CN105031724A - 一种组织工程软骨支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织工程软骨支架及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：步骤A：提取Ⅱ型胶原蛋白；步骤B:利用所述Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素以及羟基磷灰石制备初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架；步骤C:利用EDC/NHS系统将步骤B中的初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架进行交联，再冷冻干燥得到CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。本发明制得的组织工程软骨支架具有生物相容性好、毒性低、易降解、降解产物无毒等优点；本发明制得的组织工程软骨支架外观形态致密，各项性能参数适于人体软骨组织的修复；本发明构建的组织工程软骨支架的材料来源广泛且容易塑形，可用于大面积创伤修复。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，尤其是涉及一种组织工程软骨支架及其制备方法。
背景技术
关节软骨是关节功能执行的必要成分，由骨组织及其周围的软骨膜构成，软骨组织则由软骨细胞、基质及纤维构成。软骨在关节功能中发挥着重要的作用。然而，关节软骨损伤是十分常见疾病，临床上各种原因进行的关节镜手术约80%的病人均发现有软骨损伤，20%为较重的软骨损伤。由于软骨内缺乏血管组织，而且软骨组织细胞被包裹在基质成分中，不能迁移到损伤部位修复缺损，致使关节软骨损伤后的自愈能力很差，不能实现再生。软骨损伤若不及时治疗，容易造成关节弹响、僵硬、疼痛加重等，最终需要关节置换，严重影响患者生活质量。
目前，针对软骨组织损伤治疗方法由关节灌洗术、关节清理术、骨膜移植、软骨移植和自体软骨细胞移植等。但是该些方法存在着明显的不足，关节清理术只能暂时缓解症状；微骨折受伤只能在缺损部位再生纤维软骨，不能达到正常软骨的力学要求；自体软骨仅适用于软骨缺损面积较小的损伤治疗。现有制备方法也得不到合格适用于人体的组织工程软骨。
由此可见，常规治疗关节软骨损伤的方法和手段存在明显的不足，治疗的效果并不理想。因此，如何基于软骨组织的结构，在体外条件下制备组织工程软骨，应用于软骨损伤的修复，为软骨缺损治疗提供最佳的选择，具有较好的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织工程软骨支架及其制备方法，该制备方法具有流程简单，制备的组织工程软骨支架合格率高，该组织工程软骨支架具有生物相容性好，毒性低，适用范围广，各项性能参数均适合人体软骨组织修复的优点。
为解决上述技术问题，本发明提供一种组织工程软骨支架的制备方法，其包括以下步骤：
步骤A：提取Ⅱ型胶原蛋白；
步骤B:利用所述Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素以及羟基磷灰石制备初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架；
步骤C:利用EDC/NHS系统将步骤B中的初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架进行交联，再冷冻干燥得到CII-HA-CS-HAP三维软骨支架；
步骤D:对所述CII-HA-CS-HAP三维软骨支架进行消毒，得到可应用于人体的组织工程软骨支架。
本发明的一个实施例中，所述的Ⅱ型胶原蛋白从牛骨、猪骨、羊骨中提取得到或者所述Ⅱ型胶原蛋白通过基因工程菌株生产得到。
本发明的一个实施例中，在所述步骤B中，所述Ⅱ型胶原蛋白、所述透明质酸、所述硫酸软骨素配制成1%-2%(m/V)的溶液；
其中，所述透明质酸溶液和所述硫酸软骨素溶液混合后，再加入透明质酸溶液或者硫酸软骨素溶液质量的4-14倍的Ⅱ型胶原蛋白溶液得到CII-HA-CS混合液；
所述羟基磷灰石添加量为所述Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸和硫酸软骨素总质量的30%-80%，与所述CII-HA-CS混合液形成均一的混合溶液。
本发明的一个实施例中，所述均一的混合溶液转移至24孔板中，冷冻干燥得到初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。
