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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet des Gewebe-Engineerings, und
insbesondere betrifft sie die Verwendung eines kultivierten Lebend-Bindegewebe-Konstrukts
bei chirurgischen Korrekturindikationen.
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Hintergrund der Erfindung
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Verletzungen
der Bandscheibe sind für
den Patienten schmerzhaft, schwächend
und kostenintensiv. Die Bandscheibe liegt zwischen den Gelenkoberflächen benachbarter
Wirbelkörper.
Die Scheibe besteht aus konzentrischen Schichten von Kollegenfasern,
dem Faserring (annulus fibrosis) und dem zentralen Gallertkern (nucleus
pulposus), welchen er umgibt. Der Gallertkern besteht aus einer
viskosen fluiden Bindegewebematrix und Zellen. Die Zellen des Gallertkerns,
physalide Zellen, sind in unregelmäßigen Aggregaten über die
extrazelluläre
Matrix, die aus Grundsubstanz besteht, verteilt. An der Außenseite
des Wirbels sind der Faserring und der Wirbel periphär durch
Längsbänder gestützt, die
sich parallel zur Wirbelsäule
erstrecken.
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Die
Bandscheibe funktioniert als eine Art hydraulischer Stoßdämpfer, wobei
der Gallertkern als das Hydraulikfluid agiert. Mit zunehmendem Alter werden
die Kollegenfasern des Faserrings dünner und schwächer. Der
Gallertkern kann den Ring nach hinten durchbrechen und die Nervenenden
zusammen drücken,
ein Zustand, der üblicherweise
als „Bandscheibenvorfall" bekannt ist. Die
in Hals/Nackenverletzungen verwickelten Scheiben liegen zwischen
dem fünften
und sechsten (C5-C6) Wirbel und dem sechsten und siebten (C6-C7)
Wirbel, und bei Verletzungen im unteren Rückenbereich sind der vierte
und fünfte
Lendenwirbel (L4-5) oder der fünfte Lendenwirbel
und der erste Kreuzbeinwirbel (L5-S1) am meisten betroffen. In Fällen, bei
denen die Scheibe nicht aufbricht, kann eine Nervkompression durch einen
Knochensporn von einer degenerativen Scheibener krankung bewirkt
werden. Der Knochensporn ragt in das Zwischenwirbelloch und komprimiert
das Nervenende, was zu einem kontinuierlichen, periodisch auftretenden
chronischen Schmerz führt.
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Wenn
ein Chirurg die gesamte oder Teile einer aufgebrochenen (ruptured)
Scheibe aus dem Rücken
entfernt, vergrößert er
die Öffnung
in dem Faserring, durch welche die aufgebrochene Scheibe und loses
Scheibengewebe in dem Zwischenraum entfernt werden. Die gebildete Öffnung verheilt
niemals, was sowohl die Anfälligkeit
gegenüber
einem weiteren Scheibenaufbruch durch die bestehende Öffnung als
auch gegenüber
einer Entzündungskaskade
erhöht,
die von der Freilegung des Scheibeinneren gegenüber dem Epiduralraum resultiert.
Die Entzündung
und die Fibrose treten in dem Zwischenwirbelraum auf, und führen häufig zu
Veränderungen bei
den umgebenden Geweben, einschließlich den Wirbeln, Hyaline-Platten,
der Dura Mater und dem Rückenmark.
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Jedes
Jahr werden ungefähr
200 000 Diskektomien durchgeführt.
Eine biologische Reparatur des Ringloches oder -defektes ist wesentlich,
um die Standardversorgung des Patienten mit einer Bandscheibenerkrankung
zu verbessern. Die
WO 98/40111 beschreibt
ein biomechanisches Implantat, welches zumindest zwei Matrixkomponenten
aufweist, wobei die erste Matrixkomponente aus Kollagen mit einer
porösen
Makrostruktur mit der Fähigkeit Zugkräften oder
Scherkräften
zu widerstehen besteht, und die zweite Matrixkomponente ein hydriertes
Alginatgel ist, welches im wesentlichen die poröse Makrostruktur der ersten
Komponente ausfüllt
und einen Quelldruck ausübt,
wobei das Implantat zusätzlich
eine Zellenpopulation aufweist, die Knorpelzellen, Fibrochondrozyte,
Fibroblasten oder Osteoblasten oder Vorgänger davon enthält. Die
WO 91/16867 beschreibt eine
prosthetische Bandscheibe, welche in ein menschliches Skelett implantiert werden
kann, und welche als Gerüst
für ein
erneutes Wachsen des Bandscheibenmaterials dienen kann. Die
WO 99/04720 beschreibt ein
Verfahren zum Verwenden einer Zelle mit einer Hydrogel-Suspension zum
Behandeln eines Bandscheibenvorfalls durch Implantieren einer Zellsuspension in
einen Patienten, wodurch eine Zelle mit einem Hydrogel gebildet
wird, welches an zumindest einer Oberfläche des Faserrings und der
Scheibe anhaftet, wobei die Zellen Knorpelzellen, Fibroblasten oder
Osteoblasten sind. Die vorliegende Erfindung adressiert diese Reparatur des
Faserrings durch Verwendung eines kultivierten Bindegewebe-Konstrukts,
welches, wenn es chirurgisch auf den Defekt in dem Ring aufgebracht
wird, die Öffnung
schließt
und eine Barriere ausbildet, um eine Entzündung und ein weiteres Bandscheibenbersten
zu verhindern.
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Zusammenfassung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reparieren einer
verletzten Bandscheibe eines Patienten unter Verwendung eines kultivierten Bindegewebe-Konstrukts.
Das Verfahren umfasst ein Modifizieren der Öffnung in dem Faserring der
Bandscheibe, die durch das Bersten der Scheibe erzeugt wurde, und
ein selektives Entfernen des Gallertkerns, und anschließend ein
Transplantieren des kultivierten Bindegewebe-Konstrukts in die Öffnung. Der Verschluß des Faserrings
ist wichtig, um ein erneutes Bersten der Scheibe zu verhindern,
und um die Entzündungsreaktion
und die Epiduralfibrose in dem Hohlraum zu lindern, die zu einem
Nervenschaden führen
können.
Das kultivierte Bindegewebe-Konstrukt ist ein kultiviertes Lebendgewebe
mit Bindegewebezellen und einer extrazellulären Matrix, wie beispielsweise
Kollagen. Aufgrund der gewebeähnlichen
Eigenschaften des kultivierten Gewebe-Konstruktes ist es bioremodellierbar,
was bedeutet, dass es in der Lage ist, eine Zellrepopulation mitzumachen,
und zwar durch das Einwachsen von Wirtszellen, einer Gefäßneubildung
und der Reorganisation und der Ersetzung von Matrixkomponenten des
implantierten Konstruktes durch Wirtszellen und Enzyme.
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Beschreibung der Figuren
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1 zeigt
eine Vorrichtung zum Bilden eines Bindegewebe-Equivalentes.
