CN115887766A - 载脱细胞膜片生物支架、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种载脱细胞膜片生物支架、制备方法及应用，所述载脱细胞膜片生物支架包括：生物支架、分别搭载在所述生物支架两侧的促牙槽骨再生脱细胞膜片和促牙周膜再生脱细胞膜片。所述载脱细胞膜片生物支架应用于制备牙周再生模块，所述载脱细胞膜片生物支架包括：生物支架、分别搭载在所述生物支架两侧的促牙槽骨再生脱细胞膜片和促牙周膜再生脱细胞膜片，所述促牙槽骨再生脱细胞膜片和所述牙周膜再生脱细胞膜片用于分别在所述生物支架的两侧提供不同的再生环境，从而提供两个独立的再生环境分别用于牙周膜再生和牙槽骨再生，进而实现牙周再生。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学基础研究领域，特别是涉及一种载脱细胞膜片生物支架、制备方法及应用。
背景技术
由牙周炎、牙槽突骨折、骨开窗、骨开裂、牙槽骨先天性发育不良及颌骨畸形等造成的牙周缺损的增量技术一直是临床上的重大问题，目前临床主要采用牙周引导性骨再生、牙周植骨手术等治疗骨缺损。但这两种治疗方法均存在一定的不足，其中，引导性骨再生等技术主要依赖病变周围组织的自我修复，过程漫长且疗效不确切，此外引导性骨再生主要针对骨组织丧失，对于牙周附着丧失及牙周膜结构损失并无针对性解决措施。
目前有通过脱细胞外基质促进骨再生的方案往往将脱细胞外基质溶于高分子溶液中，结合静电纺丝技术，赋予细胞外基质一定形态和强度。然而这种应用方式往往破坏了细胞外基质的三维结构，并且导致细胞外基质的浓度下降，从而削弱细胞外基质的应用效果。
因此，目前亟需一种新的针对牙周缺损的解决方案。
发明内容
为解决上述背景技术中存在的问题，本发明提供了一种载脱细胞膜片生物支架、制备方法及应用。本发明实施例采用生物相容性良好的生物支架，利用其细胞亲和力直接构建高质量有序排列的细胞膜片，通过温和的脱细胞方法，获得高质量的、结构完整的、与支架紧密结合的载双面脱细胞膜片的“三明治结构”生物支架，以进行牙周缺损修复。
第一方面，本发明提供了一种载脱细胞膜片生物支架，所述载脱细胞膜片生物支架包括：生物支架、分别搭载在所述生物支架两侧的促牙槽骨再生脱细胞膜片和促牙周膜再生脱细胞膜片。
可选地，所述生物支架为三层结构，包括：牙周膜层、中间层、牙槽骨层，所述牙周膜层和所述牙槽骨层为有序纤维，所述中间层为无序网格状纤维。
可选地，所述生物支架为明胶-聚己内酯生物支架。
可选地，所述促牙槽骨再生脱细胞膜片包括以下任一种：骨髓间充质干细胞脱细胞膜片、脂肪干细胞脱细胞膜片、成骨细胞脱细胞膜片；
所述促牙周膜再生脱细胞膜片包括以下任一种：牙周膜干细胞脱细胞膜片、牙囊干细胞脱细胞膜片、成牙骨质细胞脱细胞膜片。
第二方面，本发明提供了一种载脱细胞膜片生物支架的制备方法，所述方法包括：
构建生物支架；
在所述生物支架两侧分别搭载骨髓间充质干细胞膜片和牙周膜干细胞膜片；
对分别搭载在生物支架两侧的骨髓间充质干细胞膜片和牙周膜干细胞膜片进行脱细胞处理，得到载脱细胞膜片生物支架。
可选地，所述构建生物支架包括：
配置明胶-聚己内酯电纺液；
分别构建牙周膜层、中间层、牙槽骨层，得到电纺丝膜；
对所述电纺丝膜进行交联，得到所述生物支架。
可选地，所述在所述生物支架两侧分别搭载骨髓间充质干细胞膜片和牙周膜干细胞膜片包括：
将所述生物支架的牙槽骨层朝上，完成促牙槽骨再生细胞膜片负载；
反转所述生物支架，将所述生物支架的牙周膜层朝上，完成促牙周膜再生细胞膜片负载。
可选地，所述方法还包括：
将所述载脱细胞膜片生物支架置于含有0.5％双抗的基础培养基中浸泡，在4℃进行短期体外保存。
