DE112008001641T5

DE112008001641T5 - Reparatur und Behandlung von Knochendefekt unter Verwendung von einem durch hypertrophierungsfähige Chondrozyten hergestellten Wirkstoff und Gerüst

Info

Publication number: DE112008001641T5
Application number: DE112008001641T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Okihana
Original assignee: Hoya Corp
Current assignee: Hoya Corp
Priority date: 2007-06-20
Filing date: 2008-06-20
Publication date: 2010-09-09
Also published as: JPWO2008156221A1; US20100297210A1; WO2008156221A1

Abstract

Ein Verbundmaterial zur Förderung oder Induzierung der Osteogenese in einem biologischen Organismus, das folgendes umfasst:
A) einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium erhalten wird, das Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure und eine Serumkomponente beinhaltet; und
B) ein biokompatibles Gerüst.

Description

FACHGEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verbundmaterial, das einen die Osteoblastendifferenzierung induzierenden Wirkstoff, der durch hypertrophierungsfähige Chondrozyten (Chondrozyten mit einer Fähigkeit zur Hypertrophie) hergestellt (induziert) wird, und ein Gerüst beinhaltet, und ein Verfahren zur Herstellung des Verbundmaterials und ein Verfahren zur Verwendung des Verbundmaterials.
STAND DER TECHNIK
Die Osteogenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer abnehmenden Osteogenese, Knochenverletzungen oder Knochendefekten einhergehen. Wenn ein Knochengewebe eine Verletzung, wie eine Knochenfraktur oder ein Abriss, aufgrund eines Knochentumors erfährt, proliferieren und differenzieren Osteoblasten, die knochenbildende Zellen darstellen, unter Bildung von Knochen so dass die Knochenfraktur oder eine Region mit Knochendefekt geheilt wird. Im Falle einer leichten Verletzung können durch Immobilisierung des Knochens in dem betroffenen Bereich die Osteoblasten aktiviert werden, so dass der betroffene Bereich geheilt wird.
Wenn Osteoblasten unter Umständen, wie komplexe Fraktur, große Ostektomie-Schäden oder ein Schaden in Verbindung mit Osteomyelitis, nicht wirksam aktiviert werden können, wird die autologe Knochenimplantation im Allgemeinen für einen solchen Schaden oder Defekt als Standardbehandlung für die Reparatur betrachtet. Wenn ferner die beschädigte Region für eine Reparatur mit autologem Knochen zu groß ist, kann künstlicher Knochen zum Teil in Kombination mit autologem Knochen verwendet werden.
Allerdings sind bei Menschen die Quellen für autologen Knochen auf einen Patienten begrenzt, und die zum Erwerb zur Verfügung stehende Menge aus dem Patienten ist begrenzt. Außerdem ist eine zusätzliche Operation zum Erwerb von autologen Knochen erforderlich und der Erwerb davon geht mit hohen Kosten und Schmerzen für den Patienten einher. Zusätzlich verursacht die Verwendung von autologem Knochen einen neuen Knochendefekt für die Region (normale Knochenregion), aus der der Knochen stammt.
Darum wurden verschiedene chirurgische Behandlungen, wie die Verwendung eines künstlichen Knochenimplantats und von anderen Knochenersatzmaterialien eingeführt. Es ist ebenfalls möglich, eine defekte Region eines biologischen Organismus, wie Knochen, die von einem Trauma und einer chirurgischen Entfernung eines Knochentumors herrührt, zu reparieren, indem biologisches Gewebeersatzmaterial, wie ein Knochenersatzmaterial, in die defekte Region implantiert wird. Hauptsächlich sind Hydroxylapatit (HAP) oder Tricalciumphosphat (TCP) als das Knochenersatzmaterial bekannt.
Im Vergleich zu autologem Knochen weisen die herkömmlichen künstlichen Knochenimplantate und Knochenersatzmaterialien allerdings auch Nachteile auf, wie schlechte Knochenbildung aufgrund eines schwachen Knochenbildungsvermögens und leichte Brüchigkeit bei Belastung aufgrund einer geringen Steifigkeit. Darum ist nach diesen chirurgischen Behandlungen die Prognose oft schlecht und es werden oft mehrere Operationen benötigt. Obwohl der Prozentsatz der Verwendung von künstlichem Knochen aus den obigen Gründen zugenommen hat, bleibt sie immer noch bei etwa 30%, während autologer Knochen in den restlichen 60 bis 70% der Fälle verwendet wird.
In den USA wird oft allogener Knochen verwendet. Andererseits ist bei Japanern die Verwendung von Leichengewebe unbeliebt und somit wird Leichengewebe nicht so oft verwendet. Obwohl Knochenbanken eine alternative Möglichkeit der Bereitstellung von autologem Knochen darstellen, ist bisher die Entwicklung unzureichend.
Zur Behebung der oben aufgeführten Nachteile von herkömmlichem künstlichem Knochen, wurden bereits Versuche zum Einsatz der regenerativen Medizin unter Verwendung der Regenerationsfähigkeit von Zellen zur Anwendung einer Behandlung füh eine Region mit Knochenfraktur oder eine Region mit Knochendefekt unternommen. Diese Versuche wurden auch zur Erhöhung der post-operativen Reparaturrate der Region mit Knochendefekt angewandt.
Stammzellen, die aus Knochenmark stammen, werden im Allgemeinen bei einer solchen regenerativen Medizin verwendet. Es wurde vorgeschlagen, ein biologisches Gewebeersatzmaterial, wie kultivierte Knochen, zu verwenden, das durch Kultivieren von Knochenmarksstammzellen oder differenzierten Osteoblasten, die aus einem Patienten stammen, mit einem Knochenersatzmaterial hergestellt wird. Bei einem solchen biologischen Gewebeersatzmaterial werden viele Knochenmarksstammzellen oder differenzierte Osteoblasten auf dem Knochenersatzmaterial als Gerüst zu ihrer Kultivierung proliferiert.
Wenn das biologische Gewebeersatzmaterial in eine Region mit Knochendefekt implantiert wird, werden die Zellen zusammen mit dem Knochenersatzmaterial ebenfalls darin implantiert. Dies ermöglicht es, die zuvor genannten Nachteile von künstlichem Knochen zu kompensieren und die Osteogenesedauer im Vergleich zu einem Verfahren, bei dem das Knochenersatzmaterial allein in die Region mit Knochendefekt implantiert wird, zu verringern.
Zur Differenzierung von aus Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammellen zu Osteoblasten wird unter Verwendung der regenerativen Medizin herkömmlich ein von Maniatopoulos et al. vorgeschlagenes Verfahren, bei dem die drei Verbindungen Dexamethason, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure verwendet werden, und ein Verfahren, bei dem Konzentrationen dieser drei Verbindungen verändert werden, verwendet.
Allerdings sind diese Verfahren künstlich und nicht natürlich. (Nicht-Patentdokument 1, d. h., Maniatopoulos et al.: Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res, 254: 317–330, 1988.). Unter den Stammzellen gibt es noch immer Zellen, durch diese drei Verbindungen nicht differenziert wurden. Als Folge besteht das Verlangen nach Eigenschaft und Funktion von differenzierten Osteoblasten.
