CN101945676B - 脱细胞的网膜基质及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种将网膜脱脂的方法和用于制备无细胞网膜的方法，所述无细胞网膜即经灭活或脱细胞的网膜，包括植入哺乳动物体系的细胞外基质。本发明还涉及一种包括脱细胞的网膜的医用构造物。

Description

脱细胞的网膜基质及其用途
技术领域
本发明一般地涉及用于组织修复和再生的生物基质领域。本发明涉及从网膜中提取脂肪的方法、脱细胞的网膜的制备方法以及脱细胞的网膜在组织修复和组织工程中的应用。
发明背景
细胞外基质(ECM)是结缔组织的重要结构成分。由细胞精制的ECM产生了一些微环境，这些细胞和其他细胞通过区分或保持其区分状态对这些微环境作出反应。ECM提供了细胞组织所附着的基底。
基于组织的ECM生物材料和装置用于各种医疗应用，如心脏瓣膜、猪SIS、人类皮肤和牛心包膜。然而，由于缺乏血管生成的血管轨道，脱细胞组织用作再生医学的组织工程支架的应用范围受到限制，而血管轨道对于组织长入以及种子细胞的生存能力和功能是很重要的。在脱细胞处理中保持血管轨道的高度血管化的组织总会在本领域受到青睐。
大网膜是用于覆盖腹腔内器官的最大的腹膜折叠。大网膜高度血管化，通常薄且有弹性，并总是含有一些脂肪。因此，大网膜已用于临床应用，如肠道手术、胸段食管手术、慢性非愈合性皮肤创伤、疝和骨盆底修复、膀胱修复等。
由于脱细胞的网膜的血管腔可以用作新生血管的轨道，因此网膜是临床应用理想的材料。然而，使用本领域已知的将哺乳动物软组织脱细胞的方法和步骤难以去除网膜内的脂肪。因此，将脱细胞的网膜用作生物基质(包括作为基于组织的ECM生物材料)的有效利用受到限制，其部分原因在于凭借本领域所说的组织再生的过程和方法不能有效地从网膜中提取脂肪。
发明内容
本发明涉及从网膜中提取脂肪的方法、制备脱细胞的网膜的方法以及经处理的脱细胞的网膜基质的医疗应用。在一个方面，一种将网膜脱细胞的方法涉及如下步骤：(1)从网膜中提取脂肪，(2)从网膜中除去会引起免疫反应或移植排斥反应的细胞，(3)消毒和(4)最终杀菌。
本发明的一些方面是从网膜中提取脂肪的一些方法，所述方法可用于本文描述的脱细胞处理中以及作为灭活处理的其它脱细胞处理中。在一实施例中，脂肪提取的方法包括：用一种或多种脱水溶剂(例如，诸如醇之类的低分子量的有机溶剂)将网膜脱水，然后使用选自非极性溶剂、极性溶剂或它们的组合的一种或多种提取溶剂来提取脂肪。脱脂后，可将网膜再水化。在本发明的一些方法中，全部和/或基本全部的脂肪被从网膜中提取。
脱细胞的网膜可“照原样”使用。此外，脱细胞的网膜可以用于其他方面，例如，被制成与细胞、组织糜、生物活性物质和其他组织工程支架结合的用于组织工程和再生医学的膜、多孔三维支架、微粒和管状结构。由于升高的组织因子(TF)浓度，网膜隔膜还具有止血性能。因此，脱细胞的网膜可用作止血剂。
对于许多应用，网膜比其它基于组织的ECM生物材料和装置(如皮肤)更受欢迎。网膜具有本文所述的脂肪提取方法和脱细胞处理中保存的许多血管腔。这些血管腔可充当新血管形成的轨道。本发明旨在应对从网膜中有效提取脂肪的问题。有效地从网膜中提取脂肪的能力促进了网膜作为生物基质的使用。
本说明书和权利要求书中所述的所有份数和百分比按重量计，除非另有规定。
附图说明
图1是根据本发明一实施例的脱细胞处理的流程图。
图2是脱细胞前后的网膜图像。
图3示出了脱细胞前后的网膜的组织图。
具体实施方式
本发明涉及脱细胞的网膜的制备方法，即，网膜的灭活或脱细胞化，所述网膜包括植入哺乳动物的细胞外基质。所述方法通常包括如下步骤：组织(特别是网膜)的脱脂和脱细胞化。本发明的一个方面涉及网膜脱脂的方法。
本发明旨在进行的脱脂是指提取组织中的脂质部分。本发明旨在进行的脱细胞化或灭活是指去除分离的器官或器官的一部分中的细胞组分而不显著损坏细胞外基质。文中，术语“脱细胞的”或“脱细胞化”以及“灭活的”或“灭活”可互换使用。灭活的组织基本上没有活细胞再生和/或新陈代谢。然而，缺乏再生活细胞的网膜可以含有不能通过减数分裂或有丝分裂的正常代谢过程增加代谢活细胞数量的代谢活细胞。此外，在缺乏代谢活细胞的网膜中，当使用显微镜观察时，代谢死细胞可能在组织学截面上是可见的，看上去类似于代谢活细胞；进一步的细胞残留物，包括核酸、小分子量蛋白质、脂质和多糖，而灭活组织还保留再生的灭活细胞和/或代谢的灭活细胞和/或大分子量的细胞质蛋白质，这种蛋白质包括(例如)用作趋化物的肌动蛋白。脱细胞的网膜或灭活网膜是指去除了全部、一部分或大量脂肪和核组分和细胞组分的网膜。
网膜可以取自哺乳类，如人、猪、牛、山羊等。在取得组织之后，可以将组织置于0.9％的盐水中供直接使用或者将其贮存(优选地，在约-20℃至约80℃的温度下)备用。
根据本发明的获取灭活网膜的方法如图1所述。这种方法包括将网膜脱脂和将脱脂后的网膜脱细胞化的步骤，还可包括任选地的消毒和去除污染物的步骤。然后，这种方法所得的灭活网膜可一直贮存到需要使用时或可在灭活处理完成后立即使用。
将网膜脱脂的方法包括脂肪提取后进行脱水，然后可任选地将脱脂后的网膜再水化，所述方法可与本文描述的脱细胞方法一起应用或者与获取灭活或脱细胞的网膜的其它工序一起应用。脱水涉及用一种或多种脱水溶剂处理网膜，例如，用(一种或多种)脱水溶剂和/或(一种或多种)这类溶剂水溶液对网膜进行一次多次处理。所述一次多次处理是用具有不同的脱水溶剂与水之比(例如，对于每一接续处理，溶液中的水量逐渐减少)的溶液执行的方法中的顺序步骤，最后的处理可能涉及使用纯溶剂，即不是含水的溶液。脱水后，可用一种或多种提取溶剂从网膜中提取脂肪，这可能发生在一个或多个提取步骤中。