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Detaillierte Beschreibung
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Die
Erfindung ist gerichtet auf ein Verfahren zum Gewebeersetzen und
-reparieren unter Verwendung eines kultivierten Bindegewebe-Konstruktes. Das
Bindegewebe-Konstrukt weist Kollagen und lebende Zellen auf und
ist daher bioremodellierbar, was bedeutet, dass wenn es einem Patienten
mit einem Bedürfnis
nach einem Gewebeersatz und -reparatur transplantiert wird, es sofort
als ein Ersatzgewebe funktioniert, während es zur gleichen Zeit
beginnt, mit dem Gewebe des Patienten bei der Implantierstelle zu
integrieren, um neues Gewebe zu bilden. Bei dem am meisten bevorzugten
Ausführungsbeispiel
ist die Erfindung gerichtet auf ein Verfahren zum Reparieren des
Faserrings der Bandscheibe, und zwar nach einer Diskektomieoperation,
bei welcher der Faserring geöffnet
wurde, mit einem kultivierten Bindegewebe-Konstrukt.
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Das
kultivierte Bindegewebe-Konstrukt wird verwendet, um die Ringwand
nach Entfernung von beschädigtem
Bandscheibengewebe, wie beispielsweise dem Gallertkern und dem Faserring,
zu schließen,
zum Korrigieren von Wirbelsäulendeformationen
nach mehrfachen Diskektomien, bei rekonstruktiver Wirbelsäulenchirurgie
oder vollständiger
oder teilweiser Entfernung einer verletzten Scheibe aufgrund einer
Verletzung wie beispielsweise einem Ringriß, einer Ringschädigung,
einem Ringaufbruch, einem Bandscheibenvorfall, einer Bandscheibenhernie
oder einer Bandscheibenperforation. Ein Verschließen des
Ringes mit diesem Verfahren versiegelt den Hohlraum, um die Entzündungsreaktion
zu vermindern und eine postoperative epidurale Fibrose zu mildern,
die üblicherweise
der Entfernung des Gewebes aus dem Hohlraum nachfolgt. Die Verschließung des
Faserrings verhindert ferner einen nachfolgenden Bandscheibenvorfall
bei dem verbleibenden Bandscheibengewebe, welches in dem Zwischenwirbelraum
verbleibt, und verlangsamt eine weitere Scheibendegeneration.
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Das
Verfahren umfasst ferner das Schließen des Faserrings unter Verwendung
eines kultivierten Bindegewebe-Konstruktes nach Implantation eines Scheibenersatzes.
Ein Stützen
des Wirbels mit einem Scheibenersatz oder einem Spacer nach Scheiben entfernung
wird gelegentlich durchgeführt,
damit die Bandscheibe ihre Funktion beibehalten kann, und um einen
Nervenschaden zu verhindern. Der Ersatz wird dem Zwischenwirbelraum
durch eine Öffnung
in dem Faserring bereitgestellt, und zwar entweder der gleichen,
die für
den Zugriff auf die beschädigte Scheibe
verwendet wurde, oder eine zusätzliche Öffnung.
Scheibenersatze werden verwendet, um die übliche Scheibenraumhöhe beizubehalten,
um ein Zusammenstoßen
der hinteren Facettengelenke zu vermeiden. Ein Druck auf die Spinalnerven
kann Schmerzen oder eine Betäubung
in dem Bereich ihrer Verteilung bewirken. Funktionale Spacer-Implantate übermitteln
und dämpfen
Kompressions- und Torsionskräfte
und stabilisieren das Gelenk. Scheibenersatzmaterialien können Metall,
Metalllegierungen, synthetische Feststoffe und synthetische Gewebe
und Hydrogele umfassen, solange diese biokompatibel mit dem Gewebe
des Patienten sind.
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Um
die beschädigte
Scheibe zu entfernen ist eine beliebige Technik gemäß dem Stand
der Technik der Bandscheibenentfernung verwendbar, einschließlich aber
nicht begrenzt auf Diskektomie, Diskotomie, Laminektomie, oder Laminotomie.
Abhängig
von der Art und dem Grad der Scheibenverletzung kann auf die Bandscheibe
auf eine beliebige Anzahl von Wegen einschließlich anterior, posterior oder
posteriorlateral zugegriffen werden. Das Verfahren zum Zugreifen
auf die Bandscheibe umfasst Laparatomie-Diskektomie Techniken. Ein
Zugriff durch den Faserring umfasst uniportale und multiportale Ansätze, wobei
entweder eine oder mehrere Öffnungen
in den Faserring zum Entfernen des Scheibenmaterials und zum Implantieren
und Positionieren einer Zwischenwirbel-Spacer-Prothese gemacht werden.
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Nachdem
die Diskektomie bei dem Patienten durchgeführt wurde, wird das kultivierte
Bindegewebe-Konstrukt in die in dem Faserring bei einer chirurgischen
Operation erzeugte Öffnung
eingeführt,
um den inneren Bereich der Bandscheibe zu versiegeln. In Abhängigkeit
von der Größe des Patienten
und der Größe des Loches
in dem Ring können
ein oder mehrere Teile verwendet werden, um die Öffnung zu verstopfen, wobei
diese Stücke
durch einen von den umliegenden Geweben aufgebauten Druck an ihrer
Stelle gehalten werden. Wahlweise und zusätzlich wird ein kultiviertes
Bindegewebe-Konstrukt über
der Öffnung
aufgebracht und an dieser Stelle entlang der Gewebegrenze der Öffnung und
des Konstruktes befestigt. Wenn das Konstrukt über der Öffnung in dem Ring aufgebracht
wurde, kann das Konstrukt durch eine Naht oder einen chirurgischen
Klebstoff, wie beispielsweise Fibrin-Kleber oder andere biologisch kompatible,
bei chirurgischen Operationen verwendete Klebstoffe, befestigt werden.
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Sobald
das Verfahren des Implantierens des Konstruktes beendet ist, nimmt
das Konstrukt sofort eine Funktion als eine Barriere zwischen dem
Hohlrauminneren des Gallertkerns und dem Äußeren der Faserringe auf.
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Bei
einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel
der Erfindung wird das kultivierte Bindegewebe-Konstrukt bei einer
chirurgischen Reparatur des zentralen Nervensystems verwendet. Das kultivierte
Bindegewebe-Konstrukt wird zum Versiegeln der Dura Mater verwendet,
welche das Gehirn und das Rückenmark
abdeckt. Das Schicht-Konstrukt ist eine angemessene Form zum Verschließen von
Duradefekten nach einer Verletzung oder nach Rückenmark- oder Schädeloperationen,
um eine Separation des Inneren des zentralen Nervensystems von anderen
Körperzellen
und -geweben aufrecht zu erhalten.
