CN105963782A - 一种生物膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种生物膜及其制备方法。该方法工艺简单，成本较低，对膜组织的胶原纤维损害较小，且脱细胞效果好，所获得的生物膜保留了动物膜组织的天然双层结构，能够引导组织再生，为引导组织再生膜在临床上的应用创造了条件。本发明实施例提供一种生物膜的制备方法，包括：步骤1)剔除哺乳动物膜组织表面的脂肪组织，获得初步去脂后的膜组织；步骤2)将初步去脂后的膜组织用碱溶液浸泡进行脱细胞处理，获得脱细胞后的膜组织；步骤3)将脱细胞后的膜组织用有机溶剂浸泡，并在振荡下进行脱脂处理，获得脱脂后的膜组织；步骤4)将脱脂后的膜组织平铺，干燥、灭菌获得生物膜。

Description

一种生物膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及引导组织再生技术领域，尤其涉及一种生物膜及其制备方法。

背景技术

引导组织再生术是一种理想的促进牙周新附着的技术；该技术是将引导组织再生膜覆盖于牙周组织缺损上方，以阻挡生长较快的上皮细胞和成纤维细胞长入缺损区，从而为牙周膜细胞和骨细胞的生长提供一定的空间，促进牙周组织再生。因此，理想的引导组织再生膜应为具有致密层和疏松层的双层结构，所述致密层可以阻挡软组织的侵入，而疏松层的多孔结构更有利于骨细胞的贴附和生长。

现有的引导组织再生膜主要通过两种方法获取，一种方法为人工合成法，通过引入外来可降解材料(如脂肪族聚酯)与从动物体内提取的胶原和丝素蛋白制备致密层和疏松层，或者，在外来可降解材料上复合透明质酸、钙盐等，通过交联或者静电纺丝技术整合成具有双层或者三层结构的引导组织再生膜，这种人工合成法所获得的引导组织再生膜需要引入外来可降解材料，可降解材料在降解后产物呈酸性，会引发炎症反应，因此，该引导组织再生膜的生物相容性和安全性较差；使得该引导组织再生膜的机械强度变差，容易发生塌陷，从而影响新生组织生长；另一种方法是通过将动物膜组织进行脱细胞、脱脂处理，获得仅包含细胞外基质的生物膜，该生物膜具有天然双层结构，该生物膜在作为引导组织再生膜用于牙周组织缺损时，不引入外来可降解材料，生物相容性、安全性、机械强度均较为优异；但是，现有技术中，对所述动物膜组织进行脱细胞时主要选用胰酶、EDTA、聚乙二醇辛基苯基醚，这些试剂脱细胞效果不明显，效率低，聚乙二醇辛基苯基醚毒性较大，胰酶对材料的胶原纤维结构损害较大。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一种生物膜及其制备方法。该方法工艺简单，成本较低，脱细胞效果好，对膜组织的胶原纤维损害较小，所获得的生物膜保留了动物膜组织的天然双层结构，能够引导组织再生，为引导组织再生膜在临床上的应用创造了条件。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供一种生物膜的制备方法，包括：

