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FACHGEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induzierung von
undifferenzierten Zellen zu Osteoblasten mittels eines Wirkstoffs,
der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten (Chondrozyten
mit einer Fähigkeit zur Hypertrophie) hergestellt wird,
unter Verwendung des Verfahrens induzierte (hergestellte) Osteoblasten,
ein die Osteoblasten enthaltendes Medikament oder medizinisches
Material, eine die Osteoblasten und eine extrazelluläre
Matrix enthaltende Zusammensetzung, ein die Osteoblasten und ein
Gerüst enthaltendes Verbundmaterial, und ein die Osteoblasten,
eine extrazelluläre Matrix und ein Gerüst enthaltendes
Verbundmaterial, und ein Verfahren zur Herstellung und ein Verfahren
zur Verwendung davon.
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STAND DER TECHNIK
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Die
Osteogenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Behandlung von Krankheiten,
die mit einer abnehmenden Osteogenese, Knochenverletzungen oder
Knochendefekten einhergehen. Wenn ein Knochengewebe eine Beschädigung
erfährt, wie eine Knochenfraktur oder Exzision aufgrund
eines Knochentumors, proliferieren und differenzieren Osteoblasten,
die knochenbildende Zellen darstellen, unter Bildung von Knochen
und heilen dadurch die Knochenfraktur oder eine Region mit Knochendefekt.
Im Falle einer leichten Verletzung lassen sich durch Immobilisierung
des Knochens in dem betroffenen Bereich die Osteoblasten aktivieren,
so dass der betroffene Bereich geheilt wird.
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Wenn
Osteoblasten unter Umständen, wie komplexe Fraktur, große
Ostektomie-Schäden oder ein Schaden in Verbindung mit Osteomyelitis,
nicht wirksam aktiviert werden können, wird die autologe
Knochenimplantation im Allgemeinen für einen solchen Schaden
oder Defekt als Standardbehandlung für die Reparatur betrachtet.
Wenn ferner die beschädigte Region für eine Reparatur
mit autologem Knochen zu groß ist, kann künstlicher
Knochen zum Teil in Kombination mit autologem Knochen verwendet
werden.
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Allerdings
sind bei Menschen die Quellen für autologen Knochen auf
einen Patienten begrenzt, und die zum Erwerb zur Verfügung
stehende Menge aus dem Patienten ist begrenzt. Außerdem
ist eine zusätzliche Operation zum Erwerb von autologen
Knochen erforderlich und der Erwerb davon geht mit hohen Kosten
und Schmerzen für den Patienten einher. Zusätzlich
verursacht die Verwendung von autologem Knochen einen neuen Knochendefekt
für die Region (normale Knochenregion), aus der der Knochen
stammt.
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Darum
wurden verschiedene chirurgische Behandlungen, wie die Verwendung
eines künstlichen Knochenimplantats und von anderen Knochenersatzmaterialien
eingeführt. Es ist ebenfalls möglich, eine defekte Region
eines biologischen Organismus, wie Knochen, die von einem Trauma
und einer chirurgischen Entfernung eines Knochentumors herrührt,
zu reparieren, indem biologisches Gewebeersatzmaterial, wie ein
Knochenersatzmaterial, in die defekte Region implantiert wird. Hauptsächlich
sind Hydroxylapatit (HAP) oder Tricalciumphosphat (TCP) als das
Knochenersatzmaterial bekannt.
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Im
Vergleich zu autologem Knochen weisen die herkömmlichen
künstlichen Knochenimplantate und Knochenersatzmaterialien
allerdings auch Nachteile auf, wie schlechte Knochenbildung aufgrund
eines schwachen Knochenbildungsvermögens und leichte Brüchigkeit
bei Belastung aufgrund einer geringen Steifigkeit. Darum ist nach
diesen chirurgischen Behandlungen die Prognose oft schlecht und
es werden oft mehrere Operationen benötigt. Obwohl der
Prozentsatz der Verwendung von künstlichem Knochen aus
den obigen Gründen zugenommen hat, bleibt sie immer noch
bei etwa 30%, während autologer Knochen in den restlichen 60
bis 70% der Fälle verwendet wird.
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In
den USA wird oft allogener Knochen verwendet. Andererseits ist bei
Japanern die Verwendung von Leichengewebe unbeliebt und somit wird
Leichengewebe nicht so oft verwendet. Obwohl Knochenbanken eine alternative
Möglichkeit der Bereitstellung von autologem Knochen darstellen,
ist bisher die Entwicklung unzureichend.
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Zur
Behebung der oben aufgeführten Nachteile von herkömmlichem
künstlichem Knochen, wurden bereits Versuche zum Einsatz
der regenerativen Medizin unter Verwendung der Regenerationsfähigkeit
von Zellen zur Anwendung einer Behandlung für eine Region
mit Knochenfraktur oder eine Region mit Knochendefekt unternommen.
Diese Versuche wurden auch zur Erhöhung der post-operativen
Reparaturrate der Region mit Knochendefekt angewandt.
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Stammzellen,
die aus Knochenmark stammen, werden im Allgemeinen bei einer solchen
regenerativen Medizin verwendet. Es wurde vorgeschlagen, ein biologisches
Gewebeersatzmaterial, wie kultivierte Knochen, zu verwenden, das
durch Kultivieren von Knochenmarksstammzellen oder differenzierten
Osteoblasten, die aus einem Patienten stammen, mit einem Knochenersatzmaterial
hergestellt wird. Bei einem solchen biologischen Gewebeersatzmaterial
werden viele Knochenmarksstammzellen oder differenzierte Osteoblasten auf
dem Knochenersatzmaterial als Gerüst zu ihrer Kultivierung
proliferiert.
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Wenn
das biologische Gewebeersatzmaterial in eine Region mit Knochendefekt
implantiert wird, werden die Zellen zusammen mit dem Knochenersatzmaterial
ebenfalls darin implantiert. Dies ermöglicht es, die zuvor
genannten Nachteile von künstlichem Knochen zu kompensieren
und die Osteogenesedauer im Vergleich zu einem Verfahren, bei dem
das Knochenersatzmaterial allein in die Region mit Knochendefekt
implantiert wird, zu verringern.
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Zur
Differenzierung von aus Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammellen
zu Osteoblasten wird unter Verwendung der regenerativen Medizin
herkömmlich ein von Maniatopoulos et al. vorgeschlagenes
Verfahren, bei dem die drei Verbindungen Dexamethason, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure verwendet werden, und ein Verfahren,
bei dem Konzentrationen dieser drei Verbindungen verändert
werden, verwendet.
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Allerdings
sind diese Verfahren künstlich und nicht natürlich.
(Nicht-Patentdokument 1, d. h., Maniatopoulos et al.: Bone
formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of
young adult rats. Cell Tissue Res, 254: 317–330, 1988.).
Unter den Stammzellen gibt es noch immer Zellen, durch diese drei
Verbindungen nicht differenziert wurden. Als Folge besteht das Verlangen
nach Eigenschaft und Funktion von differenzierten Osteoblasten.
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Darum
bedarf es der Bereitstellung von sicheren, kostengünstigen
und stabilen Osteoblasten zur Behandlung von Krankheiten, die mit
der abnehmenden Osteogenese, Knochenverletzungen oder Knochendefekten
einhergehen.
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Es
wird angenommen, dass BMP (knochenmorphogenetisches Protein)-2,
BMP-4 und BMP-7 durch Induktion von Osteoblasten bei der Osteogenese
eine bedeutende Rolle spielen. Es wird angenommen, dass BMP-2, BMP-4
und BMP-7 zu Osteoblasten induzieren. Obwohl es in der BMP-Familie
viele Familienmitglieder gibt, stellen von BMP-2-, BMP-4- und BMP-7
verschiedene Moleküle Homologe dar, die basierend auf einer
zuvor identifizierten Sequenz von BMP-2 ohne Rücksicht
auf ihre Funktion erhalten wurden. Daher verfügen die Homologen
nicht immer über die Fähigkeit, die Differenzierung
zu Osteoblasten zu induzieren.
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Es
wird beschrieben, dass BMP-2, BMP-4 und BMP-7 die Osteoblasten wirksam
in Mäusen und Ratten induzieren, jedoch beträgt
die Wirksamkeit nur ein Tausendstel von derjenigen im Menschen (Nicht-Patentdokumente
2 bis 5, d. h., Wozney, J. M. et al.: Novel Regulators of
Bone Formation: Molecular Clones and Activities. Science, 242: 1528–1534,
1988.; Wuerzler K. K. et al.: Radiation-Induced
Impairment of Bone Healing Can Be overcome by Recombinant Human
Bone Morphogenetic Protein-2. J. Craniofacial Surg., 9: 131–137, 1998.; Govender
S. et al.: Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 for treatment
of Open Tibial Fractures. J. Bone Joint Surg., 84A: 2123–2134,
2002.; Johnsson R. et al.: Randomized Radiostereometric Study
Comparing Osteogenic Protein-1 (BMP-7) and Autograft Bone in Human
Noninstrumented Posterolateral Lumber Fusion. Spine, 27: 2654–2661,
2002).
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Der
vorliegende Erfinder hat festgestellt, dass die Osteogenese aufgrund
von intrakartilaginärer Ossifikation durch BMP-Implantation
in Heterotopien induziert wird. Wozney et al.,
die BMP klonierten, verwendeten den Ausdruck ”Knorpel-induzierende
Aktivität” beim Messen der BMP-Aktivität
(Nicht-Patentdokument 2, d. h., Wozney, J. M. et al.: Novel
Regulators of Bone Formation: Molecular Clones and Activities. Science,
242: 1528–1534, 1988).
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Mit
dieser Feststellung berücksichtigte der vorliegende Erfinder,
dass die Osteogenese nicht direkt von BMP-2, BMP-4 und BMP-7 induziert
wird, sondern von Osteoblasten induziert wird, die durch einen Wirkstoff differenziert
werden, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt
wird, die durch BMP-2, BMP-4 und BMP-7 induziert werden (Nicht-Patentdokumente
6 und 7, d. h., Hiroyuki Okihana: seichonankotsu no seisansuru
kotsukeiseiinshi [an osteogenesic agent produced by growth cartilage],
igaku no ayumi [Journal of Clinical and Experimental Medicine],
165: 419, 1993.; Okihana, H. & Shimomura, Y: Osteogenic Activity
of Growth Cartilage Examined by Implanting Decalcified and Devitalized
Ribs and Costal Cartilage Zone, and Living Growth Cartilage Cells.
Bone, 13: 387–393, 1992).
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Ein
peptiderger Wirkstoff oder ein aus einem biologischen Organismus
stammender Wirkstoff mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder
mehr, der die Induktion, Chemotaxis und Aktivierung von Osteoblasten direkt
beeinflusst, war jedoch unbekannt.
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Das
Patentdokument 1 (
offengelegte
japanische Patentanmeldung Nr. 2004-305259 ) offenbart ein Verfahren
zur Herstellung für ein biologisches Gewebeersatzmaterial.
Das Verfahren umfasst das Anheften von Stammzellen an ein biologisches
Gewebeersatzmaterial, das Induzieren der Differenzierung der Stammzellen,
wodurch die Wirkung der Bildung eines biologischen Gewebes unter
Verwendung des biologischen Gewebeersatzmaterials als Gerüst
hervorgerufen wird, und die Behandlung zur Devitalisierung der gebildeten Gewebezellen.
Das Patentdokument 1 offenbart, dass die Stammzellen an dem biologischen
Gewebeersatzmaterial anhaften und dann zu Osteoblasten differenziert
werden.
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Das
Patentdokument 1 offenbart ferner, dass die Differenzierung induzierende
Wirkstoffe, wie ein essentielles Minimalmedium, fötales
Kälberserum (FBS), Dexamethason und β-Glycerophosphat
und Nahrungsergänzungsmittel, wie Ascorbinsäure,
mit einem in dieser Kultur zu verwendenden Medium vermischt werden können
und dass ein Medium, mit dem das essentielle Minimalmedium, fötale
Kälberserum (FBS) und Dexamethason vermischt werden, in
einer Zellkultur verwendet wird.
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Jedoch
offenbart das Patentdokument 1 folgendes nicht: ein Verfahren zur
Induzierung von undifferenzierten Zellen zu Osteoblasten mittels
eines Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wird, unter Verwendung des Verfahrens induzierte (hergestellte)
Osteoblasten, eine die Osteoblasten enthaltende Zusammensetzung,
ein die Osteoblasten enthaltendes Verbundmaterial, eine extrazelluläre
Matrix und ein Gerüst und die Tatsache, dass das Verbundmaterial
die Osteogenese in einem biologischen Organismus fördert
und induziert.
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Das
Patentdokument 2 (
offengelegte
japanische Patentanmeldung Nr. 2004-305260 ) offenbart ein Verfahren
zur Herstellung für ein biologisches Gewebeersatzmaterial.
Das Verfahren umfasst das Anheften von Stammzellen an ein biologisches
Gewebeersatzmaterial, das Induzieren der Differenzierung der Stammzellen,
wodurch die Wirkung der Bildung eines biologischen Gewebes unter
Verwendung des biologischen Gewebeersatzmaterials als Gerüst
hervorgerufen wird, und die Behandlung zur Devitalisierung der gebildeten Gewebezellen,
wobei die Behandlung zur Devitalisierung das Einfrieren des biologischen
Gewebeersatzmaterials und das anschließende Trocknen einschließt.
Das Patentdokument 2 offenbart, dass die Stammzellen an dem biologischen
Gewebeersatzmaterial anhaften und dann zu Osteoblasten differenziert
werden.
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Das
Patentdokument 2 offenbart ferner, dass die Differenzierung induzierende
Wirkstoffe, wie ein essentielles Minimalmedium, fötales
Kälberserum (FBS), Dexamethason und β-Glycerophosphat
und Nahrungsergänzungsmittel, wie Ascorbinsäure,
mit einem in dieser Kultur zu verwendenden Medium vermischt werden und
dass ein Medium, mit dem das essentielle Minimalmedium, fötale
Kälberserum (FBS) und Dexamethason vermischt werden, in
einer Zellkultur verwendet wird.
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Jedoch
offenbart das Patentdokument 2 folgendes nicht: ein Verfahren zur
Induzierung von undifferenzierten Zellen zu Osteoblasten mittels
eines Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wird, unter Verwendung des Verfahrens induzierte (hergestellte)
Osteoblasten, eine die Osteoblasten und eine extrazelluläre
Matrix enthaltende Zusammensetzung, ein die Osteoblasten enthaltendes
Verbundmaterial, eine extrazelluläre Matrix und ein Gerüst
und die Tatsache, dass das Verbundmaterial die Osteogenese in einem
biologischen Organismus fördert und induziert.
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Das
Patentdokument 3 (
offengelegte
japanische Patentanmeldung Nr. 2004-49142 ) offenbart ein
Verfahren zur Herstellung von kultiviertem Knochen. Das Verfahren
umfasst folgendes: einen ersten Kultivierungsschritt zum Erhalt
mesenchymaler Stammzellen durch Kultivieren von aus einem Patienten
gewonnener Knochenmarkszellen in einem vorbestimmten Kulturmedium;
einen zweiten Kultivierungsschritt zur Induzierung der Differenzierung
der kultivierten mesenchymalen Stammzellen zu Osteoblasten durch
ihre Kultivierung in einem vorbestimmten knochenbildenden Kulturmedium;
einen Gewinnungsschritt zur Gewinnung der differenzierten Osteoblasten
und eines hergestellten Knochensubstrats; und einen Vermischungsschritt
zum Vermischen der gewonnenen Ostenblasten und des Knochensubstrats
mit Kügelchen aus einem Knochenersatzmaterial.
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Das
Patentdokument 3 offenbart ferner, dass die mesenchymalen Stammzellen
zu den Osteoblasten unter Verwendung eines Mediums differenziert
werden, mit dem die Differenzierung induzierende Wirkstoffe, wie
ein essentielles Minimalmedium, fötales Kälberserum
(FBS), Dexamethason und β-Glycerophosphat und Nahrungsergänzungsmittel,
wie Ascorbinsäure, vermischt werden.
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Jedoch
offenbart das Patentdokument 3 folgendes nicht: ein Verfahren zur
Induzierung von undifferenzierten Zellen zu Osteoblasten mittels
eines Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wird, unter Verwendung des Verfahrens induzierte (hergestellte)
Osteoblasten, eine die Osteoblasten und eine extrazelluläre
Matrix enthaltende Zusammensetzung, ein die Osteoblasten enthaltendes
Verbundmaterial, eine extrazelluläre Matrix und ein Gerüst
und die Tatsache, dass das Verbundmaterial die Osteogenese in einem
biologischen Organismus fördert und induziert.
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Das
Patentdokument 4 (
offengelegte
japanische Patentanmeldung Nr. 2005-205074 ) offenbart ein Verfahren
zur Herstellung eines kultivierten Knochens, indem mesenchymale
Stammzellen, die durch Kultivieren der aus einem Patienten gewonnenen
Zellen erhalten wurden, auf einem Knochenersatzmaterial getragen werden,
und dann die mesenchymalen Stammzellen, die auf dem Knochenersatzmaterial
getragen werden, kultiviert und zu Osteoblasten differenziert werden
oder ein Verfahren zur Herstellung eines kultivierten Knochens,
indem mesenchymale Stammzellen, die durch Kultivieren der aus einem
Patienten gewonnenen Zellen erhalten wurden, zu Osteoblasten differenziert
und dann die Osteoblasten auf einem Knochenersatzmaterial getragen
werden.
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Das
Patentdokument 4 offenbart ferner, dass die mesenchymalen Stammzellen
zu den Osteoblasten unter Verwendung eines Mediums differenziert
werden, mit dem die Differenzierung induzierende Wirkstoffe, wie
ein essentielles Minimalmedium, fötales Kälberserum
(FBS), Dexamethason und β-Glycerophosphat und Nahrungsergänzungsmittel,
wie Ascorbinsäure, vermischt werden. Bei diesem Verfahren
muss der Kulturflüssigkeit zur Kultivierung der dem Patienten
entnommenen Zellen, der Kulturflüssigkeit zur Kultivierung
der mesenchymalen Stammzellen oder der Kulturflüssigkeit
nach Induzierung der Differenzierung der mesenchymalen Stammzellen
zu den Osteoblasten plättchenreiches Plasma zugesetzt werden.
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Jedoch
offenbart das Patentdokument 4 folgendes nicht: ein Verfahren zur
Induzierung von undifferenzierten Zellen zu Osteoblasten mittels
eines Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wird, unter Verwendung des Verfahrens induzierte (hergestellte)
Osteoblasten, eine die Osteoblasten und eine extrazelluläre
Matrix enthaltende Zusammensetzung, ein die Osteoblasten enthaltendes
Verbundmaterial, eine extrazelluläre Matrix und ein Gerüst
und die Tatsache, dass das Verbundmaterial die Osteogenese in einem
biologischen Organismus fördert und induziert.
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Das
Patentdokument 5 (offengelegte PCT der
japanischen nationalen Phase Nr. 2003-531604 )
offenbart ein Verfahren zur Isolierung mesenchymaler Stammzelle
aus einem menschlichen Gewebe nach der Geburt, wie menschliches
Präputium-Gewebe nach der Geburt, sowie ein Verfahren zur
Induzierung der Differenzierung der isolierten mesenchymalen Stammzellen
zu verschiedenen Zelllinien, wie Osteogenese, Adipogenese und einer
Knorpelbildungslinie.
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Das
Patentdokument 5 offenbart ferner, dass die mesenchymalen Stammzellen
zu den Osteoblasten unter Verwendung eines Mediums differenziert
werden, das fötales Kälberserum (FBS), antibiotische
und osteogene Ergänzungssubstanzen, wie Dexamethason, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure-2-Phosphorsäure beinhaltet.
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Jedoch
offenbart das Patentdokument 5 folgendes nicht: ein Verfahren zur
Induzierung von undifferenzierten Zellen zu Osteoblasten mittels
eines Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wird, unter Verwendung des Verfahrens induzierte (hergestellte)
Osteoblasten, eine die Osteoblasten und eine extrazelluläre
Matrix enthaltende Zusammensetzung, ein die Osteoblasten enthaltendes
Verbundmaterial, eine extrazelluläre Matrix und ein Gerüst
und die Tatsache, dass das Verbundmaterial die Osteogenese in einem
biologischen Organismus fördert und induziert.
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Das
Patentdokument 6 (
japanisches
Patent Nr. 2984176 ) offenbart ein Verfahren zur Kultivierung
von Knochenmarkszellen, ein Gemisch zur Kultivierung und ein Material,
das in eine Region mit Hartgewebedefekt implantiert werden soll.
In dem Patentdokument 6 wird beschrieben, dass sowohl Hormone, wie
Dexamethason, und Sera einem Medium zur Kultivierung von Osteoblasten
nicht zugegeben werden müssen und dass das Medium vorzugsweise
Ascorbinsäure beinhaltet. Ferner wird in dem Patentdokument
6 ein Gemisch aus L-Ascorbinsäure, eine HEPES-Pufferlösung
und ein essentielles Minimalmedium α (αMEM) zur
Induzierung der Differenzierung verwendet.
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Jedoch
offenbart das Patentdokument 6 folgendes nicht: ein Verfahren zur
Induzierung von undifferenzierten Zellen zu Osteoblasten mittels
eines Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wird, unter Verwendung des Verfahrens induzierte (hergestellte)
Osteoblasten, eine die Osteoblasten und eine extrazelluläre
Matrix enthaltende Zusammensetzung, ein die Osteoblasten enthaltendes
Verbundmaterial, eine extrazelluläre Matrix und ein Gerüst
und die Tatsache, dass das Verbundmaterial die Osteogenese in einem
biologischen Organismus fördert und induziert.
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Das
Patentdokument 7 (
japanisches
Patent Nr. 3808900 ) offenbart eine physiologische Substanz,
ein Verfahren zur Herstellung davon und ein Verfahren zur Verwendung
davon als Implantat. In dem Patentdokument 7 ist beschrieben, dass
für die Osteogenese mesenchymale Stammzellen unter Verwendung
eines Mediums, enthaltend fatales Kälberserum (FBS), L-Glutamin,
Penicillin/Streptomycin, Ascorbinsäure und Dexamethason,
differenziert werden.
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Jedoch
offenbart das Patentdokument 7 folgendes nicht: ein Verfahren zur
Induzierung von undifferenzierten Zellen zu Osteoblasten mittels
eines Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wird, unter Verwendung des Verfahrens induzierte (hergestellte)
Osteoblasten, eine die Osteoblasten und eine extrazelluläre
Matrix enthaltende Zusammensetzung, ein die Osteoblasten enthaltendes
Verbundmaterial, eine extrazelluläre Matrix und ein Gerüst
und die Tatsache, dass das Verbundmaterial die Osteogenese in einem
biologischen Organismus fördert und induziert.
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Bei
jedem Patentdokument 1 bis 7 ist nur beschrieben, dass die Differenzierung
von undifferenzierten Zellen zu Osteoblasten unter Verwendung eines
Mediums induziert wird, das Dexamethason, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure beinhaltet, die herkömmlich
als fähige Komponenten zur Induzierung der Differenzierung
zu Osteoblasten verwendet werden.
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Das
Patentdokument 8 (
offengelegte
japanische Patentanmeldung Nr. 2006-289062 ) offenbart ein Knochenersatzmaterial,
das unter Verwendung von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
und eines Gerüsts hergestellt wird. Jedoch offenbart das
Patentdokument 8 folgendes nicht: ein Verfahren zur Induzierung von
undifferenzierten Zellen zu Osteoblasten mittels eines Wirkstoffs,
der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt
wird, unter Verwendung des Verfahrens induzierte (hergestellte)
Osteoblasten, eine die Osteoblasten und eine extrazelluläre
Matrix enthaltende Zusammensetzung, ein die Osteoblasten enthaltendes
Verbundmaterial, eine extrazelluläre Matrix und ein Gerüst
und die Tatsache, dass das Verbundmaterial die Osteogenese in einem
biologischen Organismus fördert und induziert.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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VON DER ERFINDUNG ZU LÖSENDE
PROBLEME
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die verstärkte und
stabile Bereitstellung von Osteoblasten, die zur Behandlung von
Krankheiten verwendet werden können, die mit einer abnehmenden
Osteogenese, Knochenverletzungen oder Knochendefekten, insbesondere
zur Behandlung von Knochentumoren, komplexen Frakturen und dergleichen,
einhergehen.
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Bisher
trat eine Osteognese auch bei dem Fall nicht ein, bei dem Osteoblasten allein
in einen biologischen Organismus implantiert wurden. Daher konnten
Osteoblasten allein nicht die Krankheiten behandeln, die mit einer
abnehmenden Osteogenese, Knochenverletzungen oder Knochendefekten
einhergehen, und konnten insbesondere nicht Knochentumore, komplexe
Frakturen und dergleichen behandeln. Dementsprechend ist eine Aufgabe
der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von Osteoblasten mit
einer Fähigkeit zur unabhängigen Behandlung von
Krankheiten oder Verletzungen, bei denen die Osteogenese notwendig
ist.
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Ferner
ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Osteoblasten bereitzustellen,
die zur Knochenbildung in einer Region verwendet werden können,
in deren Umgebung kein Knochen vorhanden ist.
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MITTEL ZUR LÖSUNG DER PROBLEME
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Bei
der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren zur Induzierung von
undifferenzierten Zellen zu Osteoblasten gefunden, indem ein die
Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierender Wirkstoff verwendet
wurde, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt
wird. Dies ermöglicht die verstärkte und stabile
Bereitstellung von Osteoblasten, die bisher nicht als Massenprodukt
hergestellt werden konnten.
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Die
vorliegende Erfindung hat als erste die Promotion und Induzierung
von Osteogenese sogar in einer Region, in deren Umgebung kein Knochen
vorhanden ist, in einem biologischen Organismus ohne Verwendung
eines Gerüsts erzielt, indem Osteoblasten, die aus undifferenzierten
Zellen induziert werden, unter Verwendung des Verfahrens zur Induzierung
der vorliegenden Erfindung unabhängig implantiert wurden.
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Zur
Erzielung der vorstehenden Aufgaben stellt die vorliegende Erfindung
die folgenden Mittel bereit.
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(Punkt 1)
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Ein
Verfahren zur Induzierung undifferenzierter Zellen zu induzierten
Osteoblasten, das folgendes umfasst:
- A) einen
Schritt der Bereitstellung eines Überstandes, der durch
Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in
einem einen Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium erhalten
wird, das mindestens eines ausgewählt aus der Gruppe umfassend
ein Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure,
oder einen die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff, der in dem Überstand vorliegt; und
- B) einen Schritt der Kultivierung der undifferenzierten Zellen
in einem Kulturmedium für undifferenzierte Zellen, das
den Überstand oder den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff und eine Mediumkomponente beinhaltet,
bei einer ausreichenden Bedingung, um die undifferenzierten Zellen zu
den induzierten Osteoblasten zu differenzieren.
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(Punkt 1A)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei in Schritt A) der die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff durch Kultivieren
der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Medium erhalten wird, das Dexamethason, β-Glycerophosphat,
Ascorbinsäure und eine Serumkomponente beinhaltet; und
wobei
in Schritt B) die undifferenzierten Zellen zu den induzierten Osteoblasten
durch Kultivierung der undifferenzierten Zellen in dem Kulturmedium
für undifferenzierte Zellen induziert werden, das den die
Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff
und die Mediumkomponente beinhaltet.
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(Punkt 1B)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei der die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in folgendem vorliegt:
(1) in dem Medium, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert werden, oder (2) in einer Fraktion mit einem
Molekulargewicht von 50.000 oder höher, erhalten durch
Ultrafiltration des Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert werden, unter Verwendung eines Filters mit
einer molekularen Trenngrenze von 50.000.
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(Punkt 1C)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei Schritt A) folgendes einschließt:
Kultivieren
der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Medium, das Dexamethason, β-Glycerophosphat,
Ascorbinsäure und die Serumkomponente beinhaltet; und
Sammeln
des Überstandes des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Mediums nach dem Kultivieren.
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(Punkt 1D)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei Schritt A) folgendes einschließt:
Ultrafiltration des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums,
in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden,
um ihn in eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder
höher aufzutrennen.
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(Punkt 2)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei das den Differenzierungswirkstoff
erzeugende Medium, das zum Kultivieren der hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten verwendet wird, sowohl β-Glycerophosphat als
auch Ascorbinsäure beinhaltet.
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(Punkt 3)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die undifferenzierten Zellen
von einem Säugetier stammende Zellen umfassen.
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(Punkt 4)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die undifferenzierten Zellen
von Menschen, Mäusen, Ratten oder Kaninchen stammende Zellen
umfassen.
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(Punkt 5)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die undifferenzierten Zellen
ausgewählt aus der Gruppe umfassend mesenchymale Stammzellen,
hämatopoietische Stammzellen, vaskuläre Stammzellen,
hepatische Stammzellen, pankreatische Stammzellen und neurale Stammzellen
umfassen.
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(Punkt 5A)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die undifferenzierten Zellen
mesenchymale Stammzellen umfassen.
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(Punkt 5B)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die mesenchymalen Stammzellen
aus Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen umfassen.
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(Punkt 5C)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die mesenchymalen Stammzellen
mesenchymale Stammzellen aus Ratten oder mesenchymale Stammzellen
aus Menschen umfassen.
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(Punkt 6)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die undifferenzierten Zellen
ausgewählt aus der Gruppe umfassend C3H10T1/2-Zellen, ATDC5-Zellen,
3T3-Swiss-Albino-Zellen, BALB/3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen, C2C12-Zellen,
PT-2501-Zellen und aus primärem Ratten-Knochenmark stammende
Stammzellen umfassen.
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(Punkt 6A)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die undifferenzierten Zellen
ausgewählt aus der Gruppe umfassend C3H10T1/2-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen,
BALB/3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen, PT-2501-Zellen und aus primärem
Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen umfassen.
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(Punkt 6B)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die undifferenzierten Zellen
C3H10T1/2-Zellen umfassen.
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(Punkt 7)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei das Kulturmedium für
undifferenzierte Zellen Eagle-Basalmedium (BME), essenzielles Minimalmedium
(MEM), modifiziertes Eagle-Medium nach Dulbecco (DMEM), Ham-F12-Medium
(HAM), essenzielles Minimalmedium α (αMEM) oder
ein gemischtes Medium davon beinhaltet.
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(Punkt 7A)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei das Kulturmedium für
undifferenzierte Zellen Eagle-Basalmedium (BME), essenzielles Minimalmedium
(MEM), Ham-F12-Medium (HAM) oder modifiziertes Eagle-Medium nach
Dulbecco (DMEM) beinhaltet.
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(Punkt 8)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, das ferner folgendes umfasst:
einen Schritt der Formung der undifferenzierten Zellen zu einem
Pellet.
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(Punkt 9)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei der Pelletformungsschritt
durch Zentrifugation bei 170 bis 200 × g für 3
bis 5 Minuten durchgeführt wird.
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(Punkt 10)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die ausreichende Bedingung,
dass die undifferenzierten Zellen zu den induzierten Osteoblasten
induziert werden, eine Kultivierungsdauer von 3 Tagen bis 3 Wochen
einschließt.
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(Punkt 11)
-
Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium
kultiviert werden, das das Glucocorticoid, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure beinhaltet,
wobei die undifferenzierten
Zellen aus der Gruppe ausgewählt sind, die mesenchymale
Stammzellen, hämatopoietische Stammzellen, vaskuläre
Stammzellen, hepatische Stammzellen, pankreatische Stammzellen und neurale
Stammzellen umfasst,
wobei das Kulturmedium für undifferenzierte
Zellen Eagle-Basalmedium (BME), essenzielles Minimalmedium (MEM),
essenzielles Minimalmedium α (αMEM) oder modifiziertes
Eagle-Medium nach Dulbecco (DMEM) beinhaltet, und
wobei die
ausreichende Bedingung, dass die undifferenzierten Zellen zu den
induzierten Osteoblasten induziert werden, eine Kultivierungsdauer
von 3 Tagen bis 3 Wochen einschließt.
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(Punkt 11A)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die undifferenzierten Zellen
aus Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen umfassen, und
wobei
Schritt A) folgendes einschließt: (1) Kultivieren der hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium,
das Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure
und eine Serumkomponente beinhaltet, und anschließendes
Sammeln des Überstandes des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums nach dem Kultivieren, und (2) Ultrafiltration
des Überstandes, um ihn in eine Fraktion mit einem Molekulargewicht
von 50.000 oder höher aufzutrennen.
-
(Punkt 12)
-
Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium
kultiviert werden, das das Glucocorticoid, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure beinhaltet,
wobei die undifferenzierten
Zellen aus der Gruppe ausgewählt sind, die C3H10T1/2-Zellen,
ATDC5-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen, BALB/3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen,
C2C12-Zellen, PT-2501-Zellen und aus primärem Ratten-Knochenmark
stammende Stammzellen umfasst,
wobei das Kulturmedium für
undifferenzierte Zellen Eagle-Basalmedium (BME), essenzielles Minimalmedium (MEM),
essenzielles Minimalmedium α (αMEM) oder modifiziertes
Eagle-Medium nach Dulbecco (DMEM) beinhaltet, und
wobei die
ausreichende Bedingung, dass die undifferenzierten Zellen zu den
induzierten Osteoblasten induziert werden, eine Kultivierungsdauer
von 3 Tagen bis 3 Wochen einschließt.
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(Punkt 12A)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die undifferenzierten Zellen
C3H10T1/2-Zellen, PT-2501-Zellen oder aus primärem Ratten-Knochenmark
stammende Stammzellen umfassen, und
wobei Schritt A) folgendes
einschließt: (1) Kultivieren der hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium,
das Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure
und eine Serumkomponente beinhaltet, und anschließendes
Sammeln des Überstandes des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums nach dem Kultivieren, und (2) Ultrafiltration
des Überstandes, um ihn in eine Fraktion mit einem Molekulargewicht
von 50.000 oder höher aufzutrennen.
-
(Punkt 13)
-
Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium
kultiviert werden, das das Dexamethason, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure beinhaltet,
wobei die undifferenzierten
Zellen aus der Gruppe ausgewählt sind, die mesenchymale
Stammzellen, hämatopoietische Stammzellen, vaskuläre
Stammzellen, hepatische Stammzellen, pankreatische Stammzellen und neurale
Stammzellen umfasst,
wobei die undifferenzierten Zellen durch
Zentrifugation bei 170 bis 200 × g für 3 bis 5
Minuten zu einem Pellet geformt werden,
wobei das Kulturmedium
für undifferenzierte Zellen Eagle-Basalmedium (BME), essenzielles
Minimalmedium (MEM), essenzielles Minimalmedium α (αMEM)
oder modifiziertes Eagle-Medium nach Dulbecco (DMEM) beinhaltet,
und
wobei die ausreichende Bedingung, dass die undifferenzierten
Zellen zu den induzierten Osteoblasten induziert werden, eine Kultivierungsdauer
von 3 Tagen bis 3 Wochen einschließt.
-
(Punkt 14)
-
Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium
kultiviert werden, das das Glucocorticoid, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure beinhaltet,
wobei die undifferenzierten
Zellen aus der Gruppe ausgewählt sind, die C3H10T1/2-Zellen,
ATDC5-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen, BALB/3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen,
C2C12-Zellen, PT-2501-Zellen und aus primärem Ratten-Knochenmark
stammende Stammzellen umfasst,
wobei die undifferenzierten
Zellen durch Zentrifugation bei 170 bis 200 × g für
3 bis 5 Minuten zu einem Pellet geformt werden,
wobei das Kulturmedium
für undifferenzierte Zellen Eagle-Basalmedium (BME), essenzielles
Minimalmedium (MEM), essenzielles Minimalmedium α (αMEM)
oder modifiziertes Eagle-Medium nach Dulbecco (DMEM) beinhaltet,
und
wobei die ausreichende Bedingung, dass die undifferenzierten
Zellen zu den induzierten Osteoblasten induziert werden, eine Kultivierungsdauer
von 3 Tagen bis 3 Wochen einschließt.
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(Punkt 15)
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Induzierte
Osteoblasten, hergestellt unter Verwendung des vorstehend beschriebenen
Verfahrens.
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(Punkt 16)
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Eine
Zusammensetzung zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese
in einem biologischen Organismus, die folgendes umfasst:
- A) eine extrazelluläre Matrix; und
- B) induzierte Osteoblasten.
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(Punkt 17)
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Die
vorstehend beschriebene Zusammensetzung, wobei die extrazelluläre
Matrix aus den induzierten Osteoblasten stammt.
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(Punkt 18)
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Die
vorstehend beschriebene Zusammensetzung, wobei die extrazelluläre
Matrix aus der Gruppe ausgewählt ist, die Typ-I-Collagen,
Knochenproteoglycan, Osteocalcin, Matrix-Gla-Protein, Osteoglycin,
Osteopontin und Knochenproteine mit Sialinsäure umfasst.
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(Punkt 19)
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Die
vorstehend beschriebene Zusammensetzung, wobei die extrazelluläre
Matrix und die induzierten Osteoblasten in einem gemischten Zustand
vorliegen.
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(Punkt 20)
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Die
vorstehend beschriebene Zusammensetzung, wobei die induzierten Osteoblasten
von Zellen stammen, die aus der Gruppe ausgewählt sind,
umfassend mesenchymale Stammzellen, hämatopoietische Stammzellen,
vaskuläre Stammzellen, hepatische Stammzellen, pankreatische
Stammzellen und neurale Stammzellen umfassen.
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(Punkt 20A)
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Die
vorstehend beschriebene Zusammensetzung, wobei die induzierten Osteoblasten
von den mesenchymalen Stammzellen stammen.
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(Punkt 20B)
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Die
vorstehend beschriebene Zusammensetzung, wobei die mesenchymalen
Stammzellen aus Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen umfassen.
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(Punkt 20C)
-
Die
vorstehend beschriebene Zusammensetzung, wobei die mesenchymalen
Stammzellen mesenchymale Stammzellen aus Ratten oder mesenchymale
Stammzellen aus Menschen umfassen.
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(Punkt 21)
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Die
vorstehend beschriebene Zusammensetzung, wobei die induzierten Osteoblasten
aus Zellen stammen, die aus der Gruppe ausgewählt sind,
umfassend C3H10T1/2-Zellen, ATDC5-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen,
BALB/3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen, C2C12-Zellen, PT-2501-Zellen und
aus primärem Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen.
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(Punkt 22)
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Die
vorstehend beschriebene Zusammensetzung, wobei die induzierten Osteoblasten
von Zellen stammen, die aus der Gruppe ausgewählt sind,
umfassend mesenchymale Stammzellen, hämatopoietische Stammzellen,
vaskuläre Stammzellen, hepatische Stammzellen, pankreatische
Stammzellen und neurale Stammzellen umfassen, und wobei die induzierten
Osteoblasten die extrazelluläre Matrix sezernieren.
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(Punkt 23)
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Die
vorstehend beschriebene Zusammensetzung, wobei die induzierten Osteoblasten
aus Zellen stammen, die aus der Gruppe ausgewählt sind,
umfassend C3H10T1/2-Zellen, ATDC5-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen,
BALB/3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen, C2C12-Zellen, PT-2501-Zellen und
aus primärem Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen,
und
wobei die induzierten Osteoblasten die extrazelluläre
Matrix sezernieren.
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(Punkt 24)
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Die
vorstehend beschriebene Zusammensetzung, wobei die Osteogenese zur
Reparatur oder Behandlung eines Knochendefekts verwendet wird.
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(Punkt 25)
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Die
vorstehend beschriebene Zusammensetzung, wobei der Knochendefekt
so groß ist, dass er nur durch Immobilisierung des Knochens
nicht behandelt werden kann.
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(Punkt 26)
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Die
vorstehend beschriebene Zusammensetzung, wobei die Osteogenese zur
Knochenbildung in einer Region verwendet wird, in deren Umgebung
kein Knochen vorhanden ist.
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(Punkt 27)
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Ein
Verbundmaterial zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese
in einem biologischen Organismus, das folgendes umfasst:
- A) eine extrazelluläre Matrix;
- B) induzierte Osteoblasten; und
- C) ein biokompatibles Gerüst.
-
(Punkt 28)
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Das
vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei die extrazelluläre
Matrix von den induzierten Osteoblasten stammt.
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(Punkt 29)
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Das
vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei die extrazelluläre
Matrix aus der Gruppe ausgewählt ist, die Typ-I-Collagen,
Knochenproteoglycan, Osteocalcin, Matrix-Gla-Protein, Osteoglycin,
Osteopontin und Knochenproteine mit Sialinsäure umfasst.
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(Punkt 30)
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Das
vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei das biokompatible
Gerüst ein Material beinhaltet, das aus der Gruppe ausgewählt
ist, umfassend Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Aluminiumoxid,
Zirconiumoxid, Apatit-Wollastonit enthaltendes Glas, Gelatine, Collagen,
Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, ein Gemisch aus extrazellulärer
Matrix, Seide, Cellulose, Dextran, Agarose, Agar, synthetisches
Polypeptid, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure,
Polyglycolsäure, Polymethylmethacrylat, Polycyanoacrylat,
Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid,
ein Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, Nylon und eine Kombination davon.
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(Punkt 31)
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Das
vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei das biokompatible
Gerüst ein Material beinhaltet, das aus der Gruppe ausgewählt
ist, umfassend poröses Hydroxylapatit, super-poröses
Hydroxylapatit, ein Apatit-Collagen-Gemisch, einen Apatit-Collagen-Komplex,
Collagengel, Collagenschwamm, Gelatineschwamm, Fibringel, synthetisches
Peptid, ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix, Alginat,
Agarose, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, ein
Polyglycolsäure/Polymilchsäure-Copolymer und eine
Kombination davon.
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(Punkt 32)
-
Das
vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei die induzierten Osteoblasten
an dem biokompatiblen Gerüst über die extrazelluläre
Matrix oder direkt anhaften.
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(Punkt 33)
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Ein
Verfahren zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese
in einem biologischen Organismus, das folgendes umfasst:
einen
Schritt der Implantierung einer Zusammensetzung, enthaltend eine
extrazelluläre Matrix und induzierte Osteoblasten, oder
eines Verbundmaterials, enthaltend eine extrazelluläre
Matrix, induzierte Osteoblasten und ein biokompatibles Gerüst,
in eine Region, in der die Osteogenese in dem biologischen Organismus
gefördert oder induziert werden muss.
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(Punkt 34)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, das zur Reparatur oder Behandlung
eines Knochendefekts verwendet wird.
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(Punkt 35)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei der Knochendefekt so groß ist,
dass er nur durch Immobilisierung des Knochens nicht repariert werden
kann.
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(Punkt 36)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, die zur Knochenbildung in einer
Region verwendet wird, in deren Umgebung kein Knochen vorhanden
ist.
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(Punkt 37)
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Ein
Verfahren zur Herstellung eines Verbundmaterials zur Förderung
oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus,
das folgendes umfasst:
- A) einen Schritt der
Bereitstellung von induzierten Osteoblasten, die unter Verwendung
eines Wirkstoffs induziert wurden, der von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wird;
- B) einen Schritt der Kultivierung der induzierten Osteoblasten
auf einem biokompatiblen Gerüst.
-
(Punkt 38)
-
Ein
Verfahren zur Herstellung eines Verbundmaterials zur Förderung
oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus,
das folgendes umfasst:
- A) einen Schritt der
Bereitstellung von induzierten Osteoblasten, hergestellt unter Verwendung
des vorstehend beschriebenen Verfahrens;
- B) einen Schritt der Kultivierung der induzierten Osteoblasten
auf einem biokompatiblen Gerüst.
-
(Punkt 39)
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren, wobei die induzierten Osteoblasten
aus undifferenzierten Zellen auf dem biokompatiblen Gerüst
induziert werden.
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(Punkt 40)
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Ein
Medikament oder medizinisches Material zur Förderung oder
Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus, das
folgendes umfasst:
Induzierte Osteoblasten, hergestellt unter
Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens.
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(Punkt 41)
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Das
vorstehend beschriebene Medikament oder medizinische Material, wobei
die undifferenzierten Zellen mesenchymale Stammzellen umfassen.
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(Punkt 42)
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Das
vorstehend beschriebene Medikament oder medizinische Material, wobei
die undifferenzierten Zellen aus Knochenmark stammende mesenchymale
Stammzellen umfassen.
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(Punkt 43)
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Das
vorstehend beschriebene Medikament oder medizinische Material, wobei
die undifferenzierten Zellen C3H10T1/2-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen,
BALB/3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen, PT-2501-Zellen oder aus primärem
Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen umfassen.
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(Punkt 44)
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Das
vorstehend beschriebene Medikament oder medizinische Material, wobei
die undifferenzierten Zellen C3H10T1/2-Zellen, PT-2501-Zellen oder
aus primärem Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen umfassen.
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(Punkt 45)
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Das
vorstehend beschriebene Medikament oder medizinische Material, wobei
die undifferenzierten Zellen zu einem Pellet geformt werden.
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(Punkt 46)
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Das
vorstehend beschriebene Medikament oder medizinische Material, wobei
die C3H10T1/2-Zellen zu einem Pellet geformt werden.
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(Punkt 47)
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Das
vorstehend beschriebene Medikament oder medizinische Material, wobei
die mesenchymalen Stammzellen mit einem Gel umhüllt werden.
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(Punkt 48)
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Ein
Verfahren zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese
in einem biologischen Organismus, das folgendes umfasst:
einen
Schritt der Implantierung von induzierten Osteoblasten, hergestellt
unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens, in eine
Region, in der die Osteogenese in dem biologischen Organismus gefördert oder
induziert werden muss.
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(Punkt 49)
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Die
Verwendung von induzierten Osteoblasten zur Herstellung eines Medikaments
oder medizinischen Materials zur Förderung oder Induzierung
von Osteogenese in einem biologischen Organismus, wobei die induzierten
Osteoblasten unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens
hergestellt werden.
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Gemäß der
vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein Verfahren zur
verstärkten und stabilen Herstellung von Osteoblasten bereitzustellen,
die die Osteogenese in einem biologischen Organismus fördern
oder induzieren können.
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Gemäß dem
Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist es möglich,
Osteoblasten bereitzustellen, die zur Behandlung von Krankheiten,
die mit einer abnehmenden Osteogenese, Knochenverletzungen oder
Knochendefekten einhergehen, insbesondere zur Behandlung von Knochentumoren,
komplexen Frakturen und dergleichen verwendet werden können.
Die Osteoblasten gemäß der vorliegenden Erfindung
können die Osteogenese in dem biologischen Organismus unabhängig
ohne Verwendung eines Gerüsts fördern oder induzieren.
Das ist eine unerwartete vorteilhafte Wirkung, die erst mit der
vorliegenden Erfindung erzielt wurde.
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Mit
der Verwendung der Osteoblasten gemäß der vorliegenden
Erfindung ist es möglich, ein Medikament oder medizinisches
Material, das die Osteoblasten beinhaltet, eine Zusammensetzung,
das die Osteoblasten und eine extrazelluläre Matrix, und
ein Verbundmaterial, das die Osteoblasten, eine extrazelluläre
Matrix und ein Gerüst beinhaltet, bereitzustellen, von
denen jedes zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer abnehmenden
Osteogenese, Knochenverletzungen oder Knochendefekten einhergehen,
insbesondere zur Behandlung von Knochentumoren, komplexen Frakturen
und dergleichen verwendet werden kann. Ferner ist es auch möglich,
ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ein Verfahren zu ihrer Verwendung
bereitzustellen.
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Solche
Osteoblasten, ein solches Medikament oder medizinisches Material, eine
solche Zusammensetzung und ein solches Verbundmaterial können
die Osteogenese in dem biologischen Organismus fördern oder
induzieren. Mit ihrer Verwendung wurde es möglich, die
Osteogenese sogar in einer Region zu induzieren, in deren Umgebung
kein Knochen vorhanden war. Diese Osteoblasten, dieses Medikament
oder medizinisches Material, diese Zusammensetzung und dieses Verbundmaterial
wurden von dem Stand der Technik bisher nicht bereitgestellt, werden
jedoch zum ersten Mal unter Verwendung der vorliegenden Erfindung
bereitgestellt.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1A zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung
von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, die auf Hydroxylapatit
geimpft wurden, indem sie zur Herstellung einer Zellsuspension verdünnt wurden
und anschließend die Zellsuspension auf das Hydroxylapatit
aufgetragen wurde.
-
Die
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden auf das Hydroxylapatit
bei einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml
geimpft und dann in einem 5% CO2 Inkubator
bei 37°C für 1 Woche zur Gewinnung einer Probe kultiviert.
Danach wurde die Probe der alkalischen Phosphatase-Färbung
unterworfen. Die Probe (Hydroxylapatit) färbte sich bei
der alkalischen Phosphatase-Färbung rot. In 1A beträgt die Länge des links
unten gezeigten Balkens 300,00 μm.
-
1B zeigt das Ergebnis der Toluidinblau-Färbung
der mit der alkalischen Phosphatase gefärbten Probe, die
in 1A gezeigt ist. Es wurde bestätigt, dass
die gleichen Bereiche der Probe (Hydroxylapatit), die in 1A gezeigt sind, sich mit der Toluidinblau-Färbung
blau färbten, womit Zellen in der Probe vorhanden waren.
In 1B beträgt die Länge des links
unten gezeigten Balkens 300,00 μm.
-
1C zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung
von ruhenden Knorpelzellen, die auf Hydroxylapatit geimpft wurden,
indem sie zur Herstellung einer Zellsuspension verdünnt
wurden und anschließend die Zellsuspension auf das Hydroxylapatit
aufgetragen wurde.
-
Die
ruhenden Knorpelzellen wurden auf das Hydroxylapatit bei einer Dichte
von 1 × 106 Zellen/ml geimpft und
dann in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
für 1 Woche zur Gewinnung einer Probe kultiviert. Danach wurde
die Probe der alkalischen Phosphatase-Färbung unterworfen.
Die Probe (Hydroxylapatit) verfärbte sich nicht bei der
alkalischen Phosphatase-Färbung. In 1C beträgt
die Länge des links unten gezeigten Balkens 300,00 μm.
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1D zeigt das Ergebnis der Toluidinblau-Färbung
der mit der alkalischen Phosphatase gefärbten Probe, die
in 1C gezeigt ist. Es wurde bestätigt, dass
die Probe (Hydroxylapatit) sich mit der Toluidinblau-Färbung
blau färbte, womit Zellen in der Probe vorhanden waren.
In 1D beträgt die Länge des links unten
gezeigten Balkens 300,00 μm.
-
1E zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung
von aus Gelenkknorpel stammenden Chondrozyten, die auf Hydroxylapatit
geimpft wurden, indem sie zur Herstellung einer Zellsuspension verdünnt
wurden und anschließend die Zellsuspension auf das Hydroxylapatit
aufgetragen wurde.
-
Die
aus Gelenkknorpel stammenden Chondrozyten wurden auf das Hydroxylapatit
bei einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml
geimpft und dann in einem 5% CO2 Inkubator
bei 37°C für 1 Woche zur Gewinnung einer Probe
kultiviert. Danach wurde die Probe der alkalischen Phosphatase-Färbung
unterworfen. Die Probe (Hydroxylapatit) verfärbte sich
nicht bei der alkalischen Phosphatase-Färbung. In 1E beträgt die Länge des links
unten gezeigten Balkens 300,00 μm.
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1F zeigt das Ergebnis der Toluidinblau-Färbung
der mit der alkalischen Phosphatase gefärbten Probe, die
in 1E gezeigt ist. Es wurde bestätigt, dass
sich gepunktete Bereiche der Probe (Hydroxylapatit) mit der Toluidinblau-Färbung
blau färbten, womit Zellen in der Probe vorhanden waren.
In 1F beträgt die Länge des links
unten gezeigten Balkens 300,00 μm.
-
2 zeigt
die alkalische Phosphatase-Aktivität von Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die jeweils gemessen wurde, indem aus Costa/costal-Knorpel stammende
hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium bzw. einem MEM-Wachstumsmedium kultiviert
wurden, ein Überstand von jedem Medium (Kulturüberstand)
in einem Zeitverlauf (4 Tage, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen) gesammelt
wurde, um partielle Überstände zu erhalten, jeder
partielle Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben
wurde und sie anschließend kultiviert wurden.
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Für
den Fall der Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums (Zellkultur) zu den Maus-C3H10T1/2-Zellen,
wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt
wurde, bei einer 4 Wochen alten Rattengruppe: der relative Wert
der Aktivität erhöhte sich auf das etwa 4,1-Fache
durch Zugabe des partiellen Überstands, der 4 Tage nach
dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 5,1-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem Kultivieren
gesammelt wurde; auf das etwa 5,4-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 2 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde; und auf das etwa
4,9-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 3
Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde.
-
Für
den vorstehenden gleichen Fall bei einer 8 Wochen alten Rattengruppe:
der relative Wert der Aktivität erhöhte sich auf
etwa das 2,9-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 3,1-Fache
durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem
Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 3,8-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren
gesammelt wurde; und auf das etwa 4,2-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde.
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Bei
jeder der 4 und 8 Wochen alten Rattengruppen gab es einen geringen
Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des
MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden (Zellkultur), und dem Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität davon, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums
kultiviert wurden.
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Die
folgenden Abkürzungen zeigen die zugegebenen Überstände.