可选地，所述方法还包括：
利用去离子水对所述载脱细胞膜片生物支架进行水洗；
冻干水洗后的载脱细胞膜片生物支架；
利用环氧乙烷进行灭菌；
进行长期保存。
第三方面，本发明提供了一种载脱细胞膜片生物支架的应用，应用于制备牙周再生模块，所述载脱细胞膜片生物支架包括：生物支架、分别搭载在所述生物支架两侧的促牙槽骨再生脱细胞膜片和促牙周膜再生脱细胞膜片，所述促牙槽骨再生脱细胞膜片和所述牙周膜再生脱细胞膜片用于分别在所述生物支架的两侧提供不同的再生环境，以分别支持牙槽骨组织和牙周膜组织的形成。
本发明实施例中，以组织工程支架的形式制备了生物支架，以促进受损牙周组织的再生。采用静电纺丝可确保调整再生膜的孔径和直径以及其他理化特性。从而能够应用不同的微观结构引导牙周组织中多个组织的形成，最终在牙周缺损处再生功能性牙周。
本发明实施例提供的载脱细胞膜片生物支架是由细胞特异性ECM修饰的生物支架，该生物支架成功负载具有有序拓扑结构ECM-P和ECM-B的静电纺丝支架以构建三明治结构，从而分别提供两个独立的再生环境用于牙周膜/牙骨质再生和牙槽骨再生。不仅这种三明治状的生物支架起到阻隔膜的作用，所搭载的细胞外基质成分还起到了再生引发剂的作用。
本发明实施例中，使用来自牙周特异性干细胞(PDLSCs和BMSC)的三明治结构脱细胞片与分层电纺明胶基膜相结合，可以提供能够指导细胞生长和促进综合牙周再生的微环境，具有理想的生物相容性，机械特性以及牙骨质分化，牙周分化和成骨分化的感应性。此外，这种三明治结构作为隔断促进了不同区域的牙骨质再生和成骨再生，为两个再生中心腾出了空间。并且，本发明实施例提供的生物支架具有理想的生物降解速率，逐渐被新生牙骨质和牙槽骨中新形成的牙周纤维取代，完成牙周组织再生。
附图说明
图1是本发明实施例中一种完整的牙周缺损修复过程的流程图；
图2是本发明实施例1中制备得到的三层明胶/聚己内酯静电纺丝膜的结构示意图；
图3是本发明实施例2中制备得到的载脱细胞膜片生物支架上负载的BMSCs和PDLSCs的免疫荧光图像；
图4是本发明实施例2中制备得到的载脱细胞膜片生物支架上负载的BMSCs和PDLSCs的扫描电镜观察结果图；
图5是本发明实施例2中制备得到载脱细胞膜片生物支架用于牙周缺损体内实验中的马松三色染色结果；
图6是本发明实施例2中制备得到载脱细胞膜片生物支架用于牙周缺损体内实验中的HE染色结果；
图7是本发明实施例2中制备得到载脱细胞膜片生物支架用于牙周缺损体内实验后对照组与实验组牙周相关蛋白免疫荧光染色结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规试剂产品。
由牙周炎、创伤和肿瘤引起的牙周缺损一直是一个令人关注的问题，牙周缺损通常会导致牙周损伤、附着缺失、骨质缺陷，最后导致牙齿脱落。由于牙周组织的复杂组织结构，丢失的牙周组织的再生具有挑战性。牙周是一种具有三明治状结构的复杂组织：牙槽骨-牙周膜-牙骨质，其中，牙周膜纤维的两端在牙槽骨和牙骨质中紧密结合。
来自下颌骨的骨髓间充质干细胞(BMSCs)主要参与牙槽骨的再生，而牙囊干细胞(PDLSCs)主要参与牙周膜和牙骨质的再生。
由此，本发明实施例提出：在用于牙周再生的生物材料的两侧提供不同的再生线索，以支持不同组织的形成。
细胞外基质(ECM)是一种动态而复杂的微环境，具有优异的生物物理，生物力学和生化特性，在体内平衡和组织再生中起着关键作用。
