CN106943628A - 一种天然组织来源的半月板脱细胞材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种天然组织来源的半月板脱细胞材料及其制备方法；本发明将哺乳动物任意半月板组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞半月板材料；本发明所采用的半月板是天然来源的生物材料，具有很好的生物相容性和取材广泛性，具有更加高效便捷的获得均一性高的脱细胞半月板材料且可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境、生化因子和生物力学性质等，可以最大限度的模拟正常半月板的复杂组织结构。

Description

一种天然组织来源的半月板脱细胞材料及其制备方法
技术领域
本发明主要涉及用于组织或器官修复及其再生的生物领域，具体是一种天然组织来源的半月板脱细胞材料及其制备方法。
背景技术
半月板在膝关节中承担着重要的生物力学作用，其损伤在临床上十分常见，往往引起严重的功能缺失，半月板退变以及关节炎症，难以自愈。在美国，每150万台膝关节手术中就有一半与半月板损伤相关，花费巨大。目前此类手术多为同种异体半月板置换术，但是免疫排斥反应强烈，生物力学性能欠佳，效果并不理想。
再生医学和组织工程技术的出现使根治半月板损伤成为可能。它由三种重要的因素构成包括细胞，支架以及生物活性分子。由细胞支架构建的材料在组织工程中应用极为广泛，例如天然的聚合物材料，合成的胶原或蛋白支架，金属材料等，但是它们难以完全模拟半月板的生理特性以及力学性能，限制了修复的效果。
天然组织来源的细胞外基质(ECM)能够在去除诱导免疫排斥的细胞的同时，保留天然的3D微结构以及细胞外基质中的有效成分包括胶原，糖胺聚糖(GAG)，细胞因子等，为修复半月板缺损提供了可能。而目前性能良好的半月板脱细胞材料尚未被发现。
发明内容
本发明针对现有的填补现有技术中，半月板在材料组成、结构、生物力学方面的不足以及半月板缺损的修复效果，提供一种适宜的治疗半月板缺损的半月板脱细胞材料的制备方法。
为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：将哺乳动物任意半月板组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞半月板材料；
所述的含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液质量浓度为1％-5％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；
所述的有机溶剂溶液为等体积比的三种溶液，氯仿和甲醇溶液、质量浓度10％-100％的丙酮溶液或质量浓度30％-70％的乙醇溶液；
所述的含Triton X的PBS缓冲液的质量浓度1％-5％的Triton X-200或Triton X-100的PBS缓冲液；
所述的含SDS的PBS缓冲液的质量浓度0.5％-5％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1-20mmol/L的Tris；
所述的含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶质量浓度为0.01-0.5mg/ml。
一种天然组织来源的半月板脱细胞材料的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)取哺乳动物全身任意半月板组织用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织、毛发和韧带；
(2)接着在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温45℃摇床100rpm震荡8-24小时；
(3)在有机溶剂溶液中，恒温45℃摇床100rpm震荡脱脂2-12小时；
(4)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡4-15天；
(5)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡2-8天；
(6)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡2-12小时；
(7)在无菌生理盐水中，37℃摇床100rpm震荡72小时，即得天然组织来源的半月板脱细胞材料；
混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为1:1；步骤(4)-(6)中PBS缓冲液和混合抗菌液体积比分别为10:1、10:1、5:1；
步骤(2)-(6)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时。
针对目前用于半月板修复和再生的骨材料及其制备方法存在的问题，发明人建立了一种天然组织来源的半月板脱细胞材料的制备方法，该法将哺乳动物任意半月板组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液、含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得半月板脱细胞材料。
相对于现有技术，本发明的显著进步在于：
(1)本发明所采用的半月板是天然来源的生物材料，具有很好的生物相容性和取材广泛性。
(2)本发明运用一种脱细胞方案即可同时实现对任意物种半月板组织进行彻底去细胞化处理，更加高效便捷的获得均一性高的脱细胞半月板材料。
(3)本发明在去除具有免疫原性的异体或异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境、生化因子和生物力学性质等，可以最大限度的模拟正常半月板的复杂组织结构。
(4)本发明可以为病人订制具有个体化、可供移殖的半月板脱细胞支架，可满足临床上复杂多样的半月板缺损修复需求，也可以将其研磨制成粉末，将正常半月板组织中所含有的生化因子溶解，用于全身任意部位的骨科疾病。
附图说明
图1是本发明的半月板大体外观图
图2是半月板支架的HE染色无细胞及无细胞核成分残留图
图3是半月板支架的DAPI染色无细胞及无细胞核成分残留图
图4是半月板DNA定量检测几乎不含有DNA成分图
图5是半月板的胶原定量检测保留大量胶原成分图