步骤1)剔除哺乳动物膜组织表面的脂肪组织，获得初步去脂后的膜组织；

步骤2)将初步去脂后的膜组织用碱溶液浸泡进行脱细胞处理，获得脱细胞后的膜组织；

步骤3)将脱细胞后的膜组织用有机溶剂浸泡，并在振荡下进行脱脂处理，获得脱脂后的膜组织；

步骤4)将脱脂后的膜组织平铺，干燥、灭菌获得生物膜。

优选的，所述哺乳动物膜组织选自小肠粘膜、腹膜、心包膜、羊膜或者隔膜中的任意一种。

进一步优选的，所述碱溶液为氢氧化钠溶液。

进一步优选的，所述有机溶剂为异丙醇、丙酮或者乙醇中的一种或者几种。

可选的，所述步骤4)中将脱脂后的膜组织平铺具体为：将所述脱脂后的膜组织的致密层贴附不锈钢板或者聚乙烯板平铺。

优选的，所述步骤4)中干燥温度为40-50℃，干燥时间为2.5-4.5h。

另一方面，本发明实施例提供一种生物膜，采用上述所述的方法制备获得。

可选的，所述生物膜的DNA残留量的质量浓度小于等于100ng/mg。

优选的，所述生物膜的脂肪含量小于等于2％。

可选的，所述生物膜的水分含量为5-20％。

本发明实施例提供的一种生物膜及其制备方法。该方法工艺简单，成本较小，通过将哺乳动物的膜组织用碱溶液代替胰酶、EDTA或/和聚乙二醇辛基苯基醚进行脱细胞，与胰酶相比碱溶液对膜组织的胶原纤维损害较小，且脱细胞效果好，与聚乙二醇辛基苯基醚相比所述碱溶液无毒，能够提高脱细胞效果与脱细胞效率，采用有机溶剂对所述动物膜组织进行脱脂，脱脂效果较好，从而能够提高成品质量；所获得的生物膜保留了天然的疏松层和致密层双层结构，脱细胞和脱脂效果好，在用于临床中时能够减少成品的免疫原性，能够引导组织再生，为引导组织再生膜在临床上的应用创造了条件。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例提供的一种生物膜的制备方法的流程示意图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所涉及的材料均可以通过商业途径或通过申请人获取。

一方面，本发明实施例提供一种生物膜的制备方法，参见图1，包括：

步骤1)剔除哺乳动物膜组织表面的脂肪组织，获得初步去脂后的膜组织；

步骤2)将初步去脂后的膜组织用碱溶液浸泡进行脱细胞处理，获得脱细胞后的膜组织；

步骤3)将脱细胞后的膜组织用有机溶剂浸泡，并在振荡下进行再次脱脂处理，获得脱脂后的膜组织；

步骤4)将脱脂后的膜组织平铺，干燥、灭菌获得生物膜。

其中，需要说明的是，由于动物膜组织本身就具有致密层和疏松层，所述致密层由较细小的胶原纤维束紧密排列而成，可以防止软组织长入骨缺损区域，为新骨的生长预留空间；所述疏松层由较粗大的胶原纤维束稀疏排列而成，形成具有多孔结构的粗糙表面，能够提供更大的接触面积，有利于细胞因子吸附及成骨类细胞的贴附生长，加快新骨形成。

本发明实施例提供的一种生物膜的制备方法。该方法工艺简单，成本较小，通过将哺乳动物的膜组织用碱溶液代替胰酶、EDTA或/和聚乙二醇辛基苯基醚进行脱细胞，与胰酶相比碱溶液对膜组织的胶原纤维损害较小，且脱细胞效果好，与聚乙二醇辛基苯基醚相比所述碱溶液无毒，能够提高脱细胞效果与脱细胞效率，采用有机溶剂对所述动物膜组织进行脱脂，根据相似相溶原理脱脂效果较好，从而能够提高成品质量；所获得的生物膜保留了天然的疏松层和致密层双层结构，脱细胞和脱脂效果好，在用于临床中时能够降低成品的免疫原性，为引导组织再生膜在临床上的应用创造了条件。

其中，对所述哺乳动物膜组织的来源不做限定。

所述哺乳动物膜组织选自小肠粘膜、腹膜、心包膜、羊膜或者隔膜中的任意一种。

其中，对所述步骤1)中剔除哺乳动物膜组织表面的脂肪组织的具体操作不做限定，可以用医用镊子将大量脂肪组织剔除，也可以用流动水洗法剔除脂肪组织。

其中，对所述碱溶液不做限定，所述碱溶液可以为氢氧化钠、氢氧化钾或者氢氧化钙等。

优选的，所述碱溶液为氢氧化钠溶液。在所述步骤2)中通过氢氧化钠溶液对初步去脂后的膜组织进行脱细胞处理，不仅能够破坏细胞结构去除核酸等免疫原性物质，还可以有效杀灭病毒、细菌等所有病原体。

