CN107715177B - 髓核细胞修饰猪小肠黏膜下层多重脱细胞材料的制备方法 - Google Patents

髓核细胞修饰猪小肠黏膜下层多重脱细胞材料的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种髓核细胞修饰猪小肠黏膜下层多重脱细胞材料的制备方法，该方法具体为，将猪SIS组织剥离后，经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞SIS材料，球磨粉碎为直径200um微粒，并与分离的髓核细胞共培养及再次脱细胞处理，获得的多重脱细胞可注射髓核修复材料。本发明在去除具有免疫原性的异体或异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境、生化因子和生物力学性质等，可以最大限度的模拟正常生理状况髓核细胞的生长环境。

Description

髓核细胞修饰猪小肠黏膜下层多重脱细胞材料的制备方法
技术领域
本发明属于腰椎间盘组织修复及其再生技术领域，尤其涉及一种天然组织来源的及天然细胞修饰的多重脱细胞髓核修复材料及其制备方法。
背景技术
腰背部疼痛在人群中的发生率高达60％，而其中的相当部分与腰椎间盘退变密切相关。虽然临床上可通过多种手术或非手术方法治疗腰椎间盘退变，但诸如疼痛控制、脊柱融合术等方法仅可缓解症状，而无法重建脊柱结构。为此，人工椎间盘修复材料是目前研究的方向所在，但由于生物相容性，髓核细胞再生困难等不足，目前仍然没有合适的材料能够真正用于椎间盘退变的治疗，使其恢复原有的生理功能。此外，由于对椎间盘进行手术操作本身亦可诱导其退变，因此修复材料因具有可微创注射的特征。而目前对于具备类似性能的髓核修复材料还基本无报道。
细胞外基质(ECM)含有正常细胞在组织或器官内正常功能所需要的各种生化因子及微观三维结构，是十分适宜细胞生长的天然支架。研究报告认为，小肠黏膜下层(SIS)是相当优良的ECM结构，运用人工脱细胞技术处理去除抗原及异体细胞成分的猪SIS进行疝、表皮损伤等疾病修复有一定的研究报道。然而，目前还未有人报道采用脱细胞SIS修复椎间盘退变。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提出了一种髓核细胞修饰猪小肠黏膜下层多重脱细胞材料及制备方法。该方法在对SIS进行去细胞及微粒化处理后，进一步使用髓核细胞改造SIS的ECM构成使其更为适应椎间盘退变，并进行二次脱细胞处理，得到稳定的可注射多重脱细胞髓核修复材料。
为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：
步骤(1)取猪空肠上段组织用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除黏膜层和肌层，并再次用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次；
步骤(2)置于液氮中完全冷却，再置于37℃水浴中半小时恢复温度，重复上述流程5次；
步骤(3)在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温45℃摇床120rpm震荡8-24小时；
步骤(4)在有机溶剂溶液中，恒温45℃摇床120rpm震荡脱脂2-12小时；
步骤(5)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡1-36小时；
步骤(6)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡0.5-24小时；
步骤(7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床120rpm震荡1-36小时；
步骤(8)在无菌生理盐水中，37℃摇床120rpm震荡72小时，即得天然组织来源的猪SIS材料；
步骤(9)将SIS材料切割成小块，浸泡于无菌生理盐水中，使用组织匀浆机以6,000rpm转速将SIS材料震荡球磨共5-20周期，每周期30秒，研磨SIS材料为微小颗粒；
步骤(10)先后将SIS悬浊液通过60目及80目细胞筛，滤除过大或过小微粒；
步骤(11)将传代的髓核细胞及SIS颗粒共同置于立体培养基内进行共培养2-4周，即得髓核细胞修饰的SIS微粒材料；
步骤(12)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡1-36小时；
步骤(13)在无菌生理盐水中，37℃摇床120rpm震荡72小时，即得髓核修饰的天然组织来源的猪SIS多重脱细胞材料；
混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的体积比例为1:1；步骤(5)-(7)及(12)中PBS缓冲液和混合抗菌液体积比分别为10:1、10:1、5:1、10:1；
步骤(3)-(7)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时；步骤(11)、(12)完成后用生理盐水浸泡5小时；
所述的含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液浓度为1％-5％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；
所述的有机溶剂溶液为等体积比的氯仿和甲醇溶液、浓度10％-100％的丙酮溶液或浓度30％-70％的乙醇溶液；
所述的含Triton X的PBS缓冲液为浓度1％-10％的Triton X-200或Triton X-100的PBS缓冲液；
所述的含SDS的PBS缓冲液为浓度0.5％-10％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1-20mmol/L的Tris；
所述的含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶浓度为0.01-0.5mg/ml；