低分子量的有机溶剂可用作脱水溶剂。在一实施例中，脱水溶剂是一种或多种醇，如选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇以及它们的组合的那些醇。脱水溶剂可在具有约60％至约70％的乙醇和约30％至约40％的水的含水溶液中。
在一实施例中，脱脂方法包括将网膜与脱水溶剂接触一段时间，例如，接触至少约30分钟，一般约30分钟至约72小时。网膜与脱水溶剂的重量比可为约1∶5至约1∶100，例如约1∶5至约1∶50，一般是约1∶10至约1∶25。网膜可完全浸没在脱水溶剂中。脱水可在环境温度下发生，然而在高于或低于环境温度的温度下的脱水也在本发明的范围内。脱脂方法的一些实施例包括在相同或不同的条件和网膜与脱水溶剂的重量比下，使用相同或不同的脱水溶剂进行的、脱水溶剂中的一种或多种脱水处理。在各脱水处理中，脱水溶剂可周期性地改变或更新。
在本发明的一实施例中，脱脂方法涉及网膜最初接触含水和醇的第一脱水溶剂，如含约60％至约70％的醇和约30％至约40％的水的溶液。网膜应在环境温度下与第一脱水溶剂接触约30分钟，然而高于或低于环境温度的温度也在本发明的范围内。网膜与第一脱水溶剂的重量比可为约1∶5至约1∶50，例如约1∶10至约1∶25。在第一处理中，网膜可被完全浸没在第一脱水溶剂中。
在用第一脱水溶剂处理网膜后，将网膜与第二脱水溶剂例如纯醇接触。在第二脱水步骤中，网膜可与第二脱水溶剂接触至少约30分钟，例如约30分钟至约24小时。第二脱水步骤可在环境温度下进行，然而在低于或高于环境温度下进行该处理均在本发明的范围内。网膜与第二脱水溶剂的重量比可为约1∶5至约1∶100，例如约1∶10至约1∶25。网膜可与第二脱水溶剂完全接触。
在另一实施例中，网膜可在第二脱水处理后可选地经受一种或多种另外的脱水处理。这些另外的脱水处理在相同的条件下进行，并且使用的材料和用量与以上关于第二脱水处理所讨论的相同。例如，在一实施例中，第二脱水处理后，进行第三脱水处理至少约30分钟，例如约30分钟至约24小时，在所述第三脱水处理中，经第二脱水处理后的网膜接触第三脱水溶剂(例如，纯醇)并且可被完全浸没。网膜与第三脱水溶剂的重量比可为约1∶5至约1∶100，例如约1∶10至约1∶25。在另一实施例中，第三脱水处理后，执行第四脱水处理至少约30分钟，例如约30分钟至约24小时，在第四脱水处理中，经第三脱水处理后的网膜接触第四脱水溶剂(例如，纯醇)并且可被完全浸没。网膜与第四脱水溶剂的重量比可为约1∶5至约1∶100，例如约1∶10至约1∶25。
经过脱水后，用一种或多种提取溶剂从网膜中提取脂肪。提取溶剂可以是非极性溶剂、极性溶剂(如极性非质子溶剂)或它们的组合。非极性溶剂的实例是非极性有机溶剂，例如，己烷、二甲苯、苯、甲苯、乙酸乙酯以及它们的组合。可用作提取溶剂的极性溶剂包括丙酮、二氧杂环己烷、乙腈以及它们的组合。在一实施例中，提取溶剂选自丙酮、己烷、二甲苯以及它们的组合。提取溶剂可含有约50％至约90％的非极性溶剂，例如己烷、二甲苯以及它们的组合和约10％至约50％的极性溶剂例如丙酮。在某些实施例中，提取溶剂可含有约50％至约70％的丙酮和约30％至约50％的己烷。
在脂肪提取步骤中通过将提取溶剂与脱水的网膜接触一段时间，进行脂肪提取。一种或多种脂肪提取步骤可使用相同或不同的提取溶剂、在相同或不同的条件下、以相同或不同的时间段进行。在一些实施例中，脂肪提取可包括将脱水的网膜与一种或多种提取溶剂或提取溶剂的组合接触至少约30分钟的时间段，例如，至少约60分钟至约24小时、或长达约48小时、或更长的时间段。另外一些实施例涉及将脱水的网膜浸没在提取溶剂中。在每个提取步骤中，溶剂可定期地改变或更新。在本发明的一些实施例中，脱水的网膜与提取溶剂的重量比为约1∶3至约1∶50。
在一实施例中，通过多个脂肪提取步骤进行脂肪提取。首先，最后一次脱水处理后，例如，在如上讨论的第二脱水处理、第三脱水处理或第四脱水处理后，脱水的网膜与第一提取溶剂(例如像极性非质子溶剂之类的极性溶剂)接触至少约30分钟，一般约30分钟至约24小时。脱水的网膜可完全浸没在第一提取溶剂中。在本发明的一个方面，脱水的网膜与第一提取溶剂的重量比为约1∶3至约1∶50，例如约1∶5至约1∶15。在一实施例中，第一提取溶剂是丙酮。
在第一提取步骤后，脱水的网膜与第二提取溶剂(例如约30％至约50％的极性溶剂和约50％至约70％的非极性溶剂)接触至少约60分钟(例如约60分钟至约24小时)的时间段。在一实施例中，第二提取溶剂含有约30％至约50％的己烷和约50％至约70％的丙酮。脱水的网膜可完全浸没在第二提取溶剂中。在本发明的一个方面，脱水的网膜与第二提取溶剂的重量比为约1∶3至约1∶50，例如约1∶5至约1∶15。
接着，脱水的网膜经受第三提取步骤，该提取步骤涉及脱水的网膜与第三提取溶剂接触。在一实施例中，脱水的网膜与第三提取溶剂接触约24小时至约48小时，并可在第三提取溶剂中浸没一段时间。第三提取溶剂可含约70％至约90％的非极性溶剂和约10％至约30％的极性溶剂，例如极性非质子溶剂。本发明的一实施例涉及第三提取溶剂，其含有约70％至约90％的己烷和约10％至约30％的丙酮。在本发明的一个方面，脱水的网膜与第三提取溶剂的重量比为约1∶3至约1∶50，如约1∶5至约1∶15。
