CN112807490B - 一种利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法，通过将幼龄牛骨或猪骨切割后经去病毒、脱脂、脱蛋白、脱钙、脱细胞、去内毒等处理后冻干，并再次剪切成需要的规格。整个工艺简单，生产周期短，便于大规模批量生产。本发明选用幼龄牛骨或猪骨作原料，其来源丰富，减少降解诱发炎症反应，并易于清除，避免植入人体后引起免疫排斥反应。且幼龄牛骨和猪骨材料具有良好的孔隙率和孔径通道，与人骨孔隙类似，模拟人体微环境，有利于成骨细胞等种子细胞爬行通过，可以很好的促进软组织愈合且成骨能力较好。另外，本发明采用在长流水状态下甩干并清洗清除各处理步骤化学试剂，不仅速度快，而且清洗彻底无残留，进一步保证产品使用的安全性。

Description

一种利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法
技术领域
本发明涉及一种利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法。
背景技术
在口腔疾病的医疗过程中，患者出现牙外伤、错位牙、额外牙、滞留乳牙等口腔内牙齿不适时，常常需要拔牙手术。拔牙后即刻进行拔牙窝内填充材料移植，可支撑和充填牙槽窝，阻断或减缓牙槽骨吸收，阻挡牙龈上皮或纤维组织进入拔牙窝，并能够引导和促进拔牙窝的骨再生，实现牙槽骨的保存或增量。
目前，牙窝填充材料大体可分为人工合成材料和生物骨材料。其中，人工合成材料存在问题在于：一方面人工合成材料在人体内的降解速度不易控制，与牙周组织修复和拔牙窝的骨再生修复速度不同步；另一方面人工合成材料，如聚乳酸的降解产物会造成局部环境的强酸性，反而会对被修补组织的修复生长起到抑制作用，因此逐渐被生物骨材料所代替。生物骨材料多选用猪骨或牛骨材料制备的牙窝填充材料在人体内的降解速度几乎能与组织修复速度同步，且降解产物也不会导致局部环境的改变，不影响牙周组织修复和拔牙窝的骨再生，有利于拔牙窝的骨再生。
然而，生物骨材料由于含有多种免疫原性物质，其必须经过一系列生物化学方法处理去除后才能使用，以避免发生免疫排斥反应。常用处理方法包含脱脂、脱细胞、去抗原、去病毒等步骤，在处理过程中要使用大量生物化学试剂，而残留化学试剂的清洗去除也同样重要。现有的生物骨材料制备过程中化学试剂清洗去除的方法多为采用清水直接洗涤或震荡清洗。例如，中国专利文献(CN110559485A)公布的一种生物组织基质材料及其制备方法与应用中生物组织基质材料，其化学试剂清洗为采用震荡清洗，单个工艺步骤的震荡清洗时间为6～80小时；再例如另一篇中国专利文献(CN104174069A)公布的一种致密骨基质及其制备方法，其化学试剂清洗各个步骤均为使用清水直接洗涤。
但是，无论是使用清水直接洗涤还是震荡清洗，均需要耗费较长时间，从而导致整个产品生产周期较长，不利于产品的大规模批量生产。而且，目前生物骨材料含有较多的杂蛋白、细胞、抗原等有机成分，清除不彻底的话，植入人体后容易引起免疫排斥反应，影响拔牙窝软组织愈合。因此需要一种合理有效的生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法，缩短产品生产周期，便于大规模批量生产，在保证产品的使用安全的同时，能促进拔牙窝软组织愈合和牙槽骨的再生。
发明内容
针对上述存在的问题及为了达到上述的目的，本发明提供一种利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法，选用幼龄的生物骨材料，切割清洗后采用在长流水状态下甩干并清洗的方式对各处理步骤进行化学试剂清除，不仅速度快，而且清洗彻底无残留。同时，具有良好的拔牙窝软组织愈合和牙槽骨再生的功能。具体技术方案如下：
本发明提供一种利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法，包括如下步骤：