4 Wochen alter Differenzierungsüberstand: Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem
aus 4 Wochen alten Ratten stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden; 8 Wochen alter Differenzierungsüberstand: Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem
aus 8 Wochen alten Ratten stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden; 4 Wochen alter Wachstumsüberstand: Überstand
des MEM-Wachstumsmediums, in dem aus 4 Wochen alten Ratten stammende
hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden;
8 Wochen alter Wachstumsüberstand: Überstand des
MEM-Wachstumsmediums, in dem aus 8 Wochen alten Ratten stammende
hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden;
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3A zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die kultiviert wurden, indem ein Überstand
von jeweils dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
und dem MEM-Wachstumsmedium, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende
hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden
(Kulturüberstand), zugegeben wurde.
-
Die
Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden in einer 24-Well-Platte (in BME-Medium)
geimpft. 18 h nach der Impfung wurde der Überstand der
Platte zugegeben und nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Färbung durchgeführt.
Obere Spalte: es wurde bestätigt, dass Proben, denen der Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums zugegeben
wurde, rot gefärbt wurden und alkalische Phosphatase-Aktivität
aufwiesen. Untere Spalte: es wurde bestätigt, dass Proben,
denen der Überstand des MEM-Wachstumsmediums zugegeben
wurde, nicht gefärbt wurden und keine alkalische Phosphatase-Aktivität
aufwiesen.
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3B zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die kultiviert wurden, indem ein Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem aus
Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), zugegeben
wurde.
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Die
Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden auf Hydroxylapatit (in BME-Medium)
geimpft. 18 h nach der Impfung wurde der Überstand dem
Hydroxylapatit zugegeben und nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Färbung
durchgeführt. Es wurde bestätigt, dass eine Probe,
der der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums zugegeben wurde, rot gefärbt wurde und alkalische
Phosphatase-Aktivität aufwies. In 3B beträgt
die Länge des links unten gezeigten Balkens 500,00 μm.
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3C zeigt das Ergebnis der Toluidinblau-Färbung
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die kultiviert wurden, indem ein Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem
aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), zugegeben
wurde.
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Die
Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden auf Hydroxylapatit (in BME-Medium)
geimpft. 18 h nach der Impfung wurde der Überstand dem
Hydroxylapatit zugegeben und nach 72 h wurde die Toluidinblau-Färbung durchgeführt.
Es wurde bestätigt, dass eine Probe mit der Toluidinblau-Färbung
blau gefärbt wurde, womit Zellen in der Probe vorhanden
waren. In 3C beträgt die Länge
des links unten gezeigten Balkens 500,00 μm.
-
3D zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die kultiviert wurden, indem ein Überstand
des MEM-Wachstumsmediums, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende
hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden
(Kulturüberstand), zugegeben wurde.
-
Die
Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden auf Hydroxylapatit (in BME-Medium)
geimpft. 18 h nach der Impfung wurde der Überstand dem
Hydroxylapatit zugegeben und nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Färbung
durchgeführt. Es wurde bestätigt, dass eine Probe,
der der Überstand des MEM-Wachstumsmediums zugegeben wurde,
nicht gefärbt wurde und keine alkalische Phosphatase-Aktivität
aufwies. In 3D beträgt die Länge
des links unten gezeigten Balkens 500,00 μm.
-
3E zeigt das Ergebnis der Toluidinblau-Färbung
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die kultiviert wurden, indem ein Überstand
des MEM-Wachstumsmediums, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende
hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden
(Kulturüberstand), zugegeben wurde.
-
Die
Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden auf Hydroxylapatit (in BME-Medium)
geimpft. 18 h nach der Impfung wurde der Überstand dem
Hydroxylapatit zugegeben und nach 72 h wurde die Toluidinblau-Färbung durchgeführt.
Es wurde bestätigt, dass eine Probe mit der Toluidinblau-Färbung
blau gefärbt wurde, womit Zellen in der Probe vorhanden
waren. In 3E beträgt die Länge
des links unten gezeigten Balkens 500,00 μm.
-
4 zeigt
die alkalische Phosphatase-Aktivität von Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die jeweils gemessen wurde, indem aus Costal-Knorpel stammende ruhende
Knorpelzellen in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Medium bzw. einem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, ein Überstand
von jedem Medium (Kulturüberstand) in einem Zeitverlauf
(4 Tage, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen) gesammelt wurde, um partielle Überstände
zu erhalten, jeder partielle Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen
zugegeben wurde und sie anschließend kultiviert wurden.
-
Es
gab einen geringen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch
Zugabe des Überstands von jeweils dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden
(Zellkultur) und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
davon, die nur durch Zugabe jeweils des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums und des MEM-Wachstumsmediums kultiviert
wurden.
-
Die
folgenden Abkürzungen zeigen die zugegebenen Überstände.
8 Wochen alter Differenzierungsüberstand: Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem
aus 8 Wochen alten Ratten stammende ruhende Knorpelzellen kultiviert
wurden; 8 Wochen alter Wachstumsüberstand: Überstand
des MEM-Wachstumsmediums, in dem aus 8 Wochen alten Ratten stammende
ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden.
-
Jeder
Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe von jeweils dem
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium
kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde.
-
5A zeigt die alkalische Phosphatase-Aktivität
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die jeweils gemessen wurde, indem aus
Gelenkknorpel stammende Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium bzw. einem MEM-Wachstumsmedium kultiviert
wurden, ein Überstand von jedem Medium (Kulturüberstand)
in einem Zeitverlauf (4 Tage, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen) gesammelt
wurde, um partielle Überstände zu erhalten, jeder
partielle Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben
wurde und sie anschließend kultiviert wurden.
-
Es
gab einen geringen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch
Zugabe des Überstands von jeweils dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium, in dem die aus
Gelenkknorpel stammenden Chondrozyten kultiviert wurden (Zellkultur),
kultiviert wurden und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
davon, die nur durch Zugabe jeweils des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums und des MEM-Wachstumsmediums kultiviert
wurden.
-
Die
folgenden Abkürzungen zeigen die zugegebenen Überstände.
8 Wochen alter Differenzierungsüberstand: Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem
aus 8 Wochen alten Ratten-Gelenkknorpel stammende Chondrozyten kultiviert
wurden; 8 Wochen alter Wachstumsüberstand: Überstand
des MEM-Wachstumsmediums, in dem aus 8 Wochen alten Ratten-Gelenkknorpel
stammende Chondrozyten kultiviert wurden.
-
Jeder
Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe von jeweils dem
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium
kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde.
-
5B zeigt die alkalische Phosphatase-Aktivität
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die jeweils gemessen wurde, indem aus
Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
HAM-Medium kultiviert wurden, ein Überstand des Mediums
(Kulturüberstand) in einem Zeitverlauf (4 Tage, 7 Tage,
14 Tage, 21 Tage) gesammelt wurde, um partielle Überstände
zu erhalten, jeder partielle Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen
zugegeben wurde und sie anschließend kultiviert wurden.
-
Jeder
Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden HAM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt
wurde. Die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden HAM-Mediums kultiviert wurden, in dem die aus Costa/costal-Knorpel
stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert
wurden, nahm zu.
-
5C zeigt die alkalische Phosphatase-Aktivität
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die jeweils gemessen wurde, indem aus
Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten in einem HAM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, ein Überstand
des Mediums (Kulturüberstand) in einem Zeitverlauf (4 Tage,
7 Tage, 14 Tage, 21 Tage) gesammelt wurde, um partielle Überstände
zu erhalten, jeder partielle Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen
zugegeben wurde und sie anschließend kultiviert wurden.
-
Jeder
Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des HAM-Wachstumsmediums
kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde. Die
alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des HAM-Wachstumsmedium
kultiviert wurden, in dem die aus Costa/costal-Knorpel stammenden
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden,
nahm nicht zu.
-
6A zeigt das Vorhandensein eines Wirkstoffs, der
die alkalische Phosphatase-Aktivität von 3T3-Swiss-Albino-Zellen
und BALB/3T3-Zellen steigern und die Differenzierung dieser undifferenzierten
Zellen zu induzierten Osteoblasten in einem Überstand (Kulturüberstand)
induzieren kann, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Medium erhalten wurde.
-
Andererseits
zeigt 6A ferner das Fehlen des vorstehenden
Wirkstoffs in einem Überstand (Kulturüberstand),
der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
in einem MEM-Wachstumsmedium erhalten wurde. Zusätzlich
zeigt 6A ferner das Fehlen des vorstehenden
Wirkstoffs in einem Überstand (Kulturüberstand),
der durch Kultivieren von nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
oder dem MEM-Wachstumsmedium erhalten wurde.
-
6B zeigt die alkalische Phosphatase-Aktivität
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die jeweils gemessen wurde, indem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten in einem Medium kultiviert wurden, dem Dexamethason, β-Glycerophosphat,
Ascorbinsäure oder eine Kombination davon als eine herkömmliche
die Osteoblasten-Differenzierung induzierende Komponente zugegeben
wurde, ein Überstand des Mediums (Kulturüberstand)
gesammelt wurde, der Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen
zugegeben wurde und sie anschließend kultiviert wurden.
Dex: Dexamethason, BGP: β-Glycerophosphat, Asc: Ascorbinsäure.
-
7A zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in einer 24-Well-Platte geimpft und
kultiviert wurden, indem der Platte eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von
50.000 oder höher zugegeben wurde, die aus einem Überstand
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums abgetrennt
wurde, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden.
-
Jede
Probe, die die Maus-C3H10T1/2-Zellen enthielt, wurde bei der alkalischen Phosphatase-Färbung
rot gefärbt. Somit wurde bestätigt, dass ein Wirkstoff,
der die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen
steigern kann, in der Fraktion mit dem Molekulargewicht von 50.000
oder höher vorhanden war.
-
7B zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die auf Hydroxylapatit geimpft und kultiviert
wurden, indem dem Hydroxylapatit eine Fraktion mit einem Molekulargewicht
von 50.000 oder höher zugegeben wurde, die aus einem Überstand
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums abgetrennt
wurde, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden.
-
Eine
Probe (Hydroxylapatit), die die Maus-C3H10T1/2-Zellen enthielt,
wurde rot gefärbt. Somit wurde bestätigt, dass
ein Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen steigern kann, in der Fraktion mit dem
Molekulargewicht von 50.000 oder höher vorhanden war.
-
7C zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in einer 24-Well-Platte geimpft und
kultiviert wurden, indem der Platte eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von
unter 50.000 zugegeben wurde, die aus einem Überstand eines
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums abgetrennt
wurde, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten
kultiviert wurden.
-
Ein
Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der
Maus-C3H10T1/2-Zellen steigern kann, wurde in der Fraktion mit dem
Molekulargewicht von unter 50.000 nicht beobachtet. In 7C beträgt die Länge des links
unten gezeigten Balkens 500,00 μm.
-
7D zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die auf Hydroxylapatit geimpft und kultiviert
wurden, indem dem Hydroxylapatit eine Fraktion mit einem Molekulargewicht
von unter 50.000 zugegeben wurde, die aus einem Überstand
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums abgetrennt
wurde, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden.
-
Ein
Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der
Maus-C3H10T1/2-Zellen steigern kann, wurde in der Fraktion mit dem
Molekulargewicht von unter 50.000 nicht beobachtet. In 7D beträgt die Länge des links
unten gezeigten Balkens 500,00 μm.
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8 zeigt
die alkalische Phosphatase-Aktivität von Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die jeweils gemessen wurde, indem jeweils hypertrophierungsfähige
Chondrozyten, erhalten aus Maus-Costa/costal-Knorpel, und ruhende
Knorpelzellen, erhalten aus Costal-Knorpel, in einem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium bzw. einem MEM-Wachstumsmedium kultiviert
wurden, ein Überstand von jedem Medium (Kulturüberstand)
gesammelt wurde, der Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen
zugegeben wurde und sie anschließend kultiviert wurden.
-
Ein
relativer Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der
Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert
wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden, stieg auf das 3,1-Fache.
-
Es
gab einen geringen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch
Zugabe des Überstands von jeweils dem MEM-Wachstumsmedium,
in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert
wurden, und dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
und dem MEM-Wachstumsmedium, in dem die aus Costal-Knorpel stammenden
ruhenden Knorpelzellen kultiviert wurden, kultiviert wurden und
dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität davon, die
nur durch Zugabe jeweils des MEM-Wachstumsmediums und des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden.
-
Die
folgenden Abkürzungen zeigen die zugegebenen Überstände.
GC-Differenzierungsüberstand: Überstand des den
Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten
kultiviert wurden; GC-Wachstumsüberstand: Überstand
des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden; RC-Differenzierungsüberstand: Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem
ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden; RC-Wachstumsüberstand: Überstand
des MEM-Wachstumsmediums, in dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden.
-
Jeder
Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe von jeweils dem
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium
kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde.
-
9 zeigt die Wirkung eines Mediums zum
Kultivieren undifferenzierter Zellen (Kulturmedium für
undifferenzierte Zellen) auf die Induktion der Differenzierung der
undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten. Jede Art der
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, ruhenden Knorpelzellen
und Gelenkknorpelzellen wurde in einem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium bzw. einem MEM-Wachstumsmedium kultiviert.
Ein Überstand von jedem Medium (Kulturüberstand)
wurde den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben, sie wurden kultiviert
und anschließend wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
davon gemessen. Ein HAM-Medium oder ein MEM-Medium wurde als das
Medium zum Kultivieren der Maus-C3H10T1/2-Zellen verwendet.
-
Bei
der Verwendung des HAM-Mediums zum Kultivieren der Maus-C3H10T1/2-Zellen
wurde beobachtet, dass die alkalische Phosphatase-Aktivität
davon, die nur durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, zunahm.
-
Die
folgenden Abkürzungen zeigen die zugegebenen Überstände.
GC-Differenzierungsüberstand: Überstand des den
Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten
kultiviert wurden; GC-Wachstumsüberstand: Überstand
des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden; RC-Differenzierungsüberstand: Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem
ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden; RC-Wachstumsüberstand: Überstand
des MEM-Wachstumsmediums, in dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden;
AC-Differenzierungsüberstand: Überstand des den
Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem Gelenkknorpelzellen
kultiviert wurden; AC-Wachstumsüberstand: Überstand
des MEM-Wachstumsmediums, in dem Gelenkknorpelzellen kultiviert
wurden.
-
Jeder
Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe von jeweils dem
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium
kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde.
-
10 zeigt die alkalische Phosphatase-Aktivität
von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe eines Wirkstoffs kultiviert
wurden, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu
induzierten Osteoblasten induzieren kann, der von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten erzeugt wurde, nachdem sie erwärmt wurden.
Ein Überstand eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden (Kulturüberstand), wurde einer Wärmebehandlung
für 3 min in kochendem Wasser unterzogen.
-
Der
nicht-wärmebehandelte Überstand, der wärmebehandelte Überstand
und das den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium allein
wurden jeweils den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben und nach 72 h
wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität davon bestimmt.
Die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des wärmebehandelten Überstands kultiviert
wurden, nahm nicht zu. Somit wurde bestätigt, dass der
Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen
zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, durch die Wärmebehandlung
degeneriert (deaktiviert) wurde.
-
Die
folgenden Abkürzungen zeigen die zugegebenen Überstände.
GC-Wärmebehandlung: Überstand des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden, wärmebehandelt; GC-Differenzierungsüberstand: Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem
hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden;
Nur Differenzierungsüberstand: den Differenzierungswirkstoff
erzeugendes MEM-Medium allein.
-
Jeder
Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt
wurde.
-
11A zeigt die TGFβ-Aktivität
in einem Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums,
das einen die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff beinhaltet.
-
11B zeigt die BMP-Aktivität in einem Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, das einen
die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden Wirkstoff
beinhaltet.
-
12A zeigt eine Röntgenaufnahme (links)
und eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie (rechts)
eines Pellets aus C3H10T1/2-Zellen. Das Pellet wurde aus 5 × 105 C3H10T1/2-Zellen geformt, die in einem
Medium kultiviert wurden, das einen Überstand eines den
Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums enthielt, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten für 1 Woche kultiviert und anschließend
unter die dorsale Haut einer CH3-Maus (Nummer 1) implantiert wurden.
-
4
Wochen nach Implantierung wurde das Pellet chirurgisch entfernt
und dann röntgengrafisch untersucht und mittels computerisierter
Mikrotomographie abgebildet. Hier wurde die Bildgebung durchgeführt,
da ein Schatten in der Röntgenaufnahme des Pellets beobachtet
wurde.
-
12B zeigt eine Röntgenaufnahme (links)
und eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie (rechts)
eines Pellets der C3H10T1/2-Zellen, die einer anderen Empfängermaus
(Nummer 2) implantiert wurden, in dem gleichen Zustand wie 12A.
-
12C zeigt eine Röntgenaufnahme (links)
und eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie (rechts)
eines Pellets der C3H10T1/2-Zellen, die einer anderen Empfängermaus
(Nummer 3) implantiert wurden, in dem gleichen Zustand wie 12A.
-
12D zeigt eine Röntgenaufnahme (links)
und eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie (rechts)
eines Pellets aus C3H10T1/2-Zellen. Das Pellet wurde aus 5 × 105 C3H10T1/2-Zellen geformt, die in einem
Medium kultiviert wurden, das einen Überstand eines den
Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums enthielt, in dem nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten für 1 Woche kultiviert und anschließend unter
die dorsale Haut der CH3-Maus (Nummer 1, zur Gewinnung der 12A verwendet) implantiert wurden.
-
4
Wochen nach Implantierung wurde das Pellet chirurgisch entfernt
und dann röntgenografisch untersucht und mittels computerisierter
Mikrotomographie abgebildet. Hier wurde die Bildgebung durchgeführt,
da ein Schatten in der Röntgenaufnahme des Pellets beobachtet
wurde.
-
12E zeigt Röntgenaufnahmen von Pellets
der C3H10T1/2-Zellen, die in die anderen Empfängermäuse
(Nummer 2 bzw. 3, zur Gewinnung der 12B und 12C verwendet) implantiert wurden, in dem gleichen
Zustand wie 12D. Hier wurde die Bildgebung
mittels computerisierter Mikrotomographie nicht durchgeführt,
da keine Schatten in der Röntgenaufnahme der Pellets beobachtet
wurden.
-
13A bis 13D zeigen
Verbundmaterialien vor Implantierung, wobei jedes unter Verwendung
von Collagengel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wurde. 13A zeigt eine
Probe mit HE-Färbung (20-fache Vergrößerung). 13B zeigt eine Probe mit TB-Färbung
(20-fache Vergrößerung). 13C zeigt
eine Probe mit AB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 13D zeigt eine Probe mit SO-Färbung
(20-fache Vergrößerung).
-
13E zeigt eine Röntgenaufnahme
einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Collagengel und hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte
implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde.
Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines
Siliconrings, der in die Ratte zur Bestimmung der implantierten
Region eingebettet wurde. Eine Calcifizierung ist an dem inneren
Mittelteil des Rings bestätigt.
-
13F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten
Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur
Gewinnung der 13E verwendet wurde,
erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine
Abbildung eines Siliconrings, der in die Ratte zur Bestimmung der
implantierten Region eingebettet wurde. Eine Calcifizierung ist
an dem inneren Mittelteil des Rings bestätigt.
-
14A bis 14D zeigen
vollständige Abbildungen von Geweben, die jeweils erhalten
wurden, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Collagengel
und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde,
unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach
Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt
wurde.
-
14A zeigt die implantierte Region mit
HE-Färbung (35-fache Vergrößerung). 14B zeigt die implantierte Region mit
TB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 14C zeigt die implantierte Region mit
AB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 14D zeigt die implantierte Region mit
SO-Färbung (35-fache Vergrößerung).
-
15A bis 15D zeigen
vergrößerte Ansichten (4-fache Vergrößerung)
von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Collagengel und hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 13A bis 13D gezeigt ist, unter die dorsale Haut
einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch
entfernt und anschließend angefärbt wurde. 15A bis 15D entsprechen 14A bis 14D.
-
16A bis 16D zeigen
vergrößerte Ansichten (10-fache Vergrößerung)
von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Collagengel und hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 13A bis 13D gezeigt ist, unter die dorsale Haut
einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch
entfernt und anschließend angefärbt wurde. 16A bis 16D entsprechen 14A bis 14D.
-
17A bis 17D zeigen
Verbundmaterialien vor Implantierung, wobei jedes unter Verwendung
von Alginsäure und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wurde. 17A zeigt eine
Probe mit HE-Färbung (20-fache Vergrößerung). 17B zeigt eine Probe mit TB-Färbung
(20-fache Vergrößerung). 17C zeigt
eine Probe mit AB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 17D zeigt eine Probe mit SO-Färbung
(20-fache Vergrößerung).
-
17E zeigt eine Röntgenaufnahme
einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Alginsäure und hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte
implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde.
Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines
Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil
des Rings bestätigt.
-
17F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten
Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur
Gewinnung der 17E verwendet wurde,
erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine
Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem
inneren Mittelteil des Rings bestätigt.
-
18A bis 18D zeigen
vollständige Abbildungen von Geweben, die jeweils erhalten
wurden, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Alginsäure
und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde,
unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach
Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt
wurde.
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18A zeigt die implantierte Region mit
HE-Färbung (35-fache Vergrößerung). 18B zeigt die implantierte Region mit
TB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 18C zeigt die implantierte Region mit
AB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 18D zeigt die implantierte Region mit
SO-Färbung (35-fache Vergrößerung).
-
19A bis 19D zeigen
vergrößerte Ansichten (4-fache Vergrößerung)
von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Alginsäure und hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 17A bis 17D gezeigt ist, unter die dorsale Haut
einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch
entfernt und anschließend angefärbt wurde. 19A bis 19D entsprechen 18A bis 18D.
-
20A bis 20D zeigen
vergrößerte Ansichten (10-fache Vergrößerung)
von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Alginsäure und hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 17A bis 17D gezeigt ist, unter die dorsale Haut
einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch
entfernt und anschließend angefärbt wurde. 20A bis 20D entsprechen 18A bis 18D.
-
21A bis 21D zeigen
Verbundmaterialien vor Implantierung, wobei jedes unter Verwendung
von Matrigel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wurde. 21A zeigt eine
Probe mit HE-Färbung (20-fache Vergrößerung). 21B zeigt eine Probe mit TB-Färbung (20-fache
Vergrößerung). 21C zeigt
eine Probe mit AB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 21D zeigt eine Probe mit SO-Färbung
(20-fache Vergrößerung).
-
21E zeigt eine Röntgenaufnahme einer
implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Matrigel und hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte
implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde.
Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines
Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil
des Rings bestätigt.
-
21F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten
Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur
Gewinnung der 21E verwendet wurde,
erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine
Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem
inneren Mittelteil des Rings bestätigt.
-
22A bis 22D zeigen
vollständige Abbildungen von Geweben, die jeweils erhalten
wurden, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Matrigel
und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde,
unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach
Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt
wurde.
-
22A zeigt die implantierte Region mit
HE-Färbung (35-fache Vergrößerung). 22B zeigt die implantierte Region mit
TB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 22C zeigt die implantierte Region mit
AB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 22D zeigt die implantierte Region mit
SO-Färbung (35-fache Vergrößerung).
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23A bis 23D zeigen
vergrößerte Ansichten (4-fache Vergrößerung)
von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Matrigel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wurde und jeweils in 22A bis 22D gezeigt ist, unter die dorsale Haut
einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch
entfernt und anschließend angefärbt wurde. 23A bis 23D entsprechen 22A bis 22D.
-
24A bis 24D zeigen
vergrößerte Ansichten (10-fache Vergrößerung)
von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Matrigel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wurde und jeweils in 22A bis 22D gezeigt ist, unter die dorsale Haut
einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch
entfernt und anschließend angefärbt wurde. 24A bis 24D entsprechen 22A bis 22D.
-
25A bis 25D zeigen
Verbundmaterialien vor Implantierung, wobei jedes unter Verwendung
von Collagengel und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wurde. 25A zeigt eine
Probe mit HE-Färbung (20-fache Vergrößerung). 25B zeigt eine Probe mit TB-Färbung
(20-fache Vergrößerung). 25C zeigt
eine Probe mit AB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 25D zeigt eine Probe mit SO-Färbung
(20-fache Vergrößerung).
-
25E zeigt eine Röntgenaufnahme
einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Collagengel und nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte
implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt
wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung
eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil
des Rings nicht bestätigt.
-
25F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten
Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur
Gewinnung der 25E verwendet wurde,
erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine
Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem
inneren Mittelteil des Rings nicht bestätigt.
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26A bis 26D zeigen
vollständige Abbildungen von Geweben, die jeweils erhalten
wurden, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Collagengel
und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt
wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen
nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend
angefärbt wurde.
-
26A zeigt die implantierte Region mit
HE-Färbung (35-fache Vergrößerung). 26B zeigt die implantierte Region mit
TB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 26C zeigt die implantierte Region mit
AB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 26D zeigt die implantierte Region mit
SO-Färbung (35-fache Vergrößerung).
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27A bis 27D zeigen
vergrößerte Ansichten (4-fache Vergrößerung)
von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Collagengel und nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 26A bis 26D gezeigt ist, unter die dorsale Haut
einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch
entfernt und anschließend angefärbt wurde. 27A bis 27D entsprechen 26A bis 26D.
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28A bis 28D zeigen
Verbundmaterialien vor Implantierung, wobei jedes unter Verwendung
von Alginsäure und nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde. 28A zeigt
eine Probe mit HE-Färbung (20-fache Vergrößerung). 28B zeigt eine Probe mit TB-Färbung
(20-fache Vergrößerung). 28C zeigt
eine Probe mit AB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 28D zeigt eine Probe mit SO-Färbung
(20-fache Vergrößerung).
-
28E zeigt eine Röntgenaufnahme
einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Alginsäure und nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte
implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt
wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung
eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil
des Rings nicht bestätigt.
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28F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten
Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur
Gewinnung der 28E verwendet wurde,
erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine
Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem
inneren Mittelteil des Rings nicht bestätigt.
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29A bis 29D zeigen
vollständige Abbildungen von Geweben, die jeweils erhalten
wurden, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Alginsäure
und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt
wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen
nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend
angefärbt wurde.
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29A zeigt die implantierte Region mit
HE-Färbung (35-fache Vergrößerung). 29B zeigt die implantierte Region mit
TB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 29C zeigt die implantierte Region mit
AB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 29D zeigt die implantierte Region mit
SO-Färbung (35-fache Vergrößerung).
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30A bis 30D zeigen
vergrößerte Ansichten (4-fache Vergrößerung)
von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Alginsäure und nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 28A bis 28D gezeigt ist, unter die dorsale Haut
einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch
entfernt und anschließend angefärbt wurde. 30A bis 30D entsprechen 29A bis 29D.
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31A bis 31D zeigen
Verbundmaterialien vor Implantierung, wobei jedes unter Verwendung
von Matrigel und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wurde. 31A zeigt eine
Probe mit HE-Färbung (20-fache Vergrößerung). 31B zeigt eine Probe mit TB-Färbung (20-fache
Vergrößerung). 31C zeigt
eine Probe mit AB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 31D zeigt eine Probe mit SO-Färbung
(20-fache Vergrößerung).
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31E zeigt eine Röntgenaufnahme einer
implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Matrigel und nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte
implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt
wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung
eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil
des Rings nicht bestätigt.
-
31F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten
Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur
Gewinnung der 31E verwendet wurde, erhalten
wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung
eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil
des Rings nicht bestätigt.
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32A bis 32D zeigen
vollständige Abbildungen von Geweben, die jeweils erhalten
wurden, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Matrigel
und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt
wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen
nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend
angefärbt wurde.
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32A zeigt die implantierte Region mit
HE-Färbung (35-fache Vergrößerung). 32B zeigt die implantierte Region mit
TB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 32C zeigt die implantierte Region mit
AB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 32D zeigt die implantierte Region mit
SO-Färbung (35-fache Vergrößerung).
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33A bis 33D zeigen
vergrößerte Ansichten (4-fache Vergrößerung)
von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial,
das unter Verwendung von Matrigel und nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 31A bis 31D gezeigt
ist, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen
nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend
angefärbt wurde. 33A bis 33D entsprechen 32A bis 32D.
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34A zeigt eine Röntgenaufnahme
einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem nur Hydroxylapatit
unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach
Implantierung chirurgisch entfernt wurde. In 34A beträgt
die Länge des links oben gezeigten Balkens 100,00 μm. 34B zeigt eine vergrößerte
Ansicht (20-fache Vergrößerung) von 34A.
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34C zeigt eine Röntgenaufnahme
einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem nur Collagengel
unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach
Implantierung chirurgisch entfernt wurde.
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34D zeigt eine Aufnahme einer computerisierten
Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur
Gewinnung der 34C verwendet wurde, erhalten
wurde.
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34E zeigt eine Röntgenaufnahme
einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem nur Alginsäure
unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach
Implantierung chirurgisch entfernt wurde. 34F zeigt
eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie, die durch
Abbildung der gleichen Probe, die zur Gewinnung der 34E verwendet
wurde, erhalten wurde.
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34G zeigt eine Röntgenaufnahme
einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem nur Matrigel
unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach
Implantierung chirurgisch entfernt wurde. 34H zeigt
eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie, die durch
Abbildung der gleichen Probe, die zur Gewinnung der 34G verwendet
wurde, erhalten wurde.
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Hier
ist in jeder 34C bis 34H die
kreisförmige Abbildung eine Abbildung des Siliconrings.
Eine Calcifizierung ist bei sämtlichen Gerüsten
nicht bestätigt.
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35A zeigt von Ratten-Costa stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten, die zu einem Pellet geformt und kultiviert wurden
(35-fache Vergrößerung). In 35A wird
ein vergrößertes Gewebe beobachtet. 35B zeigt aus Ratten-Costa stammende nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten, die zu einem Pellet geformt und kultiviert wurden
(35-fache Vergrößerung). In 35B wird
bestätigt, dass die nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten nicht vergrößert sind.
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35C zeigt eine Röntgenaufnahme
einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Pellet von
Ratten-Costa stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
gebildet, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen
nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde. Hier ist die kreisförmige
Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung
ist an dem inneren Mittelteil des Rings bestätigt.
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35D zeigt eine Aufnahme einer computerisierten
Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur
Gewinnung der 35C verwendet wurde,
erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine
Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem
inneren Mittelteil des Rings bestätigt.
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35E zeigt eine Röntgenaufnahme
einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Pellet von
Ratten-Costa stammenden nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten gebildet, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert
und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde. Hier
ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings
und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings nicht
bestätigt.
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35F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten
Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur
Gewinnung der 35E verwendet wurde,
erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine
Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem
inneren Mittelteil des Rings nicht bestätigt.
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36A bis 36D zeigen
Gewebe, das jeweils erhalten wurde, indem ein Pellet von Ratten-Costa
stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gebildet,
unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert, 4 Wochen nach Implantierung
chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt
wurde.
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36A zeigt die implantierte Region mit
HE-Färbung (4-fache Vergrößerung). 36B zeigt die implantierte Region mit
TB-Färbung (4-fache Vergrößerung). 36C zeigt die implantierte Region mit
AB-Färbung (4-fache Vergrößerung). 36D zeigt die implantierte Region mit
SO-Färbung (4-fache Vergrößerung).
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37A bis 37D zeigen
vergrößerte Ansichten (10-fache Vergrößerung)
von Gewebe, das jeweils erhalten wurde, indem das Pellet, das von
Ratten-Costa stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gebildet
wurde und in 35A gezeigt ist, unter
die dorsale Haut einer Ratte implantiert, 4 Wochen nach Implantierung
chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt
wurde. 37A bis 37D entsprechen 36A bis 36D.
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38A bis 38D zeigen
Gewebe, das jeweils erhalten wurde, indem ein Pellet von Ratten-Costa
stammenden nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
gebildet, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert, 4 Wochen
nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend
angefärbt wurde.
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38A zeigt die implantierte Region mit
HE-Färbung (4-fache Vergrößerung). 38B zeigt die implantierte Region mit
TB-Färbung (4-fache Vergrößerung). 38C zeigt die implantierte Region mit
AB-Färbung (4-fache Vergrößerung). 38D zeigt die implantierte Region mit
SO-Färbung (4-fache Vergrößerung).
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39(1) zeigt eine Aufnahme einer alkalischen
Phosphatase-Färbung von menschlichen undifferenzierten
mesenchymalen Stammzellen, die kultiviert wurden, indem ein Überstand
eines Wirkstoff-erzeugenden Mediums zugegeben wurde, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden (Wirkstoff-haltiges Differenzierungsmedium).
Es wurde bestätigt, dass die menschlichen undifferenzierten
mesenchymalen Stammzellen rot gefärbt wurden.
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39(2) zeigt eine Aufnahme einer alkalischen
Phosphatase-Färbung von menschlichen undifferenzierten
mesenchymalen Stammzellen, die kultiviert wurden, indem nur ein
den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium, d. h. ein
Medium, das keinen Wirkstoff gemäß der vorliegenden
Erfindung, sondern Dexamethason (Osteoblasten-Differenzierungsmedium
nach Maniatopoulos) beinhaltet, zugegeben wurde. Es wurde bestätigt,
dass die menschlichen undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen
schwach rot gefärbt wurden.
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39(3) zeigt eine Aufnahme einer alkalischen
Phosphatase-Färbung von menschlichen undifferenzierten
mesenchymalen Stammzellen, die kultiviert wurden, indem nur ein
MEM-Wachstumsmedium (ohne Wirkstoff und ohne Dexamethason) zugegeben
wurde. Es wurde bestätigt, dass die menschlichen undifferenzierten
mesenchymalen Stammzellen kaum angefärbt wurden. Hier wurde
jeder der vorstehenden Abläufe dreimal durchgeführt.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung wird im Folgenden beschrieben. Es wird verstanden,
außer es ist anders angegeben, dass die Darstellungen in
der Einzahl in der vorliegenden Beschreibung den Plural davon einschließen.
Deshalb wird verstanden, außer es ist spezifisch beschrieben,
dass Einzahlartikel (zum Beispiel ”a”, ”an” und ”the” und
dergleichen in der englischen Sprache) den Plural einschließen.
-
Es
wird ebenfalls verstanden, dass die hier verwendeten Begriffe die
Definitionen aufweisen, die herkömmlich im Stand der Technik
verwendet werden, außer es ist anders angegeben. Deshalb
haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier
verwendet werden, außer es ist anders angegeben, dieselbe Bedeutung,
wie sie der Fachmann für gewöhnlich versteht.
Ansonsten geht die vorliegende Anmeldung (einschließlich
der Definitionen) vor.
-
(Definition von Begriffen)
-
Die
Definitionen der Begriffe, die hier insbesondere verwendet werden,
sind im Folgenden aufgezählt.
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Ein ”Verbundmaterial”,
so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Material, das Zellen
und ein Gerüst einschließt.
-
Beispiele
für einen ”Knochendefekt”, so wie hier
verwendet, beinhalten Läsionen, wie Knochentumore, Osteoporose,
rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Osteomyelitis und Osteonekrosis;
Korrekturen, wie Immobilisierung des Knochens, Foraminotomie und
Osteotomie; Trauma, wie eine komplexe Fraktur; Knochendefekte, die
von einer Entnahme aus Hüftknochen stammen; und dergleichen,
sind jedoch nicht darauf eingeschränkt.
-
”Förderung” der
Osteogenese, so wie hier verwendet, bedeutet die Steigerung der
Rate der Osteogenese in dem Fall, wo eine gewünschte Veränderung
in einer Region vorgenommen wurde, wo die Osteogenese bereits eingesetzt
hat. ”Induzieren” der Osteogenese bedeutet, dass
die Osteogenese in dem Fall induziert wird, wo eine gewünschte
Veränderung in einer Region vorgenommen wurde, wo die Osteogenese
noch nicht induziert wurde.
-
”Reparatur” einer
Region mit Knochendefekt bedeutet, dass die Region mit Knochendefekt
einen normalen Zustand erlangt oder einem solchen Zustand nahe kommt.
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Eine ”Größe,
die nicht durch Immobilisierung allein repariert werden kann”,
so wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Größe,
die die Verwendung eines Implantats oder Knochenersatzmaterials
erfordert.
-
(Zellen)
-
”Wachsende
Knorpelzellen” oder ”wachsende Chondrozyten” werden
hier austauschbar verwendet und betreffen Zellen in einem Gewebe
(d. h. wachsender Knorpel), das während einer Entwicklungs-
oder Wachstumsstufe und eines Zeitraums der Erholung und Proliferation
des Knochens Knochen bildet. Der wachsende Knorpel bezieht sich
auf allgemein ein Gewebe, das den Knochen während der Wachstumsstufe
bildet, während es hier ein Gewebe bedeutet, das den Knochen
während der Entwicklungs- oder Wachstumsstufe und des Zeitraums
der Proliferation oder Erholung des Knochens bildet.
-
Die
wachsenden Knorpelzellen (wachsende Chondrozyten) werden auch als
hypertrophierungsfähige Chondrozyten, calcifizierungsfähige
Chondrozyten oder Chondrozyten aus Epiphyse(nlinie) bezeichnet.
Werden die wachsenden Knorpelzellen beim Menschen verwendet, sind
aus Menschen stammende Zellen bevorzugt, allerdings ist es auch
möglich, nicht-menschliche Zellen zu verwenden, da Probleme,
wie Immunabstoßung, unter Verwendung von wohl bekannten
Verfahren des Standes der Technik vermieden werden können.
-
Die
wachsenden Knorpelzellen gemäß der vorliegenden
Erfindung stammen aus einem Säugetier, vorzugsweise aus
Menschen, Mäusen, Ratten oder Kaninchen.
-
Die
wachsenden Knorpelzellen gemäß der vorliegenden
Erfindung können aus einer Knorpel-Knochen-Verbindung der
Costa, einer Epiphysenlinie von Röhrenknochen (z. B. Femur,
Tibia, Fibula, Numerus, Ulna und Radius), einer Epiphysenlinie von
Wirbeln, einer Knorpel-Proliferationszone von Handknochen, Fußknochen,
Brustknochen und anderen, Perichondrium, aus Fötus-Knorpel
gebildetem Knochen-Primordium, einer Callus-Region einer heilenden
Knochenfraktur und einem kartilaginären Teil einer Knochen-Proliferationsphase
gewonnen werden. Diese wachsenden Knorpelzellen können
beispielsweise unter Verwendung der in den Beispielen der vorliegenden
Beschreibung beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
-
”Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf
Zellen, die hypertrophisches Wachstum in der Zukunft durchlaufen
können. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
beinhalten beliebige andere hypertrophierungsfähige Zellen,
die mit einem Verfahren zur Bestimmung einer ”Fähigkeit zur
Hypertrophierung” bestimmt werden, das nachstehend definiert
ist, zusätzlich zu ”wachsenden Knorpelzellen”,
die aus einem biologischen Organismus gewonnen werden.
-
Die
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gemäß der
vorliegenden Erfindung stammen von einem Säugetier, vorzugsweise
Menschen, Mäusen, Ratten oder Kaninchen. Werden die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
beim Menschen verwendet, sind aus Menschen stammende Zellen bevorzugt,
allerdings ist es auch möglich, nicht-menschliche Zellen
zu verwenden, da Probleme, wie Immunabstoßung, unter Verwendung von
wohl bekannten Verfahren des Standes der Technik vermieden werden
können.
-
Die
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gemäß der
vorliegenden Erfindung können zum Beispiel aus einer Knorpel-Knochen-Verbindung
der Costa, einer Epiphysenlinie von Röhrenknochen (z. B.
Femur, Tibia, Fibula, Numerus, Ulna und Radius), einer Epiphysenlinie
von Wirbeln, einer Knorpel-Proliferationszone von Handknochen, Fußknochen,
Brustknochen und anderen, Perichondrium, aus Fetus-Knorpel gebildetem Knochen-Primordium,
einer Callus-Region einer heilenden Knochenfraktur und einem kartilaginären
Teil einer Knochen-Proliferationsphase gewonnen werden. Die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten gemäß der vorliegenden Erfindung
können ferner durch Induzieren der Differenzierung von
undifferenzierten Zellen gewonnen werden.
-
Die
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gemäß der
vorliegenden Erfindung können Chondrozyten sein, die aus
beliebigen von den vorstehend beschriebenen Regionen verschiedenen
Regionen gewonnen werden. Da Knochen, der durch endochondrale Ossifikation
(enchondrale Ossifikation) gebildet wurde, unabhängig von
Körperregionen über den gleichen Mechanismus gebildet
wird. Mit anderen Worten wird Knorpel gebildet und durch Knochen
ersetzt.
-
Ein
Großteil der von dem Cranium und Clavicula verschiedenen
Knochen wird durch endochondrale Ossifikation (enchondrale Ossifikation)
gebildet. Daher sind die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
in dem größten Teil der von dem Cranium und Clavicula
verschiedenen Knochen des Körpers vorhanden. Die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten besitzen die Fähigkeit zur Induzierung der
Osteogenese.
-
Die
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten können morphologisch
durch Hypertrophie gekennzeichnet sein.
-
”Hypertrophie”,
so wie hier verwendet, kann morphologisch unter einem Mikroskop
bestimmt werden. Wenn Zellen zur Bildung einer Wachstumsschicht
säulenartig angeordnet sind, wird die Hypertrophie der
Zellen benachbart zur Wachstumsschicht beobachtet. Wenn die Zellen
nicht säulenförmig angeordnet sind, bedeutet andererseits
die Hypertrophie der Zellen einen Zustand, in dem sie größer
sind als marginale Zellen.
-
Die
Fähigkeit zur Hypertrophie wird wie folgt bestimmt: Zentrifugieren
einer HAM-F12 Kulturlösung, das 5 × 105 Zellen enthält, zur Bildung eines
Pellets aus den Zellen, Kultivieren des Pellets für einen
vorbestimmten Zeitraum und Vergleichen der Größen
der Zellen vor und nach der Zellkultur unter einem Mikroskop. Wenn
bei diesem Vergleich eine signifikante Zunahme der Größen
beobachtet wird, besitzen die Zellen die Fähigkeit zur
Hypertrophie.
-
”Ruhende
Knorpelzellen” oder ”ruhende Chondrozyten” werden
hier austauschbar verwendet und betreffen Knorpelzellen oder Chondrozyten,
die in einer Region beabstandet von der Knorpel-Knochen-Verbindung
der Costa (Knorpel-Proliferationszone) angeordnet sind. Die Region
ist ein Gewebe, das während der gesamten Lebensdauer als
Knorpel existiert. In dem ruhenden Knorpel befindliche Zellen werden
als ruhende Knorpelzellen bezeichnet. ”Gelenkknorpelzellen”,
so wie hier verwendet, betreffen Zellen in einem kartilaginären
Gewebe (Gelenkknorpel), das auf einer Gelenkoberfläche
liegen.
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Die
Chondrozyten, so wie hier verwendet, werden durch Identifizierung
der Expression von mindestens einem Marker, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Typ-II-Collagen, Knorpel-Proteoglycan
(Aglycan) oder Komponenten davon, Hyaluronsäure, Typ-IX-Collagen,
Typ-XI-Collagen und Chondromodulin, bestimmt. Unter den Chondrozyten
werden hypertrophierungsfähige Zellen weiterhin durch Identifizieren
der Expression von mindestens einem Marker, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Typ-X-Collagen, alkalischer Phosphatase
und Osteonectin, bestimmt. Chondrozyten, die keines von Typ-X-Collagen,
alkalischer Phosphatase oder Osteonectin exprimieren, werden als
nich-hypertrophierungsfähig bestimmt.
-
Darum
können die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten,
so wie hier verwendet, auch durch Identifizieren der Expression
von mindestens einem, ausgewählt aus Chondrozyten-Markern,
und mindestens einem, ausgewählt aus Markern für
hypertrophierungsfähige Chondrozyten, anstelle der Feststellung
der morphologischen Hypertrophie bestimmt werden. Die Lokalisierung
oder Expression dieser Marker wird durch jedes beliebige Verfahren
der Analyse von aus Kulturzellen extrahierten Proteinen oder RNA,
wie spezifisches Färben, immunhistochemische Verfahren,
in situ Hybridisierung, Western-Blotting oder PCR, identifiziert.
-
Ein ”Chondrozyten-Marker
(Marker für Chondrozyten)”, so wie hier verwendet,
bezieht sich auf jede Substanz, deren Lokalisierung oder Expression
in den Chondrozyten die Identifikation davon unterstützt.
Vorzugsweise bezeichnet er eine beliebige Substanz, die zur Identifizierung
des Chondrozyten durch ihre Lokalisierung oder Expression (beispielsweise
Lokalisierung oder Expression von Typ-II-Collagen, Knorpel-Proteoglycan
(Aglycan) oder von Komponenten davon, Hyaluronsäure, Typ-IX-Collagen,
Typ-XI-Collagen oder Chondromodulin) verwendet werden kann.
-
Ein ”Marker
für hypertrophierungsfähige Chondrozyten”,
so wie hier verwendet, bezieht sich auf jede Substanz, deren Lokalisierung
oder Expression in den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
die Identifizierung davon unterstützt. Vorzugsweise bezieht
er sich auf jede Substanz, die zur Identifizierung der hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten durch ihre Lokalisierung oder Expression (beispielsweise
Lokalisierung oder Expression von Typ-X-Collagen, alkalischer Phosphatase
oder Osteonectin) verwendet werden kann.
-
”Knorpel-Proteoglycan”,
so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Makromolekül,
das aus einem Kernprotein und einer Vielzahl von Glucosaminoglycanen,
die mit dem Kernprotein verbunden sind, zusammengesetzt ist. Beispiele
für Glucosaminoglycane beinhalten Chondroitintetrasulfat,
Chondroitinhexasulfat, Keratansulfat, O-verknüpftes Oligosaccharid,
N-verknüpftes Oligosaccharid und dergleichen. Das Knorpel-Proteoglycan
bindet ferner über ein Verknüpfungsprotein unter
Bildung von Knorpel-Proteoglycan-Aggregaten an Hyaluronsäure.
In dem kartilaginären Gewebe ist das Glucosaminoglycan
reichlich vorhanden und nimmt 20 bis 40% des Trockengewichts des
Gewebes ein. Knorpel-Proteoglycan wird auch als Aglycan bezeichnet.
-
”Knochen-Proteoglycan”,
so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Makromolekül,
das ein geringeres Molekulargewicht aufweist als Knorpel-Proteoglycan,
und aus einem Kernprotein und Glucosaminoglycanen, die mit dem Kernprotein
verbunden sind, zusammengesetzt ist. Beispiele für Glucosaminoglycane
beinhalten Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, O-verknüpfte
Oligosaccharide, N-verknüpfte Oligosaccharide und dergleichen.
In dem Knochengewebe nimmt Glucosaminoglycan 1% oder weniger des
Trockengewichts des decalcifizierten Knochens ein. Beispiele für
Knochen-Proteoglycan beinhalten Decorin und Biglycan.
-
”Osteoblasten”,
so wie hier verwendet, beziehen sich auf Zellen, die auf der Knochenmatrix
liegen und die Knochenmatrix bilden und sie calcifizieren. Osteoblasten
sind Zellen mit einer Größe von 20 bis 30 μm
und von würfelförmiger oder säulenförmiger
Form. So wie hier verwendet, können Osteoblasten ”Präosteoblasten” einschließen,
der Vorläuferzellen für die Osteoblasten sind.
-
Die
Osteoblasten werden durch Identifizieren der Expression von mindestens
einem Marker, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Typ-I-Collagen,
Knochen-Proteoglycan (z. B. Decorin, Biglycan), alkalischer Phosphatase,
Osteocalcin, Matrix-Gla-Protein, Osteoglycin, Osteopontin, Knochenprotein
mit Sialinsäure, Osteonectin und Pleiotrophin, bestimmt.
Zusätzlich können die Osteoblasten durch Identifizieren
einer fehlenden Expression von Chondrozyten-Markern, wie Typ-II-Collagen,
Knorpel-Proteoglycan (Aglycan) oder von Komponenten davon, Hyaluronsäure,
Typ-IX-Collagen, Typ-XI-Collagen oder Chondromodulin, bestimmt werden.
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Die
Lokalisierung oder Expression dieser Marker wird durch beliebige
Verfahren zur Analyse von aus Kulturzellen extrahierten Proteinen
oder RNA, wie spezifisches Färben, immunhistochemische
Verfahren, in situ Hybridisierung, Western-Blotting oder PCR, identifiziert.
-
Ein ”Osteoblasten-Marker
(Marker für Osteoblasten)”, so wie hier verwendet,
bezieht sich auf jede Substanz, deren Lokalisierung oder Expression
in den Osteoblasten die Identifizierung davon unterstützt.
Vorzugsweise bezeichnet er jede Substanz, die zur Identifizierung
der Osteoblasten durch ihre Lokalisierung oder Expression (beispielsweise
Lokalisierung oder Expression von Typ-I-Collagen, Knochen-Proteoglycan
(z. B. Decorin, Biglycan), alkalischer Phosphatase, Osteocalcin,
Matrix-Gla-Protein, Osteoglycin, Osteopontin, Knochenprotein mit
Sialinsäure, Osteonectin oder Pleiotrophin) verwendet werden
kann.
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Osteoglycin
wird als osteoinduktiver Faktor (OIF) bezeichnet. Osteopontin wird
als BSP-I oder 2ar bezeichnet. Knochenprotein mit Sialinsäure
wird als BSP-II bezeichnet. Pleiotrophin wird als Osteoblastenspezifisches
Protein oder Osteoblastenspezifischer Faktor-1 (OSF-1) bezeichnet.
Osteonectin wird als SPARC oder BM-40 bezeichnet.
-
Die
Osteoblasten können beispielsweise folgendermaßen
identifiziert werden: Bestimmen von Zellen als positiv für
einen Marker, der nur Osteoblasten identifiziert; Bestimmen von
Zellen als positiv für einen Marker, der Osteoblasten und
hypertrophierungsfähige Chondrozyten identifiziert, während
er Chondrozyten nicht identifiziert, und Bestimmen von Zellen als
positiv für einen Marker, der Osteoblasten und Chondrozyten
identifiziert, während er hypertrophierungsfähige
Chondrozyten nicht identifiziert; Bestimmen von Zellen als positiv für
einen Marker, der Osteoblasten und hypertrophierungsfähige
Chondrozyten identifiziert, jedoch als negativ für einen
Marker, der Osteoblasten nicht identifiziert, während er
hypertrophierungsfähige Chondrozyten identifiziert; oder
Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der
Osteoblasten und Chondrozyten identifiziert, jedoch als negativ
für einen Marker, der Osteoblasten nicht identifiziert,
während er Chondrozyten identifiziert.
-
Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten können beispielsweise identifiziert werden
durch: Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker,
der nur hypertrophierungsfähige Chondrozyten identifiziert;
Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der
hypertrophierungsfähige Chondrozyten und Osteoblasten identifiziert,
während er Chondrozyten nicht identifiziert, und Bestimmen
von Zellen als positiv für einen Marker, der hypertrophierungsfähige
Chondrozyten und Chondrozyten identifiziert, während er
Osteoblasten nicht identifiziert; Bestimmen von Zellen als positiv
für einen Marker, der hypertrophierungsfähige
Chondrozyten und Osteoblasten identifiziert, jedoch als negativ
für einen Marker, der hypertrophierungsfähige
Chondrozyten nicht identifiziert, während er Osteoblasten
identifiziert; oder Bestimmen von Zellen als positiv für
einen Marker, der hypertrophierungsfähige Chondrozyten
und Chondrozyten identifiziert, jedoch als negativ für
einen Marker, der hypertrophierungsfähige Chondrozyten
nicht identifiziert, während er Chondrozyten identifiziert.
-
(Nicht-hypertrophierungsfähige)
Chondrozyten können beispielsweise identifiziert werden
durch: Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker,
der nur Chondrozyten identifiziert; Bestimmen von Zellen als positiv
für einen Marker, der Chondrozyten und Osteoblasten identifiziert,
während er hypertrophierungsfähige Chondrozyten
nicht identifiziert und Bestimmen von Zellen als positiv für
einen Marker, der Chondrozyten und hypertrophierungsfähige
Chondrozyten identifiziert, während er Osteoblasten nicht
identifiziert; Bestimmen von Zellen als positiv für einen
Marker, der Chondrozyten und Osteoblasten identifiziert, jedoch
als negativ für einen Marker, der Chondrozyten nicht identifiziert,
während er Osteoblasten identifiziert; oder Bestimmen von Zellen
als positiv für einen Marker, der Chondrozyten und hypertrophierungsfähige
Chondrozyten identifiziert, jedoch als negativ für einen
Marker, der Chondrozyten nicht identifiziert, während er
hypertrophierungsfähige Chondrozyten identifiziert.
