CN104940996A - 基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架的制备方法及其在骨软骨缺损修复中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架的制备方法及其在骨软骨缺损修复中的应用，该方法包括采用放射状胶原支架装置制作放射状胶原支架，胶原水溶液的制备和结合SDF-1的放射状胶原支架的制备，本发明提供一种能够促进自体细胞迁移的含SDF-1的放射状胶原支架在骨软骨缺损修复中的应用，其通过两个方面促进了干细胞的迁移，现有的材料多数结构紊乱，而骨软骨缺损是需要能够促进间充质干细胞迁移的材料；本发明明确了含SDF-1的放射状胶原支架制作方法，并实现了体内的功能检验，为含SDF-1的放射状胶原支架的临床应用供了基础。
Description
技术领域
本发明设计骨软骨缺损的修复，特别涉及一种基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架在骨软骨缺损修复中的应用。
背景技术
骨软骨缺损是发生在骨性关节炎（Osteoarthritis ,OA）晚期的一个重要病理变化，骨性关节炎是最常见的骨科疾病并导致巨大医疗消耗, 因此世界卫生组织启动第二个“骨关节十年”计划对抗OA，由于关节软骨缺乏自我修复能力，所以关节软骨缺损修复是临床治疗骨关节炎的最大挑战。到目前为止，临床上对于骨软骨缺损的治疗以自体软骨细胞移植为首选，尽管其疗效确切，但它的手术适应症有限，80％的病人最终选择了关节置换手术，但其手术风险大和术后易出现并发症和合并症，且长期疗效不佳的特点。因此，寻找治疗骨软骨缺损的有效治疗方法是当务之急。
虽然通过细胞移植来治疗骨关节炎已经被广泛研究，通过自体细胞归巢而不经过细胞的移植，作为一种有前景的方法目前仍然缺乏研究。一般认为骨软骨缺损可以通过缺损底部的骨髓间充质干细胞（BMSC）来修复，然而最近的研究也表明部分修复的软骨来自缺损周边软骨细胞的浸润。因此设计一种能够促进自体细胞迁移的材料非常重要。由于材料的三维结构和孔隙率等性质都可以影响细胞在其内部的生长，目前大多数的材料结构都是无序的并不利于细胞的迁移，因此设计一种放射状的材料具有重要的意义。基质细胞衍生因子-1（SDF-1）在很多器官中表达，研究表明它能够促进干细胞的归巢和迁移。因此我们探讨了通过放射状胶原支架结合SDF-1对促进细胞迁移和软骨再生的作用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提出了一种基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架的制备方法及其在骨软骨缺损修复中的应用。
本发明提供一种基质细胞衍生因子的新用途，即基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架在骨软骨缺损修复中的应用，本发明以放射状胶原支架结合SDF-1为个例，对材料的物理表征以及材料在体外对骨髓间充质干细胞的迁移进行了研究，明确了放射状胶原支架结合SDF-1对兔子股骨骨软骨缺损的修复作用。现有的生物材料用于骨软骨缺损时无法促进间充质干细胞的迁移，往往无法达到较好的修复效果，本发明在使用了放射状胶原支架的基础上，还结合了能够促进干细胞迁移的SDF-1来修复骨软骨缺损。
本发明采用的技术方案是：
步骤一：采用放射状胶原支架装置制作放射状胶原支架
将内径为5.0mm，高为20.0mm的圆柱形模具，在-20℃下冷冻作为冷冻源，在模具的中央设有一直径为1.5mm的塑料圆柱，模具的顶部和底用均为塑料；将胶原水溶液加入模具中，在-20℃的温度下冷冻，胶原水溶液从模具外向内逐渐结晶成放射状；当整个模具内的胶原水溶液全部结晶完毕时，将模具在-80℃放置至胶原结晶温度降至-80℃，将模具真空干燥48~120 小时，获得放射状胶原支架；
步骤二：所述胶原水溶液的制备