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Das
kultivierte Bindegewebe-Konstrukt ist bioremodellierbar, was bedeutet,
dass es in der Lage ist, eine Zellrepopulation durch das Einwachsen
von Wirtszellen, Gefäßneubildung
und Reorganisation und Ersatz von Matrixkomponenten des implantierten
Konstruktes durch Wirtszellen und Enzyme mitzumachen. Die Transplantatprothese
behält
ihre funktionalen Charakteristika, während die Zellen des Patienten
das gesamte oder im Wesentlichen das gesamte Konstrukt remodellieren,
um es mit Wirtsgewebe zu integrieren, und als solches funktioniert
es als ein Analogon des Gewebes, welches es repariert oder ersetzt.
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Das
kultivierte Bindegewebe-Konstrukt weist Bindegewebezellen auf, die
durch eine extrazelluläre Matrix,
primär
aus Kollagen, gebunden sind. Der Aspekt der extrazellulären Matrix des
Konstruktes kann bezüglich
der Organisation und Zusammensetzung variieren und dennoch ein Bindegewebe-Konstrukt für die Verwendung
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
sein. Das Bindegewebe-Konstrukt kann ein kontrahiertes Kollagennetzwerk
mit Fibroblasten sein, wie es von Bell in dem
US Patent Nr. 4,485,096 oder von Kemp,
et al. in dem
US Patent Nr. 5,536,656 beschrieben
wurde, bei denen das kontrahierte Kollagennetzwerk auf einem azellulären Kollagengel
angeordnet ist. Jedoch bildet dieses Ausführungsbeispiel keinen Teil
der vorliegenden Erfindung, es stellt lediglich Hintergrundinformationen
dar, welche für das
Verständnis
der Erfindung nützlich
sind. Ein weiteres Konstrukt für
die Verwendung bei dem Verfahren ist ein biotechnisches Gewebe-Konstrukt
aus kultivierten Zellen und endogen hergestellten extrazellulären Matrixkomponenten
ohne die Erfordernis von exogenen Matrixkomponenten oder einer Netzwerkunterstützung oder
Gerüstelementen,
das in der PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 00/29553 von
Murphy, et al. beschrieben wurde. Bindegewebe-Konstrukte wie solche,
die ein synthetisches oder bioresorbierbares Gewebeelement mit kultivierten
Fibroblastenenden aufweisen, umschließen es mit endogen hergestellter
Matrix, wie sie in den
US Patenten
Nr. 5,580,781 ,
5,443,950 ,
5,266,480 ,
5,032,508 ,
4,963,489 von Naughton, et al. beschrieben
ist, können
ebenfalls verwendet werden, und eine faserige Kollagenmatrix mit
kultivierten Zellen darin, wie beschrieben durch
US Patente Nr. 4,505,266 und
4,280,954 von Yannas, et
al. Xenogene Materialien, wie beispielsweise de-epidermalisierte
und de-zellularisierte Dermis und andere flache Schichtgewebe, die
von antigenen Determinanten und zellulären Bruchstücken befreit wurden, können als
eine Matrixkomponente verwendet werden, die mit nichtallogenen Zellen
zum Wiederbevölkern
des Konstruktes kultiviert wird.
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Zelltypen
für die
Verwendung bei der Erfindung sind Fibroblasten, oder bei dem am
meisten bevorzugten Ausführungsbeispiel,
menschliche Fibroblasten. Menschliche Fibroblastzellstämme können von
einer Anzahl von Quellen bezogen werden, einschließlich aber
nicht begrenzt auf die Vorhaut von männlichen Neugeborenen, die
Dermis, eine Sehne, die Lun ge, Nabelschnüre, Knorpel, die Hahnröhre, die
Hornhautstroma, die Schleimhaut und den Darm. Eine bevorzugte Fibroblasten-Art
wird von der Dermis erhalten. Die menschlichen Zellen können enthalten,
sind aber nicht begrenzt auf: Fibroblasten, Eingeweidemuskelzellen,
Knorpelzellen oder andere Bindegewebszellen von mesenchymalem Ursprung. Embryonale
Vorläuferzellen,
wie beispielsweise Mesenchymalstammzellen, können bei der Erfindung zum
Herstellen des kultivierten Konstruktes verwendet werden und können entweder
in vitro oder in vivo induziert werden, um sich zu dem gewünschten
Gewebe zu entwickeln. Es ist für
den Fachmann ersichtlich, dass das kultivierte Bindegewebe-Konstrukt
entweder durch absichtliche Hinzufügung oder als Ergebnis der
Kultivierung von Fibroblasten aus primären Quellen andere Zellen enthalten
kann, die im Bindegewebe oder anderen extrazellulären Matrixkomponenten
gefunden werden. Es ist bevorzugt aber nicht erforderlich, dass
der Ursprung der bei der Herstellung des Gewebekonstruktes verwendet
matrixherstellenden Zelle von einem Gewebetyp abgeleitet wird, der
dem bzw. den nach Anwendung der Kultivierungsverfahren der Erfindung ähnelt oder
vortäuscht.
Beispielsweise wird ein Konstrukt mit Fibroblasten kultiviert, um
ein Lebendbindegewebe-Konstrukt
zu erhalten, oder mit Myoblasten für ein Skelett-Muskel-Konstrukt.
Beim Herstellen eines Gewebe-Konstruktes können mehr als ein Zelltyp verwendet
werden.
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Obwohl
menschliche Zellen bei der Verwendung der Erfindung bevorzugt sind,
sind die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
zu verwendenden Zellen nicht begrenzt auf Zellen von menschlichen Quellen.
Zellen von anderen Säugetierspezien
umfassen, sind aber nicht begrenzt auf vom Pferd stammende, vom
Hund stammende, vom Schwein stammende, vom Rind stammende, von Katzen
stammende, von Ziegen stammende und von Schafen stammende Quellen
können
verwendet werden. Mauszellen, Zellen von Nagetierquellen können ebenfalls
verwendet werden. Zellspender können
in Entwicklung und Alter variieren. Zellen können von Spendergeweben von
Embryos, Neugeborenen oder älteren
Individuen einschließlich
Erwachsenen erhalten werden.
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Darüber hinaus
können
genetisch veränderte
Zellen, die ohne fremde Einwirkung, chemisch oder viral transfiziert
sind, bei dieser Erfindung verwendet werden. Für solche Ausführungsbeispiele, die
mehr als einen Zelltyp verwenden, können Mischungen von normalen
und genetisch modifizierten oder transfizierten Zellen verwendet
werden, und Mischungen von Zellen von zwei oder mehr Spezien oder
Gewebequellen oder beides können
verwendet werden. Rekombinante oder genetisch veränderte Zellen
können
bei der Herstellung des Gewebe-Konstrukts verwendet werden, um ein
Gewebe-Konstrukt zu erzeugen, dass als ein Medikamentzuführungsimplantat
bei einem Patienten dienen kann, der erhöhte Level an natürlichen
Zellprodukten oder eine Behandlung mit einem Therapeutikum benötigt. Die
Zellen können
rekombinante Zellprodukte, Wachstumsfaktoren, Hormone, Peptide oder
Proteine für
einen kontinuierlichen Zeitraum oder wie benötigt produzieren, wenn dies
aufgrund der Zustände
in der Kultur biologisch, chemisch oder thermisch signalisiert wird. Die
Zellen können
ferner genetisch verändert
sein, um Proteine oder verschiedene Arten von extrazellulären Matrixkomponenten
zu exprimieren, welche entweder „normal" aber bei höheren Leveln exprimiert werden
oder irgendwie modifiziert sind, damit eine Transplantateinrichtung
extrazelluläre
Matrix und lebende Zellen aufweist, die therapeutisch vorteilhaft
für eine
verbesserte Wundheilung und vereinfachte oder gerichtete Gefäßneubildung
sind. Diese Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und sind
beschrieben bei Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989),
hierin durch Bezugnahme aufgenommen. Sämtliche der oben genannten
Zelltypen können
bei dieser Erfindung für
die Herstellung eines kultivierten Haut-Konstrukts verwendet werden,
dass die abhängigen
Medien enthaltend Cytokine synthetisieren wird.
