CN112190759A - 一种脱细胞基质与环戊烯酮类前列腺素组合物的制备方法 - Google Patents

一种脱细胞基质与环戊烯酮类前列腺素组合物的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112190759A
CN112190759A CN202010994012.6A CN202010994012A CN112190759A CN 112190759 A CN112190759 A CN 112190759A CN 202010994012 A CN202010994012 A CN 202010994012A CN 112190759 A CN112190759 A CN 112190759A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
pgj
pcl
acellular matrix
periodontal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010994012.6A
Other languages
English (en)
Inventor
吴燕岷
柳佳美
黄佳萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Affiliated Hospital Zhejiang University College Of Medicine
Original Assignee
Second Affiliated Hospital Zhejiang University College Of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Affiliated Hospital Zhejiang University College Of Medicine filed Critical Second Affiliated Hospital Zhejiang University College Of Medicine
Priority to CN202010994012.6A priority Critical patent/CN112190759A/zh
Publication of CN112190759A publication Critical patent/CN112190759A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3633—Extracellular matrix [ECM]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/22—Lipids, fatty acids, e.g. prostaglandins, oils, fats, waxes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/41—Anti-inflammatory agents, e.g. NSAIDs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/12—Materials or treatment for tissue regeneration for dental implants or prostheses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种脱细胞基质与环戊烯酮类前列腺素组合物的制备方法，本发明由负载于聚己内酯/明胶电纺纳米纤维膜的牙周韧带细胞脱细胞基质与15d‑PGJ2‑NC组合而成，该方法首次将两者组合，并用于牙周缺损。相对于单一组分的应用，组合物兼具组织再生和抗炎作用，适用牙周炎性环境。本发明首次采用经明胶改性的PCL/GE作为脱细胞膜片承托支架，相对于单纯的PCL或其他混纺比例的PCL/GE，具有更好的促进细胞粘附与血管化作用。本发明所需材料的制备方法与设备需求简单、成本低廉、所得材料一致性较好。动物实验结果表明，本发明组合物应用可达到良好的修复牙周缺损的效果，为该组合物的临床应用提供了初步的科学证据。

Description

一种脱细胞基质与环戊烯酮类前列腺素组合物的制备方法
技术领域
本发明属于组织工程与再生医学领域，涉及一种脱细胞基质与环戊烯酮类前列腺素组合物的制备方法，是一种由牙周韧带细胞膜片的脱细胞基质与15d-PGJ2-NC组合的组合物制备方法，可用于牙周缺损修复。
背景技术
慢性牙周炎是一种以牙周组织破坏为特征的慢性感染性疾病，在我国发病率高达80％，是成年人缺牙的首要原因。牙周组织由复杂的软硬组织构成，包括牙槽骨，牙周韧带和牙骨质，修复牙周组织缺损是牙周治疗的最终目标。传统的牙周组织再生疗法，如骨移植、引导组织再生术、生长因子、局部应用釉基质蛋白等，可使牙周膜、牙骨质和牙槽骨获得一定程度的再生，但其再生是极有限的且难以预计的。而且，牙周炎导致的牙周组织缺损处于炎性环境中，因此如何在牙周炎性微环境中修复牙周缺损仍是一大难题。
