CN111643734A - 一种应用于半月板损伤修复的脱细胞基质 - Google Patents

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Abstract

本发明所涉及的是一种用于半月板损伤修复的脱细胞基质和制备方法，属于再生医学生物材料制备和应用领域。本项发明应用专有的脱细胞去抗原生物技术，以富含毛细血管组织和III型胶原的猪的特定组织部位为原料，制备去除引起免疫排斥反应的物质(组织细胞DNA和α‑半乳糖基)而保留细胞外结构基质组成和天然结构的脱细胞生物材料，作为半月板组织修复和再生提供模板骨架的基质材料。其能够提供良好的再生物质环境和和组织再生的营养条件，同时可降解吸收，能促进组织快速再生，有效缩短恢复周期。目前国际国内还没有同类产品。

Description

一种应用于半月板损伤修复的脱细胞基质
1.技术领域
本发明所涉及的是一种用于半月板损伤修复的脱细胞基质的制备和使用方法，属于再生医学生物材料制备和应用领域。
本项发明应用专有脱细胞去抗原生物技术，选取富含毛细血管组织和III型胶原的猪的特定组织部位为原料，制备去除引起免疫排斥反应的物质(组织细胞DNA和α-半乳糖基) 而保留细胞外结构基质组成和天然结构的脱细胞生物材料，作为组织修复和再生提供模板骨架的半月板再生基质材料。因为其能够提供半月板损伤修复需要的良好的再生物质环境，提供组织再生的营养条件，同时可降解吸收，因而能促进组织快速再生，有效缩短恢复周期，对半月板损伤修复有良好效果。
该项发明产生的半月板损伤修复方法摈弃了切除等破坏半月板的生物力学和生理学功能的传统方法，是半月板损伤修复方法的创新，目前国际国内还没有同类的研究产品，本项发明可填补我国在该领域的空白。项目研究成功可产生良好的社会效益和经济效益。
本项发明的先进性是使用去α-半乳糖基抗原专有技术，高效地完全去除组织排斥反应因子，使基质具有良好的机械强度和生物相容性，优良的组织再生能力。
本项发明选择与人有高度的组织结构和免疫学相似性的猪作为特定组织的材料来源，该材料来源广泛，价格低廉，在脱去引起排斥反应的抗原细胞成分的同时去除α-半乳糖基抗原(Strattice)，提高了脱细胞基质的生物相容性，降低其抗原性，提高其促进组织再生能力，代替同种异体脱细胞基质生物材料，可制成多种用途和剂型规格的产品，并大幅降低脱细胞生物医学材料的生产成本和市场价格。性能优良的脱细胞基质为解决临床组织修复的问题提供了新的很好的途径。
本项发明核心技术是去除引起免疫排斥反应的物质而保留细胞外结构基质组成和天然结构。应用该技术制备的脱细胞基质生物材料，作为组织修复和再生的全新材料，是开发再生医学产品的理想生物医学材料。该脱细胞基质生物材料优越的性能使其在组织修复再生医学材料领域处于领先的水平。
2.背景技术
半月板损伤是一种常见的多发病，由运动损伤或意外事故造成。在国内，半月板手术每年已近30万例。随着近年来我国户外运动者和老龄人大幅增加，患病年增长率为11％。由于半月板的特殊位置环境，当受伤后大多只能切除，修复困难，不能自身修复，造成运动受限和残疾，丧失劳动和自理能力，给家庭和社会造成沉重的负担。半月板损伤所带来的痛苦是常人所无法体会到的，很多患者受尽了病痛的折磨。探索寻找好的治疗修复方法，是膝关节外科领域非常重要的任务和课题。
目前国内主要的治疗方法是手术缝合、关节腔镜清理和手术切除，造成半月板的生物力学和生理学功能丧失，减弱或失去人的跳跃、负重等基本生理功能。医学界对半月板的生物力学功能进行的多年研究，越来越认识到半月板的生物力学功能重要性，认为不宜简单地将损伤半月板切除，而应修复它们，但由于半月板本身内部无血液，只在周围有血液循环，所以，半月板损伤仅边缘撕裂经过长时间修养有可能会自己愈合，半月板中心区无法自己愈合，修复极其困难。
2015年美国有一项研究以脱细胞生物材料作为半月板损伤的修复材料，据报道效果显著、恢复期很短。目前已近完成临床研究。