Darum bedarf es der Bereitstellung von sicheren, kostengünstigen und stabilen Osteoblasten zur Behandlung von Krankheiten, die mit der abnehmenden Osteogenese, Knochenverletzungen oder Knochendefekten einhergehen.
Es wird angenommen, dass BMP(knochenmorphogenetisches Protein)-2, BMP-4 und BMP-7 durch Induktion von Osteoblasten bei der Osteogenese eine bedeutende Rolle spielen. Es wird angenommen, dass BMP-2, BMP-4 und BMP-7 zu Osteoblasten induzieren. Obwohl es in der BMP-Familie viele Familienmitglieder gibt, stellen von BMP-2-, BMP-4- und BMP-7 verschiedene Moleküle Homologe dar, die basierend auf einer zuvor identifizierten Sequenz von BMP-2 ohne Rücksicht auf ihre Funktion erhalten wurden. Daher verfügen die Homologen nicht immer über die Fähigkeit, die Differenzierung zu Osteoblasten zu induzieren.
Es wird beschrieben, dass BMP-2, BMP-4 und BMP-7 die Osteoblasten wirksam in Mäusen und Ratten induzieren, jedoch beträgt die Wirksamkeit nur ein Tausendstel von derjenigen im Menschen (Nicht-Patentdokumente 2 bis 5, d. h., Wozney, J. M. et al.: Novel Regulators of Bone Formation: Molecular Clones and Activities. Science, 242: 1528–1534, 1988.; Wuerzler K. K. et al.: Radiation-Induced Impairment of Bone Healing Can Be overcome by Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2. J. Craniofacial Surg., 9: 131–137, 1998.; Govender S. et al.: Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 for treatment of Open Tibial Fractures. J. Bone Joint Surg., 84A: 2123–2134, 2002.; Johnsson R. et al.: Randomized Radiostereometric Study Comparing Osteogenic Protein-1 (BMP-7) and Autograft Bone in Human Noninstrumented Posterolateral Lumber Fusion. Spine, 27: 2654–2661, 2002).
Der vorliegende Erfinder hat festgestellt, dass die Osteogenese aufgrund von intrakartilaginärer Ossifikation durch BMP-Implantation in Heterotopien induziert wird. Wozney et al., die BMP klonierten, verwendeten den Ausdruck ”Knorpel-induzierende Aktivität” beim Messen der BMP-Aktivität (Nicht-Patentdokument 2, d. h., Wozney, J. M. et al.: Novel Regulators of Bone Formation: Molecular Clones and Activities. Science, 242: 1528–1534, 1988).
Mit dieser Feststellung berücksichtigte der vorliegende Erfinder, dass die Osteogenese nicht direkt von BMP-2, BMP-4 und BMP-7 induziert wird, sondern von Osteoblasten induziert wird, die durch einen Wirkstoff differenziert werden, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird, die durch BMP-2, BMP-4 und BMP-7 induziert werden (Nicht-Patentdokumente 6 und 7, d. h., Hiroyuki Okihana: seichonankotsu no seisansuru kotsukeiseiinshi [an osteogenesic agent hergestellt vongrowth cartilage], igaku no ayumi [Journal of Clinical and Experimental Medicine], 165: 419, 1993.; Okihana, H. & Shimomura, Y: Osteogenic Activity of Growth Cartilage Examined by Implanting Decalcified and Devitalized Ribs and Costal Cartilage Zone, and Living Growth Cartilage Cells. Bone, 13: 387–393, 1992).
Ein peptiderger Wirkstoff oder ein aus einem biologischen Organismus stammender Wirkstoff mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder mehr, der die Induktion, Chemotaxis und Aktivierung von Osteoblasten direkt beeinflusst, war jedoch unbekannt.
Das Patentdokument 1 (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 2004-305259 ) offenbart ein Verfahren zur Herstellung für ein biologisches Gewebeersatzmaterial. Das Verfahren umfasst das Anheften von Stammzellen an ein biologisches Gewebeersatzmaterial, das Induzieren der Differenzierung der Stammzellen, wodurch die Wirkung der Bildung eines biologischen Gewebes unter Verwendung des biologischen Gewebeersatzmaterials als Gerüst hervorgerufen wird, und die Behandlung zur Devitalisierung der gebildeten Gewebezellen. Das Patentdokument 1 offenbart, dass die Stammzellen an dem biologischen Gewebeersatzmaterial anhaften und dann zu Osteoblasten differenziert werden.
Das Patentdokument 1 offenbart ferner, dass die Differenzierung induzierende Wirkstoffe, wie ein essenzielles Minimalmedium, fötales Kälberserum (FBS), Dexamethason und β-Glycerophosphat und Nahrungsergänzungsmittel, wie Ascorbinsäure, mit einem in dieser Kultur zu verwendenden Medium vermischt werden können und dass ein Medium, mit dem das essenzielle Minimalmedium, fötale Kälberserum (FBS) und Dexamethason vermischt werden, in einer Zellkultur verwendet wird.
Jedoch offenbart das Patentdokument 1 folgendes nicht: ein Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung, das einen die Osteoblastendifferenzierung induzierenden Wirkstoff und ein Gerüst beinhaltet und die Tatsache, dass das Verbundmaterial die Osteogenese in einem biologischen Organismus fördert und induziert.
Das Patentdokument 2 (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 2004-305260 ) offenbart ein Verfahren zur Herstellung füh ein biologisches Gewebeersatzmaterial. Das Verfahren umfasst das Anheften von Stammzellen an ein biologisches Gewebeersatzmaterial, das Induzieren der Differenzierung der Stammzellen, wodurch die Wirkung der Bildung eines biologischen Gewebes unter Verwendung des biologischen Gewebeersatzmaterials als Gerüst hervorgerufen wird, und die Behandlung zur Devitalisierung der gebildeten Gewebezellen, wobei die Behandlung zur Devitalisierung das Einfrieren des biologischen Gewebeersatzmaterials und das anschließende Trocknen einschließt. Das Patentdokument 2 offenbart, dass die Stammzellen an dem biologischen Gewebeersatzmaterial anhaften und dann zu Osteoblasten differenziert werden.
Das Patentdokument 2 offenbart ferner, dass die Differenzierung induzierende Wirkstoffe, wie ein essenzielles Minimalmedium, fötales Kälberserum (FBS), Dexamethason und β-Glycerophosphat und Nahrungsergänzungsmittel, wie Ascorbinsäure, mit einem in dieser Kultur zu verwendenden Medium vermischt werden und dass ein Medium, mit dem das essenzielle Minimalmedium, fötale Kälberserum (FBS) und Dexamethason vermischt werden, in einer Zellkultur verwendet wird.
Jedoch offenbart das Patentdokument 2 folgendes nicht: ein Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung, das einen die Osteoblastendifferenzierung induzierenden Wirkstoff und ein Gerüst beinhaltet, und die Tatsache, dass das Verbundmaterial die Osteogenese in einem biologischen Organismus fördert und induziert.
Das Patentdokument 3 (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 2004-49142 ) offenbart ein Verfahren zur Herstellung von kultiviertem Knochen. Das Verfahren umfasst folgendes: einen ersten Kultivierungsschritt zum Erhalt mesenchymaler Stammzellen durch Kultivieren von aus einem Patienten gewonnener Knochenmarkszellen in einem vorbestimmten Kulturmedium; einen zweiten Kultivierungsschritt zur Induzierung der Differenzierung der kultivierten mesenchymalen Stammzellen zu Osteoblasten durch ihre Kultivierung in einem vorbestimmten knochenbildenden Kulturmedium; einen Gewinnungsschritt zur Gewinnung der differenzierten Osteoblasten und eines hergestellten Knochensubstrats; und einen Vermischungsschritt zum Vermischen der gewonnenen Ostenblasten und des Knochensubstrats mit Kügelchen aus einem Knochenersatzmaterial.