基于此，本发明实施例经过一系列地探索后，提出了一种新的牙周再生的解决方案，如图1所示，示出了本发明实施例提供的牙周再生策略的流程示意图，包括三部分：(A)生物支架(GP-TLS支架)构建、(B)有序牙周膜干细胞(PDLSC)/骨髓间充质干细胞(BMSC)膜片构建、双载有序PDLSC/BMSC膜片外基质支架构建及应用。其中，生物支架包括：具有有序纤维表面的牙周膜层、具有多孔结构的中间层、具有有序纤维的牙槽骨层，该生物支架的材料为明胶/聚己内酯。完成生物支架的构建之后，在生物支架的牙槽骨层接种BMSCs，再翻转生物支架，在牙周膜层接种PDLSC，从而完成细胞膜片的构建，得到有序PDLSC/BMSC膜。进一步，利用脱细胞技术对负载了有序PDLSC/BMSC膜的生物支架进行脱细胞处理，得到双载有序PDLSC/BMSC膜片外基质支架，该支架的牙周膜侧负载了PDLSC外基质、牙槽骨侧负载了BMSC外基质。将该双载有序PDLSC/BMSC膜片外基质支架移植到牙周缺损处，完成牙周缺损的修复。
具体的，本发明实施例中提出了一种载脱细胞膜片生物支架，所述载脱细胞膜片生物支架包括：生物支架、分别搭载在所述生物支架两侧的促牙槽骨再生脱细胞膜片和促牙周膜再生脱细胞膜片。
所述生物支架为三层结构，包括：牙周膜层、中间层、牙槽骨层，所述牙周膜层和所述牙槽骨层为有序纤维，所述中间层为无序网格状纤维。
具体的，所述生物支架为明胶-聚己内酯生物支架。
所述促牙槽骨再生脱细胞膜片包括以下任一种：骨髓间充质干细胞脱细胞膜片、脂肪干细胞脱细胞膜片、成骨细胞脱细胞膜片。
本发明实施例中，具有牙槽骨再生能力的骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞或者成骨细胞，均可以作为促牙槽骨再生脱细胞膜片的来源。
所述促牙周膜再生脱细胞膜片包括以下任一种：牙周膜干细胞脱细胞膜片、牙囊干细胞脱细胞膜片、成牙骨质细胞脱细胞膜片。
本发明实施例中，具有牙周膜再生能力的牙周膜干细胞、牙囊干细胞、成牙骨质细胞，均可以作为促牙周膜再生脱细胞膜片的来源。
纯ECM的简单应用往往无法重建缺陷结构。这可能是由牙周组织的复杂组成和结构引起的，牙周组织是软组织和硬组织的有机组合，而ECM通常太脆弱，无法提供所需的刚度和负载力的机械转导。脱细胞膜片太脆弱，无法形成具有所需形状和尺寸的可靠3D结构，也无法保持在某些牙周诱导结构中。
本发明实施例中，以组织工程支架的形式制备了生物支架，以促进受损牙周组织的再生。采用静电纺丝可确保调整再生膜的孔径和直径以及其他理化特性。从而能够应用不同的微观结构引导牙周组织中多个组织的形成，最终在牙周缺损处再生功能性牙周。
本发明实施例提供的载脱细胞膜片生物支架是由细胞特异性ECM修饰的生物支架，该生物支架成功负载具有有序拓扑结构PDLSC外基质(ECM-P)和BMSC外基质(ECM-B)的静电纺丝支架以构建三明治结构，从而分别提供两个独立的再生环境用于牙周膜再生和牙槽骨再生。这种三明治状的生物支架起到阻隔膜的作用，其所搭载的细胞外基质还起到了再生引发剂的作用。
本发明实施例中，使用来自牙周特异性干细胞(PDLSCs和BMSC)的三明治结构脱细胞片与分层电纺明胶基膜相结合，可以提供能够指导细胞生长和促进综合牙周再生的微环境，具有理想的生物相容性，机械特性以及牙骨质分化，牙周分化和成骨分化的感应性。此外，这种三明治结构作为隔断促进了不同区域的牙骨质再生和成骨再生，为两个再生中心腾出了空间。并且，本发明实施例提供的生物支架具有理想的生物降解速率，逐渐被新生牙骨质和牙槽骨中新形成的牙周纤维取代，完成牙周组织再生。
本发明实施例中还提出了一种载脱细胞膜片生物支架的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S1，构建生物支架。
具体的，所述S1包括以下子步骤：
S11，配置明胶-聚己内酯电纺液：3.6g明胶/0.4g聚己内酯(90：10)共4g溶于40mL三氟乙醇中，37℃水浴过夜。