其中，对所述氢氧化钠溶液的浓度不做限定，对所述步骤2)中的浸泡时间不做限定。

本发明的一实施例中，氢氧化钠溶液的浓度为0.25-1M，所述步骤2)中浸泡时间为0.5-3h。由于氢氧化钠的浓度越大，腐蚀性越强，因此，针对不同种类的哺乳动物膜组织所选用的氢氧化钠的浓度不同，当选用牛源性的膜组织时，氢氧化钠的浓度相对高一些，这样能够提高氢氧化钠溶液的脱细胞效果；但是，若氢氧化钠溶液的浓度过大，腐蚀性过强，容易对膜组织的胶原纤维造成损害，若氢氧化钠的浓度过小，会影响脱细胞效果，从而延长脱细胞时间，效率较低。同样的，当氢氧化钠溶液的浓度一定，若浸泡时间过短，会影响动物膜组织的脱细胞效果，若浸泡时间过长，使得动物膜组织处于强碱性环境下，容易造成膜组织的胶原纤维破损，影响成品质量；针对不同的膜组织，选用不同浓度的氢氧化钠浸泡不同的时间，可以在有效去除病原体，保证产品安全性的同时提高脱细胞效果，例如，采用1M的氢氧化钠对所述牛心包膜浸泡1h能够去除疯牛病原体，保证产品的安全。

本发明的一实施例中，在所述步骤2)之后还包括：用磷酸盐缓冲液或水对所述脱细胞后的膜组织进行清洗，使得所述脱细胞后的膜组织的pH值为6.0-8.0。

通过将所述膜组织的内部环境保持在中性，能够减少氢氧化钠残留，从而减少对所述膜组织的胶原纤维的损害。

本发明的又一实施例中，用磷酸盐缓冲液或水对所述脱细胞后的动物膜组织进行清洗具体为：用3份质量为所述脱细胞后的膜组织15倍的磷酸盐缓冲液或水分别对所述脱细胞后的膜组织清洗10-15min。

其中，对所述步骤3)中有机溶剂不做限定。

本发明的一实施例中，所述有机溶剂为异丙醇、丙酮或者乙醇中的一种或者几种。

优选的，所述有机溶剂为异丙醇。通过试验发现：在有机溶剂中异丙醇脱脂效果优于丙酮和乙醇，且所述异丙醇比丙酮的毒性小。

其中，对所述步骤3)中的振荡时间不做限定。由于随着振荡时间的不同，脱脂量也不同，在实际操作中，通常脱脂后的膜组织的脂肪含量越小越好。

本发明的一实施例中，所述振荡时间为1.5-4h。在本发明实施例中，通过异丙醇在振荡下浸泡膜组织脱脂1.5-4h，所获得的膜组织的脂肪含量小于等于2％，能够满足生物膜在临床中的安全性要求。

本发明的又一实施例中，在所述步骤3)之后还包括：用水对所述脱脂后的动物膜组织进行清洗，使得有机溶剂的残留量的质量浓度小于等于100μg/g。

通过在制备过程中将有机溶剂清洗干净，能够保证成品用于临床时的安全性。

本发明的又一实施例中，用水对所述脱脂后的膜组织进行清洗具体为：在振荡下，用5份质量为所述脱脂后的膜组织15倍的水分别对所述脱脂后的膜组织清洗10-15min。

其中，对所述步骤4)中干燥的具体操作不做限定。所述干燥可以为自然风干，也可以为烘干，也可以为冷冻干燥。

需要说明的是，由于冷冻干燥过程中材料内部水分直接由固态升华，因此，所获得的生物膜疏松多孔，从而会影响所述生物膜的力学性能；而在自然风干或烘干条件下干燥，水分从液态变为气态挥发，所获得的生物膜表面发生收缩，使得生物膜的结构更加致密，从而能够提高所获得的生物膜的力学性能，且在体内降解速度较慢。

其中，对所述干燥温度与干燥时间不做限定。

本发明的一实施例中，所述步骤4)中干燥温度为40-50℃，干燥时间为2.5-4.5h。

其中，对所述步骤4)中灭菌的具体操作也不做限定。

本发明的又一实施例中，灭菌具体为：在25KGy钴60辐照灭菌。

另一方面，本发明实施例提供一种生物膜，采用上述所述的方法制备获得。

本发明实施例提供一种生物膜，该生物膜的脱细胞和脱脂效果较好，胶原纤维的损害较小，保留了天然的疏松层和致密层双层结构，应用于临床中时具有较低的免疫原性，具有较长的体内降解时间，且降解产物对人体无害，能够引导组织再生，为引导组织再生膜在临床上的应用创造了条件。