首都医科大学附属北京朝阳医院骨科周预、刘玉杰、黄靖香等《同种和异种脱细胞半月板的制备及生物力学研究》中华关节外科杂志(电子版)2014年10月第8卷第5期，探讨人脱细胞半月板和兔脱细胞半月板的制备方法，比较两者生物力学性能差异，分别对两组脱细胞半月板进行组织学观察，扫描电镜观察，用生物力学机测定两组脱细胞半月板在不同压缩比率下的瞬时形变恢复率，最大形变恢复率及最大受压强度，显示人脱细胞半月板的力学性能优于兔脱细胞半月板，可作为组织工程支架材料。但人脱细胞半月板来源非常有限，其临床应用受到限制。
重庆师范大学大学杨小宁《半月板运动性损伤的组织工程修复：国际研究趋势与未来》中国组织工程研究第16卷第24期(2012-06-10出版)，提示骨组织工程学、基因工程、生物力学以及材料学等学科的深入研究为半月板损伤的治疗提供了新途径。
上海长征医院关节外科符培亮、张雷《半月板组织工程研究进展》中国修复重建外科杂志2013年4月第27卷第4期，显示半月板组织工程研究已取得许多成果，寻找可塑性强、无抗原性、可降解、力学性能接近正常半月板的支架材料是研究重点。最有效的方法是构建组织工程半月板。组织工程半月板构建的主要步骤是首先构建支架，然后将细胞接种于支架上，调控细胞-支架复合物，使之产生细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，最终形成有功能的半月板组织。
中国人民解放军总医院《组织工程半月板复合支架及其制备方法》(中国发明专利，公告号：CN109199649B)，公开了一种组织工程半月板复合支架及其制备方法。所述支架采用可降解高分子材料纤维作基质材料，提供细胞生长所需微环境，从而使新生半月板具有优良的形态、结构、力学性能及生理功能。该发明的支架基质采用高分子材料纤维，其生物相容性和可降解性不理想。
浙江大学《一种天然组织来源的半月板脱细胞材料及其制备方法》(中国发明专利，公告号：CN106943628A)，公开了一种天然组织来源的半月板脱细胞材料及其制备方法，所采用的半月板是天然来源的生物材料，具有生物相容性和取材广泛性。该发明脱细胞材料选取猪半月板，存在脱细胞工艺过程复杂、成本较高、脱细胞不彻底组织反应。
医用生物材料的研究方向是通过改性或复合的方法，改善现有材料的不足，增强其各种性能，为细胞的生长和繁殖提供营养和代谢环境，调节细胞的生长和排列，并最终降解达到组织永久性替代的目的组织工程化生物材料。
目前国际上脱细胞再生生物材料研究包括：
脱细胞基质产品：主要是在制造过程中使用来源不同的细胞和组织材料以及不同的脱细胞工艺技术方法。
各种动物和人类的衍生产品的利用：动物源产品(移植)是由采集鲜活组织(如真皮、小肠黏膜下层、心包等)从不同的供体动物(如猪、羊、马或牛)不同的年龄阶段。
动物来源胶原基质衍生产品：如
Figure RE-GSB0000188820360000031
BioMatrix Collagen伤口敷料Synovis。
胶原蛋白、多糖与合成材料制造的复合材料产品：如
Figure RE-GSB0000188820360000032
双层基质伤口敷料，Integra LifeSciences。
人源产品、捐赠的人尸体皮肤(移植)及各种工艺去除细胞和病原体：如
Figure RE-GSB0000188820360000033
Lifecell；
Figure RE-GSB0000188820360000034
Wright Medical。
经过近年的技术进步，异种脱细胞生物材料已经成为组织再生及修复的主流产品，其脱除引起排斥反应的抗原细胞成分，保留细胞外基质和三维空间框架结构，抗原性低、生物相容性好，无排斥反应、无菌、无毒、无刺激，再造后组织力学强度高、弹性好，不变形，材料规格可不受限制制成临床上需要的任何尺寸。在材料上负载各种药物和生长因子，有效控制药物释放，同时达到伤口愈合及治疗作用。