研究表明，牙周韧带细胞与其他牙周来源的细胞如牙龈结缔组织和牙槽骨细胞相比更适合作为牙周再生的种子细胞。采用体外培养患者自身的带有完整细胞外基质的牙周韧带干细胞膜片后再植的细胞膜片技术，使牙周韧带细胞直接接触到牙根表面促进组织原位再生，有助于早期新附着形成和牙槽骨新生，该方法在小动物和大动物实验中都被证实可成功获得牙周再生，表明牙周韧带细胞及其细胞外基质具有促进牙周再生的作用。但该方法应用于临床仍有许多局限，如依赖患者自身的细胞、需要经过体外培养后再植入和经认证具有干细胞培养资质的实验室设施等。而采用脱细胞基质可克服上述缺点。脱细胞基质去除了细胞和可溶性蛋白等引起免疫反应的物质，保留了天然结构，现有研究证实体外培养的组织工程化的脱细胞结构可保持其结构完整性，维持分子功能，体内移植后可提高组织再生能力。此外，在脱细胞基质中还发现有成纤维细胞生长因子-2、转化生长因子-2、血管内皮生长因子等对细胞生长分化有重要作用的生长因子。有学者发现脱细胞牙周韧带基质可被同种异体的人牙周韧带干细胞再细胞化。基于上述研究，脱细胞牙周韧带基质极有希望成为兼具良好牙周再生潜力和易于临床转化优点的可商品化的牙周组织工程产品。
然而，牙周韧带细胞脱细胞基质的机械性能较差，影响其处理与转运。使用聚己内酯制成的纳米电纺纤维膜已被证明具有支持用于牙周韧带和牙本质等软硬组织界面再生纤维的细胞膜片所需的生物力学特性。但是单纯的PCL电纺纤维膜亲水性较差，实际操作中成功率不高。天然材料明胶具有良好的亲水性，可以与其他材料混纺改善其生物力学特性。研究表明，PCL/GE电纺纳米纤维膜具有良好的细胞粘附特性和促进组织再生能力。其中PCL与GE混纺比例为70:30时，具有更好的细胞粘附、促进血管化效果。因此，PCL/GE电纺纤维膜用于负载牙周韧带细胞脱细胞基质增强其机械强度可能具有更好的再生应用前景。
环戊烯酮类前列腺素15d-PGJ2是具有调控宿主免疫炎症反应潜能的脂质信号分子。作为过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)的内源性配体，15d-PGJ2可通过PPAR-γ依赖或PPAR-γ独立方式抑制多种前炎性因子基因的转录活化。15d-PGJ2潜在的抗炎特性已经过大量体内体外实验证实。在申请人前期研究中已成功制备具有缓释作用的l5d-PGJ2聚乳酸羟基乙酸(PLGA)纳米粒，且研究结果证实l5d-PGJ2-NC在大鼠临界骨缺损区可发挥抗炎和促成骨作用。目前，尚未有研究将脱细胞基质与l5d-PGJ2-NC组合物用于牙周缺损。因此，本发明首次将牙周韧带细胞膜片来源的脱细胞基质与l5d-PGJ2-NC同时应用于修复牙周组织缺损，有望控制牙周组织局部炎症对牙周再生的影响，为炎症环境下牙周组织再生创造条件，提供一种抗炎和再生并进的新型材料。
经文献检索，目前采用脱细胞基质联合15d-PGJ2-NC用于修复牙周缺损的组合物尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种脱细胞基质与环戊烯酮类前列腺素组合物的制备方法，所述环戊烯酮类前列腺素为15d-PGJ2-NC，是一种由牙周韧带细胞膜片的脱细胞基质与15d-PGJ2-NC组合的组合物的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案包括以下几个步骤实现：
1.脱细胞基质的制备：
(1)将牙周韧带细胞以高密度接种于12孔细胞培养板；
(2)培养板中加入含一定浓度抗坏血酸的完全培养基，培养获得牙周韧带细胞膜片；
(3)采用静电纺丝法获得PCL/GE电纺纳米纤维膜，经紫外消毒后包裹上牙周韧带细胞膜片；
(4)采用表面活性剂联合DNA酶处理上述细胞膜片，漂洗后获得相应的脱细胞基质。
所述步骤(1)中牙周韧带细胞接种密度为1×105个/孔。
所述步骤(2)所加入的培养基中抗坏血酸的浓度为100μg/mL，细胞膜片培养周期约为10～14天，观察到细胞膜片边缘稍卷曲即代表细胞膜片已培养成熟。
所述步骤(3)通过常温下称取0.6g PCL溶于10mL的四氟乙烯(Tetrafluoroethylene，TFE)溶液中，0.6g GE溶于10mL的TFE溶液中振荡至完全溶解，制备6wt％的PCL/TFE溶液和GE/TFE溶液。按质量比7:3混合6wt％的PCL/TFE和6wt％的明胶/TFE来制备PCL-GE溶液，向溶液中加少量0.2v/v％的乙酸(HAc)/TFE溶液，得到透明的PCL-GE-HAc(PGH)溶液。用注射器吸取PGH电纺液，电纺电压20kV，接收距离设置为8cm，注射泵推进速率为0.3mL/h，温度50℃，设置静电纺丝机的取向为90°进行层层堆积，使用干净的尖头镊子收集，放入干净的培养皿，-40℃冷冻4h后冷冻干燥24h，使用前紫外过夜灭菌。
所述步骤(4)中处理细胞膜片的试剂为Triton X-100/NH4OH溶液和I型DNA酶溶液，漂洗液为PBS缓冲液。
2.15d-PGJ2-NC的制备，采用乳化溶剂蒸发法：
将PLGA(100mg)、司班60(40mg)、硬脂酸甘油酯(200mg)、15d-PGJ2(100μg)，溶于丙酮(30mL)中形成油相；水相为吐温80(60mg)充分溶于30mL的ddH2O，将溶解后的油相缓慢加入水相中，边加边搅拌，持续搅拌10分，旋转蒸发至适宜的药物浓度，制备的15d-PGJ2-NC溶液的药物终浓度为100mg/L。