-
In
der vorliegenden Beschreibung können die Chondrozyten,
die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten und die Osteoblasten
und die induzierte Osteoblasten beispielsweise unter Verwendung
von Kombinationen der nachstehend aufgeführten Marker identifiziert
werden.
| Chondrozyten | Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten | Osteoblasten,
induzierte Osteoblasten |
Typ-II-Collagen,
Knorpel-Proteoglycan (Aglycan), Hyaluronsäure, Typ-IX-Collagen, Typ-XI-Collagen,
Chondromodulin | +: Expression | +: Expression | –: keine Expression |
Typ-X-Collagen | –:
keine Expression | +:
Expression | –:
keine Expression |
Alkalische
Phosphatase, Osteonectin | –:
keine Expression | +:
Expression | +:
Expression |
Typ-I-Collagen,
Knochen-Proteoglycan (z. B. Decorin, Biglycan), Osteocalcin, Matrix-Gla-Protein,
Osteoglycin, Osteopontin, Knochenprotein mit Sialinsäure,
Pleiotrophin | –: keine Expression | –: keine Expression | +: Expression |
-
Ferner
können in der vorliegenden Beschreibung die Chondrozyten,
die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten und die Osteoblasten
zusätzlich zu dem vorstehenden Nachweis der Marker auch
durch Beobachtung der Morphologien davon oder verschiedener angefärbter
Zustande davon identifiziert werden.
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Die
Chondrozyten sind Zellen, deren Aggregatszustand unter einem Mikroskop
beobachtet wird. Die Zellen zeigen Metachromasie bei der sauren
Toluidinblau-Färbung, werden bei der Alcianblau-Färbung
blau gefärbt, werden bei der Safranin-O-Färbung
rot gefärbt und werden bei der alkalischen Phosphatase-Färbung nicht
gefärbt.
-
Wenn
Zellen zur Bildung einer Wachstumsschicht säulenartig angeordnet
sind, werden unter dem Mikroskop die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten als Zellen benachbart zur Wachstumsschicht beobachtet, wobei
sie größer sind als die Zellen, die die Wachstumsschicht
bilden. Wenn die Zellen nicht säulenförmig angeordnet
sind, werden unter dem Mikroskop die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten als Zellen beobachtet, die größer
sind als marginale Zellen.
-
Die
Zellen zeigen Metachromasie bei der sauren Toluidinblau-Färbung,
werden bei der Alcianblau-Färbung blau gefärbt,
werden bei der Safranin-O-Färbung rot gefärbt
und werden bei der alkalischen Phosphatase-Färbung gefärbt.
-
Die
Osteoblasten sind Zellen mit einer Größe von 20
bis 30 μm, von würfelförmiger oder säulenförmiger
Form und besitzen eine alkalische Phosphatase-Aktivität.
-
Die
alkalische Phosphatase-Aktivität wird durch die folgenden
Schritte bestimmt: A) Bestimmen von zwei Extinktionen bei 405 nm
einer Probe, wobei eine Extinktion wie folgt gemessen wird: zu 100 μl
der Probe werden 50 μl 4 mg/ml p-Nitrophenylphosphatlösung
und 50 μl Alkalipuffer (”A9226”, hergestellt
von Sigma) zugegeben, bei 37°C für 15 min umgesetzt
und anschließend werden der Probe 50 μl 1 N NaOH
zum Stoppen der Reaktion zugegeben, und wobei die andere Extinktion
wie folgt gemessen wird: zusätzlich werden der Probe, deren
eine Extinktion bereits bestimmt wurde, 20 μl konzentrierte
Salzsäure zugegeben; und B) Berechnen der Differenz zwischen
den Extinktionen vor und nach Zugabe der konzentrierten Salzsäure.
-
Hier
ist der Extinktionsunterschied ein Indikator für die alkalische Phosphatase-Aktivität.
Wenn ein absoluter Wert des Extinktionsunterschieds steigt, besitzen
die Osteoblasten spezifisch die alkalische Phosphatase-Aktivität.
-
Diese
alkalische Phosphatase-Aktivität kann auch durch die folgenden
Schritte bestimmt werden: A) Bestimmen von zwei Extinktionen bei
405 nm einer Probe, wobei eine Extinktion wie folgt gemessen wird:
zu 100 μl der Probe werden 50 μl 4 mg/ml p-Nitrophenylphosphatlösung
und 50 μl Alkalipuffer (”A9226”, hergestellt
von Sigma) zugegeben, bei 37°C für 15 min umgesetzt
und anschließend werden der Probe 50 μl 1 N NaOH
zum Stoppen der Reaktion zugegeben, und wobei die andere Extinktion
wie folgt gemessen wird: zusätzlich werden der Probe, deren
eine Extinktion bereits bestimmt wurde, 20 μl konzentrierte
Salzsäure zugegeben; und B) Berechnen der Differenz zwischen
den Extinktionen vor und nach Zugabe der konzentrierten Salzsäure.
-
Hier
ist der Extinktionsunterschied ein Indikator für die alkalische
Phosphatase-Aktivität. Wenn ein relativer Wert des Extinktionsunterschieds
um mehr als das etwa 1-Fache steigt, besitzen die Osteoblasten spezifisch
die alkalische Phosphatase-Aktivität.
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0
bis 10 mM p-Nitrophenollösungen werden bei jeder Untersuchung
hergestellt, die Extinktionen werden unter Verwendung der p-Nitrophenollösungen
gemessen und anschließend werden die gemessenen Werte mit
der x-Achse als Konzentration und der y-Achse als Extinktion aufgetragen,
um eine lineare Kalibrierungskurve der Werte zu erstellen. Der absolute
Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität kann aus der
Extinktion basierend auf dieser linearen Kalibrierungskurve berechnet
werden.
-
”Induzierte
Osteoblasten”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf
Zellen, die aus undifferenzierten Zellen mit einem die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff gemäß der
vorliegenden Erfindung induziert wurden. Diese induzierten Osteoblasten
können unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt werden,
das folgendes einschließt: A) einen Schritt der Bereitstellung
eines Überstandes, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in einem einen Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium
erhalten wird, das mindestens eines ausgewählt aus der
Gruppe umfassend ein Glucocorticoid, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure, oder einen die Differenzierung von induzierten
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff beinhaltet, der in dem Überstand
vorliegt; und B) einen Schritt der Kultivierung der undifferenzierten Zellen
in einem Kulturmedium für undifferenzierte Zellen, das
den Überstand oder den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff und eine Mediumkomponente beinhaltet,
bei einer ausreichenden Bedingung, um die undifferenzierten Zellen
zu den induzierten Osteoblasten zu differenzieren.
-
Die
vorstehenden induzierten Osteoblasten können auch unter
Verwendung eines Verfahrens induziert werden, das folgendes einschließt:
A) einen Schritt der Bereitstellung eines die Differenzierung induzierter Osteoblasten
induzierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Medium erhalten wird, das Dexamethason, β-Glycerophosphat,
Ascorbinsäure und eine Serumkomponente beinhaltet; und
B) einen Schritt der Kultivierung der undifferenzierten Zellen in
einem Kulturmedium für undifferenzierte Zellen, das den
die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff
und eine Mediumkomponente beinhaltet, um die undifferenzierten Zellen
zu den induzierten Osteoblasten zu differenzieren.
-
Die
induzierten Osteoblasten der vorliegenden Erfindung zeigen keine
Metachromasie bei der sauren Toluidinblau-Färbung und könnten
sich bei der Safranin-O-Färbung negativ verhalten.
-
Ein ”induzierter
Osteoblasten-Marker (Marker für induzierte Osteoblasten)”,
so wie hier verwendet, bezieht sich auf jede Substanz, deren Lokalisierung
oder Expression in den induzierten Osteoblasten die Identifizierung
davon unterstützt, zum Beispiel jede Substanz, die zur
Identifizierung der induzierten Osteoblasten über ihre
Lokalisierung oder Expression verwendet werden kann. Die induzierten
Osteoblasten sowie natürliche Osteoblasten können
durch Lokalisierung oder Expression der folgenden Marker identifiziert
werden (beispielsweise Lokalisierung oder Expression von Typ-I-Collagen,
Knochen-Proteoglycan (z. B. Decorin, Biglycan), alkalischer Phosphatase,
Osteocalcin, Matrix-Gla-Protein, Osteoglycin, Osteopontin, Knochenprotein
mit Sialinsäure, Osteonectin oder Pleiotrophin).
-
”Induzieren
der Differenzierung”, so wie hier verwendet, bezieht sich
auf den Entwicklungsprozess von Teilen in einem biologischen Organismus,
wie Zellen, Gewebe und Organe, wobei der Entwicklungsprozess ein
Prozess der Induktion der Bildung von Geweben oder Organen mit speziellen
Merkmalen ist. Die Begriffe ”Differenzierung” und ”Induzieren
der Differenzierung” werden hauptsächlich in der
Embryologie, der Entwicklungsbiologie und dergleichen verwendet.
-
Die
Gewebe und Organe in einem biologischen Organismus werden durch
die Teilungen eines befruchteten Eis, das aus einer einzigen Zelle
besteht, bis zum Erreichen des Erwachsenenalters gebildet. Es ist schwierig,
zwischen Zellen und Zellpopulationen in der frühen Entwicklung
eines biologischen Organismus zu unterscheiden, der sich vor der
Differenzierung befindet oder nicht gut differenziert ist, da die
Zellen und Zellpopulationen keinerlei morphologische oder funktionelle
Merkmale aufweisen. Ein solcher Zustand wird als ”undifferenziert” bezeichnet.
-
Außerdem
erfolgt die ”Differenzierung” in einem Organ,
und dadurch entwickeln sich verschiedene Zellen, aus denen das Organ
besteht, zu spezifischen Zellen und Zellpopulationen. Dies wird
als Differenzierung innerhalb des Organs bei der Organogenese bezeichnet.
Eine solche Induzierung der Entwicklung wird auch als Induzierung
der Differenzierung bezeichnet.
-
Eine ”Fähigkeit
zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten”,
so wie hier verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit zur
Induzierung der Differenzierung undifferenzierter Zellen, vorzugsweise embryonaler
Stamm-(ES)-Zellen, embryonaler Keim-(EG)-Stammzellen oder Gewebestammzellen,
stärker bevorzugt mesenchymaler Stammzellen, zu den induzierten
Osteoblasten der vorliegenden Erfindung. Als ein Indikator für
die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten
Osteoblasten kann ein induzierter Osteoblasten-Marker (z. B. alkalische
Phosphatase) verwendet werden.
-
Spezifisch
besitzt der Wirkstoff Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung
zu induzierten Osteoblasten, wenn die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität
von C3H10T1/2-Zellen, die einem in der vorliegenden Erfindung verwendeten
Wirkstoff in einem Eagle-Basalmedium ausgesetzt werden, oder die
alkalische Phosphatase-Aktivität von mesenchymalen Stammzellen,
die dem Wirkstoff in essenziellem Minimalmedium (MEM) ausgesetzt
werden, um mehr als das etwa 1-fache der Aktivität der
jeweiligen Zellen steigt, die in Eagle-Basalmedium oder essenziellen
Minimalmedium ohne Wirkstoff kultiviert wurden (z. B. alkalische
Phosphatase-Aktivität von Ganzzellen).
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Die
alkalische Phosphatase-Aktivität wird durch die folgenden
Schritte bestimmt: A) Bestimmen von zwei Extinktionen bei 405 nm
einer Probe, wobei eine Extinktion wie folgt gemessen wird: zu 100 μl
der Probe, mit oder ohne Wirkstoff, werden 50 μl 4 mg/ml
p-Nitrophenylphosphatlösung und 50 μl Alkalipuffer
(”A9226”, hergestellt von Sigma) zugegeben, bei
37°C für 15 min umgesetzt und anschließend
werden der Probe 50 μl 1 N NaOH zum Stoppen der Reaktion
zugegeben, und wobei die andere Extinktion wie folgt gemessen wird: zusätzlich
werden der Probe, deren eine Extinktion bereits bestimmt wurde,
20 μl konzentrierte Salzsäure zugegeben; und B)
Berechnen der Differenz zwischen den Extinktionen vor und nach Zugabe
der konzentrierten Salzsäure. Hier ist der Extinktionsunterschied
ein Indikator für die alkalische Phosphatase-Aktivität.
-
Ferner
besitzt der Wirkstoff Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung
zu induzierten Osteoblasten, wenn die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität
von C3H10T1/2-Zellen, die einem in der vorliegenden Erfindung verwendeten
Wirkstoff in einem Eagle-Basalmedium ausgesetzt werden, oder die
alkalische Phosphatase-Aktivität von mesenchymalen Stammzellen,
die dem Wirkstoff in essenziellem Minimalmedium (MEM) ausgesetzt
werden, im Vergleich mit der Aktivität der jeweiligen Zellen
steigt, die in Eagle-Basalmedium oder essenziellen Minimalmedium
ohne Wirkstoff kultiviert wurden (z. B. alkalische Phosphatase-Aktivität
von Ganzzellen).
-
Diese
alkalische Phosphatase-Aktivität wird durch die folgenden
Schritte bestimmt: A) Bestimmen von zwei Extinktionen bei 405 nm
einer Probe, wobei eine Extinktion wie folgt gemessen wird: zu 100 μl
der Probe, mit oder ohne Wirkstoff, werden 50 μl 4 mg/ml
p-Nitrophenylphosphatlösung und 50 μl Alkalipuffer
(”A9226”, hergestellt von Sigma) zugegeben, bei
37°C für 15 min umgesetzt und anschließend
werden der Probe 50 μl 1 N NaOH zum Stoppen der Reaktion
zugegeben, und wobei die andere Extinktion wie folgt gemessen wird: zusätzlich
werden der Probe, deren eine Extinktion bereits bestimmt wurde,
20 μl konzentrierte Salzsäure zugegeben; und B)
Berechnen der Differenz zwischen den Extinktionen vor und nach Zugabe
der konzentrierten Salzsäure. Hier ist der Extinktionsunterschied
ein Indikator für die alkalische Phosphatase-Aktivität.
-
0
bis 10 mM p-Nitrophenollösungen werden bei jeder Untersuchung
hergestellt, die Extinktionen werden unter Verwendung der p-Nitrophenollösungen
gemessen und anschließend werden die gemessenen Werte mit
der x-Achse als Konzentration und der y-Achse als Extinktion aufgetragen,
um eine lineare Kalibrierungskurve der Werte zu erstellen. Der absolute
Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität kann aus der
Extinktion basierend auf dieser linearen Kalibrierungskurve berechnet
werden.
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Bisher
wurde diese alkalische Phosphatase-Aktivität als Indikator
für Osteogenese verwendet. Wenn die alkalische Phosphatase-Aktivität
steigt, wird die Osteogenese als fortgeschritten bestimmt (Suda
Tatsuo Hrsg., "kotsukeisei to kotsukyushu oyobi sorera
no tyosetsuinshi 1 [osteogenesis, osteoclasis and regulators thereof
1" Kabushiki Kaisya Hirokawa Shoten [Hirokawa Shoten Co.],
1995, 30. März, S. 39–44.).
-
In
der vorliegenden Beschreibung bezieht sich ”Fähigkeit
zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten” für
undifferenzierte Zellen (z. B. embryonale Stammzellen, embryonale
Keimstammzellen, mesenchymale Stammzellen, hämatopoietische
Stammzellen, vaskuläre Stammzellen, hepatische Stammzellen,
pankreatische (allgemeine) Stammzellen, neurale Stammzellen) auf
die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung der undifferenzierten
Zellen zu den induzierten Osteoblasten.
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Beispielsweise
kann die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung
zu induzierten Osteoblasten die Fähigkeit zur Induzierung
der Differenzierung von undifferenzierten Zellen einschließen,
die nicht durch ein Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und
Ascorbinsäure zu den induzierten Osteoblasten induziert
wurden.
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Die
Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten
Osteoblasten kann durch das folgende Experiment bestimmt werden:
gleichmäßiges Impfen von Zielzellen in einer 24-Well-Platte
(hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte
von 1,25 × 104 Zellen/cm2 (d. h., 2,5 × 104 Zellen/Loch),
Kultivieren der Zellen in einem 5% CO2 Inkubator
bei 37°C für 72 h und anschließendes
Messen des Ausmaßes einer induzierten oder erhöhten
Expression von mindestens einem der induzierten Osteoblasten-Marker.
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”Undifferenzierte
Zellen”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf Zellen,
die die Enddifferenzierung noch nicht erreicht haben, oder auf Zellen,
die die Fähigkeit zur Differenzierung besitzen. In der
vorliegenden Beschreibung können die undifferenzierten
Zellen Stammzellen (z. B. embryonale Stammzellen, embryonale Keimstammzellen
oder Gewebestammzellen) sein. Zum Beispiel können die Stammzellen
mesenchymale Stammzellen (z. B. aus Knochenmark stammende mesenchymale
Stammzellen), hämatopoietische Stammzellen, vaskuläre
Stammzellen, hepatische Stammzellen, pankreatische (allgemeine)
Stammzellen oder neurale Stammzellen sein. Die undifferenzierten
Zellen beinhalten weiterhin sämtliche Zellen auf dem Weg
zur Differenzierung. Solche undifferenzierte Zellen können
C3H10T1/2-Zellen, ATDC5-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen, BALB/3T3-Zellen,
NIH3T3-Zellen, PT-2501-Zellen oder aus primärem Ratten-Knochenmark
stammende Stammzellen sein.
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Diese
Zellen können von ansässigen und ausländischen
Firmen bezogen werden, wie Sanko Junyaku Co., Ltd., Cosmo Bio Co.,
Ltd., Takara Bio Inc., Toyobo Co., Ltd., Summit Pharma Biomedical,
Cambrex Corporation, Stem Cell Technology, Invitrogen Corporation,
eine Zellbank und dergleichen zusätzlich zu Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten undifferenzierten
Zellen können beliebige Zellen sein, die zu den induzierten
Osteoblasten differenziert werden können. Ferner können
die in der vorliegenden Erfindung verwendeten undifferenzierten
Zellen aus einem Säugetier (z. B. Mensch, Ratte, Maus,
Kaninchen) stammende Zellen sein. Beispiele für diese Zellen
können aus Ratten-Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen
einschließen.
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”Stammzellen”,
so wie hier verwendet, beziehen sich auf zur Selbstreplikation und
Pluripotenz (d. h. Multipotenz) fähige Zellen. Typischerweise
können Stammzellen ein verletztes Gewebe regenerieren.
Hier verwendete Stammzellen können embryonale Stammzellen
(ES), embryonale Keimstammzellen (EG) oder Gewebestammzellen (auch
als gewebliche Stammzellen oder gewebespezifische Stammellen bezeichnet)
sein, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Stammzellen
können ferner künstlich hergestellte Zellen (z.
B. Fusionszellen oder reprogrammierte Zellen, wie in der vorliegenden
Beschreibung beschrieben) sein, solange sie die oben beschriebenen
Fähigkeiten aufweisen können.
-
Embryonale
Stammzellen beziehen sich auf pluripotente Stammzellen, die aus
frühen Embryonen stammen. Embryonale Stammzellen wurden
zuerst 1981 entwickelt und seit 1989 bei der Herstellung von Knockout-Mäusen
angewandt. 1998 wurden menschliche embryonale Stammzellen entwickelt
und werden derzeit der Regenerationsmedizin zur Verfügung
gestellt. Es wird angenommen, dass embryonale Keimstammzellen durch
Dedifferenzierung von Urgeschlechtszellen durch Exposition gegenüber
einem spezifischen umgebenden Wirkstoff gebildet werden. Während
embryonale Keimstammzellen eine Eigenschaft als embryonale Stammzellen
besitzen, tragen embryonale Keimzellen einen Teil einer Eigenschaft
der Urgeschlechtszellen, aus denen sie stammen.
-
Gewebestammzellen
sind in Gewebe vorhanden, besitzen einen geringeren Pluripotenzgrad
als embryonale Stammzellen und besitzen im Gegensatz zu embryonalen
Stammzellen ein relativ eingeschränktes Differenzierungsniveau.
Im Allgemeinen haben Stammzellen eine undifferenzierte intrazelluläre
Struktur, ein hohes Nukleus/Zytoplasma-Verhältnis und wenige
intrazelluläre Organellen. Wie hier verwendet, können Stammzellen
vorzugsweise mesenchymale Stammzellen sein, obwohl Gewebestammzellen,
embryonale Keimzellen oder embryonale Stammzellen, in Abhängigkeit
von den Umständen, ebenfalls als Stammzellen verwendet
werden können.
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Gewebestammzellen
werden in Kategorien von Stellen aufgetrennt, aus denen die Zellen
stammen, wie das Hautsystem, Verdauungssystem, Knochenmarksystem
und Nervensystem. Beispiele für Gewebestammzellen im Hautsystem
umfassen epidermale Stammzellen, Haarfollikel-Stammzellen und dergleichen. Beispiele
für Gewebestammzellen im Verdauungssystem umfassen pankreatische
Stammzellen, hepatische Stammzellen und dergleichen. Beispiele für
Gewebestammzellen im Knochenmarksystem umfassen hämatopoietische
Stammzellen, mesenchymale Stammzellen und dergleichen. Beispiele
für Gewebestammzellen im Nervensystem umfassen neurale
Stammzellen, retinale Stammzellen und dergleichen.
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Stammzellen
können anhand ihres Ursprungs eingeteilt werden und werden
insbesondere in aus Ektoderm, Endoderm oder Mesoderm stammende Stammzellen
eingeteilt. Stammzellen ektodermalen Ursprungs sind hauptsächlich
im Gehirn vorhanden, einschließlich neuraler Stammzellen
und dergleichen. Stammzellen endodermalen Ursprungs sind hauptsächlich
im Knochenmark vorhanden, einschließlich vaskulärer
Stammzellen, hämatopoietischer Stammzellen, mesenchymaler
Stammzellen und dergleichen. Stammzellen mesodermalen Ursprungs
sind hauptsächlich in Organen vorhanden, einschließlich
hepatischer Stammzellen, pankreatischer Stammzellen und dergleichen.
-
”Mesenchymale
Stammzellen”, so wie hier verwendet, beziehen sich auf
Stammzellen, die in einem mesenchymalen Gewebe beobachtet werden.
Beispiele für mesenchymales Gewebe umfassen Knochenmark,
Fettgewebe, vaskuläres Endothel, glatte Muskulatur, Herzmuskel,
Skelettmuskel, Knorpel, Knochen und ein Band, sind jedoch nicht
darauf eingeschränkt. Mesenchymale Stammzellen stammen
typischerweise aus Knochenmark, Fettgewebe, Synovialgewebe, Muskelgewebe,
peripherem Blut, Placentagewebe, Menstruationsblut oder Nabelschnurblut
(vorzugsweise Knochenmark).
-
Ein ”Wachstumsmedium”,
so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Medium, das ein Basismedium, Antibiotika
(z. B. Penicillin und Streptomycin), ein antibakterielles Mittel
(z. B. Amphotericin B) und eine Serumkomponente (z. B. Humanserum,
Rinderserum, fetales Rinderserum) enthält. Typischerweise
kann die Serumkomponente bis zu 20% des Wachstumsmediums ausmachen.
Wenn das Basismedium ein essenzielles Minimalmedium (MEM) ist, wird
außerdem das Medium als ”MEM-Wachstumsmedium” bezeichnet,
und wenn das Basismedium ein HAM-F12-Medium (HAM) ist, wird das
Wachstumsmedium als ”HAM-Wachstumsmedium” bezeichnet.
-
Ein ”den
Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium”, so wie hier
verwendet, bezieht sich auf ein Medium, das ein Basismedium und
mindestens eine herkömmliche die Differenzierung von Osteoblasten
induzierende Komponente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus einem Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure,
umfasst. Das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium kann
mindestens eine herkömmliche die Differenzierung von Osteoblasten
induzierende Komponente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure, umfassen.
Das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium kann sämtliche
aus Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure
als herkömmliche die Differenzierung von Osteoblasten induzierende
Komponente umfassen.
-
Vorzugsweise
beinhaltet das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium essenzielles
Minimalmedium (MEM) als Basiskomponente, und β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure als die herkömmlichen die Differenzierung
von Osteoblasten induzierende Komponenten. Vorzugsweise kann ”den
Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium” außerdem
eine Serumkomponente (z. B. Humanserum, Rinderserum, fetales Rinderserum)
beinhalten. Typischerweise kann die Serumkomponente bis zu 20% des
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums ausmachen. Stärker
bevorzugt kann das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium
das Glucocorticoid, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure
und die Serumkomponente beinhalten.
-
Wenn
zudem das Basismedium ein essenzielles Minimalmedium (MEM) ist,
wird das Medium als ”den Differenzierungswirkstoff erzeugendes
MEM-Medium” bezeichnet, und wenn das Basismedium ein HAM-F12-Medium
(HAM) ist, wird das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium
als ”den Differenzierungswirkstoff erzeugendes HAM-Medium” bezeichnet.
-
Es
wurde nicht gezeigt, dass das den Differenzierungswirkstoff erzeugende
Medium an sich die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung
von C3H10T1/2-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen, Balb-3T3-Zellen oder
NIH3T3-Zellen zu Osteoblasten aufweist. Darum wird angenommen, dass
der bei der vorliegenden Erfindung verwendete Wirkstoff von den
Komponenten, die in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Medium eingeschlossen sind, verschieden ist.
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Eine ”herkömmliche
die Differenzierung von Osteoblasten induzierende Komponente”,
so wie hier verwendet, wurde von Maniatopoulos et al. (Maniatopoulos,
C et. al.: Bone formation in vitro by stromal cells obtained from
bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res., 254: 317–330,
1988) vorgeschlagen. Darum ist die herkömmliche
die Differenzierung von Osteoblasten induzierende Komponente eine
zur Induzierung der Differenzierung von Knochenmarkszellen zu Osteoblasten
verwendete Komponente und bezieht sich auf eine Kombination von
einem Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure.
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”Glucocorticoid”,
so wie hier verwendet, ist ein Nebennierenrindenhormon und ist der
generische Name eines mit dem Zuckermetabolismus zusammenhängenden
Steroidhormons. Das Glucocorticoid ist als eine Komponente zur Induzierung
der Differenzierung von Knochenmarkszellen zu Osteoblasten bekannt
(Maniatopoulos, C. et al.: Bone formation in vitro by stromal
cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue
Res., 254: 317–330, 1988). Allerdings ist es nicht
bekannt, dass das Glucocorticoid eine Fähigkeit zur Induzierung
der Differenzierung der vorstehend beschriebenen Zellen zu Osteoblasten
besitzt.
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Das
Glucocorticoid wird auch als Kohlenhydratcorticoid bezeichnet. Typische
Beispiele für das Glucocoricoid beinhalten Dexamethason,
Betamethason, Prednisolon, Prednison, Cortison, Cortisol, Corticosteron und
dergleichen, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Vorzugsweise
wird Dexamethason als das Glucocorticoid verwendet. Beispiele für
das Glucocorticoid können ferner eine chemisch synthetisierte
Substanz mit der gleichen Wirkung wie natives Glucocorticoid einschließen.
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Wenn
diese typischen Glucocorticoide bei der Kultur von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten zusammen mit β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure
verwendet werden, wird ein Wirkstoff mit der Aktivität
zur Induzierung der Differenzierung von C3H10T1/2-Zellen zu Osteoblasten
erzeugt. Darum können bei der vorliegenden Erfindung diese
typischen Glucocorticoide in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Medium enthalten sein. Das Glucocorticoid kann in dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Medium bei einer Konzentration von 0,1 nM bis 10 mM
und vorzugsweise bei einer Konzentration von 10 bis 100 nM enthalten
sein.
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”β-Glycerophosphat”,
so wie hier verwendet, ist ein generischer Name eines Salzes, das
mit einer Phosphatgruppe in der β-Position von Glycerophosphorsäure
(C3H5(OH)2OPO3H2)
gebunden ist. Beispiele für das Salz beinhalten ein Calciumsalz,
Natriumsalz und dergleichen. Das β-Glycerophosphat ist
als eine zur Induzierung der Differenzierung von Knochenmarkszellen
zu Osteoblasten fähige Komponente bekannt (Maniatopoulos,
C. et al.: Bone formation in vitro by stromal cells obtained from
bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res., 254: 317–330,
1988). Allerdings ist es nicht bekannt, dass das β-Glycerophosphat
eine Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung der
vorstehend beschriebenen Zellen zu Osteoblasten besitzt.
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Wenn
das β-Glycerophosphat bei der Kultur von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
zusammen mit Glucocorticoid und Ascorbinsäure verwendet
wird, wird ein Wirkstoff mit der Aktivität zur Induzierung
der Differenzierung von C3H10T1/2-Zellen zu Osteoblasten erzeugt.
Darum kann bei der vorliegenden Erfindung β-Glycerophosphat
in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium enthalten
sein. β-Glycerophosphat kann in dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Medium bei einer Konzentration von 0,1 mM bis 1 M und
vorzugsweise bei einer Konzentration von 10 mM enthalten sein.
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”Ascorbinsäure”,
so wie hier verwendet, ist ein weißes, kristallines, wasserlösliches
Vitamin. Die Ascorbinsäure ist in den meisten Pflanzen,
insbesondere Zitrusfrüchten, enthalten. Die Ascorbinsäure
wird auch als Vitamin C bezeichnet. Ascorbinsäure ist als
eine zur Induzierung der Differenzierung von Knochenmarkszellen
zu Osteoblasten fähige Komponente bekannt (Maniatopoulos,
C. et al.: Bone formation in vitro by stromal cells obtained from
bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res., 254: 317–330,
1988). Allerdings ist es nicht bekannt, dass die Ascorbinsäure
eine Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung der
vorstehend beschriebenen Zellen zu Osteoblasten besitzt.
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Bei
der vorliegenden Erfindung kann Ascorbinsäure Ascorbinsäure
und Derivate davon einschließen. Beispiele für
die Ascorbinsäure beinhalten L-Ascorbinsäure,
L-Ascorbinsäurenatrium, L-Ascorbylpalmitat, L-Ascorbylstearat,
L-Ascorbinsäure-2-glucosid, Ascorbinsäurephosphatmagnesium
und Ascorbinsäureglucosid, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt.
Beispiele für die Ascorbinsäure können
chemisch synthetisierte Substanzen mit der gleichen Wirkung wie
native Ascorbinsäure einschließen.
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Wenn
diese typischen Ascorbylsäuren bei der Kultur eines hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten zusammen mit Glucocorticoid und β-Glycerophosphat
verwendet werden, wird dadurch ein Wirkstoff mit der Aktivität
zur Induzierung der Differenzierung von C3H10T1/2-Zellen zu Osteoblasten
erzeugt. Darum können bei der vorliegenden Erfindung diese
typischen Ascorbinsäuren in dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Medium enthalten sein. Die Ascorbinsäure kann
in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium bei einer
Konzentration von 0,1 μg/ml bis 5 mg/ml und vorzugsweise
bei einer Konzentration von 10 bis 50 μg/ml enthalten sein.
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Ein ”Kulturmedium
für undifferenzierte Zellen”, so wie hier verwendet,
bezieht sich auf ein Medium, das den die Differenzierung der induzierten
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff der vorliegenden Erfindung
und eine Mediumkomponente beinhaltet. Das Kulturmedium für
undifferenzierte Zellen kann Eagle-Basalmedium (BME), essenzielles
Minimalmedium (MEM), modifiziertes Eagle-Medium nach Dulbecco (DMEM), Ham-F12-Medium
(HAM), essenzielles Minimalmedium α (αMEM) und
ein gemischtes Medium davon beinhalten, ist jedoch nicht darauf
eingeschränkt.
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Dieses
Medium kann ferner eine Serumkomponente (z. B. Humanserum, Rinderserum,
fetales Rinderserum) enthalten. Typischerweise kann die Serumkomponente
in dem Kulturmedium für undifferenzierte Zellen bis zu
20% davon (vorzugsweise in dem Bereich von 10 bis 15% davon und
stärker bevorzugt etwa 10% davon) ausmachen.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
besten Weisen für die vorliegende Erfindung sind nachstehend
beschrieben. Es wird davon ausgegangen, dass die nachstehend bereitgestellten
Ausführungsformen für den Zweck des besseren Verständnisses
der Erfindung bereitgestellt sind. Der Umfang der Erfindung sollte
nicht auf die folgenden Beschreibungen beschränkt werden.
Es ist darum offensichtlich, dass die Fachleute die Beschreibungen
hier lesen und sie entsprechend im Rahmen der vorliegenden Erfindung
modifizieren können.
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(Induzierungsverfahren für induzierte
Osteoblasten)
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In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Induzierung undifferenzierter Zellen zu induzierten Osteoblasten
gemäß der vorliegenden Erfindung bereit. Das Verfahren
kann folgendes einschließen: A) einen Schritt der Bereitstellung
eines Überstandes, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in einem einen Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Medium erhalten wird, das mindestens eines ausgewählt aus
der Gruppe umfassend ein Glucocorticoid, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure, oder einen die Differenzierung von induzierten
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff, der in dem Überstand
vorliegt, beinhalte; und B) einen Schritt der Kultivierung der undifferenzierten
Zellen in einem Kulturmedium für undifferenzierte Zellen,
das den Überstand oder den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff und eine Mediumkomponente beinhaltet,
bei einer ausreichenden Bedingung, um die undifferenzierten Zellen
zu den induzierten Osteoblasten zu differenzieren.
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Obwohl
bisher Osteoblasten nicht verstärkt gewonnen oder hergestellt
werden konnten, ist es unter Verwendung des Induzierungsverfahrens
der vorliegenden Erfindung, die Osteoblasten verstärkt
und stabil bereitzustellen. Die induzierten Osteoblasten gemäß der
vorliegenden Erfindung werden zur Behandlung von Krankheiten, die
mit einer abnehmenden Osteogenese, Knochenverletzungen oder Knochendefekten
verbunden sind, insbesondere zur Behandlung von Knochentumoren,
komplexen Frakturen und dergleichen verwendet.
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In
einer Ausführungsform kann das Verfahren zur Induzierung
undifferenzierter Zellen zu induzierten Osteoblasten folgendes einschließen:
A) einen Schritt der Bereitstellung eines die Differenzierung induzierter Osteoblasten
induzierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Medium erhalten wird, das Dexamethason, β-Glycerophosphat,
Ascorbinsäure und eine Serumkomponente beinhaltet; und
B) einen Schritt der Kultivierung der undifferenzierten Zellen in
einem Kulturmedium für undifferenzierte Zellen, das den
die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff
und eine Mediumkomponente beinhaltet, um die undifferenzierten Zellen
zu den induzierten Osteoblasten zu differenzieren.
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In
einer Ausführungsform kann das zum Kultivieren der hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem Induzierungsverfahren der vorliegenden Erfindung
verwendete Medium (in der vorliegenden Beschreibung als ein ”den
Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium” bezeichnet)
mindestens eines aus einem Glucocorticoid (z. B. Dexamethason, Predonisolon,
Predonison, Cortison, Betamethason, Cortisol, Corticosteron), β-Glycerophosphat,
Ascorbinsäure und dergleichen enthalten. Vorzugsweise kann
dieses Medium sowohl β-Glycerophosphat als auch Ascorbinsäure
enthalten. Stärker bevorzugt beinhaltet dieses Medium das Glucocorticoid, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure.
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Zusätzlich
kann dieses Medium weiterhin andere Komponenten einschließen,
wie Transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β),
Knochen-morphogenetischen Faktor (BMP), Leukämie-inhibitorischen
Faktor (LIF), Kolonien-stimulierenden Faktor (CSF), Insulin-artigen
Wachstumsfaktor (IGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), plättchenreiches
Plasma (PRP), aus Plättchen stammenden Wachstumsfaktor
(PDGF) und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF).
Es kann brauchbar sein, dass dieses Medium ferner eine Serumkomponente
(z. B. Humanserum, Rinderserum, fetales Rinderserum) beinhaltet.
Typischerweise kann die Serumkomponente in dem Medium bis zu 20%
davon ausmachen.
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Weitere
Beispiele für das zum Kultivieren der hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem Induzierungsverfahren der vorliegenden Erfindung
verwendete Medium können Ham-F12-Medium (HAM-F12 oder HAM),
modifiziertes Eagle-Medium nach Dulbecco (DMEM), essenzielles Minimalmedium
(MEM), essenzielles Minimalmedium α (αMEM), Eagle-Basalmedium
(BME), ein modifiziertes Medium nach Fitton-Jackson (BGJb) beinhalten,
sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Dieses Medium kann
jede Substanz enthalten, die die Proliferation und Induzierung der
Differenzierung von Zellen fördern kann. Hier wurde noch
nicht gezeigt, dass dieses Medium die Fähigkeit zur Induzierung
der Differenzierung von C3H10T1/2-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen,
Balb-3T3-Zellen oder N1H3T3-Zellen zu Osteoblasten besitzt.
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In
einer Ausführungsform können die in dem Induzierungsverfahren
der vorliegenden Erfindung verwendeten undifferenzierten Zellen
aus einem Säugetier stammende Zellen sein, vorzugsweise
aus Mensch, Maus, Ratte oder Kaninchen stammende Zellen, sind jedoch
nicht darauf eingeschränkt.
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In
einer Ausführungsform können die in dem Herstellungsverfahren
der vorliegenden Erfindung verwendeten undifferenzierten Zellen
Stammzellen sein (z. B. embryonale Stammzellen, embryonale Keimstammzellen,
Gewebestammzellen). Zum Beispiel können die Stammzellen
mesenchymale Stammzellen, hämatopoietische Stammzellen,
vaskuläre Stammzellen, hepatische Stammzellen, pankreatische
(allgemeine) Stammzellen oder neurale Stammzellen) sein. Vorzugsweise
können die undifferenzierten Zellen mesenchymale Stammzellen
sein. Die undifferenzierten Zellen beinhalten ferner sämtliche
Zellen auf dem Weg der Differenzierung.
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Vorzugsweise
können diese undifferenzierten Zellen C3H10T1/2-Zellen,
ATDC5-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen, BALB/3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen,
C2C12-Zellen, PT-2501-Zellen und aus primärem Ratten-Knochenmark
stammende Stammzellen und dergleichen sein (vorzugsweise C3H10T1/2-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen,
BALB/3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen, PT-2501-Zellen und aus primärem
Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen, stärker bevorzugt
C3H10T1/2-Zellen, PT-2501-Zellen und aus primärem Ratten-Knochenmark
stammende Stammzellen). Hier können die in der vorliegenden
Erfindung verwendeten undifferenzierten Zellen beliebige Zellen
sein, die zu induzierten Osteoblasten differenziert werden können.
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In
einer weiteren Ausführungsform kann ein zum Kultivieren
der undifferenzierten Zellen in dem Induzierungsverfahren der vorliegenden
Erfindung verwendete Medium (in der vorliegenden Beschreibung als
ein ”Kulturmedium für undifferenzierte Zellen” bezeichnet)
ein Eagle-Basalmedium (BME), essenzielles Minimalmedium (MEM), modifiziertes
Eagle-Medium nach Dulbecco (DMEM), Ham-F12-Medium (HAM), essenzielles Minimalmedium α (αMEM)
oder ein gemischte Medium davon beinhalten, ist jedoch nicht darauf
eingeschränkt.
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Wenn
das in dem Medium enthaltene Basismedium ein Medium ist, das allgemein
zum Kultivieren von Zellen verwendet werden kann, beeinträchtigt
das Basismedium nicht den die Differenzierung von induzierten Osteoblasten
induzierenden Wirkstoff gemäß der vorliegenden
Erfindung. Wenn der die Differenzierung von induzierten Osteoblasten
induzierende Wirkstoff mit den undifferenzierten Zellen in der Kultur
in Kontakt kommen kann, können daher die undifferenzierten
Zellen zu den induzierten Osteoblasten differenziert werden.
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Die
Fachleute können zweckmäßig ein geeignetes
Medium zum Kultivieren der undifferenzierten Zellen basierend auf
der Offenbarung der vorliegenden Beschreibung und dem allgemeinen
Fachwissen auswählen. Vorzugsweise kann das Kulturmedium
für undifferenzierte Zellen Eagle-Basalmedium (BME), essenzielles Minimalmedium
(MEM), Ham-F12-Medium (HAM) oder essenzielles Minimalmedium α (αMEM)
sein.
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In
einer Ausführungsform kann der in der vorliegenden Erfindung
verwendete die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende
Wirkstoff in folgendem vorliegen: (1) in dem Medium, in dem die
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden,
oder (2) in einer Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000
oder höher, erhalten durch Ultrafiltration des Mediums,
in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert
werden, unter Verwendung eines Filters mit einer molekularen Trenngrenze
von 50.000.
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In
einer Ausführungsform kann in dem Induzierungsverfahren
der vorliegenden Erfindung Schritt A) folgendes einschließen:
Kultivieren der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in
dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium, das Dexamethason, β-Glycerophosphat,
Ascorbinsäure und die Serumkomponente beinhaltet; und Sammeln
des Überstandes des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Mediums nach dem Kultivieren.
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In
einer Ausführungsform kann in dem Induzierungsverfahren
der vorliegenden Erfindung Schritt A) folgendes einschließen:
Ultrafiltration des Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert werden, um ihn in eine Fraktion mit einem
Molekulargewicht von 50.000 oder höher aufzutrennen.
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In
einer weiteren Ausführungsform kann das Induzierungsverfahren
der vorliegenden Erfindung ferner einen Schritt der Formung der
undifferenzierten Zellen zu einem Pellet umfassen. Dieser Pelletformungsschritt kann
durch Zentrifugation bei 170 bis 200 × g für 3
bis 5 Minuten durchgeführt werden, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt.
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In
einer weiteren Ausführungsform in dem Induzierungsverfahren
der vorliegenden Erfindung kann die ausreichende Bedingung, dass
die undifferenzierten Zellen zu den induzierten Osteoblasten induziert
werden, eine Kultivierungsdauer von 3 Tagen bis 3 Wochen einschließen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform in dem Induzierungsverfahren
der vorliegenden Erfindung können die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium kultiviert
werden, das das Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure
beinhaltet; die undifferenzierten Zellen können aus der
Gruppe ausgewählt sein, die C3H10T1/2-Zellen, ATDC5-Zellen,
3T3-Swiss-Albino-Zellen, BALB/3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen, C2C12-Zellen,
PT-2501-Zellen und aus primärem Ratten-Knochenmark stammende
Stammzellen umfasst; das Kulturmedium für undifferenzierte
Zellen kann Eagle-Basalmedium (BME), essenzielles Minimalmedium
(MEM), essenzielles Minimalmedium α (αMEM) oder
modifiziertes Eagle-Medium nach Dulbecco (DMEM) beinhalten; und
die ausreichende Bedingung, dass die undifferenzierten Zellen zu
den induzierten Osteoblasten induziert werden, kann eine Kultivierungsdauer
von 3 Tagen bis 3 Wochen einschließen.
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Dieses
Induzierungsverfahren kann ferner den Schritt der Formung der undifferenzierten
Zellen zu einem Pellet durch Zentrifugation bei 170 bis 200 × g
für 3 bis 5 Minuten einschließen.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können
die in dem Induzierungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten
undifferenzierten Zellen mesenchymale Stammzellen (z. B. aus Knochenmark stammende
mesenchymale Stammzellen) sein; und Schritt A) kann folgendes einschließen:
(1) Kultivieren der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium, das Dexamethason, β-Glycerophosphat,
Ascorbinsäure und die Serumkomponente beinhaltet, und anschließendes Sammeln
des Überstandes des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Mediums nach dem Kultivieren; und (2) Ultrafiltration des Überstandes,
um ihn in eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder höher
aufzutrennen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform können die in
dem vorliegenden Induzierungsverfahren verwendeten undifferenzierten
Zellen C3H10T1/2-Zellen, PT-2501-Zellen oder aus primärem
Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen sein; und Schritt A) kann
folgendes einschließen: (1) Kultivieren der hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium,
das Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure
und eine Serumkomponente beinhaltet, und anschließendes
Sammeln des Überstandes des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums nach dem Kultivieren, und (2) Ultrafiltration
des Überstandes, um ihn in eine Fraktion mit einem Molekulargewicht
von 50.000 oder höher aufzutrennen.
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Der
in der vorliegenden Erfindung verwendete die Differenzierung von
induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff besitzt die Fähigkeit
zur Steigerung der alkalischen Phosphatase-(ALP)-Aktivität
von C3H10T1/2-Zellen, die dem Wirkstoff in Eagle-Basalmedium ausgesetzt
werden, oder der alkalischen Phosphatase-Aktivität von
mesenchymalen Stammzellen, die dem Wirkstoff in essenziellem Minimalmedium
(MEM) ausgesetzt werden, um mehr als das etwa 1-fache der Aktivität
der jeweiligen Zellen, die in Eagle-Basalmedium oder essenziellen
Minimalmedium ohne Wirkstoff kultiviert wurden (z. B. alkalische
Phosphatase-Aktivität von Ganzzellen).
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Die
alkalische Phosphatase-Aktivität wird durch die folgenden
Schritte bestimmt: A) Bestimmen von zwei Extinktionen bei 405 nm
einer Probe, wobei eine Extinktion wie folgt gemessen wird: zu 100 μl
der Probe, mit oder ohne Wirkstoff, werden 50 μl 4 mg/ml
p-Nitrophenylphosphatlösung und 50 μl Alkalipuffer
(”A9226”, hergestellt von Sigma) zugegeben, bei
37°C für 15 min umgesetzt und anschließend
werden der Probe 50 μl 1 N NaOH zum Stoppen der Reaktion
zugegeben, und wobei die andere Extinktion wie folgt gemessen wird: zusätzlich
werden der Probe, deren eine Extinktion bereits bestimmt wurde,
20 μl konzentrierte Salzsäure zugegeben; und B)
Berechnen der Differenz zwischen den Extinktionen vor und nach Zugabe
der konzentrierten Salzsäure. Hier ist der Extinktionsunterschied
ein Indikator für die alkalische Phosphatase-Aktivität.
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Die
alkalische Phosphatase-Aktivität zeigt vorzugsweise eine
mindestens 2-fache, mindestens 3-fache, mindestens 4-fache, mindestens
5-fache, mindestens 6-fache, mindestens 7-fache, mindestens 8-fache, mindestens
9-fache, mindestens 10-fache, mindestens 11-fache, mindestens 12-fache
oder mindestens 13-fache Steigerung.
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Der
in der vorliegenden Erfindung verwendete die Differenzierung von
induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff besitzt die Fähigkeit
zur Steigerung der alkalischen Phosphatase-(ALP)-Aktivität
von C3H10T1/2-Zellen, die dem Wirkstoff in Eagle-Basalmedium ausgesetzt
werden, oder der alkalischen Phosphatase-Aktivität von
mesenchymalen Stammzellen, die dem Wirkstoff in essenziellem Minimalmedium (MEM) ausgesetzt
werden, im Vergleich zu der Aktivität der jeweiligen Zellen,
die in Eagle-Basalmedium oder essenziellen Minimalmedium ohne Wirkstoff
kultiviert wurden (z. B. alkalische Phosphatase-Aktivität
von Ganzzellen).
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Die
alkalische Phosphatase-Aktivität wird durch die folgenden
Schritte bestimmt: A) Bestimmen von zwei Extinktionen bei 405 nm
einer Probe, wobei eine Extinktion wie folgt gemessen wird: zu 100 μl
der Probe, mit oder ohne Wirkstoff, werden 50 μl 4 mg/ml
p-Nitrophenylphosphatlösung und 50 μl Alkalipuffer
(”A9226”, hergestellt von Sigma) zugegeben, bei
37°C für 15 min umgesetzt und anschließend
werden der Probe 50 μl 1 N NaOH zum Stoppen der Reaktion
zugegeben, und wobei die andere Extinktion wie folgt gemessen wird: zusätzlich
werden der Probe, deren eine Extinktion bereits bestimmt wurde,
20 μl konzentrierte Salzsäure zugegeben; und B)
Berechnen der Differenz zwischen den Extinktionen vor und nach Zugabe
der konzentrierten Salzsäure. Hier ist der Extinktionsunterschied
ein Indikator für die alkalische Phosphatase-Aktivität.
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Die
alkalische Phosphatase-Aktivität zeigt vorzugsweise eine
mindestens 2-fache, mindestens 3-fache, mindestens 4-fache, mindestens
5-fache, mindestens 6-fache, mindestens 7-fache, mindestens 8-fache, mindestens
9-fache, mindestens 10-fache, mindestens 11-fache, mindestens 12-fache
oder mindestens 13-fache Steigerung.
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Ein ”Mittel” oder ”Faktor” wird
hier austasuchbar verwendet und kann jede beliebige Substanz oder Komponente
sein, solange sie das beabsichtigte Ziel erreicht. Der in der vorliegenden
Erfindung verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten
induzierende Wirkstoff kann beispielsweise ein Protein, ein Polypeptid, ein
Oligopeptid, ein Peptid, eine Aminosäure, eine Nukleinsäure,
ein Polysaccharid, ein Lipid, ein organisches niedermolekulares
Molekül oder ein Komplex davon sein.
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Ein ”die
Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierender Wirkstoff”,
so wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Wirkstoff, der die
Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu
induzierten Osteoblasten induzieren kann, und kann einfach oder
komplex sein, solange er die Aktivität selbst aufweisen
kann. Der die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende
Wirkstoff kann durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Medium erhalten werden, das mindestens eines ausgewählt
aus der Gruppe enthält, die ein Glucocorticoid, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure umfasst.
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Es
ist selbstverständlich, dass ein durch ein anderes Verfahren
erhaltener Wirkstoff oder ein Wirkstoff aus einer unterschiedlichen
Bildung austauschbar in der vorliegenden Erfindung verwendet wird,
solange der Wirkstoff die gleiche Aktivität des in der
vorliegenden Erfindung verwendeten die Differenzierung von induzierten
Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs aufweist, der zur Induktion
der Differenzierung undifferenzierter Zellen zu induzierten Osteoblasten
in der Lage ist. Ein solcher Wirkstoff kann unter Verwendung des
allgemeinen Fachwissens auf der Grundlage der Offenbarung der vorliegenden
Beschreibung identifiziert werden, zusätzlich zu den Wirkstoffen,
die grundsätzlich in den Beispielen angegeben sind.
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Der
in der vorliegenden Erfindung verwendete die Differenzierung von
induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff besitzt die Fähigkeit
zur Steigerung der Expression einer für induzierte Osteoblasten
spezifischen Substanz, ausgewählt aus der Gruppe umfassend
Typ-I-Collagen, Knochen-Proteoglycan (z. B. Decorin, Biglycan),
alkalische Phosphatase, Osteocalcin, Matrix-Gla-Protein, Osteoglycin,
Osteopontin, Knochenprotein mit Sialinsäure, Osteonectin
und Pleiotrophin.
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Darum
ist das hier verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten
induzierende Wirkstoff durch die Steigerung der alkalischen Phosphatase-Aktivität
von undifferenzierten Zellen bei der Enzymaktivität gekennzeichnet.
Ferner ist der die Differenzierung von induzierten Osteoblasten
induzierende Wirkstoff ein Wirkstoff mit der Fähigkeit
zur Expression von mindestens einem Osteoblasten-Marker in den undifferenzierten
Zellen auf dem Niveau der Genexpression oder Proteinexpression gekennzeichnet.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform kann der in der vorliegenden
Erfindung verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten
induzierende Wirkstoff durch Messen der Zunahme der Alkalischen Phosphatase-Aktivität
und durch die Expression oder Lokalisierung eines induzierten Osteoblasten-Markers
in undifferenzierten Zellen identifiziert werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform verliert der in der vorliegenden
Erfindung verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten
induzierende Wirkstoff die Fähigkeit zur Induzierung der
Differenzierung undifferenzierter Zellen zu induzierten Osteoblasten
durch Erwärmen für 3 min in siedendem Wasser (im
Allgemeinen einschließlich etwa 96 bis 100°C,
z. B. etwa 96°C, etwa 97°C, etwa 98°C,
etwa 99°C und etwa 100°C). Das Sieden wird durch
Beobachten bestätigt. Der Verlust der Fähigkeit
zur Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen
zu induzierten Osteoblasten bedeutet einen Zustand, der die Lokalisierung
oder Expression eines induzierten Osteoblasten-Markers nicht wesentlich
erhöht.
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In
einer weiteren Ausführungsform verliert der in der vorliegenden
Erfindung verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten
induzierende Wirkstoff die Fähigkeit zur Induzierung der
alkalischen Phosphatase-Aktivität von undifferenzierten
Zellen durch Erwärmen für 3 min in siedendem Wasser
gehindert. Der Verlust der Fähigkeit zur Induzierung der
alkalischen Phosphatase-Aktivität von undifferenzierten
Zellen bedeutet einen Zustand, der die alkalische Phosphatase-Aktivität
darin nicht wesentlich erhöht.
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Die
Begriffe ”Protein”, ”Polypeptid”, ”Oligopeptid” und ”Peptid”,
so wie hier verwendet, besitzen die gleiche Bedeutung und beziehen
sich auf ein Aminosäurepolymer mit beliebiger Länge.
Die chemische Struktur dieses Polymers kann geradkettig, verzweigt
oder zyklisch sein. Die Aminosäure kann eine natürlich
oder nicht natürlich vorkommende Aminosäure oder
eine modifizierte Aminosäure sein. Da das hier verwendete
Aminosäurepolymer vorzugsweise eine Form aufweist, die
basierend auf einem Nukleinsäuremolekül translatiert wurde,
besitzt es eine lineare chemische Struktur und besteht nur aus natürlichen
Aminosäuren, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt.
Der Begriff kann diejenigen einschließen, die zu einem
Komplex aus einer Vielzahl von Polypeptidketten zusammengefügt
wurden.