本发明的一个实施例中，所述初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架浸泡在含乙醇、MES、NHS、EDC的混合溶液中，在培养箱中20℃-25℃条件下交联24-36小时得到CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。
本发明的一个实施例中，所述步骤D中，所述CII-HA-CS-HAP三维软骨支架通过紫外线、Co60灭菌或环氧乙烷灭菌进行消毒。
本发明的一个实施例中，所述步骤B中，通过3D打印机得到初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。
本发明还提供一种应用上述方法制备的组织工程软骨支架，该组织工程软骨支架吸水率为300-600%，孔隙率为90%以上，孔径为50-300μm，抗压强度为大于8kPa。
本发明的一个实施例中，所述组织工程软骨支架3周的降解率为15%-35%。
本发明的一个实施例中，所述组织工程软骨支架经过小鼠成软骨细胞ATDC-5培养，可使得成软骨细胞ATDC-5生长良好。
本发明的有益效果为：
本发明的组织工程软骨支架制备方法应用机体中存在的天然物质的复合材料，制备的组织工程软骨支架具有生物相容性好、毒性低、易降解、降解产物无毒等优点，本发明制得的组织工程软骨支架外观形态致密，各项性能参数适于人体软骨组织的修复；本发明构建组织软骨支架的材料来源广泛、容易塑形、可用于大面积创伤修复。本发明可根据3D打印技术构建出不同的形状，针对不同部位的缺损大小及形状量体裁衣，方便应用，可在室温下长期保存。
附图说明
图1为本发明的组织工程软骨支架一实施例的结构示意图；
图2为本发明的组织工程软骨支架1000倍的电镜图；
图3为本发明的组织工程软骨支架3500倍的电镜图；
图4为本发明的组织工程软骨支架上培养2天的软骨细胞ATDC-5荧光染色图；
图5为本发明的组织工程软骨支架上培养4天的软骨细胞ATDC-5荧光染色图；
图6为本发明的组织工程软骨支架上培养7天的软骨细胞ATDC-5荧光染色图；
图7为本发明的组织工程软骨支架上培养12天的软骨细胞ATDC-5荧光染色图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
本发明组织工程软骨支架制备方法，包括以下步骤：
步骤一：Ⅱ型胶原蛋白的提取。
首先，选择新鲜的牛软骨，用三氯甲烷、甲醇除去骨膜,并将该新鲜牛软骨粉碎。接着，用含4mol/L盐酸胍溶液0.05mol/LTris-HCl搅拌处理粉碎的软骨组织、并在4℃下低温离心，去上清。重复多次除去蛋白多糖。然后，将离心得到的沉淀物用0.1-0.5mol/L乙酸充分洗涤后，溶解于同浓度的乙酸中，加入胃蛋白酶对沉淀物进行消化处理10-18小时，4℃保存离心，将离心得到的上清液，再进行消化处理5-8小时，合并上述得到的上清液，制备得到Ⅱ型胶原蛋白溶液。最后，将上述上清液经盐析，通过冷冻干燥机干燥得到Ⅱ型胶原蛋白。
在本步骤中，Ⅱ型胶原蛋白还可以通过猪软骨、羊软骨等动物软骨中提取的得到，或者Ⅱ型胶原蛋白通过基因工程菌株生产得到。
步骤二：制备初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。
首先，将步骤一中提取的冷冻干燥得到的Ⅱ型胶原蛋白溶于0.05mol/LHCl溶液中，在4℃条件下，搅拌使其溶解完全，得到终浓度为1%-2%(m/V)的Ⅱ型胶原蛋白溶液。同时，用去离子水分别溶解透明质酸HA和硫酸软骨素CS，在4℃条件下，搅拌使其完全溶解得到浓度为1%-2%(m/V)的透明质酸溶液，终浓度为1%-2%(m/V)硫酸软骨素溶液，其中，m/V为溶质质量相对于溶液体积的百分比，例如，1g固体溶于100ml液体，则m/V为1%。并将上述透明质酸溶液和硫酸软骨素溶液进行混合。接着，在透明质酸溶液和硫酸软骨素溶液的混合溶液中加入透明质酸溶液或者硫酸软骨素溶液质量的4-14倍的Ⅱ型胶原蛋白溶液，并不断搅拌。最后，添加Ⅱ型胶原蛋白，透明质酸和硫酸软骨素总质量的30%-80%的羟基磷灰石得到混合溶液体系。将该混合溶液体系在4℃条件下继续搅拌，得到均一的混合溶液。最后，将上述均一的混合溶液体系转移至24孔板中，真空冷冻干燥，得到初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。