(1)切割：将冷冻的幼龄生物骨原材料在常温下化冻，并切割成一定宽度的条状骨原料；
(2)清洗：反复冲洗切割后的条状骨原料，直至没有明显血水和油脂；
(3)去病毒：配制NaOH溶液，将清洗后的条状骨原料倒入NaOH溶液中，搅拌、浸泡后捞出，在长流水状态下清洗并甩干；
(4)脱脂：配制三氯甲烷-甲醇混合溶液，将去病毒后的条状骨原料倒入到混合溶液中，搅拌、浸泡后捞出，真空干燥脱除残留的三氯甲烷和甲醇；
(5)脱蛋白：配制胰蛋白酶溶液，将脱脂后的条状骨原料倒入到胰蛋白酶溶液中，搅拌、浸泡后捞出，再使用氢氧化钠溶液浸泡一段时间，然后在长流水状态下清洗并甩干；
(6)脱钙：配制盐酸溶液，将二次去病毒后的条状骨原料倒入盐酸溶液中，搅拌、浸泡、后捞出，在长流水状态下清洗并甩干；
(7)脱细胞：配制双氧水溶液，将脱钙后的条状骨原料倒入双氧水溶液中，搅拌、浸泡成后捞出，以备去内毒；
(8)去内毒：将脱细胞后的条状骨原料用倒入到注射用水中，反复浸泡清洗；
(9)冻干：将去内毒后的条状骨原料平铺于容器中，使用冻干机进行冻干；
(10)二次切割：将冻干后的条状骨原料按照需求切割成长方体，获得胶原蛋白基质产品；
(11)包装：将剪切后的胶原蛋白基质产品装入西林瓶，封口，压盖，得到口腔用胶原蛋白基质材料成品。
作为优选的技术方案的，步骤(1)中，所述幼龄生物骨原材料为牛龄或猪龄为0～7天的牛骨或猪骨；所述切割成的条状骨原料宽度为9～12mm。
作为优选的技术方案的，步骤(2)中，所述清洗为采用自来水反复冲洗。
作为优选的技术方案的，步骤(3)中，所述去病毒及二次去病毒，配制的NaOH溶液浓度均为0.1～3mol/L，其浸泡的时间为1～4h。
作为优选的技术方案的，步骤(4)中，所述脱脂，配制的三氯甲烷-甲醇混合溶液中三氯甲烷与甲醇的混合体积比为2～3:1，其浸泡的时间为24～72h。
作为优选的技术方案的，步骤(5)中，所述脱蛋白，配制的胰蛋白酶溶液浓度为0.1％～1％；其浸泡的时间为2～4h；所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5mol/L，浸泡的时间为30min。
作为优选的技术方案的，步骤(6)中，所述脱钙，配制的盐酸溶液浓度为0.5～3mol/L，其浸泡的时间为12～24h。
作为优选的技术方案的，步骤(7)中，所述脱细胞，配制的双氧水溶液浓度为1％～10％，其浸泡的时间为12～24h。
作为优选的技术方案的，步骤(3)、(5)、(6)中，所述长流水状态下清洗并甩干为：长流水状态下清洗25～30min，甩干5min，重复4次，至清洗液的pH为中性。
作为优选的技术方案的，步骤(8)中，所述去内毒为将条状骨倒入到注射用水中浸泡清洗1～5次，每次浸泡时间为0.5～2h。
作为优选的技术方案的，步骤(9)中，所述冻干，条件设定为-20℃下预冻12～18h，-60℃下冻干48～72h。
本发明的有益效果是：
(1)本发明选用牛骨和猪骨作为生物骨原料制备口腔用胶原蛋白基质材料，其来源丰富，且与人工合成材料相比，可减少降解后诱发炎症反应。
(2)本发明选用的为0～7天的小牛骨或小猪骨，与其他动物源材料相比，其含有细胞、抗原等有机成分较少，易于清除，可避免植入人体使用后引起免疫排斥反应。
(3)选用的幼龄的小牛骨和小猪骨材料，在保证良好孔隙率和孔径通道的同时就要优越的抗压强度，临床使用更加广泛。
(4)本发明制备方法通过低浓度氢氧化钠清洗残留胰蛋白酶、甩干机清洗试剂残留，在保证清洗彻底的同时大大缩短了生产周期，便于大规模批量生产。
(5)临床试验证明本发明的胶原蛋白基质早期能够促进软组织愈合，同时具有生物支架作用，促进骨组织愈合。
附图说明
图1为本发明利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料冻干后的未切割的条状骨照片；
