CN105031734A - 髓核-软骨细胞外基质支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种髓核-软骨细胞外基质支架及其制备方法,属于生物组织工程技术。本发明分别将椎间盘髓核和骨关节面软骨经过粉碎、脱细胞、梯度离心收集细胞外基质微丝悬液、冷冻冻干、获得冻干的脱细胞髓核基质和脱细胞软骨基质，按一定比例取两种基质溶于超纯水配成一定浓度的混合基质悬液，再冷冻冻干后依次经紫外线照射交联和化学试剂交联而制成。这样设计的本发明克服了椎间盘髓核量少不易获取的缺点；制备工艺简单，脱细胞彻底；可降解，生物相容性好；呈三维结构，力学性能和可塑性好，易于种子细胞的分布、生长、分化；冻干的细胞外基质方便储存和配制，可用于构建组织工程椎间盘修复椎间盘部分缺损，具有良好的临床应用前景。

Description

髓核-软骨细胞外基质支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物组织工程技术，具体是一种髓核-软骨细胞外基质支架及其制备方法。

背景技术

随着人口老龄化和人们工作、生活方式的改变，椎间盘退行性疾病越来越多，尤其是椎间盘突出等导致的颈肩痛、腰腿痛十分常见，病情严重者常需手术治疗，椎间盘部分切除是脊柱外科最常采用的手术方法，然而椎间盘切除后一直没有理想的修复重建方法。随着组织工程技术的飞速发展，椎间盘组织工程为手术后椎间盘缺损的永久性修复带来了可能。

近年来，用于构建组织工程椎间盘的支架材料研究较多。如取向性PCL支架，虽然结构规则、孔隙均匀，但成分与天然椎间盘相差很大，生物相容性差；聚已酸内酯苹果酸三醇/脱钙骨基质明胶双相纤维环支架，双相支架的内外层结合不牢、容易脱落，且生物相容性差；丝素蛋白支架虽然生物相容性较好，但成分差别很大且降解速率过慢。所以，目前国内外无论是天然仿生材料还是人工合成材料都难以达到理想的效果。

脱细胞基质去除了细胞和可溶性蛋白等引起免疫反应的物质，保留了组织的天然成分，具有良好的生物相容性，能够为组织细胞生存提供相近的生存环境，脱细胞基质作为一种理想的支架载体，已得到广泛的应用研究，其中猪脱细胞心瓣膜、猪脱细胞膀胱、异体脱细胞真皮基质已被批准应用于临床。

完整脱细胞髓核基质支架也有相关报道，但髓核呈胶冻状易散开，不易获得完整的脱细胞髓核支架，而且该脱细胞髓核支架力学性能和可塑性差，种子细胞不易均匀分布到支架内，不能满足椎间盘部分缺损的修复要求。来源于结缔组织细胞外基质的明胶海绵已经上市并应用于临床椎间盘退变修复的研究，但明胶海绵力学性能不足，成分和椎间盘细胞外基质相比也有较大差别。软骨组织与髓核组织的细胞外基质的主要成分都是Ⅱ型胶原和蛋白多糖，两者的细胞在形态和功能上也十分接近，均分泌Ⅱ型胶原和蛋白多糖，有学者（伍耀宏,徐宝山,杨强,等.以骨基质明胶及软骨基质构建一体化纤维环-髓核双相支架的实验研究[J].中华骨科杂志,2013,33(2):179-185.）以脱细胞软骨基质为髓核相制备了一体化纤维环-髓核双相支架。另有学者在一项“纤维环与髓核一体化双向支架及其构建方法”的专利（申请号：201310000722.2）中，将脱细胞髓核基质作为髓核相制备新型一体化纤维环-髓核双相支架，但该脱细胞髓核基质制备方法存在脱细胞不易彻底，脱细胞周期长易变质，获得的髓核细胞外基质悬液不易储存、浓度不易调节的不足。而且一体化纤维环-髓核双相支架适用于全椎间盘置换修复，而临床上多椎间盘部分缺损。目前尚没有将脱细胞髓核基质和脱细胞软骨基质相混合制备支架的报道。

发明内容

本发明就是为了解决现有支架所存在的上述问题，而提供一种髓核-软骨细胞外基质支架及其制备方法。

一种髓核-软骨细胞外基质支架，所述支架是由冻干的脱细胞髓核基质与冻干的软骨细胞外基质按照1:10~10:1的比例混合溶解，冻干后通过物理、或化学或物理与化学联合的方式交联而成的三维多孔海绵状结构。

