ITPD950225A1

ITPD950225A1 - Sistemi di coltura di cellule staminali di midollo osseo umano in matrici tridimensionali costituiti da esteri dell'acido ialuronico

Info

Publication number: ITPD950225A1
Application number: IT95PD000225A
Authority: IT
Inventors: Giovanni Abatangelo; Lanfranco Callegaro
Original assignee: Fidia Advanced Biopolymers Srl
Priority date: 1995-11-20
Filing date: 1995-11-20
Publication date: 1997-05-20
Also published as: DE69626035D1; ITPD950225A0; IL124450A; CA2238011C; EP0863776A1; AU709236B2; DE69626035T2; IL124450A0; JP3808900B2; IT1282207B1; EP0863776B1; JP2000500372A; WO1997018842A1; ES2189890T3; DK0863776T3; PT863776E; US6596274B1; CA2238011A1; ATE231730T1; AU7693496A

Abstract

La presente invenzione descrive la preparazione e l'utilizzo di materiali biocompatibili e biodegradabili a base di esteri di acido ialuronico quali substrati idonei a permettere lo sviluppo e la crescita tridimensionale di fibroblasti derivanti da tessuto mesenchimale del midollo osseo. Il biomateriale è rappresentato in particolar modo dall'estere benzilico dell'acido ialuronico con un grado di esterificazione variante dal 25 al 100%.

Description

Descrizione di una domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo "Sistemi di coltura di cellule staminali di midollo osseo umano in matrici tridimensionali costituiti da esteri dell'acido ialuronico"

OGGETTO DELL’INVENZIONE

CAMPO DELL'INVENZIONE

Le perdite di materiale cutaneo, ad eziologia diversa quale la traumatica o metabolica, rappresentano in certi casi una condizione morbosa che stenta a riparare spontaneamente. Questa difficoltà può essere dovuta a cause metaboliche, circolatorie distrettuali, a defedamento del paziente, oppure alla notevole ampiezza della lesione, come nel caso degli ustionati gravi. Il fallimento di terapia farmacologica ha portato alla adozione di trattamento chirurgico ricostruttivo utilizzando il trapianto di lembi di pelle dello stesso paziente, laddove possibile. Una svolta importante nel trattamento di queste lesioni si è verificata con la adozione di tecniche per colture cellulari "in vitro".

Un altro problema per l'allestimento di sostituti dermici è anche rappresentato dall'approvigionamento dei fibroblasti da seminare all'interno delle matrici biocompatibili. Infatti, non sempre è facile l'isolamento dei fibroblasti da tessuti dermici, soprattutto in pazienti anziani o in soggetti defedati. Una soluzione a questi problemi è offerta dalla popolazione delle cellule mesenchimali presenti nel tessuto osseo midollare. Queste cellule sono molto attive e possono opportunamente differenziarsi in varie linee cellulari se poste nelle condizioni ottimali. Da queste cellule staminali è possibile ottenere cellule differenziate quali fibroblasti, cellule adipose, muscolari, osteoblasti, condrociti.

J. Rheinwald and H. Green, Cell, 6 (1975) 331-344, coltivarono per primi dei cheratinociti che potevano essere successivamente utilizzati nella pratica clinica per la copertura di lesioni cutanee (G.G. Gallico et al., N. Engl. J. Med., 311, (1984), 448-451). Questa tecnica innovativa si è rivelata non priva di limiti, primi fra tutti la fragilità estrema del foglietto epiteliale e la ridotta capacità di attecchimento sulla ferita. Per ovviare a questi limiti si è pensato di costruire derivati dermici sui quali si potessero far crescere dei cheratinociti. Yannas et al., Science, 215, (1982), 174-176, hanno utilizzato una miscela di collagene e glicosaminoglicani per ottenere un materiale poroso riassorbibile da utilizzare come sostituto dermico da applicare su lesioni accompagnate da perdita di sostanza cutanea.