脂肪提取后，脱脂网膜可任选地被再水化。可通过将脱脂网膜与再水化溶剂接触，例如与醇或诸如含有约60％至约70％醇的醇溶液接触，将脱脂网膜再水化。可以使用低分子量的醇，例如，甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇以及它们的组合。在本发明的一实施例中，再水化通过一个或多个再水化处理(例如两个再水化处理)进行。在本发明的一个方面，在所有或部分再水化处理中，脱脂网膜与再水化溶剂的重量比为约1∶5至约1∶100，如约1∶10至约1∶25。脱脂网膜可与再水化溶剂接触至少约30分钟，例如约30分钟至约72小时，并且可完全浸没在再水化溶剂中。
在一实施例中，通过两个再水化处理进行脱脂网膜的再水化。在第一再水化处理中，脱脂网膜与第一再水化溶剂接触至少约30分钟，例如约30分钟至约72小时，第一再水化溶剂通常是低分子量的醇，例如乙醇。在本发明的一个方面，脱脂网膜与第一再水化溶剂的重量比为约1∶5至约1∶100，例如约1∶10至约1∶25。第一再水化溶剂可以是纯醇，即不是含水的溶液。脱脂网膜可完全浸没在第一再水化溶剂中。
然后，在第二再水化处理中，脱脂网膜与第二再水化溶剂接触，第二再水化溶剂可以是低分子量的醇，特别是低分子量醇的水溶液，例如含约60％至70％醇的溶液。在一实施例中，第二再水化溶剂是乙醇，例如，含约60％至约70％乙醇的平衡水溶液。脱脂网膜可与第二再水化溶剂接触至少约30分钟，例如约30分钟至约72小时。在本发明的一个方面，脱脂网膜与第二再水化溶剂的重量比为约1∶5至约1∶100，例如约1∶10至约1∶25。脱脂网膜可完全浸没在第二再水化溶剂中。
脱脂网膜是脱细胞化的，本领域技术人员已知的脱细胞处理可应用于将脱脂网膜脱细胞。在一实施例中，脱脂网膜可通过核组分和细胞质组分的增溶作用进行脱细胞化。例如，脱脂网膜可浸没于脱细胞缓冲剂中，例如浸没于具有非离子型洗涤剂和溶于酸的金属盐的脱细胞缓冲剂一段时间，通常至少约30分钟。可用于本发明的非离子型洗涤剂包括聚山梨醇酯(例如，TWEEN80)、乙氧基化醇(例如，TRITONX-100)和聚乙醇(例如，HP 40和IGEPAL CA-630)以及它们的组合。可用的金属盐包括氯化镁、磷酸盐、醋酸盐和柠檬酸盐以及它们的组合。这些金属盐通常溶于Tris-HCL。例如，脱细胞缓冲剂可包括TRITONX-100(1％ w/V)和MgCl2(1％)(溶于50mM的Tris-HCl(pH 7.2))。然后，从脱细胞缓冲剂中取出脱脂网膜，并将其与酶溶液接触，例如，与含核酸内切酶(例如，Benzonase)和脱细胞缓冲剂组分的酶溶液接触。在一实施例中，将脱脂网膜在酶溶液中旋转一段时间，例如至少约20小时，通常约20小时至约48小时。然后，将脱脂网膜在洗涤液中(例如，在含有酸、金属盐和非离子型清洗剂的洗涤液中)清洗一次或多次，例如两次。所述酸、金属盐和非离子型清洗剂可与以上讨论的材料相同，包括Tris-HCl、MgCl2和TRITONX-100的组合。随后，网膜与含盐(例如，NaCl和EDTA)和非离子型洗涤剂(例如，TRITONX-100)的细胞提取溶液接触一段时间，例如至少约1小时，通常约1小时至约48小时。美国专利No.4,776,853和No.4,801,299中还描述了一些典型脱细胞处理的实例，这两个专利的全部内容以引用方式并入本文中。
然后，可以对脱细胞的网膜进行消毒以去除污染物。在一实施例中，脱细胞的网膜与消毒液接触足够有效的时间段以对脱细胞的网膜进行消毒，例如接触至少约0.5小时，通常约1小时至约12小时。脱细胞的网膜可完全浸没在消毒液中。消毒液可含有醇或醇的水溶液，也可能包含酸。消毒液可包括下列物质中的一种或多种：乙醇、甲醇、异丙醇、丙醇、过氧化氢、过乙酸以及它们的组合。在一实施例中，消毒液含有乙醇(例如，80％的乙醇溶液)和过乙酸。可选地，可用超纯水将脱细胞的网膜清洗一次或多次。
图2示出了未经处理的猪网膜1和脱细胞后的猪网膜2的对比。未经处理的猪网膜1在邻近血管轨道4处有脂肪3，而在脱细胞后的猪网膜中，邻近血管轨道5处并没有任何脂肪或者仅有少量的脂肪。
脱细胞的网膜可应用于组织工程和内部器官的再生，例如肾、肝、脾和膀胱的再生。脱细胞的网膜也可用于骨组织的修复和再生，例如骨骼、软骨和肌腱的修复和再生。脱细胞的网膜的其他用途包括与生物相容性网织品结合的软组织的加固和修复，例如硬脑膜移植，疝气修补和骨盆底修复；神经再生，例如末梢神经管状结构的再生；组织修复；细胞和生物活性物质的输送；慢性创面修复；和骨修复。脱细胞的网膜的这些使用和应用说明了几个潜在用途，但不应被理解为对用本文所述的方法和工艺制备的脱细胞的网膜的使用和应用类型的限制。
脱细胞的网膜可与合成构造结合而形成增强构造。例如，脱细胞的网膜基质可作为植入到哺乳动物体内的支架结构，例如用于组织修复的支架。脱细胞的网膜基质可通过生物活性物质、细胞、小分子、组织糜和细胞溶解物进一步增强。如果举出脱细胞的网膜几个附加用途，则是脱细胞的网膜可与聚合物一起冷冻干燥而形成三维泡沫或热熔成膜或网织品。此外，纤维可静电旋转涂布到网膜上，“照原样”使用或与合成构造结合以形成增强结构。
在一个实施例中，脱细胞的网膜被制成需要或不需要增强的管状结构。管状网膜基质可与内皮细胞共培养，其中灭活网膜用作细胞附着支架和生长促进基底。接种于脱细胞的网膜上的内皮细胞可用作血管重建的构造基础材料。