Das Patentdokument 3 offenbart ferner, dass die mesenchymalen Stammzellen zu den Osteoblasten unter Verwendung eines Mediums differenziert werden, mit dem die Differenzierung induzierende Wirkstoffe, wie ein essenzielles Minimalmedium, fötales Kälberserum (FBS), Dexamethason und β-Glycerophosphat und Nahrungsergänzungsmittel, wie Ascorbinsäure, vermischt werden.
Jedoch offenbart das Patentdokument 3 folgendes nicht: ein Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung, das einen die Osteoblastendifferenzierung induzierenden Wirkstoff und ein Gerüst beinhaltet, und die Tatsache, dass das Verbundmaterial die Osteogenese in einem biologischen Organismus fördert und induziert.
Das Patentdokument 4 (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 2005-205074 ) offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines kultivierten Knochens, indem mesenchymale Stammzellen, die durch Kultivieren der aus einem Patienten gewonnenen Zellen erhalten wurden, auf einem Knochenersatzmaterial getragen werden, und dann die mesenchymalen Stammzellen, die auf dem Knochenersatzmaterial getragen werden, kultiviert und zu Osteoblasten differenziert werden oder ein Verfahren zur Herstellung eines kultivierten Knochens, indem mesenchymale Stammzellen, die durch Kultivieren der aus einem Patienten gewonnenen Zellen erhalten wurden, zu Osteoblasten differenziert und dann die Osteoblasten auf einem Knochenersatzmaterial getragen werden.
Das Patentdokument 4 offenbart ferner, dass die mesenchymalen Stammzellen zu den Osteoblasten unter Verwendung eines Mediums differenziert werden, mit dem die Differenzierung induzierende Wirkstoffe, wie ein essenzielles Minimalmedium, fötales Kälberserum (FBS), Dexamethason und β-Glycerophosphat und Nahrungsergänzungsmittel, wie Ascorbinsäure, vermischt werden. Bei diesem Verfahren muss der Kulturflüssigkeit zur Kultivierung der dem Patienten entnommenen Zellen, der Kulturflüssigkeit zur Kultivierung der mesenchymalen Stammzellen oder der Kulturflüssigkeit nach Induzierung der Differenzierung der mesenchymalen Stammzellen zu den Osteoblasten plättchenreiches Plasma zugesetzt werden.
Jedoch offenbart das Patentdokument 4 folgendes nicht: ein Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung, das einen die Osteoblastendifferenzierung induzierenden Wirkstoff und ein Gerüst beinhaltet, und die Tatsache, dass das Verbundmaterial die Osteogenese in einem biologischen Organismus fördert und induziert.
Das Patentdokument 5 (offengelegte PCT der japanischen nationalen Phase Nr. 2003-531604 ) offenbart ein Verfahren zur Isolierung mesenchymaler Stammzelle aus einem menschlichen Gewebe nach der Geburt, wie menschliches Präputium-Gewebe nach der Geburt, sowie ein Verfahren zur Induzierung der Differenzierung der isolierten mesenchymalen Stammzellen zu verschiedenen Zelllinien, wie Osteogenese, Adipogenese und einer Knorpelbildungslinie.
Das Patentdokument 5 offenbart ferner, dass die mesenchymalen Stammzellen zu den Osteoblasten unter Verwendung eines Mediums differenziert werden, das fötales Kälberserum (FBS), antibiotische und osteogene Ergänzungssubstanzen, wie Dexamethason, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure-2-Phosphorsäure beinhaltet.
Jedoch offenbart das Patentdokument 5 folgendes nicht: ein Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung, das das einen die Osteoblastendifferenzierung induzierenden Wirkstoff und ein Gerüst enthält, und die Tatsache, dass das Verbundmaterial die Osteogenese in einem biologischen Organismus fördert und induziert.
Das Patentdokument 6 (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 2006-289062 ) offenbart ein Knochenersatzmaterial, das unter Verwendung von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten und eines Gerüsts hergestellt wird. Jedoch offenbart das Patentdokument 6 folgendes nicht: ein Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung, das einen die Osteoblastendifferenzierung induzierenden Wirkstoff und ein Gerüst enthält, und die Tatsache, dass das Verbundmaterial die Osteogenese in einem biologischen Organismus fördert und induziert.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG VON DER ERFINDUNG ZU LÖSENDE PROBLEME
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verbundmaterials, das einen die Osteoblastendifferenzierung induzierenden Wirkstoff, der durch hypertrophierungsfähige Chondrozyten induziert (produziert) wird, und ein Gerüst enthält, das zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer abnehmenden Osteogenese, Knochenverletzungen oder Knochendefekten zusammenhängen, insbesondere zur Behandlung von Knochentumoren, komplexen Frakturen und dergleichen, verwendet werden kann, und ein Verfahren zur Herstellung des Verbundmaterials und ein Verfahren zur Verwendung des Verbundmaterials.
Ferner ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verbundmaterial bereitzustellen, das einen die Osteoblastendifferenzierung induzierenden Wirkstoff, der durch hypertrophierungsfähige Chondrozyten induziert (produziert) wird, und ein Gerüst enthält, das zur Knochenbildung in einer Region verwendet werden kann, in deren Umgebung kein Knochen vorhanden ist.
MITTEL ZUR LÖSUNG DER PROBLEME
Diese Ziele wurden durch ein Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung erreicht, das einen die Osteoblastendifferenzierung induzierenden Wirkstoff und ein biokompatibles Gerüst enthält. Im Allgemeinen wird es in dem Fall, wenn ein die Osteoblastendifferenzierung induzierender Wirkstoff allein in einem biologischen Organismus implantiert wird, es in dem biologischen Organismus zerstreut und geht verloren, und somit können undifferenzierte Zellen nicht zu Osteoblasten induziert werden. Allerdings wurde durch Experimente festgestellt, dass das Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung eine Eigenschaft besitzt, die unerwartet Osteogenese auslösen kann.
Das bedeutet, die vorliegende Erfindung hat als erste die Promotion oder Induzierung von Osteogenese in dem biologischen Organismus unter Verwendung einer Kombination des die Osteoblastendifferenzierung induzierenden Wirkstoffs und des biokompatiblen Gerüsts erreicht.
Im Einzelnen stellt die vorliegende Erfindung zum Erreichen der obigen Ziele die folgenden Mittel bereit:
(Punkt 1)
Ein Verbundmaterial zur Promotion oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus, umfassend:

A) einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierender Wirkstoff, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem einen Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium erhalten wird, das mindestens eines, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend ein Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure, enthält; und
B) ein biokompatibles Gerüst.

(Punkt 1A)
Ein Verbundmaterial zur Promotion oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus, umfassend:

A) einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierender Wirkstoff, der durch Kultivieren hypertrophierungsfähiger Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium erhalten wird, das Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure und eine Serumkomponente beinhaltet; und
B) ein biokompatibles Gerüst.

(Punkt 1B)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in folgendem vorkommt (1) in dem Medium, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden, oder 2) in einer Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder höher, die erhalten wird, indem mit einem Überstand des Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, unter Verwendung eines Filters mit einer molekularen Trenngrenze von 50.000 kultiviert werden.
(Punkt 2)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff konzentriert ist.
(Punkt 3)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff gefriergetrocknet ist.
(Punkt 3A)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff konzentriert oder gefriergetrocknet ist.
(Punkt 4)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff an dem biokompatiblen Gerüst haftet.
(Punkt 5)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in dem biokompatiblen Gerüst dispergiert ist.
(Punkt 6)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff an einer vorbestimmten Region des biokompatiblen Gerüsts, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend eine Oberfläche davon und eine interne Pore davon, haftet oder darin dispergiert ist.
(Punkt 7)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei das biokompatible Gerüst aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend ein gelatineartiges Gerüst und ein dreidimensionales Gerüst.
(Punkt 7A)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei das biokompatible Gerüst ein Material beinhaltet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Aluminiumoxid, Zirconiumoxid, Apatit-Wollastonit enthaltendes Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix, Seide, Cellulose, Dextran, Agarose, Agar, synthetisches Polypeptid, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglycolsäure, Polymethylmethacrylat, Polycyanoacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, ein Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, Nylon und eine Kombination davon.
(Punkt 8)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei das biokompatible Gerüst ein Material beinhaltet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend poröses Hydroxylapatit, super-poröses Hydroxylapatit, ein Apatit-Collagen-Gemisch, einen Apatit-Collagen-Komplex, Collagengel, Collagenschwamm, Gelatineschwamm, Fibringel, synthetisches Peptid, ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix, Alginsäure, Agarose, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, ein Polyglycolsäure/Polymilchsäure-Copolymer und eine Kombination davon.
(Punkt 8A)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei das biokompatible Gerüst ein Material beinhaltet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend den Hydroxylapatit, das Collagen, die Alginsäure, ein Gemisch von Laminin, Typ-IV-Collagen und Entactin, und eine Kombination davon.
(Punkt 9)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium sowohl β-Glycerophosphat als auch Ascorbinsäure beinhaltet.
(Punkt 10)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium weiterhin eine Serum-Komponente enthält.
(Punkt 10A)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in einem gefriergetrockneten Zustand mit einer Collagenlösung gemischt wird, und wobei das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium ein Minimum Essential Medium (MEM) als eine Basiskomponente beinhaltet.
(Punkt 11)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in einem gefriergetrockneten Zustand mit einer Collagenlösung gemischt wird, und wobei das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium ein Minimum Essential Medium (MEM) als eine Basiskomponente beinhaltet, und
wobei das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium weiterhin das Glucocorticoid, das β-Glycerophosphat und die Ascorbinsäure enthält.
(Punkt 11A)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff an Hydroxylapatit haftet oder in Hydroxylapatit dispergiert ist, und
wobei das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium ein Minimum Essential Medium (MEM) als eine Basiskomponente beinhaltet.
(Punkt 12)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff an Hydroxylapatit haftet oder in Hydroxylapatit dispergiert ist, und
wobei das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium weiterhin das Glucocorticoid, das β-Glycerophosphat und die Ascorbinsäure enthält.
(Punkt 13)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei die Osteogenese zur Reparatur oder Behandlung eines Knochendefekts verwendet wird.
(Punkt 14)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei der Knochendefekt eine Größe hat, die nur durch Immobilisieren von Knochen nicht repariert werden kann.
(Punkt 15)
Das vorstehend beschriebene Verbundmaterial, wobei die Osteogenese zur Bildung von Knochen in einer Region verwendet wird, wo der Knochen nicht in deren Umgebung vorkommt.
(Punkt 16)
Ein Verfahren zur Herstellung eines Verbundmaterials zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus, das folgendes umfasst:

A) einen Schritt der Kultivierung von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem einen Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium, das mindestens eines aus der Gruppe beinhaltet, die Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure beinhaltet; und
B) einen Schritt des Mischen eines Überstands des Mediums nach der Kultur mit einem biokompatiblen Gerüst.

(Punkt 16A)
Ein Verfahren zur Herstellung eines Verbundmaterials zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus, das folgendes umfasst:

A) einen Schritt der Bereitstellung eines die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium, das Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure oder eine Serumkomponente beinhaltet, erhalten wird; und
B) einen Schritt des Mischens des die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs mit einem biokompatiblen Gerüst.

(Punkt 16B)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in folgendem vorliegt: (1) in dem Medium, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden, oder (2) in einer Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder höher, erhalten durch Ultrafiltration des Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden, unter Verwendung eines Filters mit einer molekularen Trenngrenze von 50.000.
(Punkt 16C)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei Schritt A) folgendes einschließt:
Kultivieren der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium, das Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure und die Serumkomponente beinhaltet; und Sammeln eines Überstandes des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums nach dem Kultivieren.
(Punkt 17)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, das weiterhin einen Schritt des Konzentrierens des Überstands nach Schritt A) umfasst.
(Punkt 18)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, das weiterhin einen Schritt des Gefriertrocknens des Überstands umfasst.
(Punkt 18A)
Das vorstehend beschriebene Verfahren wobei der Schritt A) die Durchführung einer Ultrafiltration mit dem Überstand des Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden, um ihn in eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder höher aufzutrennen.
(Punkt 18B)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, das weiterhin den Schritt des Gefriertrocknens des Überstands nach dem Schritt A) umfasst.
(Punkt 19)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei der Schritt B) eine Schritt des in Kontakt Bringens des Überstands mit dem biokompatiblen Gerüst umfasst.
(Punkt 20)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei der Schritt B) folgendes umfasst: eine Schritt des Erhaltens des die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs aus dem Überstand; und
einen Schritt des Mischens des die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs mit dem biokompatiblen Gerüst.
(Punkt 21)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei der Schritt B) folgendes umfasst: eine Schritt des in Kontakt Bringens des Überstands mit dem biokompatiblen Gerüst nachdem das aus dem Überstand konzentrierte Produkt verdünnt ist, so dass genügend Volumen vorhanden ist, welches Kontakt mit dem biokompatiblen Gerüst herstellt.
(Punkt 21 A)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei das biokompatible Gerüst aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend eine gelatineartiges Produkt und ein dreidimensionales Produkt.
(Punkt 22)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei das biokompatible Gerüst ein Material beinhaltet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Aluminiumoxid, Zirconiumoxid, Apatit-Wollastonit enthaltendes Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix, Seide, Cellulose, Dextran, Agarose, Agar, synthetisches Polypeptid, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglycolsäure, Polymethylmethacrylat, Polycyanoacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, ein Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, Nylon und eine Kombination davon.
(Punkt 23)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei das biokompatible Gerüst ein Material wobei das biokompatible Gerüst ein Material beinhaltet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend poröses Hydroxylapatit, super-poröses Hydroxylapatit, ein Apatit-Collagen-Gemisch, einen Apatit-Collagen-Komplex, Collagengel, Collagenschwamm, Gelatineschwamm, Fibringel, synthetisches Peptid, ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix, Alginsäure, Agarose, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, ein Polyglycolsäure/Polymilchsäure-Copolymer und eine Kombination davon.
(Punkt 23A)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei das biokompatible Gerüst ein Material beinhaltet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend den Hydroxylapatit, das Collagen, die Alginsäure, ein Gemisch von Laminin, Typ-IV-Collagen und Entactin, und ein Kombination davon.
(Punkt 24)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei der Schritt B) folgendes umfasst: eine Schritt des Gefriertrocknen eines aus dem Überstand konzentrierten Produkts, das durch Konzentrieren des Überstands erhalten wurde; und einen Schritt des in Kontakt Bringens des Überstands mit dem biokompatiblen Gerüst nachdem das aus dem Überstand konzentrierte Produkt verdünnt ist, so dass genügend Volumen vorhanden ist, welches Kontakt mit dem biokompatiblen Gerüst herstellt, und
wobei das biokompatible Gerüst ein Material beinhaltet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend poröses Hydroxylapatit, super-poröses Hydroxylapatit, ein Apatit-Collagen-Gemisch, einen Apatit-Collagen-Komplex, Collagengel, Collagenschwamm, Gelatineschwamm, Fibringel, synthetisches Peptid, ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix, Alginsäure, Agarose, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, ein Polyglycolsäure/Polymilchsäure-Copolymer und eine Kombination davon.
(Punkt 24A)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei der Schritt B) einen Schritt des Mischens des Überstands in einem gefriergetrockneten Zustand mit einer Collagenlösung umfasst.
(Punkt 24B):
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei der Schritt B) eine Schritt des in Kontakt Bringens des konzentrierten Überstands mit Hydroxylapatit umfasst.
(Punkt 25)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium sowohl β-Gylcerophosphat als auch Ascorbinsäure umfasst.
(Punkt 26)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium weiterhin eine Serum-Komponente umfasst.
(Punkt 27)
Ein Verfahren zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus, das folgendes umfasst:
einen Schritt der Implantierung eines Verbundmaterials, das einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff und ein biokompatibles Gerüst beinhaltet, in eine Region, in der die Osteogenese in dem biologischen Organismus gefördert oder induziert werden muss.
(Punkt 28)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, das zur Reparatur oder Behandlung eines Knochendefekts verwendet wird.
(Punkt 29)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, wobei der Knochendefekt so groß ist, dass er nur durch Immobilisierung des Knochens nicht behandelt werden kann.
(Punkt 30)
Das vorstehend beschriebene Verfahren, das zur Knochenbildung in einer Region verwendet wird, in deren Umgebung kein Knochen vorhanden ist.
(Punkt 31)
Ein Verbundmaterial zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus, das folgendes umfasst:
Ein Verbundmaterial zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus, das folgendes umfasst:

A) hypertrophierungsfähige Chondrozyten; und
B) Alginsäure.

(Punkt 32)
Ein Verbundmaterial zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus, das folgendes umfasst:

A) hypertrophierungsfähige Chondrozyten; und
B) ein Gemisch von Laminin, Typ-IV-Collagen und Entactin.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein Verbundmaterial bereitzustellen, das einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff, der durch hypertrophierungsfähige Chondrozyten produziert wurde, und ein Gerüst beinhaltet, das Osteogenese in einem biologischen Organismus fördern oder induzieren kann, und ein Verfahren zur Herstellung des Verbundmaterials und ein Verfahren zur Verwendung der Verbundmaterials.
Ein solches Verbundmaterial kann die Osteogenese in dem biologischen Organismus fördern oder induzieren. Mit ihrer Verwendung wurde es möglich, die Osteogenese sogar in einer Region zu induzieren, in deren Umgebung kein Knochen vorhanden war. Ein solches Verbundmaterial konnte unter Verwendung des Standes der Technik nicht bereitgestellt werden, aber es wird zum ersten Mal in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, die auf Hydroxylapatit geimpft wurden, indem sie zur Herstellung einer Zellsuspension verdünnt wurden und anschließend die Zellsuspension auf das Hydroxylapatit aufgetragen wurde.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden auf das Hydroxylapatit bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml geimpft und dann in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C für 1 Woche zur Gewinnung einer Probe kultiviert. Danach wurde die Probe der alkalischen Phosphatase-Färbung unterworfen. Die Probe (Hydroxylapatit) färbte sich bei der alkalischen Phosphatase-Färbung rot. In 1A beträgt die Länge des links unten gezeigten Balkens 300,00 μm.
1B zeigt das Ergebnis der Toluidinblau-Färbung der mit der alkalischen Phosphatase gefärbten Probe, die in 1A gezeigt ist. Es wurde bestätigt, dass die gleichen Bereiche der Probe (Hydroxylapatit), die in 1A gezeigt sind, sich mit der Toluidinblau-Färbung blau färbten, womit Zellen in der Probe vorhanden waren. In 1B beträgt die Länge des links unten gezeigten Balkens 300,00 μm.
1C zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung von ruhenden Knorpelzellen, die auf Hydroxylapatit geimpft wurden, indem sie zur Herstellung einer Zellsuspension verdünnt wurden und anschließend die Zellsuspension auf das Hydroxylapatit aufgetragen wurde.
Die ruhenden Knorpelzellen wurden auf das Hydroxylapatit bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml geimpft und dann in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C füh 1 Woche zur Gewinnung einer Probe kultiviert. Danach wurde die Probe der alkalischen Phosphatase-Färbung unterworfen. Die Probe (Hydroxylapatit) verfärbte sich nicht bei der alkalischen Phosphatase-Färbung. In 1C beträgt die Länge des links unten gezeigten Balkens 300,00 μm.
1D zeigt das Ergebnis der Toluidinblau-Färbung der mit der alkalischen Phosphatase gefärbten Probe, die in 1C gezeigt ist. Es wurde bestätigt, dass die Probe (Hydroxylapatit) sich mit der Toluidinblau-Färbung blau färbte, womit Zellen in der Probe vorhanden waren. In 1D beträgt die Länge des links unten gezeigten Balkens 300,00 μm.
1E zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung von aus Gelenkknorpel stammenden Chondrozyten, die auf Hydroxylapatit geimpft wurden, indem sie zur Herstellung einer Zellsuspension verdünnt wurden und anschließend die Zellsuspension auf das Hydroxylapatit aufgetragen wurde.
Die aus Gelenkknorpel stammenden Chondrozyten wurden auf das Hydroxylapatit bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml geimpft und dann in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C für 1 Woche zur Gewinnung einer Probe kultiviert. Danach wurde die Probe der alkalischen Phosphatase-Färbung unterworfen. Die Probe (Hydroxylapatit) verfärbte sich nicht bei der alkalischen Phosphatase-Färbung. In 1E beträgt die Länge des links unten gezeigten Balkens 300,00 μm.
1F zeigt das Ergebnis der Toluidinblau-Färbung der mit der alkalischen Phosphatase gefärbten Probe, die in 1E gezeigt ist. Es wurde bestätigt, dass sich gepunktete Bereiche der Probe (Hydroxylapatit) mit der Toluidinblau-Färbung blau färbten, womit Zellen in der Probe vorhanden waren. In 1F beträgt die Länge des links unten gezeigten Balkens 300,00 μm.
2 zeigt die alkalische Phosphatase-Aktivität von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die jeweils gemessen wurde, indem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium bzw. einem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, ein Überstand von jedem Medium (Kulturüberstand) in einem Zeitverlauf (4 Tage, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen) gesammelt wurde, um partielle Überstände zu erhalten, jeder partielle Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde und sie anschließend kultiviert wurden.
Für den Fall der Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums (Zellkultur) zu den Maus-C3H10T1/2-Zellen, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde, bei einer 4 Wochen alten Rattengruppe: der relative Wert der Aktivität erhöhte sich auf das etwa 4,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 5,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 5,4-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde; und auf das etwa 4,9-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde.
Für den vorstehenden gleichen Fall bei einer 8 Wochen alten Rattengruppe: der relative Wert der Aktivität erhöhte sich auf etwa das 2,9-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 3,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 3,8-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde; und auf das etwa 4,2-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde.
Bei jeder der 4 und 8 Wochen alten Rattengruppen gab es einen geringen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden (Zellkultur), und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität davon, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden.
Die folgenden Abkürzungen zeigen die zugegebenen Überstände. 4 Wochen alter Differenzierungsüberstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem aus 4 Wochen alten Ratten stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden; 8 Wochen alter Differenzierungsüberstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem aus 8 Wochen alten Ratten stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden; 4 Wochen alter Wachstumsüberstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem aus 4 Wochen alten Ratten stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden; 8 Wochen alter Wachstumsüberstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem aus 8 Wochen alten Ratten stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden;
3A zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die kultiviert wurden, indem ein Überstand von jeweils dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), zugegeben wurde.
Die Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden in einer 24-Well-Platte (in BME-Medium) geimpft. 18 h nach der Impfung wurde der Überstand der Platte zugegeben und nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Färbung durchgeführt. Obere Spalte: es wurde bestätigt, dass Proben, denen der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums zugegeben wurde, rot gefärbt wurden und alkalische Phosphatase-Aktivität aufwiesen. Untere Spalte: es wurde bestätigt, dass Proben, denen der Überstand des MEM-Wachstumsmediums zugegeben wurde, nicht gefärbt wurden und keine alkalische Phosphatase-Aktivität aufwiesen.
3B zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die kultiviert wurden, indem ein Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), zugegeben wurde.
Die Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden auf Hydroxylapatit (in BME-Medium) geimpft. 18 h nach der Impfung wurde der Überstand dem Hydroxylapatit zugegeben und nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Färbung durchgeführt. Es wurde bestätigt, dass eine Probe, der der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums zugegeben wurde, rot gefärbt wurde und alkalische Phosphatase-Aktivität aufwies. In 3B beträgt die Länge des links unten gezeigten Balkens 500,00 μm.
3C zeigt das Ergebnis der Toluidinblau-Färbung von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die kultiviert wurden, indem ein Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), zugegeben wurde.