本步骤中，可以利用上述均一的混合溶液通过3D打印机得到初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架，3D打印机可以根据具体的需要有针对性的进行制备组织工程软骨支架的形状。
本步骤中，也可通过模具根据具体的需要，制备相应的组织工程软骨支架。
本步骤中，所述的酸溶液包括盐酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液等常用的酸溶液。
步骤三：应用EDC/NHS系统对CII-HA-CS-HAP三维软骨初级支架进行交联。首先，将CII-HA-CS-HAP三维软骨初级支架在乙醇、MES混合溶液中室温条件下浸泡30min。然后，将该三维软骨初级支架浸泡在含乙醇、MES、NHS、EDC混合溶液中，并置于培养箱中20℃条件下交联24小时。再在震荡条件下，将该三维软骨支架在Na2HPO4溶液中洗涤2次，每次15-30min；NaCl溶液中多次洗涤；三蒸水多次洗涤。最后，将处理过的三维软骨支架在真空中冷冻干燥，得到CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。
步骤四：对CII-HA-CS-HAP三维软骨支架进行消毒。
将CII-HA-CS-HAP三维软骨支架在253.7nm紫外灯下灭菌，灭菌时，需要将软骨组织支架的每一个面在紫外灯下照射1-2h。或者将三维软骨支架经过Co60灭菌或环氧乙烷灭菌。灭菌后的三维软骨支架可以应用到人体的软骨组织的修复中。
本发明的制备方法得到适于应用的组织工程三维软骨支架，制备方法流程简单，实验过程可靠，组织工程软骨支架各项性能参数符合要求。本发明通过加入羟基磷灰石增加了该组织工程软骨支架的强度，并且通过控制Ⅱ型胶原蛋白，透明质酸，硫酸软骨素和羟基磷灰石的用量及相应的反应条件可制备得到适合应用人体的组织工程软骨支架。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，在步骤三中，将CII-HA-CS-HAP三维软骨初级支架在乙醇、MES混合溶液中室温条件下浸泡30min。然后，将该初级三维软骨支架浸泡在含乙醇、MES、NHS、EDC混合溶液中，并置于培养箱中25℃条件下交联36小时。其他实验步骤的各个条件不变，得到本发明的组织工程三维软骨支架。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，在步骤三中，将CII-HA-CS-HAP三维软骨初级支架在乙醇、MES混合溶液中室温条件下浸泡30min。然后，将该初级三维软骨支架浸泡在含乙醇、MES、NHS、EDC混合溶液中，并置于培养箱中22℃条件下交联30小时。其他各个条件不变，最终得到本发明的组织工程软骨支架。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，在所述步骤二中，首先，将步骤一中从牛软骨中提取冷冻干燥得到的Ⅱ型胶原蛋白溶溶于硫酸溶液中，在4℃条件下，搅拌使其溶解完全，得到终浓度为1%(m/V)的Ⅱ型胶原蛋白溶液。同时，用去离子水分别溶解透明质酸HA和硫酸软骨素CS，在4℃条件下，搅拌使其完全溶解，得到浓度为1%(m/V)透明质酸溶液以及终浓度为1%(m/V)的硫酸软骨素溶液。将上述透明质酸溶液和硫酸软骨素溶液等量混合。接着，在透明质酸溶液和硫酸软骨素溶液的混合溶液中加入透明质酸溶液或者硫酸软骨素溶液质量的4倍的Ⅱ型胶原蛋白溶液，并不断搅拌。最后，加入Ⅱ型胶原蛋白，透明质酸和硫酸软骨素总质量的30%的羟基磷灰石，得到一混合溶液体系，将该混合溶液体系在4℃条件下，继续搅拌至均一混合溶液。最后，将上述均一的混合溶液体系转移至24孔板中，冷冻干燥，得到初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。其他各个条件均不变，得到本发明的组织工程软骨支架。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于，在所述步骤二中，首先，将步骤一中从牛软骨中提取冷冻干燥得到的Ⅱ型胶原蛋白溶于醋酸溶液中，在4℃条件下搅拌使其溶解完全，得到终浓度为2%(m/V)Ⅱ型胶原蛋白溶液。同时，用去离子水分别溶解透明质酸HA和硫酸软骨素CS，在4℃条件下搅拌使其完全溶解，得到浓度为2%(m/V)透明质酸溶液以及终浓度为2%(m/V)的硫酸软骨素溶液。并将上述透明质酸溶液和硫酸软骨素溶液等量进行混合。接着，在透明质酸溶液和硫酸软骨素溶液的混合溶液中加入透明质酸溶液或者硫酸软骨素溶液质量的14倍的Ⅱ型胶原蛋白溶液，并不断搅拌。