3.脱细胞基质与15d-PGJ2-NC组合物
脱细胞基质与15d-PGJ2-NC分别包装，15d-PGJ2-NC负载明在明胶海绵上，明胶海绵负载的15d-PGJ2-NC浓度为100mg/L，体积为25μL。
本发明组合物的使用：
1.采用种植机设备制备大鼠牙周缺损模型；
2.将基于牙周韧带细胞膜片的脱细胞基质置入牙周缺损；
3.在脱细胞基质表面置入负载适量15d-PGJ2-NC的明胶海绵；
4.分层缝合，关闭创口。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的修复牙周缺损的新型组合物材料是在应用牙周韧带细胞膜片来源的脱细胞基质的基础上联合应用15d-PGJ2-NC，首次将其用于牙周缺损的再生治疗，该组合物兼具组织再生和减轻局部炎症的作用，利于炎性环境中的牙周组织再生。本发明通过所述组合物建立了一种利用Triton X-100/NH4OH溶液联合I型DNA酶制备，PCL/GE电纺纳米纤维膜负载的脱细胞基质的方法，其设备需求简单、成本低廉、产品一致性好。基于牙周韧带细胞膜片的脱细胞基质具有良好的细胞外基质网络，含有丰富的I型胶原蛋白和纤维连接蛋白，而且去除了细胞和可溶性蛋白等引起免疫反应的物质，无免疫。动物实验结果表明，本发明的脱细胞基质和15d-PGJ2-NC组合物可达到良好的修复牙周缺损的效果，可用于牙周缺损修复，为该新型组合物材料的临床应用提供了初步的科学证据，应用前景良好。
附图说明
图1是牙周韧带细胞膜片与牙周韧带细胞脱细胞基质扫描电镜镜下形貌。
图2是牙周韧带细胞膜片与牙周韧带细胞脱细胞基质主要成分分析。
图3是透射电镜下15d-PGJ2-NC的形态。
图4是牙周韧带细胞脱细胞基质对牙周骨缺损再生影响动物实验手术过程。
图5是大鼠下颌骨Micro-CT影像。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步的详细说明。
实施例1一种脱细胞基质与15d-PGJ2-NC组合物的制备方法
1.脱细胞基质的制备：
(1)将牙周韧带细胞以高密度接种于12孔细胞培养板；牙周韧带细胞接种密度为1×105个/孔。
(2)培养板中加入含一定浓度抗坏血酸的完全培养基，培养获得牙周韧带细胞膜片；所加入的培养基中抗坏血酸的浓度为100μg/mL，细胞膜片培养周期约为10～14天，观察到细胞膜片边缘稍卷曲即代表细胞膜片已培养成熟。
(3)采用静电纺丝法获得PCL/GE电纺纳米纤维膜，经紫外消毒后包裹上牙周韧带细胞膜片；通过常温下称取0.6g PCL溶于10mL的四氟乙烯(Tetrafluoroethylene，TFE)溶液中，0.6g GE溶于10mL的TFE溶液中振荡至完全溶解，制备6wt％的PCL/TFE溶液和GE/TFE溶液。按质量比7:3混合6wt％的PCL/TFE和6wt％的明胶/TFE来制备PCL-GE溶液，向溶液中加少量0.2v/v％的乙酸(HAc)/TFE溶液，得到透明的PCL-GE-HAc(PGH)溶液。用注射器吸取PGH电纺液，电纺电压20kV，接收距离设置为8cm，注射泵推进速率为0.3mL/h，温度50℃，设置静电纺丝机的取向为90°进行层层堆积，使用干净的尖头镊子收集，放入干净的培养皿，-40℃冷冻4h后冷冻干燥24h，使用前紫外过夜灭菌。
(4)采用表面活性剂联合DNA酶处理上述细胞膜片，漂洗后获得相应的脱细胞基质；处理细胞膜片的试剂为Triton X-100/NH4OH溶液和I型DNA酶溶液，漂洗液为PBS缓冲液。
图1所示为牙周韧带细胞膜片与牙周韧带细胞脱细胞基质SEM镜下形貌对比：应用抗坏血酸诱导形成人牙周韧带细胞膜片，采用表面活性剂联合DNA酶脱细胞，脱细胞前后分别取样进行SEM电镜观察，A-C为牙周韧带细胞膜片，D-F为牙周韧带细胞脱细胞基质。牙周韧带细胞脱细胞基质具有致密连接的纤维网络结构，其形态和结构与牙周韧带细胞膜片相似，且无明显的细胞碎片和核碎片。
图2牙周韧带细胞膜片与牙周韧带细胞脱细胞基质主要成分分析：应用抗坏血酸诱导形成人牙周韧带细胞膜片，采用表面活性剂联合DNA酶脱细胞，脱细胞前后分别取样采用ELISA检测生长因子、picogreen试剂盒检测DNA、羟脯氨酸试剂盒检测胶原蛋白；A-C:牙周韧带细胞膜片和牙周韧带细胞脱细胞基质的bFGF、HGF、VEGF含量；D：牙周韧带细胞膜片和牙周韧带细胞脱细胞基质的胶原蛋白含量；E：牙周韧带细胞膜片和牙周韧带细胞脱细胞基质的DNA含量。黑色：脱细胞前；灰色：脱细胞后。*表示p<0.05。结果提示该制备方法成功去除96.6％的DNA，保留了大部分胶原蛋白，并能保留脱细胞前大约10％的生长因子。在这些实例中我们成功有效构建了基于牙周韧带细胞膜片的脱细胞基质。
2.15d-PGJ2-NC的制备，采用乳化溶剂蒸发法：
将PLGA(100mg)、司班60(40mg)、硬脂酸甘油酯(200mg)、15d-PGJ2(100μg)，溶于丙酮(30mL)中形成油相；水相为吐温80(60mg)充分溶于30mL的ddH2O，将溶解后的油相缓慢加入水相中，边加边搅拌，持续搅拌10分，旋转蒸发至适宜的药物浓度，制备的15d-PGJ2-NC溶液的药物终浓度为100mg/L。图3为透射电镜下15d-PGJ2-NC的形态，乳化溶剂蒸发法制备15d-PGJ2-NC，然后在透射电镜下进行观察，纳米粒呈圆形，大小均匀分布。