Die Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden auf Hydroxylapatit (in BME-Medium) geimpft. 18 h nach der Impfung wurde der Überstand dem Hydroxylapatit zugegeben und nach 72 h wurde die Toluidinblau-Färbung durchgeführt. Es wurde bestätigt, dass eine Probe mit der Toluidinblau-Färbung blau gefärbt wurde, womit Zellen in der Probe vorhanden waren. In 3C beträgt die Länge des links unten gezeigten Balkens 500,00 um.
3D zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die kultiviert wurden, indem ein Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), zugegeben wurde.
Die Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden auf Hydroxylapatit (in BME-Medium) geimpft. 18 h nach der Impfung wurde der Überstand dem Hydroxylapatit zugegeben und nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Färbung durchgeführt. Es wurde bestätigt, dass eine Probe, der der Überstand des MEM-Wachstumsmediums zugegeben wurde, nicht gefärbt wurde und keine alkalische Phosphatase-Aktivität aufwies. In 3D beträgt die Länge des links unten gezeigten Balkens 500,00 μm.
3E zeigt das Ergebnis der Toluidinblau-Färbung von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die kultiviert wurden, indem ein Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), zugegeben wurde.
Die Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden auf Hydroxylapatit (in BME-Medium) geimpft. 18 h nach der Impfung wurde der Überstand dem Hydroxylapatit zugegeben und nach 72 h wurde die Toluidinblau-Färbung durchgeführt. Es wurde bestätigt, dass eine Probe mit der Toluidinblau-Färbung blau gefärbt wurde, womit Zellen in der Probe vorhanden waren. In 3E beträgt die Länge des links unten gezeigten Balkens 500,00 μm.
4 zeigt die alkalische Phosphatase-Aktivität von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die jeweils gemessen wurde, indem aus Costal-Knorpel stammende ruhende Knorpelzellen in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium bzw. einem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, ein Überstand von jedem Medium (Kulturüberstand) in einem Zeitverlauf (4 Tage, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen) gesammelt wurde, um partielle Überstände zu erhalten, jeder partielle Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde und sie anschließend kultiviert wurden.
Es gab einen geringen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands von jeweils dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden (Zellkultur) und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität davon, die nur durch Zugabe jeweils des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums und des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden.
Die folgenden Abkürzungen zeigen die zugegebenen Überstände. 8 Wochen alter Differenzierungsüberstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem aus 8 Wochen alten Ratten stammende ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden; 8 Wochen alter Wachstumsüberstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem aus 8 Wochen alten Ratten stammende ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden.
Jeder Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe von jeweils dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde.
5A zeigt die alkalische Phosphatase-Aktivität von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die jeweils gemessen wurde, indem aus Gelenkknorpel stammende Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium bzw. einem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, ein Überstand von jedem Medium (Kulturüberstand) in einem Zeitverlauf (4 Tage, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen) gesammelt wurde, um partielle Überstände zu erhalten, jeder partielle Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde und sie anschließend kultiviert wurden.
Es gab einen geringen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands von jeweils dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium, in dem die aus Gelenkknorpel stammenden Chondrozyten kultiviert wurden (Zellkultur), kultiviert wurden und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität davon, die nur durch Zugabe jeweils des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums und des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden.
Die folgenden Abkürzungen zeigen die zugegebenen Überstände. 8 Wochen alter Differenzierungsüberstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem aus 8 Wochen alten Ratten-Gelenkknorpel stammende Chondrozyten kultiviert wurden; 8 Wochen alter Wachstumsüberstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem aus 8 Wochen alten Ratten-Gelenkknorpel stammende Chondrozyten kultiviert wurden.
Jeder Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe von jeweils dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde.
5B zeigt die alkalische Phosphatase-Aktivität von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die jeweils gemessen wurde, indem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Medium kultiviert wurden, ein Überstand des Mediums (Kulturüberstand) in einem Zeitverlauf (4 Tage, 7 Tage, 14 Tage, 21 Tage) gesammelt wurde, um partielle Überstände zu erhalten, jeder partielle Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde und sie anschließend kultiviert wurden.
Jeder Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde. Die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums kultiviert wurden, in dem die aus Costa/costal-Knorpel stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, nahm zu.
5C zeigt die alkalische Phosphatase-Aktivität von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die jeweils gemessen wurde, indem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einem HAM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, ein Überstand des Mediums (Kulturüberstand) in einem Zeitverlauf (4 Tage, 7 Tage, 14 Tage, 21 Tage) gesammelt wurde, um partielle Überstände zu erhalten, jeder partielle Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde und sie anschließend kultiviert wurden.
Jeder Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des HAM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde. Die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des HAM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, in dem die aus Costa/costal-Knorpel stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, nahm nicht zu.
6A zeigt das Vorhandensein eines Wirkstoffs, der die alkalische Phosphatase-Aktivität von 3T3-Swiss-Albino-Zellen und BALB/3T3-Zellen steigern und die Differenzierung dieser undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten in einem Überstand (Kulturüberstand) induzieren kann, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium erhalten wurde.
Andererseits zeigt 6A ferner das Fehlen des vorstehenden Wirkstoffs in einem Überstand (Kulturüberstand), der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem MEM-Wachstumsmedium erhalten wurde. Zusätzlich zeigt 6A ferner das Fehlen des vorstehenden Wirkstoffs in einem Überstand (Kulturüberstand), der durch Kultivieren von nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium oder dem MEM-Wachstumsmedium erhalten wurde.
6B zeigt die alkalische Phosphatase-Aktivität von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die jeweils gemessen wurde, indem hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einem Medium kultiviert wurden, dem Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure oder eine Kombination davon als eine herkömmliche die Osteoblasten-Differenzierung induzierende Komponente zugegeben wurde, ein Überstand des Mediums (Kulturüberstand) gesammelt wurde, der Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde und sie anschließend kultiviert wurden. Dex: Dexamethason, BGP: β-Glycerophosphat, Asc: Ascorbinsäure.
7A zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in einer 24-Well-Platte geimpft und kultiviert wurden, indem der Platte eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder höher zugegeben wurde, die aus einem Überstand eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums abgetrennt wurde, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
Jede Probe, die die Maus-C3H10T1/2-Zellen enthielt, wurde bei der alkalischen Phosphatase-Färbung rot gefärbt. Somit wurde bestätigt, dass ein Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen steigern kann, in der Fraktion mit dem Molekulargewicht von 50.000 oder höher vorhanden war.