S. Boyce e J. Hansbrough, Surgery, 103, (1988), 421-431, hanno descritto l’impiego di lamine formate da collagene e glicosaminoglicani quali supporto per far crescere in superficie i cheratinociti da trapiantare successivamente.

Un altro sistema per l’allestimento di sostituti dermici è infine rappresentato dalla coltura di fibroblasti su matrici tridimensionali biocompatibili a base di polimeri sintetici o semisintetici. Su queste strutture è possibile seminare e far sviluppare i fibroblasti e quindi permettere la produzione di una matrice extra cellulare paragonabile a quella di un connettivo naturale.

Alcuni noti esempi di sostituti dermici sono:

1) Dermagraft, sviluppato dalla Advanced Tissue Science (California), in cui i fibroblasti umani vengono seminati e coltivati su una matrice formata da acido poli-lattico, poliglicolico e poligalattosidico. Su queste matrici popolate da fibroblasti vengono successivamente seminati i cheratinociti, allo scopo di promuovere una loro crescita più "fisiologica"; 2) Graft-skin, della Organogenesis Ine. (Boston USA), fatto da un substrato collagenico sul quale vengono seminati i fibroblasti umani eterologhi;

3) AlloDerm, prodotto da Life Celi Corp. (Texas, USA), costituito da derma umano o porcino, conservato intatto a bassa temperatura. Al momento dell'uso può essere seminato con fibroblasti e keratinociti autoioghi e quindi utilizzato per il trapianto.

Questi prodotti, pur rappresentando un buon supporto biologico per le colture "in vitro", mostrano tuttavia dei limiti nella loro applicazione "in vivo", sia per problemi di reazioni immunologiche, essendo costituiti da materiale proteico non autologo, che per rischi di trasmissione di malattie virali.

Infine, altri manufatti derivanti dall’acido ialuronico sono noti per essere usati nei trapianti di pelle in quanto rappresentano materiali altamente biocompatibili e biodegradabili (Benedetti et al., Biomaterials, 14 (1993) 1154-1160; Cortivo R. et al., Biomaterials, 12 (1991) 727-730) esenti da eventuali problemi di immunoreazioni. Infatti, l'acido ialuronico, essendo un componente della matrice extracellulare, durante la sua degradazione nei tessuti, libera frammenti che risultano del tutto naturali.

Scopo della presente invenzione è di mettere a punto un sistema efficiente di coltura di cellule staminali di midollo osseo umano all'interno di matrici tridimensionali costituite da estere benzilico dell'acido ialuronico, in modo che avvenga la crescita ed il differenziamento cellulare in senso fibroblastico, con deposizione di matrice extracellulare.

Il dispositivo in questione, qualora trapiantato su cute lesionata, grazie alla sua biodegradabilità, può essere riassorbito in tempi prefissati, lasciando così nel sito dove viene applicato un tessuto dermico neoformato. Nel caso siano state seminate cellule autologhe, queste potranno rimanere nel tessuto dermico neoformato e contribuire alla riparazione della lesione tramite i vari fattori di crescita che sono in grado di secernere.

Nel caso le cellule mesenchimali midollari seminate nel contesto della matrice provengano da paziente diverso dal ricevente, queste possono essere allontanate, mediante successive lisi osmotiche, dal tessuto neoformato, che in questo caso rimane costituito dalla sola componente extracellulare.

Queste matrici, deprivate o meno della componente cellulare, possono inoltre servire quale substrato per la successiva semina in vitro di cheratinociti autoioghi od omologhi per essere successivamente trapiantati.

Inoltre, per quanto riguarda la crescita di cellule mesenchimali del midollo osseo, esiste la possibilità di costituire tessuto cartilagineo e tessuto osseo sfruttando la capacità delle suddette cellule di differenziarsi lungo varie linee.

Infine, il derma così ottenuto, privato o meno della componente cellulare, può essere crioconservato a bassa temperatura in modo tale da costituire una banca tissutale e da essere utilizzato come materiale da trapianto o come supporto per l'allestimento di cheratinociti.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

La presente invenzione descrive pertanto la produzione di un sostituto dermico da impiegarsi nelle lesioni cutanee dove c'è perdita di sostanza. In aggiunta, tale sostituto dermico può servire come tessuto guida per la crescita di cheratinociti e sviluppo conseguente di un tessuto cutaneo completo. Le cellule da impiegare per l'allestimento di tale derma artificiale sono rappresentate dalle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo che, una volta seminate in questa matrice biodegradabile fatta di estere benzilico di acido ialuronico, possono essere eventualmente rimosse, con opportuno trattamento che lasci intatta la matrice extracellulare neosintetizzata.

I supporti dentro i quali vengono coltivati le cellule mesenchimali midollari sono rappresentati, in questo caso, dall'estere benzilico dell'acido ialuronico (HYAFF) con % di esterificazione del 75 (HYAFF-llp75) e del 100% (HYAFF-11) preparati secondo il metodo descritto nel brev. US. N. 4,851,521. La parziale esterificazione del biomateriale permette una accelerata degradazione e quindi una diminuita residenza nel sito di impianto. I due tipi di biomateriale sono stati usati sotto forma di non-tessuto, di garze, spugne, membrane:

1) il materiale midollare viene prelevato o dalla cresta iliaca o dallo sterno di soggetti sani volontari. Il materiale viene seminato su piastre di coltura nei terreni in condizioni standard.

Dopo 48 ore vengono allontanate tutte le cellule supernatanti e si aggiunge nuovo terreno. Dopo ulteriori 48 ore si cambia ancora il terreno e si coltivano le cellule aderenti.

2) Dopo la formazione delle prime colonie, le cellule vengono staccate mediante tripsinizzazione e trasferite su nuove piastre di coltura dove sono state precedentemente attaccate alcune matrici di HYAFF-11 o di HYAFF-llp75. Questi pezzi di biomateriale (cm 2x2) vengono resi aderenti sulla piastra mediante formazione di un coagulo di fibrina piasmatica umana nell'interfaccia plastica/biomateriale. Le cellule staminali midollari vengono depositate sul pezzo di biomateriale ad una densità di IO4 cellule/ cm2. Le colture si lasciano per 2 settimane con cambi di terreno ogni 3 giorni.

3) Come colture di controllo sono stati utilizzati fibroblasti ottenuti da cute umana sana, prelevata in corso di interventi chirurgici (mastectomie, circoncisioni).

4) Al termine del periodo di coltura, in particolare dopo 7 e 14 giorni, i biomateriali vengono staccati dalla piastra senza uso di enzimi litici e divisi in due parti. Una è fissata in formalina per le indagini istologiche di routine, e l'altra è congelata in azoto liquido e conservata per le successive indagini immunoistochimiche.

5) I pezzi fissati in formalina sono colorati con ematossilina/eosina o con metodo van Gieson, mentre sul materiale congelato si eseguono colorazioni immunoistochimiche con anticorpi mono o policlonali per evidenziare la presenza di:

1) fibronectina, 2) collagene I, III e IV, laminina.

A titolo puramente indicativo si descrivono alcuni esempi di caratterizzazione del tessuto neoformato.

ESEMPIO 1:

Pezzi di tessuto (cm 1,5x1, 5) costituiti sia da HYAFF~llp75 che da HYAFF-11, vengono separatamente fissati su piastre di coltura mediante coagulo di fibrina. Fibroblasti umani ottenuti da espianti cutanei e da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo vengono separatamente seminati sul biomateriale ad una densità di 10<4 >cellule x cm2 in 0,2 mi di medium cercando di imbibire lentamente il biomateriale. Dopo circa 30 min. si aggiunge il medium di coltura DMEM completo di FCS al 10% e 50 μg/ml di addo 1-ascorbico e le piastre vengono poste ad incubare a 37°C.

Il medium viene cambiato ogni 48 ore e le colture vengono osservate sotto microscopio a contrasto di fase.

I pezzi di biomateriale di HYAFF-llp75 vengono tenuti i coltura per 7 giorni e successivamente analizzati per la morfologia e per la presenza di matrice extracellulare mediante impiego di anticorpi. Nel caso particolare delle colture di fibroblasti su HYAFF-llp75 si è notato che questo, dopo 7 giorni di coltura, incomincia a dissolversi nel medium. Il biomateriale HYAFF-11 invece può essere tenuto in coltura per periodi di tempo prolungato (circa 6 settimane). In questo caso, i pezzi di HYAFF-11 sono stati incubati con le cellule per un periodo di 7,14 e 21 giorni. Al termine di questi vari periodi di incubazione, i pezzi sono stati prelevati ed analizzati come descritto per HYAFF-11 p75.

Risultati delle colorazioni istologiche

Ematossilina/eosina

Si evidenziano cellule allungate con la tipica morfologia dei fibroblasti sia nei biomateriali HYAFF-llp75 che HYAFF-11. Da un punto di vista morfologico sia i fibroblasti ottenuti dal derma che dalle cellule mesenchmali midollari appaiono del tutto simili. Nel caso dello HYAFF-11 si evidenziano le fibre del biomateriale ben conservate mentre, per quanto riguarda le fibre del biomateriale che costituiscono HYAFF-llp75, queste mostrano evidenti segni di dissoluzione.

Analizzando il biomateriale, è evidente la presenza di una delicata trama di fibrille esili che, con la colorazione del metodo Van Gieson, appaiono di un tenue colore rosa /rosso, a conferma che si tratta di fibrille collagene neosintezzate dai fibroblasti.

Caratterizzazone immunoistochimica

I seguenti anticorpi sono stati usati per la evidenziazione delle molecole più rappresentative della matrice extracellulare:

1) anticorpi monoclonali anti collagene I umano

2) anticorpi monoclonali anti collagene umano III

3) anticorpi policlonali anti collagene umano IV

4) anticorpi monoclonali anti fibronectina umana

5) anticorpi monoclonali anti laminina umana.

La matrice extra cellulare depositata dai fibroblasti, sia di derivazione dermica che di derivazione mesenchimale midollare, si è rivelata positiva alle suddette immunoreazioni. In particolare si è evidenziata una notevole componente di collagene fibrillare (I e III) nonché collagene IV. Le tipiche molecole adesive, fibronectina e laminina, caratteristiche del tessuto dermico, sono chiaramente espresse da queste cellule fibroblastiche, dimostrando come aH'interno delle matrici utilizzate dalla Richiedente si possa costituire una impalcatura extracellulare completa.

ESEMPIO 2:

Allo scopo di dimostrare la possibilità di criopreservare il derma artificiale ottenuto dalle colture delle cellule mesenchimali midollari, i pezzi di biomateriali contenenti le cellule sono stati congelati in presenza di un agente crioconservante (dimetisolfossido DMSO). Le colture vengono prelevate e poste in capsule contenenti terreno DMEM, FCS e DMSO 10% raffreddato a 4°C e dopo 5 min. poste a -80°C.

A distanza di una settimana, i pezzi di HYAFF-llp75 vengono scongelati portando la temperatura velocemente a 37°C e lavando, quindi, più volte con DMEM con 10% FCS al fine di eliminare il DMSO. Si lascia in incubatore per 24 ore e successivamente le colture vengono trasferite su nuovi pezzi di biomateriale HYAFF-llp75 delle stesse dimensioni, precedentemente adesi su piastre di coltura. Questo passaggio si rende necessario per provvedere un nuovo supporto alle cellule, dato che il non-tessuto originario incomincia dopo 7 giorni a dissolversi nel medium.

I pezzi di HYAFF-11 vengono, invece, rimessi a coltivare dopo lo scongelamento effettuato nelle stesse condizioni sopra descritte. Tutti i biomateriali scongelati vengono coltivati per 7 giorni ed analizzati successivamente come descritto nell'esempio 1. I risultati di queste nuove osservazioni sono paragonabili a quelli descritti nell'esempio 1 e le prove effettuate con il test di colorazione al tripan blue dimostrano che le cellule presenti nella matrice di HYAFF-11 dopo lo scongelamento sono ancora vitali.

Nelle figure 1-5/A-B sono riportate alcune immagini istologiche del biomateriale non-tessuto HYAFF-11 nel quale sono state seminate cellule fibroblastiche di midollo e di derma umano. Ogni figura descrive la relativa immunolocalizzazione del collagene I, III, IV , fibronectina e laminina. I vari biomateriali fatti di HYAFF-11 e HYAFF-llp75 (garze, spugne, membrane) non differiscono sostanzialmente fra di loro per quanto riguarda la crescita dei fibroblasti e la deposizione di matrice extracellulare.

ESEMPIO 3:

Allo scopo di verificare la possibilità di ottenere delle matrici di derma artificiale "in vitro" con le modalità sopradescritte e successivamente private della componente cellulare, si è proceduto nel modo seguente:

I pezzi di biomateriale HYAFF, al termine del periodo di coltura come descritto nell'esempio 1, vengono trattati con acqua distillata e poi con deossicolato di sodio al 5% per Usare i fibroblasti presenti. Questi due trattamenti portano alla lisi cellulare ed alla solubilizzazione delle membrane, lasciando pressoché intatta la componente extracellulare. Successivamente a questo trattamento si procede all'esame istologico ed immunoistologico dei pezzi di biomateriale come descritto per gli esempi precedenti.

La colorazione della matrice extracellulare effettuata con gli anticorpi specifici dimostra che il procedimento di eliminazione della componente cellulare non altera l'architettura e la composizione della matrice extracellulare che appare del tutto simile a quella presente nelle matrici di partenza, prima del trattamento di rimozione cellulare.

Claims

RIVENDICAZIONI 1) Un manufatto biocompatibile e biodegradabile a base di derivati di acido ialuronico che permette l'espressione della componente matura della matrice extra cellulare da parte di cellule staminali mesenchimali e fibroblasti di derma umano.
2) Un manufatto costituito da matrice extracellulare in assenza di componenti cellulari per evitare reazioni immunologiche.
3) Un manufatto di cui alla riv. 1 in cui il derivato è un estere dell'acido ialuronico parzialmente esterificato a partire dal 25% e la rimanente parte salificata con sodio.
4) Un manufatto di cui alla riv. 1 in cui il derivato è un estere dell'acido ialuronico totalmente esterificato al 100%.
5) Un manufatto di cui alle riv. 1-4 rappresentato da un nontessuto, membrane, spugne, granuli, microsfere, tubicini, garze. Un processo per la preparazione di manufatti secondo le rivendicazioni 1-5, che prevede lo sviluppo e la crescita di cellule differenziate, quali fibroblasti, condrociti, osteociti, derivanti da tessuto mesenchimale del midollo osseo e dal derma su matrici tridimensionali a base di un derivato di acido ialuronico. 7) Un processo per la crioconservazione del derma, preparato in accordo alla riv. 6, privato o meno della componente cellulare, per la costituzione di una "banca tissutale” per trapianti. 8) Impiego di un manufatto secondo le riv. 1-6 come sostituto dermico nella copertura di lesioni cutanee e nei trapianti di pelle. 9) Impiego di un manufatto secondo le rivendicazioni 1-6 come sostituto cartilagineo per coprire zone di cartilagine erosa o degenerata. Impiego di un manufatto secondo le rivendicazioni 1-6 come sostituto di tessuto osseo in caso di perdita di sostanza ossea.