图2为本发明实施例1制备的口腔用胶原蛋白基质材料切割成长方体的产品照片；
图3为本发明实施例2制备的口腔用胶原蛋白基质材料切割成长方体的产品照片；
图4为本发明实施例3制备的口腔用胶原蛋白基质材料切割成长方体的产品照片；
图5为本发明利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料×100电镜扫描照片；
图6为本发明利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料×200电镜扫描照片；
图7至图9为本发明利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料临床应用充填牙槽窝的过程。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例1～3为利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料；对比例1为采用成龄牛骨制备的口腔用胶原蛋白基质材料；对比例2为制备异种骨胶原基质；实施例4、5为效果例。
实施例1本实施例是利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料，具体步骤如下：
(1)切割：将冷冻的牛龄为2天小牛骨在常温下化冻，清洗；然后使用擦拭消毒过的切割机，调整切割挡板到锯条距离为10mm，将生物骨原材料切割成条状骨原料。
(2)清洗：使用自来水反复冲洗切割完的条状骨原料，直至没有明显血水和油脂。
(3)去病毒：配制0.5mol/L的NaOH溶液，将清洗完的条状骨原料倒入NaOH溶液中，搅拌，浸泡2h，完成后捞出条状骨，使用甩干机长流水状态下清洗30min，甩干5min，然后在水中浸泡25min，重复4次。
(4)脱脂：配制三氯甲烷:甲醇(V/V)＝2:1的三氯甲烷-甲醇混合溶液，将去病毒后的条状骨原料倒入到混合溶液中，搅拌、浸泡30h；完成后将脱脂完成的条状骨捞出，使用真空干燥箱真空脱除三氯甲烷、甲醇残留。
(5)脱蛋白：配制0.5％浓度的胰蛋白酶溶液，将脱脂后的条状骨倒入到胰蛋白酶溶液中，搅拌、浸泡2h；完成后捞出条状骨，再使用浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡30min；然后使用甩干机长流水状态下清洗30min，甩干5min，然后在水中浸泡25min，重复4次。
(6)脱钙：配制2mol/L盐酸溶液，将二次去病毒后的条状骨倒入盐酸溶液中，搅拌，浸泡12h；完成后捞出条状骨原料，使用甩干机在长流水状态下清洗30min，甩干5min，然后在水中浸泡25min，重复4次。
(7)脱细胞：配制5％浓度的双氧水溶液，将脱钙后的条状骨倒入双氧水溶液中，搅拌，浸泡16h。完成后捞出条状骨，再进行去内毒处理。
(8)去内毒：将脱细胞后的条状骨用倒入到注射用水中，浸泡清洗3次，每次浸泡1h。
(9)冻干：将去内毒后的条状骨平铺在注射用水清洗的不锈钢盘中，使用冻干机进行冻干，冻干条件设定为-20℃下预冻12h，-60℃下冻干48h，如图1所示。
(10)再次切割：将冻干后的条状骨原料按照胶原蛋白基质产品的要求切割成长×宽×高＝8×8×5mm的长方体，如图2所示。
(11)包装：将切割后好的产品装入西林瓶，封口，压盖，得到口腔用胶原蛋白基质材料成品。
实施例2本实施例也是利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料，其制备步骤与实施例1一致，具体如下：
(1)切割：将冷冻的牛龄为3天小猪骨在常温下化冻，清洗；然后使用擦拭消毒过的切割机，调整切割挡板到锯条距离为12mm，将生物骨原材料切割成条状骨原料。
(2)清洗：使用自来水反复冲洗切割完的条状骨原料，直至没有明显血水和油脂。