其中，对所述生物膜的DNA残留量的质量浓度不做限定。

本发明的一实施例中，所述生物膜的DNA残留量的质量浓度小于等于100ng/mg。该生物膜的遗传物质残留量较小，能够减小所述生物膜在应用时的排异反应，保证产品临床应用时的安全性。

其中，对所述生物膜中的脂肪含量也不做限定，本发明的一实施例中，所述生物膜的脂肪含量小于等于2％。该生物膜的免疫原性物质的含量较低，能够减少所述生物膜在应用中产生的排异反应。

其中，对所述生物膜的水分含量不做限定。

本发明的一实施例中，所述生物膜的水分含量为5-20％。该生物膜具有一定的柔韧性，便于取用；若水分含量过低，则使得生物膜较脆，容易折损，若水分含量过高，则会缩短所述生物膜的保存时间。

实施例

下面的实施例用来说明本发明，并不是想限制本发明的范围。以下实施例仅以具体实施过程中各组分的实际添加浓度为例进行说明，实际使用时，各组分的浓度并不对本发明目的的实现构成影响。

实施例1

S101、将牛心包表面的脂肪组织剔除，清洗表面异物，获得初步去脂后的牛心包；

S102、将初步去脂后的牛心包用5倍量的1M的氢氧化钠浸泡1.0h，获得脱细胞后的牛心包；

S103、用3份质量为所述脱细胞后的膜组织15倍的磷酸盐缓冲液分别对所述脱细胞后的牛心包清洗15min，使得所述牛心包的pH值为6.0；

S104、将步骤S103所获得的牛心包用5倍量的异丙醇振荡脱脂3h，获得脱脂后的牛心包，所述脱脂后的牛心包的脂肪含量为1.5％；

S105、用5份质量为所述脱脂后的牛心包15倍的水分别对所述脱脂后的牛心包清洗15min，使得所述异丙醇残留量的质量浓度为55μg/g；

S106、将脱脂后的牛心包的致密层贴附于不锈钢板平铺，放入干燥箱中50℃干燥3.5h，得到生物膜，所述生物膜的水分含量为5％；

S107、裁切、包装、采用25KGy的钴对所述生物膜进行辐照灭菌，获得成品，所述生物膜的DNA残留量的质量浓度为40ng/mg。

结论：本发明实施例提供的生物膜的制备方法工艺简单，成本较小，用碱溶液对牛心包进行脱细胞处理，所述碱溶液毒性较小，脱细胞效果好，对牛心包的胶原纤维损害较小，通过将牛心包的致密层贴附不锈钢板平铺，能够提高致密层的致密程度，并且，在50℃干燥3.5h，能够进一步提高所述生物膜的机械强度，延长所述生物膜在体内的降解时间，所获得的生物膜保留了天然的疏松层和致密层双层结构，能够引导组织再生，为引导组织再生膜在临床上的应用创造了条件。