剥取新鲜猪腿的肌腱，去除筋膜和脂肪制成预处理后的肌腱，然后剪成薄片，浸泡于三羟甲基氨基甲烷与乙二胺四乙酸和氯化钠的混合溶液a 中，4℃过夜，取浸泡后的肌腱薄片用蒸馏水冲洗后溶于0.5mol/L 乙酸水溶液中，调节pH 值为1 后加入胃蛋白酶，4℃放置3 天，离心，弃去上层脂肪层，取下层胶原混合物a 用0.5mol/L 乙酸水溶液稀释3 倍体积，纱布过滤，取滤液用等体积的0.9mol/L 氯化钠水溶液配制成混合溶液b，4℃过夜，离心，取下层胶原混合物b 加入1/4 体积的0.5mol/L 乙酸水溶液在4℃溶解过夜后用双蒸水透析，取截留液在-80℃冷冻干燥后用双蒸水配制成10mg/mL 的胶原水溶液，4℃保存；所述混合溶液a 中三羟甲基氨基甲烷终浓度为0.05mol/L，乙二胺四乙酸终浓度为0.02mol/L，氯化钠终浓度为0.5mol/L；所述胃蛋白酶的用量为100mg 酶/1g 预处理后的肌腱，胃蛋白酶的酶活是3000-3500NFU/mg
步骤三：结合SDF-1的放射状胶原支架的制备
以1：2.5的比例将100ng/ml的SDF-1溶于浓度为40mg/ml的纤维凝胶缓冲A液中，再与40mg/ml的纤维凝胶B液1：1混合，获得混合液；将混合液注射入放射状胶原支架中心的孔中，混合液在一分钟以内成胶，获得含有SDF-1的放射状胶原支架。
基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架在骨软骨缺损修复中的应用。
本发明有益效果主要体现在：本发明提供一种能够促进自体细胞迁移的含SDF-1的放射状胶原支架在骨软骨缺损修复中的应用，其通过两个方面促进了干细胞的迁移，现有的材料多数结构紊乱，而骨软骨缺损是需要能够促进间充质干细胞迁移的材料；本发明明确了含SDF-1的放射状胶原支架制作方法，并实现了体内的功能检验，为含SDF-1的放射状胶原支架的临床应用供了基础。
附图说明
图 1 为制备放射状胶原支架示意图；
图 2A为制备的放射状胶原支架垂直面扫描图；
图 2B为制备的放射状胶原支架水平面电镜扫描图；
图 3A为制备的传统胶原支架垂直面扫描图；
图 3B为制备的传统胶原支架水平面电镜扫描图；
图 4 为体外骨髓间充质干细胞迁移模型；
图 5A为传统胶原支架；
图 5B放射状胶原支架；
图 5C为结合SDF-1的放射状胶原支架苏木精伊红染色图；
图 6A为传统胶原支架荧光DAPI染色图；
图 6B放射状胶原支架荧光DAPI染色图；
图 6C结合SDF-1的放射状胶原支架荧光DAPI染色图；
图 7a为实施例2中传统胶原支架组大体动物标本照片；
图 7b 为放射状胶原支架组大体动物标本照片；
图 7c为结合SDF-1和放射状胶原支架组大体动物标本照片；
图 8 为实施例2中大体动物标本照片，a为传统胶原支架组，b为放射状胶原支架组，c为结合SDF-1和放射状胶原支架组的ICRS 评分；
图 9a 为实施例2中传统胶原支架组缺损部位切片的SO染色图；
图 9b 为实施例2中放射状胶原支架组缺损部位切片的SO染色图；
图 9c 为实施例2中结合SDF-1和放射状胶原支架组缺损部位切片的SO染色图；
图 10 a 为传统胶原支架组软骨组织切片I型胶原免疫组化染色图；
图 10 b 为放射状胶原支架组软骨组织切片I型胶原免疫组化染色图；
图 10 c 为结合SDF-1和放射状胶原支架组软骨组织切片I型胶原免疫组化染色图
图 11 a 为传统胶原支架组软骨组织切片MMP13免疫组化染色图；
图 11 b 为放射状胶原支架组软骨组织切片MMP13免疫组化染色图；
图 11 c 为结合SDF-1和放射状胶原支架组软骨组织切片MMP13免疫组化染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所用实验材料：
实验动物：雌性新西兰大白兔(2.5kg)SPF 由浙江大学动物实验中心提供。
实验药品：
纤维凝胶 杭州普济公司
其他试剂：美国Sigma公司
实验仪器设备：
搅拌机 金坛市国旺实验仪器厂
石蜡切片机 德国MICROW 公司