一种髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，包括以下步骤：

①脱细胞髓核基质的制备

a.将椎间盘髓核组织在0~4℃下浸泡于含有蛋白酶抑制物的Tris-HCl缓冲液中振荡8h~48h；

b.粉碎，采用密度梯度离心法获取直径为100nm-5μm的髓核基质微丝；

c.放入含0.5~2%TritonX-100和0.35~1.0%脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液，0~4℃下振荡12～72h；

d.无菌超纯水清洗，用含有DNaseⅠ和RNaseA的无菌PBS缓冲液振荡消化8～48h；

e.无菌超纯水清洗，获得脱细胞髓核基质微丝悬液，冻干，冷藏备用；

②脱细胞软骨基质的制备

a.取骨关节面软骨，浸泡于含蛋白酶抑制物的无菌PBS缓冲液中;

b.粉碎，密度梯度离心获取直径为100nm-5μm左右的软骨基质微丝；

c.将软骨基质微丝放入含蛋白酶抑制物和0.5~2%TritonX-100的Tris-HCl缓冲液中，0~4℃下振荡12～72h；

d.无菌超纯水清洗，用含DNaseⅠ和RNaseA的PBS缓冲液震荡消化8～48h；

e.无菌超纯水清洗，获得脱细胞软骨基质微丝悬液，冻干，冷藏备用；

③支架的构架和交联

a．按质量比为冻干的脱细胞髓核基质：脱细胞软骨基质=1:10~10:1的比例称取以上两种物质并溶于去离子水中，配成质量体积比为0.6%~6%的乳悬液；

b．将上述乳悬液注入模具中，排出模具中的气体；

c．放入-20~-80℃冷冻1~48h；再放入冷冻干燥机中，待其完全冻干；

d．将完全冻干的样品在碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中交联1h～48h；或将完全冻干的样品在京尼平溶液中交联1h~48h；或将完全冻干的样品在醛类化合物溶液中交联1h～48h；或将完全冻干的样品置于紫外线下交联；或将冻干的样品先经紫外线照射后采用化学试剂联合交联；

e．获得的样品进行清洗，烘干，灭菌。

所述步骤①a、c、d和步骤②c、d中振荡频率为80~250r/min。

所述步骤①a中Tris-HCl的浓度为50mmol/L，pH7.5；步骤①a和②a、c中蛋白酶抑制物为苯甲基磺酰氟，浓度为0.020~0.050mmol/L。

步骤①d和②d中DNaseⅠ和RNaseA的浓度分别为0.72~50U/ml、0.72~1U/ml。

步骤③d中碳化二亚胺的浓度为0.001～1m/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.001～1m/L。

步骤③d中京尼平溶液的浓度为1%~2%。

步骤③d中醛类化合物溶液的浓度为0.01%～2.5%。

步骤③d中紫外线波长为258nm，距离光源5～10cm，交联时间15min～8h。

本发明获得了如下的有益效果：

①本发明所采用的髓核、软骨材料属于天然生物材料，具有良好的生物相容性和可降解性，软骨材料的加入与使用克服了椎间盘髓核量少不易获取的缺点，利于大批量生产。

②通过脱细胞系列处理去除抗原成分，避免发生免疫排斥反应、传播疾病。

③本发明将新鲜髓核或软骨粉碎、离心、冷冻冻干便于脱细胞和储存（4℃冷藏可达一年），可称重配制悬液，易于准确的调节细胞外基质微丝悬液的比例和浓度。

④通过调节混合细胞外基质微丝悬液中两者的比例、浓度及冷冻时的温度、降温速率等因素，控制多孔支架的成分和微结构，制备出具有适宜成分、孔径和孔隙率的三维多孔支架，操作简便。

⑤通过控制交联时间或交联剂浓度，调节多孔支架的生物力学特性和降解速率，使组成结构及力学性能与椎间盘细胞外基质相似。

⑥本发明所述支架呈三维多孔海绵状结构，力学性能好，主要成分和人椎间盘细胞外基质相似，可为种子细胞提供一个适宜的生长环境，有利于种子细胞向椎间盘细胞方向分化。

⑦本发明所述支架制备工艺简单、制备周期短、弹性好、可塑性好、可个体化制成与椎间盘缺损大小相符合的支架，符合临床椎间盘部分缺损的修复要求，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1是本发明髓核-软骨细胞外基质支架的外观图；