S12，分别构建牙周膜层、中间层、牙槽骨层，得到电纺丝膜：
“牙周膜层”静电纺丝：利用28-30KV电压，1600-1800rpm转速,获得“牙周膜层”有序静电纺丝层；模拟牙周膜有序表面结构；
“中间层”静电纺丝：利用28-30KV电压，500-600rpm转速，获得无序静电纺丝层；提供各向异性以维持力学强度，避免纺丝结构薄弱；促进组织长入及材料降解；
“牙槽骨层”静电纺丝：利用28-30KV电压，1600-1800rpm转速,获得“牙槽骨层”有序静电纺丝层。
S13，对所述电纺丝膜进行交联，得到所述生物支架。
具体的，S13包括以下子步骤：
S131，配置交联液体：将0.47gEDC和0.28gNHS彻底溶于5mL去离子水中，转移至95mL无水乙醇中获得交联液；
S132，交联：室温条件下，将生物之家放入交联液中，低速水平摇床过夜；
S133，复水：将交联后的生物支架放入500mL去离子水中，4h更换一次，低速水平摇床24h，之后，将生物支架转移至-20℃冰箱2h，再将生物支架转移至-80℃冰箱过夜；
S134，冻干：冻干12h至生物支架完全干燥；
S135，利用环氧乙烷对冻干后的生物支架灭菌，并保存。
S2，在所述生物支架两侧分别搭载骨髓间充质干细胞膜片和牙周膜干细胞膜片。
所述步骤S2具体包括以下子步骤：
步骤S21，将所述生物支架的牙槽骨层朝上，完成促牙槽骨再生细胞膜片负载。
具体的，所述步骤S21包括：
将生物支架骨侧朝上，利用重力作用，完成促牙槽骨再生细胞膜片负载，以促牙槽骨再生细胞为骨髓间充质干细胞为例，可以在骨侧接种4*105个BMSC，接种时间为2天。
步骤S22，反转所述生物支架将所述生物支架的牙周膜层朝上，完成促牙周膜再生细胞膜片负载。
具体的，所述步骤S22包括：
反转使得牙周膜侧朝上，实现牙周膜干细胞膜片负载，以促牙周膜再生细胞为牙周膜干细胞为例，可以在于牙周膜侧接种1*105个PDLSC。使用共同培养基完成BMSC和PDLSC协同培养，获得载双面膜片支架。
S3，对分别搭载在生物支架两侧的骨髓间充质干细胞膜片和牙周膜干细胞膜片进行脱细胞处理，得到载脱细胞膜片生物支架。
具体的，所述S3包括：1％tritonx-100(1mL)+4mmol/L氨水(1mL)处理15min，后无菌生理盐水2mL摇床洗3次，每次10min；循环3次；a-MEM培养基平衡3次，每次1h；0.02mg/mLDNA酶37℃孵箱过夜；a-mem漂洗3次，每次15min。
本发明实施例中，在制备得到载脱细胞膜片生物支架之后，还可以对载脱细胞膜片生物支架进行体外保存，具体包括：将所述载脱细胞膜片生物支架置于含有0.5％双抗的基础培养基中，用以抑制细菌生长保持支架形态，存放于4℃进行体外保存。本发明实施例中，在该保存条件下，载脱细胞膜片生物支架可以体外保存两周。
本发明实施例中，还可以对载脱细胞膜片生物支架进行长期保存，具体包括：
利用去离子水对所述载脱细胞膜片生物支架进行水洗；
冻干水洗后的载脱细胞膜片生物支架；
利用环氧乙烷进行灭菌；
进行长期保存。
本发明实施例中还提出了一种载脱细胞膜片生物支架的应用，应用于制备牙周再生模块，所述载脱细胞膜片生物支架包括：生物支架、分别搭载在所述生物支架两侧的促牙槽骨再生脱细胞膜片和促牙周膜再生脱细胞膜片，所述促牙槽骨再生脱细胞膜片和所述牙周膜再生脱细胞膜片用于分别在所述生物支架的两侧提供不同的再生环境，以分别支持牙槽骨组织和牙周膜组织的形成。
为使本领域技术人员更好地理解本发明，以下通过具体的实施例来说明本发明提供的载脱细胞膜片生物支架、制备方法及应用。
实施例1：三层明胶/聚己内酯静电纺丝膜(TLS)的制备