显微镜摄影机 日本OLYMPUS 公司
BMJ- Ⅲ包埋机及冷冻台 中国常州中威电子仪器有限公司
扫描电镜 日立
实施例1 支架制备及检测：
（1）制备放射状胶原支架：采用放射状胶原支架装置制作放射状胶原支架，所述放射状胶原支架装置为一内径为5.0mm，高20.0mm的模具，该模具为圆柱形，并在-20℃下冷冻作为冷冻源。在模具的中央有一直径为1.5mm的塑料圆柱，模具的顶部和底用均为塑料。将胶原水溶液加入模具中，继续在-20℃下冷冻，胶原水溶液从模具外向内逐渐结晶。当整个模具内的胶原水溶液全部结晶完毕时，将放射状胶原支架装置在-80℃放置至放射状胶原支架温度降至-80℃，将放射状胶原支架装置真空干燥48小时，获得胶原支架。制备支架过程的示意图见图1。倍数扫描电镜图显示，有序胶原支架结构稳定、规则，在水平方向呈放射状，在垂直方向上平行排列，见图2A和图2B。
（2）制备传统胶原支架：传统胶原支架制备装置同上，在胶原水溶液结晶时置于液氮下快速结晶，后经冻干即可获得，倍数扫描电镜图见图3A和图3B所示，胶原支架结构杂乱无序。
（3）制备结合SDF-1的放射状胶原支架：以1：2.5的比例将SDF-1（100ng/ml）溶于纤维凝胶缓冲A液中（40mg/ml），再与纤维凝胶B液1：1混合。将混合液注射入放射状胶原支架中心的孔中，混合液在一分钟以内成胶，获得含有SDF-1的放射状胶原支架（图5A、图5B、图5C）。
（4）体外骨髓间充质干细胞迁移模型检测：骨髓间充质干细胞以2*105/孔的数量种植在非黏附24孔板上，加入传统胶原支架，放射状胶原支架，结合SDF-1的放射状胶原支架培养，示意图见图4。24小时后，用PBS冲洗支架5次然后进行组织学染色。从DAPI来看，放射状胶原支架上细胞数量多于传统支架，SDF-1的加入进一步增强了这种效果（图6A、图6B、图6C）。
实施例2
基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架的制备方法及其在骨软骨缺损修复中的应用
1、动物模型建立和支架植入
①麻醉：按40mg/kg 计算，用1％戊巴比妥钠腹腔麻醉。
②在无菌环境下行兔子膝关节皮肤准备：用2％碘伏消毒，沿髌韧带内侧缘切开约1cm 大小的切口，逐层切开暴露膝关节，用带刻度的手摇转在股骨滑车钻取4mm 直径和5mm 深度的骨软骨缺损，完成造模。
2、动物实验分组：
18 只新西兰大白兔全部进行造模，制造缺损后随机分为3 组：传统胶原支架组，放射状胶原支架组和含SDF-1放射状胶原支架组，各6 只。
3、标本采取：
将步骤1 中造模兔子分成三组，即传统胶原支架组，放射状胶原支架组和含SDF-1放射状胶原支架组，将三种胶原支架( 实施例1 制备) 植入潮线以下位置，即支架的上表面与潮线在一条直线上，立即消毒，缝合。
实验后12 周处死所有兔子，取兔子膝关节股骨，置于10％福尔马林中浸泡固定48h 后，进行大体观察、ICRS 评分，接着经质量浓度4％乙二胺四乙酸(EDTA) 水溶液脱钙8 周，经脱水，石蜡包埋切片，按常规番红- 阿辛蓝(SO) 染色，进行病理组织学分析。
4、指标测定方法：
(1) 国际软骨修复协会软骨损伤分级系统(ICRS) ：缺损修复程度：完全修复为4分，75％修复为3 分，50％修复为2 分，25％修复为1 分，0％修复为0 分；与周围正常软骨的结合程度：与正常软骨组织完全融合为4 分，与边界的距离小于1mm 为3 分，3/4 与周围组织相连但1/4 的组织大于1mm 厚度为2 分，1/2 组织与周围组织相连但1/2 的组织大于1mm厚度为1 分，未和周围组织相连为0 分；大体观察：完整的表面组织为4 分，纤维化的表面为3 分，小的且分散的组织委2 分，大的缺损为1 分，无任何组织为0 分。整体评分：一级为12分；二级为11-8 分；三级为7-4 分；四级为3-1 分。
(2) 组织学检测：组织切片经过脱蜡，水化后用0.02％ Fastgreen 染8min，然后自来水洗去多余的染料，1％醋酸中分色，水洗，0.1％ Safrain-O 染2min，脱色，透明，封片用于观察。同时行I型胶原和MMP13免疫组化检测。