图6是半月板的Masson染色胶原定性检测保留大量胶原成分图
图7是半月板扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留图
图8是CCK-8检测不同支架浸提液浓度下MSCs的增值情况图
具体实施方案
下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此
1.脱细胞半月板材料的制备与研究
(1)取材：取5个月(雌雄均可)健康猪膝关节，剪取左右两侧半月板，转移至4℃环境中，用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织、脂肪和韧带等组织；取材大小视临床实际手术需要而定，可以选用全半月板。
(2)在1000ml含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液(质量浓度为1％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml)中，恒温45℃摇床100rpm震荡10小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(3)在1000ml有机溶剂溶液(等体积比的氯仿和甲醇溶液)中，恒温45℃摇床100rpm震荡脱脂12小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(4)在1000ml含Triton X的PBS缓冲液(浓度为2％的Triton X-100)，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡12天，并用生理盐水冲洗5小时；
(5)在1000ml含SDS的PBS缓冲液(质量浓度0.5％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1mmol/L的Tris)，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡5天，并用生理盐水冲洗5小时；
(6)在300ml含DNA酶的PBS缓冲液中(DNA酶浓度为0.01mg/ml)，加入60ml青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡12小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(7)在无菌生理盐水中，37℃摇床100rpm震荡72小时，即得天然组织来源的半月板脱细胞材料，液氮中保存，待手术时取出。
其中，混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为1:1。
对本例所得天然组织来源的半月板脱细胞材料进行组织学评价、抗原成分定量检测，结果如图1-8。通过图1和2显示完全脱细胞半月板材料大体结构保留完好，细胞外基质保留完整，细胞核成分完全去除，无细胞及其碎片残留；图3DAPI染色进一步提示材料中细胞核成分呈阴性，抗原性得到完全去除；图4的DNA抗原成分定量检测说明通过去细胞DNA去除率可以达到95％以上；图5和图6的胶原定量和定性检测发现细胞外基质主要胶原成分得到很好保留；图7的扫描电镜先是半月板微观结构保留完整；图8的CCK-8细胞毒性检测表明半月板脱细胞材料无细胞毒性，生物相容性。
实施例2脱细胞半月板材料的制备和研究
(1)取材：取5个月(雌雄均可)健康猪膝关节，剪取左右两侧半月板，转移至4℃环境中，用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织、脂肪和韧带等组织；取材大小视临床实际手术需要而定，可以选用全半月板。
(2)在1000ml含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液(质量浓度为5％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml)中，恒温45℃摇床100rpm震荡8小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(3)在1000ml有机溶剂溶液(质量浓度10％-100％的丙酮溶液)中，恒温45℃摇床100rpm震荡脱脂10小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(4)在1000ml含Triton X的PBS缓冲液(浓度为5％的Triton X-100)，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡15天，并用生理盐水冲洗5小时；
(5)在1000ml含SDS的PBS缓冲液(质量浓度5％的SDS的PBS缓冲液，其中混合20mmol/L的Tris)，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡2天，并用生理盐水冲洗5小时；
(6)在300ml含DNA酶的PBS缓冲液中(DNA酶浓度为0.5mg/ml)，加入60ml青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡2小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(7)在无菌生理盐水中，37℃摇床100rpm震荡72小时，即得天然组织来源的半月板脱细胞材料，液氮中保存，待手术时取出。
其中，混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为1:1。
实施例3脱细胞半月板材料的制备和研究
(1)取材：取5个月(雌雄均可)健康猪膝关节，剪取左右两侧半月板，转移至4℃环境中，用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织、脂肪和韧带等组织；取材大小视临床实际手术需要而定，可以选用全半月板。