在另一个实施例中，脱细胞的网膜可与人肾源细胞(hKDC)共培养，其中脱细胞的网膜用作细胞附着支架和生长促进基底。接种于脱细胞的网膜上的HKDC可用作肾组织工程应用的构造基础材料。
在另外的实施例中，脱细胞的网膜可与尿道上皮细胞共培养，其中脱细胞的网膜用作细胞附着支架和生长促进基底。接种于脱细胞的网膜上的尿道上皮细胞可用作膀胱重建的构造基础材料。
生物活性剂可复合在组织支架中和/或涂布在组织支架上，并且/或者可施加到随后复合到支架的活组织糜上。优选地，在将活组织添加到支架上之前，将生物活性剂复合在支架中或涂覆在支架上。生物活性剂可以选自多种效应物，当存在于损伤部位时，它们可以促进受影响组织的愈合和/或再生。除了促进或加速愈合的化合物或试剂之外，效应物可能还包括预防感染的化合物或试剂(如抗菌剂和抗生素)、减少炎症的化合物或试剂(如抗炎剂)、防止或最小化粘连形成的化合物，例如，氧化再生纤维素(如得自Ethicon公司(Somerville，New Jersey，USA)的INTERCEED和SURGICEL)、抑制免疫系统的化合物或试剂(如免疫抑试剂)以及它们的组合。
作为非限制性实例，本发明的具有脱细胞的网膜的植入物中存在的其他类型的效应物可以包括异源或自体生长因子、蛋白质(包括基质蛋白)、肽、抗体、酶、血小板、富含血小板的血浆、糖蛋白、激素、细胞因子、糖胺聚糖、核酸、止痛剂、病毒、病毒颗粒、细胞类型以及它们的组合。相同或不同功能的一种或多种效应物可被复合在植入物内。
已知的用于促进受伤或受损组织愈合和/或再生的异源或自体生长因子可被直接加入支架，或者支架可以包括生长因子(例如血小板)的源。生物活性剂还可包括下列物质中的一种或多种：趋化剂；治疗剂(例如抗生素、甾类和非甾类类止痛剂和抗炎剂，以及诸如免疫抑制剂的抗排异剂及抗癌药物之类的治疗药物)；各种蛋白质(例如短期肽、骨形态发生蛋白、糖蛋白和脂蛋白)；细胞附着介体；生物活性配体；整合素结合序列；配体；各种生长和/或分化剂及其片段(如表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(如bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素衍生生长因子(如IGF-1和IGF-II)和转化生长因子(如TGF-β I-III)、甲状旁腺激素，甲状旁腺激素相关肽，骨形态发生蛋白(如BMP-2、BMP-4；BMP-6；BMP-12)、音猬因子(sonic hedgehog)、生长分化因子(如GDF5、GDF6、GDF8)，重组人类生长因子(如MP52)、软骨源形态发生蛋白(CDMP-1))；影响特异性生长因子上调的小分子；腱糖蛋-C；透明质酸；硫酸软骨素；纤粘蛋白饰胶蛋白聚糖；凝血弹力蛋白；凝血酶衍生肽；肝素结合域；肝素；硫酸乙酰肝素；DNA片段及DNA质粒。合适的效应物同样包括上述试剂的激动剂和拮抗剂。生长因子也可包括上述生长因子的组合。此外，生长因子可以是由血液中的血小板提供的自体生长因子，血液中可能有与血小板正态相关的各种生长因子。如果其他这类物质在整形外科领域有治疗价值，则预计至少其中的一些物质将用于本发明中，这类物质应为“生物活性剂”的含义所涵盖，除非以其它方式明确定义。
脱细胞的网膜可以进一步配制成与生物相容性合成或天然聚合物结合的复合支架。在一个实施例中，脱细胞的网膜基质可进行加固以提高其机械强度。加固构件可以是有孔或无孔二维膜、纤维结构、三维泡沫等。加固的脱细胞的网膜可与细胞、组织糜、生物活性物质及其他组织工程支架相结合，配制成组织工程和再生医学的内腔中的二维膜、三维基质以及含有和不含三维基质的管状结构。
多种生物可吸收的聚合物可用于具有根据本发明的脱细胞的网膜的非织造组织工程支架及网织品。合适的生物相容并且生物可吸收的聚合物的实例包括选自下列物质的聚合物：脂族聚酯、聚(氨基酸)、共聚(醚-酯)、聚亚烷基草酸酯、聚酰胺、酪氨酸衍生聚碳酸酯、聚(亚氨基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧杂酯(polyoxaester)、聚酰氨基酯、含胺基的聚氧杂酯、聚(酸酐)、聚磷腈、生物分子(也即，生物聚合物，比如胶原、弹性蛋白、生物可吸收淀粉等)以及它们的共混物。脂族聚酯包括(但不限于)如下物质的均聚物和共聚物：丙交酯(包括乳酸、D-丙交酯、L-丙交酯和内消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、ε-己内酯、对二氧杂环己酮(1，4-二氧杂环己烷-2-酮)、三亚甲基碳酸酯(1，3-二氧杂环己烷-2-酮)、三亚甲基碳酸酯的烷基衍生物以及它们的聚合物共混物。
多种生物相容的不可吸收的聚合物也可用于根据本发明的非织造组织工程支架及网织品。一个实例是聚丙烯网织品，Ethicon公司(Somerville，New Jersey，USA)以商品名称PROLENE出售。
各种生物相容的天然聚合物也可用于具有根据本发明的脱细胞的网膜的非织造组织工程支架及网织品。合适的生物相容的天然聚合物的实例包括胶原、弹性蛋白、透明质酸、层粘连蛋白和明胶。
以下实例旨在说明本发明的原理和实践，而非限制本发明。一旦具有本公开的有益效果，本发明范围和精神内的许多其他实施例对本领域技术人员来说将显而易见。
实例
实例1：猪脂肪的溶解度