(3)去病毒：配制1mol/L的NaOH溶液，将清洗完的条状骨原料倒入NaOH溶液中，搅拌，浸泡3h，完成后捞出条状骨，使用甩干机长流水状态下清洗25min，甩干5min，重复4次，至pH为中性。
(4)脱脂：配制三氯甲烷:甲醇(V/V)＝3:1的三氯甲烷-甲醇混合溶液，将去病毒后的条状骨原料倒入到混合溶液中，搅拌、浸泡36h；完成后将脱脂完成的条状骨捞出，使用真空干燥箱真空脱除三氯甲烷、甲醇残留。
(5)脱蛋白：配制1％浓度的胰蛋白酶溶液，将脱脂后的条状骨倒入到胰蛋白酶溶液中，搅拌、浸泡3h；完成后捞出条状骨，再使用浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡30min；然后使用甩干机长流水状态下清洗25min，甩干5min，重复4次，至pH为中性。
(6)脱钙：配制1mol/L盐酸溶液，将二次去病毒后的条状骨倒入盐酸溶液中，搅拌，浸泡14h；完成后捞出条状骨原料，使用甩干机在长流水状态下清洗25min，甩干5min，重复4次，至pH为中性。
(7)脱细胞：配制3％浓度的双氧水溶液，将脱钙后的条状骨倒入双氧水溶液中，搅拌，浸泡1h。完成后捞出条状骨，再进行去内毒处理。
(8)去内毒：将脱细胞后的条状骨用倒入到注射用水中，浸泡清洗5次，每次浸泡0.5h。
(9)冻干：将去内毒后的条状骨平铺在注射用水清洗的不锈钢盘中，使用冻干机进行冻干，冻干条件设定为-20℃下预冻14h，-60℃下冻干60h，如图1所示。
(10)再次切割：将冻干后的条状骨原料按照胶原蛋白基质产品的要求切割成长×宽×高＝8×8×8mm的长方体，如图3所示。
(11)包装：将切割后好的产品装入西林瓶，封口，压盖，得到口腔用胶原蛋白基质材料成品。
实施例3本实施例同样是利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料，其制备步骤与实施例1一致，具体如下：
(1)切割：将冷冻的牛龄为5天小牛骨在常温下化冻，清洗；然后使用擦拭消毒过的切割机，调整切割挡板到锯条距离为9mm，将生物骨原材料切割成条状骨原料。
(2)清洗：使用自来水反复冲洗切割完的条状骨原料，直至没有明显血水和油脂。
(3)去病毒：配制3mol/L的NaOH溶液，将清洗完的条状骨原料倒入NaOH溶液中，搅拌，浸泡4h，完成后捞出条状骨，使用甩干机长流水状态下清洗25min，甩干5min，重复4次，至pH为中性。
(4)脱脂：配制三氯甲烷:甲醇(V/V)＝3:1的三氯甲烷-甲醇混合溶液，将去病毒后的条状骨原料倒入到混合溶液中，搅拌、浸泡72h；完成后将脱脂完成的条状骨捞出，使用真空干燥箱真空脱除三氯甲烷、甲醇残留。
(5)脱蛋白：配制1％浓度的胰蛋白酶溶液，将脱脂后的条状骨倒入到胰蛋白酶溶液中，搅拌、浸泡4h；完成后捞出条状骨，再使用浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡30min；然后使用甩干机长流水状态下清洗25min，甩干5min，重复4次，至pH为中性。
(6)脱钙：配制3mol/L盐酸溶液，将二次去病毒后的条状骨倒入盐酸溶液中，搅拌，浸泡24h；完成后捞出条状骨原料，使用甩干机在长流水状态下清洗25min，甩干5min，重复4次，至pH为中性。
(7)脱细胞：配制10％浓度的双氧水溶液，将脱钙后的条状骨倒入双氧水溶液中，搅拌，浸泡24h。完成后捞出条状骨，再进行去内毒处理。
(8)去内毒：将脱细胞后的条状骨用倒入到注射用水中，浸泡清洗5次，每次浸泡2h。
(9)冻干：将去内毒后的条状骨平铺在注射用水清洗的不锈钢盘中，使用冻干机进行冻干，冻干条件设定为-20℃下预冻18h，-60℃下冻干72h，如图1所示。
(10)再次切割：将冻干后的条状骨原料按照胶原蛋白基质产品的要求切割成长×宽×高＝8×8×12mm的长方体，如图4所示。
(11)包装：将切割后好的产品装入西林瓶，封口，压盖，得到口腔用胶原蛋白基质材料成品。