共培养指将髓核细胞与1000微球/mL的SIS微粒在立体培养环境下共同培养，培养基为含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液针对目前用于修复椎间盘退变材料及其制备方法存在的问题，本发明人建立了一种以天然猪SIS为基础，髓核细胞修饰的多重脱细胞可注射髓核修复材料的制备方法。改法将猪SIS经过球磨，含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液、含DNA酶的PBS缓冲液处理，并用髓核细胞对该材料进行改造，再次经脱细胞流程获得脱细胞SIS材料。本发明在条件温和、无ECM损害、快速稳定地利用SIS优良的ECM性能同时，最大限度地通过髓核细胞对其特性进行改造，所得髓核修复材料具有生物相容性好，髓核细胞粘附生长能力强，实用性高(可注射)的优点，可用于临床椎间盘退变情况下的髓核修复。
相对于现有技术，本发明的显著进步在于：
(1)本发明在去除具有免疫原性的异体或异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境、生化因子和生物力学性质等，可以最大限度的模拟正常生理状况髓核细胞的生长环境。
(2)本发明构建的材料具有良好的可注射性，以满足临床运用中高效、低损伤地进行髓核修复操作的要求。
(3)本发明可以为病人订制具有个体化的髓核修复材料，通过使用患者自体髓核细胞对材料进行改造时可进一步增强材料的修复效果。
附图说明
图1是本发明SIS微粒的粒径大小分布测试图；
图2是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的HE染色无细胞及无细胞核成分残留示意图；
图3是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的Masson三色染色无细胞及无细胞核成分残留，且胶原含量丰富示意图；
图4是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的DAPI染色无细胞及细胞核成分残留示意图；
图5是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料DNA定量检测，在初次和再次脱细胞后均几乎不含有DNA成分图；
图6是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的阿尔新蓝胶原定型检测，显示保留大量胶原成分图；
图7是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料在扫描电镜下表现为完整的，适宜细胞生长的空间立体结构图；
图8是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料经CCK-8检测无细胞毒性图；
图9(a)是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料用于修复兔子椎间盘退变造模时的效果图(核磁共振，T2序列)。
图9(b)是髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料用于修复兔子椎间盘退变模型3月后的修复效果图(核磁共振，T2序列)
具体实施方式
实施例1髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的制备和研究
(1)猪空肠上段组织用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除黏膜层和肌层，并再次用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次；取材大小通常为5cm x 5cm。
(2)将SIS置于液氮中完全冷却，再置于37℃水浴中半小时恢复温度；重复上述流程10次，以利于后续试剂扩散；
(3)在1000ml含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液(浓度为1％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml)中，恒温45℃摇床120rpm震荡24小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(4)在1000ml有机溶剂溶液(等体积比的氯仿和甲醇溶液)中，恒温45℃摇床120rpm震荡脱脂12小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(5)在1000ml含Triton X的PBS缓冲液(浓度1％的Triton X-100)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡36小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(6)在1000ml含SDS的PBS缓冲液(SDS浓度为0.5％，混合1mmol的Tris)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡24小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(7)在300ml含DNA酶的PBS缓冲液中(DNA酶浓度为0.01mg/ml)，加入60ml青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床120rpm震荡36小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(8)在无菌生理盐水中，37℃摇床150rpm震荡72小时，即得天然组织来源的猪SIS材料；
(9)将SIS材料切成约5mm x 5mm小块，每块与1ml生理盐水一起置于组织匀浆管中，并加入4-5颗研磨球，以8,000rpm转速将SIS材料震荡球磨共5周期，每周期30秒，研磨SIS材料为微小颗粒；
(10)先后将组织匀浆后的SIS悬浊液通过60目及80目细胞筛，收集粒径小于60目细胞筛孔隙而大于80目细胞筛孔隙的SIS颗粒；
(11)将传代的髓核细胞以5×106细胞/mL的密度，与1000微球/mL的SIS微粒共同置于立体培养环境中(总体积50ml)，培养基为含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，共培养2周，即得髓核细胞修饰的SIS微粒材料；