3.脱细胞基质与15d-PGJ2-NC组合物：
脱细胞基质与15d-PGJ2-NC分别包装，15d-PGJ2-NC负载明在明胶海绵上，明胶海绵负载的15d-PGJ2-NC浓度为100mg/L，体积为25μL。
实施例2组合物使用
一种脱细胞基质与15d-PGJ2-NC组合物用于牙周缺损修复的方法，包括以下步骤：
1.采用种植机设备制备大鼠牙周缺损模型；大鼠选用8周龄雄性SD大鼠，所制备的牙周缺损区大小为2mm×4mm(高×宽)，深度以到达牙根面且不损伤牙根为宜，约1～1.5mm。
2.将基于牙周韧带细胞膜片的脱细胞基质置入牙周缺损；
3.在脱细胞基质表面置入负载适量15d-PGJ2-NC的明胶海绵；明胶海绵负载的15d-PGJ2-NC浓度为100mg/L，体积为25μL。
4.分层缝合，关闭创口。
图4所示为实例中将基于牙周韧带细胞膜片的脱细胞基质和负载适量15d-PGJ2-NC的明胶海绵一起置入大鼠骨缺损的动物实验过程。A消毒后剃毛，B切开皮肤，C制备下颌骨骨缺损，D植入牙周韧带细胞脱细胞基质，E植入含1.5μg 15d-PGJ2-NC的明胶海绵，F缝合关闭创口。在术后2周和4周处死实例中大鼠，取下颌骨进行Micro-CT扫描。
图5为大鼠下颌骨Micro-CT影像，A、B为术后2周，C、D为术后4周；A、C为对照组，B、D为牙周韧带细胞脱细胞基质组。结果显示2周时大鼠下颌第一磨牙颊侧骨质不连续，有长矩形骨缺损，缺损深至牙根表面，4周时对照组大鼠下颌第一磨牙颊侧骨质依然有不连续区域，仍有深达牙根表面的骨缺损，相对2周不连续区域缩小，实验组骨表面无明显不连续，骨表面粗糙不光滑，呈凹坑样表面，但牙根已被骨质覆盖。在这些实例中，脱细胞基质联合15d-PGJ2-NC表现出令人满意的促进牙周骨缺损愈合能力。
本发明的修复牙周缺损的新型组合物材料是在应用牙周韧带细胞膜片来源的脱细胞基质的基础上联合应用15d-PGJ2-NC，该方法首次将其用于牙周缺损的再生治疗，有利于解决炎性微环境下牙周组织再生困难的问题，为临床上牙周再生治疗提供了崭新的思路。本发明建立了一种利用Triton X-100/NH4OH溶液联合I型DNA酶制备，PCL/GE电纺纳米纤维膜负载的脱细胞基质的方法，其设备需求简单、成本低廉、产品一致性好。基于牙周韧带细胞膜片的脱细胞基质具有良好的细胞外基质网络，含有丰富的I型胶原蛋白和纤维连接蛋白，且无免疫原性，克服了细胞疗法用于牙周组织再生的诸多缺点，如依赖患者自身的细胞、细胞需经体外培养后再植入而致治疗周期长等。经30％明胶改性的PCL/GE电纺纳米纤维膜具有良好的细胞粘附特性和促进组织再生能力。本发明的另一优点是，本发明的组合物二采用负载15d-PGJ2-NC溶液的明胶海绵。大量体内外实验已证实15d-PGJ2-NC的潜在抗炎特性，且明胶海绵是一种可吸收生物材料，是抗炎纳米粒的良好载体，安全性好。因此，本发明的组合物有利于减轻局部炎症，并在体内构建适宜的微环境从而达到良好的组织再生修复效果。
最后所应当说明的是，在本说明书的描述中，参考术语“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。此外，尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (5)

1.一种脱细胞基质与环戊烯酮类前列腺素组合物的制备方法，所述环戊烯酮类前列腺素为15d-PGJ2-NC，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)脱细胞基质的制备：
(a)将牙周韧带细胞以高密度接种于12孔细胞培养板；
(b)培养板中加入含一定浓度抗坏血酸的完全培养基，培养获得牙周韧带细胞膜片；
(c)采用静电纺丝法获得PCL/GE电纺纳米纤维膜，经紫外消毒后包裹上牙周韧带细胞膜片；
(d)采用表面活性剂联合DNA酶处理上述细胞膜片，漂洗后获得相应的脱细胞基质；
(2)15d-PGJ2-NC的制备，采用乳化溶剂蒸发法：
将PLGA、司班60、硬脂酸甘油酯、15d-PGJ2，溶于丙酮中形成油相；水相为吐温80充分溶于ddH2O，将溶解后的油相缓慢加入水相中，边加边搅拌，持续搅拌10分，旋转蒸发，制备的15d-PGJ2-NC溶液的药物终浓度为100mg/L；
(3)脱细胞基质与15d-PGJ2-NC组合物：
脱细胞基质与15d-PGJ2-NC分别包装，15d-PGJ2-NC负载明在明胶海绵上，明胶海绵负载的15d-PGJ2-NC浓度为100mg/L，体积为25μL。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中牙周韧带细胞接种密度为1×105个/孔。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)加入的培养基中抗坏血酸的浓度为100μg/mL，细胞膜片培养周期约为10～14天，观察到细胞膜片边缘稍卷曲即代表细胞膜片已培养成熟。