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Während Kollagen
die am meisten bevorzugte extrazelluläre Matrixzusammensetzung für eine Verwendung
bei der Herstellung von Haut-Equivalenten ist, die Cytokine zum
Konditionieren der Kulturmedien produzieren und absondern, können andere
extrazelluläre
Matrixkomponenten verwendet werden. Diese extrazel lulären Matrixkomponenten können alleine
verwendet werden oder können
vorzugsweise mit dem Kollagen umfasst sein, um eine natürliche Dermal-Matrix
zu imitieren. Diese extrazellulären
Matrixkomponenten können
umfassen: andere Kollagene, sowohl faseriges als auch nicht-faseriges
Kollagen aus der Kollagenfamilie wie beispielsweise die Kollagentypen
II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI,
XVII, XVIII, XIX, andere Matrixproteine, welche umfassen können aber
nicht begrenzt sind auf Elastin, Proteoglycane wie beispielsweise
Dicorin oder Biglycan, oder Glycoproteine wie bespielsweise Tenascin,
Vitronectin, Fibronectin, Laminin, ThrombospondinI und Glycosaminoglycane
(GAG) wie beispielsweise Hyaluronsäure (HA). Die Dermal-Matrix
kann bezüglich
der Zusammensetzung und der Struktur variieren. Kollagenschwämme, biokompatible,
bioremodellierbare, de-zellularisierte Dermis oder Kollagengele.
Anstatt den Hautzellen extrazelluläre Matrixkomponenten bereitzustellen,
können
sie auf biologisch abbaubaren Gewebeelementen (wie beispielsweise
Nylon oder Polygalactin (PGA)) kultiviert werden, um einen Kulturträger bereitzustellen,
und zum Erzeugen einer extrazellulären Matrix kultiviert werden,
bis die Zellen und ihre Matrix den Träger umschließen. Bei
dem bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist das kultivierte Bindegewebe-Konstrukt ein kontrahiertes Kollagengel, kontrahiert
durch Fibroblasten, wie beispielsweise solche beschrieben in dem
US Patent Nr. 4,485,096 von
Bell. Bei einem alternativen Ausführungsbeispiel kann das kontrahierte
Kollagengel auf einer azellulären
Grundkollagenschicht auf einer porösen Membran angeordnet sein,
um das Gel an der Membran zu befestigen und um eine exzessive radiale
Kontraktion des Gels zu vermeiden. Verfahren zum Aufnehmen von azellulären Kollagenschichten
sind beschrieben in dem
US Patent
Nr. 5,536,656 von Kemp, et al. Jedoch bildet dieses Ausführungsbeispiel
keinen Teil der vorliegenden Erfindung, sondern stellt lediglich
eine Hintergrundinformation dar, welche für das Verständnis der Erfindung nützlich ist.
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Das
erfindungsgemäße Gewebe-Equivalent kann
unter Verwendung von Kollagen hergestellt werden, das von Haut und
einer Sehne, einschließlich
einer Rattenschwanzsehne, Kalbfellkollagen und der Kalbextensorsehne,
erhalten wurde. Andere Kollagenquellen sind geeignet. Eine besonders
bevorzugte von der gemeinsamen Kalbfingerextensorsehne erhaltene
Kollagenzusammensetzung und Verfahren zum Erhalten solcher Kollagenzusammensetzungen
sind in dem
US Patent Nr. 5,106,949 von Kemp
beschrieben.
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Ein
Haut-Equivalent wird direkt auf die untere Oberfläche einer
Gewebekulturschale gegeben, oder direkt auf ein poröses Teil
wie beispielsweise eine bezüglich
einer Flüssigkeit
permeable Membran, und zwar unter Verwendung von Verfahren gemäß den vorgenannten
Lehren von Kemp, et al. und wie es nachfolgend hier beschrieben
wird. Eine Gießmischung
mit Kollagen und Fibroblasten wird in den inneren Container 20 gegeben
und unter Bedingungen gehalten, die ein Ausbilden des Gewebe-Equivalents ermöglichen.
Die Kollagenkonzentration, die Anzahl von Zellen und das Volumen
der Gießmischung
können
gesteuert werden, um den Durchmesser und die Dicke des Lebendgewebe-Equivalentes zu steuern. Die
Gießmischung
weist Zellen mit einer Konzentration von 1,25 × 104 bis
5 × 104 Zellen/ml und Kollagen zu 0,5 bis 2,0 mg/ml
in einem Nährmedium
auf. Eine bevorzugte Zellenkonzentration ist 2,5 × 104 Zellen/ml. Die Kulturen werden in einem
Inkubator aufbewahrt, um ausreichende Umgebungsbedingungen mit kontrollierter
Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Gasmischung für die Zellenkultur zu gewährleisten. Bevorzugte
Bedingungen sind zwischen 34°C
und 38°C,
insbesondere 37 ± 1°C, bei einer
Atmosphäre zwischen
5-10 ± 1%
CO2 und einer relativen Luftfeuchtigkeit
(Rh) zwischen 80 und 90%. Sobald sich die Kollagennetzwerke kontrahiert
haben, können
sie für
chirurgische Anwendungen zum Behandeln eines Patienten verwendet
werden, der eine Gewebereparatur oder einen Gewebeersatz benötigt.
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Bei
einem alternativen Ausführungsbeispiel kann
ein azelluläres
Kollagengel vor der Ausbildung des Bindegewebe-Konstrukts auf dem Kultursubstrat gebildet
werden, um dem Substrat ein Haftmittel bereitzustellen. In einigen
Fällen
benötigt
das Substrat dieses Haftmittel, und in anderen Fällen wird es nicht benötigt. Wenn
die azelluläre
Kollagengelkomponente bei der Herstellung des kultivierten Bindegewebe-Konstrukts verwendet
wird, wurde gefunden, dass das Verhältnis des Volumens der Gießmischung
für das
Gewebe-Equivalent zu dem Volumenen der Gießmischung für das azelluläre hydrierte
Kollagengel eine Auswirkung auf die Zelllebensfähigkeit und die Zelldifferentiation
hat. Nützliche
Verhältnisse,
Volumen zu Volumen (v/v), von Gießmischung des Gewebe-Equivalentes
zu Gießmischung
des Kollagengels sind 3:1 bis 1:3. Ein bevorzugtes Verhältnis, bei welchem
die Zellkonzentration in dem Kollegennetzwerk 2,5 × 104 Zellen/ml beträgt, ist 3:1. Das azelluläre hydrierte
Kollagengel 25 wird aus einer Kollegenzusammensetzung hergestellt,
die 0,5 bis 2,0 mg/ml Kollagen, vorzugsweise ungefähr 0,9 bis
1,1 mg/ml, und Nährmedium
enthält.