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Der
Begriff umfasst auch ein natürlich vorkommendes oder ein
künstlich modifiziertes Aminosäurepolymer. Beispiele
für eine solche Modifikation umfassen Disulfidbrückenbildung,
Glycosylierung, Lipidierung, Acetylierung, Phosphorylierung oder
jede andere beliebige Manipulation oder Modifikation (z. B. Verknüpfung mit
einer Markierungsgruppe). Diese Definition umfasst ein Polypeptid,
das mindestens ein Aminosäureanalog (z. B. eine nicht-natürliche
Aminosäure), eine peptidartige Verbindung (z. B. Peptoid)
und Verbindungen beinhaltet, die unter Verwendung von anderen auf
dem Fachgebiet bekannten Verfahren modifiziert wurden.
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Es
sollte selbstverständlich sein, dass, wie insbesondere
hier erwähnt, ”Protein” sich auf ein
Aminosäurepolymer mit relativ hohem Molekulargewicht oder
auf ein modifiziertes Polymer davon bezieht, und dass sich ”Peptid” auf
ein Aminosäurepolymer mit relativ niedrigem Molekulargewicht
oder auf ein modifiziertes Polymer davon bezieht.
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(Hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten hypertrophierungsfähigen
Chondrozyt stammen aus einem Säugetier, vorzugsweise Mensch,
Maus, Ratte oder Kaninchen. Es gibt zwei Arten der Ossifikation,
die membranöse Ossifikation und die chondrale Ossifikation,
die in einem Säugetier vorkommen.
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Die
membranöse Ossifikation ist eine Art, die bei der Bildung
von Plattenknochen (z. B. Großteil des Schädels
und Clavicula) nahe der Oberfläche fungiert. Bei der membranösen
Ossifikation wird membranöser Knochen direkt gebildet,
ohne dass Bindegewebe Knorpel durchläuft. Die membranöse
Ossifikation wird auch als intramembranöse Ossifikation
oder Bindegewebsossifikation bezeichnet.
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Andererseits
ist die chondrale Ossifikation ist eine Art, die bei der Bildung
des Endoskeletts (z. B Wirbel, Costa, Gliedmaßenknochen)
im Körperinneren fungiert. Bei der chondralen Ossifikation
bildet sich zunächst Knorpel, Blutgefäße
infiltrieren in das Grundgerüst des Knorpels und anschließend
wird der Knorpel unter Bildung von calcifiziertem Knorpel calcifiziert.
Der gebildete calcifizierte Knorpel wird vorübergehend
zerschlagen, und anschließend wird die Ossifikation unter
Bildung von Knochen und primordialem Knochenmark eingeleitet.
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Bei
diesem Vorgang wird Knorpel-Primordium innerhalb des Knorpels gebildet
und anschließend wird das Knorpel-Primordium durch ein
Wachstumshormon und dergleichen beeinflusst. Dadurch verlängert
sich der Knorpel und nimmt in seiner Größe in
der Längsachse und der kleineren Achse zu. Anschließend
infiltrieren Blutgefäße die Epiphyse, um die Ossifikation
zu induzieren.
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Die
chondrale Ossifikation wird auch als endochondrale oder enchondrale
Ossifikation bezeichnet (siehe Fujita Hisao, Fujita Tsuneo, "hone
no hassei" hyojun soshikigaku, Seite 127 ["the
development of bone" standard histological review, Seite
127]; kososhiki no kigen to shinka-josetsu-, Suda
Tateo, The BONE, 18 kan, Seiten 421–426, 2004 [The origin
and evolution of the hard tissue-introduction-, Suda Tateo, The
BONE, 18. Ausg., Seiten 421–426, 2004; nainankotsusei
kotsukeisei no katei, Suzuki Fujio, "hone wa donoyonishite
dekiruka" Osaka Daigaku Shuppankai, Seite 21, 2004 [The
process of endochondral ossification, Suzuki Fujio, "How
does bone formation?" Osaka University Press, Seite 21,
2004]; Suzuki Takao et al. edit, "Hone
no jiten", Asakura shoten [Suzuki Takao et al. Hrsg., "The
dictionary of bone", Asakura shoten]).
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Darum
existieren die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, die
einen zur Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten
Zellen zu induzierten Osteoblasten fähigen Wirkstoff erzeugen
können, gleichmäßig in einem Säugetier,
einschließlich Ratte, Maus, Kaninchen, Menschen und dergleichen.
Der Wirkstoff spielt bei der Ossifikation eine bedeutende Rolle.
Somit kann der Wirkstoff der vorliegenden Erfindung von den hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten unter Verwendung des gleichen Vorgangs in einem Säugetier
und dergleichen, bei denen die endochondrale Ossifikation induziert
wird, ohne Rücksicht auf die Spezies hergestellt werden.
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Unter
Verwendung molekularbiologischer Verfahren wurde gezeigt, dass die
Osteogenese durch Implantation eines menschlichen rekombinanten
BMP-Proteins in Ratten induziert wird und daher das von Menschen
stammende BMP auf die gleiche Weise wie das aus Ratten stammende
BMP-Protein funktioniert (siehe Wozney, J. M. et al., Science,
242: 1528–1534, 1988, und Wuerzler K.
K. et al., J. Craniofacial Surg., 9: 131–137, 1998).
Es wurde auch bewiesen, dass der mit der Ossifikation assoziierte
Wirkstoff austauschbar zwischen Mensch und Ratte verwendet werden
kann. Es ist bekannt, dass diese BMPs auf dem Niveau ihrer Aminosäuresequenzen
verschieden, jedoch in ihren Eigenschaften als Protein (d. h. Eigenschaften
im festen Zustand bei Bedingungen der Induzierung und dergleichen)
im Wesentlichen identisch sind.
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Die
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gemäß der
vorliegenden Erfindung können beispielsweise aus einer
Region wie der Knorpel-Knochen-Verbindung der Costa, der Epiphysenlinie
von Röhrenknochen (z. B. Femur, Tibia, Fibula, Numerus,
Ulna und Radius), der Epiphysenlinie von Wirbeln, der Knorpel-Proliferationszone
kleiner Knochen (z. B. von Handknochen, Fußknochen und
Brustknochen), Perichondrium, aus Fötus-Knorpel gebildetem
Knochen-Primordium, der Callus-Region einer heilenden Knochenfraktur
und dem kartilaginären Teil einer Knochen-Proliferationsphase
isoliert oder induziert werden.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten können Chondrozyten sein, die aus beliebigen
Regionen erhalten wurden, solange sie die Fähigkeit zur
Hypertrophierung aufweisen. Die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten können auch durch Induzieren der Differenzierung
erhalten werden.
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Wenn
der die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende
Wirkstoff von den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
erzeugt wird, können in der vorliegenden Erfindung die
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten typischerweise auf
eine Zelldichte von 4 × 104 Zellen/cm2 eingestellt werden. Die Zelldichte wird
normalerweise auf einen Wert in dem Bereich von 104 bis
106 Zellen/cm2 eingestellt,
kann jedoch auf weniger als 104 Zellen/cm2 oder auf mehr als 106 Zellen/cm2 eingestellt werden.
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In
der vorliegenden Erfindung wird das Kultivieren der hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten unter Verwendung von Zellen durchgeführt,
die mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren isoliert oder
induziert wurden.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten können Zellen sein, die in einem beliebigen
Medium kultiviert wurden, das Ham-F12-Medium (HAM-F12), modifiziertes Eagle-Medium
nach Dulbecco (DMEM), essenzielles Minimalmedium (MEM), essenzielles
Minimalmedium α (αMEM), Eagle-Basalmedium (BME),
ein modifiziertes Medium nach Fitton-Jackson (BGJb) beinhaltet,
sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten können in einem Medium kultivierte Zellen
sein, das jede Substanz enthalten kann, die die Proliferation und
Induzierung der Differenzierung von Zellen fördern kann.
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In
der vorliegenden Erfindung kann ein den Differenzierungswirkstoff
erzeugendes Medium mindestens eine herkömmliche die Differenzierung
von Osteoblasten induzierende Komponente ausgewählt aus
der Gruppe umfassend ein Glucocorticoid (z. B. Dexamethason, Predonisolon,
Predonison, Cortison, Betamethason, Cortisol, Corticosteron), β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure enthalten. Der in der vorliegenden Erfindung
verwendete Wirkstoff wird ferner unter Verwendung des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums hergestellt, das nur β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure beinhaltet. Vorzugsweise beinhaltet das
den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium das Glucocorticoid, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure.
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In
der vorliegenden Erfindung kann das den Differenzierungswirkstoff
erzeugende Medium weiterhin andere Komponenten beinhalten, wie Transformierenden
Wachstumsfaktor-β (TGF-β), Knochen-morphogenetischen
Faktor (BMP), Leukämie-inhibitorischen Faktor (LIF), Kolonien-stimulierenden
Faktor (CSF), Insulin-artigen Wachstumsfaktor (IGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor
(FGF), plättchenreiches Plasma (PRP), aus Plättchen
stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) und vaskulären endothelialen
Wachstumsfaktor (VEGF). Es kann brauchbar sein, dass das den Differenzierungswirkstoff
erzeugende Medium ferner eine Serumkomponente (z. B. Humanserum,
Rinderserum, fetales Rinderserum) beinhaltet. Typischerweise kann
die Serumkomponente in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Medium bis zu 20% davon ausmachen.
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In
der vorliegenden Beschreibung kann eine Zeitspanne zum Kultivieren
der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten eine Zeitspanne
sein, in der der Wirkstoff in einer ausreichenden Menge hergestellt
werden kann (z. B. mehrere Monate bis zu einem halben Jahr, oder
3 Tage bis 3 Wochen (z. B. 3 Tage, 4 Tage, 5 Tage, 6 Tage, 7 Tage,
8 Tage, 9 Tage, 10 Tage, 20 Tage, mehr als 1 Monat, ein halbes Jahr,
5 Monate, 4 Monate, 3 Monate, 2 Monate, 1 Monat, 3 Wochen oder weniger,
und mögliche Kombinationen davon in einem beliebigen Bereich).
Wenn die Zeitspanne des Kultivieren fortgeschritten ist und die
Zellen in einem Kulturgefäß konfluent sind, werden
die Zellen bevorzugt umgesetzt.
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(Induzierte Osteoblasten)
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Die
vorliegende Erfindung stellt induzierte Osteoblasten bereit, die
aus undifferenzierten Zellen unter Verwendung eines die Differenzierung
von induzierten Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs induziert
wurden, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt
wird. Bei der Induzierung der induzierten Osteoblasten können
beliebige verwendet werden, die vorstehend in (Induzierungsverfahren
für induzierte Osteoblasten), (Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten) und dergleichen in der vorliegenden Beschreibung beschrieben
sind.
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Die
unter Verwendung des Induzierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung
hergestellten induzierten Osteoblasten können auf die gleiche
Art und Weise wie natürliche Osteoblasten verwendet werden.
Daher können die induzierten Osteoblasten der vorliegenden
Erfindung unabhängig zur Behandlung von Knochendefekten
und dergleichen, als eine Zusammensetzung gemeinsam mit einer extrazellulären
Matrix und dergleichen oder als ein Verbundmaterial zusammen mit
einem Gerüst verwendet werden.
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(Medikament und medizinisches Material)
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In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Medikament oder
medizinisches Material zur Förderung oder Induzierung von
Osteogenese in einem biologischen Organismus bereit, das induzierte
Osteoblasten enthält. Das Medikament gemäß der
vorliegenden Erfindung kann zur Behandlung von Krankheiten, die
mit einer abnehmenden Osteogenese, Knochenverletzungen oder Knochendefekten
verbunden sind, insbesondere zur Behandlung von Knochentumoren,
komplexen Frakturen und dergleichen verwendet werden. Das Medikament
gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Osteogenese
in dem biologischen Organismus fördern oder induzieren,
und kann erstaunlicherweise die Osteogenese sogar in einer Region
induzieren, in deren Umgebung kein Knochen vorhanden ist.
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In
einer Ausführungsform können die in der vorliegenden
Erfindung verwendeten undifferenzierten Zellen C3H10T1/2-Zellen,
ATDC5-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen, BALB/3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen, C2C12-Zellen, PT-2501-Zellen,
aus primärem Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen und
dergleichen sein (vorzugsweise C3H10T1/2-Zellen, PT-2501-Zellen
und aus primärem Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen),
sind jedoch nicht darauf eingeschränkt.
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In
einer Ausführungsform können die in der vorliegenden
Erfindung verwendeten undifferenzierten Zellen mesenchymale Stammzellen
(z. B. aus Ratten-Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen)
sein. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten undifferenzierten
Zellen können aus einem Säugetier stammende Zellen
sein (z. B. Mensch, Ratte, Maus, Kaninchen). Beispiele für
solche undifferenzierten Zellen können zum Beispiel aus
Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen einschließen.
Als undifferenzierte Zellen kann ferner ein im Handel erhältlicher
Zellstamm (z. B. menschliche mesenchymale Stammzellen (hMSC): ”PT-2501”,
hergestellt von Cambrex Corporation) verwendet werden.
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In
einer Ausführungsform können die in der vorliegenden
Erfindung verwendeten undifferenzierten Zellen zu einem Pellet geformt
werden. Zum Beispiel können die vorstehenden undifferenzierten
Zellen C3H10T1/2-Zellen sein, die zu dem Pellet geformt werden.
Die mit dem Induzierungsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten
induzierten Osteoblasten können auf die gleiche Art und
Weise wie natürliche Osteoblasten verwendet werden. Daher
kann das Medikament der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Knochendefekten
und dergleichen verwendet werden.
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Bei
der Herstellung der induzierten Osteoblasten können beliebige
verwendet werden, die vorstehend in (Induzierungsverfahren für
induzierte Osteoblasten), (Hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
und dergleichen in der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind.
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(Zusammensetzung)
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung
zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem
biologischen Organismus bereit, die folgendes umfasst: A) eine extrazelluläre
Matrix; und B) induzierte Osteoblasten. Die Zusammensetzung gemäß der
vorliegenden Erfindung kann zur Behandlung von Krankheiten, die
mit einer abnehmenden Osteogenese, Knochenverletzungen oder Knochendefekten
verbunden sind, insbesondere zur Behandlung von Knochentumoren,
komplexen Frakturen und dergleichen verwendet werden. Die Zusammensetzung
gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Osteogenese
in dem biologischen Organismus fördern oder induzieren,
und kann erstaunlicherweise die Osteogenese sogar in einer Region
induzieren, in deren Umgebung kein Knochen vorhanden ist.
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In
einer Ausführungsform kann die extrazelluläre
Matrix eine extrazelluläre Matrix sein, die von den induzierten
Osteoblasten stammt, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform kann diese extrazelluläre
Matrix Typ-I-Collagen, Knochenproteoglycan, Osteocalcin, Matrix-Gla-Protein,
Osteoglycin, Osteopontin, Knochenprotein mit Sialinsäure
und dergleichen sein, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt.
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In
einer Ausführungsform können in der Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung die induzierten Osteoblasten und die
extrazelluläre Matrix in einem gemischten Zustand vorliegen.
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In
einer Ausführungsform können die undifferenzierten
Zellen, von denen die induzierten Osteoblasten stammen und die in
der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten sind, Stammzellen
(z. B. embryonale Stammzellen, embryonale Keimstammzellen oder Gewebestammzellen)
sein. Zum Beispiel können die Stammzellen mesenchymale
Stammzellen (z. B. aus Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen),
hämatopoietische Stammzellen, vaskuläre Stammzellen,
hepatische Stammzellen, pankreatische (allgemeine) Stammzellen oder
neurale Stammzellen sein.
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Die
undifferenzierten Zellen beinhalten ferner sämtliche Zellen
auf dem Weg der Differenzierung. Vorzugsweise können diese
undifferenzierten Zellen C3H10T1/2-Zellen, ATDC5-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen, BALB/3T3-Zellen,
NIH3T3-Zellen, C2C12-Zellen, PT-2501-Zellen, aus primärem
Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen und dergleichen sein (stärker
bevorzugt C3H10T1/2-Zellen, PT-2501-Zellen und aus primärem
Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen).
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten undifferenzierten Zellen
können beliebige Zellen sein, die zu den induzierten Osteoblasten
differenziert werden können. Die in der vorliegenden Erfindung
verwendeten undifferenzierten Zellen können aus einem Säugetier
stammende Zellen sein (z. B. Mensch, Ratte, Maus, Kaninchen). Beispiele
für die Zellen können aus Ratten-Knochenmark gewonnene
mesenchymale Stammzellen einschließen. Als undifferenzierte
Zellen kann ferner ein im Handel erhältlicher Zellstamm
(z. B. menschliche mesenchymale Stammzellen (hMSC): ”PT-2501”,
hergestellt von Cambrex Corporation) verwendet werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform können in der Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung die induzierten Osteoblasten Zellen enthalten,
die die extrazelluläre Matrix sezernieren. In einer bevorzugten
Ausführungsform können in der Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung die induzierten Osteoblasten Zellen sein,
die von C3H10T1/2-Zellen, ATDC5-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen,
BALB/3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen, C2C12-Zellen, PT-2501-Zellen, aus
primärem Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen und dergleichen
stammen (bevorzugt C3H10T1/2-Zellen, PT-2501-Zellen und aus primärem
Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen). Zusätzlich sezernieren
die induzierten Osteoblasten die extrazelluläre Matrix.
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In
einer weiteren Ausführungsform kann die Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung bei der Osteogenese zur Reparatur oder
Behandlung von Knochendefekten verwendet werden. Der Knochendefekt kann
jeweils so groß sein, dass er nur durch Immobilisierung
des Knochens nicht behandelt werden kann.
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In
einer weiteren Ausführungsform kann die Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung bei der Osteogenese zur Knochenbildung
in einer Region verwendet werden, in deren Umgebung kein Knochen
vorhanden ist. In der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
kann eine beliebige verwendet werden, die vorstehend in (Induzierungsverfahren
für induzierte Osteoblasten), (Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten) und dergleichen in der vorliegenden Beschreibung beschrieben
ist.
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(Verbundmaterial)
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In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verbundmaterial
zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem
biologischen Organismus bereit. Das Verbundmaterial kann folgendes
enthalten: A) eine extrazelluläre Matrix; B) induzierte
Osteoblasten; und C) ein biokompatibles Gerüst. Das Verbundmaterial
gemäß der vorliegenden Erfindung kann zur Behandlung
von Krankheiten, die mit einer abnehmenden Osteogenese, Knochenverletzungen
oder Knochendefekten verbunden sind, insbesondere zur Behandlung von
Knochentumoren, komplexen Frakturen und dergleichen verwendet werden.
Das Verbundmaterial gemäß der vorliegenden Erfindung
kann die Osteogenese in dem biologischen Organismus fördern
oder induzieren, und kann erstaunlicherweise die Osteogenese sogar
in einer Region induzieren, in deren Umgebung kein Knochen vorhanden
ist.
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In
einer Ausführungsform kann die extrazelluläre
Matrix eine extrazelluläre Matrix sein, die von den induzierten
Osteoblasten stammt, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform kann diese extrazelluläre
Matrix Typ-I-Collagen, Knochenproteoglycan, Osteocalcin, Matrix-Gla-Protein,
Osteoglycin, Osteopontin, Knochenprotein mit Sialinsäure
und dergleichen sein, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt.
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In
einer Ausführungsform kann das in dem Verbundmaterial der
vorliegenden Erfindung verwendete biokompatible Gerüst
Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Aluminiumoxid, Zirconiumoxid,
Apatit-Wollastonit enthaltendes Glas, Gelatine, Collagen, Chitin,
Fibrin, Hyaluronsäure, ein Gemisch aus extrazellulärer
Matrix, Seide, Cellulose, Dextran, Agarose, Agar, synthetisches
Polypeptid, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglycolsäure,
Polymethylmethacrylat, Polycyanoacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan,
Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, ein Ethylen-Vinylacetat-Copolymer,
Nylon, eine Kombination davon und dergleichen sein, ist jedoch nicht
darauf eingeschränkt. Das ist deshalb der Fall, da ein
beliebiges biokompatibles Gerüst verwendet werden kann,
solange der vorliegende Wirkstoff daran anhaftet oder darin dispergiert
wird, oder daran anhaften oder darin dispergiert werden kann.
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Vorzugsweise
kann das biokompatible Gerüst zum Beispiel folgendes sein:
poröses Hydroxylapatit (z. B. ”APACERAM mit Porosität
50%”, hergestellt von HOYA CORPORATION), super-poröses
Hydroxylapatit (z. B. ”APACERAM mit Porosität
85%”, hergestellt von HOYA CORPORATION, ”3D Scaffold”,
hergestellt von BD Corporation), ein Apatit-Collagen-Gemisch (z.
B. ein Gemisch aus ”APACERAM GRANULE”, hergestellt
von HOYA CORPORATION, und ”Collagen Gel”, hergestellt
von Nitta Gelatin Inc.), ein Apatit-Collagen-Komplex (z. B. ”APACOLLA”,
hergestellt von HOYA CORPORATION), Collagengel (z. B. ”Collagen
Gel”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.), Collagenschwamm
(z. B. ”Collagen Sponge”, hergestellt von Nitta
Gelatin Inc.), Gelatineschwamm (z. B. ”Hemostatic Gelatin
Sponge”, hergestellt von Yamanouchi Pharmaceutical Co.,
Ltd.), Fibringel (”Beriplast P”, hergestellt von
Nipro), synthetisches Peptid (z. B. ”Pramax”,
hergestellt von 3D Matrix Corporation), ein Gemisch aus extrazellulärer
Matrix (z. B. ”Matrigel”, hergestellt von BD Corporation),
Alginat (”Kelton LVCR”, hergestellt von Kelco
Corporation), Agarose (”Agarose”, hergestellt
von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Polyglycolsäure,
Polymilchsäure, ein Polyglycolsäure-Polymilchsäure-Copolymer
und eine Kombination davon. Stärker bevorzugt kann das
biokompatible Gerüst Hydroxylapatit, Collagengel und ein
Gemisch aus extrazellulärer Matrix sein.
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In
einer weiteren Ausführungsform können die induzierten
Osteoblasten an dem biokompatiblen Gerüst über
die extrazelluläre Matrix oder direkt anhaften.
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In
einer Ausführungsform kann das Verbundmaterial der vorliegenden
Erfindung bei der Osteogenese zur Reparatur oder Behandlung von
Knochendefekten verwendet werden. Beispiele für solche
Knochendefekte beinhalten Läsionen, wie Knochentumore,
Osteoporose, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Osteomyelitis und
Osteonekrosis; Korrekturen, wie Immobilisierung des Knochens, Foraminotomie
und Osteotomie; Trauma, wie eine komplexe Fraktur; Knochendefekte,
die von einer Entnahme aus Hüftknochen stammen; und dergleichen,
sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Der Knochendefekt
kann jeweils so groß sein, dass er nur durch Immobilisierung
des Knochens nicht behandelt werden kann.
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In
einer weiteren Ausführungsform kann das Verbundmaterial
der vorliegenden Erfindung bei der Osteogenese zur Knochenbildung
in einer Region verwendet werden, in deren Umgebung kein Knochen
vorhanden ist. Eine solche Region, in deren Umgebung kein Knochen
vorhanden ist, kann Weichgewebe, wie subkutanes Gewebe, Muskelgewebe
und Fettgewebe, Verdauungsorgane, Atmungsorgane, Harnorgane, Geschlechtsorgane,
endokrine Organe, vaskuläre Systeme, Nervensysteme und
Sinnesorgane einschließen, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt.
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In
dem Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung können als
induzierte Osteoblasten beliebige verwendet werden, die vorstehend
in (Induzierungsverfahren für induzierte Osteoblasten),
(Hypertrophierungsfähige Chondrozyten), (Zusammensetzung)
und dergleichen in der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind.
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(Herstellungsverfahren)
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In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung eines Verbundmaterials zur Förderung oder Induzierung
von Osteogenese in einem biologischen Organismus bereit. Das Verfahren schließt
folgendes ein: A) einen Schritt der Bereitstellung von induzierten
Osteoblasten, die unter Verwendung eines Wirkstoffs induziert wurden,
der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt
wird; B) einen Schritt der Kultivierung der induzierten Osteoblasten
auf einem biokompatiblen Gerüst. Das Herstellungsverfahren
der vorliegenden Erfindung kann das Verbundmaterial bereitstellen,
um die Osteogenese in dem biologischen Organismus verstärkt
und stabil zu fördern oder zu induzieren. Das Verbundmaterial
kann ferner die Osteogenese sogar in einer Region induzieren, in
deren Umgebung kein Knochen vorhanden ist.
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In
einer Ausführungsform kann das Herstellungsverfahren der
vorliegenden Erfindung folgendes einschließen: A) einen
Schritt der Bereitstellung der induzierten Osteoblasten, in dem
sie unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens in
(Induzierungsverfahren für induzierte Osteoblasten) in
der vorliegenden Beschreibung hergestellt werden; und B) einen Schritt
der Kultivierung der induzierten Osteoblasten auf dem biokompatiblen
Gerüst.
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In
einer Ausführungsform in dem vorliegenden Herstellungsverfahren
können die induzierten Osteoblasten aus undifferenzierten
Zellen auf dem biokompatiblen Gerüst induziert werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform kann das unter Verwendung
dieses Herstellungsverfahrens hergestellte Verbundmaterial eine
extrazelluläre Matrix beinhalten. In einer Ausführungsform
kann die extrazelluläre Matrix hergestellt werden, indem
die induzierten Osteoblasten auf dem biokompatiblen Gerüst
kultiviert werden. In einer weiteren Ausführungsform kann
die extrazelluläre Matrix dem biokompatiblen Gerüst
von außen zugegeben werden. Die extrazelluläre
Matrix kann dem biokompatiblen Gerüst vor, nach oder während
des Impfens der induzierten Osteoblasten auf das biokompatible Gerüst
zugegeben werden.
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In
dem Herstellungsverfahren des Verbundmaterials der vorliegenden
Erfindung können als induzierte Osteoblasten bzw. als Verbundmaterial
beliebige verwendet werden, die vorstehend in (Induzierungsverfahren für
induzierte Osteoblasten), (Hypertrophierungsfähige Chondrozyten),
(Zusammensetzung), (Verbundmaterial) und dergleichen in der vorliegenden
Beschreibung beschrieben sind.
-
(Gerüst)
-
Ein ”Gerüst”,
so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Material zum Tragen
von Zellen. Das Gerüst weist konstante Stärke
und Bioverträglichkeit auf. So wie hier verwendet, wird
das Gerüst aus biologischen Materialien, natürlich
bereitgestellten Materialien oder natürlich vorkommenden
Materialien oder synthetisch bereitgestellten Materialien hergestellt.
-
In
einem spezifisch beschriebenen Fall wird das Gerüst aus
anderen Materialien als Organismen, wie Geweben oder Zellen (d.
h. nicht-zelluläres Material) gebildet. So wie hier verwendet,
ist das Gerüst eine Zusammensetzung, die aus anderen Materialien
als Organismen, wie Geweben oder Zellen gebildet wird, einschließlich
Materialien, die von einem biologischen Organismus abgeleitet sind,
wie Collagen oder Hydroxylapatit. Ein ”Organismus”,
so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Materialsystem, das
derart organisiert ist, dass es eine lebende Funktion aufweist.
Dies bedeutet, dass der Begriff ”Organismus” Lebewesen
von anderen Materialsystemen unterscheidet. Das Konzept des Organismus
umfasst Zellen, Gewebe oder andere, während Materialien,
die von Lebewesen stammen und aus dem Organismus extrahiert sind,
nicht umfasst werden.
-
Beispiele
für den Gerüstbereich, an den die Zellen fixiert
sind, schließen eine Oberfläche des Gerüsts und
eine innere Pore des Gerüsts ein (wenn es eine solche innere
Pore aufweist, die Zellen aufnehmen kann). Zum Beispiel schließt
ein aus Hydroxylapatit hergestelltes Gerüst viele Poren
ein, die normalerweise Zellen in ausreichender Weise aufnehmen können.
-
Ein
Material, aus dem das Gerüst besteht, kann Calciumphosphat,
Calciumcarbonat, Aluminiumoxid, Zirconiumoxid, Apatit-Wollastonit
enthaltendes Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure,
ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix, Seide, Cellulose,
Dextran, Agarose, Agar, synthetisches Polypeptid, Polymilchsäure,
Polyleucin, Alginsäure, Polyglycolsäure, Polymethylmethacrylat,
Polycyanoacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen,
Polyvinylchlorid, ein Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, Nylon, eine Kombination
davon und dergleichen sein, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt.
Das ist deshalb der Fall, da ein beliebiges biokompatibles Gerüst
verwendet werden kann, solange der vorliegende Wirkstoff daran anhaftet
oder darin dispergiert wird, oder daran anhaften oder darin dispergiert
werden kann.
-
Vorzugsweise
kann das biokompatible Gerüst zum Beispiel folgendes sein:
poröses Hydroxylapatit (z. B. ”APACERAM mit Porosität
50%”, hergestellt von HOYA CORPORATION), super-poröses
Hydroxylapatit (z. B. ”APACERAM mit Porosität
85%”, hergestellt von HOYA CORPORATION, ”3D Scaffold”,
hergestellt von BD Corporation), ein Apatit-Collagen-Gemisch (z.
B. ein Gemisch aus ”APACERAM GRANULE”, hergestellt
von HOYA CORPORATION, und ”Collagen Gel”, hergestellt
von Nitta Gelatin Inc.), ein Apatit-Collagen-Komplex (z. B. ”APACOLLA”,
hergestellt von HOYA CORPORATION), Collagengel (z. B. ”Collagen
Gel”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.), Collagenschwamm
(z. B. ”Collagen Sponge”, hergestellt von Nitta
Gelatin Inc.), Gelatineschwamm (z. B. ”Hemostatic Gelatin
Sponge”, hergestellt von Yamanouchi Pharmaceutical Co.,
Ltd.), Fibringel (”Beriplast P”, hergestellt von
Nipro), synthetisches Peptid (z. B. ”Pramax”,
hergestellt von 3D Matrix Corporation), ein Gemisch aus extrazellulärer
Matrix (z. B. ”Matrigel”, hergestellt von BD Corporation),
Alginat (”Kelton LVCR”, hergestellt von Kelco
Corporation), Agarose (”Agarose”, hergestellt
von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Polyglycolsäure,
Polymilchsäure, ein Polyglycolsäure-Polymilchsäure-Copolymer
und eine Kombination davon. Stärker bevorzugt kann das
biokompatible Gerüst Hydroxylapatit, Collagengel und ein
Gemisch aus extrazellulärer Matrix sein.
-
Diese
Gerüste können in jeder beliebigen Form bereitgestellt
werden, wie eine granuläre Form, eine Blockform oder eine
Schwammform. Diese Gerüste können porös
oder nicht-porös sein. Für solche Gerüste können
die im Handel erhältlichen z. B. von HOYA CORPORATION,
Olympus Corporation, Kyocera Corporation, Mitsubishi Pharma Corporation,
Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd., Kobayashi Pharmaceuticals Co. Ltd.,
Zimmer Inc. verwendet werden. Standardverfahren zur Herstellung
und Charakterisierung von Gerüsten sind auf dem Fachgebiet
bekannt, die nur routinemäßige Untersuchungen
und das allgemeine Fachwissen erfordern. Siehe beispielsweise das
US-Patent Nr. 4,975,526 ;
Nr. 5,011,691 ;
Nr. 5,171,574 ;
Nr. 5,266,683 ;
Nr. 5,354,557 ; und
Nr. 5,468,845 , die hier als Literaturhinweise
mit eingeschlossen sind.
-
Weitere
Gerüste sind ebenfalls beschrieben, beispielsweise in den
folgenden Dokumenten: Artikel über biokompatible Materialien,
wie LeGeros und Daculsi, Handbook of Bioactive Ceramics,
II S. 17–28 (1990, CRC Press); andere veröffentlichte
Beschreibungen, wie Yang Cao, Jie Weng, Biomaterials 17
(1996), S. 419–424; LeGeros, Adv. Dent.
Res. 2, 164 (1988); Johnson et al., J. Orthopaedic
Research, 1996; Bd. 14, S. 351–369; und Piattelli
et al., Biomaterials 1996, Bd. 17, S. 1767–1770,
deren Offenbarungen hier als Literaturhinweise mit eingeschlossen
sind.
-
”Calciumphosphat”,
so wie hier verwendet, ist der generische Name für Phosphate
des Calciums. Beispiele für die Calciumphosphate beinhalten
Verbindungen, die durch die folgenden chemischen Formeln dargestellt
sind: CaHPO4, Ca3(PO4)2, Ca4O(PO4)2, Ca10(PO4)6P(OH)2,
CaP4O11, Ca(PO3)2, Ca2P2O7, und Ca(H2PO4)2·H2O, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt.
-
”Hydroxylapatit”,
so wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Verbindung, deren allgemeine
Zusammensetzung Ca10(PO4)6(OH)2 ist. Dieses
Hydroxylapatit ist ein Hauptbestandteil des harten Gewebes von Säugetieren
(Knochen und Zähne), wie Collagen. Obwohl Hydroxylapatit
eine Reihe der vorstehend beschriebenen Calciumphosphate enthält,
sind die Bestandteile PO4 und OH innerhalb
des Apatits in den harten Geweben von biologischen Organismen häufig
mit einem CO3-Bestandteil in Körperflüssigkeiten
substituiert.
-
Weiterhin
ist Hydroxylapatit ein Material, dessen Sicherheit durch das Ministerium
für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt in Japan und die FDA
(US Nahrungs- und Arzneimittelzulassung) festgestellt wurde. Obwohl
viele im Handel erhältliche Hydroxylapatite im biologischen
Organismus nicht absorbierbar sind und im biologischen Organismus
kaum absorbiert verbleiben, sind andere vom biologischen Organismus
absorbierbar.
-
Ein ”Gemisch
aus extrazellulärer Matrix”, so wie hier verwendet,
bezieht sich auf ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix
und einem Wachstumsfaktor. Beispiele für die extrazelluläre
Matrix beinhalten Laminin, Collagen und dergleichen, sind jedoch
nicht darauf eingeschränkt. Die extrazelluläre
Matrix kann aus einem biologischen Organismus stammen oder synthetisch
sein.
-
(Verfahren zur Förderung oder
Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus)
-
In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen
Organismus bereit. Das Verfahren kann folgendes einschließen:
einen Schritt der Implantierung von induzierten Osteoblasten, eines
Medikaments, einer Zusammensetzung oder eines Verbundmaterials gemäß der
vorliegenden Erfindung in eine Region, in der die Osteogenese in
dem biologischen Organismus gefördert oder induziert werden
muss.
-
Als
induzierte Osteoblasten, Medikament, Zusammensetzung oder Verbundmaterial
gemäß der vorliegenden Erfindung können
beliebige verwendet werden, die vorstehend in (Induzierungsverfahren
für induzierte Osteoblasten), (Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten), (Medikament und medizinisches Material), (Zusammensetzung),
(Verbundmaterial) und dergleichen in der vorliegenden Beschreibung
beschrieben sind. Die induzierten Osteoblasten gemäß der
vorliegenden Erfindung können auf die gleiche Art und Weise
wie natürliche Osteoblasten verwendet werden. Daher können
sie zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in dem
biologischen Organismus verwendet werden.
-
In
einer Ausführungsform kann in dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung die Osteogenese zur Reparatur oder Behandlung von Knochendefekten
verwendet werden. Der Knochendefekt kann jeweils so groß sein,
dass er nur durch Immobilisierung des Knochens nicht behandelt werden
kann.
-
In
einer weiteren Ausführungsform kann die Osteogenese ferner
zur Knochenbildung in einer Region verwendet werden, in deren Umgebung
kein Knochen vorhanden ist.
-
Ein ”Subjekt”,
so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Lebewesen, bei dem eine
Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung vorgenommen
wird. Es wird auch als ein ”Patient” bezeichnet.
Das Subjekt oder der Patient kann ein Hund, eine Katze oder ein
Pferd, vorzugsweise ein Mensch sein.
-
Ein
subkutaner Test für Osteogenese ist ein Test zum Bewerten
der osteogenen Fähigkeit zur Knochenbildung in einer Region,
in der ursprünglich kein Knochen vorhanden ist. Diese osteogene
Fähigkeit wird auch als Prosthesis bezeichnet. Weil dieser
Test einfach durchgeführt werden kann, wird er auf dem
Fachgebiet weitreichend verwendet. Im Falle einer Knochenbehandlung
kann ein Knochendefekttest als ein Testverfahren verwendet werden.
-
In
diesem Test erfolgt die Osteogenese in einer Umgebung, in dem dafür
induzierungsfähige Bedingungen vollendet wurden. Ferner
wird die Osteogenese von Osteoblasten, die bereits in der Nähe
einer Region mit Knochendefekt vorhanden sind, oder von Osteoblasten,
die induziert wurden/dorthin gewandert sind, induziert. Somit wird
normalerweise angenommen, dass eine Rate der Osteogenese in dem
Knochendefekttest besser als in dem subkutanen Test ist.
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Es
ist wohl bekannt, dass das Ergebnis des subkutanen Tests mit der
Rate der Osteogenese bei einem tatsächlichen Knochendefekt übereinstimmt
(siehe z. B. Urist, M. R., Science, 150: 893–899
(1965); Wozney, J. M. et al., Science, 242: 1528–1532
(1988); Johnson, E. E. et al., Clin. Orthop., 230:
257–265 (1988); Ekelund, A. et al., Clin.
Orthop., 263: 102–112 (1991); und Riley,
E. H. et al., Clin. Orthop., 324: 39–46 (1996)). Wenn
deshalb Osteogenese als das Ergebnis des subkutanen Tests beobachtet
wird, versteht der Fachmann, dass Osteogenese auch in dem Knochendefekttest
induziert werden sollte.
-
Wenn
Maus-C3H10T1/2-Zellen zu Pellets (Zellpellets) geformt und anschließend
die Pellets in einem Medium kultiviert werden, dem ein Überstand
zugegeben wird, der den die Differenzierung von induzierten Osteoblasten
induzierenden Wirkstoff der vorliegenden Erfindung beinhaltet, werden
die Maus-C3H10T1/2-Zellen der Pellets zu induzierten Osteoblasten
induziert. Wenn danach die Pellets der induzierten Osteoblasten unter
die Haut und in Regionen mit Knochendefekt von syngenen Tieren oder
immundefizienten Tieren implantiert werden, wird die Osteogenese
induziert.
-
Wenn
andererseits die Pellets der Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem Medium,
dem ein Überstand, der den die Differenzierung von induzierten
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff nicht beinhaltet (ein Überstand des
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, in dem nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden) oder ein Überstand eines
Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten
kultiviert wurden, zugegeben wird, oder einem Medium, dem nur das
den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium zugegeben wurde,
kultiviert werden, werden die Maus-C3H10T1/2-Zellen der Pellets
nicht zu induzierten Osteoblasten in dem Zellpellet induziert. Selbst
wenn danach die Pellets unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt
implantiert werden, wird vorhergesagt, dass die Osteogenese nicht
induziert wird.
-
Wenn
mesenchymale Stammzellen (z. B. aus Knochenmark stammende undifferenzierte
Zellen) zu Pellets (Zellpellets) geformt und anschließend
die Pellets in einem Medium kultiviert werden, dem ein Überstand
zugegeben wird, der den die Differenzierung von induzierten Osteoblasten
induzierenden Wirkstoff der vorliegenden Erfindung beinhaltet, wird
vorhergesagt, dass die mesenchymalen Stammzellen der Pellets zu induzierten
Osteoblasten induziert werden. Wenn danach die Pellets der induzierten
Osteoblasten unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt von
syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert werden,
wird vorhergesagt, dass die Osteogenese induziert wird.
-
Wenn
die Pellets der mesenchymalen Stammzellen (z. B. die aus Knochenmark
stammenden undifferenzierten Zellen) in einem Medium, dem ein Überstand,
der den die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff nicht beinhaltet (ein Überstand des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums, in dem nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden), oder ein Überstand eines
Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert
wurden, zugegeben wird, oder einem Medium, dem nur das den Differenzierungswirkstoff
erzeugende Medium zugegeben wurde, kultiviert werden, wird vorhergesagt,
dass die mesenchymalen Stammzellen der Pellets nur mäßig
zu induzierten Osteoblasten induziert werden.
-
Das
geschieht darum, da das den Differenzierungswirkstoff erzeugende
Medium Komponenten beinhaltet, die zur Induzierung der Differenzierung
von Knochenmarkzellen zu Osteoblasten verwendet werden (Glucocorticoid, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure). Wenn die Pellets der mesenchymalen
Stammzellen unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert
werden, wird vorhergesagt, dass die Osteogenese nur mäßig
mit einem geringen Anteil induziert wird.
-
Wenn
die Pellets der mesenchymalen Stammzellen (z. B. die aus Knochenmark
stammenden undifferenzierten Zellen) in einem Medium, dem ein Überstand,
der den die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff nicht beinhaltet (ein Überstand eines Wachstumsmediums,
in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert
wurden) zugegeben wird, oder einem Medium, dem nur das den Differenzierungswirkstoff
erzeugende Medium zugegeben wurde, kultiviert werden, werden die
mesenchymalen Stammzellen zu den induzierten Osteoblasten nicht
induziert. Sogar wenn die Pellets der mesenchymalen Stammzellen
unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert werden,
wird vorhergesagt, dass die Osteogenese nicht induziert wird.
-
Wenn
zur Herstellung des Verbundmaterials der vorliegenden Erfindung Maus-C3H10T1/2-Zellen
auf ein Gerüst geimpft und anschließend in einem
Medium kultiviert werden, dem ein Überstand zugegeben wird, der
den die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff der vorliegenden Erfindung beinhaltet, werden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
auf dem Gerüst zu induzierten Osteoblasten induziert. Wenn dieses
Verbundmaterial unter die Haut von syngenen Tieren oder immundefizienten
Tieren implantiert wird, wird vorhergesagt, dass die Osteogenese
induziert wird. Wenn ferner dieses Verbundmaterial den Tieren in Regionen
mit Knochendefekt implantiert wird, wird vorhergesagt, dass eine
gute Osteogenese induziert wird.
-
Wenn
andererseits die Maus-C3H10T1/2-Zellen auf ein Gerüst geimpft
und anschließend in einem Medium kultiviert werden, dem
ein Überstand, der den die Differenzierung von induzierten
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff nicht beinhaltet (ein Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, in dem nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden) oder ein Überstand eines
Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten
kultiviert wurden, zugegeben wird, oder einem Medium, dem nur das
den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium zugegeben wurde,
kultiviert werden, werden die Maus-C3H10T1/2-Zellen auf dem Gerüst
nicht zu induzierten Osteoblasten induziert.
-
Selbst
wenn dieses Verbundmaterial unter die Haut implantiert wird, wird
vorhergesagt, dass die Osteogenese nicht induziert wird. Wenn dieses
Verbundmaterial in Regionen mit Knochendefekt implantiert wird, wird
vorhergesagt, dass die Osteogenese nur mäßig induziert
wird (ähnlich wenn das Gerüst unabhängig
darin implantiert wird), sogar wenn die induzierten Osteoblasten
auf dem Gerüst nicht induziert wurden.
-
Wenn
zur Herstellung des Verbundmaterials der vorliegenden Erfindung
mesenchymale Stammzellen (z. B. aus Knochenmark stammende undifferenzierte
Zellen) auf ein Gerüst geimpft und anschließend
in einem Medium kultiviert werden, dem ein Überstand zugegeben
wird, der den die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff der vorliegenden Erfindung beinhaltet, werden die mesenchymalen Stammzellen
auf dem Gerüst zu induzierten Osteoblasten induziert. Wenn
danach dieses Verbundmaterial unter die Haut von syngenen Tieren
oder immundefizienten Tieren implantiert wird, wird vorhergesagt,
dass die Osteogenese induziert wird. Wenn ferner dieses Verbundmaterial
den Tieren in Regionen mit Knochendefekt implantiert wird, wird
vorhergesagt, dass eine gute Osteogenese induziert wird.
-
Wenn
andererseits die mesenchymalen Stammzellen (z. B. die aus Knochenmark
stammenden undifferenzierten Zellen) auf ein Gerüst geimpft
und anschließend in einem Medium, dem ein Überstand,
der den die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff nicht beinhaltet (ein Überstand des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums, in dem nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden) zugegeben wird, oder einem Medium,
dem nur das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium zugegeben
wurde, kultiviert werden, wird vorhergesagt, dass die mesenchymalen
Stammzellen nur mäßig zu induzierten Osteoblasten
induziert werden.
-
Das
geschieht darum, da das den Differenzierungswirkstoff erzeugende
Medium Komponenten beinhaltet, die zur Induzierung der Differenzierung
von Knochenmarkzellen zu Osteoblasten verwendet werden (Glucocorticoid, β-Glycerophosphat
und Ascorbinsäure). Wenn danach dieses Verbundmaterial
unter die Haut von syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren
implantiert wird, wird vorhergesagt, dass die Osteogenese nur mäßig
induziert wird. Wenn ferner dieses Verbundmaterial den Tieren in
Regionen mit Knochendefekt implantiert wird, wird vorhergesagt,
dass die Osteogenese im Vergleich zur unabhängigen Implantierung
des Gerüsts darin mit einem nur mäßig
erhöhten Ausmaß induziert wird.
-
Wenn
ferner die mesenchymalen Stammzellen (z. B. die aus Knochenmark
stammenden undifferenzierten Zellen) auf ein Gerüst geimpft
und anschließend in einem Medium, dem ein Überstand,
der den die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff nicht beinhaltet (ein Überstand eines Wachstumsmediums,
in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert
wurden) zugegeben wird, oder einem Medium, dem nur das Wachstumsmedium
zugegeben wurde, kultiviert werden, wird vorhergesagt, dass die
mesenchymalen Stammzellen auf dem Gerüst nicht zu den induzierten
Osteoblasten induziert werden.
-
Selbst
wenn dieses Verbundmaterial unter die Haut von syngenen Tieren oder
immundefizienten Tieren implantiert wird, wird vorhergesagt, dass
die Osteogenese nicht induziert wird. Wenn dieses Verbundmaterial
den Tieren in Regionen mit Knochendefekt implantiert wird, wird
vorhergesagt, dass die Osteogenese nur mäßig induziert
wird (ähnlich wenn das Gerüst unabhängig
darin implantiert wird), sogar wenn die induzierten Osteoblasten
auf dem Gerüst nicht induziert wurden.
-
Das
Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung kann mittels Implantation
zum Reparieren und Rekonstruieren von Knochen verwendet werden.
Beispiele für eine Region, in die das Verbundmaterial implantiert wird,
beinhalten Regionen mit Knochendefekt, die aufgrund von Läsionen,
Exzision von Knochentumoren oder dergleichen entstanden sind, bei
denen eine Reparatur und Rekonstruktion des Knochens normalerweise
erforderlich ist, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt.
Das Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung kann zur Bildung
von Knochen in einer Region verwendet werden, in deren Umgebung
kein Knochen vorhanden ist. Die Implantation kann auf die gleiche
Art und Weise wie die bekannte Implantation unter Verwendung von
aus Knochenmark stammenden Stammzellen durchgeführt werden.
Die Menge des zu implantierenden Verbundmaterials wird zweckmäßig
in Abhängigkeit von Größen der Regionen
mit Knochendefekt, Symptomen und dergleichen ausgewählt.
-
Die
vorliegende Erfindung kann wahlweise zusammen mit einer physiologisch
aktiven Substanz, wie einem Cytokin, verwendet werden.
-
Eine ”Physiologisch
aktive zelluläre Substanz” oder ”physiologisch
aktive Substanz” wird hier austauschbar verwendet und bezieht
sich auf eine Substanz, die Zellen oder Gewebe beeinflusst. Beispiele
für solche Wirkungen umfassen die Kontrolle oder Modifikation
der Zellen oder Gewebe, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt.
Die physiologisch aktive Substanz umfasst ein Cytokin oder einen
Wachstumsfaktor. Die physiologisch aktive Substanz kann eine natürlich
vorkommende oder synthetisierte Substanz sein.
-
Vorzugsweise
kann die physiologisch aktive Substanz eine Substanz sein, die von
einer Zelle hergestellt wird, oder eine modifizierte Substanz sein,
die eine ähnliche Funktion zu der aufweist, die in einer
Zelle hergestellt wird. Die physiologisch aktive Substanz, so wie
hier verwendet, kann in Form von Proteinen, einschließlich
Peptiden, in Form von Nukleinsäuren oder in anderen Formen
vorliegen.
-
”Cytokin”,
so wie hier verwendet, wird mit der gleichen Bedeutung definiert,
die der weitläufigsten Bedeutung auf dem Fachgebiet entspricht.
Es bezieht sich auf eine physiologisch aktive Substanz, die in einer Zelle
hergestellt wird, die die gleiche oder eine unterschiedliche Zelle
beeinflusst. Im Allgemeinen ist ein Cytokin ein Protein oder Polypeptid
und besitzt Wirkungen, die die Immunantwort steuern, das endokrine
System modulieren, das Nervensystem modulieren, die Anti-Tumor-Wirkung
beeinflussen, die antivirale Wirkung beeinflussen, das Zellwachstum
modulieren, die Zelldifferenzierung modulieren, die Zellfunktion
modulieren und dergleichen. Das Cytokin, so wie hier verwendet,
kann in Form des Proteins, in Form der Nukleinsäure oder
in anderen Formen vorliegen. Allerdings liegt zum Zeitpunkt der
tatsächlichen Beeinflussung von Zellen das Cytokin oft
in Form des Proteins, einschließlich des Peptids, vor.
-
Ein ”Wachstumsfaktor” oder ”Zellwachstumsfaktor” wird
hier austauschbar verwendet und bezieht sich auf eine Substanz,
die die Proliferation und Induktion der Differenzierung von Zellen
fördert oder steuert. Der Wachstumsfaktor wird auch als
ein Proliferations- oder Entwicklungsfaktor bezeichnet. In einer
Zellkultur oder Gewebekultur kann der Wachstumsfaktor dem Medium
zugegeben werden und die Funktion von Serum-Makromolekülen
substituieren. Es ist bewiesen, dass, zusätzlich zum Zellwachstum,
viele Wachstumsfaktoren als Faktoren fungieren, die einen Differenzierungszustand
regulieren.
-
Typische
Beispiele für ein Cytokin, das mit Osteogenese assoziiert
ist, beinhaltet Faktoren, wie Transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β),
Knochen-morphogenetischen Faktor (BMP), Leukämie-inhibitorischen
Faktor (LIF), Kolonien-stimulierenden Faktor (CSF), Insulin-artigen
Wachstumsfaktor (IGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), plättchenreiches
Plasma (PRP), aus Plättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF)
und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF); und
Verbindungen, wie Ascorbinsäure, Glucocorticoid und Glycerophosphorsäure.
-
Da
die physiologisch aktive Substanz, wie das Cytokin oder der Wachstumsfaktor,
im Allgemeinen redundant sind, können Cytokine oder Wachstumsfaktoren,
die unter anderem Namen und unter einer anderen Funktion (wie Zelladhäsionsaktivität
oder Zell-Matrix-Adhäsionsaktivität) bekannt sind,
ebenfalls bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange
sie die Aktivität der in der vorliegenden Erfindung verwendeten physiologisch
aktiven Substanz aufweisen.
-
Cytokine
oder Wachstumsfaktoren können bei der Durchführung
der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange sie die bevorzugten
Aktivitäten, wie Wachstumsaktivität für
Stammzellen, Induzierungsaktivität der Differenzierung
zu Osteoblasten und Förderungsaktivität der Herstellung
des die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden
Wirkstoffs auf die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
aufweisen.
-
Der
in der vorliegenden Erfindung verwendete die Differenzierung von
induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff kann aus Zellen
stammen, die aus einem Individuum, das in einem syngenen Verhältnis
zu einem biologischen Organismus steht, einem Individuum, das in
einem allogenen Verhältnis zu einem biologischen Organismus
steht, oder einem Individuum, das in einem heterologen Verhältnis
zu einem biologischen Organismus steht, gewonnen wurden.
-
”Aus
einem Individuum mit syngenem Verhältnis zu einem biologischen
Organismus”, so wie hier verwendet, bedeutet eine Abstammung
von einer autologen, reinen Linie oder Inzuchtlinie.
-
”Aus
einem Individuum mit allogenem Verhältnis zu einem biologischen
Organismus”, so wie hier verwendet, bedeutet eine Abstammung
von einem anderen Individuum der gleichen Spezies, die sich genetisch unterscheiden.
-
”Aus
einem Individuum mit heterologem Verhältnis zu einem biologischen
Organismus”, so wie hier verwendet, bedeutet eine Abstammung
von einem heterologen Individuum. Wenn zum Beispiel der Empfänger ein
Mensch ist, stammen somit Zellen aus einer Ratte ”aus einem
Individuum mit heterologem Verhältnis zu einem biologischen
Organismus”.
-
(Verwendung)
-
In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von induzierten
Osteoblasten zur Herstellung eines Medikaments oder medizinischen
Materials, das zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese
in einem biologischen Organismus fähig ist. Die in der
vorliegenden Erfindung verwendeten induzierten Osteoblasten können
auf beliebige Weise hergestellt werden, die vorstehend in (Induzierungsverfahren
für induzierte Osteoblasten) in der vorliegenden Beschreibung
beschrieben ist.