7B zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die auf Hydroxylapatit geimpft und kultiviert wurden, indem dem Hydroxylapatit eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder höher zugegeben wurde, die aus einem Überstand eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums abgetrennt wurde, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
Eine Probe (Hydroxylapatit), die die Maus-C3H10T1/2-Zellen enthielt, wurde rot gefärbt. Somit wurde bestätigt, dass ein Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen steigern kann, in der Fraktion mit dem Molekulargewicht von 50.000 oder höher vorhanden war.
7C zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in einer 24-Well-Platte geimpft und kultiviert wurden, indem der Platte eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von unter 50.000 zugegeben wurde, die aus einem Überstand eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums abgetrennt wurde, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
Ein Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen steigern kann, wurde in der Fraktion mit dem Molekulargewicht von unter 50.000 nicht beobachtet. In 7C beträgt die Länge des links unten gezeigten Balkens 500,00 μm.
7D zeigt das Ergebnis der alkalischen Phosphatase-Färbung von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die auf Hydroxylapatit geimpft und kultiviert wurden, indem dem Hydroxylapatit eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von unter 50.000 zugegeben wurde, die aus einem Überstand eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums abgetrennt wurde, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
Ein Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen steigern kann, wurde in der Fraktion mit dem Molekulargewicht von unter 50.000 nicht beobachtet. In 7D beträgt die Länge des links unten gezeigten Balkens 500,00 μm.
8 zeigt die alkalische Phosphatase-Aktivität von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die jeweils gemessen wurde, indem jeweils hypertrophierungsfähige Chondrozyten, erhalten aus Maus-Costa/costal-Knorpel, und ruhende Knorpelzellen, erhalten aus Costal-Knorpel, in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium bzw. einem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, ein Überstand von jedem Medium (Kulturüberstand) gesammelt wurde, der Überstand den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde und sie anschließend kultiviert wurden.
Ein relativer Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, stieg auf das 3,1-Fache.
Es gab einen geringen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands von jeweils dem MEM-Wachstumsmedium, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, und dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium, in dem die aus Costal-Knorpel stammenden ruhenden Knorpelzellen kultiviert wurden, kultiviert wurden und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität davon, die nur durch Zugabe jeweils des MEM-Wachstumsmediums und des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden.
Die folgenden Abkürzungen zeigen die zugegebenen Überstände. GC-Differenzierungsüberstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden; GC-Wachstumsüberstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden; RC-Differenzierungsüberstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden; RC-Wachstumsüberstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden.
Jeder Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe von jeweils dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde.
9 zeigt die Wirkung eines Mediums zum Kultivieren undifferenzierter Zellen (Kulturmedium füh undifferenzierte Zellen) auf die Induktion der Differenzierung der undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten. Jede Art der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, ruhenden Knorpelzellen und Gelenkknorpelzellen wurde in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium bzw. einem MEM-Wachstumsmedium kultiviert. Ein Überstand von jedem Medium (Kulturüberstand) wurde den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben, sie wurden kultiviert und anschließend wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität davon gemessen. Ein HAM-Medium oder ein MEM-Medium wurde als das Medium zum Kultivieren der Maus-C3H10T1/2-Zellen verwendet.
Bei der Verwendung des HAM-Mediums zum Kultivieren der Maus-C3H10T1/2-Zellen wurde beobachtet, dass die alkalische Phosphatase-Aktivität davon, die nur durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, zunahm.
Die folgenden Abkürzungen zeigen die zugegebenen Überstände. GC-Differenzierungsüberstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden; GC-Wachstumsüberstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden; RC-Differenzierungsüberstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden; RC-Wachstumsüberstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden; AC-Differenzierungsüberstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem Gelenkknorpelzellen kultiviert wurden; AC-Wachstumsüberstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem Gelenkknorpelzellen kultiviert wurden.
Jeder Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe von jeweils dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde.
10 zeigt die alkalische Phosphatase-Aktivität von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe eines Wirkstoffs kultiviert wurden, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wurde, nachdem sie erwärmt wurden. Ein Überstand eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), wurde einer Wärmebehandlung für 3 min in kochendem Wasser unterzogen.
Der nicht-wärmebehandelte Überstand, der wärmebehandelte Überstand und das den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium allein wurden jeweils den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben und nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität davon bestimmt. Die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des wärmebehandelten Überstands kultiviert wurden, nahm nicht zu. Somit wurde bestätigt, dass der Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, durch die Wärmebehandlung degeneriert (deaktiviert) wurde.
Die folgenden Abkürzungen zeigen die zugegebenen Überstände. GC-Wärmebehandlung: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden, wärmebehandelt; GC-Differenzierungsüberstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden; Nur Differenzierungsüberstand: den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium allein.
Jeder Wert ist angegeben, indem der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde.
11A zeigt die TGFβ-Aktivität in einem Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, das einen die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden Wirkstoff beinhaltet.
11B zeigt die BMP-Aktivität in einem Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, das einen die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden Wirkstoff beinhaltet.
12 zeigt Alkalische Phosphatase-Aktivitäten von Maus-C3H10T1/2-Zellen, jeweils gemessen durch Tränken eines superporösen Hydroxylapatits (APACERAM AX-Füllstoff) mit einer Testprobenlösung, Zugabe des Hydroxylapatits zu einem Medium, in dem die Maus-C3H10T1/2-Zellen 18 Stunden lang geformt, die in einem Medium kultiviert wurden, Kultivieren der Maus-C3H10T1/2-Zellen für 72 Stunden und dann Entfernen des Hydroxylapatits aus dem Medium.
Dieser zugesetzte superporöse Hydroxylapatit ist nachstehend gezeigt. HApAXGC/Differenzierungstauchung: APACERAM AX Füllstoff, der mit Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden, getränkt war; HApAXGC/Differenzierungstauchung: APACERAM AX Füllstoff, der mit Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums getränkt war; nur HapAX: nur APACERAM AX Füllstoff; nur Differenzierungsmedium (MEM): den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend keinen APACERAM AX Füllstoff) allein.
13A bis 13D zeigen Verbundmaterialien vor Implantierung, wobei jedes unter Verwendung von Collagengel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde. 13A zeigt eine Probe mit HE-Färbung (20-fache Vergrößerung). 13B zeigt eine Probe mit TB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 13C zeigt eine Probe mit AB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 13D zeigt eine Probe mit SO-Färbung (20-fache Vergrößerung).
13E zeigt eine Röntgenaufnahme einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Collagengel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings, der in die Ratte zur Bestimmung der implantierten Region eingebettet wurde. Eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings bestätigt.