对比例1：本实施例同样是制备的口腔用胶原蛋白基质材料。本实施例采用成龄牛骨制备的口腔用胶原蛋白基质材料，其制备流程及参数与实施例3一致。
对比例2：本实施例是采用现有方法制备异种骨胶原基质，具体的制备流程如下：
(1)将冷冻后的小牛骨采用低速锯切割，切割完成的骨块用50℃压力水反复清洗，然后用0.1mol/LNaOH溶液室温下浸泡24h。
(2)将浸泡后的骨块置于含有三氯甲烷-甲醇混合液的索氏提取器中于60℃下脱脂72h；期间，每24h将骨块取出在离心机以4000r/min的速度离心30min左右，清除骨块内细胞成分和脂肪组织，脱脂完成后，骨块捞出，挥发48h，去除残留三氯甲烷和甲醇，并用纯化水清洗4h。
(3)清洗后的骨块再在1mol/L的盐酸中，部分脱钙10min，然后使用双蒸水透析8h，至pH值为6，以去除残留酸液。
(4)脱钙后的骨块放入含有6mol/L尿素的溶液中，并置于4℃的冰箱中脱除非胶原蛋白，时间为24h。
(5)脱除非胶原蛋白后的骨块用0.1％的胰蛋白酶消化，加入叠氮化钠溶液防腐，在37℃条件下消化36h，再用4M的NaCL溶液浸泡12h，然后用重蒸水反复冲洗12h，去除残留胰蛋白酶。
(6)消化候的骨块再进行真空干燥24h，并使用三层聚乙烯薄膜封装，然后环氧乙烷消毒2h，辐照灭菌，即得异种骨胶原基质。
实施例4效果例
本实施例将实施例1～3中利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料与对比例1采用成龄牛骨制备的口腔用胶原蛋白基质材料进行临床性能检测对比，具体结果如表1所示：
表1.各实施例制备的口腔用胶原蛋白基质材料临床性能对比
Figure BDA0002911816690000111
由表1中的数据可以看出，在工艺相同的前提下，实施例1、2、3中α-Gal(残留抗原)和残留DNA含量明显低于对比例1，说明本发明中选用的胎牛松质骨中的异种抗原含量较低，得到的胶原蛋白基质具有较低的免疫原性，临床使用时出现免疫排斥和炎症反应的可能性较小。
由于牛松质骨中的胶原蛋白可以促进成骨细胞的分化，加速机智的均匀矿化，并维持成骨细胞的表型，有利于成骨。因此，由表1数据可以看出，实施例1～3得到的胶原蛋白基质的羟脯氨酸(胶原蛋白的特征氨基酸，作为胶原蛋白的量化指标)含量较高，杂蛋白含量较低，更有利于成骨。
另外，虽然对于多孔材料的最佳孔径大小，尚存在不同的争议，但均认为材料的孔隙大小应满足骨单位和骨细胞生长所需要的空间。实验证明成骨细胞悬浮液中的直径约为20μm，附着时约30μm，展平时伸出伪足可达70μm以上。孔径在5～40μm时，纤维组织可以长入。孔径为40～100μm时，非矿化的骨样组织可以长入，孔径在150μm以上时，能够为骨组织的长入提供理想环境。但是孔隙过大时，会降低胶原基质的弹性和机械强度。由表1中数据可以看出，相对于成年牛松质骨，本发明专利选用胎牛松质骨或猪骨得到的胶原基质，具有良好孔隙率(如图5和图6所示)，同时拥有更好的抗压强度，在临床上更有优势。
实施例5效果例
本实施例将实施例1～3中利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料与对比例2采用现有方法制备异种骨胶原基质进行清洗残留物含量检测对比并进行临床应用效果对比，具体结果如表2和表3所示：
表2.各实施例制备的口腔用胶原蛋白基质材料残留物含量对比
Figure BDA0002911816690000121
由表2中数据可以看出，相对于传统的自然挥发或用乙醇清洗三氯甲烷的方法，本发明中采用真空干燥箱抽真空的方式去除残留三氯甲烷和甲醇，时间更短，而且不会引入新的化学试剂。
本发明采用低浓度的氢氧化钠清洗残留胰蛋白酶，同时利用甩干机清洗残留氢氧化钠，整个胰蛋白去除时间缩短8.5h，成品检测中胰蛋白酶残留量也较低。同时利用甩干机清洗残留盐酸，相对于对比例2清洗时间缩短6h。总体而言，本发明在保证产品质量的前提下，大大缩短了产品周期，更有利于量产。