-
Als
die induzierten Osteoblasten können beliebige verwendet
werden, die vorstehend in (Induzierungsverfahren für induzierte
Osteoblasten), (Hypertrophierungsfähige Chondrozyten) und
dergleichen in der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind. Die
induzierten Osteoblasten können auf die gleiche Art und Weise
wie natürliche Osteoblasten verwendet werden. Daher können
die induzierten Osteoblasten der vorliegenden Erfindung zur Herstellung
des Medikaments oder medizinischen Materials, das zur Förderung
oder Induzierung der Osteogenese in einem biologischen Organismus
fähig ist, verwendet werden.
-
Hiernach
wird die vorliegende Erfindung anhand verschiedener Beispiele beschrieben.
Die nachstehend beschriebenen Beispiele sind lediglich für
erläuternde Zwecke bereitgestellt. Dementsprechend wird
der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht durch die vorstehend
beschriebenen Ausführungsformen oder die nachstehenden
Beispiele eingeschränkt, sondern wird statt dessen nur
durch die angefügten Ansprüche eingeschränkt.
-
BEISPIELE
-
In
den nachstehend beschriebenen Beispielen wurden mit einigen Ausnahmen
Reagenzien verwendet, die von Wako Pure Chemical Industries Ltd.,
Invitrogen Corporation, Cambrex Corporation, Aldrich-Sigma Corporation
und dergleichen bezogen wurden.
-
(Herstellung der Medien)
-
In
den Beispielen der vorliegenden Beschreibung wurden mit Ausnahme
eines spezifisch beschriebenen Falls die folgenden Medien verwendet. (Für Zellen verwendete Medien)
Zelltyp | Verwendetes
Medium |
Chondrozyten | HAM-Medium |
C3H10T1/2-Zellen | BME-Medium |
3T3 | Swiss-Albino-Zellen | D-MEM-Medium |
BALB-Zellen | D-MEM-Medium |
NIH-Zellen | D-MEM-Medium |
Knochenmarkzellen | MEM-Wachstumsmedium |
Menschliche
mesenchymale Stammzellen (h-MSC) | MSCGM
(Wachstumsmedium) |
-
Ein
HAM-Medium, BME-Medium, D-MEM-Medium, MEM-Wachstumsmedium und MSCGM
(Wachstumsmedium) wurde hergestellt, um Zusammensetzungen davon
zu erhalten, die in der folgenden Tabelle angegeben sind. * HAM-Medium, BME-Medium, D-MEM-Medium ••• herkömmlich
Medium
(HAM, BME, D-MEM) | 88,9% |
Fötales
Rinderserum | 10% |
Penicillin·Streptomycin | 1% |
Fungizon | 0,1% |
Summe | 100% |
- Medium: Basismedium, das zur Herstellung
der einzelnen Medien verwendet wurde
- HAM: HAM-F12-Medium
- BME: Eagle-Basismedium
- D-MEM: modifiziertes Eagle-Medium nach Dulbecco
- Fungizon: 250 μg/ml Amphotericin B (”15290-018”,
hergestellt von Invitrogen Corporation)
* MEM-Wachstumsmedium Essenzielles
Minimalmedium | 83,9% |
Fötales
Rinderserum | 15% |
Penicillin·Streptomycin | 1% |
Fungizon | 0,1% |
Summe | 100% |
* Differenzierungswirkstoff erzeugendes
MEM-Medium Essenzielles
Minimalmedium | 80,9% |
Fötales
Rinderserum | 15% |
Penicillin·Streptomycin | 1% |
Fungizon | 0,1% |
β-Glycerophosphat | 1% |
Dexamethason | 1% |
Ascorbinsäure | 1% |
Summe | 100% |
* MSCGM (Wachstumsmedium) MSCBM | 88% |
MSCGS | 10% |
L-Glutamin | 2% |
Penicillin·Streptomycin | 0,1% |
Summe | 100% |
- Fungizon: 250 μg/ml Amphotericin
B (”15290-018”, hergestellt von Invitrogen Corporation)
- MSCBM: ”PT-3238”, hergestellt von Cambrex
Corporation
- MSCGS: ”PT-3001”, hergestellt von Cambrex
Corporation
-
(Beispiel 1: Herstellung und Nachweis
eines zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, hergestellt durch Kultivieren
von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten aus Costa/costal-Knorpeln
in dem Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium)
-
(Herstellung von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten aus Costa/costal-Knorpeln)
-
Gruppen
von 4 Wochen alten männlichen Ratten (Wistar) bzw. von
8 Wochen alten männlichen Ratten (Wistar) wurden in dem
vorliegenden Beispiel untersucht. Diese Ratten wurden unter Verwendung
von Chloroform getötet. Der Brustkorb der Ratten wurde
unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen
Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung
(10-fach verdünnt) eingetaucht. Der Brustkorb der Ratten
wurde eingeschnitten und die Costa/costal-Knorpel aseptisch entnommen.
-
Die
durchscheinende Wachstumsknorpelregion wurde aus der Grenzregion
der Costa/costal-Knorpel gesammelt. Der Wachstumsknorpel wurde zerschnitten
und in 0,25% Trypsin-EDTA/Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
nach Dulbecco (D-PBS) bei 37°C für 1 Stunde gerührt.
Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei
170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend
zusammen mit 0,2% Collagenase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/D-PBS
bei 37°C für 2,5 h gerührt.
-
Die
Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei
170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend
zusammen mit 0,2% Dispase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/(HAM
+ 10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei
37°C gerührt. Am folgenden Tag wurden die Zellen
filtriert und durch Zentrifugation (bei 170 × g für
3 min) gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt
und ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
-
Die
Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden,
wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt
wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
-
(Identifizierung von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten)
-
Da
die in Beispiel 1 erhaltenen Zellen durch die bei der Zelltrennung
verwendeten Enzyme (z. B. Trypsin, Collagenase und Dispase) beeinträchtigt
waren, wurden sie zur Erholung kultiviert. Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden unter Verwendung der Lokalisierung und Expression
von Chondrozyten-Markern und ihrer morphologischen Hypertrophien
unter einem Mikroskop identifiziert.
-
(Expression von spezifischen Markern für
hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
-
Ein
unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens hergestelltes
Lysat wurde mit Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt, um eine SDS-behandelte
Lösung zu erhalten. Mit der SDS-behandelten Lösung
wurde eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt.
Das in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendete Gel wurde
anschließend auf eine Transfermembran aufgetragen (Western-Blotting), mit
einem primären Antikörper auf einen Chondrozyten-Marker
umgesetzt und mit einem sekundären Antikörper
nachgewiesen, der mit einem Enzym, wie Peroxidase, alkalische Phosphatase
oder Glucosidase, oder einem Fluoreszenzmarker, wie Fluoresceinisothiocyanat
(FITC), Phycoerythrin (PE), Texas-Rot, 7-Amino-4-methylcoumarin-3-acetat
(AMCA) oder Rhodamin, markiert ist.
-
(Expression eines Marker-Gens für
hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
-
Die
Expression der Marker kann ferner durch Extraktion von RNA aus den
Zellen, die unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens
erhalten wurden, und anschließendes Testen der RNA unter Verwendung
eines PCR-Verfahrens nachgewiesen werden. In diesem Beispiel wurden
die Expressionsniveaus von alkalischer Phosphatase, Typ-II-Collagen,
Aglycan und Osteocalcin unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Verfahrens
gemessen. GAPDH wurde als integrales Kontroll-Gen verwendet.
-
Proben
(Gp1 und Gp2) wurden durch Zentrifugation von 5 × 105 hypertrophierungsfähigen Chondrozyten,
die in diesem Beispiel hergestellt wurden, bei 170 bis 200 × g
für 3 bis 5 min unter Bildung von Pellets hergestellt und
anschließend wurden die Pellets in einem 5% CO2 Inkubator
bei 37°C für 1 Woche kultiviert und verwendet.
Als Medium wurde HAM-Medium + 10% FBS oder HEM-Medium + 15% FBS
verwendet.
-
(Extraktion von Gesamt-RNA)
-
1
ml ISOGEN (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.) wurde
einer Kultur (Zellkultur) mit einer Kulturfläche von 12
cm2 zugegeben. Die Zellen wurden mit einem
Zellschaber entfernt, in ein 2 ml Röhrchen gegeben und
bei Raumtemperatur für 10 min belassen. 0,2 ml Chloroform
wurden dem Röhrchen zugegeben, es wurde kräftig
gevortext (gerührt) und anschließend bei 4°C
für 5 min belassen. Das Röhrchen wurde bei 12.000 × g
und bei 4°C für 15 min zentrifugiert und anschließend
wurde der Überstand, der eine flüssige Phase war,
in ein 1,5 ml Röhrchen gegeben.
-
0,5
ml Isopropanol wurden dem Röhrchen zugegeben und es wurde
kräftig gevortext und bei Raumtemperatur für 10
min belassen. Das Röhrchen wurde bei 12.000 × g
und bei 4°C für 15 min zentrifugiert, der Überstand
wurde vollständig entferntet, 1 ml 70% Ethanol wurden dem
Röhrchen zugegeben und anschließend wurde das
Röhrchen gevortext, um die Gesamt-RNA zu erhalten. Die
erhaltene Gesamt-RNA wurde in etwa 20 μl RNase-freies Wasser
gelöst und anschließend bei –80°C
gelagert.
-
cDNA
wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung eines High-Capacity cDNA
Archive Kit (hergestellt von Applied Biosystems, Inc.) synthetisiert.
Expressionen von alkalischer Phosphatase, Typ-II-Collagen und Knorpelproteoglycan
(Aglycan), Osteocalcin und GAPDH wurden unter Verwendung der cDNA
als Template mit dem Verfahren des Taqman Assays (”Taqman® Gene Expression Assays”,
hergestellt von Applied Biosystems, Inc.) getestet.
-
Anschließend
wurden die Expressionsniveaus von alkalischer Phosphatase, Typ-II-Collagen,
Knorpelproteoglycan (Aglycan), Osteocalcin und GAPDH unter Verwendung
eines Echtzeit-PCR-Geräts (”PRISM 7900HT”,
hergestellt von Applied Biosystems, Inc.) gemessen. Spezifisch wurde
eine Echtzeit-PCR-Reaktionslösung (enthaltend 25 μl
2 × TaqMan Universal PCR Master Mix, 2,5 μ 20 × Taqman® Gene Expression Assay Mix, 21,5 μl
RNase-freies Wasser und 1 Templat-cDNA) hergestellt und anschließend
in eine 96-Loch-Reaktionsplatte gegeben.
-
Nach
Erwärmen der Echtzeit-PCR-Reaktionslösung bei
50°C für 2 min und bei 95°C für
10 min wurde eine PCR über 40 Zyklen der Wärmebehandlung
durchgeführt, von denen jeder ein Erwärmen bei
95°C für 15 s und bei 60°C für
1 min beinhaltete. Nach Abschluss der PCR wurden das Festsetzen
der Grenzwerte und das Berechnen der Leistungszyklen unter Verwendung
der analytischen Software, die mit dem Gerät (”PRISM 7900HT”)
bereitgestellt wurde, durchgeführt.
-
Die
Expressionsniveaus jedes Zell-Markers wurden durch das Expressionsniveau
von GAPDH zur Berechnung von Korrekturwerten geteilt und anschließend
wurde ein mittleres Expressionsniveau durch Mittelung der Korrekturwerte
erhalten. Im Ergebnis exprimierten die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten alkalische Phosphatase, Typ-II-Collagen und Aglycan,
exprimierten jedoch kein Osteocalcin (siehe Tabelle I). (Tabelle I) Alkalische Phosphatase
| Niveau (Korrekturwert
mit GAPDH) Durchschnittswert |
Probe | 1 | 2 | 3 | gemittelt |
Gp1 | 0,0455 | 0,0490 | 0,0596 | 0,0514 |
Gp2 | 0,0656 | 0,0571 | 0,0650 | 0,0626 |
Typ-II-Collagen
| Niveau (Korrekturwert
mit GAPDH) Durchschnittswert |
Probe | 1 | 2 | 3 | gemittelt |
Gp1 | 0,2574 | 0,2576 | 0,2628 | 0,2593 |
Gp2 | 0,3724 | 0,4158 | 0,5251 | 0,4378 |
Aglycan
| Niveau (Korrekturwert
mit GAPDH) Durchschnittswert |
Probe | 1 | 2 | 3 | gemittelt |
Gp1 | 0,6254 | 0,6284 | 0,6227 | 0,6255 |
Gp2 | 0,9471 | 0,9735 | 1,0005 | 0,9737 |
Osteocalcin
| Niveau (Korrekturwert
mit GAPDH) Durchschnittswert |
Probe | 1 | 2 | 3 | gemittelt |
Gp1 | 0,0006 | 0,0007 | 0,0005 | 0,0006 |
Gp2 | 0,0065 | 0,0062 | 0,0087 | 0,0071 |
- Gp1 und Gp2: Pellets von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten, 1 Woche kultiviert.
-
Es
wurde bestätigt, dass jeweils Typ-X-Collagen, Typ-I-Collagen,
Matrix-Gla-Protein, Pleiotrophin, Decorin und Biglycan ebenfalls
auf die gleiche Art und Weise wie dieses Beispiel exprimiert wurden.
-
(Lokalisierung von spezifischen Markern
für hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
-
Die
Kultur, die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise
erhalten wurde, wurde mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert,
mit einem primären Antikörper auf einen Chondrozyten-Marker
umgesetzt und anschließend mit einem sekundären
Antikörper nachgewiesen, der mit einem Enzym, wie Peroxidase,
alkalische Phosphatase oder Glucosidase, oder einem Fluoreszenzmarker,
wie FITC, PE, Texas-Rot, AMCA oder Rhodamin markiert ist.
-
Die
alkalische Phosphatase kann ferner durch Färben nachgewiesen
werden. Die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise
erhaltene Kultur wurde gefärbt, indem sie mit 60% Aceton/Citronensäure-Puffer
fixiert, mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend
in ein Gemisch aus First Violet B und Naphthol AS-MX bei Raumtemperatur
im Dunkeln für 30 min zur Umsetzung eingetaucht wurde.
-
Zur
Bestimmung, ob hypertrophierungsfähige Chondrozyten in
einer Zellsuspension vorlagen, in der die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten verdünnt vorlagen, wurde das folgende Experiment
durchgeführt. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
wurden auf Hydroxylapatit bei einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml geimpft und in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C für
eine Woche inkubiert. Diese Probe (mit Zellen geimpftes Hydroxylapatit)
wurde anschließend mit alkalischer Phosphatase und dann
mit Toluidinblau gefärbt.
-
Für
die alkalische Phosphatase-Färbung wurde die Probe durch
Eintauchen in 60% Aceton/Citronensäure-Puffer für
30 s fixiert, mit Wasser gespült und anschließend
mit alkalischer Phosphatase-Färbelösung (2 ml
0,25% Naphthol AS-MX alkalische Phosphatase (Sigma-Aldrich Corporation)
+ 48 ml 25% First Violet B Salzlösung (Sigma Aldrich Corporation)
bei Raumtemperatur in der Dunkelheit für 30 min inkubiert.
-
Für
die Toluidinblau-Färbung wurde die Probe mit Toluidinblau-Färbelösung
(”0,25% Toluidinblau-Lösung: pH 7,0”,
hergestellt von Wake Pure Chemical Industries Ltd.) bei Raumtemperatur
für 5 min. inkubiert. Mit der alkalischen Phosphatase-Färbung
zeigte die Probe rot gefleckte Färbungen (siehe 1A). Mit der Toluidinblau-Färbung wurden
die gleichen Bereiche der Probe blau gefärbt, wodurch das
Vorhandensein von Zellen angezeigt wurde (siehe 1B). Somit wurde beobachtet, dass auf dem Hydroxylapatit
vorhandene Zellen eine alkalische Phosphatase-Aktivität
aufweisen.
-
(Morphologische Bewertung der Fähigkeit
zur Hypertrophie in Chondrozyten)
-
Ein
HAM-F12-Medium, enthaltend 5 × 105 Zellen,
wurde zur Bildung eines Pellets aus den Zellen zentrifugiert. Das
Pellet (Zellpellet) wurde für eine vorbestimmte Zeitspanne kultiviert.
Die Zellgrößen vor und nach dem Kultivieren wurden
unter einem Mikroskop verglichen. Wurde eine signifikante Zunahme
der Größe festgestellt, wurden die Zellen als
hypertrophierungsfähig bestimmt.
-
(Ergebnisse)
-
Die
in Beispiel 1 erhaltenen Zellen exprimierten einen Chondrozyten-Marker
und wurden als morphologisch hypertroph bestimmt. Das zeigt, dass
die in Beispiel 1 erhaltenen Zellen hypertrophierungsfähige Chondrozyten
waren. Diese Zellen wurden in den folgenden Untersuchungen verwendet.
-
(Nachweis des Wirkstoffs, der von aus
Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde)
-
Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium
(enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales
Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat,
50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1
mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde
den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zur Herstellung
einer Zellsuspension bis zu einer Verdünnung mit einer
Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
-
Die
Zellsuspension wurde gleichmäßig auf eine Schale
(hergestellt von Becton, Dickinson and Company) geimpft, die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten wurden in einem 5% CO2 Inkubator
bei 37°C kultiviert und anschließend wurde ein Überstand (Kulturüberstand)
des Mediums über einen Zeitraum (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage,
14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung von partiellen Überständen
gesammelt.
-
(Untersuchungen, ob der gewonnene Überstand
die Fähigkeit der Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten
Zellen zu induzierten Osteoblasten aufweist)
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte
(hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte
von 1,25 × 104 Zellen/cm2 (d. h. 2,5 × 104 Zellen/Vertiefung)
geimpft.
-
Diese
Zellen können von ansässigen und ausländischen
Firmen bezogen werden, wie Sanko Junyaku Co., Ltd., Cosmo Bio Co.,
Ltd., Takara Bio Inc., Toyobo Co., Ltd., Summit Pharma Biomedical,
Stem Cell Sciences, Cambrex Corporation, Stem Cell Technologies,
Invitrogen Corporation und Osiris Therapeutic Inc. oder von Spendenorganisationen
(Gewebezellbanken), wie ansässige Organisationen (z. B.
Health Science Research Resources Bank; Cell Bank, RIKEN BioResource
Center; Cell Bank, National Institute of Health Sciences; Institute
of Development, und Aging, Cancer at Tohoku University), und ausländische
Organisationen (z. B. IIAM, ATCC), zusätzlich zu Dainippon
Sumitomo Pharma Co. Ltd.
-
18
h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand
und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
zur Gewinnung von Proben und einer Kontrollprobe kultiviert. Nach
72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität unter Verwendung
der folgenden Vorgehensweisen gemessen.
-
(Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität)
-
Zur
Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität wurden zu
100 μl jeder Probe mit Wirkstoff oder der Kontrollprobe
ohne Wirkstoff 50 μl 4 mg/ml p-Nitrophenylphosphatlösung
und 50 μl Alkalipuffer (”A9226”, hergestellt
von Sigma) zugegeben und anschließend wurde bei 37°C
für 15 min umgesetzt. Anschließend wurden der
Probe 50 μl 1 N NaOH zum Stoppen der Reaktion zugegeben
und ihre Extinktion (bei 405 nm) wurde gemessen. Danach wurden der
Probe 20 μl konzentrierte Salzsäure zugegeben
und ihre Extinktion (bei 405 nm) wurde gemessen.
-
Der
Unterschied dieser Extinktionen wurde als ”absoluter aktiver
Wert” (als ”absoluter Wert” in der Tabelle
angegeben) bezeichnet und wurde als Indikator für die alkalische
Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen verwendet.
In der 4 Wochen alten Gruppe wurden fünf Experimente durchgeführt, und
drei Versuche wurden pro Experiment durchgeführt. In der
8 Wochen alten Gruppe wurden drei Experimente durchgeführt,
und in dem ersten Experiment wurden zwei Versuche, in dem zweiten
Experiment zwei Versuche und in dem dritten Experiment ein Versuch
durchgeführt.
-
Der
absolute Wert jeder Probe, dividiert durch den absoluten Wert der
Kontrollprobe, dem nur das Medium zugegeben wurde, (d. h. absoluter
aktiver Wert der Kontrollprobe, der erhalten wurde, indem nur das
Medium den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde) wird in der vorliegenden
Beschreibung als ”relativer aktiver Wert” (in
der Tabelle als ”relativer Wert” angegeben) bezeichnet
und wurde als weiterer Indikator für die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen verwendet.
-
In
diesem Beispiel wurde der vorliegende Wirkstoff mit der Fähigkeit
zur Steigerung der alkalischen Phosphatase-Aktivität bestimmt,
wenn ein Wert der alkalischen Phosphatase-(ALP)-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen (Ganzzellen), die durch Zugabe des Überstands
mit dem vorliegenden Wirkstoff kultiviert wurden, um mehr als das
1,5-Fache des Wertes der Maus-C3H10T1/2-Zellen zunahm, die durch
Zugabe des Mediums ohne den vorliegenden Wirkstoff kultiviert wurden.
-
Für
den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität
unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde,
bei der 4 Wochen alten Rattengruppe: der relative aktive Wert erhöhte
sich auf das etwa 4,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 5,1-Fache
durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach
dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 5,4-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren
gesammelt wurde; und auf das etwa 4,9-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde.
-
Für
den vorstehenden gleichen Fall bei der 8 Wochen alten Rattengruppe:
der relative Wert der Aktivität erhöhte sich auf
etwa das 2,9-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 3,1-Fache
durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem
Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 3,8-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren
gesammelt wurde; und auf das etwa 4,2-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde (siehe obere Spalte
in Tabelle 1 und 2).
-
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
-
(Alkalische Phosphatase-Färbung)
-
(Zugabe von Überständen
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in
dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden)
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte
(hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte
von 1,25 × 104 Zellen/cm2 (d. h. 2,5 × 104 Zellen/Vertiefung)
und auf Hydroxylapatit bei einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml geimpft. 18 h nach dem Impfen
wurden der Platte und dem Hydroxylapatit 1 ml eines Überstands
(Kulturüberstand) des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten
kultiviert wurden, zugegeben und anschließend wurden die
Zellen in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
zur Gewinnung von Kulturen (Zellkulturen) kultiviert.
-
Die
Kulturen wurden gefärbt, indem sie mit 60% Aceton/Citronensäure-Puffer
fixiert, mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend
in ein Gemisch aus First Violet B und Naphthol AS-MX bei Raumtemperatur
im Dunkeln für 30 min eingetaucht wurden.
-
(Zugabe von Überständen
eines MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden)
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte
(hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte
von 1,25 × 104 Zellen/cm2 (d. h. 2,5 × 104 Zellen/Vertiefung)
und auf Hydroxylapatit bei einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml geimpft. 18 h nach dem Impfen
wurden der Platte und dem Hydroxylapatit 1 ml eines Überstands
(Kulturüberstand) des MEM-Wachstumsmediums (enthaltend
essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin,
0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B),
in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert
wurden, zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
zur Gewinnung von Kulturen (Zellkulturen) kultiviert.
-
Die
Kulturen wurden gefärbt, indem sie mit 60% Aceton/Citronensäure-Puffer
fixiert, mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend
in ein Gemisch aus First Violet B und Naphthol AS-MX bei Raumtemperatur
im Dunkeln für 30 min eingetaucht wurden.
-
Wie
vorstehend beschrieben ist, wurde gezeigt, dass die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität,
die eine von den induzierten Osteoblasten-Markern ist, der Maus-C3H10T1/2-Zellen
von dem Wirkstoff gesteigert wird, der die Differenzierung zu induzierten
Osteoblasten induzieren kann. Außerdem wurde ebenfalls
gezeigt, dass die Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des zur
Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten fähigen
Wirkstoffs kultiviert wurden, bei der alkalischen Phosphatase-Färbung
rot gefärbt wurden.
-
Somit
wurde die Expression der alkalischen Phosphatase unter Verwendung
des Färbeverfahrens ebenfalls angezeigt. Folglich wurde
bestätigt, dass die Maus-C3H10T1/2-Zellen zu den induzierten
Osteoblasten differenziert wurden (siehe obere Spalte in Tabelle
1, 2, obere Spalte in 3A und 3B).
-
Außerdem
wurde ein Pellet der differenzierten Zellen auf die gleiche Art
und Weise hergestellt, wie vorstehend beschrieben, und anschließend
mit saurem Toluidinblau und Safranin O angefärbt. Im Ergebnis
zeigte sich keine Metachromasie und die Safranin-Färbung
war negativ. Somit wurde bestätigt, dass diese differenzierten
Zellen keine Chondrozyten waren. Damit konnte bestätigt
werden, dass die differenzierten Zellen nicht die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten waren.
-
(Vergleichsbeispiel 1A: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costa/costal-Knorpel
gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in MEM-Wachstumsmedium
hergestellt wurde)
-
Aus
Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium
(MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und
0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von
4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage,
21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte
(hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte
von 1,25 × 104 Zellen/cm2 (d. h. 2,5 × 104 Zellen/Vertiefung)
geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand
und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Für
den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität
unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden,
auf ”1” festgelegt wurde, bei der 4 Wochen alten
Rattengruppe: der relative aktive Wert erhöhte sich auf
das etwa 1,0-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 1,3-Fache
durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach
dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des
partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren
gesammelt wurde; und auf das etwa 1,0-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde.
-
Für
den vorstehenden gleichen Fall bei der 8 Wochen alten Rattengruppe:
der relative Wert der Aktivität erhöhte sich auf
etwa das 1,2-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 1,0-Fache
durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem
Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 1,0-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren
gesammelt wurde; und auf das etwa 0,9-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde (siehe untere
Spalte in Tabelle 1 und 2).
-
In
jeder der 4 und 8 Wochen alten Ratten-Gruppen gab es einen geringfügigen
Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands
des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden (Zellkultur), und dem Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe
des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden.
-
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
-
(Alkalische Phosphatase-Färbung)
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
wurden in eine 24-Well-Platte und Hydroxylapatit (in einem BME-Medium) geimpft
und für 18 h zur Gewinnung von Kulturen (Zellkulturen)
kultiviert. Anschließend wurde ein Überstand (Kulturüberstand)
eines MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden, den Kulturen zugegeben und nach
72 h wurde die alkalische Phosphatase-Färbung durchgeführt.
Es wurde bestätigt, dass die durch Zugabe des Überstands
kultivierten Maus-C3H10T1/2-Zellen mit der alkalischen Phosphatase-Färbung
nicht gefärbt wurden und somit keine alkalische Phosphatase-Aktivität
aufwiesen (siehe untere Spalte in 3A und 3D).
-
(Tabelle 1: alkalische Phosphatase-Aktivität
bei Zugabe eines Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums oder MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden)
-
Differenzierungswirkstoff erzeugendes
MEM-Medium (Mittelwert)
| | 0
Tage | 4
Tage | 1
Woche | 2
Wochen | 3
Wochen |
4 Wochen alt | Relativer
Wert | 1 | 4,1 | 5,1 | 5,4 | 4,9 |
Absoluter
Wert (Zugabe von Überstand) | | 0,077 | 0,098 | 0,103 | 0,095 |
Absoluter
Wert (nur Zugabe von Medium) | 0,023 | 0,023 | 0,024 | 0,023 | 0,021 |
8 Wochen alt | Relativer
Wert | 1 | 2,9 | 3,1 | 3,8 | 4,2 |
Absoluter
Wert (Zugabe von Überstand) | | 0,065 | 0,066 | 0,077 | 0,079 |
Absoluter
Wert (nur Zugabe von Medium) | 0,021 | 0,021 | 0,021 | 0,019 | 0,019 |
MEM-Wachstumsmedium (Mittelwert)
| | 0
Tage | 4
Tage | 1
Woche | 2
Wochen | 3
Wochen |
4 Wochen alt | Relativer
Wert | 1 | 1,0 | 1,3 | 1,1 | 1,0 |
Absoluter
Wert (Zugabe von Überstand) | | 0,020 | 0,023 | 0,027 | 0,024 |
Absoluter
Wert (nur Zugabe von Medium) | 0,022 | 0,022 | 0,020 | 0,024 | 0,024 |
8 Wochen alt | Relativer
Wert | 1 | 1,2 | 1,0 | 1,0 | 0,9 |
Absoluter
Wert (Zugabe von Überstand) | | 0,023 | 0,021 | 0,019 | 0,017 |
Absoluter
Wert (nur Zugabe von Medium) | 0,020 | 0,020 | 0,021 | 0,019 | 0,019 |
- 4 Wochen alt: fünf Experimente
wurden durchgeführt, und 3 Versuche wurden pro Experiment
durchgeführt.
- 8 Wochen alt: drei Experimente wurden durchgeführt.
In dem ersten Experiment wurden zwei Versuche, in dem zweiten Experiment
zwei Versuche und in dem dritten Experiment ein Versuch durchgeführt.
-
Auf
die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 kann bestätigt
werden, ob ein Überstand (Kulturüberstand) eines
MEM-Wachstumsmediums, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende
hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden,
die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise
erhalten wurden, Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen
exprimiert.
-
(Schlussfolgerung aus Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel
1A)
-
Wenn
hypertrophierungsfähige Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium kultiviert wurden, wurde bestätigt,
dass in dem Überstand des Mediums (Kulturüberstand)
der Wirkstoff vorhanden war, der die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die undifferenzierte Zellen waren, steigern
und die Differenzierung der Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann. Wenn andererseits die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
in dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt,
dass in dem Überstand des Mediums kein Wirkstoff vorhanden
war.
-
Somit
wurde festgestellt, dass die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
einen Wirkstoff erzeugten, der die Differenzierung von undifferenzierten
Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, indem sie in dem
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert
wurden. Ein solcher Wirkstoff war bisher unbekannt. Daher wird angenommen,
dass die Existenz des Wirkstoffs selbst überraschend ist.
Außerdem weist das bisher bekannte BMP die Wirkung der
direkten Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen
zu induzierten Osteoblasten nicht auf, wie in anderen Teilen beschrieben.
-
(Vergleichsbeispiel 1B: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel gewonnenen
ruhenden Knorpelzellen in dem Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Medium hergestellt wurde)
-
(Herstellung von ruhenden Knorpelzellen
aus Costal-Knorpel)
-
4
Wochen alte männliche Ratten (Wistar) und 8 Wochen alte
männliche Ratten (Wistar) wurden unter Verwendung von Chloroform
getötet. Der Brustkorb der Ratten wurde unter Verwendung
eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen Körper wurden
zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung (10-fach verdünnt)
eingetaucht. Der Brustkorb der Ratten wurde eingeschnitten und die
Costa/costal-Knorpel aseptisch entnommen. Durchsichtige ruhende
Knorpel Regionen wurden aus dem Costal-Knorpel entnommen.
-
Der
ruhende Knorpel wurde zerschnitten und in 0,25% Trypsin-EDTA/D-PBS
(Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung nach Dulbecco) bei
37°C für 1 Stunde gerührt. Die Schnitte
wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g
für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen
mit 0,2% Collagenase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/D-PBS
bei 37°C für 2,5 h gerührt. Die Schnitte
wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g
für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen
mit 0,2% Dispase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/(HAM +
10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei 37°C
gerührt. Wahlweise wurde die Behandlung 0,2% Dispase über
Nacht weggelassen. Am folgenden Tag wurden die Zellen filtriert
und durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min)
gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und
ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
-
Die
Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden,
wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt
wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
-
(Identifizierung von aus Costal-Knorpel
stammenden nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten)
-
Es
wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 bestimmt,
ob hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einer Zellsuspension
vorhanden waren, die durch Verdünnen von aus Costal-Knorpel
stammenden ruhenden Knorpelzellen erhalten wurde. Hydroxylapatit
wurde mit der alkalischen Phosphatase-Färbung nicht gefärbt
(siehe 1C). Gefleckte Bereiche des
Hydroxylapatits wurden mit der Toluidinblau-Färbung blau
gefärbt, wodurch das Vorhandensein von Zellen angezeigt
wurde (siehe 1D).
-
Somit
wurde bestätigt, dass die auf dem Hydroxylapatit vorhandenen
Zellen keine alkalische Phosphatase-Aktivität aufweisen,
was zeigt, dass nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten
(Chondrozyten ohne die Fähigkeit zur Hypertrophie) in der
Zellsuspension vorhanden waren, die in diesem Vergleichsbeispiel
verwendet wurde.
-
(Identifizierung der Expression eines
Marker-Gens für hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
-
In
diesem Vergleichsbeispiel wurden die Expressionsniveaus von alkalischer
Phosphatase, Typ-II-Collagen, Aglycan und Osteocalcin unter Verwendung
eines Echtzeit-PCR-Verfahrens auf die gleiche Art und Weise wie
in Beispiel 1 gemessen. GAPDH wurde als integrales Kontroll-Gen
verwendet.
-
Proben
(Rp1 und Rp2) wurden durch Zentrifugation von 5 × 105 nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten, die in diesem Vergleichsbeispiel hergestellt wurden,
bei 170 bis 200 × g für 3 bis 5 min unter Bildung von
Pellets hergestellt und anschließend wurden die Pellets
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
für 1 Woche kultiviert und verwendet. Als Medium wurde
HAM-Medium + 10% FBS oder HEM-Medium + 15% FBS verwendet.
-
Eine
Echtzeit-PCR wurde durchgeführt und die Expressionsniveaus
von jedem Zell-Marker wurde unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Geräts
(”PRISM 7900HT”, hergestellt von Applied Biosystems,
Inc.) auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Nach Abschluss der PCR wurden das Festsetzen der Grenzwerte und
das Berechnen der unter Verwendung der analytischen Software, die
mit dem Gerät (”PRISM 7900HT”) bereitgestellt
wurde, durchgeführt.
-
Die
Expressionsniveaus jedes Zell-Markers wurden durch das Expressionsniveau
von GAPDH zur Berechnung von Korrekturwerten geteilt und anschließend
wurde ein mittleres Expressionsniveau durch Mittelung der Korrekturwerte
erhalten. Im Ergebnis exprimierten die nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten Typ-II-Collagen und Aglycan, exprimierten jedoch keine
alkalische Phosphatase und kein Osteocalcin (siehe Tabelle II).
-
(Tabelle II)
-
Alkalische Phosphatase
| Niveau (Korrekturwert
mit GAPDH) Durchschnittswert |
Probe | 1 | 2 | 3 | gemittelt |
Rp1 | 0,0002 | 0,0003 | 0,0003 | 0,0002 |
Rp2 | 0,0001 | 0,0001 | 0,0001 | 0,0001 |
Typ-II-Collagen
| Niveau (Korrekturwert
mit GAPDH) Durchschnittswert |
Probe | 1 | 2 | 3 | gemittelt |
Rp1 | 0,3448 | 0,4111 | 0,4168 | 0,3909 |
Rp2 | 0,2838 | 0,2762 | 0,2877 | 0,2826 |
Aglycan
| Niveau (Korrekturwert
mit GAPDH) Durchschnittswert |
Probe | 1 | 2 | 3 | gemittelt |
Rp1 | 1,0586 | 1,1427 | 1,1478 | 1,1164 |
Rp2 | 1,0437 | 0,8835 | 0,9133 | 0,9468 |
Osteocalcin
| Niveau (Korrekturwert
mit GAPDH) Durchschnittswert |
Probe | 1 | 2 | 3 | gemittelt |
Rp1 | 0,0001 | 0,0001 | 0,0002 | 0,0001 |
Rp2 | 0,0000 | 0,0000 | 0,0000 | 0,0000 |
- Rp1 und Rp2: Pellets von nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten, 1 Woche kultiviert.
-
Durch
Nachweis der Lokalisierung oder Expression der Chondrozyten-Marker
mit dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 und der morphologischen
Bewertung der Zellen wurde bestimmt, dass die erhaltenen Zellen
nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten waren.
-
(Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren
von aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt
wurde)
-
Ein
den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend
essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum),
10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml
Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin
und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den aus Costal-Knorpel
gewonnenen ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung
mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden
kultiviert und anschließend wurde ein Überstand
des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage,
18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach
dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und
das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Für
den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität
unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde:
der relative aktive Wert betrug das etwa 0,9-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren
gesammelt wurde; das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,0-Fache
durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach
dem Kultivieren gesammelt wurde; und das etwa 1,1-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren
gesammelt wurde (siehe obere Spalte in Tabelle 2 und 4).
-
Es
gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die ruhenden Knorpelzellen
(Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden.
-
Mit
dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel
1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des
Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Vorgehensweise erhalten wurde, die induzierten Osteoblasten-Marker
in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
-
(Vergleichsbeispiel 1C: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel gewonnenen
ruhenden Knorpelzellen in MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
-
Aus
Costal-Knorpel stammende ruhende Knorpelzellen wurden auf die gleiche
Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 1B erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium
(enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml
Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin
B) wurde den ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung
mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden
kultiviert und anschließend wurde ein Überstand
des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage,
18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte
geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand
und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Für
den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität
unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden,
auf ”1” festgelegt wurde: der relative aktive
Wert betrug das etwa 1,0-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,0-Fache
durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach
dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 0,9-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren
gesammelt wurde; und das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde (siehe untere
Spalte in Tabelle 2 und 4).
-
Es
gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums
kultiviert wurden, in dem die ruhenden Knorpelzellen (Zellkultur)
kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert
wurden (siehe untere Spalte in Tabelle 2 und 4).
-
Mit
dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel
1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des
Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Vorgehensweise erhalten wurde, die induzierten Osteoblasten-Marker
in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
-
(Tabelle 2: alkalische Phosphatase-Aktivität
bei Zugabe eines Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums oder MEM-Wachstumsmediums, in dem aus Costal-Knorpel
stammende ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden)
-
Differenzierungswirkstoff erzeugendes
MEM-Medium (Mittelwert)
| | 0
Tage | 4
Tage | 1
Woche | 2
Wochen | 3
Wochen |
8
Wochen | Relativer
Wert | 1 | 0,9 | 1,1 | 1,0 | 1,1 |
alt | Absoluter
Wert (Zugabe von Überstand) | | 0,014 | 0,015 | 0,015 | 0,014 |
| Absoluter
Wert (nur Zugabe von Medium) | 0,015 | 0,015 | 0,014 | 0,014 | 0,014 |
MEM-Wachstumsmedium (Mittelwert)
| | 0 Tage | 4 Tage | 1 Woche | 2 Wochen | 3 Wochen |
8
Wochen alt | Relativer Wert | 1 | 1,0 | 1,0 | 0,9 | 1,1 |
Absoluter Wert (Zugabe von Überstand) | | 0,014 | 0,012 | 0,012 | 0,012 |
Absoluter Wert (nur Zugabe
von Medium) | 0,013 | 0,013 | 0,012 | 0,011 | 0,011 |
- 8 Wochen alt: drei Experimente wurden durchgeführt.
In dem ersten Experiment wurden drei Versuche, in dem zweiten Experiment
ein Versuch und in dem dritten Experiment drei Versuche durchgeführt.
-
(Schlussfolgerung aus Vergleichsbeispiel
1B und Vergleichsbeispiel 1C)
-
Sogar
wenn die aus Costal-Knorpel gewonnenen nicht-hypertrophierungsfähigen
ruhenden Knorpelzellen in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Medium oder MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt,
dass sie keinen Wirkstoff erzeugten, der die Differenzierung von
undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann.
-
(Vergleichsbeispiel 1D: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Gelenkknorpel gewonnenen
Chondrozyten in den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
hergestellt wurde)
-
(Herstellung von Chondrozyten aus Gelenkknorpel)
-
8
Wochen alte männlichen Ratten (Wistar) wurden unter Verwendung
von Chloroform getötet. Die Kniegelenke der Ratten wurden
unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen
Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung
(10-fach verdünnt) eingetaucht. Die Kniegelenke der Ratten
wurden eingeschnitten und die Gelenkknorpel aseptisch entnommen.
-
Die
Gelenkknorpel wurden zerschnitten und in 0,25% Trypsin-EDTA/D-PBS
bei 37°C für 1 Stunde gerührt. Die Schnitte
wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g
für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen
mit 0,2% Collagenase/D-PBS bei 37°C für 2,5 h
gerührt. Die Schnitte wurden anschließend durch
Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen
und anschließend zusammen mit 0,2% Dispase/(HAM + 10% FBS)
in einem Rührkolben über Nacht bei 37°C
gerührt.
-
Wahlweise
wurde die Behandlung 0,2% Dispase über Nacht weggelassen.
Am folgenden Tag wurden die Zellen filtriert und durch Zentrifugation
(bei 170 × g für 3 min) gewaschen. Die Zellen
wurden mit Trypanblau gefärbt und ihre Anzahl wurde unter
einem Mikroskop gezählt.
-
Die
Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden,
wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt
wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
-
(Identifizierung von aus Gelenkknorpel
stammenden nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten)
-
Es
wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 bestimmt,
ob hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einer Zellsuspension
vorhanden waren, die durch Verdünnen von aus Gelenkknorpel
stammenden Chondrozyten erhalten wurde. Hydroxylapatit wurde mit
der alkalischen Phosphatase-Färbung nicht gefärbt (siehe 1E). Gefleckte Bereiche des Hydroxylapatits wurden
mit der Toluidinblau-Färbung blau gefärbt, wodurch
das Vorhandensein von Zellen angezeigt wurde (siehe 1F).
-
Somit
wurde bestätigt, dass die auf dem Hydroxylapatit vorhandenen
Zellen keine alkalische Phosphatase-Aktivität aufweisen,
was zeigt, dass nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten
in der Zellsuspension vorhanden waren, die in diesem Vergleichsbeispiel
verwendet wurde.
-
Durch
Nachweis der Lokalisierung oder Expression der Chondrozyten-Marker
mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel
1 und der morphologischen Bewertung der Zellen wurde bestimmt, dass
die erhaltenen Zellen nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten
waren.
-
(Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren
von aus Gelenkknorpel gewonnenen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
-
Ein
den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend
essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum),
10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml
Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin
und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den aus Gelenkknorpel
stammenden Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer
Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben. Die Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage,
21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach
dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und
das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Für
den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität
unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde:
der relative aktive Wert betrug das etwa 1,4-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren
gesammelt wurde; das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,1-Fache
durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach
dem Kultivieren gesammelt wurde; und das etwa 1,1-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren
gesammelt wurde (siehe obere Spalte in Tabelle 3 und 5A).
-
Es
gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die Chondrozyten
(Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden.
-
Mit
dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel
1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des
Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Vorgehensweise erhalten wurde, die induzierten Osteoblasten-Marker
in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
-
(Vergleichsbeispiel 1E: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Gelenkknorpel gewonnenen
Chondrozyten in MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
-
Aus
Gelenkknorpel gewonnene Chondrozyten wurden auf die gleiche Art
und Weise wie in Vergleichsbeispiel 1D erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium
(enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml
Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin
B) wurde den Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer
Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben. Die Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
(Kulturüberstand) in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage,
11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach
dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und
das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Für
den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität
unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden,
auf ”1” festgelegt wurde: der relative aktive
Wert betrug das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,0-Fache
durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach
dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,1-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren
gesammelt wurde; und das etwa 1,2-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde (siehe untere
Spalte in Tabelle 3 und 5A).
-
Es
gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in
dem die aus Gelenkknorpel stammenden Chondrozyten kultiviert wurden,
und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der
Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert
wurden (siehe untere Spalte in Tabelle 3 und 5A).
-
Mit
dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel
1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des
Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Vorgehensweise erhalten wurde, die induzierten Osteoblasten-Marker
in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
-
(Tabelle 3: alkalische Phosphatase-Aktivität
bei Zugabe eines Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums oder MEM-Wachstumsmediums, in dem aus Gelenkknorpel
stammende Chondrozyten kultiviert wurden)
-
Differenzierungswirkstoff erzeugendes
MEM-Medium (Mittelwert)
| | 0
Tage | 4
Tage | 1
Woche | 2
Wochen | 3
Wochen |
8 Wochen alt | Relativer
Wert | 1 | 1,4 | 1,1 | 1,1 | 1,1 |
Absoluter
Wert (Zugabe von Überstand) | | 0,020 | 0,019 | 0,019 | 0,020 |
Absoluter
Wert (nur Zugabe von Medium) | 0,016 | 0,016 | 0,017 | 0,016 | 0,017 |
- 8 Wochen alt: sechs Experimente wurden
durchgeführt. In dem ersten Experiment wurde ein Versuch,
in dem zweiten Experiment ein Versuch, in dem dritten Experiment drei
Versuche, in dem vierten Experiment zwei Versuche, in dem fünften
Experiment ein Versuch und in dem sechsten Experiment ein Versuch
durchgeführt.
MEM-Wachstumsmedium (Mittelwert) | | 0
Tage | 4
Tage | 1
Woche | 2
Wochen | 3
Wochen |
8 Wochen alt | Relativer
Wert | 1 | 1,1 | 1,0 | 1,1 | 1,2 |
Absoluter
Wert (Zugabe von Überstand) | | 0,019 | 0,017 | 0,017 | 0,019 |
Absoluter
Wert (nur Zugabe von Medium) | 0,018 | 0,018 | 0,018 | 0,014 | 0,017 |
- 8 Wochen alt: fünf Experimente
wurden durchgeführt. In dem ersten Experiment wurden zwei
Versuche, in dem zweiten Experiment zwei Versuche, in dem dritten
Experiment drei Versuche, in dem vierten Experiment ein Versuch
und in dem fünften Experiment ein Versuch durchgeführt.
-
(Schlussfolgerung aus Vergleichsbeispiel
1D und Vergleichsbeispiel 1E)
-
Sogar
wenn die aus Gelenkknorpel gewonnenen nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
oder MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt,
dass sie keinen Wirkstoff erzeugten, der die Differenzierung von
undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann.
-
(Beispiel 2: Herstellung und Nachweis
des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren
von aus Sternum-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
hergestellt wurde)
-
(Herstellung von hypertrophierungsfähige
Chondrozyten aus Sternum-Knorpel)
-
8
Wochen alte männliche Ratten (Wistar) wurden unter Verwendung
von Chloroform getötet. Der Brustkorb der Ratten wurde
unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen
Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung
(10-fach verdünnt) eingetaucht. Der Brustkorb der Ratten
wurde eingeschnitten und untere Abschnitte von Sternum-Knorpel und
Schwertfortsatz wurden aseptisch entnommen. Die durchscheinende
Wachstumsknorpelregion wurde aus den unteren Abschnitten von Sternum-Knorpel
und Schwertfortsatz gewonnen.
-
Der
Wachstumsknorpel wurde zerschnitten und in 0,25% Trypsin-EDTA/Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung nach Dulbecco (D-PBS) bei 37°C
für 1 Stunde gerührt. Die Schnitte wurden anschließend
durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen
und anschließend zusammen mit 0,2% Collagenase (hergestellt
von Invitrogen Corporation)/D-PBS bei 37°C für
2,5 h gerührt. Die Schnitte wurden anschließend
durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen
und anschließend zusammen mit 0,2% Dispase (hergestellt von
Invitrogen Corporation)/(HAM + 10% FBS) in einem Rührkolben über
Nacht bei 37°C gerührt. Wahlweise wurde die Behandlung
0,2% Dispase über Nacht weggelassen. Am folgenden Tag wurden
die Zellen filtriert und durch Zentrifugation (bei 170 × g
für 3 min) gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau
gefärbt und ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
-
Die
Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden,
wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt
wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
-
(Identifizierung von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten)
-
Es
wurde mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie
in Beispiel 1 bestimmt, ob die gewonnenen Zellen hypertrophierungsfähige
Chondrozyten sind.
-
(Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren
von aus Sternum-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
hergestellt wurde)
-
Ein
den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend
essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum),
10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml
Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin
und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den aus Sternum-Knorpel
stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu
einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21
Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach
dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und
das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Der
Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität von Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden (Zellkultur), steigt im Vergleich
zu dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen,
die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums kultiviert wurden.
-
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
-
Mit
dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel
1 wurde bestätigt, dass der Überstand des Mediums
(Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Vorgehensweise erhalten wurde, die induzierten Osteoblasten-Marker
in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
-
(Vergleichsbeispiel 2: Herstellung des
Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Sternum-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
-
Aus
Sternum-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten
wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 2 erhalten.
Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM),
15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml
Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
(Kulturüberstand) in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach
dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und
das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Es
gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums
kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe
des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden.
-
Mit
dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel
1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des
Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Vorgehensweise erhalten wurde, die induzierten Osteoblasten-Marker
in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
-
(Schlussfolgerung aus Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel
2)
-
Wenn
der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, steigt, wurde bestimmt, dass in
dem Überstand der Wirkstoff vorhanden ist, der die Differenzierung
zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
-
Wenn
andererseits der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands
des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, nicht steigt, wurde bestimmt, dass
in dem Überstand kein Wirkstoff vorhanden ist, der die
Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
-
In
diesem Fall wurde bestimmt, dass die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten, die in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Medium kultiviert wurden, den Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung
von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann.
-
(Beispiel 3: Herstellung und Nachweis
des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren
von aus Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Medium
hergestellt wurde)
-
(Nachweis des Wirkstoffs, der von aus
Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde)
-
Aus
Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes HAM-Medium
(enthaltend HAM-Medium, 10% FBS (fötales Rinderserum),
10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml
Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin
und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von
4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
(Kulturüberstand) in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage,
11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach
dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und
das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Für
den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität
unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
HAM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde:
der relative aktive Wert betrug das etwa 1,2-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren
gesammelt wurde; das etwa 2,3-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 3,1-Fache
durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach
dem Kultivieren gesammelt wurde; und das etwa 2,2-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren
gesammelt wurde (siehe obere Spalte in Tabelle 3-2 und 5B).
-
Es
wurde gezeigt, dass die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität,
die eine von den induzierten Osteoblasten-Markern ist, der Maus-C3H10T1/2-Zellen
von dem Wirkstoff gesteigert wird, der die Differenzierung zu induzierten
Osteoblasten induzieren kann (siehe Tabelle 3-2 und 5B). Außerdem wurde die Expression der
alkalischen Phosphatase unter Verwendung der alkalischen Phosphatase-Färbung
ebenfalls angezeigt. Folglich wurde bestätigt, dass die
Maus-C3H10T1/2-Zellen zu den induzierten Osteoblasten differenziert
wurden.
-
(Tabelle 3-2: alkalische Phosphatase-Aktivität
bei Zugabe eines Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
HAM-Mediums oder HAM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden)
-
Differenzierungswirkstoff erzeugendes
HAM-Medium (Mittelwert)
| 0
Tage | 4
Tage | 1
Woche | 2
Wochen | 3
Wochen |
Relativer
Wert | 1 | 1,2 | 2,3 | 3,1 | 2,2 |
Absoluter
Wert (Zugabe von Überstand) | 0,015 | 0,018 | 0,033 | 0,047 | 0,037 |
Absoluter
Wert (nur Zugabe von Medium) | 0,015 | | 0,014 | 0,015 | 0,017 |
-
Drei
Experimente wurden durchgeführt. Drei Versuche wurden pro
Experiment durchgeführt. HAM-Wachstumsmedium (Mittelwert)
| 0
Tage | 4
Tage | 1
Woche | 2
Wochen | 3
Wochen |
Relativer
Wert | 1 | 1,0 | 0,9 | 1,2 | 1,2 |
Absoluter
Wert (Zugabe von Überstand) | 0,026 | 0,025 | 0,023 | 0,020 | 0,024 |
Absoluter
Wert (nur Zugabe von Medium) | 0,026 | | 0,024 | 0,021 | 0,023 |
-
Fünf
Experimente wurden durchgeführt. In dem ersten Experiment
wurden drei Versuche, in dem zweiten Experiment drei Versuche, in
dem dritten Experiment drei Versuche, in dem vierten Experiment
drei Versuche und in dem fünften Experiment zwei Versuche
durchgeführt.
-
(Vergleichsbeispiel 3A: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costa/costal-Knorpel
gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in HAM-Wachstumsmedium
hergestellt wurde)
-
Aus
Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 erhalten. Ein HAM-Wachstumsmedium (enthaltend HAM-Medium, 10%
FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml
Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach
dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und
das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Für
den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität
unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des HAM-Wachstumsmediums kultiviert wurden,
auf ”1” festgelegt wurde: der relative aktive
Wert betrug das etwa 1,0-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 0,9-Fache
durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach
dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,2-Fache durch Zugabe
des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren
gesammelt wurde; und das etwa 1,2-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands,
der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde (siehe untere
Spalte in Tabelle 3-2 und 5C).
-
Es
gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums
kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe
des HAM-Wachstumsmediums kultiviert wurden (siehe untere Spalte
in Tabelle 3-2 und 5C).
-
Es
wurde bestätigt, dass der Überstand der Mediums
(Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Vorgehensweise erhalten wurde, keine induzierte Osteoblasten-Marker
in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimierte.
-
(Schlussfolgerung aus Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel
3A)
-
Wenn
hypertrophierungsfähige Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden HAM-Medium kultiviert wurden, wurde bestätigt,
dass in dem Überstand des Mediums der Wirkstoff vorhanden war,
der die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die undifferenzierte Zellen waren, steigern und die Differenzierung
der Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
-
Wenn
andererseits die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
in dem HAM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt,
dass in dem Überstand des Mediums kein Wirkstoff vorhanden
war. Somit wurde festgestellt, dass die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten, die in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
HAM-Medium kultiviert wurden, den Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung
von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann.