5、统计学方法
统计学处理：计量数据均用x±s 表示，采用SPSS13.0 统计分析软件进行处理。多组间比较及两两之间比较采用方差分析。P<0.01 认为两两组之间有显著统计学差异，P<0.05 认为两两组之间有统计学差异。
6、实验结果
6.1 缺损部位的大体观察，ICRS 评分及SO染色
从大体上看，放射状胶原支架结合SDF-1的软骨修复表面更加平滑（图7a、图7b、图7c），进行国际软骨修复协会ICRS评分后，12周后，有序支架修复效果显著高于无序，同时SDF-1对修复有一定的促进作用（图8A、图8B、图8C）。从组织学切片上可以发现，传统胶原支架组表面粗糙，新生的组织主要是纤维组织，而放射状胶原支架组和含SDF-1的放射支架修复之后，新生的组织为一层厚的透明软骨组织（图9a、图9b、图9c）。因此可以认为放射状胶原支架对软骨的再生过程具有促进作用，同时SDF-1对这个过程有一定的促进作用。
6.2 放射状胶原支架结合SDF-1减少体内软骨骨化及软骨降解
除了软骨修复，我们还对骨化程度和软骨降解进行了评估，Col1（软骨骨化标志物）在传统支架组中表达远高于放射状支架组、含SDF-1的放射状支架组，同时SDF-1的添加一定程度上也减少了Col1的表达（图10a、图10b、图10c），这表明含SDF-1的放射状支架可以有效的抑制损伤部位的骨化。同样的，MMP13（软骨降解标志物）在传统支架组中表达远高于放射状支架组、含SDF-1的放射状支架组，同时SDF-1的添加一定程度上也减少了MMP13的表达（图11a、图11b、图11c）。这表明含SDF-1的放射状支架可以有效的抑制损伤部位的软骨的降解。
Claims (2)
1. 基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
步骤一：采用放射状胶原支架装置制作放射状胶原支架
将内径为5.0mm，高为20.0mm的圆柱形模具，在-20℃下冷冻作为冷冻源，在模具的中央设有一直径为1.5mm的塑料圆柱，模具的顶部和底用均为塑料；将胶原水溶液加入模具中，在-20℃的温度下冷冻，胶原水溶液从模具外向内逐渐结晶成放射状；当整个模具内的胶原水溶液全部结晶完毕时，将模具在-80℃放置至胶原结晶温度降至-80℃，将模具真空干燥48~120 小时，获得放射状胶原支架；
步骤二：所述胶原水溶液的制备
剥取新鲜猪腿的肌腱，去除筋膜和脂肪制成预处理后的肌腱，然后剪成薄片，浸泡于三羟甲基氨基甲烷与乙二胺四乙酸和氯化钠的混合溶液a 中，4℃过夜，取浸泡后的肌腱薄片用蒸馏水冲洗后溶于0.5mol/L 乙酸水溶液中，调节pH 值为1 后加入胃蛋白酶，4℃放置3 天，离心，弃去上层脂肪层，取下层胶原混合物a 用0.5mol/L 乙酸水溶液稀释3 倍体积，纱布过滤，取滤液用等体积的0.9mol/L 氯化钠水溶液配制成混合溶液b，4℃过夜，离心，取下层胶原混合物b 加入1/4 体积的0.5mol/L 乙酸水溶液在4℃溶解过夜后用双蒸水透析，取截留液在-80℃冷冻干燥后用双蒸水配制成10mg/mL 的胶原水溶液，4℃保存；所述混合溶液a 中三羟甲基氨基甲烷终浓度为0.05mol/L，乙二胺四乙酸终浓度为0.02mol/L，氯化钠终浓度为0.5mol/L；所述胃蛋白酶的用量为100mg 酶/1g 预处理后的肌腱，胃蛋白酶的酶活是3000-3500NFU/mg
步骤三：结合SDF-1的放射状胶原支架的制备
以1：2.5的比例将100ng/ml的SDF-1溶于浓度为40mg/ml的纤维凝胶缓冲A液中，再与40mg/ml的纤维凝胶B液1：1混合，获得混合液；将混合液注射入放射状胶原支架中心的孔中，混合液在一分钟以内成胶，获得含有SDF-1的放射状胶原支架。
2.根据权利要求1所述的基质细胞衍生因子结合放射状胶原支架在骨软骨缺损修复中的应用。
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