最后，加入量为Ⅱ型胶原蛋白，透明质酸和硫酸软骨素总质量的50%的羟基磷灰石，得到一混合溶液体系，将该混合溶液体系在4℃条件下继续搅拌至溶液均一。最后，将上述均一的混合溶液体系转移至24孔板中，真空冷冻干燥，得到初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。其他各个条件不变，得到本发明的组织工程软骨支架。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于，在所述步骤二中，首先，将步骤一中从牛软骨中提取冷冻干燥得到的Ⅱ型胶原蛋白溶于0.05mol/LHCl溶液中，在4℃条件下搅拌使其溶解完全，得到终浓度为1%(m/V)Ⅱ型胶原蛋白溶液。同时，用去离子水分别溶解透明质酸HA和硫酸软骨素CS，在4℃条件下，搅拌使其完全溶解，得到浓度为1%(m/V)透明质酸溶液，终浓度为1%(m/V)的硫酸软骨素溶液。并将透明质酸溶液和硫酸软骨素溶液进行混合。接着，在透明质酸溶液和硫酸软骨素溶液的混合溶液中加入透明质酸溶液或者硫酸软骨素溶液质量的9倍的Ⅱ型胶原蛋白溶液，并不断搅拌。最后，加入量为Ⅱ型胶原蛋白，透明质酸和硫酸软骨素总质量的80%的羟基磷灰石。得到一混合溶液体系，将该混合溶液体系在4℃条件下继续搅拌至均一混合溶液。最后，将上述均一的混合溶液体系转移至24孔板中，真空冷冻干燥，得到初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。其他各个条件不变，得到本发明的组织工程软骨支架。
实施例7
本实施例与实施例1的区别在于，在所述步骤二中，首先，将步骤一中从牛软骨中提取冷冻干燥得到的Ⅱ型胶原蛋白溶溶于0.05mol/LHCl溶液中，在4℃条件下，搅拌使其溶解完全，得到终浓度为1.5%(m/V)的Ⅱ型胶原蛋白溶液。同时，用去离子水分别溶解透明质酸HA和硫酸软骨素CS，在4℃条件下，搅拌使其完全溶解，得到浓度为1.5%(m/V)透明质酸溶液以及终浓度为1.5%(m/V)的硫酸软骨素溶液。并将上述透明质酸溶液和硫酸软骨素溶液进行混合。接着，在透明质酸溶液和硫酸软骨素溶液的混合溶液中加入透明质酸溶液或者硫酸软骨素溶液质量的10倍的Ⅱ型胶原蛋白溶液，并不断搅拌。最后，加入Ⅱ型胶原蛋白，透明质酸和硫酸软骨素总质量的60%的羟基磷灰石，得到一混合溶液体系，将该混合溶液体系在4℃条件下，继续搅拌至均一混合溶液。最后，将上述均一的混合溶液体系转移至24孔板中，真空冷冻干燥，得到初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。其他各个条件均不变，得到本发明的组织工程软骨支架。
本发明制备组织工程软骨支架的制备方法中，通过调整各种物质的加入量以及控制反应条件，在制备组织工程软骨支架的过程中，各个组分加入的量以及反应条件并没有特定的规律性，尤其是Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素和羟基磷灰石的合适的反应比例以及合适的反应条件的选择上，制备的组织工程软骨支架的合格率受到多个条件影响，只有多个条件共同满足时，才能制备得到合适的组织工程软骨支架。
实施例8
请配合图1至图7所示，对上述本发明的实施例中制备的CII-HA-CS-HAP三维软骨支架的各项性能参数进行测定，检测的项目主要包括吸水率、孔隙率、孔径、抗张强度以及降解率。
1、本发明的组织工程软骨支架的孔隙率的检测。
用无水乙醇测定组织工程软骨支架的孔隙率，在小量筒内装入一定体积的无水乙醇记为V，放入组织工程软骨支架，记下此时乙醇体积V1，拿出组织工程软骨支架，乙醇体积记为V2，（V1-V2）为组织工程软骨支架总体积，（V-V2）为孔隙体积，比值即为孔隙率。
经测得得到的本发明的组织工程软骨支架的孔隙率均为90%以上，为细胞的分布和生长提供充足的空间，本发明的软骨组织支架具有较高的孔隙率，该孔隙率可以很好的增加提高细胞生存环境的比表面积。
2、本发明的组织工程软骨支架的孔径的检测。
该组织工程软骨支架表面喷金在电子显微镜下观察孔径，检测本发明的组织工程软骨支架的孔径为50-300μm。
经实验证明，本发明的组织工程软骨支架的孔径大小适宜，且孔洞相互交通，可提供足够的表面积，有利于细胞的粘附、增长、迁移以及细胞外基质的沉积，同时极为利于营养和氧气的进入以及代谢产物的排出。
3.本发明的组织工程软骨支架的力学性能的检测。
本发明的组织工程软骨支架力学性能检测方法：将本发明的组织工程软骨支架裁剪成截面为10mm×10mm的条状，两端夹具固定，以5mm/min的速度对组织工程软骨支架进行拉伸。经实验测得，本发明的软骨组织工程支架的实验数据抗张强度大于8kPa。本发明的软骨组织支架具有较强的抗张强度，非常符合人体的需求。