将溶解在乙酸(HAc)掺杂的三氟乙醇(TFE，40ml)(HAc/TFE 0.1％)中的明胶/聚己内酯(3.6g/0.4g)透明溶液通过注射器泵以1.0ml/h的进料速率输送到用作喷丝头的钝金属针(18G)中。并应用不同的旋转速率形成分层模式。具体包括：以1600rpm的速度收集静电纺丝3小时以获得一定厚度的静电纺丝膜片，形成具有有序纤维的牙周膜层，600rpm持续4小时以形成具有随机分布纤维的多孔中间层，以1600rpm的速度收集3小时以形成具有有序纤维的牙槽骨层，获得理想的三层静电纺丝膜。
本发明实施例中，在喷丝头和安装在可调节实验室插孔表面的铝箔(150mm*300mm)之间施加高压电源(TXR1020N30-30，中国大连特斯拉曼)的28.0kV电位，与喷丝头尖端保持15cm的间隙距离。将制备好的明胶/聚己内酯纤维膜在室温下在真空烘箱中干燥3天，以除去残留溶剂，然后再后续使用。对于制备的三层静电纺丝膜进行交联处理，具体包括：将1.91克EDC和1.15克NHS溶解在100mL无水乙醇中，然后将三层静电纺丝膜在37℃水浴下浸入溶液中24小时振荡。后续可以将三层静电纺丝膜定制成不同的形状，作为生物支架。
形态学研究使用SEM仪器(S-4800，日本日立)在5kV的加速电压下，对喷金的样品进行支架的表征扫描电子显微镜(SEM)观察。通过图像采集和分析软件(NanoMeasurer1.2)测量约150根纤维和500个孔隙，确定了纤维直径和孔径的分布，结果为平均直径±标准偏差(M±SD)。
本发明实施例中，通过调整静电纺丝速度构建的三层明胶/聚己内酯静电纺丝膜(TLS)如图2所示，图2示出了本发明实施例制备得到的三层明胶/聚己内酯静电纺丝膜的结构示意图。其中，左边为静电纺丝膜的截面图和表面图的SEM显微照片。从上到下依次为：牙周膜层、多孔内层、牙槽骨层；白色箭头表示纤维方向。右边还给出每个膜的平均纤维直径和平均孔径。
实施例2：载脱细胞膜片生物支架的制备
从正畸治疗拔除的健康前磨牙根表面的中间1/3刮取来自10个个体(15-18岁)的人牙周膜样本。以下述的方法分离PDLSCs：首先，将组织样品切成1mm3片并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤；随后，使用2mg/ml胶原酶I(Sigma)的溶液在37℃下消化切除的碎片10分钟；在短暂消化后，将这些组织碎片在在37℃下、5％CO2孵箱培养环境中，用含有10％胎牛血清(FBS)和100U/ml青霉素/链霉素的α-MEM培养。一旦观察到细胞从组织块中长出，就用0.25％胰蛋白酶消化、收集它们；将传代细胞在基础培养基(含有10％FBS的α-MEM)中培养。将第3-5代之间的PDLSC用于以下实验。
人骨髓间充质干细胞是从赛业生物公司购买的。用含有10％胎牛血清(FBS)和100U/ml青霉素/链霉素的α-MEM培养。将第4-6代之间的PDLSC用于以下实验。
对实施例1制备得到的三层明胶/聚己内酯静电纺丝膜(TLS)进行裁剪，得到生物支架，在该生物支架的牙槽骨层的表面上接种5*104个BMSC。24小时后，翻转生物支架，在牙周膜层的表面上接种5*104个PDLSC。将两面细胞在具有相同培养基成分的同一培养基中培养。48h后，将浓度为100ug/mL的抗坏血酸加入到培养基中，以诱导细胞在静电纺丝膜的每一侧形成特定的细胞片，得到载细胞膜片生物支架。采用扫描电镜和免疫荧光染色对载脱细胞膜片生物支架进行表征。
免疫荧光染色用于检测细胞形态，并比较细胞在有序和随机纤维膜上的分布。用0.5％Triton X-100使固定细胞通透15分钟(未对细胞表面抗原进行透化)。然后将细胞在含有0.1％Triton X-100的PBS中的5％牛血清白蛋白中阻断，在室温下1小时。在室温下用细胞染色30分钟，然后用PBS洗涤三次。用鬼笔环肽(CST，#8953)在室温下染色30分钟，然后在DAPI染色(中国Solarbio)之前用PBS洗涤三次。