表3.各实施例制备的口腔用胶原蛋白基质材料临床应用效果对比
Figure BDA0002911816690000131
牙齿缺损后由于牙槽骨丧失了功能性刺激易出现进行性萎缩，因此为缓解牙槽骨骨量减少，提高种植修复效果，临床常应用骨移植材料进行拔牙后的伤口填充。术后常应用牙龈是否充血以及颊侧龈缘中点至舌侧龈缘中点距离表征拔牙窝填充后软组织愈合率，颊侧龈缘中点至舌侧龈缘中点距离小于5mm表示软组织愈合良好。如图7至图9所示，临床试验证明本发明的胶原蛋白基质早期能够促进软组织愈合，其中图7为填充前图片，图8为刚填充图片，图9为愈合图片。
另外，填充修复后一定时间后，需采用CT扫描观察患者的骨吸收体积和骨缺损体积，通过公式(骨缺损体积-骨吸收体积)/骨缺损体积×100％计算骨体积转化率，利用骨体积转化率表征拔牙后种植体对成骨的影响，骨体积转化率小于80％，表示无成骨功能。由表3种可以看出，实施例1～3和对比例2得到的产品在术后30天都使牙龈无充血，也都具有一定的成骨作用。但是，相对于对比例2，实施例1～3的产品在术后30天颊侧龈缘中点至舌侧龈缘中点距离均小于5，说明填充实施例产品的患者软组织愈合情况良好。同时，实施例中的骨体积转化率均在90％以上，说明成骨能力优于对比例。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.一种利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）切割：将冷冻的0～7天龄生物骨原材料在常温下化冻，并切割成一定宽度的条状骨原料；
（2）清洗：反复冲洗切割后的条状骨原料，直至没有明显血水和油脂；
（3）去病毒：配制NaOH溶液，将清洗后的条状骨原料倒入NaOH溶液中，搅拌、浸泡后捞出，在长流水状态下清洗25～30min，甩干5min，重复4次，至清洗液的pH为中性；
（4）脱脂：配制三氯甲烷-甲醇混合溶液，将去病毒后的条状骨原料倒入到混合溶液中，搅拌、浸泡后捞出，真空干燥脱除残留的三氯甲烷和甲醇；
（5）脱蛋白：配制胰蛋白酶溶液，将脱脂后的条状骨原料倒入到胰蛋白酶溶液中，搅拌、浸泡后捞出，再使用氢氧化钠溶液浸泡一段时间，然后在长流水状态下清洗25～30min，甩干5min，重复4次，至清洗液的pH为中性；
（6）脱钙：配制盐酸溶液，将二次去病毒后的条状骨原料倒入盐酸溶液中，搅拌、浸泡、后捞出，在长流水状态下清洗25～30min，甩干5min，重复4次，至清洗液的pH为中性；
（7）脱细胞：配制双氧水溶液，将脱钙后的条状骨原料倒入双氧水溶液中，搅拌、浸泡成后捞出，以备去内毒；
（8）去内毒：将脱细胞后的条状骨原料用倒入到注射用水中，反复浸泡清洗；
（9）冻干：将去内毒后的条状骨原料平铺于容器中，使用冻干机进行冻干；
（10）二次切割：将冻干后的条状骨原料按照需求切割成长方体，获得胶原蛋白基质产品；
（11）包装：将剪切后的胶原蛋白基质产品装入西林瓶，封口，压盖，得到口腔用胶原蛋白基质材料成品。
2.根据权利要求1所述的利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述0～7天龄生物骨原材料为牛龄或猪龄为0～7天的牛骨或猪骨；所述切割成的条状骨原料宽度为9～12mm。
3.根据权利要求1所述的利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述去病毒，配制的NaOH溶液浓度均为0.1～3mol/L，其浸泡的时间为1～4h。
4.根据权利要求1所述的利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述脱脂，配制的三氯甲烷-甲醇混合溶液中三氯甲烷与甲醇的混合体积比为2～3:1，其浸泡的时间为24～72h。