-
(Vergleichsbeispiel 3B: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel gewonnenen
ruhenden Knorpelzellen in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
HAM-Medium hergestellt wurde)
-
Aus
Costal-Knorpel stammende ruhende Knorpelzellen wurden auf die gleiche
Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 1B erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff
erzeugendes HAM-Medium (enthaltend HAM-Medium, 10% FBS (fötales
Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat,
50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1
mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde
den ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung mit
einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden
kultiviert und anschließend wurde ein Überstand
des Mediums in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte
geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand
zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Wenn
die beiden nachstehend beschriebenen Bedingungen erfüllt
waren, wurde bestimmt, dass die Maus-C3H10T1/2-Zellen nicht zu induzierten
Osteoblasten differenziert wurden. Erstens gab es nämlich
einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums kultiviert
wurden, in dem die ruhenden Knorpelzellen (Zellkultur) kultiviert
wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der
Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
HAM-Mediums oder des HAM-Wachstumsmediums kultiviert wurden. Zweitens
exprimiert der Überstand des Mediums (Zellkultur), der unter
Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten
wurde, nicht die induzierten Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen.
-
In
diesem Fall wurde bestimmt, dass die aus Costal-Knorpel stammenden
ruhenden Knorpelzellen, die in dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden HAM-Medium kultiviert wurden, keinen Wirkstoff erzeugen, der
die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten
Osteoblasten induzieren kann.
-
(Vergleichsbeispiel 3C: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel gewonnenen
ruhenden Knorpelzellen in dem HAM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
-
Aus
Costal-Knorpel stammende ruhende Knorpelzellen wurden auf die gleiche
Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 1B erhalten. Ein HAM-Wachstumsmedium
(enthaltend HAM-Medium, 10% FBS (fötales Rinderserum),
100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml
Amphotericin B) wurde den ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung
mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden
kultiviert und anschließend wurde ein Überstand
des Mediums in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte
geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand
zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Wenn
die beiden nachstehend beschriebenen Bedingungen erfüllt
waren, wurde bestimmt, dass die Maus-C3H10T1/2-Zellen nicht zu induzierten
Osteoblasten differenziert wurden. Erstens gab es nämlich
einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands
des HAM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die ruhenden
Knorpelzellen (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums oder des
HAM-Wachstumsmediums kultiviert wurden. Zweitens exprimiert der Überstand
des Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Vorgehensweise erhalten wurde, nicht die induzierten Osteoblasten-Marker
in den Maus-C3H10T1/2-Zellen.
-
In
diesem Fall wurde bestimmt, dass die aus Costal-Knorpel stammenden
ruhenden Knorpelzellen, die in dem HAM-Wachstumsmedium kultiviert
wurden, keinen Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten
Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
-
(Schlussfolgerung aus Beispiel 1, Beispiel
3, Vergleichsbeispielen 1A bis 1E und 3A bis 3C)
-
Gemäß den
vorstehend beschriebenen Beispielen erzeugen die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten, die in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Medium kultiviert wurden, den Wirkstoff, der die Differenzierung
von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann, unabhängig von der Art des in dem Medium enthaltenen
Basismediums. Selbst wenn die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in einem beliebigen Wachstumsmedium kultiviert wurden,
erzeugen sie nicht den Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten
Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
-
Selbst
wenn nicht-hypertrophierungsfähige ruhende Knorpelzellen
und nicht-hypertrophierungsfähige Gelenkknorpelzellen in
einem beliebigen Medium kultiviert wurden, erzeugen sie nicht den
Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen
zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
-
Deshalb
wird vorgeschlagen, dass der Wirkstoff, der die Differenzierung
von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann, nur durch Kultivieren der hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium
erzeugt wird. Da außerdem das in dem Medium enthaltene
Basismedium die Erzeugung des die Differenzierung von induzierten
Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs unwahrscheinlich beeinträchtigt,
solange es in einer Zellkultur normal verwendet werden kann, wird angenommen,
dass ein beliebiges Basismedium in dem vorliegenden Verfahren verwendet
werden kann.
-
(Beispiel 4: Herstellung und Nachweis
des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren
von menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
in den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt
wurde)
-
(Nachweis des Wirkstoffs, der von menschlichen
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde)
-
Aus
menschlichen Geweben stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten (z. B. Polydactylie, Tumor, vorausgesetzt kartilaginäres
Gewebe) wurden von Spendenorganisationen für menschliches
Gewebe, wie ansässige Organisationen (z. B. Health Science
Research Resources Bank; Cell Bank, RIKEN BioResource Center; Cell
Bank, National Institute of Health Sciences; Institute of Development,
Aging and Cancer at Tohoku University), und ausländische
Organisationen (z. B. IIAM, ATCC), und Herstellungsfirmen für
Zellen, wie Osiris, bezogen.
-
Ein
den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend
essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum),
10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml
Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin
und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den erhaltenen hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von
4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Menschliche
mesenchymale Stammzellen für Prüfzwecke wurden
von den vorstehend beschriebenen Organisationen bezogen. Die menschlichen
mesenchymalen Stammzellen wurden gleichmäßig in
eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte
1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend
wurden die menschlichen mesenchymalen Stammzellen kultiviert. Nach
72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen
mesenchymalen Stammzellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Wenn
die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität, die eine von
den induzierten Osteoblasten-Markern ist, der menschlichen undifferenzierten
Zellen für Prüfzwecke von dem Wirkstoff gesteigert
wird, der die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann, wurde bestimmt, dass die undifferenzierten Zellen zu induzierten
Osteoblasten differenziert wurden. Wenn außerdem die Expression
der alkalischen Phosphatase mit der alkalischen Phosphatase-Färbung
nachgewiesen wurde, wurde ferner bestimmt, dass die undifferenzierten
Zellen zu den induzierten Osteoblasten differenziert wurden.
-
(Vergleichsbeispiel 4A: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von menschlichen
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in MEM-Wachstumsmedium
hergestellt wurde)
-
Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
4 erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium
(MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und
0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von
4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Menschliche
undifferenzierte Zellen für Prüfzwecke wurden
in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte
1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend
wurden die menschlichen undifferenzierten Zellen kultiviert. Nach
72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen
undifferenzierten Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Bei
Vorhandensein eines geringfügigen Unterschieds zwischen
dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der menschlichen
undifferenzierten Zellen, die durch Zugabe des Überstands
des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe
des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, wurde bestimmt, dass
die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten keinen Wirkstoff
erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu
induzierten Osteoblasten induzieren kann.
-
Wenn
menschliche hypertrophierungsfähige Chondrozyten in dem
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert
wurden, wird vorhergesagt, dass sie den Wirkstoff erzeugen, der
die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten
Osteoblasten induzieren kann. Wenn andererseits die menschlichen
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem MEM-Wachstumsmedium
kultiviert wurden, wird vorhergesagt, dass sie nicht den Wirkstoff
erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu
induzierten Osteoblasten induzieren kann.
-
(Vergleichsbeispiel 4B: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von menschlichen nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
oder MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
-
Menschliche
nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden von der
vorstehend beschriebenen Organisation bezogen. Jeweils ein den Differenzierungswirkstoff
erzeugendes MEM-Medium und ein MEM-Wachstumsmedium wurde den nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von
4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Menschliche
undifferenzierte Zellen für Prüfzwecke wurden
in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte
1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend
wurden die menschlichen undifferenzierten Zellen kultiviert. Nach
72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen
undifferenzierten Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Wenn
der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der menschlichen
undifferenzierten Zellen, die durch Zugabe des Überstands
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert
wurden, in dem die menschlichen nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, kaum verändert wurde, wurde
bestimmt, dass die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
keinen Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten
Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
-
Wenn
ferner die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen
undifferenzierten Zellen, die durch Zugabe des Überstands
des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, kaum verändert wurde, wurde
ebenfalls bestimmt, dass die nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten keinen Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung
von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann.
-
Selbst
wenn die menschlichen nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium oder MEM-Wachstumsmedium
kultiviert wurden, wird vorhergesagt, dass sie nicht den Wirkstoff
erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu
induzierten Osteoblasten induzieren kann.
-
(Beispiel 5: Herstellung und Nachweis
des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren
von menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
in dem Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Medium hergestellt
wurde)
-
Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
4 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes HAM-Medium
wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu
einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Menschliche
undifferenzierte Zellen für Prüfzwecke wurden
in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte
1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend
wurden die menschlichen undifferenzierten Zellen kultiviert. Nach
72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen
undifferenzierten Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Wenn
die menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Medium kultiviert
wurden, kann mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien
wie in Beispiel 1 bestätigt werden, dass sie einen Wirkstoff
erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu
induzierten Osteoblasten induzieren kann.
-
(Vergleichsbeispiel 5A: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von menschlichen
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in HAM-Wachstumsmedium
hergestellt wurde)
-
Menschlichen
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurde ein HAM-Wachstumsmedium
bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Menschliche
undifferenzierte Zellen für Prüfzwecke wurden
in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte
1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend
wurden die menschlichen undifferenzierten Zellen kultiviert. Nach
72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen
undifferenzierten Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Wenn
die menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
in dem HAM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, kann mit dem gleichen
Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 bestätigt
werden, dass sie keinen Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung
von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann.
-
(Vergleichsbeispiel 5B: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von menschlichen nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Medium
oder HAM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
-
Menschliche
nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die
gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 4B erhalten. Jeweils
ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes HAM-Medium und ein
HAM-Wachstumsmedium wurde den nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von
4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden
kultiviert und anschließend wurde ein Überstand
des Mediums in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Menschliche
undifferenzierte Zellen für Prüfzwecke wurden
in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte
1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend
wurden die menschlichen undifferenzierten Zellen kultiviert. Nach
72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen
undifferenzierten Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Mit
dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel
1 kann bestätigt werden, ob die menschlichen undifferenzierten
Zellen, die durch Zugabe eines Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
HAM-Mediums oder HAM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in denen
die menschlichen nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden (Kulturüberstand), induzierte Osteoblasten-Marker
exprimieren.
-
(Schlussfolgerung aus Beispiel 4 und 5
sowie Vergleichsbeispiel 4A bis 5B)
-
Gemäß den
vorstehend beschriebenen Beispielen kann untersucht werden, ob die
menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten den
Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen
zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, unabhängig
von der Art des in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Mediums enthaltenen Basismediums.
-
Gemäß Beispiel
1 und 3 sowie Vergleichsbeispiel 1A bis 1E und 3A bis 3C gilt: Selbst
wenn die aus Ratten stammenden hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in einem beliebigen Wachstumsmedium kultiviert wurden,
erzeugen sie nachweislich nicht den Wirkstoff, der die Differenzierung
von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann. Selbst wenn aus Ratten stammende nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten in einem beliebigen Medium kultiviert wurden, erzeugen
sie nachweislich nicht den Wirkstoff, der die Differenzierung von
undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann.
-
Deshalb
wird vorgeschlagen, dass der Wirkstoff, der die Differenzierung
von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann, nur durch Kultivieren der hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium
erzeugt wird. Da außerdem das in dem Medium enthaltene
Basismedium die Erzeugung des die Differenzierung von induzierten
Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs unwahrscheinlich durch die menschlichen
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten beeinträchtigt, solange
es in einer Zellkultur normal verwendet werden kann, wird angenommen,
dass ein beliebiges Basismedium in dem vorliegenden Verfahren verwendet
werden kann.
-
(Beispiel 6: Untersuchung, ob der Wirkstoff,
der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt
wurde, die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung
von Maus-C3H10T1/2-Zellen verschiedenen undifferenzierten Zellen
zu induzierten Osteoblasten aufweist)
-
Ein Überstand
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums oder
MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten
kultiviert wurden (Kulturüberstand), wurde auf die gleiche
Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten. BALB/3T3-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen
und NIH3T3-Zellen wurden als undifferenzierte Zellen verwendet.
Jeder Zelltyp wurde in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem
Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem Überstand und das
Medium zugegeben und anschließend wurden die Zellen in
einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
-
Für
den Fall der Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, zu jedem Zelltyp, wenn der Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch
Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums
kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde: der
Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der BALB/3T3-Zellen betrug
das etwa 5,9-Fache (siehe linke Seite der Tabelle 4 und 6A), der 3T3-Swiss-Albino-Zellen das etwa 13,8-Fache
(sie Mitte der Tabelle 4 und 6A)
und der NIH3T3-Zellen das etwa 5,4-Fache (siehe rechte Seite der
Tabelle 4 und 6A).
-
Für
den Fall der Zugabe des MEM-Wachstumsmediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, zu jedem Zelltyp, wenn der Wert
der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur
durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt
wurde: der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der
BALB/3T3-Zellen betrug das etwa 1,3-Fache (siehe linke Seite der
Tabelle 4 und
6A), der 3T3-Swiss-Albino-Zellen
das etwa 1,1-Fache (sie Mitte der Tabelle 4 und
6A) und der NIH3T3-Zellen das etwa 0,9-Fache (siehe
rechte Seite der Tabelle 4 und
6A). (Tabelle 4: Fähigkeit der Induzierung
der Differenzierung von BALB/3T3-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen
oder NIH3T3-Zellen zu Osteoblasten)
| BALB/3T3 | 3T3-Swiss-Albino | NIH3T3 |
| Relativer Wert | Absoluter Wert | Relativer Wert | Absoluter Wert | Relativer Wert | Absoluter Wert |
GC-Differenzierungsüber
stand | 5,9 | 0,107 | 13,8 | 0,174 | 5,4 | 0,097 |
Nur
Differenzierungs-Medium | 1 | 0,018 | 1 | 0,013 | 1 | 0,018 |
GC-Wachstums-Überstand | 1,3 | 0,021 | 1,1 | 0,013 | 0,9 | 0,016 |
Nur
Wachstumsmedium | 1 | 0,016 | 1 | 0,013 | 1 | 0,018 |
- GC (4 Wochen alt): ein Experiment wurde
durchgeführt. Drei Versuche wurden durchgeführt.
- GC-Differenzierungs-Überstand: Überstand des
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden.
- GC-Wachstums-Überstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums,
in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert
wurden.
- Nur Differenzierungs-Medium: MEM-Differenzierungsmedium allein.
- Nur Wachstumsmedium: MEM-Wachstumsmedium allein.
-
Wenn
hypertrophierungsfähige Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium kultiviert wurden, wurde bestätigt,
dass in dem Überstand des Mediums (Kulturüberstand)
der Wirkstoff vorhanden war, der die alkalische Phosphatase-Aktivität
von jedem Typ der 3T3-Swiss-Albino-Zellen, BALB/3T3-Zellen und NIH3T3-Zellen
steigern und die Differenzierung der Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann. Wenn andererseits die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
in dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt,
dass in dem Überstand des Mediums kein Wirkstoff vorhanden
war.
-
(Vergleichsbeispiel 6: Untersuchung, ob
die in einem Überstand des Mediums vorhandene Komponente,
in dem nicht-hypertrophierungsfähige ruhende Knorpelzellen
kultiviert wurden, die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung
von Maus-C3H10T1/2-Zellen verschiedenen undifferenzierten Zellen
zu induzierten Osteoblasten aufweist)
-
Ein Überstand
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums oder MEM-Wachstumsmediums,
in dem nicht-hypertrophierungsfähige ruhende Knorpelzellen
kultiviert wurden, wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel
1B erhalten. BALB/3T3-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen und NIH3T3-Zellen
wurden als undifferenzierte Zellen verwendet. Jeder Zelltyp wurde
in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte
1 ml von jedem Überstand und das Medium zugegeben und anschließend
wurden die Zellen in einem 5% CO2 Inkubator
bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
-
Für
den Fall der Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums, in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen
ruhenden Knorpelzellen kultiviert wurden, zu jedem Zelltyp, wenn
der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen,
die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt
wurde: der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der
BALB/3T3-Zellen betrug das etwa 1,0-Fache (siehe linke Seite der
Tabelle 5 und 6A), der 3T3-Swiss-Albino-Zellen
das etwa 1,1-Fache (sie Mitte der Tabelle 5 und 6A) und der NIH3T3-Zellen das etwa 1,0-Fache (siehe
rechte Seite der Tabelle 5 und 6A).
-
Für
den Fall der Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums,
in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen ruhenden Knorpelzellen
kultiviert wurden, zu jedem Zelltyp, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert
wurden, auf ”1” festgelegt wurde: der Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der BALB/3T3-Zellen betrug das
etwa 1,3-Fache (siehe linke Seite der Tabelle 5 und
6A), der 3T3-Swiss-Albino-Zellen das etwa 0,9-Fache
(sie Mitte der Tabelle 5 und
6A)
und der NIH3T3-Zellen das etwa 1,0-Fache (siehe rechte Seite der
Tabelle 5 und
6A). (Tabelle 5: Fähigkeit der Induzierung
der Differenzierung von BALB/3T3-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen
oder NIH3T3-Zellen zu Osteoblasten)
| BALB/3T3 | 3T3-Swiss-Albino | NIH3T3 |
| Relativer Wert | Absoluter Wert | Relativer Wert | Absoluter Wert | Relativer Wert | Absoluter Wert |
RC-Differenzierungsüberstand | 1,0 | 0,018 | 1,1 | 0,014 | 1,0 | 0,018 |
Nur
Differenzierungsmedium | 1 | 0,018 | 1 | 0,013 | 1 | 0,018 |
RC-Wachstumsüberstand | 1,3 | 0,020 | 0,9 | 0,012 | 1,0 | 0,019 |
Nur
Wachstumsmedium | 1 | 0,016 | 1 | 0,013 | 1 | 0,018 |
- RC (8 Wochen alt): ein Experiment wurde
durchgeführt. Drei Versuche wurden durchgeführt.
- RC-Differenzierungsüberstand: Überstand des
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem ruhende
Knorpelzellen kultiviert wurden.
- RC-Wachstumsüberstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums,
in dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden.
- Nur Differenzierungs-Medium: MEM-Differenzierungsmedium allein.
- Nur Wachstumsmedium: MEM-Wachstumsmedium allein.
-
Es
gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität bei jedem Typ von 3T3-Swiss-Albino-Zellen,
BALB/3T3-Zellen und NIH3T3-Zellen, die durch Zugabe des Überstands
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert
wurden, in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen ruhenden
Knorpelzellen kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden.
-
Somit
wurde bestätigt, dass in dem Überstand des Mediums
(Kulturüberstand) kein Wirkstoff vorhanden war, der die
Differenzierung von jedem Typ dieser undifferenzierten Zellen zu
induzierten Osteoblasten induzieren kann. Es wurde ferner bestätigt,
dass in dem Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem nicht-hypertrophierungsfähige
ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden, kein Wirkstoff vorhanden
war.
-
(Beispiel 7: Herstellung und Nachweis
des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren
von aus Costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in einem Medium mit verschiedenen Arten herkömmlicher
die Osteoblasten-Differenzierung induzierender Komponenten hergestellt
wurde)
-
Aus
Costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten
wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten.
Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM),
15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml
Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10
4 Zellen/cm
2 zugegeben
und anschließend wurde Dexamethason, β-Glycerophosphat,
Ascorbinsäure oder eine Kombination davon als eine herkömmliche
Osteoblasten-Differenzierungskomponente dem Medium zugegeben. Die
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
Zugegebene
Komponente | Konzentration
der jeweils zugegebenen die Osteoblasten-Differenzierung induzierenden
Komponente |
Differenzierungswirkstoff
erzeugendes Medium | Dex:
10 nM, βGP: 10 mM, Asc: 50 μg/ml |
Dex | Dex:
10 nM |
βGP | βGP:
10 mM |
Asc | Asc:
50 μg/ml |
Dex
+ βGP | Dex:
10 nM, βGP: 10 mM |
Dex
+ Asc | Dex:
10 nM, Asc: 50 μg/ml |
βGP
+ Asc | βGP:
10 mM, Asc: 50 μg/ml |
Wachstumsmedium | Keine
die Osteoblasten-Differenzierung induzierende Komponente |
- Dex: Dexamethason, βGP: β-Glycerophosphat,
Asc: Ascorbinsäure
-
1
ml von jedem partiellen Überstand wurde Maus-C3H10T1/2-Zellen
(1,25 × 104 Zellen/cm2)
zugegeben, sie wurden in einem 5% CO2 Inkubator
bei 37°C kultiviert und anschließend wurde die
alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Wie in
der nachstehenden Tabelle und 6B gezeigt
ist, betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der
Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums,
enthaltend Dex, βGP und Asc (Differenzierungswirkstoff erzeugendes
MEM-Medium) kultiviert wurden, 0,041, und der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums,
enthaltend βGP und Asc betrug 0,044.
-
Ferner
betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der
Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums,
enthaltend nur Dex, 0,016, der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums,
enthaltend nur BGP, 0,015 und der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums,
enthaltend nur Asc, 0,016. Der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums,
enthaltend Dex und BGP, betrug 0,022 und der Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands
des MEM-Wachstumsmediums, enthaltend Dex und Asc, 0,017.
-
Wenn
ein Überstand des Wachstumsmediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, den Maus-C3H10T1/2-Zellen als Kontrolle
zugegeben wurde, betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen 0,014. Wenn nur das den Differenzierungswirkstoff erzeugende MEM-Medium
und das MEM-Wachstumsmedium den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben
wurde, betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen 0,016 bzw. 0,014.
-
(Wirkung der herkömmlichen Osteoblasten-Differenzierung
induzierenden Komponenten auf die Erzeugung des Wirkstoffs, der
die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren kann)
-
|
Mittelwert
SA |
|
Dex
+ βGP + Asc |
0,041 |
0,008 |
Dex |
0,016 |
0,004 |
βGP |
0,015 |
0,004 |
Asc |
0,016 |
0,001 |
Dex
+ βGP |
0,022 |
0,004 |
Dex
+ Asc |
0,017 |
0,002 |
βGP
+ Asc |
0,044 |
0,016 |
Wachstumsmedium |
0,014 |
0,002 |
Nur
Differenzierungsmedium |
0,016 |
0,002 |
Nur
Wachstumsmedium |
0,014 |
0,001 |
- Dex: Dexamethason
- βGP: β-Glycerophosphat
- Asc: Ascorbinsäure
- Nur Differenzierungsmedium: Differenzierungswirkstoff erzeugendes
MEM-Medium allein (in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten
nicht kultiviert wurden)
- Nur Wachstumsmedium: MEM-Wachstumsmedium allein (in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten nicht kultiviert wurden)
-
Wenn
jede der herkömmlichen Osteoblasten-Differenzierung induzierenden
Komponenten dem MEM-Wachstumsmedium unabhängig zugegeben
wurde, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert
wurden, wurde der Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten
Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, nicht erzeugt.
Wenn β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure dem MEM-Wachstumsmedium
zugegeben wurde, wurde der Wirkstoff, der die Differenzierung von
undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann, hergestellt.
-
Wenn
gemeinsam Dexamethason, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure
dem MEM-Wachstumsmedium zugegeben wurde (d. h. das den Differenzierungswirkstoff
erzeugende MEM-Medium wurde verwendet), wurde bestätigt,
dass die Erzeugung des Wirkstoffs, der die Differenzierung von undifferenzierten
Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, gefördert
wurde.
-
(Beispiel 8: Untersuchung des in einem Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums enthaltenen
Wirkstoffs, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden)
-
Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 kultiviert und ein Überstand
des Mediums wurde zur Gewinnung von partiellen Überstanden
in einer Zeitspanne von 4 Tagen bis 3 Wochen gesammelt. Jeder partielle Überstand
wurde in ein Zentrifugenfilter gegeben und anschließend
eine Zentrifugen-Ultrafiltration bei 4.000 × g und bei
4°C für 30 min unter einer solchen Bedingung durchgeführt,
dass eine hochmolekulare Fraktion und eine niedermolekulare Fraktion
von einander getrennt wurden. So wurde der partielle Überstand
in eine hochmolekulare Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000
oder höher und eine niedermolekulare Fraktion mit einem
Molekulargewicht von 50.000 oder weniger aufgetrennt.
-
Dann
wurden Maus-C3H10T1/2-Zellen (in einem BME-Medium) in eine 24-Well-Platte
bei einer Dichte von 1,25 × 104 Zellen/cm2 und auf Hydroxylapatit bei einer Dichte
von 1 × 106 Zellen/ml geimpft.
18 h nach dem Impfen wurde der Platte und dem Hydroxylapatit 1 ml
der hochmolekularen Fraktion und der niedermolekularen Fraktion
zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Wenn
die hochmolekulare Fraktion mit dem Molekulargewicht von 50.000
oder höher, die aus jedem partiellen Überstand
abgetrennt wurde, den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde, die
auf die 24-Well-Platte und auf Hydroxylapatit geimpft wurden, wurden
sie rot gefärbt (siehe 7A und 7B).
Es wurde angezeigt, dass der Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen steigern kann, in der hochmolekularen
Fraktion vorhanden war.
-
Wenn
andererseits die niedermolekulare Fraktion mit dem Molekulargewicht
von 50.000 oder weniger, die aus jedem partiellen Überstand
abgetrennt wurde, den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde, die
auf die 24-Well-Platte und auf Hydroxylapatit geimpft wurden, wurden
sie nicht gefärbt. D. h. die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen (siehe 7C und 7D).
-
Gemäß den
vorstehenden Ergebnissen wurde festgestellt, das der Wirkstoff,
der die Differenzierung der Maus-C3H10T1/2-Zellen zu induzierten
Osteoblasten induzieren kann, in der hochmolekularen Fraktion mit
dem Molekulargewicht von 50.000 oder höher, die aus jedem
partiellen Überstand des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums abgetrennt wurde, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, vorhanden war.
-
(Beispiel 9: Herstellung und Nachweis
des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren
von aus Maus-Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
hergestellt wurde)
-
(Herstellung von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten aus Maus-Costa/costal-Knorpel)
-
8
Wochen alte männliche Mäuse (Balb/cA) wurden in
diesem Beispiel untersucht. Die Mäuse wurden unter Verwendung
von Chloroform getötet. Der Brustkorb der Mäuse
wurde unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen
Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung
(10-fach verdünnt) eingetaucht. Der Brustkorb der Mäuse
wurde eingeschnitten und die Costa/costal-Knorpel aseptisch entnommen.
-
Die
durchscheinende Wachstumsknorpelregion wurde aus der Grenzregion
der Costa/costal-Knorpel gesammelt. Der Wachstumsknorpel wurde zerschnitten
und in 0,25% Trypsin-EDTA/Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
nach Dulbecco (D-PBS) bei 37°C für 1 Stunde gerührt.
Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei
170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend
zusammen mit 0,2% Collagenase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/D-PBS
bei 37°C für 2,5 h gerührt.
-
Die
Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei
170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend
zusammen mit 0,2% Dispase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/(HAM
+ 10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei
37°C gerührt. Am folgenden Tag wurden die Zellen
filtriert und durch Zentrifugation (bei 170 × g für
3 min) gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt
und ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
-
Die
Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden,
wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt
wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
-
(Identifizierung von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten)
-
Da
die in Beispiel 9 erhaltenen Zellen durch die bei der Zelltrennung
verwendeten Enzyme (z. B. Trypsin, Collagenase und Dispase) beeinträchtigt
waren, wurden sie zur Erholung kultiviert. Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden unter Verwendung der Lokalisierung und Expression
von Chondrozyten-Markern und ihrer morphologischen Hypertrophien
unter einem Mikroskop identifiziert.
-
(Lokalisierung oder Expression von spezifischen
Markern für hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
-
Ein
unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens hergestelltes
Lysat wurde mit Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt, um eine SDS-behandelte
Lösung zu erhalten. Mit der SDS-behandelten Lösung
wurde eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt.
Das in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendete Gel wurde
anschließend auf eine Transfermembran aufgetragen (Western-Blotting), mit
einem primären Antikörper auf einen Chondrozyten-Marker
umgesetzt und mit einem sekundären Antikörper
nachgewiesen, der mit einem Enzym, wie Peroxidase, alkalische Phosphatase
oder Glucosidase, oder einem Fluoreszenzmarker, wie Fluoresceinisothiocyanat
(FITC), Phycoerythrin (PE), Texas-Rot, 7-Amino-4-methylcoumarin-3-acetat
(AMCA) oder Rhodamin, markiert ist.
-
Die
Kultur (Zellkultur), die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Vorgehensweise erhalten wurde, wurde mit 10% neutralem gepuffertem
Formalin fixiert, mit einem primären Antikörper
auf einen Chondrozyten-Marker umgesetzt und anschließend
mit einem sekundären Antikörper nachgewiesen,
der mit einem Enzym, wie Peroxidase, alkalische Phosphatase oder
Glucosidase, oder einem Fluoreszenzmarker, wie FITC, PE, Texas-Rot,
AMCA oder Rhodamin markiert ist.
-
Die
alkalische Phosphatase kann ferner durch Färben nachgewiesen
werden. Die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise
erhaltene Kultur wurde gefärbt, indem sie mit 60% Aceton/Citronensäure-Puffer
fixiert, mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend
in ein Gemisch aus First Violet B und Naphthol AS-MX bei Raumtemperatur
im Dunkeln für 30 min zur Umsetzung eingetaucht wurde.
-
(Morphologische Bewertung der Fähigkeit
zur Hypertrophie in Chondrozyten)
-
Ein
HAM-F12-Medium, enthaltend 5 × 105 Zellen,
wurde zur Bildung eines Pellets aus den Zellen zentrifugiert. Das
Pellet (Zellpellet) wurde für eine vorbestimmte Zeitspanne
kultiviert. Die Zellgrößen vor und nach dem Kultivieren
wurden unter einem Mikroskop verglichen. Wurde eine signifikante
Zunahme der Größe festgestellt, wurden die Zellen
als hypertrophierungsfähig bestimmt.
-
Es
kann bestätigt werden, ob die in Beispiel 9 erhaltenen
Zellen hypertrophierungsfähige Chondrozyten sind, indem
bestimmt wird, ob diese Zellen einen Chondrozyten-Marker exprimieren
oder morphologisch hypertroph sind.
-
(Nachweis des Wirkstoffs, der von aus
Maus-Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt wurde)
-
Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
9 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium
(enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales
Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat,
50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1
mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde
den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zur Herstellung
einer Zellsuspension bis zu einer Verdünnung mit einer
Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
-
Die
Zellsuspension wurde gleichmäßig auf eine Schale
(hergestellt von Becton, Dickinson and Company) geimpft, die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten wurden in einem 5% CO2 Inkubator
bei 37°C kultiviert und anschließend wurde ein Überstand
des Mediums (Kulturüberstand) über einen Zeitraum
(4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung
von partiellen Überständen gesammelt.
-
(Untersuchung, ob der gewonnene Überstand
die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten
Zellen zu induzierten Osteoblasten aufweist)
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte
(hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte
von 1,25 × 104 Zellen/cm2 (d. h. 2,5 × 104 Zellen/Vertiefung)
geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand
und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
In
diesem Beispiel wurde der vorliegende Wirkstoff mit der Fähigkeit
zur Steigerung der alkalischen Phosphatase-Aktivität bestimmt,
wenn ein Wert der alkalischen Phosphatase-(ALP)-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen (Ganzzellen), die durch Zugabe des Überstands
mit dem vorliegenden Wirkstoff kultiviert wurden, um mehr als das
1,5-Fache des Wertes der Maus-C3H10T1/2-Zellen zunahm, die durch
Zugabe des Mediums ohne den vorliegenden Wirkstoff kultiviert wurden.
-
Wenn
der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt
wurde, erhöhte sich der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die durch Zugabe des Überstands kultiviert
wurden, auf das etwa 3,1-Fache (siehe obere Spalte in Tabelle 6 und 8).
-
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
-
Wie
vorstehend beschrieben ist, wurde gezeigt, dass die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität,
die eine von den induzierten Osteoblasten-Markern ist, der Maus-C3H10T1/2-Zellen
von dem Wirkstoff gesteigert wird, der die Differenzierung zu induzierten
Osteoblasten induzieren kann. Außerdem wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten
Osteoblasten fähigen Wirkstoffs für 72 h kultiviert
wurden, bei der alkalischen Phosphatase-Färbung signifikant
rot gefärbt.
-
Somit
wurde die Expression der alkalischen Phosphatase unter Verwendung
des Färbeverfahrens ebenfalls angezeigt. Folglich wurde
bestätigt, dass die Maus-C3H10T1/2-Zellen zu den induzierten
Osteoblasten differenziert wurden.
-
(Vergleichsbeispiel 9A: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Maus-Costa/costal-Knorpel
gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in MEM-Wachstumsmedium
hergestellt wurde)
-
Aus
Maus-Costa/costal-Knorpel gewonnene hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
9 erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium
(MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und
0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von
4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage,
21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte
(hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte
von 1,25 × 104 Zellen/cm2 (d. h. 2,5 × 104 Zellen/Vertiefung)
geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand
und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Wenn
der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden,
auf ”1” festgelegt wurde, betrug der Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch
Zugabe des Überstands kultiviert wurden, das etwa 1,6-Fache
(siehe untere Spalte in Tabelle 6 und 8).
-
Es
gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums
kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe
des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden (siehe 8).
-
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
-
In
dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 9 wurde bestätigt,
dass der Überstand des Mediums (Zellkultur), der durch
die vorstehend beschriebene Vorgehensweise erhalten wurde, keine
induzierten Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimierte.
-
(Vergleichsbeispiel 9B: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Maus-Costal-Knorpel
gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
-
(Herstellung von ruhenden Knorpelzellen
aus Costal-Knorpel)
-
8
Wochen alte männliche Mäuse (Balb/cA) wurden unter
Verwendung von Chloroform getötet. Der Brustkorb der Mäuse
wurde unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen
Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung
(10-fach verdünnt) eingetaucht. Der Brustkorb der Mäuse
wurde eingeschnitten und die Costa/costal-Knorpel aseptisch entnommen.
-
Die
durchscheinenden ruhenden Knorpelregionen wurden aus den Costal-Knorpeln
gesammelt. Die ruhenden Knorpelregionen wurden zerschnitten und
in 0,25% Trypsin-EDTA/D-PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
nach Dulbecco) bei 37°C für 1 Stunde gerührt.
Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g
für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen
mit 0,2% Collagenase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/D-PBS
bei 37°C für 2,5 h gerührt.
-
Die
Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei
170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend
zusammen mit 0,2% Dispase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/(HAM
+ 10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei
37°C gerührt. Wahlweise wurde die Behandlung 0,2%
Dispase über Nacht weggelassen. Am folgenden Tag wurden
die Zellen filtriert und durch Zentrifugation (bei 170 × g
für 3 min) gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau
gefärbt und ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
-
Die
Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden,
wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt
wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
-
(Identifizierung von aus Costal-Knorpel
stammenden nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten)
-
In
dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 9 kann die Lokalisierung
oder Expression von Chondrozyten-Markern nachgewiesen werden. Ferner
kann bestätigt werden, ob die erhaltenen Zellen hypertrophierungsfähige
Chondrozyten sind, indem sie morphologisch untersucht werden.
-
(Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren
von aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt
wurde)
-
Ein
den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend
essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum),
10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml
Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin
und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den aus Costal-Knorpel
gewonnenen ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung
mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden
kultiviert und anschließend wurde ein Überstand
des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage,
18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach
dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und
das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Wenn
der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt
wurde, betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die durch Zugabe des Überstands kultiviert
wurden, das etwa 0,8-Fache (siehe obere Spalte in Tabelle 6 und 8).
-
Es
gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die ruhenden Knorpelzellen
(Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden (siehe obere Spalte in
Tabelle 6 und 8).
-
Mit
dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel
1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des
Mediums (Zellkultur), der durch die vorstehend beschriebene Vorgehensweise
erhalten wurde, induzierte Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen
exprimiert.
-
(Vergleichsbeispiel 9C: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Maus-Costa/costal-Knorpel
gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in MEM-Wachstumsmedium hergestellt
wurde)
-
Aus
Costal-Knorpel stammende ruhende Knorpelzellen wurden auf die gleiche
Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 9B erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium
(enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml
Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin
B) wurde den ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung
mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden
kultiviert und anschließend wurde ein Überstand
des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage,
18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach
dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und
das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Wenn
der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden,
auf ”1” festgelegt wurde, betrug der Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch
Zugabe des Überstands kultiviert wurden, das etwa 1,0-Fache
(siehe untere Spalte in Tabelle 6 und 8).
-
Es
gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums
kultiviert wurden, in dem die ruhenden Knorpelzellen kultiviert
wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der
Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert
wurden (siehe untere Spalte in Tabelle 6 und 8).
-
Es
wurde bestätigt, dass der Überstand des Mediums
(Zellkultur), der durch die vorstehend beschriebene Vorgehensweise
erhalten wurde, keine induzierten Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimierte.
-
(Tabelle 6: Vergleich der alkalischen
Phosphatase-Aktivitäten von Beispiel 9 und Vergleichsbeispiel
9A bis 9C, wobei in jedem ein Überstand des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums oder MEM-Wachstumsmediums, in denen murine
Chondrozyten kultiviert wurden, Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben
wurde)
-
Differenzierungswirkstoff erzeugendes
MEM-Medium (Mittelwert)
| Relativer
Wert | Absoluter
Wert |
GC-Überstand | 3,1 | 0,038 |
RC-Überstand | 0,8 | 0,011 |
Nur
Differenzierungsmedium | 1 | 0,012 |
MEM-Wachstumsmedium (Mittelwert)
| Relativer
Wert | Absoluter
Wert |
GC-Überstand | 1,6 | 0,021 |
RC-Überstand | 1,0 | 0,013 |
Nur
Differenzierungsmedium | 1 | 0,014 |
- 8 Wochen alt: ein Experiment wurde durchgeführt.
Zwei Versuche wurden durchgeführt.
- GC-Überstand: Überstand jedes Mediums, in
dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
- RC-Überstand: Überstand jedes Mediums, in
dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden.
- Nur Differenzierungsmedium: den Differenzierungswirkstoff erzeugendes
MEM-Medium allein.
- Nur Wachstumsmedium: MEM-Wachstumsmedium allein.
-
(Schlussfolgerung aus Beispiel 9 und Vergleichsbeispiel
9A bis 9C)
-
Wenn
aus Maus-Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass in dem Überstand
des Mediums (Kulturüberstand) der Wirkstoff vorhanden war,
der die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen
und die Differenzierung der Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann.
-
Wenn
andererseits die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
in dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt,
dass in dem Überstand des Mediums (Kulturüberstand)
kein Wirkstoff vorhanden war. Somit wurde festgestellt, dass die
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten einen Wirkstoff erzeugten, der
die Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen
zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, indem sie in dem den
Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert wurden.
-
Sogar
wenn die aus Maus-Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen
in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium oder
MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt,
dass sie keinen Wirkstoff erzeugten, der die Differenzierung von
undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann.
-
(Beispiel 10: Herstellung und Nachweis
des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren
von aus Kaninchen-Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
hergestellt wurde)
-
(Herstellung von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten aus Kaninchen-Costa/costal-Knorpel)
-
8
Wochen alte männliche Kaninchen (Japanese White) wurden
in diesem Beispiel untersucht. Die Kaninchen wurden unter Verwendung
von Chloroform getötet. Der Brustkorb der Kaninchen wurde
unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen
Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung (10-fach
verdünnt) eingetaucht. Der Brustkorb der Kaninchen wurde
eingeschnitten und die Costa/costal-Knorpel aseptisch entnommen.
-
Die
durchscheinende Wachstumsknorpelregion wurde aus der Grenzregion
der Costa/costal-Knorpel gesammelt. Der Wachstumsknorpel wurde zerschnitten
und in 0,25% Trypsin-EDTA/D-PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
nach Dulbecco) bei 37°C für 1 Stunde gerührt.
Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei
170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend
zusammen mit 0,2% Collagenase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/D-PBS
bei 37°C für 2,5 h gerührt.
-
Die
Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei
170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend
zusammen mit 0,2% Dispase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/(HAM
+ 10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei
37°C gerührt. Am folgenden Tag wurden die Zellen
filtriert und durch Zentrifugation (bei 170 × g für
3 min) gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt
und ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
-
Die
Zellen, die als nicht gerbte Zellen bewertet wurden, wurden als
lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt
wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
-
(Identifizierung von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten)
-
Da
die in Beispiel 10 erhaltenen Zellen durch die bei der Zelltrennung
verwendeten Enzyme (z. B. Trypsin, Collagenase und Dispase) beeinträchtigt
waren, wurden sie zur Erholung kultiviert. Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden unter Verwendung der Lokalisierung und Expression
von Chondrozyten-Markern und ihrer morphologischen Hypertrophien
unter einem Mikroskop identifiziert.
-
(Lokalisierung oder Expression von spezifischen
Markern für hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
-
Ein
unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens hergestelltes
Lysat wurde mit Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt, um eine SDS-behandelte
Lösung zu erhalten. Mit der SDS-behandelten Lösung
wurde eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt.
Das in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendete Gel wurde
anschließend auf eine Transfermembran aufgetragen (Western-Blotting), mit
einem primären Antikörper auf einen Chondrozyten-Marker
umgesetzt und mit einem sekundären Antikörper
nachgewiesen, der mit einem Enzym, wie Peroxidase, alkalische Phosphatase
oder Glucosidase, oder einem Fluoreszenzmarker, wie Fluoresceinisothiocyanat
(FITC), Phycoerythrin (PE), Texas-Rot, 7-Amino-4-methylcoumarin-3-acetat
(AMCA) oder Rhodamin, markiert ist.
-
Die
Kultur (Zellkultur), die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Vorgehensweise erhalten wurde, wurde mit 10% neutralem gepuffertem
Formalin fixiert, mit einem primären Antikörper
auf einen Chondrozyten-Marker umgesetzt und anschließend
mit einem sekundären Antikörper nachgewiesen,
der mit einem Enzym, wie Peroxidase, alkalische Phosphatase oder
Glucosidase, oder einem Fluoreszenzmarker, wie FITC, PE, Texas-Rot,
AMCA oder Rhodamin markiert ist.
-
Die
alkalische Phosphatase kann ferner durch Färben nachgewiesen
werden. Die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise
erhaltene Kultur wurde gefärbt, indem sie mit 60% Aceton/Citronensäure-Puffer
fixiert, mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend
in ein Gemisch aus First Violet B und Naphthol AS-MX bei Raumtemperatur
im Dunkeln für 30 min zur Umsetzung eingetaucht wurde.
-
(Morphologische Bewertung der Fähigkeit
zur Hypertrophie in Chondrozyten)
-
Ein
HAM-F12-Medium, enthaltend 5 × 105 Zellen,
wurde zur Bildung eines Pellets aus den Zellen zentrifugiert. Das
Pellet (Zellpellet) wurde für eine vorbestimmte Zeitspanne
kultiviert. Die Zellgrößen vor und nach dem Kultivieren
wurden unter einem Mikroskop verglichen. Wurde eine signifikante
Zunahme der Größe festgestellt, wurden die Zellen
als hypertrophierungsfähig bestimmt.
-
(Ergebnisse)
-
Es
kann bestätigt werden, ob die in Beispiel 10 erhaltenen
Zellen hypertrophierungsfähige Chondrozyten sind, indem
bestimmt wird, ob diese Zellen einen Chondrozyten-Marker exprimieren
oder morphologisch hypertroph sind.
-
(Nachweis des Wirkstoffs, der von aus
Kaninchen-Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt wurde)
-
Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
10 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium
(enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales
Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat,
50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1
mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde
den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zur Herstellung
einer Zellsuspension bis zu einer Verdünnung mit einer
Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
-
Die
Zellsuspension wurde gleichmäßig auf eine Schale
(hergestellt von Becton, Dickinson and Company) geimpft, die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten wurden in einem 5% CO2 Inkubator
bei 37°C kultiviert und anschließend wurde ein Überstand
(Kulturüberstand) des Mediums über einen Zeitraum
(4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung
von partiellen Überständen gesammelt.
-
(Untersuchung, ob der gewonnene Überstand
die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten
Zellen zu induzierten Osteoblasten aufweist)
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte
(hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte
von 1,25 × 104 Zellen/cm2 (d. h. 2,5 × 104 Zellen/Vertiefung)
geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand
und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
In
diesem Beispiel wurde der vorliegende Wirkstoff mit der Fähigkeit
zur Steigerung der alkalischen Phosphatase-Aktivität bestimmt,
wenn ein Wert der alkalischen Phosphatase-(ALP)-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen (Ganzzellen), die durch Zugabe des Überstands
mit dem vorliegenden Wirkstoff kultiviert wurden, um mehr als das
1,5-Fache des Wertes der Maus-C3H10T1/2-Zellen zunahm, die durch
Zugabe des Mediums ohne den vorliegenden Wirkstoff kultiviert wurden.
-
Wenn
der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt
wurde, erhöhte sich der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die durch Zugabe des Überstands kultiviert
wurden.
-
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
-
Wie
vorstehend beschrieben ist, wurde gezeigt, dass die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität,
die eine von den induzierten Osteoblasten-Markern ist, der Maus-C3H10T1/2-Zellen
von dem Wirkstoff gesteigert wird, der die Differenzierung zu induzierten
Osteoblasten induzieren kann. Außerdem wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten
Osteoblasten fähigen Wirkstoffs für 72 h kultiviert
wurden, bei der alkalischen Phosphatase-Färbung signifikant
rot gefärbt.
-
Somit
wurde die Expression der alkalischen Phosphatase unter Verwendung
des Färbeverfahrens ebenfalls angezeigt. Folglich wurde
bestätigt, dass die Maus-C3H10T1/2-Zellen zu den induzierten
Osteoblasten differenziert wurden.
-
(Vergleichsbeispiel 10A: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Kaninchen-Costa/costal-Knorpel
gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in MEM-Wachstumsmedium
hergestellt wurde)
-
Aus
Kaninchen-Costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
10 erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium
(MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und
0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von
4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage,
21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte
(hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte
von 1,25 × 104 Zellen/cm2 (d. h. 2,5 × 104 Zellen/Vertiefung)
geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand
und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Es
gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums
kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen
Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe
des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden.
-
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
-
Mit
dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel
10 kann bestätigt werden, ob der Überstand des
Mediums (Zellkultur), der durch die vorstehend beschriebene Vorgehensweise
erhalten wurde, induzierte Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen
exprimiert.
-
(Vergleichsbeispiel 10B: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Kaninchen-Costal-Knorpel
gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
-
(Herstellung von ruhenden Knorpelzellen
aus Costal-Knorpel)
-
8
Wochen alte männliche Kaninchen (Japanese White) wurden
unter Verwendung von Chloroform getötet. Der Brustkorb
der Kaninchen wurde unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert,
und ihre ganzen Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung
(10-fach verdünnt) eingetaucht. Der Brustkorb der Kaninchen
wurde eingeschnitten und die Costa/costal-Knorpel aseptisch entnommen.
-
Die
durchscheinenden ruhenden Knorpelregionen wurden aus den Costal-Knorpeln
gesammelt. Die ruhenden Knorpelregionen wurden zerschnitten und
in 0,25% Trypsin-EDTA/D-PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
nach Dulbecco) bei 37°C für 1 Stunde gerührt.
Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei
170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend
zusammen mit 0,2% Collagenase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/D-PBS
bei 37°C für 2,5 h gerührt.
-
Die
Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei
170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend
zusammen mit 0,2% Dispase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/(HAM
+ 10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei
37°C gerührt.
-
Wahlweise
wurde die Behandlung 0,2% Dispase über Nacht weggelassen.
Am folgenden Tag wurden die Zellen filtriert und durch Zentrifugation
(bei 170 × g für 3 min) gewaschen. Die Zellen
wurden mit Trypanblau gefärbt und ihre Anzahl wurde unter
einem Mikroskop gezählt.
-
Die
Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden,
wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt
wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
-
(Identifizierung von aus Costal-Knorpel
stammenden nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten)
-
Mit
dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel
10 kann bestätigt werden, ob die erhaltenen Zellen nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten sind, indem die Lokalisierung oder Expression von Chondrozyten-Markern
nachgewiesen wird und sie morphologisch untersucht werden.
-
(Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren
von aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt
wurde)
-
Ein
den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend
essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum),
10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml
Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin
und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde aus Costal-Knorpel
gewonnenen ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung
mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden
kultiviert und anschließend wurde ein Kulturüberstand
des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage,
18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach
dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und
das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Es
gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die ruhenden Knorpelzellen
(Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden.
-
Mit
dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel
1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des
Mediums (Zellkultur), der durch die vorstehend beschriebene Vorgehensweise
erhalten wurde, induzierte Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen
exprimiert.
-
(Vergleichsbeispiel 10C: Herstellung und
Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel
gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in MEM-Wachstumsmedium hergestellt
wurde)
-
Aus
Costal-Knorpel stammende ruhende Knorpelzellen wurden auf die gleiche
Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 10B erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium
(enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml
Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin
B) wurde den ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung
mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden
kultiviert und anschließend wurde ein Überstand
des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage,
18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach
dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und
das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Es
gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der
alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums
kultiviert wurden, in dem die aus Costal-Knorpel stammenden ruhenden
Knorpelzellen kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden.
-
Mit
dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel
1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des
Mediums (Zellkultur), der durch die vorstehend beschriebene Vorgehensweise
erhalten wurde, induzierte Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen
exprimiert.
-
(Schlussfolgerung aus Beispiel 10 und
Vergleichsbeispiel 10A bis 10C)
-
Wenn
aus Kaninchen-Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass in dem Überstand
des Mediums (Kulturüberstand) der Wirkstoff vorhanden war,
der die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen
und die Differenzierung der Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
-
Wenn
andererseits die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
in dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt,
dass in dem Überstand des Mediums (Kulturüberstand)
kein Wirkstoff vorhanden war. Somit wurde festgestellt, dass die
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten einen Wirkstoff erzeugten, der
die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten
Osteoblasten induzieren kann, indem sie in dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium kultiviert wurden.
-
Sogar
wenn die aus Kaninchen-Costal-Knorpel gewonnenen nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium
oder MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt,
dass sie keinen Wirkstoff erzeugten, der die Differenzierung von
undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann.
-
(Beispiel 11: Untersuchung der Wirkung
eines Mediums zum Kultivieren von undifferenzierten Zellen (Kulturmedium
für undifferenzierte Zellen) auf die Induzierung der Differenzierung
von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten)
-
Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten, nicht-hypertrophierungsfähige ruhende Knorpelzellen
und nicht-hypertrophierungsfähige Gelenkknorpelzellen wurden
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1, Vergleichsbeispiel
1B bzw. Vergleichsbeispiel 1D erhalten. Jeweils ein den Differenzierungswirkstoff
erzeugendes MEM-Medium und ein MEM-Wachstumsmedium wurde jeder Art
der Zellen bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von
4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die Zellen wurden in einem 5% CO2 Inkubator
bei 37°C kultiviert und anschließend wurde ein Überstand
des Mediums (Kulturüberstand) in einer Zeitspanne (4 Tage,
7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
wurden als undifferenzierte Zellen verwendet. Die Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden
in eine 24-Loch-Platte, enthaltend ein HAM-Medium oder MEM-Medium,
bei einer Dichte von 1,25 × 104 Zellen/cm2 geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der
Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium
zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Es
wurde festgestellt, dass der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in dem MEM-Medium kultiviert wurden,
dem der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums zugegeben wurde, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, um das etwa 10,8-Fache des Wertes
der Maus-C3H10T1/2-Zellen zunahm, die in dem MEM-Medium kultiviert
wurden, dem nur das den Differenzierungswirkstoff erzeugende MEM-Medium
zugegeben wurde.
-
Es
wurde festgestellt, dass der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in dem MEM-Medium kultiviert wurden,
dem der Überstand des MEM-Wachstumsmediums zugegeben wurde,
in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert
wurden (Kulturüberstand), nicht zunahm. Es wurde ferner
festgestellt, dass die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in dem MEM-Medium kultiviert wurden,
dem der Überstand von jeweils dem Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium zugegeben wurde,
in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen ruhenden Knorpelzellen
oder die nicht-hypertrophierungsfähigen Gelenkknorpel-Chondrozyten
kultiviert wurden (Kulturüberstand), nicht zunahm.
-
Somit
wurde belegt, dass das zum Kultivieren der Maus-C3H10T1/2-Zellen
verwendete Basismedium die Induzierung der Differenzierung der Zellen
zu induzierten Osteoblasten nicht beeinträchtigte (siehe
Tabelle 7 und 9).
-
(Tabelle 7: Wirkung des zum Kultivieren
von undifferenzierten Zellen verwendeten Basismediums auf die Induzierung
der Differenzierung der Zellen zu induzierten Osteoblasten)
-
HAM-Medium (Mittelwert)
| Relativer
Wert | Absoluter
Wert |
GC-Differenzierungsüberstand | 6,7 | 0,058 |
GC-Wachstumsüberstand | 1,1 | 0,010 |
RC-Differenzierungsüberstand | 1,2 | 0,011 |
RC-Wachstumsüberstand | 1,1 | 0,010 |
AC-Differenzierungsüberstand | 1,2 | 0,010 |
AC-Wachstumsüberstand | 1,2 | 0,011 |
Nur
Differenzierungsmedium | 1 | 0,009 |
Nur
Wachstumsmedium | 1 | 0,009 |
MEM-Medium (Mittelwert)
| Relativer
Wert | Absoluter
Wert |
GC-Differenzierungsüberstand | 10,8 | 0,085 |
GC-Wachstumsüberstand | 1,3 | 0,015 |
RC-Differenzierungsüberstand | 1,5 | 0,012 |
RC-Wachstumsüberstand | 0,7 | 0,008 |
AC-Differenzierungsüberstand | 1,3 | 0,010 |
AC-Wachstumsüberstand | 0,6 | 0,007 |
Nur
Differenzierungsmedium | 1 | 0,008 |
Nur
Wachstumsmedium | 1 | 0,011 |
- GC (4 Wochen alt): ein Experiment wurde
durchgeführt. Drei Versuche wurden durchgeführt.