Diese Kollegenzusammensetzung wird dem inneren Container 20 zugefügt und unter
Bedingungen gehalten, welche es der Kollegenzusammensetzung ermöglichen,
sich abzusetzen und ein azelluläres
hydriertes Kollagengel mit geeigneten Dimensionen, üblicherweise
1 bis 5 mm dick, zu bilden, wobei ein bevorzugter Dickebereich zwischen
2 mm und 3 mm beträgt.
Ein azelluläres
hydriertes Kollagengel 25 ist vorzugsweise dick genug, dass
ein Abschnitt azellulär
verbleibt, wenn Zellen von dem Gewebe-Equivalent in ein azelluläres hydriertes
Kollagengel wandern, und dünn
genug, so dass das Gewebe-Equivalent nicht unerwünscht von der in dem äußeren Container 10 bereitgestellten Nährquelle
entfernt wird. Jedoch bildet dieses Ausführungsbeispiel keinen Teil
der vorliegenden Erfindung, sondern stellt lediglich Hintergrundinformationen
dar, die für
das Verständnis
der Erfindung hilfreich sind.
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Bei
einem anderen alternativen Ausführungsbeispiel
wird das kultivierte Bindegewebe-Konstrukt aus Zellen gebildet,
die unter Bedingungen zum Herstellen einer Schicht einer extrazellulären Matrix
gewachsen sind, welche von den kultivierten Fibroblastenzellen synthetisiert
und zusammengesetzt ist, wobei die kultivierten Fibroblastenzellen
in der synthetisierten extrazellulären Matrixschicht enthalten
sind, wobei die extrazelluläre
Matrix durch die kultivierten Fibroblastenzellen in der Abwesenheit von
exogenen Matrixkomponenten oder synthetischen Elementen während den
Kultivierungsbedingungen produziert wird. Verfahren zum Herstellen dieser
kultivierten Bindegewebe-Konstrukte sind in der PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 00/29553 von
Murpy, et al. beschrieben.
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Sobald
eine ausreichende Zellzahl nach Isolation und Scale-Up erhalten
wurde, werden die Zellen geerntet und auf einer geeigneten Kulturoberfläche angesetzt
und unter geeigneten Wachstumsbedingungen kultiviert, um eine konfluierende
Zellschicht zu erhalten. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel werden die Zellen
auf einer porösen
Membran angesetzt, die untergetaucht wird, um einen Mediumkontakt
von unterhalb der Kultur durch die Poren und direkt von oberhalb
zu ermöglichen.
Vorzugsweise werden die Zellen entweder in einem Basis- oder einem
Wachstumsmedium suspendiert und werden auf der Zellkulturoberfläche mit
einer Dichte zwischen 1 × 105 Zellen/cm2 bis
6,6 × 105/cm2, bevorzugt zwischen
3 × 105 Zellen/cm2 bis
6,6 × 105/cm2 und am bevorzugsten
bei 6,6 × 105 Zellen/cm2, angesetzt (Zellen
pro Quadratzentimeter Oberflächenbereich). Die
Kulturen werden in einem Wachstumsmedium kultiviert, um die Kultur
zu etablieren, und werden bis zu einer Konfluenz zwischen 80% und
100% kultiviert, wobei sie zu dieser Zeit chemisch induziert werden,
indem das Medium auf ein Matrixherstellungsmedium gewechselt wird,
um die Synthese und Sekretion der extrazellulären Matrix hochzusteuern. Bei einem
alternativen Verfahren werden die Zellen direkt auf Produktionsmedien
angesetzt, um das Bedürfnis
der Änderung
von den Basismedien zu den Produktionsmedien zu vermeiden, jedoch
ist dies ein Verfahren, das höhere
Ansatzdichten benötigt.
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Während der
Kultivierung organisieren Fibroblasten die abgesonderten Matrixmoleküle, um eine
dreidimensionale gewebeähnliche
Struktur zu bilden, weisen jedoch keine signifikanten Kontraktionskräfte auf,
um die Ausbildung des Zellmatrix-Konstrukts
zu bewirken, um sich zu kontrahieren und sich selbst von dem Kultursubstrat
abzuheben. Medienaustausche werden alle zwei bis drei Tage mit einem frischen
Matrixherstellungsmedium vorgenommen, und mit der Zeit nimmt die
abgeson derte Matrix an Dicke und Organisation zu. Die Zeit, die
zum Erzeugen eines Zellmatrix-Konstrukts notwendig ist, ist abhängig von
der Fähigkeit
der anfänglichen
Ansatzdichte, dem Zelltyp, dem Alter der Zelllinie und der Fähigkeit
der Zelllinie, eine Matrix zu synthetisieren und abzusondern. Nach
vollständiger
Ausbildung haben die erfindungsgemäßen Konstrukte aufgrund der erzeugten
und durch die Zellen organisierte Fasermatrix eine Grunddicke bzw.
Bulk-Dicke; sie sind keine gewöhnlich
konfluierenden oder übermäßig konfluierenden
Zellkulturen, bei welchen die Zellen lose aneinander haften können. Die
Faserqualität
gibt den Konstrukten kohäsive
gewebeähnliche
Eigenschaften unähnlich üblichen
Kulturen, da sie einer physikalischen Beschädigung, beispielsweise Reißen und Spalten,
oder einer Routinehandhabung in klinischer Umgebung widerstehen.
Bei der Herstellung eines kultivierten Haut-Konstrukts bilden die
Zellen eine organisierte Matrix um sich selbst auf der Zellkulturoberfläche, vorzugsweise
zumindest 30 Mikrometer oder mehr dick, bevorzugter zwischen 60
bis 120 Mikrometer dick, über
die Oberfläche
der Membran. Jedoch wurden Dicken von mehr als 120 Mikrometer erreicht
und diese sind für
eine Verwendung beim Testen oder klinischen Anwendungen geeignet,
bei denen derartige größere Dicken
benötigt
werden.