4.本发明的组织工程软骨支架的降解率的测定。
在EP管中加入3-4mg交联后的三维软骨支架，称重。而后每管分别加入1mL双蒸水和2mg胶原蛋白酶粉末或胰蛋白酶。置于37℃培养箱中，50-200r/min震荡，在第三周或一定时间后（时间可自定）取出EP管，离心机离心10-20min。沉淀用双蒸水洗涤，小心弃上清，而后将EP管在-20℃冷冻，真空冷冻干燥机冻干，称重。试验平行进行三次。试验前三维软骨支架的质量记为m3，试验后三维软骨支架的质量记为m4，按照下列公式计算其降解率。
降解率(%)=(m3-m4)/m3×100%
式中m3为酶解前三维软骨支架的质量（g）；m4为酶解后三维软骨支架的质量（g）。
该组织工程软骨支架的体外实验结果得到，本发明的组织工程软骨支架的3周降解率为15%-35%。
5、经测定本发明的组织工程软骨支架的吸水率为300-600%。
经过上述测定可知，本发明的组织工程软骨支架力学强度和材料降解率都比较适宜，其降解时间正好利于种子细胞的分化、增殖和组织结构的形成，恰当的降解率利于组织结构的形成。通过对本发明的软骨组织的孔隙率、孔径大小结构以及力学性能的检测，其具有良好的力学强度，良好的理化性能以及良好的三维孔洞结构，本发明的组织工程软骨支架模拟了软骨组织的组成成分，具有良好的生物相容性和细胞相容性，因此适宜作为组织工程软骨支架材料。
实施例9
验证本发明的组织工程软骨支架的生物相容性，具体如下：
溶液准备：0.25%的胰蛋白酶溶液；0.01mol/L的PBS溶液；在DMEM:F12细胞培养基中加入10%胎牛血清、1%双抗和1%谷氨酰胺制成完全培养基。
细胞复苏：将冻存有ATDC-5小鼠成软骨细胞的冻存管直接在37℃水浴锅中水浴至完全融化，将其中的细胞悬液转移到15mL离心管中，1000g（离心力）离心3min，去除上清液，用一次性吸管吸取适当培养基反复吹打沉淀（沉淀为细胞），形成细胞悬液，转移至培养瓶中，在37℃、含5%CO2的培养箱中--进行细胞培养。
细胞传代：-将长满培养瓶底部的细胞取出，用一次性吸管吸去瓶内培养基，后用大约3mL0.01mol/L的PBS溶液洗涤细胞，吸去PBS溶液，加入1mL0.25%的胰蛋白酶溶液进行细胞消化处理，在倒置显微镜下观察，当细胞缩小即将变为球形时，吸除胰蛋白酶并加入适量的细胞培养基终止消化。用吸管小心吹打细胞将细胞从培养瓶壁上吹打下来并吹散。而后将吹散的细胞按1:2的比例接种到新的培养瓶中并加入适量培养基继续培养。
细胞换液：实验前预热PBS溶液、培养基、并对超净工作台进行紫外灭菌。从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，表面用酒精擦拭后放于超净台台面上，在火焰旁用一次性塑料吸管吸净培养基，而后加入3mL0.01mol/L的PBS溶液，轻轻摇动培养瓶后倒掉培养基。而后加入5mL细胞培养基，置于CO2培养箱中进行培养。本试验进行过程中每天换液1次。
取生长状态良好的小鼠成软骨细胞ATDC-5，消化后计数，调整细胞，按照2.5×104/孔的密度接种到放有上述实施例制备的三维复合软骨支架的孔板中培养。因细胞在三维复合软骨支架表面及内部生长，普通的倒置荧光显微镜无法清楚的观察到细胞，为了更好的观察细胞在三维复合软骨支架中的生长状态，对支架及细胞进行荧光染色后再采用倒置荧光显微镜来观察。
请配合参阅图1至图7所示，可将本发明的组织工程软骨支架制作为直径为150mm的软骨组织支架。本发明中，以Hoechst33342荧光染料为例，首先配制1mg/mL的Hoechst33342溶液，小心弃去孔中培养基，用浓度为0.01mol/L的PBS溶液多次洗涤支架，再加入适当体积的0.01mol/L的PBS溶液和Hoechst33342溶液，小心混匀。置于CO2培养箱中避光条件下37℃染色15-30min。分别在第2天、4天、7天、12天进行染色试验，并用倒置荧光显微镜观察支架中的细胞，拍照记录。
本发明的制备方法制备的三维软骨支架的均一性好，孔径适中且孔隙均匀，孔洞之间相互贯通，赋予了组织工程软骨支架极大的比表面积。该组织工程软骨支架具有适宜的孔径、孔隙率和吸水率。通过荧光染色图可以清楚的看出支架为三维立体状（远处细胞模糊），细胞均匀吸附在三维立体支架中，生长状态良好。本发明由Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素HAP以及羟基磷灰石制备的三维软骨支架非常适合ATDC-5细胞的生长增殖。