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)通过常温下称取0.6gPCL溶于10mL的四氟乙烯溶液中，0.6g GE溶于10mL的四氟乙烯溶液中振荡至完全溶解，制备6wt％的PCL/TFE溶液和GE/TFE溶液，按质量比7:3混合6wt％的PCL/TFE和6wt％的明胶/TFE来制备PCL-GE溶液，向溶液中加少量0.2v/v％的HAc/TFE溶液，得到透明的PCL-GE-HAc溶液，用注射器吸取PGH电纺液，电纺电压20kV，接收距离设置为8cm，注射泵推进速率为0.3mL/h，温度50℃，设置静电纺丝机的取向为90°进行层层堆积，使用干净的尖头镊子收集，放入干净的培养皿，-40℃冷冻4h后冷冻干燥24h，使用前紫外过夜灭菌。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)中处理细胞膜片的试剂为Triton X-100/NH4OH溶液和I型DNA酶溶液，漂洗液为PBS缓冲液。
CN202010994012.6A 2020-09-21 2020-09-21 一种脱细胞基质与环戊烯酮类前列腺素组合物的制备方法 Pending CN112190759A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010994012.6A CN112190759A (zh) 2020-09-21 2020-09-21 一种脱细胞基质与环戊烯酮类前列腺素组合物的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010994012.6A CN112190759A (zh) 2020-09-21 2020-09-21 一种脱细胞基质与环戊烯酮类前列腺素组合物的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112190759A true CN112190759A (zh) 2021-01-08

Family

ID=74015763

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010994012.6A Pending CN112190759A (zh) 2020-09-21 2020-09-21 一种脱细胞基质与环戊烯酮类前列腺素组合物的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112190759A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115887766A (zh) * 2022-11-18 2023-04-04 成都世联康健生物科技有限公司 载脱细胞膜片生物支架、制备方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103966158A (zh) * 2014-05-28 2014-08-06 中国人民解放军第四军医大学 一种牙周组织特异性细胞外基质ecm的制备方法及其应用
US20200179566A1 (en) * 2017-07-14 2020-06-11 Wuhan Kangchuang Technology Co., Ltd, A composite membrane comprising a decellularized amniotic membrane and a method for preparing the same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103966158A (zh) * 2014-05-28 2014-08-06 中国人民解放军第四军医大学 一种牙周组织特异性细胞外基质ecm的制备方法及其应用
US20200179566A1 (en) * 2017-07-14 2020-06-11 Wuhan Kangchuang Technology Co., Ltd, A composite membrane comprising a decellularized amniotic membrane and a method for preparing the same

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CF ALVES等: ""Effects of 15d-PGJ2-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanocapsules on inflammation"", 《BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY》 *
FARAG A等: ""The effect of decellularized tissue engineered constructs on periodontal regeneration"", 《J CLIN PERIODONTOL.》 *