- RC (8 Wochen alt): ein Experiment wurde durchgeführt.
Drei Versuche wurden durchgeführt.
- AC (8 Wochen alt): ein Experiment wurde durchgeführt.
Drei Versuche wurden durchgeführt.
- GC-Differenzierungs-Überstand: Überstand des
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden.
- GC-Wachstums-Überstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums,
in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert
wurden.
- RC-Differenzierungsüberstand: Überstand des
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem ruhende
Knorpelzellen kultiviert wurden.
- RC-Wachstumsüberstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums,
in dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden.
- AC-Differenzierungs-Überstand: Überstand des
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem Gelenkknorpelzellen
kultiviert wurden.
- AC-Wachstums-Überstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums,
in dem Gelenkknorpelzellen kultiviert wurden.
- Nur Differenzierungs-Medium: den Differenzierungswirkstoff erzeugendes
MEM-Medium allein.
- Nur Wachstumsmedium: MEM-Wachstumsmedium allein.
-
Es
wurde festgestellt, dass der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in dem HAM-Medium kultiviert wurden,
dem der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums zugegeben wurde, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, um das etwa 6,7-Fache des Wertes
der Maus-C3H10T1/2-Zellen zunahm, die in dem HAM-Medium kultiviert
wurden, dem nur das den Differenzierungswirkstoff erzeugende MEM-Medium
zugegeben wurde.
-
Es
wurde festgestellt, dass der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in dem HAM-Medium kultiviert wurden,
dem der Überstand des MEM-Wachstumsmediums zugegeben wurde,
in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert
wurden (Kulturüberstand), nicht zunahm. Es wurde ferner
festgestellt, dass die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in dem HAM-Medium kultiviert wurden,
dem der Überstand von jeweils dem Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium zugegeben wurde,
in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen ruhenden Knorpelzellen
oder die nicht-hypertrophierungsfähigen Gelenkknorpel-Chondrozyten
kultiviert wurden (Kulturüberstand), nicht zunahm (siehe
Tabelle 7 und 9).
-
(Beispiel 12: Hitzedenaturierung des von
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugten Wirkstoffs,
der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten
Osteoblasten induzieren kann)
-
Hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium
(enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales
Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat,
50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1
mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde
den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer
Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
(Kulturüberstand) in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage,
11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände
gesammelt. Ein Teil von jedem partiellen Überstand wurde
für 3 min in siedendem Wasser erwärmt.
-
Maus-C3H10T1/2-Zellen
wurden in einem BME-Medium bei einer Dichte von 1,25 × 104 Zellen/cm2 kultiviert.
Nach 18 h wurde dem Medium jeweils 1 ml der nicht-erwärmten
partiellen Überstände, der erwärmten partiellen Überstände
und des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums allein
zugegeben. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 gemessen.
-
Wenn
der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt
wurde, betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität
der Zellen, die durch Zugabe des nicht-erwärmten Überstands
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert
wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden, das etwa 12,8-Fache (siehe Tabelle 8 und 10).
-
Andererseits
betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der
Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des erwärmten Überstands
kultiviert wurden, das etwa 1,6-Fache (siehe Tabelle 8 und 10). Gemäß den Ergebnissen wurde
bestätigt, dass der Wirkstoff, der die Differenzierung
von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren
kann, der in dem Überstand des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums vorhanden war, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, durch die Wärmebehandlung
denaturiert (deaktiviert) wurde.
-
(Tabelle 8: Hitzedenaturierung des Wirkstoffs,
der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten
Osteoblasten induzieren kann)
-
ALP-Aktivität (Mittelwert)
| Relativer
Wert | Absoluter
Wert |
Erwärmt | 1,6 | 0,014 |
Nicht-erwärmt | 12,8 | 0,111 |
Nur
Differenzierungsmedium | 1 | 0,009 |
- 4 Wochen alt: ein Experiment wurde durchgeführt.
Drei Versuche wurden durchgeführt.
- Erwärmt: wärmebehandelter Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem
hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
- Nicht-behandelt: Überstand des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden.
- Nur Differenzierungs-Medium: den Differenzierungswirkstoff erzeugendes
MEM-Medium allein.
-
(Beispiel 13: Auswirkung der subkutanen
Implantierung eines Verbundmaterials, das unter Verwendung von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten mit der Fähigkeit zur Erzeugung eines zur
Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten fähigen
Wirkstoffs und eines biokompatiblen Gerüsts hergestellt
wurde)
-
Aus
Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium
wurde den erhaltenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
zur Herstellung einer Zellsuspension bis zu einer Verdünnung
mit einer Dichte von 1 × 106 Zellen/cm2 zugegeben. Die Zellsuspension wurde gleichmäßig
auf Collagengel, Alginsäure bzw. MatrigelTM (hergestellt
von Becton, Dickinson and Company) geimpft und anschließend
wurden die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zur Herstellung
der Verbundmaterialien in einem 5% CO2 Inkubator
bei 37°C für 1 Woche kultiviert. Bei dem Kultivieren
wurde ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium verwendet.
-
Diese
Verbundmaterialien wurden unter die dorsale Haut syngener Tiere
implantiert. 4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere
getötet und anschließend wurden die implantierten
Regionen chirurgisch entfernt und mit 10% neutralem gepuffertem
Formalin fixiert. Nachdem die implantierten Regionen röntgengrafisch
und mittels computerisierter Mikrotomographie untersucht wurden,
wurden sie in Paraffin eingebettet. Dünne Schnittproben
der implantierten Regionen wurden mit einer routinemäßigen
Vorgehensweise erzeugt und dann mit Hämatoxylin-Eosin (HE),
Toluidinblau (TB), Alcianblau (AB) und Safranin O (SO) angefärbt.
Anschließend wurde der Zustand der implantierten Regionen
bewertet.
-
Jedes
der folgenden Experimente wurde durchgeführt.
-
Röntgengraphie:
die implantierte Region wurde röntgengrafisch aus einer
senkrechten Richtung dazu bei 100 KV unter Verwendung eines computerisierten
Mikrotomographie-Geräts (”High Resolution X-ray
micro-CT scanner SKYSCAN1172”, hergestellt von TOYO Corporation)
untersucht.
-
Computerisierte
Mikrotomographie: die implantierte Region wurde röntgengrafisch
bei 100 KV unter Verwendung des gleichen Geräts wie das
vorstehende computerisierte Mikrotomographie-Gerät, während
es bei jedem 4. Grad zur Gewinnung röntgengrafischer Daten
gedreht wurde, und anschließend wurden die röntgengrafischen
Daten unter Verwendung von NRecon, die eine gebündelte
Software ist, umstrukturiert und ein dreidimensionales Bild wurde
unter Verwendung von VGStudio Max, die eine dreidimensionale Volumendarstellungssoftware
ist, erhalten.
-
HE-Färbung:
die dünne Schnittprobe wurde von Paraffin befreit und in
eine Hämatoxylin-Lösung für 5 bis 10
min eingetaucht und danach gewaschen. Nachdem die dünne
Schnittprobe eine Färbung zeigte, wurde sie in eine Eosin-Lösung
für 3 bis 5 min eingetaucht.
-
TB-Färbung:
die dünne Schnittprobe wurde von Paraffin befreit und in
eine 0,05% Toluidinblau-Lösung für 15 bis 30 min
eingetaucht.
-
AB-Färbung:
die dünne Schnittprobe wurde von Paraffin befreit und in
eine 3% Essigsäure-Lösung für 3 bis 5
min eingetaucht. Danach wurde sie in eine Alcianblau-Lösung
für 20 bis 30 min eingetaucht, gewaschen und anschließend
in eine Kernechtrot-Lösung für 10 bis 15 min eingetaucht.
-
SO-Färbung:
die dünne Schnittprobe wurde von Paraffin befreit, in eine
Eisen-Hämatoxylin-Lösung für 5 bis 15
min eingetaucht, gewaschen und danach fraktioniert (mit salzsaurem
Alkohol). Nachdem die dünne Schnittprobe eine Färbung
zeigte, wurde sie in eine 1% Essigsäure, in eine Fast-Green-Lösung
für 1 bis 5 min, in eine 1% Essigsäure und danach
in eine Safranin-O-Lösung für 3 bis 5 min eingetaucht.
-
Bei
sämtlichen Verbundmaterialien, die die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten enthielten, von denen jede mit der Fähigkeit
zur Erzeugung eines des zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten
Osteoblasten fähigen Wirkstoffs durch Kultivieren in dem
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium erhalten hat,
wurde die Osteogenese beobachtet (siehe 13 bis 24).
-
Kontrollen,
die ein Teil der zur Implantierung zu verwendenden Verbundmaterialien
waren, wurden mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert und
danach in Paraffin eingebettet. Anschließend wurde eine
dünne Schnittprobe von jeder Kontrolle hergestellt und
danach angefärbt.
-
Auf
die gleiche Art und Weise wie in diesem Beispiel wurden die Verbundmaterialien
unter Verwendung der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt, die in Beispiel 2 und 3 (Ratte), Beispiel 4 und 5 (Mensch),
Beispiel 7 (Ratte), Beispiel 9 (Maus) bzw. Beispiel 10 (Kaninchen),
hergestellt wurden, anstatt der vorstehenden hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten, und wurden danach unter die Haut von syngenen Tieren
oder immundefizienten Tieren implantiert. Auf diese Weise kann die
Auswirkung der subkutanen Implantierung jedes Verbundmaterials bewertet
werden.
-
Ferner
wurden auf die gleiche Art und Weise wie in diesem Beispiel weitere
Verbundmaterialien unter Verwendung von zum Beispiel Hydroxylapatit,
PuraMatrixTM (”catalog number 354250:
BD PuraMatrix peptide hydrogel” hergestellt von Becton, Dickinson
and Company), Collagen (Schwamm), Gelatine (Schwamm) bzw. Agarose
als biokompatible Gerüste anstatt des vorstehenden Collagengels,
der Alginsäure und des MatrigelTM hergestellt
und unter die Haut von syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren
implantiert. Auf diese Weise kann die Auswirkung der subkutanen
Implantierung jedes Verbundmaterials bewertet werden.
-
(Vergleichsbeispiel 13A: Wirkung der subkutanen
Implantierung von Verbundmaterial, das unter Verwendung von nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten und einem biokompatiblen Gerüst hergestellt
wurde)
-
Nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten, die auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel
1B (Ratte) hergestellt wurden, wurden verwendet. Die nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten wurden in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Medium oder einem MEM-Wachstumsmedium verdünnt und
anschließend wurden Verbundmaterialien auf die gleiche
Art und Weise wie in Beispiel 13 hergestellt. Als biokompatible
Gerüste wurden Collagengel, MatrigelTM (hergestellt
von Becton, Dickinson and Company) bzw. Alginsäure verwendet.
-
Diese
Verbundmaterialien wurden unter die dorsale Haut syngener Tiere
implantiert. 4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere
getötet und anschließend wurden die implantierten
Regionen chirurgisch entfernt und mit 10% neutralem gepuffertem
Formalin fixiert. Nachdem die implantierten Regionen röntgenografisch
und mittels computerisierter Mikrotomographie untersucht wurden,
wurden sie in Paraffin eingebettet. Dünne Schnittproben
der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann mit Hämatoxylin-Eosin (HE),
Toluidinblau (TB), Alcianblau (AB) und Safranin O (SO) angefärbt.
Anschließend wurde der Zustand der implantierten Regionen
bewertet.
-
Wenn
nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten verwendet wurden,
wurde keine Osteogenese in dem Verbundmaterial beobachtet, das unter
Verwendung eines beliebigen biokompatiblen Gerüsts hergestellt wurde.
Die Ergebnisse, die bei Verwendung des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums erhalten wurden, sind in 25 bis 33 gezeigt.
-
Auf
die gleiche Art und Weise wie in diesem Vergleichsbeispiel wurden
die Verbundmaterialien unter Verwendung der nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt, die in Vergleichsbeispiel 1D (Ratte),
Vergleichsbeispiel 3B (Ratte), Vergleichsbeispiel 4B (Mensch), Vergleichsbeispiel
5B (Mensch), Vergleichsbeispiel 9B (Maus) bzw. Vergleichsbeispiel
10B (Kaninchen) hergestellt wurden, anstatt der vorstehenden nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten, und wurden danach unter die Haut von syngenen Tieren oder
immundefizienten Tieren implantiert. Auf diese Weise kann die Auswirkung
der subkutanen Implantierung jedes Verbundmaterials bewertet werden.
-
Ferner
wurden auf die gleiche Art und Weise wie in diesem Vergleichsbeispiel
weitere Verbundmaterialien unter Verwendung von zum Beispiel Hydroxylapatit,
PuraMatrixTM (”catalog number 354250:
BD PuraMatrix peptide hydrogel” hergestellt von Becton,
Dickinson and Company), Collagen (Schwamm), Gelatine (Schwamm) bzw.
Agarose als biokompatible Gerüste anstatt des vorstehenden
Collagengels, des MatrigelTM und der Alginsäure
hergestellt und unter die Haut von syngenen Tieren oder immundefizienten
Tieren implantiert. Auf diese Weise kann die Auswirkung der subkutanen
Implantierung jedes Verbundmaterials bewertet werden.
-
(Vergleichsbeispiel 13B: Auswirkung der
unabhängigen subkutanen Implantierung eines Gerüsts)
-
Dieses
Vergleichsbeispiel wurde auf die gleiche Art und Weise wie Beispiel
13 mit der Ausnahme durchgeführt, dass die Gerüste
unabhängig implantiert wurden. Hydroxylapatit, Collagengel,
Alginsäure und MatrigelTM (hergestellt
von Becton, Dickinson and Company), die die Gerüste waren,
wurden unabhängig unter die Haut syngener Tiere implantiert.
Im Ergebnis wurde keine Osteogenese beobachtet (siehe 34).
-
Auf
die gleiche Art und Weise wie in diesem Vergleichsbeispiel wurden
zum Beispiel PuraMatrixTM (”catalog
number 354250: BD PuraMatrix peptide hydrogel” hergestellt
von Becton, Dickinson and Company), Collagen (Schwamm) und Gelatine
(Schwamm) unabhängig unter die Haut von syngenen Tieren
oder immundefizienten Tieren anstatt des vorstehenden Hydroxylapatits,
Collagengels, der Alginsäure und des MatrigelTM implantiert.
Auf diese Weise kann die Auswirkung jedes Gerüsts bewertet
werden.
-
(Beispiel 14: Auswirkung der subkutanen
Implantierung eines Pellets aus hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten mit der Fähigkeit zur Erzeugung eines zur
Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten fähigen
Wirkstoffs)
-
(Herstellung des Pellets aus hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten mit der Fähigkeit zur Erzeugung eines zur
Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten fähigen
Wirkstoffs)
-
Aus
Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium
wurde 5 × 105 hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten zur Herstellung einer Zellsuspension bis zu einer Verdünnung mit
einer Dichte von 5 × 105 Zellen/0,5
ml zugegeben. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert (bei 1000 Upm (170 × g)
für 5 min), um Pellets aus den hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten mit der Fähigkeit zur Herstellung des Wirkstoffs
zu bilden, die die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren
können. Diese Pellets wurden bei 37°C für
1 Woche kultiviert (siehe 35A). In
dieser Kultur wurde das den Differenzierungswirkstoff erzeugende
MEM-Medium verwendet.
-
Danach
wurden diese Pellets unter die dorsale Haut syngener Tiere implantiert.
4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere getötet
und anschließend wurden die implantierten Regionen chirurgisch entfernt
und mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert. Nachdem die
implantierten Regionen röntgenografisch und mittels computerisierter
Mikrotomographie untersucht wurden, wurden sie in Paraffin eingebettet.
-
Dünne
Schnittproben der implantierten Regionen wurden mit einer routinemäßigen
Vorgehensweise erzeugt und dann mit Hämatoxylin-Eosin (HE),
Toluidinblau (TB), Alcianblau (AB) und Safranin O (SO) auf die gleiche
Art und Weise wie in Beispiel 13 angefärbt. Anschließend
wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Wenn die
Pellets der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten mit der
Aktivität zur Erzeugung des Wirkstoffs, der die Differenzierung
zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, implantiert wurden,
wurde im Ergebnis die Osteogenese in den implantierten Regionen
beobachtet (siehe 35C, 35D, 36 und 37).
-
Auf
die gleiche Art und Weise wie in diesem Beispiel wurden die Pellets
unter Verwendung der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
hergestellt, die in Beispiel 2 und 3 (Ratte), Beispiel 4 und 5 (Mensch),
Beispiel 7 (Ratte), Beispiel 9 (Maus) bzw. Beispiel 10 (Kaninchen),
hergestellt wurden, anstatt der vorstehenden hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten, und wurden danach unter die Haut von syngenen Tieren
oder immundefizienten Tieren implantiert. Auf diese Weise kann die
Auswirkung der subkutanen Implantierung jedes Pellets bewertet werden.
-
(Vergleichsbeispiel 14A: Auswirkung der
subkutanen Implantierung eines Pellets aus nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten)
-
Nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden verwendet, die auf die gleiche Art und Weise
wie in Vergleichsbeispiel 1B (Ratte) erhalten wurden. Ein den Differenzierungswirkstoff
erzeugendes MEM-Medium wurde 5 × 105 nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten zur Herstellung einer Zellsuspension bis zu einer Verdünnung
mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen/0,5
ml zugegeben. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert (bei 1000 Upm
(170 × g) für 5 min), um Pellets aus den nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten zu bilden. Diese Pellets wurden bei 37°C für
1 Woche kultiviert (siehe 35B).
-
Danach
wurden diese Pellets unter die dorsale Haut syngener Tiere implantiert.
Ferner wurde die Auswirkung der Implantierung des Pellets aus den
nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in jeder implantierten
Region auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 14 beobachtet.
Im Ergebnis wurde keine Osteogenese in den implantierten Regionen
beobachtet (35E, 35F und 38).
-
Auf
die gleiche Art und Weise wie in diesem Vergleichsbeispiel wurden
die Pellets unter Verwendung der nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellt, die in Vergleichsbeispiel 1D (Ratte),
Vergleichsbeispiel 3B (Ratte), Vergleichsbeispiel 4B (Mensch), Vergleichsbeispiel
5B (Mensch), Vergleichsbeispiel 9B (Maus) bzw. Vergleichsbeispiel
10B (Kaninchen) hergestellt wurden, anstatt der vorstehenden nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten. Danach wurden diese Pellets unter die Haut von syngenen
Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert. Nach der Implantierung
kann die Auswirkung der Implantierung des Pellets aus den nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten in jeder implantierten Region auf die gleiche Art und Weise
wie in Beispiel 14 beobachtet werden.
-
(Beispiel 15: Verhältnis zwischen
Wirkstoff, der die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren kann
und von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt
wird, und BMP oder TGFβ)
-
Aus
Ratten-Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend
essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum),
10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml
Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin
und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von
4 × 104 Zellen/cm2 zugegeben.
-
Die
hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert
und anschließend wurde ein Überstand des Mediums
in einer Zeitspanne gesammelt. Die TGFβ- und BMP-Assays
des Überstands wurden wie folgt durchgeführt und
die TGFβ- und BMP-Aktivitäten wurden durch Messung
der alkalischen Phosphatase-Aktivität nachgewiesen.
-
(TGFβ-Assay)
-
Der
TGFβ-Assay des Überstands wurde unter Verwendung
eines Verfahrens durchgeführt, das in Nagano, T.
et al.: Effect of heat treatment an bioactivities of enamel matrix
derivatives in human periodontal ligament (HPDL) cells. J. Periodont.
Res., 39: 249–256, 2004, beschrieben ist. HPDL-Zellen
wurden in eine 96-Well-Platte bei einer Dichte von 5 × 104 Zellen/Vertiefung geimpft und für
24 h kultiviert. Danach wurde das Kulturmedium durch ein Medium,
das 10 nM 1α,25-Dihydroxy-Vitamin D3 enthielt, und den Überstand
als Testprobe ersetzt.
-
Danach
wurden die HPDL-Zellen für 96 h kultiviert, mit PBS gewaschen
und anschließend wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
davon gemessen. Spezifisch wurden die HPDL-Zellen mit 10 mM p-Nitrophenylphosphat
als Substrat in einem 100 mM 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol-Salzsäure-Puffer
(pH 10,0), enthaltend 5 mM MgCl2, bei 37°C
für 10 min umgesetzt. Danach wurde dem Puffer NaOH zugegeben
und die Extinktion bei 405 nm gemessen.
-
Wenn
der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden (Kulturüberstand), der 96-Well-Platte
als Testprobe zugegeben wurde, betrug die Extinktion etwa 0,1515,
etwa 0,2545 und etwa 0,1242 (siehe Tabelle 9 und
11A). (Tabelle 9: TGFβ-Aktivität)
| 405
nm (OD) | SA |
1 | 0,1515 | 0,01818 |
2 | 0,2545 | 0,00303 |
3 | 0,1242 | 0,03030 |
-
(BMP-Assay)
-
Der
BMP-Assay des Überstands wurde unter Verwendung eines Verfahrens
durchgeführt, das in Iwata, T. et al.: Noggin Blocks
Osteoinductive Activity of Porcine Enamel Extracts. J. Dent. Res.,
81: 387–391, 2002, beschrieben ist. ST2-Zellen
wurden in eine 96-Well-Platte bei einer Dichte von 5 × 104 Zellen/Vertiefung geimpft und für
24 h kultiviert. Danach wurde das Kulturmedium durch ein Medium,
das 200 nM all-trans-Retinolsäure enthielt, und den Überstand
als Testprobe ersetzt.
-
Danach
wurden die ST2-Zellen für 72 h kultiviert, mit PBS gewaschen
und anschließend wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität
davon gemessen. Spezifisch wurden die ST2-Zellen mit 10 mM p-Nitrophenylphosphat
als Substrat in einem 100 mM 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol-Salzsäure-Puffer
(pH 10,0), enthaltend 5 mM MgCl2, bei 37°C
für 8 min umgesetzt. Danach wurde dem Puffer NaOH zugegeben
und die Extinktion bei 405 nm gemessen.
-
Wenn
der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden, der 96-Well-Platte als Testprobe zugegeben wurde, betrug
die Extinktion etwa 0,05, etwa 0,075 und etwa 0,075 (siehe Tabelle
10 und
11B). (Tabelle 10: BMP-Aktivität)
| 405
nm (OD) | SA |
1 | 0,0500 | 0,0188 |
2 | 0,0750 | 0,0125 |
3 | 0,0750 | 0,0063 |
-
Die
TGFβ-Aktivität wurde in dem Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums beobachtet,
das einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff enthielt. Es wurde belegt, das TGFβ in diesem Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums vorhanden
war (siehe 11A). Andererseits wurde die
BMP-Aktivität nur mäßig beobachtet (siehe 11B).
-
Obwohl
der BMP-Pfad bei Vorhandensein von TGFβ unterdrückt
wird, stieg die alkalische Phosphatase-Aktivität der Zellen,
sogar wenn der Überstand des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums, enthaltend das TGFβ, den Zellen zugegeben
wurde. Gemäß dem Ergebnis wird angenommen, dass
die Steigerung der alkalischen Phosphatase-Aktivität der
Zellen durch den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff induziert wurde, der nicht das BMP war.
-
(Beispiel 16: Auswirkung des von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten erzeugten Wirkstoffs auf Pellets, die aus undifferenzierten
Zellen gebildet wurden)
-
Ein Überstand
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in
dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden,
wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten.
5 × 105 Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”,
hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden zur Bildung
der Pellets bei 1.000 Upm (170 × g) für 3 bis
5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und anschließend wurden
die Pellets für 1 Woche kultiviert.
-
Bei
dieser Kultur wurde ein BME-Medium, dem der Überstand des
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums zugegeben wurde,
in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert
wurden, wurde auf die gleiche Art und Weise wie Beispiel 1 hergestellt
und verwendet.
-
(Verfahren zur Bildung einer subkutanen
Tasche)
-
Jedes
der zur Implantierung vorgesehenen syngenen Tiere oder immundefizienten
Tiere wurde betäubt und die Haut zur Bildung einer offenen
Wunde aseptisch eingeschnitten. Eine Rundschere wurde subkutan durch
die offene Wunde eingeführt, um die Haut von dem subkutanen
Gewebe zu trennen. Auf diese Weise wurde eine subkutane Tasche in
jedem Tier gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Jedes
der zur Implantierung vorgesehenen syngenen Tiere oder immundefizienten
Tiere wurde betäubt. Anschließend wurde die Haut über
dem Femur oder der Tibia aseptisch eingeschnitten und danach wurde
ein kartilaginäres Gewebe weggeklappt, um die vorgesehene
Region mit Knochendefekt zu exponieren, oder die Haut über
dem Schädel wurde eingeschnitten, um die vorgesehene Region
mit Knochendefekt zu exponieren. Eine perforative oder disjunktive
Region mit Knochendefekt wurde in jedem Tier unter Verwendung einer
Bohrstange oder -scheibe eines Dentalbohrers gebildet.
-
(Implantierung eines Pellets)
-
(Subkutane Implantierung)
-
Subkutane
Taschen mit einem Durchmesser von 1 bis 2 cm wurden unter der dorsalen
Haut von jeweils drei 8 Wochen alten männlichen C3H-Mäusen
(gezüchtet von CLEA Japan, Inc.) unter Verwendung des vorstehend
beschriebenen Verfahrens gebildet. Die in diesem Beispiel hergestellten
Pellets (Zellpellets) wurden unter die dorsale Haut jeder C3H-Maus
implantiert. 4 Wochen nach Implantierung wurden die implantierten
Regionen und die Peripherie davon chirurgisch entfernt. Danach wurde
eine osteogene Fähigkeit der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die
jedes Pellet bildeten, durch Messung mittels computerisierter Mikrotomographie und
Herstellung von Präparaten bewertet.
-
Die
Osteogenese in den drei C3H-Mäusen (Nummer 1 bis 3) wurde
auf einer oder auf einer anderen Stufe induziert. Spezifisch wiesen
die Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in dem Medium kultiviert wurden,
dem der Überstand mit dem Wirkstoff zugegeben wurde, eine
ektopische osteogene Fähigkeit auf (Fähigkeit
zur subkutanen Knochenbildung) (siehe 12A bis 12C).
-
(Implantierung in eine Region mit Knochendefekt)
-
Die
in diesem Beispiel hergestellten Pellets wurden bei syngenen Tieren
oder immundefizienten Tieren in die Regionen mit Knochendefekt implantiert
und anschließend wurde die osteogene Fähigkeit
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, aus denen jedes Pellet bestand, bewertet.
-
Ferner
wurde das gleiche Experiment für den die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff durchgeführt,
der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird,
die in Beispiel 2 und 3 (Ratte), Beispiel 4 und 5 (Mensch), Beispiel
7 (Ratte), Beispiel 9 (Maus) bzw. Beispiel 10 (Kaninchen) hergestellt
wurden. Anschließend wurde die osteogene Fähigkeit
der Maus-C3H10T1/2-Zellen, aus denen jedes Pellet bestand, durch
Messung mittels computerisierter Mikrotomographie und Herstellung
von Präparaten bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 16A)
-
Dieses
Vergleichsbeispiel wurde auf die gleiche Art und Weise wie Beispiel
16 mit der Ausnahme durchgeführt, dass die aus Maus-C3H10T1/2-Zellen
gebildeten Pellets in einem Medium kultiviert wurden, dem ein Überstand
eines Wachstumsmediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden (Überstand ohne die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), anstatt des Mediums,
dem der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden (Überstand mit dem die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), zugegeben wurde.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
16 gebildet.
-
(Implantierung eines Pellets)
-
Die
in diesem Vergleichsbeispiel hergestellten Pellets (Zellpellets)
wurden unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert.
Anschließend wurde die osteogene Fähigkeit der
Maus-C3H10T1/2-Zellen bewertet, aus denen jedes Pellet bestand und
die in dem Medium kultiviert wurden, dem der Überstand ohne
den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff
zugegeben wurde.
-
(Vergleichsbeispiel 16B)
-
Dieses
Vergleichsbeispiel wurde auf die gleiche Art und Weise wie Beispiel
16 mit der Ausnahme durchgeführt, dass die aus Maus-C3H10T1/2-Zellen
gebildeten Pellets in einem Medium kultiviert wurden, dem ein Überstand
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, in dem
die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert
wurden (Überstand ohne die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), anstatt des Mediums, dem
der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden (Überstand mit dem die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), zugegeben wurde.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
16 gebildet.
-
5 × 105 Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”,
hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden zu Pellets
geformt und anschließend wurden die Pellets für
1 Woche in einem Medium kultiviert, dem ein Überstand eines
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums zugegeben wurde,
in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden. Diese Pellets wurden unter die dorsale Haut jeder
in Beispiel 16 verwendeten C3H-Maus (Nummer 1 bis 3) implantiert.
-
4
Wochen nach Implantierung wurden die Pellets chirurgisch entfernt
und dann wurden die entfernten Pellets röntgengrafisch
untersucht. Da ein Schatten in jeder Röntgenaufnahme der
Pellets beobachtet wurde, die aus der C3H-Maus Nummer 1 entfernt
wurden, wurden die Pellets mittels computerisierter Mikrotomographie
untersucht (siehe 12D). Da andererseits kein
Schatten in den Röntgenaufnahmen der Pellets beobachtet
wurden, die aus der C3H-Maus Nummer 2 und 3 entfernt wurden (siehe 12E), wurden die Pellets nicht mittels computerisierter
Mikrotomographie untersucht.
-
Es
wurde bestätigt, dass die in dem Medium kultivierten Maus-C3H10T1/2-Zellen,
dem der Überstand ohne den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff zugegeben wurde, keine ektopische
osteogene Fähigkeit aufwiesen.
-
Die
in diesem Vergleichsbeispiel hergestellten Pellets wurden in die
Regionen mit Knochendefekt implantiert und anschließend
wurde die osteogene Fähigkeit der Maus-C3H10T1/2-Zellen,
aus denen jedes Pellet bestand, bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 16C)
-
Dieses
Vergleichsbeispiel wurde auf die gleiche Art und Weise wie Beispiel
16 mit der Ausnahme durchgeführt, dass die aus Maus-C3H10T1/2-Zellen
gebildeten Pellets in einem Medium kultiviert wurden, dem nur ein
den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium oder ein Wachstumsmedium
anstatt des Mediums, dem der Überstand des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden (Überstand mit dem die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), zugegeben wurde.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
16 gebildet.
-
(Implantierung eines Pellets)
-
Die
in diesem Vergleichsbeispiel hergestellten Pellets (Zellpellets)
wurden unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert.
Anschließend wurde die osteogene Fähigkeit der
Maus-C3H10T1/2-Zellen bewertet, aus denen jedes Pellet bestand und
die in dem Medium kultiviert wurden, dem nur das den Differenzierungswirkstoff
erzeugende Medium oder Wachstumsmedium zugegeben wurde.
-
(Beispiel 17: Auswirkung der Implantierung
eines Verbundmaterials, das unter Verwendung von induzierten Osteoblasten,
die von dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff induziert wurden, und eines biokompatiblen Gerüsts
hergestellt wurde, unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt)
-
(Herstellung von Verbundmaterialien)
-
In
diesem Beispiel wurde ein BEM-Medium verwendet, dem ein Überstand
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums zugegeben
wurde, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden, die in Beispiel 1 bis 3 (Ratte), Beispiel 4 und
5 (Mensch), Beispiel 7 (Ratte), Beispiel 9 (Maus) bzw. Beispiel
10 (Kaninchen) hergestellt wurden (Überstand mit dem die
Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff).
-
Die
Verbundmaterialien wurden hergestellt, indem Maus-C3H10T1/2-Zellen
(”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo
Pharma Co. Ltd.) auf in Tabelle 11 angeführte Gerüste
geimpft wurden. Die Verbundmaterialien wurden für 1 Woche
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Bei diesem Kultivieren, als eine Kulturlösung,
wurde das BEM-Medium, dem der Überstand mit dem vorliegenden
Wirkstoff zugegeben wurde, wie vorstehend beschrieben verwendet.
Auf die gleiche Art und Weise und mit den gleichen Kriterien wie
in Beispiel 1 kann bestätigt werden, ob die Maus-C3H10T1/2-Zellen
auf den Gerüsten zu induzierten Osteoblasten induziert
werden.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Jedes
der zur Implantierung vorgesehenen syngenen Tiere oder immundefizienten
Tiere wurde betäubt und die Haut zur Bildung einer offenen
Wunde aseptisch eingeschnitten. Eine Rundschere wurde subkutan durch
die offene Wunde eingeführt, um die Haut von dem subkutanen
Gewebe zu trennen. Auf diese Weise wurde eine subkutane Tasche in
jedem Tier gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Jedes
der zur Implantierung vorgesehenen syngenen Tiere oder immundefizienten
Tiere wurde betäubt. Anschließend wurde die Haut über
dem Femur oder der Tibia aseptisch eingeschnitten und danach wurde
ein kartilaginäres Gewebe weggeklappt, um die vorgesehene
Region mit Knochendefekt zu exponieren, oder die Haut über
dem Schädel wurde eingeschnitten, um die vorgesehene Region
mit Knochendefekt zu exponieren. Eine perforative oder disjunktive
Region mit Knochendefekt wurde in jedem Tier unter Verwendung einer
Bohrstange oder -scheibe eines Dentalbohrers gebildet.
-
(Implantierung von Verbundmaterialien)
-
Die
Verbundmaterialien wurden unter die Haut und in die Regionen mit
Knochendefekt bei syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert.
4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere oder immundefizienten
Tiere getötet. Anschließend wurden die implantierten
Regionen chirurgisch entfernt, mit 10% neutralem gepuffertem Formalin
fixiert und danach in Paraffin eingebettet.
-
Dünne
Schnittproben der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann
mit HE-Färbung angefärbt. Anschließend
wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Bei jedem
Verbundmaterial, das die induzierten Chondrozyten enthielt, die
von dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff
induziert wurden, und unter die Haut und in die Regionen mit Knochendefekt
implantiert wurde, wurde eine osteogene Fähigkeit der Maus-C3H10T1/2-Zellen
bewertet. (Tabelle 11)
Gerüst | Zusammensetzung |
Poröses
Hydroxylapatit | ”APACERAM
mit Porosität 50%”, hergestellt von HOYA CORPORATION |
Super-poröses
Hydroxylapatit | ”APACERAM
mit Porosität 85%”, hergestellt von HOYA CORPORATION |
Super-poröses
Hydroxylapatit | ”3D
Scaffold”, hergestellt von BD Corporation |
Apatit-Collagen-Gemisch | ”APACERAM
GRANULE”, hergestellt von HOYA CORPORATION + ”Collagen
Gel”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc. |
Apatit-Collagen-Komplex | ”APACOLLA”,
hergestellt von HOYA CORPORATION |
Collagen-Gel | ”Collagen
Gel”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc. |
Collagen-Schwamm | ”Collagen
Sponge”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc. |
Gelatine-Schwamm | ”Hemostatic
Gelatin Sponge”, hergestellt von Yamanouchi Pharmaceutical
Co., Ltd. |
Fibrin-Gel | ”Beriplast
P”, hergestellt von Nipro |
Synthetisches
Peptid | ”Pramax”,
hergestellt von 3D Matrix Corporation |
Gemisch
aus extrazellulärer Matrix | ”Matrigel,
hergestellt von BD Corporation |
Alginat | ”Kelton
LVCR”, hergestellt von Kelco Corporation |
Agarose | ”Agarose”,
hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. |
Polyglycolsäure | ”Polyglycolsäure”,
hergestellt von COREFRONT Corporation |
Polymilchsäure | ”Polymilchsäure”,
hergestellt von COREFRONT Corporation |
Polyglycolsäure-Polymilchsäure-Copolymer | ”Polyglycolsäure-Polymilchsäure-Copolymer”,
hergestellt von COREFRONT Corporation |
-
(Vergleichsbeispiel 17A: Auswirkung der
Implantierung eines Verbundmaterials, das unter Verwendung von undifferenzierten
Zellen, die in einem Medium ohne den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff kultiviert wurden, und eines
biokompatiblen Gerüsts hergestellt wurde, unter die Haut
und in Regionen mit Knochendefekt)
-
(Herstellung von Verbundmaterialien)
-
In
diesem Vergleichsbeispiel wurde ein BME-Medium verwendet, dem ein Überstand
eines Wachstumsmediums zugegeben wurde, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, die in Beispiel 1 bis 3 (Ratte),
Beispiel 4 und 5 (Mensch), Beispiel 7 (Ratte), Beispiel 9 (Maus)
bzw. Beispiel 10 (Kaninchen) hergestellt wurden (Überstand
ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff).
-
Die
Verbundmaterialien wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
17 hergestellt, indem Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”,
hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) auf in Tabelle
11 angeführte Gerüste geimpft wurden. Die Verbundmaterialien
wurden für 1 Woche in einem 5% CO2 Inkubator bei
37°C kultiviert. Bei diesem Kultivieren, als eine Kulturlösung,
wurde das BEM-Medium, dem der Überstand ohne den vorliegenden
Wirkstoff zugegeben wurde, wie vorstehend beschrieben verwendet.
Auf die gleiche Art und Weise und mit den gleichen Kriterien wie
in Beispiel 1 kann bestätigt werden, ob die Maus-C3H10T1/2-Zellen
auf den Gerüsten zu induzierten Osteoblasten induziert
werden.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 17
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
17 gebildet.
-
(Implantierung von Verbundmaterialien)
-
Die
Verbundmaterialien wurden unter die Haut und in die Regionen mit
Knochendefekt bei syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert.
4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere oder immundefizienten
Tiere getötet. Anschließend wurden die implantierten
Regionen chirurgisch entfernt, mit 10% neutralem gepuffertem Formalin
fixiert und danach in Paraffin eingebettet.
-
Dünne
Schnittproben der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann
mit HE-Färbung angefärbt. Anschließend
wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Bei jedem
Verbundmaterial, das unter die Haut und in die Regionen mit Knochendefekt
implantiert wurde, wurde eine osteogene Fähigkeit der Maus-C3H10T1/2-Zellen
bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 17B: Auswirkung der
Implantierung eines Verbundmaterials, das unter Verwendung von undifferenzierten
Zellen, die in einem Medium ohne den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff kultiviert wurden, und eines
biokompatiblen Gerüsts hergestellt wurde, unter die Haut
und in Regionen mit Knochendefekt)
-
(Herstellung von Verbundmaterialien)
-
In
diesem Vergleichsbeispiel wurde ein BME-Medium verwendet, dem ein Überstand
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums zugegeben
wurde, in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden, die in Vergleichsbeispiel 1B (Ratte), Vergleichsbeispiel
1D (Ratte), Vergleichsbeispiel 3B (Ratte), Vergleichsbeispiel 4B
(Mensch), Vergleichsbeispiel 5B (Mensch), Vergleichsbeispiel 9B (Maus)
bzw. Vergleichsbeispiel 10B (Kaninchen) hergestellt wurden (Überstand
ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff).
-
Die
Verbundmaterialien wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
17 hergestellt, indem Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”,
hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) auf in Tabelle
11 angeführte Gerüste geimpft wurden. Die Verbundmaterialien
wurden für 1 Woche in einem 5% CO2 Inkubator bei
37°C kultiviert. Bei diesem Kultivieren, als eine Kulturlösung,
wurde das BEM-Medium, dem der Überstand ohne den vorliegenden
Wirkstoff zugegeben wurde, wie vorstehend beschrieben verwendet.
Auf die gleiche Art und Weise und mit den gleichen Kriterien wie
in Beispiel 1 kann bestätigt werden, ob die Maus-C3H10T1/2-Zellen
auf den Gerüsten zu induzierten Osteoblasten induziert
werden.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 17
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
17 gebildet.
-
(Implantierung von Verbundmaterialien)
-
Die
Verbundmaterialien wurden unter die Haut und in die Regionen mit
Knochendefekt bei syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert.
4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere oder immundefizienten
Tiere getötet. Anschließend wurden die implantierten
Regionen chirurgisch entfernt, mit 10% neutralem gepuffertem Formalin
fixiert und danach in Paraffin eingebettet.
-
Dünne
Schnittproben der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann
mit HE-Färbung angefärbt. Anschließend
wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Bei jedem
Verbundmaterial, das unter die Haut und in die Regionen mit Knochendefekt
implantiert wurde, wurde eine osteogene Fähigkeit der Maus-C3H10T1/2-Zellen
bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 17C: Auswirkung der
Implantierung eines Verbundmaterials, das unter Verwendung von undifferenzierten
Zellen, die in einem Medium ohne den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff kultiviert wurden, und eines
biokompatiblen Gerüsts hergestellt wurde, unter die Haut
und in Regionen mit Knochendefekt)
-
(Herstellung von Verbundmaterialien)
-
Die
Verbundmaterialien wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
17 hergestellt, indem Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”,
hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) auf in Tabelle
11 angeführte Gerüste geimpft wurden. Die Verbundmaterialien
wurden für 1 Woche in einem 5% CO2 Inkubator bei
37°C kultiviert. Bei diesem Kultivieren, als eine Kulturlösung,
wurde ein Medium verwendet, dem nur das den Differenzierungswirkstoff
erzeugende Medium oder Wachstumsmedium zugegeben wurde. Auf die
gleiche Art und Weise und mit den gleichen Kriterien wie in Beispiel
1 kann bestätigt werden, ob die Maus-C3H10T1/2-Zellen auf
den Gerüsten zu induzierten Osteoblasten induziert werden.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 17
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
17 gebildet.
-
(Implantierung von Verbundmaterialien)
-
Die
Verbundmaterialien wurden unter die Haut und in die Regionen mit
Knochendefekt bei syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert.
4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere oder immundefizienten
Tiere getötet. Anschließend wurden die implantierten
Regionen chirurgisch entfernt, mit 10% neutralem gepuffertem Formalin
fixiert und danach in Paraffin eingebettet.
-
Dünne
Schnittproben der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann
mit HE-Färbung angefärbt. Anschließend
wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Bei jedem
Verbundmaterial, das unter die Haut und in die Regionen mit Knochendefekt
implantiert wurde, wurde eine osteogene Fähigkeit davon
bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 17D: Auswirkung der
unabhängigen Implantierung eines Gerüsts unter
die Haut und in Regionen mit Knochendefekt)
-
Die
in Tabelle 11 angeführten Gerüste wurden bei syngenen
Tieren oder immundefizienten Tieren auf die gleiche Art und Weise
wie in Beispiel 17 unabhängig unter die Haut und in Regionen
mit Knochendefekt implantiert. In jedem Gerüst, das unter
die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert wurde, wurde die osteogene
Fähigkeit der Maus-C3H10T1/2-Zellen bewertet.
-
(Beispiel 18: Vergleich zwischen induzierten
Osteoblasten, die durch den die Differenzierung induzierter Osteoblasten
induzierenden Wirkstoff induziert wurden, und natürlichen
Osteoblasten)
-
(Pellets aus induzierten Osteoblasten,
die durch den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff induziert wurden)
-
Dieses
Beispiel wurde auf die gleiche Art und Weise wie Beispiel 16 durchgeführt. Maus-C3H10T1/2-Zellen
wurden zu Pellets geformt und anschließend wurden die Pellets
für 1 Woche in einem Medium kultiviert, dem ein Überstand
mit dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff
zugegeben wurde, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
erzeugt wurde. Auf diese Weise wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen
zu induzierten Osteoblasten induziert.
-
Zur
Bildung der Pellets (Zellpellets) wurden die induzierten Osteoblasten
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16 zentrifugiert.
Im Ergebnis wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen zu Pellets geformt.
-
(Verbundmaterialien, die unter Verwendung
von induzierten Chondrozyten, die durch den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff induziert wurden, und eines
biokompatiblen Gerüsts hergestellt wurden)
-
Die
Verbundmaterialien wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
17 hergestellt und anschließend unter die Haut und in Regionen
mit Knochendefekt implantiert. Bei jedem Verbundmaterial, das unter
die Haut und in die Regionen mit Knochendefekt implantiert wurde,
wurde eine osteogene Fähigkeit der Maus-C3H10T1/2-Zellen
bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 18A: Pellet aus natürlichen
Osteoblasten)
-
(Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung
von Osteoblasten)
-
Die
Calvarien neugeborener Ratten wurden entnommen. Die Calvarien wurden
mit DPBSA (phosphathaltige Pufferlösung nach Dulbecco)
gewaschen, nachdem sie von Bindegewebe befreit wurden. Diese Calvarien
wurden zerkleinert und anschließend in ein Gefäß mit
Rührer gegeben. Anschließend wurde nach Filtersterilisation
0,1% Collagenase/DPBS in das Gefäß geleitet und
bei 37°C für 90 min zur Kultivierung der zerkleinerten
Calvarien gerührt.
-
Danach
wurden die Zellen unter Verwendung eines Zellsiebs filtriert, mit
einem Medium (MEM) gewaschen, in ein Kulturgefäß geimpft
und anschließend in einem 5% CO2 Inkubator
kultiviert.
-
(Herstellung von Pellets)
-
Zur
Bildung der Pellets (Zellpellets) wurden die Osteoblasten auf die
gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16 zentrifugiert. Danach wurde
bewertet, ob die Pellets gebildet wurden.
-
(Vergleichsbeispiel 18B: Verbundmaterialien,
die unter Verwendung natürlicher Osteoblasten und eines
biokompatiblen Gerüsts hergestellt wurden)
-
Die
Verbundmaterialien wurden in diesem Vergleichsbeispiel unter Verwendung
der gewonnenen natürlichen Osteoblasten auf die gleiche
Art und Weise wie in Beispiel 17 hergestellt. Diese Verbundmaterialien wurden
bei syngenen Tieren oder immundefiziente Tieren unabhängig
unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert. Bei
jedem Verbundmaterial, das unter die Haut und in die Regionen mit
Knochendefekt implantiert wurde, wurde eine osteogene Fähigkeit
der natürlichen Osteoblasten bewertet.
-
(Beispiel 19: Auswirkung des die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs auf undifferenzierte
Zellen aus Ratten-Knochenmark)
-
(Herstellung des die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten erzeugt wird)
-
Die
Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoffe
wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 bis 3 (Ratte),
Beispiel 4 und 5 (Mensch), Beispiel 7 (Ratte), Beispiel 9 (Maus)
bzw. Beispiel 10 (Kaninchen) hergestellt.
-
(Herstellung undifferenzierter Zellen
aus Ratten-Knochenmark)
-
Die
Femora wurden Ratten entnommen, das Bindegewebe wurde davon entfernt
und anschließend wurden beide Epiphysenregionen davon entfernt.
Ein Medium wurde in eine Spritze gegeben und anschließend
in beide Femora von beiden Enden über eine Nadel der Spritze
eingespritzt, so dass das Knochenmark darin mit dem Medium ausgespült
wurde. Auf diese Weise wurde eine gemischte Zelllösung
erhalten. Als das Medium wurde ein MEM-Medium verwendet, das 15%
FBS enthielt.
-
Die
erhaltene gemischte Zelllösung wurde pipettiert, in T-75-Kolben
in einer Menge entsprechend einem Femur pro T-75-Kolben geimpft
und danach in einem CO2 Inkubator bei 37°C
kultiviert. Eine Hälfte jedes Mediums wurde dreimal pro
Woche durch ein neues Medium ersetzt. 7 bis 10 Tage nach dem Kultivieren
wurden die an den T-75-Kolben anhaftenden Zellen mit einer 0,05%
Trypsin-EDTA-Lösung entfernt, um eine Kultur zu erhalten.
-
Ein Überstand,
das jeden der in diesem Beispiel hergestellten die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffe enthielt, wurde
einem Medium zugegeben, das die Kultur der aus Ratten-Knochenmark
stammenden undifferenzierten Zellen enthielt, und anschließend
wurde die Kultur weiter kultiviert. Danach wurde bei jedem der die
Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffe
die Fähigkeit zur Induzierung der aus Ratten-Knochenmark
stammenden undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 bewertet.
-
Aus
Knochenmark stammende undifferenzierte Zellen wurden unter Verwendung
eines herkömmlichen Verfahrens zu Osteoblasten induziert
und die induzierten Osteoblasten wurden verwendet. Spezifisch wurden
die undifferenzierten Stammzellen aus Knochenmark von Rattenoberschenkeln
gemäß einem Verfahren gewonnen, das in Maniatopoulos
et al., Cell Tissue Res., 254: 317–330, 1988,
beschrieben ist. Danach wurden diese undifferenzierten Stammzellen
bei 170 bis 200 × g für 3 bis 5 min zur Bildung
von Pellets zentrifugiert, und anschließend wurden die
Pellets in einem Medium, das von Maniatopoulos vorgeschlagen wurde (hierin
als ein ”Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium” bezeichnet),
in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
für 2 Wochen zur Induzierung der Osteoblasten (Bp) kultiviert.
Diese Osteoblasten (Bp) wurden verwendet.
-
Eine
Echtzeit-PCR wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 durchgeführt und jeder Zell-Marker wurde unter Verwendung
eines Echtzeit-PCR-Geräts (”PRISM 7900HT”,
hergestellt von Applied Biosystems, Inc.) gemessen. Nach Abschluss
der PCR wurden das Festsetzen der Grenzwerte und das Berechnen der
Leistungszyklen unter Verwendung der analytischen Software, die
mit dem Gerät (”PRISM 7900HT”) bereitgestellt
wurde, durchgeführt.
-
Die
Expressionsniveaus jedes Zell-Markers wurden durch das Expressionsniveau
von GAPDH zur Berechnung von Korrekturwerten geteilt und anschließend
wurde ein mittleres Expressionsniveau durch Mittelung der Korrekturwerte
erhalten. Im Ergebnis exprimierten die nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten Typ-II-Collagen und Aglycan, exprimierten jedoch keine
alkalische Phosphatase und kein Osteocalcin (siehe Vergleichsbeispiel
1B und Table II).
-
Andererseits
exprimierten unter Verwendung des herkömmlichen Verfahrens
die aus den undifferenzierten Zellen induzierten Osteoblasten, die
aus Knochenmark stammten, alkalische Phosphatase und Osteocalcin,
exprimierten jedoch kein Typ-II-Collagen und Aglycan (Tabelle III).
-
(Tabelle III)
-
Alkalische Phosphatase
| Niveau (Korrekturwert
mit GAPDH) Durchschnittswert |
Probe | 1 | 2 | 3 | gemittelt |
Bp | 0,0815 | 0,0776 | 0,0839 | 0,0810 |
Typ-II-Collagen
| Niveau (Korrekturwert
mit GAPDH) Durchschnittswert |
Probe | 1 | 2 | 3 | gemittelt |
Bp | 0,0000 | 0,0000 | 0,0000 | 0,0000 |
Aglycan
| Niveau (Korrekturwert
mit GAPDH) Durchschnittswert |
Probe | 1 | 2 | 3 | gemittelt |
Bp | 0,0010 | 0,0009 | 0,0013 | 0,0011 |
Osteocalcin
| Niveau (Korrekturwert
mit GAPDH) Durchschnittswert |
Probe | 1 | 2 | 3 | gemittelt |
Bp | 0,7282 | 0,7136 | 1,1064 | 0,8494 |
- Bp: Pellet aus undifferenzierten Stammzellen,
aus Femur-Knochenmark gewonnen und in Osteoblasten-Differenzierungsmedium
kultiviert
-
(Vergleichsbeispiel 19A: Auswirkung eines Überstands
ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff auf aus Ratten-Knochenmark stammende undifferenzierte
Zellen)
-
Dieses
Vergleichsbeispiel wurde auf die gleiche Art und Weise wie Beispiel
19 mit der Ausnahme durchgeführt, dass ein Überstand
eines Wachstumsmediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden (Überstand ohne die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), dem Medium anstatt
des Überstands, enthaltend den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff, zugegeben wurde. Der Überstand
ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff wurde dem Medium zugegeben, das die Kultur der aus Rattenknochenmark
stammenden undifferenzierten Zellen enthielt, und anschließend
wurde die Kultur weiter kultiviert.
-
Danach
wurde die Auswirkung eines Überstands des Wachstumsmediums,
in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert
wurden (Überstand ohne den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff) auf aus Ratten-Knochenmark
stammende undifferenzierte Zellen auf die gleiche Art und Weise
wie in Beispiel 1 bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 19B: Auswirkung eines Überstands
ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff auf aus Ratten-Knochenmark stammende undifferenzierte
Zellen)
-
Nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden verwendet, die in Vergleichsbeispiel 1B (Ratte), Vergleichsbeispiel
1D (Ratte), Vergleichsbeispiel 3B (Ratte), Vergleichsbeispiel 4B
(Mensch), Vergleichsbeispiel 5B (Mensch), Vergleichsbeispiel 9B
(Maus) bzw. Vergleichsbeispiel 10B (Kaninchen) hergestellt wurden. Ein Überstand
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, in dem
die in jedem Vergleichsbeispiel hergestellten Zellen kultiviert
wurden (Überstand ohne den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), wurde dem Medium zugegeben,
das die Kultur der aus Ratten-Knochenmark stammenden undifferenzierten
Zellen enthielt, und danach wurde die Kultur weiter kultiviert.