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Bei
einem weiteren alternativen Ausführungsbeispiel
kann das kultivierte Bindegewebe-Konstrukt vor der Aufbringung auf
einen Patienten behandelt werden, um die Implantatannahme oder Heilung,
oder beides, bei der Aufbringungsstelle bei dem Patienten zu erhöhen. Die
Konstrukte können
mit anderen Komponenten behandelt werden, indem diese mit einer
Lösung
mit den Komponenten durch beispielsweise Eintauchen in Kontakt gebracht
werden. Komponenten für
eine Behandlung eines Konstruktes vor der Anwendung umfassen extrazelluläre Matrixkomponenten
wie beispielsweise Hyaluronsäure, Kollagen,
Proteoglycan, Orglycosaminoglycane oder Cytokine einschließlich Wachstumsfaktoren
wie beispielsweise: Basis-Fibroblast-Wachstumsfaktor (bFGF), epidermaler
Wachstumsfaktor (EFG), keratinocyter Wachstumsfaktor (KGF), Transforming-Growth-Faktor
Alpha (TFGα),
Transforming-Growth-Faktor Beta (TGFβ) einschließlich Transforming-Growth-Faktor
Beta-1 (TGFβ1)
und Transforming Growth-Faktor Beta-2 (TGFβ2), Granulocyten-Kolonie stimulierender
Faktor (FCSF), Insulin-ähnlicher
Wachstumsfaktor (IFG), Vascular-endothelial-Wachstumsfaktor (VEGF)
und Tumor-Nekrose-Faktor
(TNF). Es sei angemerkt, dass die vorstehenden Begriffe in Klammern
Abkürzungen
sind, die allgemein bekannt sind und im Stand der Technik für die formale
Nomenklatur des Vorherstehenden verwendet werden.
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Die
folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Ausführung der
vorliegenden Erfindung besser zu erklären, und sollen nicht als den
Umfang der vorliegenden Erfindung begrenzend interpretiert werden.
Der Fachmann erkennt, dass verschiedene Modifikationen an den hier
beschriebenen Verfahren vorgenommen werden können, ohne von dem Schutzumfang
der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
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BEISPIELE
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Referenzbeispiel 1: Herstellung eines
Bindegewebe-Konstrukts
mit einem kontrahierten Kollagennetzwerk
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Menschliche
neonatale Vorhaut-Fibroblasten (stammend von Organogenesis, Inc.
Canton, MA) wurden bei 5 × 105 Zellen/162 cm2 Gewebekultur
in behandelten Flaschen angesetzt und in einem Wachstumsmedium gezüchtet. Das
Wachstumsmedium besteht aus: Dublecco's Modified Eagle's medium (DMEM) (Hoch-Glukose-Formulierung, ohne L-Glutamin,
BioWhittaker, Walkersville, MD) ergänzt mit 10% neugeborenem Kalbserum
(NBCS) (HyClone Laborstories, Inc., Logan, Utah) und 4 mM L-Glutamin
(BioWhittaker, Walkersville, MD). Die Zellen werden in einem Inkubator
bei 37 ± 1°C mit einer
Atmosphäre
von 10 ± 1%
CO2 gehalten. Das Medium wurde alle zwei
bis drei Tage gegen ein frisch zubereitetes Medium ersetzt. Nach
8 Tagen in Kultur waren die Zellen auf Konfluenz gewachsen, das
heißt die
Zellen hatten eine gepackte Monoschicht entlang dem Boden der Gewebekulturflasche
gebildet, und das Medium wurde aus der Kulturflasche abgesaugt. Um
die Monoschicht auszuspülen
wurde eine steril gefilterte Phosphat-gepufferte physiologische
Kochsalzlösung
bei dem Boden jeder Kulturflasche zugegeben und dann aus den Flaschen
abgesaugt. Die Zellen wurden aus den Flaschen durch Hinzufügung von
5 ml Trypsin-Versene-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD) in
jede Flasche und sanftes Schütteln
zur Sicherstellung der vollständigen
Abdeckung der Monoschicht freigesetzt. Die Kulturen wurden in den
Inkubator zurückgeführt. Sobald
die Zellen freigesetzt waren, wurden 5 ml SBTI (Soyabohnen-Trypsin-Inhibitor)
jeder Flasche zugegeben und mit der Suspension gemischt, um die
Wirkung des Trypsin-Versene zu stoppen. Die Zellsuspension wurde aus
den Flaschen entfernt und gleichmäßig auf sterile konische Zentrifugierröhrchen verteilt.
Die Zellen wurden durch eine Zentrifugierung bei ungefähr 800 bis
1000 × g
für 5 Minuten
gesammelt.
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Eine
Vorrichtung ähnlich
der in 1 gezeigten wurde beim Ausführen der nachfolgend beschriebenen
Arbeiten verwendet. Die Abdeckung wird zum Bedienen entfernt, wird
jedoch anderweitig zum Aufrechterhalten der Sterilität geschlossen
gehalten. Sachdienliche Informationen bezüglich der Vorrichtung sind
aufgeführt:
Der äußere Container 10 weist einen
Durchmesser von 100 mm oder mehr auf. Der innere Container 200 weist
einen Durchmesser von 75 mm auf. Das permeable Element 24 besteht
aus einer Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von ungefähr 3 μm und einer
Dicke von 5 μm.
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Eine „vorgeschmischte" Lösung von
16,2 ml 10X Minium Essential Medium (MEM), 1,6 ml 200 mM L-Glutamin,
0,2 ml 50 mg/ml Gentamycin, 18,0 ml embryonales Rinderserum, 5,0
ml 71,2 mg/ml Natriumbicarbonat. Die Vorratslösungen wurden aseptisch in
der obigen Reihenfolge kombiniert und bei 4°C für 30 Minuten in einer sterilen
50 ml Röhre
gelagert. Ungefähr
27,44 ml einer 2,2 mg/ml Kollagenlösung (extrahiert durch Säure von
der gemeinsamen Kalbfingerextensorsehne) in 0,05% v/v Essigsäure wurden
in einer 50 ml Röhre
ausgewogen und für
30 Minuten bei 4°C
gelagert. Dulbecco's
Minium Essential Medium (DMEM) complete (umfassend 10% FBS, 4 mM
L-Glutamin, 50 μm/ml
Gentamycin) wurde zugegeben und 1 ml Aliquote wurden auf die Membran
des inneren Containers 20 pipettiert und eine Gelbildung
bei Raumtemperatur wurde ermöglicht.
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Die
Bindegewebeschicht, ein hydriertes Kollagengel mit Zellen, wurde
mit menschlichen Hautfibroblasten gegossen. Eine allgemeine Beschreibung der
Verfahren und Reagentien kann ebenfalls gefunden werden in dem
US Patent Nr. 4,485,096 von
Bell, dem
US Patent Nr. 5,536,656 von
Kemp, et al. und dem
US Patent
Nr. 5,712,163 von Parenteau. Die Gießmischung für die Herstellung jedes Bindegewebe-Konstrukts
umfasst ungefähr
12,5 ml der oben beschriebenen Vormischung, zu welcher 27,44 ml
einer 2,2 mg/ml Kollagenlösung
in 0,05% v/v Essigsäure, ebenfalls
oben beschrieben, und 6,25 × 10
5 menschliche Hautfibroblasten zugefügt sind.
Nachdem die Komponenten auf ein Gesamtvolumen von ungefähr 40 ml
gemischt wurden, wurde dieses in dem Container
20 verteilt
und die Gelbildung ermöglicht.