图2是本发明HE染色无细胞及无细胞碎片残留图；

图3是本发明未脱细胞髓核匀浆Hochest33258染色图；

图4是本发明正常软骨基质Hochest33258染色图；

图5是本发明髓核-软骨细胞外基质支架的Hochest33258染色图；

图6是本发明髓核-软骨细胞外基质支架的番红O染色图；

图7是本发明髓核-软骨细胞外基质支架的甲苯胺蓝染色图；

图8是本发明髓核-软骨细胞外基质支架光镜下多孔网状结构图；

图9是本发明髓核-软骨细胞外基质支架扫描电镜下多孔网状结构图；

图10是MTT检测支架浸提液培养下骨髓间充质干细胞的增殖图；

图11是Live/Dead染色活骨髓间充质干细胞在支架上的分布图；

图12是Live/Dead染色死骨髓间充质干细胞在支架上的分布图。

具体实施方式

现结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。

1、脱细胞髓核基质的制备

将新鲜的羊椎间盘髓核组织用生理盐水冲洗干净，浸泡于50mmol/L的Tris-HCl缓冲液（缓冲液pH7.5，内含有0.035mmol/L蛋白酶抑制物——苯甲基磺酰氟PMSF），4℃下摇床（北京市六一仪器厂，WD-9405B型水平摇床）振荡8h；经粉碎机（山东九阳股份有限公司，粉碎研磨机）粉碎，采用密度梯度离心法获取直径为100nm-5μm左右的髓核基质微丝；放入含0.6%TritonX-100和1.0%脱氧胆酸钠的无菌Tris-HCl缓冲液（pH7.5），4℃下摇床持续振荡12h，去除细胞成分；无菌超纯水彻底清洗后，放入含有50U/mlDNaseⅠ和1U/mlRNaseA的无菌PBS缓冲液中，于恒温振荡器（江苏省太仓市实验设备厂，DSHZ-300多用途油浴恒温振荡器）37℃下振荡消化12h；再次无菌超纯水彻底清洗后，获得脱细胞髓核基质微丝悬液，冷冻冻干，4℃冷藏备用。

2、脱细胞软骨基质的制备

将新鲜的羊股骨头关节面软骨用手术刀剃下，生理盐水冲洗干净，将关节软骨浸泡于含0.035mmol/L蛋白酶抑制物PMSF的无菌PBS缓冲液（pH7.5）中，经组织粉碎机（山东九阳股份有限公司，粉碎研磨机）粉碎、梯度离心获取直径为100nm-5μm左右的软骨基质微丝；软骨基质微丝放入含0.035mmol/LPMSF和1%TritonX-100的无菌Tris-HCl缓冲液（pH7.5），4℃下摇床持续振荡12h，脱去细胞成分；无菌超纯水彻底清洗干净后放入含有50U/mlDNaseⅠ和1U/mlRNaseA的无菌PBS缓冲液中，于恒温振荡器（江苏省太仓市实验设备厂，DSHZ-300多用途油浴恒温振荡器）37℃下振荡消化12h；再次无菌超纯水彻底清洗后，获得脱细胞软骨基质微丝悬液，冷冻冻干，4℃冷藏备用。

3、支架的构建和交联

按髓核和软骨3:1的比例称取一定重量的冻干脱细胞髓核基质和冻干脱细胞软骨基质溶于去离子水中，4℃下磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂，85-1型磁力搅拌器）搅拌（800r/min）12h，配成质量体积比为4%的混合乳状悬液；将该混合基质悬液注入模具（直径12mm,深12mm），真空机（巩义市英峪仪器厂，SHZ-DⅢ循环水式真空泵）排出气体；立即放入-80℃冰箱冷冻8h后把样品放入冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司，冷冻干燥机），冷冻干燥24h以上；待其完全冻干，将其取出置于波长258nm紫外线下照射，照射距离为10cm，首次照射1h，翻转后继续照射1h；然后将样品浸入含50mmol/L碳化二亚胺（EDAC）和20mmol/LN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的酒精溶液中，常温下交联24h；交联后的支架经酒精、超纯水彻底清洗后置于烘箱（河南省豫华仪器有限公司，DHG101-3A电热恒温鼓风干燥箱）干燥，容器密封，钴60照射灭菌既得三维多孔海绵状支架（见图1），4℃冰箱保存备用。

4、支架的组织学及电镜观察

组织学染色、电镜扫面结果表明，本发明髓核-软骨脱细胞基质支架，脱细胞彻底，保留了两者细胞外基质的生化成分，形成了孔隙相互连通、孔径较均一的三维网状结构。HE染色显示支架中无细胞及细胞碎屑残留（见图2）；Hochest33258染色可见未脱细胞髓核匀浆中的细胞呈点状荧光（见图3），正常软骨基质内细胞也呈点状荧光（见图4）而经脱细胞后制成的支架呈阴性（见图5）；番红O染色可见髓核-软骨脱细胞基质微丝相互连接，形成网状结构，无细胞成分，支架呈红染（见图6）；甲苯胺蓝染色呈阳性，网状结构均呈蓝色（见图7）；电镜扫描和光镜下可见支架呈网状结构，孔隙相互连通、孔径较均一（见图8、9）。