将大约0.75g的猪脂肪加入0.5mL的所选溶剂中。对脂肪的溶解度进行了视觉观察，并记录了其完全溶解的时间。结果示于表中。浊度等级为0(澄清)至5(高浊度)。
实例2：网膜脱细胞化处理
脂肪提取：在取得猪网膜后，将猪网膜置于0.9％的盐水中。用盐水溶液清洗3次以清洗掉血液和其他外来的碎片，然后将网膜置于70％的乙醇中30分钟。用70％的盐水处理后，将组织置于100％的乙醇中脱水30分钟，并两次更换成新鲜乙醇。然后，将组织转移到丙酮中放置180分钟，每60分钟更换新鲜溶液。随后，将组织置于50∶50的丙酮/己烷的混合物中60分钟，然后置于20∶80的相同混合物中24-48小时(三次更换新鲜溶液)以进行脂肪提取。然后，将组织转移到100％的乙醇中放置30分钟，随后转移到70％的乙醇中，如果有必要，可将其保存在4℃下直至脱细胞化处理开始。
脱细胞化：将组织浸入脱细胞缓冲剂中放置30分钟，该脱细胞缓冲剂含有TRITONX-100(1％ w/V；非离子型洗涤剂)和溶于50mM的Tris-HCl(pH 7.2)的MgCl2(1％)的混合物。之后用含核酸内切酶(Benzonase；41.8U/mL)与脱细胞缓冲剂相混合的混合物的酶溶液进行处理。将组织在该溶液中旋转20小时。然后，将组织在含50mM的Tris-HCl(pH 7.2)、5mM的MgCl2和1％(W/V)的TRITONX-100的溶液中清洗两次(每次2小时)。然后，将组织置于pH值为7.0、含1M的NaCl、20mm的EDTA和0.2％(W/V)的TRITONX-100的细胞提取溶液中1小时，之后，用超纯水将组织清洗(4次，每次5分钟)。
消毒：在水洗(4次，每次20分钟)后，将该组织转移到含0.15％的过乙酸(或醋酸)的80∶20的水∶乙醇(200标准强度)的消毒液中放置1小时，然后将组织存放到4℃的70％的醇中。
实例3：组织学评价
未经处理的网膜样品和根据实例2灭活的脱细胞的网膜样品固定于10％的中性缓冲福尔马林中2天。然后，对样品进行常规组织学处理(即水洗、用醇脱水、二甲苯澄清、石蜡包埋、切片和随后处理载玻片，即用苏木精-伊红进行染色处理)。图3示出了新鲜猪网膜6在基质8中含有脂肪7，而在脱细胞的网膜9中，基质11中的脂肪10少得多。
实例4：猪尿道上皮和人脐带组织源细胞(hUTC)在灭活猪网膜上的 生长
从猪膀胱分离尿道上皮细胞。简而言之，从Farm-to-Pharm(Bridgewater，New Jersey，USA)获取的猪膀胱被用PBS洗净并排空尿液。然后沿其长轴将膀胱切割，尿道上皮侧朝上平放。然后，用0.25％的胰蛋白酶溶液将其覆盖约4小时。消化之后，用细胞刮刀刮尿道上皮侧，剥离尿道上皮，消化液通过一个40微米的过滤筛进行过滤。然后，将液体减速，用角质形成细胞无血清(KSF)培养基(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)对细胞进行清洗。用KSF培养基将细胞固定在T-75细胞培养瓶中。每隔2-3天更换培养基。
人脐带组织源细胞(hUTC)的分离如美国专利申请公布N0.US2005/0054098 A1描述(该专利申请以引用的方式全部并入本文)，且在涂有明胶的T75烧瓶中的生长培养基(DMEM低糖培养基(Gibco，Carlsbad，California，USA)，15％(v/v)的胎牛血清(Cat.#SH30070.03；Hyclone，Logan，Utah，USA)、0.001％(v/v)的β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA)、青霉素/链霉素(Gibco)中生长。细胞每3-4天传代一次。
将根据实例2制备的脱细胞的网膜切割为大约2.5×2.5厘米的正方形，并将其置于超低族群6孔培养皿中。通过在纯乙醇中培养16小时(PDS膜)或1小时(对预先贮存在70％的乙醇中的网膜)对网膜进行消毒。然后，将该材料在3mL的PBS(不含Ca和Mg)中清洗3次。
通过用PBS进行洗涤并使用4mL的0.25％的胰蛋白酶-EDTA(Gibco)进行胰蛋白酶消化获得猪尿道上皮细胞(P1)和hUTC。加入等量的尿道上皮细胞的角质细胞--SFM(Gibco公司)和hUTC生长培养基后，反应停止。通过离心法收集细胞，在培养基中重悬起细胞微粒。用Guava仪器(GuavaTechnologies，Hayward，California，USA)进行细胞计数，将含100,000细胞的1mL培养基接种在6孔培养皿的网膜隔膜上。在37℃下培养2小时后，将另外的2mL培养基加到每个孔中。在免疫荧光染色前10天接种尿道上皮细胞或hUTC。
在细胞接种后的第10天，用3mL的PBS清洗网膜隔膜，然后用冷的4％(w/v)的多聚甲醛(Sigma-Aldrich)在室温下固定10分钟。对针对下列抗原决定部位的抗体进行免疫细胞化学反应：α平滑肌肌动蛋白(1∶200，Chemicon International cat#：CBL171，Temecula，California，USA)和细胞角蛋白AE1/AE3(1∶200；Chemicon International cat#：MAB3412)。