Das Kollagengel enthaltend die suspendierten Fibroblasten wurde
in Dulbecco's Minimum
Essential Medium (DMEM) getaucht, welches vollständig in den äußeren Container
20 gegeben
wurde, und dann bei 36°C/10%
CO
2 für
4 bis 8 Tage inkubiert, um zu ermöglichen, dass die Zellen das
Kollagen kontrahieren, um ein kontrahiertes Kollagennetzwerk zu
bilden, welches das kultivierte Bindegewebe-Konstrukt
52 darstellt.
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Beispiel 1: Herstellung eines Bindegewebe-Konstrukts
aus kultivierten Zellen und endogen hergestellten extrazellulären Matrixkomponenten
ohne die Erfordernis von exogenen Matrixkomponenten oder Netzwerkunterstützung oder
Gerüstelementen
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Das
Bindegewebe-Konstrukt von kultivierten Zellen und endogen hergestellten
extrazellulären Matrixkomponenten
wurde gemäß den Lehren
von Murphy, et al., beschrieben in der PCT-Veröffentlichung
WO 00/29553 hergestellt.
Menschliche neonatale Vorhautfibroblasten wurden kultiviert, um
deren Anzahl zu erhöhen,
und zwar unter Verwendung der in dem Referenzbeispiel 1 beschriebenen
Verfahren, jedoch in einem chemisch definierten Medium, dass heißt ohne
Serum oder Organextrakte von Tieren. Die Zellen wurden dann resuspendiert
auf eine Konzentration von 3 × 10
6 Zellen/ml und angesetzt auf behandelten
Membraneinsätzen
mit 0,4 μm
Porengröße, 24 mm
Durchmesser in einem Magazin mit 6 Mulden bei einer Dichte von 3,0 × 10
6 Zellen/TW (6,6 × 10
5 Zellen/cm
2). Die Zellen bei diesem Beispiel wurden
vollständig
in einem chemisch definierten Medium kultiviert.
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Das
Medium enthält:
eine Basis 3:1 Mischung von DMEM, Hams F-12 Medium (Quality Biologics,
Gaithersburg, MD) 4 mM Gluta-MAX
(Gibco BRL, Grand Island, NY) und Zusätze: 5 ng/ml menschlicher rekombinanter
Epidermal-Wachstumsfaktor (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY),
1 × 10–4 M
Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY, Katalog Nr. 02400 ACS-Reinheit),
1 × 10–4 M
o-Phosphoryl-Ethanolamin
(Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin
(Sigma, St. Louis, MO), 20 ρM
Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis,
MO), 0,4 μg/ml
Hydrochortison (Sigma, St. Louis, MO), 6,78 μg/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals
Company, Milwaukee, WI), 50 μg/ml
L-Ascorbinsäure
(WAKO Chemicals USA, Inc.), 0,2 μg/ml L-Prolin (Sigma, St.
Louis, MO), 0,1 μg/ml
Glycin (Sigma, St. Louis, MO).
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Proben
für histologische
Analysen wurden bei den Tagen 7, 14 und 21 gezogen und in Formalin fixiert,
dann in Paraffin für
eine Hemotoxylin- und Eosinfärbung
für eine
Lichtmikroskopanalyse eingebettet. Eine den Kollagengehalt des Konstrukts
messende biochemische Analyse zeigt 170,88 ± 9,07 μg/cm2. Neben
endogen hergestellten Fibrillarkollagen waren ebenfalls Decorin
und Glycosaminoglycan in den Zellmatrix-Konstrukten enthalten. Die gebildeten
kultivierten Haut-Konstrukte
weisen Hautfibroblasten und eine endogen erzeugte Matrix auf. Sämtliche weisen
vollständig
ausgebildete Kollagenfasern in gepackter Organisation, angeordnet
zwischen den Zellen, auf. Deren Faserqualitäten, Dicke und Kohäsionsintegrität geben
dem Konstrukt eine beträchtliche
Stärke,
die es diesem erlaubt, abschälend
von der Kulturmembran entfernt zu werden und gehandhabt zu werden,
wenn es auf einen mit dem Konstrukt zu behandelnden Patienten übertragen
wird, und zwar als verpflanztes Gewebe oder Implantat.
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Beispiel 2: Verwendung eines Bindegewebe-Konstrukts
zum Reparieren des Faserrings nach einer teilweisen Diskektomie
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Um
die Persistenz der transplantierten Fibroblasten in dem kultivierten
Bindegewebe-Konstrukt zu überwachen,
werden Konstrukte mit vom Schwein stammenden Fibroblasten, gekennzeichnet
mit grünfluoriszierendem
Protein (GFP), in ein Schwein-Modell
implantiert.
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Sechs
junge Schweine unterschiedlichen Geschlechts bis zu 50 kg wurden
individuell mindestens zwei Tage vor der Operation aufgezogen, wobei sie
mit üblichem
Schweinefutter gefüttert
wurden.
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Versuchstiere
wurden mit Telazol und Atropin voranästhesiert und intubiert. Sie
werden auf ein Inhalationsgas aus Isofluran und Sauerstoff gesetzt und
in der Narkose gehalten. Ihnen wird ebenfalls ein Antibiotika verabreicht.
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Defekte
an den Scheiben werden erzeugt, indem 5 × 10 mm große Einschnitte an dem Faserring vorgenommen
werden, gefolgt von einer Standard-Diskotomie mit gleichmäßiger Kernentfernung bei
jedem Raum. Eine Gesamtzahl von drei Scheiben werden pro Schwein
operiert. Zwei Stellen werden mit kultivierten Bindegewebe-Konstrukten
mit GFP-markierten Fibroblasten behandelt und die verbleibende Stelle
dient als eine Kontrolle. Um das Bindegewebe-Konstrukt anzuwenden,
wird es zunächst in
drei oder vier kleinere Teile getrennt und dann in die Ringöffnung eingeführt. Zwei
Tiere werden jeweils in den Wochen 2, 4 und 6 euthanisiert und die Operationsbereiche
werden entfernt. Die Scheiben werden vor der histologischen Bearbeitung
in Formalin und anschließend
70%igem Enthanol angeordnet. Die Scheiben werden nacheinander sektioniert
und unter Fluoreszenz auf einen Nachweis von GFP-markierten Fibroblasten
untersucht.
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Beispiel 3: Verwendung eines Bindegewebe-Konstrukts
mit Bandscheiben-Spacer zum Aufrechterhalten des Zwischenwirbelraums
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Um
die Persistenz von übertragenen
Fibroblasten in dem kultivierten Bindegewebe-Konstrukt zu beobachten,
werden Konstrukte mit Fibroblasten in ein Schwein-Modell implantiert.
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Versuchsstiere
werden mit Telazol und Antropin voranästäsiert und intubiert. Sie werden
auf ein Inhalationsgas aus Isofluran und Sauerstoff gesetzt und
und in der Narkose gehalten. Ihnen wird ebenfalls ein Antibiotika
verabreicht.