本发明的组织工程软骨支架具有以下优点：
1、本发明的软骨组织支架完全符合组织工程支架材料的要求，具有良好的生物相容性；
2、本发明的组织工程软骨支架的制备过程最大程度保存了胶原的三维结构,且在细胞培养的过程中，早期即大量增殖，随着培养时间的延长,细胞不仅在数量上增多,还分化表达软骨细胞特征性的Ⅱ型胶原成分,未见细胞增殖受抑制或中毒迹象；
3、本发明中通过加入了羟基磷灰石，达到增加该软骨支架的强度的目的，其具有良好的生物降解性和机械强度；
4、本发明的Ⅱ型胶原遇水易膨胀,实验中通过EDC/NHS交联法对CII-HA-CS-HAP进行交联,可通过交联时间来控制CII-HA-CS-HAP材料的降解速率,从而和软骨生成的速率相匹配，同时提高了材料力学性能；
5、本发明可根据3D打印技术或者模具构建出不同的形状，针对不同部位的缺损大小及形状量体裁衣，方便应用，易消毒,CII-HA-CS-HAP材料经消毒后，可在室温下长期保存。
以上仅为本发明的较佳实施例，不得以此限定本发明实施的保护范围，因此凡参考本发明的说明书内容所作的简单等效变化与修饰，仍属本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种组织工程软骨支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A：提取Ⅱ型胶原蛋白；
步骤B:利用所述Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素以及羟基磷灰石制备初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架；
步骤C:利用EDC/NHS系统将步骤B中的初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架进行交联，再冷冻干燥得到CII-HA-CS-HAP三维软骨支架；
步骤D:对所述CII-HA-CS-HAP三维软骨支架进行消毒，得到可应用于人体的组织工程软骨支架。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述的Ⅱ型胶原蛋白从牛骨、猪骨、羊骨中提取得到或者所述Ⅱ型胶原蛋白通过基因工程菌株生产得到。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
在所述步骤B中，所述Ⅱ型胶原蛋白、所述透明质酸、所述硫酸软骨素配制成1%-2%(m/V)的溶液；
其中，所述透明质酸溶液和所述硫酸软骨素溶液混合后，再加入透明质酸溶液或者硫酸软骨素溶液质量的4-14倍的Ⅱ型胶原蛋白溶液得到CII-HA-CS混合液；
所述羟基磷灰石添加量为所述Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸和硫酸软骨素总质量的30%-80%，与所述CII-HA-CS混合液形成均一的混合溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述均一的混合溶液转移至24孔板中，冷冻干燥得到初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架浸泡在含乙醇、MES、NHS、EDC的混合溶液中，在培养箱中20℃-25℃条件下交联24-36小时得到CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述步骤D中，所述CII-HA-CS-HAP三维软骨支架通过紫外线、Co60灭菌或环氧乙烷灭菌进行消毒。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述步骤B中，通过3D打印机得到初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。
8.一种应用权利要求1至权利要求7中任一方法制备的组织工程软骨支架，其特征在于，
该组织工程软骨支架吸水率为300-600%，孔隙率为90%以上，孔径为50-300μm，抗压强度为大于8kPa。
9.根据权利要求8所述的组织工程软骨支架，其特征在于，
所述组织工程软骨支架3周的降解率为15%-35%。
10.根据权利要求8所述的组织工程软骨支架，其特征在于，
所述组织工程软骨支架经过小鼠成软骨细胞ATDC-5培养，可使得成软骨细胞ATDC-5生长良好。
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