BMSCs和PDLSCs的免疫荧光图像如图3所示，表明三层支架的形态适合于在三层GPA支架的骨侧和PDL侧分别由BMSC和PDLSC衍生的细胞片的制备。还通过SEM观察细胞沿纤维扩散，如图4所示，该结果证实，三层明胶/聚己内酯静电纺丝膜(TLS)是在每侧生长有序的细胞片的理想支架。
载脱细胞膜片生物支架的构建：在37℃下用含有0.5％TritonX-100(Sigma-Aldrich)和2mM氢氧化铵的PBS处理培养物15分钟裂解细胞膜，通过循环洗涤来收获并除去细胞成分，具体地，用PBS洗涤5次，每次5-10min，最后得到载脱细胞膜片生物支架。
实施例3：体内试验
为了表征载脱细胞膜片生物支架的成骨/成纤维分化能力，牙槽骨缺损在体内建模，每个孔的大小为3mm(L)×2mm(W)×1mm(D)。将大鼠随机分为6组(每组n＝4)。分为：(1)空白：对照组有牙槽骨缺损但未进行任何治疗；(2)生物支架：有牙槽骨缺损并经生物支架处理的实验组；(3)ECM-P-支架：有牙槽骨缺损、用PDLSC-ECM支架处理的实验组；(4)ECM-B-支架：具有牙槽骨缺损、并用ECM-B-支架处理的实验组；(5)双ECM支架：具有牙槽骨缺损并用双ECM支架处理、在缺陷的PDL侧使用ECM-P，在BMSC侧使用ECM-B的实验组；(6)r-Bi-ECM-支架：具有牙槽骨缺损，用反向铺设双ECM支架进行处理的实验组；其中，(5)和(6)在同一个体的下颌骨任一侧进行。
6周后，杀死大鼠，收获下颌骨并用10％甲醛固定。使用Micro-CT断层扫描。3D图片由NRecon软件重建。感兴趣区域(ROI)的选择范围为3毫米(长)×2毫米(宽)×1毫米(深)对应于缺陷。
之后，下颌骨在10％乙二胺四乙酸二钠(EDTA，西格玛，美国)中脱钙，脱水并包埋在石蜡中。将石蜡样品制备成5μm厚的切片，并进行苏木精和曙红(H&E)，马松三色(巴索诊断公司，中国)和免疫荧光(IF)染色。使用一抗包括OPN(1：400，英国Abcam)、OCN(1：300，中国正能)、Periostin(1：200，英国Abcam)和RUNX2(1：400，英国Abcam)。图像是通过共聚焦显微镜(日本奥林巴斯)获取的，结果如图5-7所示，其中，图5是马松三色染色结果、图6是HE染色结果、图7是牙周相关蛋白免疫荧光染色结果。
本发明实施例中研究了载脱细胞膜片生物支架(TLS负载ECM-B/P)在支持细胞内生长和新组织原位重建中的功能。鉴于ECM-B在骨再生中起有利作用，而ECM-P在牙骨质再生和牙周再生方面均具有优势，Bi-ECM-TLS与根面接触的ECM-P用于牙周膜再生，ECM-B与骨膜接触用于牙槽骨再生。在另一组中，将载脱细胞膜片生物支架以相反的方式放置，以研究不同来源的ECM是否在软组织和硬组织再生中发挥不同的作用。此外，采用仅负载一种脱细胞膜片的TLS来研究ECM-P或ECM-B对PDL和牙周再生的影响。设置裸露的TLS支架，与未对牙周缺损进行治疗的对照组相比。
在大鼠牙周缺损植入后六周，对含有植入物的牙周组织进行H&E染色。在所有情况下，缺陷都被纤维/骨组织覆盖。对照组大部分残余缺损区被组织松散的纤维结缔组织侵袭，可见充血和水肿。然而，对照组显示出最少的新骨形成，并且残余缺陷区域充满了结缔组织，没有明确的PDL边界。裸支架TLS似乎为组织再生提供了支持。