用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗培养物后，将其与含PBS、4％(v/v)的山羊血清(Chemicon)和0.3％(v/v)的TRITON(X-100)的蛋白质阻断溶液接触1小时以进入细胞内抗原。初级抗体在阻断溶液中稀释后，加到培养物上在室温下保持1小时。然后，除去初级抗体溶液，在施加含阻断剂和羊抗鼠IgG-FITC缀合物(1∶200；Sigma-Aldrich公司)的二级抗体溶液(室温下1小时)之前，用PBS清洗培养物。然后，清洗培养物，用10μM的DAPI(分子探针)染色10分钟，以观察细胞核。
经过免疫染色后，使用适当的Olympus倒置表面荧光显微镜(Olympus，Melville，New York，USA)上的荧光滤镜观察其荧光性。在所有情况下，阳性染色表示以上对照染色的荧光信号，其中除了施用初级抗体溶液(第一对照物)的之外，沿用上文对整个过程的描述。用彩色数码摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics，Carlsbad，California，USA)对代表性图像进行了捕集。对于双染样本，每幅图像每次仅用一个发射滤片拍摄。使用Adobe Photoshop软件制作分层剪辑(Adobe，San Jose，California，USA)。
本实验结果表明，这两种类型的细胞在脱细胞化猪网膜上都生长良好。此外，这两种细胞类型建立了单层，并保留了关键指标的坚稳表达：尿道上皮细胞的角蛋白和hUTC的平滑肌肌动蛋白。
实例5：灭活猪网膜上的人肾源细胞的生长
正常人肾脏取自National Disease Research Interchange(国家疾病研究交流中心)(NDRI，Philadelphia，Pennsylvania，USA)。本研究中所用的肾脏取自一名健康的21岁男性。为了除去血液和碎片，在Dulbecco’s改性Eagles培养基(DMEM-低糖培养基；nvitrogen，Carlsbad，California，USA)中或磷酸盐缓冲盐水(PBS；Invitrogen)清洗肾脏。组织切割自肾脏皮质区。然后，在细胞培养板上机械地分离组织，直到组织被剁碎成细浆。然后，将组织转移到50mL的锥形管中。接着，将组织在含0.25单位的PZ活性/mL胶原酶(NB6，N0002779；ServaElectrophoresis GmbH，Heidelberg，Germany)、2.5单位/mL的分散酶(Dispase II 165 859，Roche Diagnostics公司，Indianapolis，Indiana，USA)和1单位/mL的透明质酸酶(Vitrase，ISTAPharmaceuticals，Irvine，California，USA)的GMP(药品生产质量管理规范)酶混合物中消化。酶混合物与肾上皮生长培养基(REGM)(Cambrex)结合。含组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃、225rpm的轨道式震荡器中培养1-2小时。
将消化材料以150xg离心处理5分钟，然后吸出上清液。在20mL的REGM中重悬颗粒。通过一个40微米尼龙BD FALCON细胞滤网(BDBiosciences，San Jose，California，USA)过滤细胞悬液。滤液被重悬在REGM(总容量50mL)中，而后以150xg离心处理5分钟。吸出上清液，细胞重悬在50mL的REGM中。这个过程重复两次。
在最终的离心处理后，吸出上清液，细胞颗粒重悬在10mL的REGM中。使用Guava仪器(Guava Technologies公司)测定活细胞数。然后，细胞固定于具有明胶涂层的细胞培养瓶中，并在正常大气条件、37℃下进行培养。细胞在未涂覆的细胞培养瓶中进一步传代6次，每2-3天更换培养基。然后细胞在液氮中冻存。
根据实例2脱细胞的网膜隔膜被切割为几个4cm2的块，然后将其浸入70％的乙醇中在4℃下过夜。然后，将各片网膜隔膜沉积入6孔培养皿的孔中。为了除去残留的乙醇，用3mL的PBS清洗网膜隔膜3次后，再用3mL的REGM清洗一次。将传代6次的hKDC解冻后，以10,000细胞/cm2的密度接种在网膜隔膜上，在REGM中培养4天。每2-3天向培养物中加入新鲜培养基。
在细胞接种后第四天，用3mL的PBS清洗网膜隔膜，然后用1μm的钙黄绿素-AM(分子探针)染色或将其固定在4％的多聚甲醛在室温下过夜。采用荧光显微镜观察钙黄绿素-AM染色样品，并将固定的样品送往&VetPath Services(VetPath Services for histological processingand H&E staining)做组织学处理和H&E染色。
培养4天后，hKDC表现出其明显附着于灭活网膜。此外，浓的钙黄绿素-AM染色证明这些细胞是活的。
实例6：灭活猪网膜上的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的生长
根据制造商的建议(以引用方式并入本文)，人脐静脉内皮细胞(HUVEC，目录编号C2517A)得自Cambrex，并在内皮细胞生长培养基(EGM-2MV，目录编号3202)中培养。对于常规传代，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，Invitrogen，目录编号14190)清洗细胞一次，然后通过胰蛋白酶消化(0.25％的胰蛋白酶-EDTA，Invitrogen公司，目录编号25200-056)将其分离。使用Guava仪器(Guava Technologies)进行细胞计数，并以5000细胞/cm2的密度接种。细胞按常规每3-4天传代。