本发明选择猪的鲜活的富含毛细血管和III型胶原的特定组织，作为脱细胞的生物材料，对半月板损伤修复具有天然优良的基质结构和营养物质条件。利用专有的去除α-半乳糖基抗原生产技术，经过严格科学的工艺有效地去除引发组织反应的细胞成分，制备成适合临床使用的剂型和规格。具有良好的机械强度和生物相容性及生物功能的猪特定组织去抗原脱细胞基质适用领域广泛，可作为多种用途的再生医学生物材料产品，应用于半月板损伤修复。
3.发明内容
本项发明应用专有脱细胞去抗原生物技术，采用富含毛细血管组织和III型胶原的猪的特定组织部位为原料，制备去除引起免疫排斥反应的物质(组织细胞DNA和α-半乳糖基) 而保留细胞外结构基质组成和天然结构的脱细胞生物材料，作为组织修复和再生提供模板骨架的半月板再生基质材料。根据半月板的组织细胞成分和生长代谢机理特点，非供血区没有丰富的血管作为损伤后提供治疗药物输送和损伤后新陈代谢机制加速条件，因此特别针对性的选择富含毛细血管组织和III型胶原的猪的大网膜，应用专有脱细胞去抗原生物技术，去除引起免疫排斥反应的物质(组织细胞DNA和α-半乳糖基)而保留细胞外结构基质组成和天然结构的脱细胞生物材料，作为组织修复和再生提供模板骨架的半月板再生基质材料。细胞外基质(ECM)在组织再生中起着非常重要的作用，ECM成分包括多糖、透明质酸、胶原和弹性蛋白、纤维粘连蛋白，是细胞间组织的重要组成成分。因为其能够提供半月板损伤修复需要的良好的再生物质环境，提供组织再生的营养条件，同时可降解吸收，因而能促进组织快速再生，有效缩短恢复周期，实现半月板损伤的修复，预期取得理想的治疗效果。
猪大网膜经脱细胞去抗原后得到一种结构为网状多微孔材料，非常利于构建三维多微孔支架，为细胞种子的生长和繁殖提供营养和代谢环境，调节细胞的生长和排列，并最终降解达到组织永久性替代的目的。可以作为理想的半月板损伤修复支架材料，并制成多种用途的再生医学生物材料，应用于半月板损伤修复及烧伤、创面愈合，乳房再造等领域。
4.具体实施方式
制备工艺流程：采集鲜活的检疫合格的猪的特定组织(大网膜)-→组织的加工处理 (剔除组织杂质、去除血液组织液、脱脂)-→去除细胞DNA(专有技术)-→去除病毒 (化学法病毒灭活)-→去除猪α-半乳糖基抗原(专有技术)-→冷冻干燥-→根据临床用途制成需要的剂型和规格-→包装和电子束灭菌
实施例1：
a、将100克膜放入0.9％氯化钠生理盐水+30Mm-EDTA，PH7.4，温度4度保存。
b、用0.9％氯化钠生理盐水清洗3次。去除粘附。
c、加入1升100％乙醇，脱水2小时。重复2次，每次用1升乙醇，脱水2小时去脂
d、加入500ml50：50甲醇：乙烷，萃取2小时，去除萃取液。
e、加入20：80甲醇：乙烷，萃取过夜。重复萃取过程，每次4小时。
f、用500ml乙醇清洗30分钟，在70％乙醇下保存。
g、将膜置于200ml0.05MTris，1％TritenX-100溶液中震荡提取过夜。
h、离心沉淀，用纯水洗涤2次。
i、将沉淀用20％乙醇+0.15％过氧乙酸处理20分钟，离心收集沉淀。
j、加入0.1M氢氧化钠100ml侵泡过夜。
k、用0.1M氢氧化钠100ml洗涤30分钟，用PBS洗涤中和。
l、水洗后置于70％乙醇保存，冻干。

Claims (8)

1.本项发明所涉及的是一种用于半月板损伤修复的脱细胞基质和制备方法。
2.权利要求1所说的脱细胞基质的原材料来源为猪大网膜。
3.权利要求1所说的脱细胞基质应用于半月板损伤修复的支架材料。
4.权利要求1所说的脱细胞基质应用于烧伤、创面愈合，乳房再造。
5.权利要求1所说的制备方法，其特征在于：100％浓度乙醇去脂、加入甲醇：乙烷混合液萃取、0.05MTris+1％TritenX-100溶液提取、20％乙醇+0.15％过氧乙酸处理、加入0.1M氢氧化钠处理，获得脱细胞基质材料。
6.权利要求5所说甲醇∶乙烷混合液比例为1∶3～3∶1。
7.权利要求5说的Tris浓度范围为0.01M～0.1M，ritenX-100浓度范围为0.5％～5％。
8.权利要求5说的乙醇+过氧乙酸溶液，乙醇浓度范围为5％～50％，过氧乙酸浓度范围为0.05％～0.5％。
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