实施例2

S101、将猪小肠粘膜表面的脂肪组织剔除，清洗表面异物，获得初步去脂后的猪小肠粘膜；

S102、将初步去脂后的猪小肠粘膜用5倍量的0.25M的氢氧化钠浸泡0.5h，获得脱细胞后的猪小肠粘膜；

S103、用3份质量为所述脱细胞后的膜组织15倍的磷酸盐缓冲液分别对所述脱细胞后的猪小肠粘膜清洗10min，使得猪小肠粘膜的pH值为8.0；

S104、将步骤S103所获得的猪小肠粘膜用5倍量的异丙醇振荡脱脂1.5h，获得脱脂后的猪小肠粘膜，所述脱脂后的猪小肠粘膜的脂肪含量为1.2％；

S105、用5份质量为所述脱脂后的猪小肠粘膜15倍的水分别对所述脱脂后的猪小肠粘膜清洗10min，使得所述异丙醇残留量的质量浓度为80μg/g；

S106、将脱脂后的猪小肠粘膜的致密层贴附不锈钢板平铺，放入干燥箱中40℃干燥2.5h，得到生物膜，所述生物膜的水分含量为20％；

S107、裁切、包装、采用25KGy的钴对所述生物膜进行辐照灭菌，获得成品，所述生物膜的DNA残留量的质量浓度为80ng/mg。

结论：本发明实施例提供的生物膜的制备方法工艺简单，成本较小，用碱溶液对猪小肠粘膜进行脱细胞处理，所述碱溶液毒性较小，脱细胞效果好，对猪小肠粘膜的胶原纤维损害较小，采用异丙醇对所述猪小肠粘膜进行脱脂，脱脂效果较好，从而能够提高成品质量；通过将猪小肠粘膜的致密层贴附不锈钢板平铺，能够提高致密层的致密程度，并且，在40℃干燥2.5h，能够进一步提高所述生物膜的机械强度，延长所述生物膜在体内的降解时间，所获得的生物膜保留了天然的疏松层和致密层双层结构，能够引导组织再生，为引导组织再生膜在临床上的应用创造了条件。

实施例3

S101、将猪腹膜表面的脂肪组织剔除，清洗表面异物，获得初步去脂后的猪腹膜；

S102、将初步去脂后的猪腹膜用5倍量的0.5M的氢氧化钠浸泡3h，获得脱细胞后的猪腹膜；

S103、用3份质量为所述脱细胞后的猪腹膜15倍的磷酸盐缓冲液分别对所述脱细胞后的猪腹膜清洗12min，使得猪腹膜的pH值为7.0；

S104、将步骤S103所获得的猪腹膜用5倍量的异丙醇振荡脱脂4h，获得脱脂后的猪腹膜，所述脱脂后的猪腹膜的脂肪含量为2％；

S105、用5份质量为所述脱脂后的猪腹膜15倍的水分别对所述脱脂后的猪腹膜清洗12min，使得所述异丙醇残留量的质量浓度为100μg/g；

S106、将脱脂后的猪腹膜的致密层贴附聚乙烯板平铺，放入干燥箱中45℃干燥4.5h，得到生物膜，所述生物膜的水分含量为8％；

S107、裁切、包装、采用25KGy的钴对所述生物膜进行辐照灭菌，获得成品，所述生物膜的DNA残留量的质量浓度为100ng/mg。

结论：本发明实施例提供的生物膜的制备方法工艺简单，成本较小，用碱溶液对猪腹膜进行脱细胞处理，所述碱溶液毒性较小，脱细胞效果好，对猪腹膜的胶原纤维损害较小，采用异丙醇对所述猪腹膜进行脱脂，脱脂效果较好，从而能够提高成品质量；通过将猪腹膜的致密层贴附聚乙烯板平铺，能够提高致密层的致密程度，并且，在45℃干燥4.5h，能够进一步提高所述生物膜的机械强度，在引导组织再生过程中，能够延长所述生物膜在体内的降解时间，所获得的生物膜保留了天然的疏松层和致密层双层结构，能够引导组织再生，为引导组织再生膜在临床上的应用创造了条件。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种生物膜的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1)剔除哺乳动物膜组织表面的脂肪组织，获得初步去脂后的膜组织；

步骤2)将初步去脂后的膜组织用碱溶液浸泡进行脱细胞处理，获得脱细胞后的膜组织；

步骤3)将脱细胞后的膜组织用有机溶剂浸泡，并在振荡下进行脱脂处理，获得脱脂后的膜组织；

步骤4)将脱脂后的膜组织平铺，干燥、灭菌获得生物膜。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物膜组织选自小肠粘膜、腹膜、心包膜、羊膜或者隔膜中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱溶液为氢氧化钠溶液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为异丙醇、丙酮或者乙醇中的一种或者几种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中将脱脂后的膜组织平铺具体为：将所述脱脂后的膜组织的致密层贴附不锈钢板或者聚乙烯板平铺。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中干燥温度为40-50℃，干燥时间为2.5-4.5h。

7.一种生物膜，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的制备方法制备获得。

8.根据权利要求7所述的生物膜，其特征在于，所述生物膜的DNA残留量的质量浓度小于等于100ng/mg。

9.根据权利要求7所述的生物膜，其特征在于，所述生物膜的脂肪含量小于等于2％。

10.根据权利要求7所述的生物膜，其特征在于，所述生物膜的水分含量为5-20％。