5、支架的生物相容性

通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测支架浸提液对细胞的毒性：将间充质干细胞(BMSCs)分别用25％、50％、100％浓度的浸提液以及含10％胎牛血清（FBS）的培养基(DMEM)培养，于第1、2、3、4、5、6天通过MTT检测BMSCs的生长情况。每个时间点四组之间均无统计学差异（P<0.05），表明支架无毒性，图10为MTT检测不同浓度浸提液培养下BMSCs的增殖图。

Live/Dead检测细胞在支架上的生长情况：将BMSCs接种到消毒后的支架上，培养3天后加入Live/Dead染液，荧光显微镜（德国Leica公司，DMI4000荧光显微镜）下观察细胞在支架上黏附与生长情况。可见细胞均匀的分布在支架上，生长状况良好（见图11），无死细胞（见图12）。

6、支架的孔隙率、吸水率和生物力学测定

比例为3:1质量体积比为4%的髓核-软骨脱细胞基质支架孔隙率为95.43%±2.26%，吸水率为1829.14%±273.97%。通过微材料力学性能测试机（天津理工大学机械工程学院实验室，MTF-100微机控制电子式微型拉力机）测定该支架弹性模量为18.43±2.33Kpa。该支架三维多孔海绵状、弹性好、力学性能好能满足椎间盘部分缺损的修复要求。

Claims (9)

1.一种髓核-软骨细胞外基质支架，其特征在于：所述支架是由冻干的脱细胞髓核基质与冻干的软骨细胞外基质按照1:10~10:1的比例混合溶解，冻干后通过物理、或化学或物理与化学联合的方式交联而成的三维多孔海绵状结构。

2.一种权利要求1所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

①脱细胞髓核基质的制备

a.将椎间盘髓核组织在0~4℃下浸泡于含有蛋白酶抑制物的Tris-HCl缓冲液中振荡8~48h；

b.粉碎，采用密度梯度离心法获取直径为100nm-5μm的髓核基质微丝；

c.将髓核基质微丝放入含0.5~2%TritonX-100和0.35~1.0%脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液，0~4℃下振荡12～72h；

d.无菌超纯水清洗，用含有DNaseⅠ和RNaseA的无菌PBS缓冲液37℃下振荡消化8～48h；

e.无菌超纯水清洗，获得脱细胞髓核基质微丝悬液，冻干，冷藏备用；

②脱细胞软骨基质的制备

a.取骨关节面软骨，浸泡于含蛋白酶抑制物的无菌PBS缓冲液中振荡8h~48h;

b.粉碎，密度梯度离心获取直径为100nm-5μm左右的软骨基质微丝；

c.将软骨基质微丝放入含蛋白酶抑制物和0.5~2%TritonX-100的Tris-HCl缓冲液中，0~4℃下振荡12～72h；

d.无菌超纯水清洗，用含DNaseⅠ和RNaseA的无菌PBS缓冲液37℃振荡消化8～48h；

e.无菌超纯水清洗，获得脱细胞软骨基质微丝悬液，冻干，冷藏备用；

③支架的构架和交联

a．按质量比为冻干的脱细胞髓核基质：脱细胞软骨基质=1:10~10:1的比例称取以上两种物质并溶于去离子水中，配成质量体积比为0.6%~6%的乳悬液；

b．将上述乳悬液注入模具中，排出模具中的气体；

c．放入-20~-80℃冷冻1~48h；再放入冷冻干燥机中，待其完全冻干；

d.将冻干的样品在碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中交联1h～48h；或将冻干的样品在京尼平溶液中交联1h~48h；或将冻干的样品在醛类化合物溶液中交联1h～48h；或将冻干的样品置于紫外线下交联；或将冻干的样品先经紫外线照射后采用化学试剂联合交联；

e．获得的样品进行清洗，烘干，灭菌。

3.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：所述步骤①a、c、d和步骤②c、d中振荡频率为80~250r/min。

4.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：所述步骤①a中Tris-HCl的浓度为50mmol/L，pH7.5；步骤①a和②a、c中蛋白酶抑制物为苯甲基磺酰氟，浓度为0.020~0.050mmol/L。

5.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：步骤①d和②d中DNaseⅠ和RNaseA的浓度分别为0.72~50U/ml、0.72~1U/ml。

6.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：步骤③d中碳化二亚胺的浓度为0.001～1m/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.001～1m/L。

7.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：步骤③d中京尼平溶液的浓度为1%~2%。

8.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：步骤③d中醛类化合物溶液的浓度为0.01%～2.5%。

9.根据权利要求2所述的髓核-软骨细胞外基质支架的制备方法，其特征在于：步骤③d中紫外线波长为258nm，距离光源5～10cm，交联时间15min～8h。