(12)在1000ml含SDS的PBS缓冲液(SDS浓度为0.5％，混合1mmol的Tris)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡36小时，并用生理盐水浸泡5小时；
(13)在无菌生理盐水中，37℃摇床150rpm震荡72小时，即得髓核修饰的猪SIS多重脱细胞可注射材料。
对本例所得髓核修饰的天然组织来源的猪SIS多重脱细胞材料进行组织学评价、抗原成分定量检测和椎间盘退变修复能力检测，结果如图1-9。图1显示髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料粒径主要分布在200um周围，其粒径大小最适细胞黏附；图2和3显示髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料大体结构保留完好，细胞外基质保留完整，细胞核成分完全去除，无细胞及其碎片残留；图4的DAPI染色进一步明确了材料中细胞核成分呈阴性，抗原性得到最大程度的去除；图5的以定量检测的形式表明通过两次去细胞操作均可以去除95％以上DNA；图6的胶原定性检测发现髓核细胞生长所需的细胞外基质主要胶原成分得到很好保留和重构；图7的扫描电镜显示SIS表现出适宜细胞黏附的微观三维结构；图8的CCK-8细胞毒性检测表明髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料无细胞毒性，生物相容性高；图9(a)、(b)的兔子椎间盘退变模型3月修复实验表明该材料可以显著抑制椎间盘退变的进程。
实施例2髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的制备和研究
取猪SIS组织，步骤(3)在1000ml含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液(浓度为3％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml)中，恒温45℃摇床120rpm震荡8小时；步骤(12)在1000ml含SDS的PBS缓冲液(SDS浓度为3％，混合10mmol的Tris)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡15小时；，其余参考实施例1的方法进行，得到髓核修饰的猪SIS多重脱细胞可注射材料。
实施例3髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的制备和研究
取猪SIS组织，其余参考实施例1的方法进行，得到髓核修饰的猪SIS多重脱细胞可注射材料。
实施例4髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的制备和研究
取猪SIS组织，步骤(4)在1000ml有机溶剂溶液(浓度70％的乙醇溶液)中，恒温45℃摇床120rpm震荡脱脂2小时；步骤(11)将传代的髓核细胞以5×104细胞/mL的密度，与1000微球/mL的SIS微粒共同置于立体培养环境中(总体积50ml)，培养基为含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，共培养3周；其余参考实施例1的方法进行，得到髓核修饰的猪SIS多重脱细胞可注射材料。
实施例5髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的制备和研究
取猪SIS组织，步骤(5)在1000ml含Triton X的PBS缓冲液(浓度5％的Triton X-200)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡1小时；步骤(6)在1000ml含SDS的PBS缓冲液(SDS浓度为5％，混合10mmol的Tris)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡24小时；其余参考实施例1的方法进行，得到髓核修饰的猪SIS多重脱细胞可注射材料。
实施例6髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的制备和研究
取猪SIS组织，步骤(6)在1000ml含SDS的PBS缓冲液(SDS浓度为10％，混合20mmol的Tris)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡0.5小时；步骤(7)在300ml含DNA酶的PBS缓冲液中(DNA酶浓度为0.2mg/ml)，加入60ml青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床120rpm震荡36小时；其余参考实施例1的方法进行，得到髓核修饰的猪SIS多重脱细胞可注射材料。
实施例7髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的制备和研究
取猪SIS组织，步骤(7)在300ml含DNA酶的PBS缓冲液中(DNA酶浓度为0.5mg/ml)，加入60ml青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床120rpm震荡1小时；步骤(9)在SIS小块与1ml生理盐水共同置于组织匀浆管并加入研磨球后，以7,000rpm转速将SIS材料震荡球磨共10周期，每周期30秒，研磨SIS材料为微小颗粒；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞软骨联合骨材料。
实施例8髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的制备和研究
取猪SIS组织，步骤(5)在1000ml含Triton X的PBS缓冲液(浓度10％的Triton X-100)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡36小时；步骤(9)在SIS小块与1ml生理盐水共同置于组织匀浆管并加入研磨球后，以8,000rpm转速将SIS材料震荡球磨共20周期，每周期30秒，研磨SIS材料为微小颗粒；其余参考实施例1的方法进行，得到髓核修饰的猪SIS多重脱细胞可注射材料。