5.根据权利要求1所述的利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述脱蛋白，配制的胰蛋白酶溶液浓度为0.1%～1%；其浸泡的时间为2～4h；所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5mol/L，浸泡的时间为30min。
6.根据权利要求1所述的利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述脱钙，配制的盐酸溶液浓度为0.5～3mol/L，其浸泡的时间为12～24h。
7.根据权利要求1所述的利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法，其特征在于：步骤（7）中，所述脱细胞，配制的双氧水溶液浓度为1%～10%，其浸泡的时间为12～24h。
8.根据权利要求1所述的利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法，其特征在于：步骤（8）中，所述去内毒为将条状骨倒入到注射用水中浸泡清洗1～5次，每次浸泡时间为0.5～2h。
9.根据权利要求1所述的利用生物骨制备口腔用胶原蛋白基质材料的方法，其特征在于：步骤（9）中，所述冻干，条件设定为-20℃下预冻12～18h，-60℃下冻干48～72h。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114788893A (zh) * 2022-04-27 2022-07-26 西岭(镇江)医疗科技有限公司 一种具有抗菌和骨引导性能的胶原蛋白基质骨修复材料的制备方法
CN114949350B (zh) * 2022-05-31 2024-04-02 西岭(镇江)医疗科技有限公司 一种负载碱性成纤维细胞生长因子的胶原蛋白支架
CN115990289B (zh) * 2023-01-09 2024-05-31 西岭(镇江)医疗科技有限公司 一种不完全脱钙骨诱导材料的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1456363A (zh) * 2003-05-27 2003-11-19 重庆大学 异种骨胶原基质制备的新方法
CN111330080A (zh) * 2020-03-31 2020-06-26 江苏白衣缘生物工程有限公司 一种引导口腔骨再生的生物膜及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006095342A2 (en) * 2005-03-07 2006-09-14 Technion Research & Development Foundation Ltd. Natural tissue-derived decellularized matrix and methods of generating and using same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1456363A (zh) * 2003-05-27 2003-11-19 重庆大学 异种骨胶原基质制备的新方法
CN111330080A (zh) * 2020-03-31 2020-06-26 江苏白衣缘生物工程有限公司 一种引导口腔骨再生的生物膜及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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脱蛋白对异种骨中骨形成蛋白影响的实验研究;田家亮等;《现代预防医学》;20150310(第05期);第886-888页 *

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