数)氢氧化钠溶液、80％的丙酮溶液；

然后先将除去粘膜层、肌膜层和浆膜层的SIS膜先置于过氧乙酸溶液中浸泡7小时；

再置于氢氧化钠溶液中浸泡7小时；

最后再置于丙酮溶液中浸泡7小时，清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质；

本步骤中所述的清洗指采用PBS溶液反复清洗3次。

步骤5、用剂量为25kGy-30kGy伽马射线辐照灭菌备用。

实施例2

本实施例提供一种猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：

步骤1、取猪小肠空肠段，清洗并径向剪开，并使用PBS溶液反复冲洗以去除污染物。

步骤2、物理去除粘膜，使用木质刮板，小心均匀地刮去SIS膜内层的粘膜层。

步骤3、物理去除肌膜和浆膜，木质刮板和手术刀配合使用，去除SIS膜外层的肌膜和浆膜。

步骤4、配置0.25％(质量分数)的过氧乙酸溶液、0.25％的(质量分数)氢氧化钠溶液、85％的丙酮(质量分数)溶液；

然后先将除去粘膜层、肌膜层和浆膜层的SIS膜先置于过氧乙酸溶液中浸泡7小时；

再置于氢氧化钠溶液中浸泡7小时；

最后再置于丙酮溶液中浸泡7小时，清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质；

本步骤中所述的清洗指采用PBS溶液反复清洗3次。

步骤5、用剂量为25kGy-30kGy伽马射线辐照灭菌备用。

实施例3

本实施例提供一种猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：

步骤1、取猪小肠空肠段，清洗并径向剪开，并使用PBS溶液反复冲洗以去除污染物。

步骤2、物理去除粘膜，使用木质刮板，小心均匀地刮去SIS膜内层的粘膜层。

步骤3、物理去除肌膜和浆膜，木质刮板和手术刀配合使用，去除SIS膜外层的肌膜和浆膜。

步骤4、配置0.15％(质量分数)的过氧乙酸溶液、0.15％(质量分数)的氢氧化钠溶液、75％(质量分数)的丙酮溶液；

然后先将除去粘膜层、肌膜层和浆膜层的SIS膜先置于过氧乙酸溶液中浸泡7小时；

再置于氢氧化钠溶液中浸泡7小时；

最后再置于丙酮溶液中浸泡7小时，清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质；

本步骤中所述的清洗指采用PBS溶液反复清洗3次。获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料。

步骤5、用剂量为25kGy-30kGy伽马射线辐照灭菌备用。

对比例1

本对比例是实施例1的对比例，差别之处主要是调换了步骤4中的浸泡顺序。本对比例的步骤4如下：

配置0.18％(质量分数)的过氧乙酸溶液、0.18％的(质量分数)氢氧化钠溶液、80％(质量分数)的丙酮溶液；

然后先将除去粘膜层、肌膜层和浆膜层的SIS膜先置于氢氧化钠溶液中浸泡7小时；

再置于过氧乙酸溶液中浸泡7小时；

最后再置于丙酮溶液中浸泡7小时，清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质。

对比例2

本对比例是实施例1的对比例，差别之处主要是省去了步骤4中的丙酮溶液浸泡的步骤。本对比例的步骤4如下：

配置0.18％(质量分数)的过氧乙酸溶液、0.18％(质量分数)的氢氧化钠溶液；

然后先将除去粘膜层、肌膜层和浆膜层的SIS膜先置于过氧乙酸溶液中浸泡7小时；

再置于氢氧化钠溶液中浸泡7小时，清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质。

对比例3

本对比例是实施例1的对比例，差别之处主要是调整了步骤4中采用的过氧乙酸溶液、氢氧化钠溶液、丙酮溶液的浓度。本对比例的步骤4如下：

配置0.3％(质量分数)的过氧乙酸溶液、0.3％(质量分数)的氢氧化钠溶液、丙酮；

然后先将除去粘膜层、肌膜层和浆膜层的SIS膜先置于过氧乙酸溶液中浸泡7小时；

再置于氢氧化钠溶液中浸泡7小时；

最后再置于丙酮中浸泡7小时，清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质。

生物相容性检测

消化收集成骨诱导的BMSCs离心，调整细胞浓度为10¹⁰个/L，立即用移液枪分别接种到实施例1至3、对比例1至3所得的猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料上，每片100μL。同时以，接种在SIS膜上为对照。

将培养瓶置于37℃，5％的CO₂的恒温箱中静置，再加5mL的成骨诱导培养液继续培养备用。

然后用AO-EB染色法观察BMSCs细胞在脱细胞SIS膜上的增殖情况。结果见图1及表1。

图1中右图为BMSCs在实施例1脱细胞基质材料上的增殖情况图，左图为BMSCs在空白组上的增殖情况图。右图为BMSCs在SIS膜上的增殖情况图。根据图1可知，BMSCs能够很好的黏附在实施例1的脱细胞基质材料并快速增殖。

根据表1可知：(1)实施例1至3的脱细胞基质材料上的BMSCs均能很好的实现增殖。相比之下，实施例1上的增殖情况优于实施例2、实施例2上的增殖情况优于实施例3，这说明本发明的技术方案存在优选方案。(2)BMSCs在实施例1至3脱细胞基质材料上的增殖情况优于对比例3，这说明，对于本发明来讲，过氧乙酸溶液、氢氧化钠溶液、丙酮溶液的浓度选择是非常重要的。(3)BMSCs在实施例1至3脱细胞基质材料上的增殖情况显著优于对比例1、2，这说明，对于本发明效果的实现而言，过氧乙酸溶液、氢氧化钠溶液、丙酮溶液的浸泡顺序、三者之间的配合关系是至关重要的。

表1

	增殖率(％)
		实施例1	378.4±21.2
实施例2	297.1±19.7
		实施例3	258.9±15.5
对比例1	167.5±24.1
		对比例2	177.8±11.5
对比例3	194.0±20.7

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：

(1)取猪小肠空肠段，清洗，径向切开，去除粘膜层、肌膜层、浆膜层，获得猪小肠粘膜下层组织膜；

(2)将步骤(1)所得猪小肠粘膜下层组织膜先置于过氧乙酸溶液中浸泡，再置于氢氧化钠溶液中浸泡；最后再置于丙酮溶液中浸泡，清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质。

2.根据权利要求1所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的过氧乙酸溶液的质量浓度为0.15％～0.25％，所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.15％～0.25％，所述的丙酮溶液的质量浓度为75％～85％。

3.根据权利要求2所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的过氧乙酸溶液的质量浓度为0.18％～0.2％，所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.18％～0.2％，所述的丙酮溶液的质量浓度为80％～82％。

4.根据权利要求1至3任一项所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，去除粘膜层的方式为采用木质刮板均匀刮除。

5.根据权利要求1至3任一项所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，去除肌膜层、浆膜层的方式为采用木质刮板、手术刀刮除。

6.根据权利要求1至3任一项所述的脱细胞基质材料的制备方法，步骤(1)、步骤(2)中，所述的清洗采用磷酸缓冲盐溶液。

7.权利要求1至6任一项所述的制备方法获得的脱细胞基质材料。

8.权利要求7所述的脱细胞基质材料作为修复材料在修复骨膜中的应用。