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Defekte
an den Scheiben werden erzeugt, indem 5 × 10 mm große Einschnitte an dem Faserring vorgenommen
werden, gefolgt von einer Standard-Diskotomie mit gleichmäßiger Kernentfernung bei
jedem Raum. Eine Gesamtzahl von drei Scheiben werden pro Schwein
operiert.
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Über die
in dem Faserring hergestellte Öffnung
wird der Zwischenwirbelraum geöffnet
und die Scheibe entfernt, und zwar begrenzt auf den vornliegenden
und mittleren dritten Abschnitt. Der Bandscheiben-Spacer weist ein
Dacron-Gewebe auf, und ein Hydrogel wird in dem Thoraxhohlraum angeordnet,
in dem es durch die Öffnung
in dem Faserring eingeführt
wird. Eine ordnungsgemäße Positionierung
des Implantates wird sichergestellt unter Verwendung von radiologischen
Verfahren, und dann wird der Spacer an Ort und Stelle fixiert. Das
kultivierte Bindegewebe-Konstrukt wird dann auf die annulare Öffnung aufgebracht,
indem das Konstrukt zunächst
auf die Größe der annularen
Lochöffnung
abgestimmt wird, und dann unter Verwendung resorbierbaren Nahtmaterials
mit dem die Öffnung
umgebenden Gewebe des Raumes vernäht wird. Während sämtliche drei Stellen mit einem
Bandscheiben-Spacer versehen werden, werden zwei Stellen mit kultiviertem
Bindegewebe-Konstrukten behandelt und die verbleibende Stelle dient
als Kontrolle.
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Zwei
Tiere werden jeweils nach 2, 4 und 6 Wochen euthanisiert und die
Operationsstellen werden entfernt. Die Scheiben werden in Formalin
und anschließend
in 70%igen Ethanol vor der histologischen Bearbeitung angeordnet.
Die Scheiben werden seriell sektioniert und unter Fluoreszenzlicht
auf ein Vorhandensein von GFP-markierten Fibroblasten untersucht.
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Bei
sämtlichen
Proben verbleiben die Bandscheiben-Spacer an ihren ursprünglichen
Stellen. Bei Kontrollproben zeigte der Gallertkern einen signifikanten
Verlust an Proteoglycan und Kollagen und eine Zunahme von anderen
Nicht-Kollagenen in dem Hohlraum. Bei Versuchsproben bildet das
Bindegewebe-Konstrukt eine vollständige Narbe über der
in dem Faserring erzeugten Öffnung.
Die biochemische Zusammensetzung des Hohlraums hat sich geringfügig geändert, war
jedoch näher
an der Zusammensetzung der negativen Kontrollproben, was andeutet, dass
die Fibrosis des Hohlraumes durch den Verschluß des Ringes nach der Scheibenverletzung
wesentlich vermindert wurde.
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Beispiel 4: Eine Studie bezüglich des
zeitlichen Verlaufs bei Verwendung von Bindegewebe-Konstrukten bei
der Korrektur des Faserrings bei Schweinen.
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Eine
Diskektomie zum Entfernen eines beschädigten und herausgedrängten Gallertkernes
ist eine übliche
klinische Praxis zum Mildern von Schmerz und einer neurologischen
Störung.
Die Operation erzeugt einen Defekt im Faserring, der sich oft mit
faserigem Gewebe füllt,
eine Situation, die schließlich
zu einem Kollaps der Bandscheibe führt und eine Fusion der benachbarten
Wirbelsegmente erfordert.
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Es
wurden vom Schwein stammende Bindegewebe-Konstrukte hergestellt,
und zwar unter Verwendung von vom Schwein stammenden Hautfibroblasten,
die gemäß den in
Referenzbeispiel 1 dargelegten Verfahren zum Exprimieren von grünem Floureszenzprotein
(GFP) transfiziert wurden. Jedes Konstrukt wurde hergestellt aus
einem vom Rind stammenden Typ-I-Kollagen mit 20 bis 30 Millionen wachstumsfähigen GFP-transfizierten
vom Schwein stammenden Hautfibroblasten und war ungefähr 2 mm
dick. Es war der Zweck dieser Studie, die Durchführbarkeit bzw. Geeignetheit
von Bindegewebe-Konstrukten zum Reparieren des Faserrings bei einem
von einem Schwein stammenden Modell zu untersuchen und die Biokompatibilität, die Persistenz und
das Remodellieren der Konstrukte bei diesem Modell zu bestimmen.
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Sechs
drei bis vier Monate alte Schweine wurden für die Untersuchung verwendet.
Bei jedem Tier wurden drei aufeinanderfolgende Bandscheiben durch
eine Laminotomie posterior freigelegt. Bei jeder freigelegten Scheibe
wurde ein chirurgischer Ringdefekt erzeugt. Mehrere Teile eines
Bindegewebe- Konstruktes,
jedes mit einem Durchmesser von ungefähr 2 bis 5 mm, wurden in zwei
Defekte jedes Tieres implantiert. Der andere Scheibeneffekt wurde zur
Kontrolle leer gelassen. Die Schweine wurden in Zweiergruppen 2,
4 und 6 Wochen nach der Implantierung euthanisiert. Die die operierten
Scheiben enthaltende Wirbelsäule
wurde entfernt und in 10%igem neutral gepuffertem Formalin fixiert.
Bei Hemotoxillin- und Eosineingefärbten Sektionen wurde eine
Hellfeldmikroskopie für
einen allgemeinen Befund durchgeführt, und eine Fluoreszenzmikroskopie
wurde zum Identifizieren von mit grünfluoreszierendem Protein markierten
Zellen bei ungefärbten
Abschnitten durchgeführt.
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Die
Mikroskopie erbrachte bei mehreren der behandelten Ringe von den
zwei Tiergruppen, die nach 2 und 4 Wochen euthanisiert wurden, einen
klaren Beweis von Resten von implantierten Bindegewebe-Konstrukten.
Es war ferner identifizierbar eine Remodellierung der Reste des
Bindegewebe-Konstruktes durch das Wirtsgewebe. Die implantierten Defekte
zeigten eine geringere Entzündung
und eine weiter fortgeschrittene Heilung als die Kontrollen zu jeder
Zeit. Die implantierten Defekte wiesen die Öffnung überbrückendes knorpeliges Gewebe
auf, wohingegen die Kontrolldefekte noch immer eine signifikante
Menge faserigen Gewebes aufwiesen. Die Ergebnisse dieser Machbarkeitsstudie
zeigen, dass das implantierte Schwein-Bindegewebe-Konstrukt bezüglich des
Wirtsgewebes biokompatibel war, bis zu vier Wochen bestehen kann
und die Wiederherstellungsaktivitäten des Ringes um sechs Wochen erhöhen kann.
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Obwohl
die vorstehende Erfindung zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses
detailliert anhand einer Veranschaulichung und von Beispielen beschrieben
wurde, ist es für
den Fachmann verständlich,
dass bestimmte Änderungen
und Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der beigefügten Ansprüche ausgeführt werden
können.