实施例9髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的制备和研究
取猪SIS组织，步骤(3)在1000ml含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液(浓度为5％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml)中，恒温45℃摇床120rpm震荡8小时；步骤(11)将传代的髓核细胞以5×104细胞/mL的密度，与1000微球/mL的SIS微粒共同置于立体培养环境中(总体积50ml)，培养基为含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，共培养4周；其余参考实施例1的方法进行，得到髓核修饰的猪SIS多重脱细胞可注射材料。
实施例10髓核修饰的猪SIS多重脱细胞材料的制备和研究
取猪SIS组织，步骤(4)在1000ml有机溶剂溶液(浓度10％的丙醇溶液)中，恒温45℃摇床120rpm震荡脱脂12小时；步骤(12)在1000ml含SDS的PBS缓冲液(SDS浓度为10％，混合20mmol的Tris)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡1小时；其余参考实施例1的方法进行，得到髓核修饰的猪SIS多重脱细胞可注射材料。
对实施例2-10所得髓核修饰的猪SIS多重脱细胞可注射材料分别进行组织学评价、抗原成分定量检测和椎间盘退变的修复能力检测，结果与实施例1相似，这表明髓核修饰的猪SIS多重脱细胞可注射材料可通过上述多种方法制得，并且对其进行组织学评价、抗原成分定量检测和修复椎间盘退变能力检测均说明材料已经完全去除细胞成分，无明显抗原成分残留；将其运用于兔子一类的大动物椎间盘退变的模型修复中可以达到很好的抑制椎间盘退变进展效果。髓核修饰的猪SIS多重脱细胞可注射材料可以作为临床上需防止椎间盘退变加重及逆转疾病进程病人的安全可靠、有效、快速的替代材料。

Claims (1)

1.髓核细胞修饰猪小肠黏膜下层多重脱细胞材料的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
步骤(1)取猪空肠上段组织用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除黏膜层和肌层，并再次用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次；
步骤(2)置于液氮中完全冷却，再置于37℃水浴中半小时恢复温度，重复上述流程5次；
步骤(3)在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温45℃摇床120rpm震荡8-24小时；
步骤(4)在有机溶剂溶液中，恒温45℃摇床120rpm震荡脱脂2-12小时；
步骤(5)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡1-36小时；
步骤(6)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡0.5-24小时；
步骤(7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床120rpm震荡1-36小时；
步骤(8)在无菌生理盐水中，37℃摇床120rpm震荡72小时，即得天然组织来源的猪SIS材料；
步骤(9)将SIS材料切割成小块，浸泡于无菌生理盐水中，使用组织匀浆机以6,000rpm转速将SIS材料震荡球磨共5-20周期，每周期30秒，研磨SIS材料为微小颗粒；
步骤(10)先后将SIS悬浊液通过60目及80目细胞筛，滤除过大或过小微粒；
步骤(11)将传代的髓核细胞及SIS颗粒共同置于立体培养基内进行共培养2-4周，即得髓核细胞修饰的SIS微粒材料；
步骤(12)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床120rpm震荡1-36小时；
步骤(13)在无菌生理盐水中，37℃摇床120rpm震荡72小时，即得髓核修饰的天然组织来源的猪SIS多重脱细胞材料；
混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的体积比例为1:1；步骤(5)-(7)及(12)中PBS缓冲液和混合抗菌液体积比分别为10:1、10:1、5:1、10:1；
步骤(3)-(7)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时；步骤(11)、(12)完成后用生理盐水浸泡5小时；
所述的含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液浓度为1％-5％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；
所述的有机溶剂溶液为等体积比的氯仿和甲醇溶液、浓度10％-100％的丙酮溶液或浓度30％-70％的乙醇溶液；
所述的含Triton X的PBS缓冲液为浓度1％-10％的Triton X-200或Triton X-100的PBS缓冲液；
所述的含SDS的PBS缓冲液为浓度0.5％-10％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1-20mmol/L的Tris；
所述的含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶浓度为0.01-0.5mg/ml；
共培养指将髓核细胞与1000微球/mL的SIS微粒在立体培养环境下共同培养，培养基为含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液。
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