虽然两个单ECM负载组(ECM-B组和ECM-P组)之间没有显著意义，但双负载ECM支架具有更好的牙周再生效果，显示出更多的骨再生。此外，根据micro-CT评估的结果，即使在反向双ECM(r-Bi-ECM)中检测到较少的骨再生，即使显示更好的牙周再生，如图6所示，多种载细胞外基质支架用于牙周缺损后有不同的牙周再生表现，图7示出了苏木精和伊红(H&E)染色结果。尽管新骨在这六组中最厚，但可以看出新骨中间有纤维结构，并且在新的牙周韧带中可以观察到新的骨结构。成纤维细胞对ECM-P的亲和力似乎使PDLSC和成纤维细胞更容易渗透到基质中，导致所有组中最厚的纤维组织，并且更多的纤维组织在缺损中生长，牙槽骨应该存在，导致皮质骨表面的弧形缺口。虽然新的PDL往往更健康，PDL宽度更薄，纤维质量好，但ECM-P与根面接触。这可能是由于ECM-P的诱导作用以及PLAP-1对PDLSC的上调作用。当牙周组织在病理条件下受损时，PLAP-1的上调可能会阻碍骨再生分析目前的数据表明PLAP-1可能会对该过程产生负面影响，这表明ECM-P的存在可能对骨再生产生负面影响。
更进一步，本发明实施例中，还进行了免疫荧光染色，通过标记新牙周韧带和新的牙槽骨中的特定蛋白质来验证牙周再生。在双ECM组中可见较高的韧带特异性标志物(Periostin)和成骨标志物(RUNX2，OCN，OPN)的表达(如图7所示)。Periostin是一种细胞外基质蛋白，支持成纤维细胞和成骨细胞的粘附和迁移，并且被认为通过分别招募PDL成纤维细胞和成骨细胞用于新的PDL和骨形成来促进牙周再生。在双ECM负载(Bi-ECM)支架上观察到高表达的Periostin，这与HE和Masson结果一致，显示更多定向纤维和与韧带结构相连的新牙槽骨，提示较强的韧带附着。此外，成骨分化相关因子OCN，OPN和RUNX2在Bi-ECM支架组中高度表达，这表明骨细胞外基质的矿化。总之，这些发现表明，选定的ECM通过增强细胞活力，迁移，增殖，基质合成和分化的协同组合，通过特定的细胞-ECM相互作用促进牙周再生，以形成新的骨骼和PDL附着。
相关技术中已经证实，ECM可以影响细胞趋化性和直接细胞分化，并诱导建设性的宿主组织重塑。上述影响可归因于ECM的3D结构、表面拓扑和组成。Integrin可以接收来自ECM或ECM衍生的机械刺激的信号，并将它们转导到调节细胞活力的下游信号通路。当生长在具有理想的物理化学性质的纤维支架表面上时，在成骨微环境中形成BMSC细胞片，这可以确保在脱细胞化后得到的ECM-B保持成骨能力。然而，PDLSC细胞片在纤维化微环境拓扑结构中培养，具有有序的纤维拓扑结构，ECM-P形成具有成纤维化分化能力，这可能更容易促进细胞粘附和韧带发生。从具有纤维发生潜力的细胞中提取的ECM更有可能促进纤维再生。因此，有序的ECM-P拓扑可作为的PDLSC牙周组织的再生模板。
本发明实施例中，制造了具有理想拓扑结构的TLS，该拓扑结构有助于改变ECM结构和良好的生物相容性，有助于整合ECM-B和ECM-P以形成用于牙周再生的3D结构。从MSC片中提取的ECM根据静电纺丝生物相容性TLS的拓扑结构保持有序的结构。有序的生物支架拓扑结构之间的相互作用促进了MSC片材产生更多的具有某些拓扑结构的ECM，以最大限度地提高源自PDLSC和BMSC的ECM的再生诱导效应。体外研究，脱细胞细胞片衍生的ECM-P和ECM-B在用温和脱细胞化试剂处理后具有生物相容性，改善了PDLSCs和BMSC的增殖、粘附、迁移和分化。此外，本发明实施例验证了牙周特异性MSC衍生的ECM对生物相容性支架刺激牙周再生的重要性。此外，本发明实施例进一步验证了MSCs对不同来源的ECM的不同反应。很明显，ECM-B对粘附具明显的促进作用，证明了整合素β1的上调和整合素连接激酶(ILK)途径的一般激活以促进骨再生。这进一步被成骨基因的mRNA表达和蛋白质表达所证明。然而，ECM-P也被证明对PDLSCs的细胞特异性作用，对PDLSCs的细胞增殖，迁移，致韧带以及牙骨质基潜力有影响。大鼠颊周缺损模型表明，Bi-ECMs支架通过两个精心构建的牙周发生中心形成新的韧带附件，最大限度地提高了ECM在促进牙周再生方面的益处。值得一提的是，随着Gel/PCL支架的降解和新的牙周纤维和牙槽骨的侵入，自然形成了称为新牙周组织的韧带结构。