-
Danach
wurde die Auswirkung des Überstands des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums, in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden (Überstand ohne den die
Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff)
auf aus Ratten-Knochenmark stammende undifferenzierte Zellen auf
die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 19C: Auswirkung des
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums oder Wachstumsmediums
auf aus Ratten-Knochenmark stammende undifferenzierte Zellen)
-
Auf
aus Ratten-Knochenmark stammende undifferenzierte Zellen wurden
in einem Medium kultiviert, dem kein Überstand mit dem
die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff,
sondern nur ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium
oder Wachstumsmedium zugegeben wurde. Danach wurde die Auswirkung
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums oder Wachstumsmediums
auf aus Ratten-Knochenmark stammende undifferenzierte Zellen auf
die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 bewertet.
-
(Beispiel 20: Auswirkung des von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten hergestellten Wirkstoffs auf Pellets undifferenzierter
Zellen aus Ratten-Knochenmark)
-
Ratten-Knochenmarkzellen
wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 19 gewonnen.
Diese Ratten-Knochenmarkzellen wurden zur Bildung von Pellets zentrifugiert,
und anschließend wurden die Pellets für 1 Woche
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16 kultiviert. In
dieser Kultur wurde ein Überstand eines den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden (Überstand mit dem die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), einem Medium
zugegeben. Hier wurde der Überstand auf die gleiche Art
und Weise wie in Beispiel 1 bis 3 (Ratte), Beispiel 4 und 5 (Mensch),
Beispiel 7 (Ratte), Beispiel 9 (Maus) bzw. Beispiel 10 (Kaninchen)
hergestellt.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
16 gebildet.
-
(Implantierung eines Pellets)
-
Die
Pellets (Zellpellets) wurden bei syngenen Tieren unter die dorsale
Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert. 4 Wochen nach
Implantierung wurden die implantierten Regionen und die Peripherie davon
chirurgisch entfernt. In jedem Pellet, das unter die Haut und in
Regionen mit Knochendefekt implantiert wurde, wurde die osteogene
Fähigkeit der Ratten-Knochenmarkzellen bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 20A: Auswirkung des Überstands
ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff auf Pellets undifferenzierter Zellen aus Ratten-Knochenmark)
-
Ratten-Knochenmarkzellen
wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 19 gewonnen.
-
Dieses
Vergleichsbeispiel wurde auf die gleiche Art und Weise wie Beispiel
20 mit der Ausnahme durchgeführt, dass ein Überstand
eines Wachstumsmediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden (Überstand ohne die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), dem Medium anstatt
des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden (Überstand mit dem die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), zugegeben wurde.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
16 gebildet.
-
(Implantierung eines Pellets)
-
Die
in diesem Vergleichsbeispiel hergestellten Pellets (Zellpellets)
wurden unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert.
In jedem Pellet, das unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert
wurde, wurde die osteogene Fähigkeit der Ratten-Knochenmarkzellen
bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 20B: Auswirkung des Überstands
ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff auf Pellets undifferenzierter Zellen aus Ratten-Knochenmark)
-
Ratten-Knochenmarkzellen
wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 19 gewonnen. Nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden verwendet, die in Vergleichsbeispiel 1B (Ratte),
Vergleichsbeispiel 1D (Ratte), Vergleichsbeispiel 3B (Ratte), Vergleichsbeispiel
4B (Mensch), Vergleichsbeispiel 5B (Mensch), Vergleichsbeispiel
9B (Maus) bzw. Vergleichsbeispiel 10B (Kaninchen), hergestellt wurden.
-
Ein Überstand
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, in dem
die in jedem Vergleichsbeispiel hergestellten Zellen kultiviert
wurden (Überstand ohne den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), wurde dem Medium zugegeben,
das die Kultur der Pellets aus Ratten-Knochenmarkzellen enthielt,
und danach wurde die Kultur weiter kultiviert.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
16 gebildet.
-
(Implantierung eines Pellets)
-
Die
in diesem Vergleichsbeispiel hergestellten Pellets (Zellpellets)
wurden unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert.
In jedem Pellet, das unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert
wurde, wurde die osteogene Fähigkeit der Ratten-Knochenmarkzellen
bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 20C: Auswirkung des
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums oder Wachstumsmediums
auf aus Ratten-Knochenmark stammende undifferenzierte Zellen)
-
Ratten-Knochenmarkzellen
wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 19 gewonnen.
Die Pellets, die aus den Ratten-Knochenmarkzellen gebildet wurden,
wurden nur unter Verwendung eines den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums oder Wachstumsmediums kultiviert.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
16 gebildet.
-
(Implantierung eines Pellets)
-
Die
in diesem Vergleichsbeispiel hergestellten Pellets (Zellpellets)
wurden unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert.
In jedem Pellet, das unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert
wurde, wurde die osteogene Fähigkeit der Ratten-Knochenmarkzellen
bewertet.
-
(Beispiel 21: Auswirkung der Implantierung
eines Verbundmaterials, das unter Verwendung von induzierten Chondrozyten,
die von dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff induziert wurden, und eines biokompatiblen Gerüsts
hergestellt wurde, unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt)
-
(Herstellung von Verbundmaterialien)
-
Dieses
Beispiel wurde auf die gleiche Art und Weise wie Beispiel 17 mit
der Ausnahme durchgeführt, dass aus Ratten-Knochenmark
stammende undifferenzierte Zellen anstatt der Maus-C3H10T1/2-Zellen
verwendet wurden.
-
Aus
Ratten-Knochenmark stammende undifferenzierte Zellen wurden auf
die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 19 gewonnen. Die Verbundmaterialien
wurden hergestellt, indem diese aus Ratten-Knochenmark stammenden
undifferenzierten Zellen auf die in Tabelle 11 angeführten
Gerüste geimpft wurden. Die Verbundmaterialien wurden in
einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
für 1 Woche inkubiert. Anschließend wurden die Zellen
auf jedem Gerüst beobachtet.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 17
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
17 gebildet.
-
(Implantierung von Verbundmaterialien)
-
Die
Verbundmaterialien wurden unter die Haut und in die Regionen mit
Knochendefekt bei syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert.
4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere oder immundefizienten
Tiere getötet. Anschließend wurden die implantierten
Regionen chirurgisch entfernt, mit 10% neutralem gepuffertem Formalin
fixiert und danach in Paraffin eingebettet.
-
Dünne
Schnittproben der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann
mit HE-Färbung angefärbt. Anschließend
wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Bei jedem
Verbundmaterial, das unter die Haut und in die Regionen mit Knochendefekt
implantiert wurde, wurde eine osteogene Fähigkeit der undifferenzierten
Zellen bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 21A: Auswirkung der
Implantierung eines Verbundmaterials, das unter Verwendung von undifferenzierten
Zellen, die in einem Medium ohne den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff kultiviert wurden, und eines
biokompatiblen Gerüsts hergestellt wurde, unter die Haut
und in Regionen mit Knochendefekt)
-
(Herstellung von Verbundmaterialien)
-
Als
Mediumlösung wurde ein Medium verwendet, dem ein Überstand
eines Wachstumsmediums zugegeben wurde, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden (Überstand ohne den die
Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff).
Die Verbundmaterialien wurden hergestellt, indem die aus Ratten-Knochenmark
stammenden undifferenzierten Zellen auf die in Tabelle 11 angeführten
Gerüste auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 21
geimpft wurden. Die Verbundmaterialien wurden in einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C für
1 Woche inkubiert. Anschließend wurden die Zellen auf jedem
Gerüst beobachtet.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 17
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
17 gebildet.
-
(Implantierung von Verbundmaterialien)
-
Die
Verbundmaterialien wurden unter die Haut und in die Regionen mit
Knochendefekt bei syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert.
4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere oder immundefizienten
Tiere getötet. Anschließend wurden die implantierten
Regionen chirurgisch entfernt, mit 10% neutralem gepuffertem Formalin
fixiert und danach in Paraffin eingebettet.
-
Dünne
Schnittproben der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann
mit HE-Färbung angefärbt. Anschließend
wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Bei jedem
Verbundmaterial, das unter die Haut und in die Regionen mit Knochendefekt
implantiert wurde, wurde eine osteogene Fähigkeit der undifferenzierten
Zellen bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 21B: Verbundmaterial,
das unter Verwendung eines Überstands ohne den die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff kultiviert wurde)
-
Die
nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden verwendet,
die in Vergleichsbeispiel 1B (Ratte), Vergleichsbeispiel 1D (Ratte),
Vergleichsbeispiel 3B (Ratte), Vergleichsbeispiel 4B (Mensch), Vergleichsbeispiel
5B (Mensch), Vergleichsbeispiel 9B (Maus) bzw. Vergleichsbeispiel
10B (Kaninchen), hergestellt wurden. Die Verbundmaterialien wurden
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 21 mit der Ausnahme
hergestellt, dass ein Medium verwendet wurde, dem ein Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, in dem die
in jedem Vergleichsbeispiel hergestellten Zellen kultiviert wurden
(Überstand ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten
induzierenden Wirkstoff), zugegeben wurde. Anschließend
wurden die Zellen auf jedem Gerüst beobachtet.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 17
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
17 gebildet.
-
(Implantierung von Verbundmaterialien)
-
Die
Verbundmaterialien wurden unter die Haut und in die Regionen mit
Knochendefekt bei syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert.
4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere oder immundefizienten
Tiere getötet. Anschließend wurden die implantierten
Regionen chirurgisch entfernt, mit 10% neutralem gepuffertem Formalin
fixiert und danach in Paraffin eingebettet.
-
Dünne
Schnittproben der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann
mit HE-Färbung angefärbt. Anschließend
wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Bei jedem
Verbundmaterial, das unter die Haut und in die Regionen mit Knochendefekt
implantiert wurde, wurde eine osteogene Fähigkeit der undifferenzierten
Zellen bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 21C: Verbundmaterial,
das nur unter Verwendung eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Mediums oder Wachstumsmediums kultiviert wurde)
-
Die
Verbundmaterialien wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
21 mit der Ausnahme hergestellt, dass ein Medium verwendet wurde,
dem nur ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium oder
Wachstumsmedium zugegeben wurde. Anschließend wurden die
Zellen auf jedem Verbundmaterial beobachtet.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 17
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
17 gebildet.
-
(Implantierung von Verbundmaterialien)
-
Die
Verbundmaterialien wurden unter die Haut und in die Regionen mit
Knochendefekt bei syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert.
4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere oder immundefizienten
Tiere getötet. Anschließend wurden die implantierten
Regionen chirurgisch entfernt, mit 10% neutralem gepuffertem Formalin
fixiert und danach in Paraffin eingebettet.
-
Dünne
Schnittproben der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann
mit HE-Färbung angefärbt. Anschließend
wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Bei jedem
Verbundmaterial, das unter die Haut und in die Regionen mit Knochendefekt
implantiert wurde, wurde eine osteogene Fähigkeit der undifferenzierten
Zellen bewertet.
-
(Beispiel 22: Auswirkung des den die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs auf menschliche
undifferenzierte Zellstämme)
-
(Herstellung des die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten erzeugt wird)
-
Die
Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoffe
wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 bis 3 (Ratte),
Beispiel 4 und 5 (Mensch), Beispiel 7 (Ratte), Beispiel 9 (Maus)
bzw. Beispiel 10 (Kaninchen) hergestellt.
-
(Herstellung menschlicher undifferenzierter
Zellstämme)
-
Als
menschliche undifferenzierte Zellstämme wurden aus Knochenmark
stammende menschliche mesenchymale Stammzellen (hMSC: ”PT-2501”,
hergestellt von Cambrex Corporation) bezogen.
-
Diese
menschlichen mesenchymalen Stammzellen wurden gemäß einem
routinemäßigen Verfahren kultiviert. Ein Überstand,
der jeden der in diesem Beispiel hergestellten die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffe enthielt, wurde
einem Medium zugegeben, das eine Kultur der menschlichen mesenchymalen
Stammzellen enthielt, und anschließend wurde die Kultur
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 weiter kultiviert.
Anschließend wurde die Auswirkung jeder der die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffe auf die menschlichen
undifferenzierten Zellstämme auf die gleiche Art und Weise
wie in Beispiel 1 bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 22A: Auswirkung eines Überstands
ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff auf menschliche mesenchymale Stammzellen)
-
Dieses
Vergleichsbeispiel wurde auf die gleiche Art und Weise wie Beispiel
22 mit der Ausnahme durchgeführt, dass ein Überstand
eines Wachstumsmediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden (Überstand ohne die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), dem Medium anstatt
des Überstands, das den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthielt, zugegeben wurde.
Der Überstand ohne die Differenzierung induzierter Osteoblasten
induzierenden Wirkstoff wurde dem Medium zugegeben, das eine Kultur
menschlicher mesenchymaler Stammzellen enthielt, und anschließend
wurde die Kultur weiter kultiviert.
-
Anschließend
wurde die Auswirkung eines Überstands des Wachstumsmediums,
in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert
wurden (Überstand ohne den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff) auf menschliche mesenchymale
Stammzellen bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 22B: Auswirkung eines Überstands
ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff auf menschliche mesenchymale Stammzellen)
-
Nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden verwendet, die in Vergleichsbeispiel 1B (Ratte), Vergleichsbeispiel
1D (Ratte), Vergleichsbeispiel 3B (Ratte), Vergleichsbeispiel 4B
(Mensch), Vergleichsbeispiel 5B (Mensch), Vergleichsbeispiel 9B
(Maus) bzw. Vergleichsbeispiel 10B (Kaninchen), hergestellt wurden. Ein Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, in dem die
in jedem Vergleichsbeispiel hergestellten Zellen kultiviert wurden
(Überstand ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff), wurde dem Medium zugegeben, das eine Kultur von menschlichen
mesenchymalen Stammzellen enthielt, und anschließend wurde
die Kultur weiter kultiviert.
-
Anschließend
wurde die Auswirkung eines Überstands des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums, in dem nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden (Überstand ohne den die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff) auf menschliche
mesenchymale Stammzellen bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 22C: Auswirkung des
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums oder Wachstumsmediums
auf menschliche mesenchymale Stammzellen)
-
Menschliche
mesenchymale Stammzellen wurden in einem Medium kultiviert, dem
nur ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium oder Wachstumsmedium
zugegeben wurde. Anschließend wurde die Auswirkung des
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums oder Wachstumsmediums
auf die menschlichen mesenchymalen Stammzellen bewertet.
-
(Beispiel 23: Auswirkung des von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten erzeugten Wirkstoffs auf Pellets aus menschlichen undifferenzierten
Zellen)
-
Aus
Knochenmark stammende menschliche mesenchymale Stammzellen (hMSC: ”PT-2501”,
hergestellt von Cambrex Corporation) wurden zur Bildung von Pellets
zentrifugiert, und anschließend wurden die Pellets für
1 Woche kultiviert. In dieser Kultur wurde ein Überstand
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, in dem
die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden
(Überstand mit dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten
induzierenden Wirkstoff), einem Medium zugegeben. Hier wurde der Überstand
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 bis 3 (Ratte), Beispiel
4 und 5 (Mensch), Beispiel 7 (Ratte), Beispiel 9 (Maus) bzw. Beispiel
10 (Kaninchen) hergestellt.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
16 gebildet.
-
(Implantierung eines Pellets)
-
Die
in diesem Beispiel hergestellten Pellets (Zellpellets) wurden bei
immundefizienten Tieren unter die dorsale Haut implantiert. 4 Wochen
nach Implantierung wurden die implantierten Regionen und die Peripherie davon
chirurgisch entfernt. In jedem Pellet, das unter die Haut implantiert
wurde, wurde die osteogene Fähigkeit der mesenchymalen
Stammzellen bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 23A: Auswirkung des Überstands
ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff auf Pellets aus menschlichen mesenchymalen Stammzellen)
-
Menschliche
mesenchymale Stammzellen wurden auf die gleiche Art und Weise wie
in Beispiel 19 hergestellt. Dieses Vergleichsbeispiel wurde auf
die gleiche Art und Weise wie Beispiel 23 mit der Ausnahme durchgeführt,
dass ein Überstand eines Wachstumsmediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden (Überstand ohne die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), dem Medium anstatt
des Überstands zugegeben wurde, das den die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthielt, in dem
die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden
(Überstand mit dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten
induzierenden Wirkstoff).
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
16 gebildet.
-
(Implantierung eines Pellets)
-
Die
in diesem Vergleichsbeispiel hergestellten Pellets (Zellpellets)
wurden unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert.
In jedem Pellet, das unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert
wurde, wurde die osteogene Fähigkeit der mesenchymalen
Stammzellen bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 23B: Auswirkung des Überstands
ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff auf Pellets aus menschlichen mesenchymalen Stammzellen
-
Menschliche
mesenchymale Stammzellen wurden auf die gleiche Art und Weise wie
in Beispiel 19 gewonnen. Nicht-hypertrophierungsfähige
Chondrozyten wurden verwendet, die in Vergleichsbeispiel 1B (Ratte), Vergleichsbeispiel
1D (Ratte), Vergleichsbeispiel 3B (Ratte), Vergleichsbeispiel 4B
(Mensch), Vergleichsbeispiel 5B (Mensch), Vergleichsbeispiel 9B
(Maus) bzw. Vergleichsbeispiel 10B (Kaninchen), hergestellt wurden.
-
Ein Überstand
eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, in dem
die in jedem Vergleichsbeispiel hergestellten Zellen kultiviert
wurden (Überstand ohne den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), wurde dem Medium zugegeben,
das die Pellets aus menschlichen mesenchymalen Stammzellen enthielt,
und danach wurden die Pellets weiter kultiviert.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
16 gebildet.
-
(Implantierung eines Pellets)
-
Die
in diesem Vergleichsbeispiel hergestellten Pellets (Zellpellets)
wurden unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert.
In jedem Pellet, das unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert
wurde, wurde die osteogene Fähigkeit der mesenchymalen
Stammzellen bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 23C: Auswirkung des
den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums oder Wachstumsmediums
auf menschliche mesenchymale Stammzellen)
-
Menschliche
mesenchymale Stammzellen wurden auf die gleiche Art und Weise wie
in Beispiel 19 gewonnen. Die Pellets, die aus den menschlichen mesenchymalen
Stammzellen gebildet wurden, wurden in einem Medium kultiviert,
dem nur ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium oder
Wachstumsmedium zugegeben wurde.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 16
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
16 gebildet.
-
(Implantierung eines Pellets)
-
Die
in diesem Vergleichsbeispiel hergestellten Pellets (Zellpellets)
wurden unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert.
In jedem Pellet, das unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert
wurde, wurde die osteogene Fähigkeit der mesenchymalen
Stammzellen bewertet.
-
(Beispiel 24: Auswirkung der Implantierung
eines Verbundmaterials, das unter Verwendung von induzierten Chondrozyten,
die von dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden
Wirkstoff induziert wurden, und eines biokompatiblen Gerüsts
hergestellt wurde, unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt
-
(Herstellung von Verbundmaterialien)
-
Dieses
Beispiel wurde auf die gleiche Art und Weise wie Beispiel 17 mit
der Ausnahme durchgeführt, dass aus Knochenmark stammende
menschliche mesenchymale Stammzellen (hMSC: ”PT-2501”,
hergestellt von Cambrex Corporation) anstatt der Maus-C3H10T1/2-Zellen
und immundefiziente Tiere als Versuchstiere verwendet wurden.
-
Die
Verbundmaterialien wurden hergestellt, indem diese menschlichen
mesenchymalen Stammzellen auf die in Tabelle 11 angeführten
Gerüste geimpft wurden. Die Verbundmaterialien wurden in
einem 5% CO2 Inkubator bei 37°C
für 1 Woche inkubiert. Anschließend wurden die
Zellen auf jedem Gerüst beobachtet.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Jedes
der zur Implantierung vorgesehenen immundefizienten Tiere wurde
betäubt und die Haut zur Bildung einer offenen Wunde aseptisch
eingeschnitten. Eine Rundschere wurde subkutan durch die offene Wunde
eingeführt, um die Haut von dem subkutanen Gewebe zu trennen.
Auf diese Weise wurde eine subkutane Tasche in jedem Tier gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
17 gebildet.
-
(Implantierung von Verbundmaterialien)
-
Diese
Verbundmaterialien wurden bei immundefizienten Tieren unter die
Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert. 4 Wochen nach
Implantierung wurden die immundefizienten Tiere getötet.
Anschließend wurden die implantierten Regionen chirurgisch
entfernt, mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert und danach
in Paraffin eingebettet.
-
Dünne
Schnittproben der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann
mit HE-Färbung angefärbt. Anschließend
wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Bei jedem
Verbundmaterial, das unter die Haut und in die Regionen mit Knochendefekt
implantiert wurde, wurde eine osteogene Fähigkeit der mesenchymalen
Stammzellen bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 24A: Auswirkung der
Implantierung eines Verbundmaterials, das unter Verwendung von undifferenzierten
Zellen, die in einem Medium ohne den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff kultiviert wurden, und eines
biokompatiblen Gerüsts hergestellt wurde, unter die Haut
und in Regionen mit Knochendefekt)
-
(Herstellung von Verbundmaterialien)
-
Ein
Medium wurde verwendet, dem ein Überstand eines Wachstumsmediums
zugegeben wurde, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten
kultiviert wurden (Überstand ohne den die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff). Die Verbundmaterialien
wurden hergestellt, indem die menschlichen mesenchymalen Stammzellen
auf die in Tabelle 11 angeführten Gerüste auf
die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 24 geimpft wurden. Die
Verbundmaterialien wurden in einem 5% CO2 Inkubator
bei 37°C für 1 Woche inkubiert. Anschließend
wurden die Zellen auf jedem Gerüst beobachtet.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Jedes
der zur Implantierung vorgesehenen immundefizienten Tiere wurde
betäubt und die Haut zur Bildung einer offenen Wunde aseptisch
eingeschnitten. Eine Rundschere wurde subkutan durch die offene Wunde
eingeführt, um die Haut von dem subkutanen Gewebe zu trennen.
Auf diese Weise wurde eine subkutane Tasche in jedem Tier gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
17 gebildet.
-
(Implantierung von Verbundmaterialien)
-
Diese
Verbundmaterialien wurden bei immundefizienten Tieren unter die
Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert. 4 Wochen nach
Implantierung wurden die immundefizienten Tiere getötet.
Anschließend wurden die implantierten Regionen chirurgisch
entfernt, mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert und danach
in Paraffin eingebettet.
-
Dünne
Schnittproben der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann
mit HE-Färbung angefärbt. Anschließend
wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Bei jedem
Verbundmaterial, das unter die Haut und in die Regionen mit Knochendefekt
implantiert wurde, wurde eine osteogene Fähigkeit der mesenchymalen
Stammzellen bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 24B: Verbundmaterial,
das unter Verwendung eines Überstands ohne den die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff kultiviert wurde)
-
Die
nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden verwendet,
die in Vergleichsbeispiel 1B (Ratte), Vergleichsbeispiel 1D (Ratte),
Vergleichsbeispiel 3B (Ratte), Vergleichsbeispiel 4B (Mensch), Vergleichsbeispiel
5B (Mensch), Vergleichsbeispiel 9B (Maus) bzw. Vergleichsbeispiel
10B (Kaninchen), hergestellt wurden.
-
Die
Verbundmaterialien wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
24 mit der Ausnahme hergestellt, dass ein Medium verwendet wurde,
dem ein Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Mediums, in dem die in jedem Vergleichsbeispiel hergestellten Zellen
kultiviert wurden (Überstand ohne den die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff), zugegeben wurde.
Anschließend wurden die Zellen auf jedem Gerüst
beobachtet.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 24
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
24 gebildet.
-
(Implantierung von Verbundmaterialien)
-
Diese
Verbundmaterialien wurden bei immundefizienten Tieren unter die
Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert. 4 Wochen nach
Implantierung wurden die immundefizienten Tiere getötet.
Anschließend wurden die implantierten Regionen chirurgisch
entfernt, mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert und danach
in Paraffin eingebettet.
-
Dünne
Schnittproben der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann
mit HE-Färbung angefärbt. Anschließend
wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Bei jedem
Verbundmaterial, das unter die Haut und in die Regionen mit Knochendefekt
implantiert wurde, wurde eine osteogene Fähigkeit der mesenchymalen
Stammzellen bewertet.
-
(Vergleichsbeispiel 24C: Verbundmaterial,
das nur unter Verwendung eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
Mediums oder Wachstumsmediums kultiviert wurde)
-
Die
Verbundmaterialien wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
21 mit der Ausnahme hergestellt, dass ein Medium verwendet wurde,
dem nur ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium oder
Wachstumsmedium zugegeben wurde. Anschließend wurden die
Zellen auf jedem Verbundmaterial beobachtet.
-
(Bildung einer subkutanen Tasche)
-
Subkutane
Taschen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 24
gebildet.
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
-
Regionen
mit Knochendefekt wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
24 gebildet.
-
(Implantierung von Verbundmaterialien)
-
Diese
Verbundmaterialien wurden bei immundefizienten Tieren unter die
Haut und in Regionen mit Knochendefekt implantiert. 4 Wochen nach
Implantierung wurden die immundefizienten Tiere getötet.
Anschließend wurden die implantierten Regionen chirurgisch
entfernt, mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert und danach
in Paraffin eingebettet.
-
Dünne
Schnittproben der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann
mit HE-Färbung angefärbt. Anschließend
wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Bei jedem
Verbundmaterial, das unter die Haut und in die Regionen mit Knochendefekt
implantiert wurde, wurde eine osteogene Fähigkeit der mesenchymalen
Stammzellen bewertet.
-
(Beispiel 25: Osteogene Rate und osteogenes
Ausmaß bei der Implantierung eines Verbundmaterials in
Regionen mit Knochendefekt, das unter Verwendung von induzierten
Chondrozyten, die von dem Wirkstoff induziert wurden, der von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten erzeugt wird, und eines biokompatiblen Gerüsts
hergestellt wurde)
-
(Bildung einer Region mit Knochendefekt
und Messung von osteogener Rate und osteogenem Ausmaß)
-
Die
Verbundmaterialien aus Beispiel 17, 21 bzw. 24, die die Osteogenese
induziert haben, wurden in Regionen mit Knochendefekt implantiert.
Anschließend wurden die osteogene Rate und das osteogene
Ausmaß in jeder der Regionen mit Knochendefekt unter Verwendung
des MZ-500S (hergestellt von MARUTO INSTRUMENT CO., LTD.) gemessen.
Diese Messung wurde unter Verwendung einer stabförmigen
Stanzvorrichtung bei Testbedingungen mit einer Geschwindigkeit von
2 mm/min durchgeführt. Als biokompatibles Gerüst
wurde jeweils Hydroxylapatit verwendet.
-
Die
Verbundmaterialien (scheibenförmig mit einem Durchmesser
von 3 mm), von denen jedes unter Verwendung von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten, die auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 erhalten wurden, und des Hydroxylapatits hergestellt wurde, wurden
in die Regionen mit Knochendefekt implantiert (Stanzöffnung
mit einem Durchmesser von 3 mm).
-
Hier
wurden die Regionen mit Knochendefekt auf die gleiche Art und Weise
wie in Beispiel 17 gebildet. 4 und 12 Wochen nach dem Implantieren
wurden die implantierten Regionen chirurgisch entfernt und die μCT-Daten
davon aufgenommen.
-
(Vergleichsbeispiel 25A)
-
Die
Verbundmaterialien von Vergleichsbeispiel 17A bis 17A, 21A bis 21C
und 24A bis 24C, Verbundmaterialien mit natürlichen Osteoblasten
und einem Gerüst sowie Gerüste allein wurden in
die Regionen mit Knochendefekt implantiert. Anschließend
wurden die osteogene Rate und das osteogene Ausmaß in jeder
der Regionen mit Knochendefekt auf die gleiche Art und Weise wie
in Beispiel 25 gemessen.
-
(Beispiel
26: Induzierung von induzierten Osteoblasten unter Verwendung eines
die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs,
der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird)
-
(Herstellung des die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten erzeugt wird)
-
In
diesem Beispiel wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel
1 die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem den
Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert und
anschließend wurde ein Überstand des Mediums wurde
zur Gewinnung von partiellen Überständen in einer
Zeitspanne von 4 Tagen bis 3 Wochen gesammelt. Jeder partielle Überstand
wurde in ein Zentrifugenfilter gegeben und anschließend
bei 4.000 × g und bei 4°C für 30 min
unter einer solchen Bedingung zentrifugiert, dass eine hochmolekulare
Fraktion und eine niedermolekulare Fraktion von einander getrennt
wurden.
-
So
wurde jeder partielle Überstand in eine hochmolekulare
Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder höher
und eine niedermolekulare Fraktion mit einem Molekulargewicht von
50.000 oder weniger aufgetrennt und gleichzeitig wurde die hochmolekulare
Fraktion 10-fach konzentriert. Danach wurde diese konzentrierte
hochmolekulare Fraktion (Mediumüberstand) mit einem den
Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium auf das 5-Fache verdünnt.
Bei der Zentrifugation wurde eine 50K-Folie (”Amicon Ultra
15, 50,000 NMWL, catalog number: UFC905024”, hergestellt
von Millipore Corporation) verwendet.
-
(Herstellung von undifferenzierten mesenchymalen
Stammzellen aus Knochenmark)
-
4
Wochen alte männliche Wistar-Ratten wurden unter Verwendung
von Chloroform getötet. Die Oberschenkel der Ratten wurden
unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen
Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung
(10-fach verdünnt) eingetaucht. Die Oberschenkel der Ratten
wurden eingeschnitten und die Femora chirurgisch aseptisch entnommen.
Danach wurden beide Epiphysen-Regionen jedes Femurs zur Gewinnung
der Diaphysen entfernt.
-
10
bis 15 ml eines MEM-Wachstumsmediums (enthaltend essenzielles Minimalmedium
(MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und
0,25 μg/ml Amphotericin B) wurden in eine Spritze mit Nadel
gegeben und anschließend in die gewonnenen Diaphysen über
die Nadel eingespritzt, so dass das Knochenmark darin mit dem Medium
ausgespült wurde, um eine Knochenmarklösung zu
gewinnen.
-
Die
Knochenmarksuspension wurde in einen T-75-Kolben (hergestellt von
Becton, Dickinson and Company) bis zur Einstellung einer Endmenge
von 30 ml geimpft. Diese Knochenmarksuspension wurde für 1
Woche bei 37°C kultiviert. Als Medium wurde ein den Differenzierungswirkstoff
erzeugendes MEM-Medium verwendet. Eine Hälfte des Mediums
wurde zweimal pro Woche durch ein neues Medium ersetzt. 1 Woche nach
dem Kultivieren wurden die an der Bodenfläche des T-75-Kolbens
anhaftenden Zellen als undifferenzierte mesenchymale Stammzellen
bestimmt.
-
Diese
Zellen wurden mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung nach
Dulbecco (”D-PBS, catalog number: 14190”, hergestellt
von Invitrogen Corporation) gewaschen und aus dem T-75-Kolben mit
einer 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung (hergestellt von Invitrogen
Corporation) abgetrennt. Danach wurden die Zellen gesammelt und
durch Zentrifugation bei 170 × g für 3 min gewaschen
und anschließend verwendet.
-
(I: Direkte Zugabe des die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten erzeugt wird)
-
Die
in diesem Beispiel hergestellten und aus Knochenmark stammenden
undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen wurden in Vertiefungen
bei einer Dichte von 1 × 10–5 Zellen/ml/Vertiefung
geimpft und dann in einem MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles
Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin
und 0,25 μg/ml Amphotericin B) über Nacht (für
18 h) kultiviert.
-
Nach
dem Kultivieren wurde 1 ml eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Mediums (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS
(fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat,
50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1
mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) mit dem
Wirkstoff oder eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums
ohne Wirkstoff (den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium
allein) den Vertiefungen zugegeben und anschließend wurden
die mesenchymalen Stammzellen für 72 h weiter kultiviert.
-
Danach
wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität, die eine von
den Osteoblasten-Markern ist, der mesenchymalen Stammzellen gemessen.
Die Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität wurde
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 12 gezeigt. (Tabelle 12)
| 1 | 2 | 3 | Mittelwert | Relativer
Wert |
Wirkstoff (+) | 0,208 | 0,226 | 0,299 | 0,244 | 2,17 |
Wirkstoff (–) | 0,120 | 0,111 | 0,107 | 0,113 | 1 |
- Wirkstoff (+): Gruppe mit dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Medium mit Wirkstoff.
- Wirkstoff (–): Gruppe mit dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Medium ohne Wirkstoff (den Differenzierungswirkstoff
erzeugendes Medium allein).
-
Es
wurde bestätigt, dass ein die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierender Wirkstoff, der von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten erzeugt wird, die alkalische Phosphatase-Aktivität
der aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden undifferenzierten
mesenchymalen Stammzellen steigern konnte.
-
(II: Zugabe des die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten erzeugt wird, der auf Hydroxylapatit imprägniert
ist)
-
(Herstellung von Hydroxylapatit)
-
Als
Hydroxylapatit wurde APACERAM AX (hergestellt von HOYA CORPORATION,
Artificial bone AB-01, GA-3) verwendet. Eine verdünnte
Lösung mit einer solchen Menge, dass das APACERAM AX vollständig
darin eingetaucht wurde (z. B. 1 ml der verdünnten Lösung
pro 10 Hydroxylapatit-Teilchen), und das APACERAM AX wurden in eine
Spritze gegeben. In diesem Zustand wurde der Kolben der Spritze
derart angezogen, dass das APACERAM AX entgast wurde. Zu diesem
Zeitpunkt wurden etwa 0,3 ml der verdünnten Lösung
in die Hydroxylapatit-Teilchen imprägniert.
-
Die
in diesem Beispiel hergestellten und aus Knochenmark stammenden
undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen wurden in Vertiefungen
bei einer Dichte von 1 × 10–5 Zellen/ml/Vertiefung
geimpft und dann in einem MEM-Wachstumsmedium über Nacht
(für 18 h) kultiviert.
-
Danach
wurde ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium mit
dem Wirkstoff oder ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes
MEM-Medium ohne Wirkstoff (den Differenzierungswirkstoff erzeugendes
Medium allein), das in das APACERAM AX imprägniert wurde,
den Vertiefungen zugegeben, in die in diesem Beispiel kultivierten
mesenchymalen Stammzellen geimpft wurden, und anschließend
wurden sie für 72 h weiter kultiviert.
-
Danach
wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität, die eine von
den Osteoblasten-Markern ist, der mesenchymalen Stammzellen gemessen.
Die Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität wurde
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 13 gezeigt. (Tabelle 13)
| 1 | 2 | 3 | Mittelwert | Relativer
Wert |
Wirkstoff
(+) | 0,169 | 0,153 | 0,191 | 0,171 | 2,15 |
Wirkstoff
(–) | 0,085 | 0,077 | 0,077 | 0,080 | 1 |
- Wirkstoff (+): Gruppe mit dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Medium mit Wirkstoff, das in APACERAM AX imprägniert
wurde.
- Wirkstoff (–): Gruppe mit dem den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Medium ohne Wirkstoff (den Differenzierungswirkstoff
erzeugendes Medium allein), das in APACERAM AX imprägniert
wurde.
-
Es
wurde bestätigt, dass ein die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierender Wirkstoff, der von hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten erzeugt wird, die alkalische Phosphatase-Aktivität
der aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden undifferenzierten
mesenchymalen Stammzellen steigern konnte.
-
(Beispiel 27A: Auswirkung des Wirkstoffs
auf die Induzierung der Differenzierung von aus Ratten-Knochenmark
stammenden undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen zu Osteoblasten)
-
(Nachweis des Wirkstoffs, der von aus
Ratten-Knochenmark stammenden hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten erzeugt wird)
-
In
diesem Beispiel wurde ein zellfunktionsregulierender Wirkstoff hergestellt,
indem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Medium auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 kultiviert
wurden.
-
(Gewinnung von aus Ratten-Knochenmark
stammenden undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen)
-
Zellen
wurden aus dem Femur-Knochenmark von Ratten gewonnen und auf die
gleiche Art und Weise wie in Beispiel 26 für 1 Woche zur
Gewinnung einer Zelllösung kultiviert. 1 ml einer Zelllösung
von 2,5 × 10–4 Zellen/ml
wurde in eine 24-Well-Platte geimpft und dann wurden die Zellen
in einem MEM-Wachstumsmedium kultiviert. Auf diese Weise wurden
die aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen
hergestellt.
-
(Zugabe der Probe und Messung der alkalischen
Phosphatase-Aktivität)
-
Nachdem
die aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen
Stammzellen in MEM-Wachstumsmedium für 18 h kultiviert
wurden, wurde 1 ml von jeder der folgenden Probelösungen
den aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen
Stammzellen zugegeben. Anschließend wurden die aus primärem
Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen für
72 h kultiviert und die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Zellen wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1
gemessen.
-
(Zugegebene Probenlösung)
-
- (1) Überstand des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten
kultiviert wurden; den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium
mit Wirkstoff.
- (2) Nur den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium;
Medium ohne Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung,
jedoch mit Dexamethason; Osteoblasten-Differenzierungsmedium nach
Maniatopouros.
- (3) Nur MEM-Wachstumsmedium; MEM-Wachstumsmedium ohne Wirkstoff
und ohne Dexamethason.
-
Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
-
Der
Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der aus primärem
Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen, die durch
Zugabe des Überstands kultiviert wurden, der den die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthielt, wurde
um mehr als das 2-Fache des Wertes der mesenchymalen Stammzellen
gesteigert, die durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums ohne Wirkstoff und
ohne Dexamethason kultiviert wurden.
-
Wenn
andererseits die aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden
mesenchymalen Stammzellen nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums mit Dexamethason, jedoch ohne den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff, kultiviert wurden, stieg die
alkalische Phosphatase-Aktivität der Zellen. Allerdings
war die Steigerung der alkalischen Phosphatase-Aktivität gering
im Vergleich mit der der mesenchymalen Stammzellen, die durch Zugabe
des Überstands mit dem die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff kultiviert wurden.
-
Aus
den Ergebnissen der 8 und dergleichen ist es unwahrscheinlich,
dass herkömmliche niedermolekulare Komponenten (einschließlich
Dexamethason) in dem Überstand enthalten sind, der den
die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff
beinhaltet. Deshalb wird angenommen, dass die Wirkung, die aus der
Zugabe des Überstands mit dem die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff resultiert, von dem die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff selbst erzielt
wurde.
-
Daher
wird aus den Ergebnissen in diesem Beispiel angenommen, dass der
die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff
eine stärkere Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung
zu Osteoblasten besitzt als die des Dexamethasons, das eines von
den herkömmlichen die Osteoblasten-Differenzierung induzierenden
Komponenten ist. (Tabelle 14) ALP (Ext. 405), 72 h (3 Tage) nach Zugabe
des Überstands
| Zugegebene
Probe | 1 | 2 | 3 | Mittelwert | Relativer Wert |
Zugabe
von Überstand | (1) | 0,688 | 0,665 | 0,686 | 0,680 | 2,1 |
| (2) | 0,426 | 0,420 | 0,490 | 0,445 | 1,4 |
Nur
Medium | (3) | 0,324 | 0,270 | 0,364 | 0,321 | 1 |
-
(Beispiel 27B: Auswirkung des Überstands
des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten
kultiviert wurden, auf die aus primärem Ratten-Knochenmark
stammenden undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen)
-
In
diesem Beispiel wurde der Überstand des MEM-Wachstumsmediums,
in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert
wurden, auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel
1A gewonnen.
-
Aus
primärem Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen wurden
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 27A hergestellt.
-
(Zugabe der Probe und Messung der alkalischen
Phosphatase-Aktivität)
-
Nachdem
die aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen
Stammzellen in MEM-Wachstumsmedium für 18 h kultiviert
wurden, wurde 1 ml von jeder der folgenden Probelösungen
den aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen
Stammzellen zugegeben. Anschließend wurden die aus primärem
Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen für
72 h kultiviert und die alkalische Phosphatase-Aktivität
der Zellen wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1
gemessen.
-
(Zugegebene Probenlösung)
-
GC/Differenzierung:
die zugegebene Probenlösung ist ein Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden.
-
GC/Wachstum:
die zugegebene Probenlösung ist ein Überstand
des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden.
-
Wachstum:
die zugegebene Probenlösung ist ein MEM-Wachstumsmedium.
-
Nachstehend
sind die Ergebnisse gezeigt.
-
Es
wurde bestätigt, dass der Wirkstoff, der die alkalische
Phosphatase-Aktivität der aus primärem Ratten-Knochenmark
stammenden mesenchymalen Stammzellen steigern kann, in dem Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem
die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden,
vorhanden war, aber der Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität
der aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen
Stammzellen steigern kann, war in dem Überstand des MEM-Wachstumsmediums,
in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert
wurden, nicht vorhanden. (Tabelle 15) Zellen: rMSC (Ratte)
| 1 | 2 | 3 | Mittelwert | Relativer Wert |
GC/Differenzierung | 0,688 | 0,665 | 0,686 | 0,680 | 2,120 |
GC/Wachstum | 0,192 | 0,184 | 0,151 | 0,176 | 0,548 |
Nur
Wachstum | 0,324 | 0,274 | 0,364 | 0,321 | 1,000 |
-
Es
ist auf die gleiche Art und Weise wie in diesem Beispiel ebenfalls
möglich, die Auswirkung eines Überstands des den
Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums, in dem die aus
Ratten stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden, auf die aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden
mesenchymalen Stammzellen zu bestätigen.
-
(Beispiel 28A: Auswirkung des Wirkstoffs
auf die Induzierung der Differenzierung von menschlichen undifferenzierten
mesenchymalen Stammzellen zu Osteoblasten)
-
(Nachweis des Wirkstoffs, der von aus
Ratten stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
erzeugt wird)
-
In
diesem Beispiel wurde ein zellfunktionsregulierender Wirkstoff hergestellt,
indem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige
Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden
MEM-Medium auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 kultiviert
wurden.
-
(Herstellung von menschlichen mesenchymalen
Stammzellen)
-
Ein
menschlicher mesenchymaler Stammzellenstamm (hMSC: ”PT-2501”)
wurde von Cambrex Corporation bezogen und für 1 Woche zur
Gewinnung einer Zelllösung kultiviert. 1 ml einer Zelllösung
von 2,5 × 10–4 Zellen/ml
wurde in eine 24-Well-Platte geimpft und dann wurden die Zellen
in einem MSCGM-Medium (Wachstumsmedium) kultiviert.
-
(Zugabe der Probe und Messung der alkalischen
Phosphatase-Aktivität)
-
Nachdem
die menschlichen mesenchymalen Stammzellen in MSCGM-Medium für
18 h kultiviert wurden, wurde 1 ml von jeder der folgenden Probelösungen
den menschlichen mesenchymalen Stammzellen zugegeben. Anschließend
wurden die menschlichen mesenchymalen Stammzellen für 72
h kultiviert und die alkalische Phosphatase-Aktivität der
Zellen wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
-
(Zugegebene Probenlösung)
-
- (1) Überstand des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten
kultiviert wurden; den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium
mit Wirkstoff.
- (2) Nur den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium;
Medium ohne Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung,
jedoch mit Dexamethason; Osteoblasten-Differenzierungsmedium nach
Maniatopouros.
- (3) Nur MEM-Wachstumsmedium; MEM-Wachstumsmedium ohne Wirkstoff
und ohne Dexamethason.
-
Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
-
Der
Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der menschlichen
mesenchymalen Stammzellen, die durch Zugabe des Überstands
kultiviert wurden, der den die Differenzierung induzierter Osteoblasten
induzierenden Wirkstoff enthielt, wurde um mehr als das 5-Fache
des Wertes der menschlichen mesenchymalen Stammzellen gesteigert,
die durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums ohne Wirkstoff und ohne
Dexamethason kultiviert wurden.
-
Wenn
andererseits die menschlichen mesenchymalen Stammzellen nur durch
Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums mit
Dexamethason, jedoch ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten
induzierenden Wirkstoff, kultiviert wurden, stieg die alkalische
Phosphatase-Aktivität der Zellen. Allerdings war die Steigerung
der alkalischen Phosphatase-Aktivität gering im Vergleich
mit der der menschlichen mesenchymalen Stammzellen, die durch Zugabe
des Überstands mit dem die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff kultiviert wurden.
-
Aus
den Ergebnissen der 8 und dergleichen ist es unwahrscheinlich,
dass herkömmliche niedermolekulare Komponenten (einschließlich
Dexamethason) in dem Überstand enthalten sind, der den
die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff
beinhaltet. Deshalb wird angenommen, dass die Wirkung, die aus der
Zugabe des Überstands mit dem die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff resultiert, von dem die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff selbst erzielt
wurde.
-
Daher
wird aus den Ergebnissen in diesem Beispiel angenommen, dass der
die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff
eine stärkere Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung
zu Osteoblasten besitzt als die des Dexamethasons, das eines von
den herkömmlichen die Osteoblasten-Differenzierung induzierenden
Komponenten ist. (Tabelle 16) ALP (Ext. 405), 72 h (3 Tage) nach Zugabe
des Überstands
Zugegebene Probe | 1 | 2 | 3 | Mittelwert | Relativer
Wert |
(1) | 0,83 | 0,73 | 0,84 | 0,80 | 5,2 |
(2) | 0,20 | 0,35 | 0,26 | 0,27 | 1,8 |
(3) | 0,13 | 0,14 | 0,18 | 0,15 | 1 |
-
(Alkalische Phosphatase-Färbung)
-
Nachdem
die menschlichen mesenchymalen Stammzellen in MSCGM-Medium (Wachstumsmedium) für
18 h kultiviert wurden, wurde 1 ml von jeder der folgenden Probelösungen
den menschlichen mesenchymalen Stammzellen zugegeben. Anschließend
wurden die menschlichen mesenchymalen Stammzellen für 72 h kultiviert
und die alkalische Phosphatase-Aktivität-Färbung
der Zellen wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1
durchgeführt.
-
(Zugegebene Probenlösung)
-
- (1) Überstand des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten
kultiviert wurden; den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium
mit Wirkstoff.
- (2) Nur den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium;
Medium ohne Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung,
jedoch mit Dexamethason; Osteoblasten-Differenzierungsmedium nach
Maniatopouros.
- (3) Nur MEM-Wachstumsmedium; MEM-Wachstumsmedium ohne Wirkstoff
und ohne Dexamethason.
-
Die
Ergebnisse sind in 39 gezeigt.
-
Die
menschlichen mesenchymalen Stammzellen, die durch Zugabe des Überstands
kultiviert wurden, der den die Differenzierung induzierter Osteoblasten
induzierenden Wirkstoff enthielt, exprimierten die alkalische Phosphatase
stark im Vergleich zu den Zellen, die durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums
ohne Wirkstoff und ohne Dexamethason kultiviert wurden.
-
Wenn
andererseits die menschlichen mesenchymalen Stammzellen nur durch
Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums mit
Dexamethason, jedoch ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten
induzierenden Wirkstoff, kultiviert wurden, exprimierten sie die
alkalische Phosphatase. Allerdings war das Expressionsniveau der
alkalischen Phosphatase gering im Vergleich mit dem der menschlichen mesenchymalen
Stammzellen, die durch Zugabe des Überstands mit dem die
Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff
kultiviert wurden.
-
Aus
den Ergebnissen der 8 und dergleichen ist es unwahrscheinlich,
dass herkömmliche niedermolekulare Komponenten (einschließlich
Dexamethason) in dem Überstand enthalten sind, der den
die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff
beinhaltet. Deshalb wird angenommen, dass die Wirkung, die aus der
Zugabe des Überstands mit dem die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff resultiert, von dem die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff selbst erzielt
wurde.
-
Daher
wird aus den Ergebnissen in diesem Beispiel angenommen, dass der
die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff
eine stärkere Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung
zu Osteoblasten besitzt als die des Dexamethasons, das eines von
den herkömmlichen die Osteoblasten-Differenzierung induzierenden
Komponenten ist.
-
(Beispiel 28B: Auswirkung des Überstands
des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten
kultiviert wurden, auf menschliche undifferenzierte mesenchymale
Stammzellen)
-
In
diesem Beispiel wurde der Überstand des MEM-Wachstumsmediums,
in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert
wurden, auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel
1A gewonnen.
-
Menschliche
undifferenzierte mesenchymale Stammzellen (hMSC: ”PT-2501”)
wurden von Cambrex Corporation bezogen und auf die gleiche Art und
Weise wie in Beispiel 28A in einem MSCGM-Medium (Wachstumsmedium)
kultiviert.
-
(Zugabe der Probe und Messung der alkalischen
Phosphatase-Aktivität)
-
Nachdem
die menschlichen mesenchymalen Stammzellen in MSCGM-Medium (Wachstumsmedium) für
18 h kultiviert wurden, wurde 1 ml von jeder der folgenden Probelösungen
den menschlichen mesenchymalen Stammzellen zugegeben. Anschließend
wurden die menschlichen mesenchymalen Stammzellen für 72 h
kultiviert und die alkalische Phosphatase-Aktivität der
Zellen wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
-
(Zugegebene Probenlösung)
-
GC/Differenzierung:
die zugegebene Probenlösung ist ein Überstand
des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem
hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
-
GC/Wachstum:
die zugegebene Probenlösung ist ein Überstand
des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige
Chondrozyten kultiviert wurden.
-
Wachstum:
die zugegebene Probenlösung ist ein MEM-Wachstumsmedium.
-
Nachstehend
sind die Ergebnisse gezeigt.
-
Es
wurde bestätigt, dass der Wirkstoff, der die alkalische
Phosphatase-Aktivität der menschlichen mesenchymalen Stammzellen
steigern kann, in dem Überstand des den Differenzierungswirkstoff
erzeugenden MEM-Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, vorhanden war, aber der Wirkstoff,
der die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen
mesenchymalen Stammzellen steigern kann, war in dem Überstand
des MEM-Wachstumsmediums, in dem die hypertrophierungsfähigen
Chondrozyten kultiviert wurden, nicht vorhanden. (Tabelle 17) Zellen: hMSC (menschlich)
| 1 | 2 | 3 | Mittelwert | Relativer Wert |
GC/Differenzierung | 1,504 | 2,315 | 1,773 | 1,864 | 4,618 |
GC/Wachstum | 0,560 | 0,395 | 0,523 | 0,493 | 1,220 |
Nur
Wachstum | 0,435 | 0,322 | 0,454 | 0,404 | 1,000 |
-
Es
ist auf die gleiche Art und Weise wie in diesem Beispiel ebenfalls
möglich, die Auswirkung eines Überstands des den
Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums, in dem die aus
Ratten stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten
kultiviert wurden, auf die menschlichen mesenchymalen Stammzellen
zu bestätigen.
-
Wie
vorstehend erläutert, wurde die vorliegende Erfindung anhand
bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung
dargestellt. Jedoch sollte der Umfang der vorliegenden Erfindung
nicht durch solche Ausführungsformen eingeschränkt
werden. Es wird verstanden, dass die vorliegende Erfindung nur durch den
Schutzumfang der Ansprüche eingeschränkt werden
sollte.
-
Es
ist selbstverständlich, dass Fachleute Äquivalente
der vorliegenden Erfindung gemäß der Beschreibung
der vorliegenden Erfindung oder dem allgemeinen Fachwissen auf dem
Fachgebiet herstellen können. Es ist ebenfalls selbstverständlich,
dass die Inhalte von hierin zitierten Patenten, Patentanmeldungen
und Dokumenten als Referenzen, wie spezifisch hierin beschrieben,
mit aufgenommen werden sollten.
-
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
-
Die
vorliegende Erfindung erzeugt in erfolgreicher Weise einen Wirkstoff,
der die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten bei einem weitläufigen
Bereich von Zellen induzieren kann, die herkömmliche Zelllinien
und/oder nicht-herkömmliche Zellen einschließen,
indem ein zellfunktionsregulierender Wirkstoff bereitgestellt wird,
der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten können
die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu den induzierten
Osteoblasten induzieren. Da ein solcher Wirkstoff unbekannt ist,
ist die Existenz des Wirkstoffs selbst industriell anwendbar.
-
ZUSAMMENFASSUNG
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Induzierung undifferenzierter
Zellen zu induzierten Osteoblasten bereit. Das Verfahren beinhaltet
folgendes: A) einen Schritt der Bereitstellung eines die Differenzierung
induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren
von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem den
Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium erhalten wird, das
Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure
und eine Serumkomponente beinhaltet; und B) einen Schritt der Kultivierung
der undifferenzierten Zellen in einem Kulturmedium für
undifferenzierte Zellen, das den die Differenzierung induzierter
Osteoblasten induzierenden Wirkstoff und eine Mediumkomponente beinhaltet,
um die undifferenzierten Zellen zu den induzierten Osteoblasten
zu differenzieren.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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