(2)在1000ml含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液(质量浓度为3％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml)中，恒温45℃摇床100rpm震荡24小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(3)在1000ml有机溶剂溶液(质量浓度30％-70％的乙醇溶液)中，恒温45℃摇床100rpm震荡脱脂2小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(4)在1000ml含Triton X的PBS缓冲液(浓度为1％的Triton X-100)，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡4天，并用生理盐水冲洗5小时；
(5)在1000ml含SDS的PBS缓冲液(质量浓度3％的SDS的PBS缓冲液，其中混合15mmol/L的Tris)，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡2天，并用生理盐水冲洗5小时；
(6)在300ml含DNA酶的PBS缓冲液中(DNA酶浓度为0.2mg/ml)，加入60ml青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡6小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(7)在无菌生理盐水中，37℃摇床100rpm震荡72小时，即得天然组织来源的半月板脱细胞材料，液氮中保存，待手术时取出。
其中，混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为1:1。
实施例4脱细胞半月板材料的制备和研究
取猪半月板，步骤(4)在1000ml含Triton X的PBS缓冲液(浓度为1％的Triton X-200)，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡4天，并用生理盐水冲洗5小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞半月板材料。
实施例5脱细胞半月板材料的制备和研究
取猪半月板，步骤(4)在1000ml含Triton X的PBS缓冲液(浓度为2％的Triton X-200)，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡4天，并用生理盐水冲洗5小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞半月板材料。
实施例6脱细胞半月板材料的制备和研究
取猪半月板，步骤(4)在1000ml含Triton X的PBS缓冲液(浓度为5％的Triton X-200)，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡4天，并用生理盐水冲洗5小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞半月板材料。
对实施例2-6所得脱细胞半月板材料分别进行组织学评价、抗原成分定量检测，结果与实施例1类似，这表明脱细胞半月板材料可通过上述多种方法制得，并且对其进行组织学评价、抗原成分定量检测均说明材料已经完全去除细胞成分，无明显抗原成分残留；将其运用于兔子一类的大动物半月板缺损模型修复中可以达到很好的软骨修复再生效果。脱细胞半月板材料可以作为临床上半月板缺损移植等病人的安全可靠、有效、快速的替代材料。

Claims (2)

1.一种天然组织来源的半月板脱细胞材料，其特征在于：将哺乳动物任意半月板组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞半月板材料；
所述的含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液质量浓度为1％-5％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；
所述的有机溶剂溶液为三种溶液中的一种，三种溶液分别为等体积比的氯仿和甲醇溶液，质量浓度10％-100％的丙酮溶液，质量浓度30％-70％的乙醇溶液；
所述的含Triton X的PBS缓冲液的质量浓度1％-5％的Triton X-200或Triton X-100的PBS缓冲液；
所述的含SDS的PBS缓冲液的质量浓度0.5％-5％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1-20mmol/L的Tris；
所述的含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶质量浓度为0.01-0.5mg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种天然组织来源的半月板脱细胞材料的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)取哺乳动物全身任意半月板组织用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织、毛发和韧带；
(2)接着在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温45℃摇床100rpm震荡8-24小时；
(3)在有机溶剂溶液中，恒温45℃摇床100rpm震荡脱脂2-12小时；
(4)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡4-15天；
(5)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床100rpm震荡2-8天；
(6)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡2-12小时；
(7)在无菌生理盐水中，37℃摇床100rpm震荡72小时，即得天然组织来源的半月板脱细胞材料；
混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为1:1；步骤(4)-(6)中PBS缓冲液和混合抗菌液体积比分别为10:1、10:1、5:1；
步骤(2)-(6)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时。
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