对于方法实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。
以上对本发明所提供的一种载脱细胞膜片生物支架、制备方法及应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种载脱细胞膜片生物支架，其特征在于，所述载脱细胞膜片生物支架包括：生物支架、分别搭载在所述生物支架两侧的促牙槽骨再生脱细胞膜片和促牙周膜再生脱细胞膜片。
2.根据权利要求1所述的载脱细胞膜片生物支架，其特征在于，所述生物支架为三层结构，包括：牙周膜层、中间层、牙槽骨层，所述牙周膜层和所述牙槽骨层为有序纤维，所述中间层为无序网格状纤维。
3.根据权利要求1所述的载脱细胞膜片生物支架，其特征在于，所述生物支架为明胶-聚己内酯生物支架。
4.根据权利要求1所述的载脱细胞膜片生物支架，其特征在于，所述促牙槽骨再生脱细胞膜片包括以下任一种：骨髓间充质干细胞脱细胞膜片、脂肪干细胞脱细胞膜片、成骨细胞脱细胞膜片；
所述促牙周膜再生脱细胞膜片包括以下任一种：牙周膜干细胞脱细胞膜片、牙囊干细胞脱细胞膜片、成牙骨质细胞脱细胞膜片。
5.一种载脱细胞膜片生物支架的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
构建生物支架；
在所述生物支架两侧分别搭载骨髓间充质干细胞膜片和牙周膜干细胞膜片；
对分别搭载在生物支架两侧的骨髓间充质干细胞膜片和牙周膜干细胞膜片进行脱细胞处理，得到载脱细胞膜片生物支架。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述构建生物支架包括：
配置明胶-聚己内酯电纺液；
分别构建牙周膜层、中间层、牙槽骨层，得到电纺丝膜；
对所述电纺丝膜进行交联，得到所述生物支架。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述在所述生物支架两侧分别搭载骨髓间充质干细胞膜片和牙周膜干细胞膜片包括：
将所述生物支架的牙槽骨层朝上，完成促牙槽骨再生细胞膜片负载；
反转所述生物支架将所述生物支架的牙周膜层朝上，完成促牙周膜再生细胞膜片负载。
8.根据权利要求5-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：
将所述载脱细胞膜片生物支架置于含有0.5％双抗的基础培养基中浸泡，在4℃进行短期体外保存。
9.根据权利要求5-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：
利用去离子水对所述载脱细胞膜片生物支架进行水洗；
冻干水洗后的载脱细胞膜片生物支架；
利用环氧乙烷进行灭菌；
进行长期保存。
10.一种载脱细胞膜片生物支架的应用，其特征在于，应用于制备牙周再生模块，所述载脱细胞膜片生物支架包括：生物支架、分别搭载在所述生物支架两侧的促牙槽骨再生脱细胞膜片和促牙周膜再生脱细胞膜片，所述促牙槽骨再生脱细胞膜片和所述牙周膜再生脱细胞膜片用于分别在所述生物支架的两侧提供不同的再生环境，以分别支持牙槽骨组织和牙周膜组织的形成。
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