燕丽等: "明胶/聚己内酯纳米纤维电纺膜在组织工程中的应用进展", 《组织工程与重建外科杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115887766A (zh) * 2022-11-18 2023-04-04 成都世联康健生物科技有限公司 载脱细胞膜片生物支架、制备方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2645473C2 (ru) Тканевые конструкции, полученные с помощью биоинженерии, и способы их получения и применения
Lee et al. Development of artificial dermis using 3D electrospun silk fibroin nanofiber matrix
JP6016751B2 (ja) 培養歯根膜細胞シート、製造方法及びその利用方法
JP6633628B2 (ja) 口腔粘膜を再生するためのバイオマテリアル足場材料
US20190216984A1 (en) Vascularized full thickness tissue-engineered skin assembled by hydrogel, nanofibrous scaffolds and skin cell layers and preparation method thereof
CN107213529B (zh) 一种用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料的制备方法
Nie et al. Nano-hydroxyapatite mineralized silk fibroin porous scaffold for tooth extraction site preservation
Safi et al. Preparing polycaprolactone scaffolds using electrospinning technique for construction of artificial periodontal ligament tissue
CN105664260A (zh) 基于石墨烯/丝素蛋白的骨组织工程三维多孔支架制备方法
CN1836034A (zh) 生产神经元的方法
CN111298198B (zh) 一种双层可吸收仿生屏障膜及其制备方法和应用
Bakhtiar et al. Fabrication and characterization of a novel injectable human amniotic membrane hydrogel for dentin-pulp complex regeneration
JP2010500335A (ja) 皮膚創傷を治療する方法
CN112190759A (zh) 一种脱细胞基质与环戊烯酮类前列腺素组合物的制备方法
WO2011050622A1 (zh) 一种用于组织修复的颗粒状生物材料及其制备方法
CN113633825B (zh) 一种负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法及应用
Feng et al. 3D printing of stem cell responsive ionically-crosslinked polyethylene glycol diacrylate/alginate composite hydrogels loaded with basic fibroblast growth factor for dental pulp tissue engineering: A preclinical evaluation in animal model
US20110305647A1 (en) Use of a polysaccharide which is excreted by the vibrio diabolicus species for the regeneration and protection of the periodontium
CN110917409B (zh) 二甲双胍缓释tHA/PCL引导组织再生膜及其制备方法
CN109589455B (zh) 一种热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物及制备方法
CN106390180A (zh) 一种具有生物活性的复合敷料及其制备方法
Cheng et al. A novel lamellar structural biomaterial and its effect on bone regeneration
CN112618798A (zh) 一种骨修复材料的制备方法
CN115737913B (zh) 一种可控释放h2s的心脏补片及其制备方法与应用
Aghazadeh et al. Recent Advances of Natural Cellulosic Non-Woven Scaffolds for Tissue Engineering

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20210108

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication