DE69626035T2

DE69626035T2 - Ein biologisches material, das eine wirksame kultur von knochenmarkstammzellen, die teilweise oder vollständing in bindegewebszellen differenziert sind, enthält, und eine dreidimensionale, bioverträgliche und biologische abbaubare matrix, die aus einen hyaluronsäurederivat besteht

Info

Publication number: DE69626035T2
Application number: DE69626035T
Authority: DE
Inventors: Giovanni Abatangelo; Lanfranco Callegaro
Original assignee: Fidia Advanced Biopolymers SRL
Current assignee: Anika Therapeutics SRL
Priority date: 1995-11-20
Filing date: 1996-11-19
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2016-11-20
Also published as: JP2000500372A; EP0863776A1; AU709236B2; PT863776E; US6596274B1; IT1282207B1; AU7693496A; ES2189890T3; IL124450A0; CA2238011C; IL124450A; WO1997018842A1; ITPD950225A1; ATE231730T1; EP0863776B1; CA2238011A1; JP3808900B2; ITPD950225A0; DK0863776T3; DE69626035D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein biologisches Material, ein Herstellungsverfahren dafür und seine Verwendung bei Gewebetransplantationen
Hintergrund der Erfindung
Der Verlust von Hautgewebe aufgrund verschiedener Ursachen, traumatischer oder metabolischer Natur zum Beispiel, erweist sich manchmal als sehr langsam verheilend. Dies kann an metabolischen oder lokalen Kreislaufproblemen, am schlechten Gesundheitszustand des Patienten oder der Größe der Wunde, wie bei großflächigen Verbrennungswunden, liegen. Die Wirkungslosigkeit der pharmakologischen Therapie hat die Mediziner zur rekonstruktiven Chirurgie unter Verwendung von Hauttransplantationen, wenn möglich vom gleichen Patienten, gebracht. Ein wichtiger Durchbruch bei der Behandlung derartiger Wunden ist die Verwendung von Techniken für in vitro Zellkulturen.
Ein weiteres Problem im Zusammenhang mit der Herstellung von Hautersatz stellt die Versorgung mit Fibroblasten zur Impfung von biokompatible Matrizes. Es ist tatsächlich nicht einfach, Fibroblasten aus dermalem Gewebe zu isolieren, insbesondere bei älteren oder stark geschwächten Patienten. Eine Lösung dieses Problems stellen Mesenchymzellen aus dem Knochenmarkgewebe dar. Diese Zellen sind sehr aktiv und können auf geeignete Weise in verschiedene Zelllinien differenziert werden, wenn sie unter den richtigen Bedingungen behandelt werden. Es ist möglich, aus diesen Stammzellen differenzierte Zellen wie Fibroblasten, Adipozyten, Myoblasten, Osteoblasten und Chondrozyten zu erhalten.
J. Rheinwald und H. Green (Cell, 6, 1975, 331–344) haben als erste Keratinozyten gezüchtet, die erfolgreich für die Bedeckung von Hautverletzungen in der klinischen Praxis verwendet werden konnten (G. G. Gallico et al. N. Engl. J. Med., 311, (1984), 448–451). Diese innovative Technik hatte jedoch Grenzen, wobei die problematischsten die außergewöhnlich starke Fragilität der Epithelschicht und die sehr rige Annahmerate waren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden dermale Abkömmlinge entwickelt, auf denen Keratinozyten gezüchtet werden können. Yannas et al. (Science, 215, (1982), 174–176) verwendeten eine Mischung aus Kollagen und Glykosaminoglykanen, um ein reabsorbierbares, poröses Material zu erhalten, das als Hautersatz auf durch Verlust der kutanen Substanz gekennzeichneten Wunden dient.
S. Boyce und J. Hansbrough (Surgery, 103, (1988), 421–431) beschrieben die Verwendung von Schichten aus Kollagen und Glykosaminoglykanen als Träger für die Züchtung von Keratinozyten für eine nachfolgende Transplantation.
Ein anderes System für die Herstellung von dermalen Ersatzstoffen stellen Kulturen von Fibroblasten auf biokompatiblen, dreidimensionalen Matrizes dar, welche auf synthetischen oder halbsynthetischen Polymeren basieren. Es ist möglich, Fibroblasten auf diese Strukturen zu impfen und zu züchten und so die Herstellung einer extrazellulären Matrix zu ermöglichen, die der von natürlichem Bindegewebe ähnelt.
Einige wohlbekannte Beispiele für dermale Ersatzstoffe sind:

1) Dermagraft, entwickelt von Advanced Tissue Science (Kalifornien), bei dem humane Fibroblasten auf einer aus Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Polygalakturonsäure gebildeten Matrix geimpft und kultiviert werden. Diese mit Fibroblasten besiedelten Matrizes werden anschließend mit Keratinozyten geimpft, um ihr mehr „physiologisches" Wachstum zu fördern;
2) Graft-skin, von Organogenesis Inc. (Boston, USA), die aus einem Kollagensubstrat besteht, auf das heterologe menschliche Fibroblasten geimpft wurden;
3) AlloDerm, von Life Cell Corp. (Texas, USA), die aus menschlicher oder Schweinehaut besteht, die intakt gelassen und bei tiefen Temperaturen gelagert wird. Vor der Verwendung kann sie mit autologen Fibroblasten und Keratinozyten geimpft und dann für Transplantationen verwendet werden.

Obwohl diese Produkte gute biologische Träger für in vitro Kulturen darstellen, ist ihre in vivo Verwendung ein wenig eingeschränkt, aufgrund von immunologischen Reaktionen gegen ihre nichtautologen Proteinbestandteile und wegen des Risikos von viralen Verunreinigungen.
Kürzlich wurde die Verwendung zur Hauttransplantation von anderen, von Hyaluronsäure abgeleiteten Produkten bekannt, deren Material sich durch großen Biokompatibilität und Bioabbaubarkeit (Benedetti et al., Biomaterials, 14 (1993) 1154– 1160; Cortivo R. et al., Biomaterials, 12 (1991) 727–730) und dem Fehlen von Immunreaktivität auszeichnet. Da Hyaluronsäure ein Bestandteil der extrazellulären Matrix ist, setzt es vollständig natürliche Fragmente während seines Abbaus im Gewebe frei.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein biologisches Material, welches die folgenden Bestandteile umfaßt:

a) eine leistungsstarke Kultur von autologen oder homologen Knochenmarkstammzellen, die teilweise oder vollständig in Zelllinien eines spezifischen Bindegewebes differenziert sind und die ferner die extrazelluläre Matrix umfaßt, welche von diesem Bindegewebe produziert wird, oder alternativ
a') die extrazelluläre Matrix, die abgesondert wird durch:
– Knochenmarksstammzellen, die teilweise oder vollständig in ein spezifisches Bindegewebe differenziert sind, oder alternativ
– die spezifischen, homologen, reifen Bindegewebszellen, wobei die extrazelluläre Matrix frei von jedweden zellulären Bestandteilen ist,

und b) eine dreidimensionale, biokompatible und bioabbaubare Matrix, welche aus einem Hyaluronsäure-Derivat besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung dieses biologischen Materials.
Wenn das erfindungsgemäße Biomaterial den Bestandteil a) oder den Bestandteil a') enthält, welcher die extrazelluläre Matrix ist, die von den aus teilweise oder vollständig differenzierten Knochenmarksstammzellen stammenden Bindegewebszellen abgesondert wird, umfasst das Verfahren folgenden Schritte:

i) Isolierung dieser homologen oder autologen Stammzellen aus dem Knochenmark,
ii) Transfer dieser isolierten Stammzellen auf die biokompatible, dreidimensionale, aus einem Hyaluronsäureester bestehenden Matrix , und
iii) Züchtung und Entwicklung dieser Stammzellen auf und in den Biomaterialien, in dem das aus dem vorhergehenden Schritt stammende biologische Material in ein Nährmedium getaucht wird, das auch einen Differenzierungsfaktor enthält, sofern die erwünschten Bindegewebszellen nicht Fibroblasten sind, um so das den Bestandteil a) enthaltende biologische Material zu erhalten, und gegebenenfalls
iv) Entfernung des homologen zellulären Bestandteils von a) durch osmotische Lyse, um so das den oben genannten Bestandteil a') enthaltenden biologische Material zu erhalten.

Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen biologischen Materials, welches den von reifen, spezifischen Bindegewebszellen abgesonderten Bestandteil a') enthält, umfaßt folgende Schritte:

i') Isolierung der reifen Zellen aus spezifischem Bindegewebe und deren Züchtung unter herkömmlichen und spezifischen Wachstumsbedingungen in Abhängigkeit von den spezifischen, reifen Bindegewebszellen,
ii') Überführung dieser reifen Bindegewebszellen auf die dreidimensionale, aus einem Hyaluronsäure-Derivat bestehende Matrix,
iii') Züchtung und Entwicklung dieser Bindegewebszellen auf und in dieser dreidimensionalen Matrix,
iv') Entfernung der zellulären Bestandteile mittels osmotischer Lyse.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung dieser biologischen Materialien bei Gewebetransplantationen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1: stellt die immunohistochemische Markierung von Kollagen I mit monoklonalen Antikörpern (Avidin/Biotin; 200x) dar von:

A: HYAFF^R 11 Vliesgewebe, welches mit humanen Fibroblasten aus Knochenmarksmesenchym geimpft wurde. Nach zwei Wochen Kultivierung kann die Gegenwart von Typ I Kollagen beobachtet werden.
B: HYAFF^R 11, welches humane Fibroblasten mit dermaler Herkunft enthält. Auch in diesem Fall fällt die Reaktion deutlich positiv aus.

2: stellt die immunohistochemische Markierung von Kollagen III mit monoklonalen Antikörpern (Avidin/Biotin; 200x) dar von:

A: HYAFF^R 11 mit mesenchymen Knochenmarksfibroblasten; zwei Wochen nach dem Impfen zeigt sich eine deutliche, positive Reaktion.
B: HYAFF^R 11 mit dermalen Fibroblasten zwei Wochen nach dem Impfen, es zeigt sich eine deutliche, positive Reaktion.

3: stellt die immunohistochemische Markierung von Antikollagen N mit monoklonalen Antikörpern (Avidin/Biotin; 100x) dar von:

A: HYAFF^R 11 mit mesenchymen Knochenmnarksfibroblasten zwei Wochen nach dem Impfen
B: HYAFF^R 11 mit dermalen Fibroblasten nach zwei Wochen in der Kultur

Die beiden verschiedenen Arten von Fibroblasten stoßen Kollagen N auf die gleiche Weise aus.
4: stellt die immunohistochemische Markierung von Fibronektin mit monoklonalen Antikörpern (Avidin/Biotin; 100x) dar von:

A: HYAFF^R 11 mit Knochenmarksfibroblasten zwei Wochen nach dem Impfen
B: HYAFF^R 11 mit dermalen Fibroblasten nach zwei Wochen in der Kultur

Es wird bei beiden Arten von Fibroblasten eine positive Immunreaktion festgestellt.
5: immunohistochemische Markierung von Laminin mit monoklonalen Antikörpern (Avidin/Biotin; 200x) dar von:

Die Gegenwart von Laminin ist in beiden Arten von Kulturen sehr deutlich erkennbar.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Vorzugsweise ist das Hyaluronsäure-Derivat, welches die dreidimensionale Matrix des erfindungsgemäßen biologischen Materials bildet, ein Hyaluronsäureester wie im US-Patent 4 851 521 beschrieben, welches wir hier durch das Zitat einschließen.
Mehr vorzuziehen ist ein Benzylester als Hyaluronsäureester, mit einem Veresterungsgrad zwischen 25 und 100%.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführung werden Hyaluronsäurebenzylester verwendet, deren Veresterungsgrad 75% (HYAFF^R-11p75) bzw. 100% (HYAFF^R-11) beträgt.
Die aus Hyaluronsäure-Derivaten bestehende dreidimensionale Matrix liegt vorzugsweise in Form von Vliesgeweben, Schwämmen, Granulaten, Mikrokugeln, Leitkanälen oder Gazen vor.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführung liegt die dreidimensionale, biokompatible Matrix des erfindungsgemäßen biologischen Materials vorzugsweise in Form von Vliesgewebe vor.
Die Herstellung dieses aus einem Hyaluronsäure-Derivat bestehenden Vliesgewebes und insbesondere des Esters der Hyaluronsäureester wird im Patent US 5 520 916 beschrieben, welches wir hier durch das Zitat einschließen.
Die spezifischen Bindegewebszellen, welche aus der vollständigen oder teilweisen Differenzierung von in a) enthaltenen Knochenmarksstammzellen stammen, im erfindungsgemäßen biologischen Material werden vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibroblasten, Osteoblasten, Myoblasten, Adipozyten, Chondrozyten und Endothelzellen.
Wenn also a) Chondrozyten enthält, welche Knorpelgewebe bilden können, kann das erfindungsgemäße biologische Material zur Bedeckung von Gebieten mit Knorpelabrieb oder degeneriertem Knorpel verwendet werden.
Wenn a) Osteoblasten enthält, welche Knochengewebe bilden können, kann das erfindungsgemäße biologische Material in Fällen von Knochensubstanzverlust verwendet werden.
Wenn a) Fibroblasten enthält, wird das erfindungsgemäße biologische Material auf die beschädigte Haut transplantiert b) wird innerhalb einer gegebenen Zeit dank seiner Bioabbaubarkeit absorbiert und läßt so neugebildetes Hautgewebe auf der Stelle zurück.
Wenn autologe Bindegewebszellen auf die aus dem Hyaluronsäure-Derivat bestehende Matrix geimpft werden, können diese in dem neugebildetem Bindegewebe verbleiben und durch verschiedene Wachstumsfaktoren und durch die extrazelluläre Matrix, welche sie absondern, zur Wundheilung beitragen.
Wenn nur Bindegewebe aus der teilweisen oder vollständigen Differenzierung von homologen Knochenmarksstammzellen oder homologes, reifes Bindegewebe zugänglich ist, fand der Anmelder, dass es mit dem biologischen Material, welches den Bestandteil a') anstatt von Bestandteil a) enthält, möglich ist, unerwünschte immunologische Reaktionen zu vermeiden.
Daher können gemäß einer bevorzugten Ausführung die Bindegewebszellen, welche die extrazelluläre Matrix in diesem biologischem Material produzieren, von homologen, teilweise oder vollständig differenzierten Knochenmarksstammzellen oder von homologem, reifen Bindegewebe abstammen. Die homologen, reifen Bindegewebszellen, welche den Bestandteil a') absondern, können aus der Gruppe bestehend aus Fibroblasten, Osteoblasten, Myoblasten, Adipozyten, Chondrozyten und Endothelzellen ausgewählt werden.
Reife Fibroblasten können durch dermales Gewebe, welches entweder aus einer Autopsie oder einer Biopsie stammt, isoliert werden, reife Chondrozyten aus Autopsie-Knorpel, reife Osteoblasten aus Biopsiefragmenten von Knochengewebe, reife Muskelzellen aus Biopsiefragmenten von Muskelgewebe, reife Endothelzellen aus Biopsiefragmenten von kleinen Gefäßen oder aus der Haut selbst und reife Adipozyten aus Biopsiefragmenten von Fettgewebe.
Daher kann das erfindungsgemäße biologische Material, welches den Bestandteil a') enthält, für die gleichen Zwecke verwendet werden, wie sie für das den Bestandteil a) enthaltende biologische Material überlegt wurden.
Insbesondere kann das erfindungsgemäße biologische Material, sowohl wenn es den Bestandteil a), welcher Fibroblasten aus der teilweisen oder vollständigen Differenzierung von Knochenmarksstammzellen enthält, als auch wenn es den Bestandteil a') enthält, welcher entweder durch homologe oder reife Fibroblasten oder durch aus homologen, teilweise oder vollständig differenzierten Stammzellen stammenden Fibroblasten abgesondert wird, als Substrat für das in vitro Impfen von autologen oder homologen Keratinozyten für eine nachfolgende Transplantation verwendet werden.
Dieses biologische Material ist geeignet für die Verwendung als dermaler Ersatz bei Hautverletzungen, wenn Substanz verloren wurde.
Bei dem Verfahren zur jeweiligen Herstellung des biologischen Materials, welches den Bestandteil a) oder alternativ den Bestandteil a') enthält, welcher durch homologe, mittels teilweiser oder vollständiger Differenzierung von Knochenmarksstammzellen erhaltenen Bindegewebszellen abgesondert wird, umfasst Schritt i) vorzugsweise folgende Arbeitsbedingungen:

1) Absaugen des Knochenmarks aus der Crista iliaca oder dem Kopf des Femur;
2) Behandlung der Flüssigkeit aus Schritt 1) in Gegenwart von Hank's Lösung bei +4°C und Zentrifugieren der so erhaltenen Mischung;
3) Entfernen der überstehenden Flüssigkeit und der Fettschicht durch Absaugen;
4) Entfernen der überschüssigen Erythrozyten unter Verwendung eines Percoll- oder Ficoll-Gradienten, um so die Mesenchymzellfraktion zu erhalten;
5) Zentrifugieren der mesenchymen Fraktion und Rückgewinnung der festen Phase;
6) Resuspendieren des Feststoffes in einem Nährmedium, welches α-MEM mit einem Zusatz von 10% fetalem Kälberserum, 1% L-Glutamin 200mM, 1% Penicillin/Streptomycin 10.000 U/10000 μm/ml enthält;
7) Impfen in einer Petrischale mit einer Dichte von 50 – 100·10⁶ Zellkerne/Schale;
8) Inkubieren der Zellen in dem Medium für 72 Stunden und Austausch des Mediums um die nicht gebundenen Zellen zu entfernen.

Schritt ii) dieses Verfahrens wird vorzugsweise gemäß der folgenden Arbeitsbedingungen ausgeführt:

1') Ablösen der Zellen der in den Schalen gebildeten Kolonien unter Verwendung herkömmlicher Methoden wie Behandlung mit Trypsin;
2') Ausplattieren dieser Zellen mit einer Dichte vorzugsweise zwischen 1·10⁴ – 5·10⁴ Zellen/cm² auf neue Petrischalenkulturen, welche bereits eine Anzahl von Stücken der dreidimensionalen, aus einem Hyaluronsäure-Derivat bestehenden Matrix enthalten, welche auf den Schalen durch Zugabe von humanem Plasmafibrin zur Grenzfläche Hyaluronsäure-Derivat – Petrischale haften.

Das in Schritt iii) verwendete Medium wird in Abhängigkeit von der Art der Differenzierung ausgewählt, der die Knochenmarksstammzellen unterzogen werden soll.
Wenn die Stammzellen zum Beispiel teilweise oder vollständig in Fibroblasten differenziert werden sollen, enthält das Medium keinerlei Differenzierungsfaktor, sondern vorzugsweise Fibroblastenwachstumsfaktoren wie bFGF (basic Fibroblast Growth Factor).
In diesem Fall entsteht eine teilweise Differenzierung bereits, bevor die Stammzellen auf die dreidimensionale Matrix überführt werden.
Wenn die Stammzellen teilweise oder vollständig in Chondrozyten differenziert werden sollen, ist das Medium vorzugsweise α-MEM mit einem Zusatz von 10% fetalem Kälberserum, 1% L-Glutamin 200 mm, 1% Penicillin/Streptomycin 10.000 U/10.000 μg/ml, 50 μg/ml/Tag Ascorbinsäure, 100–1000 nM Dexamethason. Dieses Medium wird vorzugsweise zweimal pro Woche ausgetauscht. Alternativ enthält das Medium Ham's F12 mit einem Zusatz von 10% fetalem Kälberserum, 1% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin/Streptomycin 10.000 U/10.000 μm/ml, 50 μg/ml/Tag Ascorbinsäure, 2 Ethanol.
Wenn die Stammzellen teilweise oder vollständig in Osteoblasten differenziert werden sollen, wird Schritt ii), nämlich der Transfer der Stammzellen auf die dreidimensionale Matrix, auf der Matrix ausgeführt, die im Voraus mit Hydroxylapatit enthaltendem Wasser behandelt wurde.
In diesem Fall ist das für Schritt iii) zu erwägende Medium α-MEM mit einem Zusatz von 10% fetalem Kälberserum, 1% L-Glutamin 200 mm, 1% Penicillin/Streptomycin 10.000 U/10.000 μg/ml, 50 μg/ml/Tag Ascorbinsäure, 10–100 nM Dexamethason.
Der Schritt iv), nämlich die osmotische Lyse, um den Bestandteil a') zu erhalten, wird vorzugsweise unter Verwendung einer Lösung mit 5% Deoxycholat ausgeführt. Auch bei dem Verfahren zur Herstellung des biologischen Materials, welches den durch reife Bindegewebszellen abgesonderten Bestandteil a') enthält, wird Schritt iv), nämlich die osmotische Lyse, vorzugsweise unter Verwendung der vorgenannten Deoxycholat-Lösung ausgeführt. Das erfindungsgemäße biologische Material kann kryokonserviert werden, so dass eine Gewebebank zur Versorgung mit Transplantationsmaterialien oder für Träger für Keratinozytenkulturen aufgebaut werden kann.
Als Folge daraus umfassen diese Verfahren zur Herstellung der obenerwähnten biologischen Materialien weiterhin einen abschließenden Kryokonservierungsschritt des erhaltenen biologischen Materials auf herkömmliche Weise.
Im Folgenden stellen wir ausschließlich zu Erläuterungszwecken einige Beispiele für die Charakterisierung von neugebildetem Gewebe vor.
Beispiel 1 Isolierung und Kultivierung von Stammzellen
Etwa 5–10 ml Knochenmark wird aus der Crista iliaca oder dem Kopf des Femur abgesaugt.
Die Flüssigkeit, welche auch Knochenfragmente des Stroma enthält, wird in eine sterile 50 ml Röhre gefüllt und mit 20–25 ml Hank's Lösung bei +4°C versehen. Die Röhre wird mit etwa 1000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit und die Fettschicht zu beseitigen, die dann abgesaugt wird. Der Erythrozytenüberschuß wird unter Verwendung eines Percoll- oder Ficoll-Gradienten beseitigt, und danach wird die Fraktion, welche die Mesenchymzellen enthält, entfernt und mit 1000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Die Pellet wird resuspendiert, entfernt und in 5 ml Nährmedium (α-MEM mit einem Zusatz von 10% fetalem Kälberserum, 1% L-Glutamin 200 mm, 1% Penicillin/Streptomycin 10.000 U/10.000 μg/ml) zentrifugiert und in Petrischalen mit einem Durchmesser von 100 mm mit einer Dichte von 50–100·10⁶ Zellkernen/Schale geimpft.
Beispiel 2 Überführung der Stammzellen in eine aus HYAFF^R 11 und HYAFF11 P75 bestehende, dreidimensionale Matrix und Differenzierung der Stammzellen in Fibroblasten
Die Zellen werden dann 72 Stunden lang inkubiert (37°C, pCO₂ etwa 5%), danach wird das Medium ausgetauscht, um die nicht gebundenen Zellen zu entfernen. Die auf der Schale verbleibenden Mesenchymzellen können durch weitere Zuchtphasen vermehrt werden (im allgemeinen eine Teilungsrate von 1 : 3) und sie werden auf eine Matrix aus Vliesgewebe aus HYAFF^R-11 und HYAFF^R 11p75 unter Zugabe von Wachstumsfaktor bFGF (lng/ml) zum Nährmedium überführt. Einige Zeit später (1–2 Wochen) fangen die Zellen im Biomaterial an, wie Fibroblasten auszusehen, und mit der Produktion von typischen Molekülen des Bindegewebes (Kollagen Typ I, II, III, IV, Fibronektin, Laminin) für Fibroblasten typische Phänotypen auszustoßen.
Beispiel 3
Herstellung einer Dermis α, die enthält:

– Fibroblasten aus Knochenmarksstammzellen
– eine dreidimensionale Matrix bestehend aus HYAFF^R 11 Vliesgewebe

einer Dermis α', die enthält.

– Fibroblasten aus humaner Dermis
– eine dreidimensionale Matrix bestehend aus HYAFF^R 11 Vliesgewebe

einer Dermis β die enthält:

– Fibroblasten aus Knochenmarksstammzellen
– eine dreidimensionale Matrix bestehend aus HYAFF^R 11p75 Vliesgewebe

einer Dermis β' die enthält:

– Fibroblasten aus humaner Dermis
– eine dreidimensionale Matrix bestehend aus HYAFF^R 11p75 Vliesgewebe

Gewebestücke (1,5 × 1,5 cm) bestehend aus HYAFF^R 11 p75 wie auch aus HAYFF^R 11 werden getrennt auf Kulturschalen mittels eines Fibrinklumpens befestigt. Humane Fibroblasten, die aus Hautexplantaten oder aus wie in Beispiel 1 beschrieben isolierten und gezüchteten Mesenchymstammzellen aus Knochenmark erhalten wurden, werden getrennt auf das Biomaterial mit einer Dichte von 10⁴ Zellen/cm² in 0,2 ml Medium geimpft, wobei das Biomaterial langsam getränkt wird. Nach etwa 30 Minuten wird DMEM, ein Nährmedium mit 10% fetalem Kälberserum und 50 μg/ml 1-Ascorbinsäure, zugegeben und die Schalen bei 37°C inkubiert.
Das Medium wird alle 48 Stunden ausgetauscht und die Kulturen werden unter einem Phasenkontrast-Mikroskop untersucht.
Die aus HYAFF^R 11 p75 hergestellten Biomaterialstücke können nur 7 Tage lang kultiviert werden, denn es wurde festgestellt, dass sich das Biomaterial bei Fibroblasten-Kulturen auf HYAFF^R 11 p75 nach 7 Tagen im Medium aufzulösen beginnt. HYAFF-11 andererseits kann viel länger kultiviert werden (etwa 6 Wochen). In diesem Fall werden die Stücke aus HYAFF-11 mit den Zellen für Zeiträume von 7,14 und 21 Tage inkubiert.
Am Ende der Kultivierungsdauer werden die Matrizes aus den Hyaluronsäurebenzylestern HYAFF^R 11 p75 und HYAFF^R 11, welche die Fibroblasten aus Stammzellen enthalten, und die entsprechenden, welche Fibroblasten aus humaner Haut enthalten, ohne Verwendung von lytischen Enzymen abgelöst und in zwei Teile geteilt.
Der eine Teil wird für routinemäßige histologische Untersuchungen in Formalin fixiert und der andere wird in flüssigem Stickstoff eingefroren und für eine nachfolgende immunohistochemische Untersuchung gelagert.
Die in Formalin fixierten Stücke werden mit Hämatoxylin/Eosin oder mit der van Gieson-Methode angefärbt, während gefrorenes Material immunohistochemisch mit mono- oder polyklonalen Antikörpern gefärbt wird, um die Gegenwart von Fibronektin, Kollagen I, II und IV sowie Laminin nachzuweisen.
Ergebnisse der histologischen Färbung
Hämatoxylin/Eosin
In beiden Biomaterialien HYAFF^R 11p75 und HYAFF^R 11 werden längliche Zellen mit der typischen Morphologie von Fibroblasten beobachtet. Vom morphologischen Standpunkt weisen die aus Dermis erhaltenen Fibroblasten und die aus den Mesenchymzellen des Knochenmarks erhaltene Fibroblasten ein ähnliches Aussehen auf. Im Fall des HYAFF^R 11 sind die Fasern des Biomaterials gut erhalten, während die Fasern des HYAFF^R 11p75 Zeichen von Auflösung aufweisen.
Die Analyse des Biomaterials zeigt die Gegenwart eines feinen Netzes von feinen Fibrillen, welche beim Färben mit der Van Gieson-Methode eine blassrosarote Färbung zeigen, was bestätigt, dass es sich um durch die Fibroblasten neusynthetisierten Kollagenfibrillen handelt.
Immunohistochemische Charakterisierung
Die folgenden Antikörper wurden verwendet, um die typischsten Moleküle in der extrazellulären Matrix nachzuweisen:

1) monoklonale Antikörper für humanes Antikollagen I
2) monoklonale Antikörper für humanes Antikollagen III
3) monoklonale Antikörper für humanes Antikollagen IV
4) monoklonale Antikörper für humanes Antifibronektin
5) monoklonale Antikörper für humanes Antilaminin

Die extrazelluläre Matrix, welche sowohl von den aus Dermis wie auch aus dem Knochenmarksmesenchym stammenden Fibroblasten abgeschieden wurde, reagierte positiv auf die obengenannten Immunreaktionen. Insbesondere wurde ein beachtlicher Bestandteil an fibrillärem Kollagen (I und III) wie auch an Kollagen IV beobachtet. Die typischen Adhäsionsmoleküle Fibronektin und Laminin, welche für dermales Gewebe charakteristisch sind, werden eindeutig durch diese Fibroblastenzellen exprimiert, was zeigt, dass eine vollständig extrazelluläre Unterlage in den vom Anmelder verwendeten Matrizes aufgebaut werden kann.
Beispiel 4 Kryokonservierung der wie in Beispiel 3 hergestellten Dermis α und Dermis β
Um die Möglichkeit der Konservierung der künstlichen Dermis aus Stammzellkulturen durch Kaltlagerung zu zeigen, wurden Stücke des die Zellen enthaltenen Biomaterials in Gegenwart eines Kühlmittels (Dimethylsulfoxid, DMSO) eingefroren. Die Kulturen wurden entfernt und in Kapseln, welche DMEM, FCS und 10% DMSO enthielten, gegeben, auf 4°C abgekühlt und 5 Minuten später auf –80°C gefroren.
Eine Woche später werden die Stücke aus HYAFF^R 11p75 aufgetaut und schnell auf 37°C erwärmt und einige Male mit DMEM mit 10% FCS gewaschen, um DMSO zu entfernen. Sie werden 24 Stunden lang in einem Inkubator gelassen und danach werden die Kulturen auf neue Stücke aus HYAFF^R 11p75 Biomaterial in der gleichen Größen gegeben, welche auf Petrischalen befestigt wurden. Dieser Schritt ist notwendig, um die Zellen mit einem neuen Träger zu versorgen, da das ursprüngliche Vliesgewebe sich nach 7 Tagen im Medium aufzulösen beginnt.
Die Stücke aus HYAFF^R 11 werden dagegen für die Kultur nach dem Einfrieren unter den obengenannten Bedingungen wiederverwendet. Alle aufgetauten Biomaterialien werden 7 Tage lang kultiviert und dann wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert. Diese neuen Ergebnisse ähneln denen, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, und die Untersuchungen, die mit einer Trypan-Blau-Färbung durchgeführt wurden, zeigen, dass die in der HYAFF^R 11-Matrix vorkommenden Zellen nach dem Auftauen immer noch wachstumsfähig sind.
Die Abbildungen 1–5/A–B zeigen histologische Fotografien von HYAFF^R 11-Vliesbiomaterial, in welches humane Fibroblasten aus Knochenmark und Dermis geimpft wurde. Jede Abbildung beschreibt die relative Immununlokalisierung von Kollagen I, III und IV sowie Fibronektin und Laminin. Die verschiedenen aus HYAFF^R 11 und HYAFF^R 11p75 hergestellten Biomaterialien (Gaze, Schwämme, Membranen) unterscheiden sich in keiner Weise von einander, was das Fibroblastenwachstum und die Ausscheidung der extrazellulären Matrix angeht.
Beispiel 5 Biologisches Material aus der Lyse der zellulären Bestandteile der Dermis α α', β und β'
Die Möglichkeit, Matrizes von künstlicher Dermis in vitro durch die oben beschriebene Methode zu erhalten, mit nachfolgendem Entfernen des zellulären Bestandteils, wurde folgendermaßen ermittelt:
Nach dem in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Kultivierungsverfahren, werden die Stücke aus dem HYAFF^R Biomaterial mit destilliertem Wasser und dann mit 5%-igem Natriumdeoxycholat behandelt, um die vorliegenden Fibroblasten aufzuschließen. Diese beiden Behandlungen führen zu zellulärer Lyse und der Auflösung der Membranen und lässt dabei den extrazellulären Bestandteil mehr oder weniger intakt. Nach dieser Behandlung wird eine histologische und immunhistologische Untersuchung der Stücke des Biomaterials durchgeführt, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben.
Färben der extrazellulären Matrix mit den spezifischen Antikörpern zeigt, dass das Verfahren des Entfernens der zellulären Komponenten den Aufbau oder die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix nicht verändert, welche in jeder Hinsicht dem Ausgangsmaterial vor der Zellentfernung ähnelt.
Beispiel 6 Bedingungen für die Förderung der Stammzellendifferenzierung in Richtung Chondrogenese
Stammellen, die wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert wurden, werden auf Matrizes aus HYAFF^R 11 Vliesgewebe gegeben und in einem Nährmedium mit einer speziellen Zusammensetzung gezüchtet: α-MEM mit einem Zusatz von 10% fetalem Kälberserum, 1% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin/Streptomycin 10.000 U/10.000 μg/ml, 50 μg/ml/Tag Ascorbinsäure und 100–1.000 nM Dexamethason. Die Zellen werden in hohen Konzentration aufgeimpft („mass culture"-Technik): mit einer mittleren Dichte von 5·10⁴ Zellen/cm². Das Nährmedium wird normalerweise zweimal pro Woche ausgetauscht. Alternativ kann folgendes Medium verwendet werden: Ham's F12 mit einem Zusatz aus fetalem Kälberserum, 1% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin/Streptomycin 10.000 U/10.000 μg/ml, 50 μg/ml/Tag Ascorbinsäure und 2% Ethanol.
Geeignete Phänotypen-Expression (Chondrozyten) wird folgendermaßen kontrolliert:

– morphologische Beobachtung mit einem optischen Mikroskop;
– spezifische Färbung der histologischen Spezies mit Alzian-Blau, Toluidin-Blau und monoklonalen Antikörpern des Typ II Antikollagens;
– Quantifizierung der überstehenden Flüssigkeit für die Herstellung von Glykosaminoglykanen und Typ II Kollagen.

Sowohl in dem Nährmedium mit einem Zusatz an Dexamethason wie auch in dem mit einem Zusatz an Ethanol, kann ein hoher Grad an Differenzierung der Stammzellen zu Chondrozyten beobachtet werden.
Beispiel 7 Bedingungen für die Förderung der Stammzellendifferenzierung in Richtung Osteogenese
Um eine Differenzierung in Richtung Osteogenese zu fördern, werden Mesenchymstammzellen auf HYAFF^R 11 Vliesgewebe im folgenden Nährmedium gezüchtet: α-MEM mit einem Zusatz von 10% fetalem Kälberserum, 1% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin/Streptomycin 10.000 U/10.000 μg/ml, 50 μg/ml/Tag Ascorbinsäure und 10–100 nM Dexamethason.
Vor dem Ausimpfen wird das HYAFFR 11 Material 12 bis 24 Stunden lang mit Wasser behandelt, das Hydroxylapatit enthält. Das Nährmedium wird normalerweise zweimal pro Woche ausgetauscht.
Geeignete Phänotypen-Expression (Osteozyten) wird folgendermaßen kontrolliert:

– morphologische Beobachtung mit einem optischen Mikroskop;
– spezifische Färbung der histologischen Spezies nach Von Kossa;
– histochemische Färbung, um die Gegenwart von alkalischer Phosphatase-Aktivität sichtbar zu machen.

Unter diesen experimentellen Bedingungen kann beobachtet werden, wie die Gegenwart von Hydroxylapatit-Kristallen im HYAFF^R 11 die Mesenchymzellen zur Differenzierung in Osteozyten anregt.

Claims

Ein Biomaterial, welches die beiden folgenden Komponenten enthält: a) eine leistungsstarke Kultur von autologen und homologen Knochenmarksstammzellen, welche partiell oder vollständig in Zelllinien eines spezifischen Bindegewebes differenziert sind, und die durch die besagten Bindegewebszellen erzeugte extrazelluläre Matrix, oder alternativ a') die extrazelluläre Matrix, die abgesondert wird durch: – die besagten Knochenmarksstammzellen, welche partiell oder vollständig in Zelllinien eines spezifischen Bindegewebes differenziert sind, oder – die spezifischen reifen Bindegewebszellen, wobei die besagte extrazelluläre Matrix frei von jedweden zellulären Bestandteilen ist, und b) eine dreidimensionale, biokompatible und bioabbaubare Matrix bestehend aus Hyaluronsäure-Derivaten, die dadurch gekennzeichnet ist, dass besagte Stammzellen, welche partiell oder vollständig in eine Zelllinie eines spezifischen Bindegewebes differenziert sind (a), oder besagte reife Bindegewebszellen, die für die Herstellung von (a') verwendet werden, auf und in der besagten dreidimensionalen Matrix gezüchtet und entwickelt werden.
Das Biomaterial nach Anspruch 1, wobei die Komponente (b) in Form von Vliesgewebe, Schwämmen, Granulat, Mikrokugeln, Leitkanälen und Gaze vorliegt.
Das Biomaterial nach Anspruch 2, wobei die Komponente (b) in Form von Vliesgewebe vorliegt.
Das Biomaterial nach den Ansprüchen 1–3, wobei besagtes Hyaluronsäure-Derivat ein Hyaluronsäureester mit einem Veresterungsgad zwischen 25 und 100% ist.
Das Biomaterial nach Anspruch 4, wobei die verwendeten Hyaluronsäurebenzylester einen Veresterungsgrad von 75% beziehungsweise 100% aufweisen.
Das Biomaterial nach den Ansprüchen 1–5, wobei die besagte extrazelluläre Matrix von (a') durch eine homologe Zellkultur abgesondert wird.
Das Biomaterial nach den Ansprüchen 1–6, wobei die besagten Knochenmarksstammzellen partiell oder vollständig in spezifische Bindegewebszellen aus der Gruppe der Fibroblasten, Oteoblasten, Myoblasten, Adipozyten, Chondrozyten und Endothelzellen differenziert sind.
Das Biomaterial nach Anspruch 7, wobei besagte Knochenmarksstammzellen partiell oder vollständig in Chondrozyten zur Verwendung für die Bedeckung von Gebieten mit Knorpelabrieb oder degeneriertem Knorpel differenziert sind.
Das Biomaterial nach Anspruch 7, wobei die besagten Knochenmarksstammzellen partiell oder vollständig in Osteoblasten zur Verwendung bei Fällen von Knochensubstanzverlusten differenziert sind.
Das Biomaterial nach Anspruch 7, wobei die besagten Knochenmarksstammzellen partiell oder vollständig in Fibroblasten zur Verwendung als Substrat für die in vitro Impfung von autologen oder homologen Keratinozyten für die nachfolgende Transplantation differenziert sind.
Das Biomaterial nach Anspruch 7, wobei die besagten Knochenmarksstammzellen partiell oder vollständig in Fibroblasten zur Verwendung als Hautersatz zur Versorgung von Hautverletzungen differenziert sind.
Das Biomaterial nach den Ansprüchen 1–6, wobei besagte reife Bindegewebszellen, welche die extrazelluläre Matrix (a') ausscheiden, aus der Gruppe bestehend aus Fibroblasten, Osteoblasten, Myoblasten, Adipozyten, Chondrozyten und Endothelzellen ausgewählt werden.
Das Biomaterial nach Anspruch 12, wobei die Komponente (a') von Osteoblasten zur Verwendung für die Bedeckung von Gebieten mit Knorpelabrieb oder degeneriertem Knorpel abgesondert wird.
Das Biomaterial nach Anspruch 12, wobei die Komponente (a') von Osteoblasten zur Verwendung bei Fällen von Knochensubstanzverlusten abgesondert wird.
Das Biomaterial nach Anspruch 12, wobei die Komponente (a') von Fibroblasten zur Verwendung als Substrat für die in vitro Impfung von autologen oder homologen Keratinozyten für die nachfolgende Transplantation abgesondert wird.
Das Biomaterial nach Anspruch 12, wobei die Komponente (a') von Fibroblasten zur Verwendung als Hautersatz zur Versorgung von Hautverletzungen abgesondert wird.
Ein Verfahren zur Herstellung von biologischem Material nach den Ansprüche 1 –11, welches die Komponente (a) oder die Komponente (a') enthält, welche durch Bindegewebszellen abgesondert wird, die durch die partielle oder vollständige Differenzierung von Knochenmarksstammzellen erhalten werden, das folgende Schritte umfasst: i) Isolierung der besagten autologen oder homologen Stammzellen aus dem Knochenmark, ii) Transfer der besagten isolierten Stammzellen auf besagte biokompatible, dreidimensionale Matrix bestehend aus einem Hyaluronsäureester, und iii) Züchten der besagten Stammzellen auf und in den Biomaterialien in einem Medium, das in Abhängigkeit vom Typ der Differenzierung, der die Knochenmarksstammzellen unterzogen werden, gewählt wird, um so das die Komponente (a) enthaltende Biomaterial zu erhalten, iv) Entfernen der zellulären Komponente von (a) durch osmotische Lyse, um so das die oben erwähnte Komponente (a') enthaltende Biomaterial zu erhalten.
Ein Verfahren nach Anspruch 17, wobei Schritt i) folgende Arbeitsbedingungen umfasst: 1) Absaugen des Knochenmarks aus der Crista iliaca oder dem Kopf des Femurs, 2) Behandlung der in Schritt (1) gewonnenen Flüssigkeit in Gegenwart von Hanks Lösung bei +4°C und Zentrifugieren der Mischung, 3) Entfernen der überstehende Fraktion und der Fettschicht durch Absaugen, 4) Entfernen der überschüssigen Erythrozyten unter Verwendung eines Percoll- oder Ficoll-Gradienten, um so die Mesenchymalzellfraktion zu erhalten, 5) Zentrifugieren der Mesenchymalzellfraktion und Rückgewinnung der festen Phase, 6) Resuspendierung der festen Phase in 5 ml Kulturmedium (alpha-MEM mit einem Zusatz von 10% fetalem Kälberserum, 1% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin/Streptomycin), 7) Impfung einer Petrischale mit einer Dichte von 50–100A10⁶ Zellen pro Schale, 8) Inkubation der Zellen im Medium für 72 h und Austausch des Mediums, um die nicht gebundenen Zellen zu entfernen.
Das Verfahren nach Anspruch 17 und 18, wobei Schritt (ii) unter folgenden Arbeitsbedingungen ausgeführt wird: 1') Ablösen der Zellen aus den in den besagten Schalen gebildeten Kolonien unter Verwendung konventioneller Methoden wie die Trypsinisierung, 2') Ausplattieren der besagten Zellen mit einer bevorzugten Zelldichte zwischen 1A10⁴–5A10⁴ Zellen/cm² auf frische Petrischale, welche bereits einige Stücke der dreidimensionalen Matrix bestehend aus einem Hyaluronsäure-Derivat enthalten, wobei das Hyaluronsäure-Derivat durch die Zugabe von Fibrin aus menschlichem Plasma auf die Grenzfläche Hyaluronsäure-Derivat – Petrischale an den Kulturschalen haftet.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 17–19, wobei das Medium das in Schritt (iii) verwendet wird aus einer Gruppe ausgesucht wird, bestehend aus: A) alpha-MEM mit einem Zusatz von 10% fetalem Kälberserum, 1% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin/Streptomycin 10.000 U/10.000 μg/ml; B) alpha-MEM mit einem Zusatz von 10% fetalem Kälberserum, 1% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin/Streptomycin 10.000 U/10.000 μg/ml, 50 μg/ml/Tag Ascorbinsäure, 100–1000 nM Dexamethason; C) Ham's F12 mit einem Zusatz von 10% fetalem Kälberserum, 1% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin/Streptomycin 10.000 U/10.000 μm/ml/Tag, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 2% Ethanol; D) alpha-MEM mit einem Zusatz von 10% fetalem Kälberserum, 1% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin/Streptomycin 10.000 U/10.000 μg/ml, 10–100 nM Dexamethason.
Das Verfahren nach Anspruch 20, wobei das besagte Medium, wenn Stammzellen partiell oder vollständig in Fibroblasten differenziert werden sollen, die Mischung (A) ist, wahlweise mit einem Wachstumsfaktor für Fibroblasten.
Das Verfahren nach Anspruch 20, wobei das besagte Medium, wenn Stammzellen partiell oder vollständig in Chondrozyten differenziert werden sollen, die Mischung (B) ist.
Das Verfahren nach Anspruch 20, wobei das besagte Medium, wenn Stammzellen partiell oder vollständig in Chondrozyten differenziert werden sollen, die Mischung (C) ist.
Das Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Schritt (ii), wenn Stammzellen partiell oder vollständig in Osteoblasten differenziert werden sollen, auf der besagten Matrix ausgeführt wird, welche vorher mit Hydroxylapatit enthaltendem Wasser behandelt wurde, und das Medium die Mischung (D) ist.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 17–24, wobei Schritt (iv) unter Verwendung einer Lösung mit 5% Deoxycholat ausgeführt wird.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 17–25, welches zusätzlich den abschließenden Schritt der Kryokonservierung des erhaltenen Biomaterials umfasst. 27. Ein Verfahren zur Herstellung von Biomaterial nach den Ansprüchen 1–6 und 11–16, welches folgende Schritte umfasst: i') Isolierung der besagten reifen Zellen aus dem spezifischen Bindegewebe und Züchtung unter konventionellen und spezifischen Wachstumsbedingungen in Abhängigkeit von den spezifischen reifen Bindegewebszellen, ii') Transfer der besagten reifen Bindegewebszellen auf die besagte dreidimensionale Matrix bestehend aus einem Hyaluronsäure-Derivat, iii') Züchtung und Entwicklung der besagten Bindegewebszellen auf und in der dreidimensionalen Matrix, iv') Entfernung der zellulären Bestandteile durch osmotische Lyse.
Das Verfahren nach Anspruch 27, wobei Schritt (iv) unter Verwendung einer Lösung mit 5% Deoxycholat ausgeführt wird.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 27 und 28, welches zusätzlich den abschließenden Schritt der Kryokonservierung des erhaltenen Biomaterials umfasst.