将根据实例2的脱细胞的网膜切割为约2.5×2.5厘米的正方形，并将其置于超低族群6孔培养皿中。在纯乙醇中培养1小时对网膜进行消毒(此前网膜保存在70％的乙醇中)。使用前，网膜隔膜在3mL的PBS(不含Ca和Mg)中清洗3次。
通过用PBS进行洗涤并使用4mL的0.25％的胰蛋白酶-EDTA(Gibco)进行胰蛋白酶消化来获得HUVEC。加入等量的EGM-2MV培养基后，反应停止。通过离心法收集细胞，在培养基中重悬起细胞微粒。用Guava仪器(Guava Technologies)进行细胞计数，将1mL培养基中的100,000细胞接种在6孔培养皿中的网膜隔膜上。在37℃下培养2小时后，将另外2mL培养基添加到各孔中。
HUVEC在网膜隔膜上生长10天，然后进行DAPI染色处理。简而言之，网膜隔膜用3mL的PBS清洗，然后用冷的4％(w/v)的多聚甲醛(Sigma-Aldrich)在室温下固定10分钟。培养物用3mL的PBS清洗后，用10μM的DAPI(分子探针)染色15分钟，以观察细胞核。为进行活性染色，使用了活/死染色试剂盒(分子探针)。用3mL的PBS清洗网膜后，在室温下用1μM的钙黄绿素-AM和1μM的碘化丙啶染色10分钟。
使用合适的Olympus倒置表面荧光显微镜(Olympus)上的荧光滤镜观察细胞核(被DAPI染色)和活细胞(被钙黄绿素-AM染色)。用彩色数码摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics)捕集了代表性图像。
这项研究的结果表明，人脐静脉内皮细胞可以在脱细胞猪网膜隔膜上附着和生长，且这些细胞是活的。
实例7：GDF-5复合到非织造支架和脱细胞的网膜的复合物上
将由平均长度为5厘米的90/10 PGA/PLA纤维制成的毛毡放置在根据实例2制备的脱细胞的网膜的两侧。然后，对该结构进行针刺，以产生毡的90/10 PGA/PLA纤维与脱细胞的网膜的相互纠结。复合物的厚度为约1mm，密度为约75mg/cc。将浓度为200mg/mL的GDF-5的10mM的HCl加到复合支架中，然后在-25℃下冻干。载有GDF-5的复合支架有可能用于结缔组织修复，例如软骨再生、骨修复及伤口愈合。
虽然本发明已通过其详细实施例得到了显示和描述，但本领域技术人员会理解，可对本发明作出形式上和细节上的各种变化而不背离受权利要求书保护的本发明的精神和范围。

Claims (37)

1.将网膜脱脂的方法，包括：提供网膜；将所述网膜脱水；将所述网膜与至少一种脱水溶剂接触；以及使用至少一种提取溶剂从脱水的网膜中提取脂肪。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述网膜内的基本上所有的脂肪被提取。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取溶剂选自非极性溶剂、极性溶剂以及它们的组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述提取溶剂选自己烷、二甲苯、苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮、二氧杂环己烷、乙腈以及它们的组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱水溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇以及它们的组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述网膜与脱水溶剂的重量比为1∶5至1∶100。
7.根据权利要求1所述的方法，其中脱水的网膜与提取溶剂的重量比为1∶3至1∶50。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述网膜通过一次或多次处理脱水。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述处理包括：将所述网膜与包含醇和水的第一脱水溶剂接触，以及将所述网膜与包含醇的第二脱水溶剂接触。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一脱水溶剂包含60％至70％的醇和30％至40％的水，而所述第二脱水溶剂为纯醇。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述处理还包括：将所述网膜与包含醇的第三脱水溶剂接触，然后将所述网膜与包含醇的第四脱水溶剂接触。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第三脱水溶剂和所述第二脱水溶剂是纯醇。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述网膜与所述第一脱水溶剂的重量比为1∶5至1∶50，所述网膜与所述第二脱水溶剂的重量比为1∶5至1∶100，所述网膜与所述第三脱水溶剂的重量比为1∶5至1∶100，所述网膜与所述第四脱水溶剂的重量比为1∶5至1∶100。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪在一个或多个脂肪提取步骤中从所述脱水的网膜中提取。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述脂肪提取步骤包括：将所述脱水的网膜与是极性溶剂的第一提取溶剂接触，然后将所述脱水的网膜与包含30％至50％的极性溶剂和50％至70％的非极性溶剂的第二提取溶剂接触，再将所述脱水的网膜与包含70％至90％的非极性溶剂和10％至30％的极性溶剂的第三提取溶剂接触。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述极性溶剂是丙酮，所述非极性溶剂是己烷。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述脱水的网膜与所述第一提取溶剂的重量比为1∶3至1∶50，所述脱水的网膜与所述第二提取溶剂的重量比为1∶3至1∶50，所述脱水的网膜与所述第三提取溶剂的重量比为1∶3至1∶50。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括：在脂肪提取后将所述网膜再水化。
19.将网膜灭活的方法，包括以下步骤：i)将网膜脱脂，其包括a)通过将所述网膜与至少一种脱水溶剂接触将所述网膜脱水；和b)使用至少一种提取溶剂从所述脱水的网膜中提取脂肪；以及ii)将脱脂后的所述网膜脱细胞化。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述网膜内的基本上所有的脂肪被提取。
21.根据权利要求19所述的方法，包括将经过脱脂和脱细胞后的所述网膜消毒的附加步骤。
22.根据权利要求19所述的方法，包括将经过脱脂和脱细胞后的所述网膜杀菌的附加步骤。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述脱水溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇以及它们的组合。
24.根据权利要求19所述的方法，其中所述提取溶剂选自己烷、二甲苯、苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮、二氧杂环己烷、乙腈以及它们的组合。
25.医用构造物，包括根据权利要求1所述的方法脱脂的脱细胞的网膜。
26.用于血管重建的管状结构，包括根据权利要求1所述的方法脱脂的，且接种有内皮细胞的脱细胞的网膜，其中所述脱细胞的网膜包括细胞附着支架和生长促进基底。
27.用于植入到哺乳动物体内的支架结构，包括根据权利要求1所述的方法脱脂的，且脱细胞的网膜。
28.根据权利要求27所述的支架结构，其中所述脱细胞的网膜与人肾源细胞共培养，所述脱细胞的网膜包括细胞附着支架和生长促进基底。
29.根据权利要求27所述的支架结构，其中所述脱细胞的网膜与尿道上皮细胞共培养，所述脱细胞的网膜包括细胞附着支架和生长促进基底。
30.根据权利要求27所述的支架结构，还包括生物活性剂。
31.根据权利要求30所述的支架结构，其中所述生物活性剂选自促进愈合的效应物、促进组织再生的效应物、促进或加速愈合的效应物、预防感染的化合物或试剂、减少炎症的化合物或试剂、防止或最小化粘连形成的化合物、抑制免疫系统的化合物或试剂以及它们的组合。
32.根据权利要求30所述的支架结构，其中所述生物活性剂选自异源生长因子、自体生长因子、蛋白质、肽、抗体、酶、血小板、富含血小板的血浆、糖蛋白、激素、细胞因子、糖胺聚糖、核酸、止痛剂、病毒、病毒颗粒、细胞类型、治疗剂、抗炎剂、抗排异剂、趋化剂、生长剂、分化剂、生长剂片段、分化剂片段以及它们的组合。
33.根据权利要求30所述的支架结构，其中所述生物活性剂选自抗生素、甾类止痛剂、非甾类止痛剂、免疫抑制剂、抗癌药物、短期肽、骨形态发生蛋白、糖蛋白、脂蛋白、细胞附着介体、生物活性配体、整合素结合序列、配体、表皮生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素衍生生长因子、转化生长因子、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素相关肽、骨形态发生蛋白、音猬因子、生长分化因子、重组人类生长因子、软骨源形态发生蛋白、小分子、影响特异性生长因子上调的小分子、生腱蛋白-C、透明质酸、硫酸软骨素、纤维连接蛋白、饰胶蛋白聚糖、凝血弹力蛋白、凝血酶衍生肽、肝素结合域、肝素、硫酸乙酰肝素、DNA片段、DNA质粒以及它们的组合。
34.根据权利要求27所述的支架结构，包括所述脱细胞的网膜和聚合物的复合物，所述聚合物选自生物相容性合成聚合物和天然聚合物。
35.根据权利要求34所述的支架结构，其中所述生物相容性的聚合物选自聚丙烯、脂族聚酯、聚氨基酸、共聚醚-酯、聚亚烷基草酸酯、聚酰胺、酪氨酸衍生聚碳酸酯、聚亚氨基碳酸酯、聚原酸酯、聚氧杂酯、聚酰氨基酯、含胺基的聚氧杂酯、聚酸酐、聚磷腈、生物分子以及它们的共混物。
36.根据权利要求34所述的支架结构，其中所述天然聚合物选自胶原、弹性蛋白、透明质酸、层粘连蛋白和明胶。
37.根据权利要求35所述的支架结构，其中所述生物分子选自胶原、弹性蛋白、生物可吸收淀粉。
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