13F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur Gewinnung der 13E verwendet wurde, erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings, der in die Ratte zur Bestimmung der implantierten Region eingebettet wurde. Eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings bestätigt.
14A bis 14D zeigen vollständige Abbildungen von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Collagengel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde.
14A zeigt die implantierte Region mit HE-Färbung (35-fache Vergrößerung). 14B zeigt die implantierte Region mit TB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 14C zeigt die implantierte Region mit AB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 14D zeigt die implantierte Region mit SO-Färbung (35-fache Vergrößerung).
15A bis 15D zeigen vergrößerte Ansichten (4-fache Vergrößerung) von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial, das unter Verwendung von Collagengel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 13A bis 13D gezeigt ist, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde. 15A bis 15D entsprechen 14A bis 14D.
16A bis 16D zeigen vergrößerte Ansichten (10-fache Vergrößerung) von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial, das unter Verwendung von Collagengel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 13A bis 13D gezeigt ist, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde. 16A bis 16D entsprechen 14A bis 14D.
17A bis 17D zeigen Verbundmaterialien vor Implantierung, wobei jedes unter Verwendung von Alginsäure und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde. 17A zeigt eine Probe mit HE-Färbung (20-fache Vergrößerung). 17B zeigt eine Probe mit TB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 17C zeigt eine Probe mit AB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 17D zeigt eine Probe mit SO-Färbung (20-fache Vergrößerung).
17E zeigt eine Röntgenaufnahme einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Alginsäure und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings bestätigt.
17F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur Gewinnung der 17E verwendet wurde, erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings bestätigt.
18A bis 18D zeigen vollständige Abbildungen von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Alginsäure und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde.
18A zeigt die implantierte Region mit HE-Färbung (35-fache Vergrößerung). 18B zeigt die implantierte Region mit TB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 18C zeigt die implantierte Region mit AB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 18D zeigt die implantierte Region mit SO-Färbung (35-fache Vergrößerung).
19A bis 19D zeigen vergrößerte Ansichten (4-fache Vergrößerung) von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial, das unter Verwendung von Alginsäure und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 17A bis 17D gezeigt ist, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde. 19A bis 19D entsprechen 18A bis 18D.
20A bis 20D zeigen vergrößerte Ansichten (10-fache Vergrößerung) von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial, das unter Verwendung von Alginsäure und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 17A bis 17D gezeigt ist, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde. 20A bis 20D entsprechen 18A bis 18D.
21A bis 21D zeigen Verbundmaterialien vor Implantierung, wobei jedes unter Verwendung von Matrigel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde. 21A zeigt eine Probe mit HE-Färbung (20-fache Vergrößerung). 21B zeigt eine Probe mit TB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 21C zeigt eine Probe mit AB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 21D zeigt eine Probe mit SO-Färbung (20-fache Vergrößerung).
21E zeigt eine Röntgenaufnahme einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Matrigel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings bestätigt.
21F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur Gewinnung der 21E verwendet wurde, erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings bestätigt.
22A bis 22D zeigen vollständige Abbildungen von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Matrigel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde.
22A zeigt die implantierte Region mit HE-Färbung (35-fache Vergrößerung). 22B zeigt die implantierte Region mit TB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 22C zeigt die implantierte Region mit AB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 22D zeigt die implantierte Region mit SO-Färbung (35-fache Vergrößerung).
23A bis 23D zeigen vergrößerte Ansichten (4-fache Vergrößerung) von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial, das unter Verwendung von Matrigel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 22A bis 22D gezeigt ist, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde. 23A bis 23D entsprechen 22A bis 22D.
24A bis 24D zeigen vergrößerte Ansichten (10-fache Vergrößerung) von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial, das unter Verwendung von Matrigel und hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 22A bis 22D gezeigt ist, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde. 24A bis 24D entsprechen 22A bis 22D.
25A bis 25D zeigen Verbundmaterialien vor Implantierung, wobei jedes unter Verwendung von Collagengel und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde. 25A zeigt eine Probe mit HE-Färbung (20-fache Vergrößerung). 25B zeigt eine Probe mit TB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 25C zeigt eine Probe mit AB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 25D zeigt eine Probe mit SO-Färbung (20-fache Vergrößerung).
25E zeigt eine Röntgenaufnahme einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Collagengel und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings nicht bestätigt.
25F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur Gewinnung der 25E verwendet wurde, erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings nicht bestätigt.
26A bis 26D zeigen vollständige Abbildungen von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Collagengel und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde.
26A zeigt die implantierte Region mit HE-Färbung (35-fache Vergrößerung). 26B zeigt die implantierte Region mit TB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 26C zeigt die implantierte Region mit AB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 26D zeigt die implantierte Region mit SO-Färbung (35-fache Vergrößerung).
27A bis 27D zeigen vergrößerte Ansichten (4-fache Vergrößerung) von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial, das unter Verwendung von Collagengel und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 26A bis 26D gezeigt ist, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde. 27A bis 27D entsprechen 26A bis 26D.
28A bis 28D zeigen Verbundmaterialien vor Implantierung, wobei jedes unter Verwendung von Alginsäure und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde. 28A zeigt eine Probe mit HE-Färbung (20-fache Vergrößerung). 28B zeigt eine Probe mit TB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 28C zeigt eine Probe mit AB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 28D zeigt eine Probe mit SO-Färbung (20-fache Vergrößerung).
28E zeigt eine Röntgenaufnahme einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Alginsäure und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings nicht bestätigt.
28F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur Gewinnung der 28E verwendet wurde, erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings nicht bestätigt.
29A bis 29D zeigen vollständige Abbildungen von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Alginsäure und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde.
29A zeigt die implantierte Region mit HE-Färbung (35-fache Vergrößerung). 29B zeigt die implantierte Region mit TB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 29C zeigt die implantierte Region mit AB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 29D zeigt die implantierte Region mit SO-Färbung (35-fache Vergrößerung).
30A bis 30D zeigen vergrößerte Ansichten (4-fache Vergrößerung) von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial, das unter Verwendung von Alginsäure und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 28A bis 28D gezeigt ist, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde. 30A bis 30D entsprechen 29A bis 29D.
31A bis 31D zeigen Verbundmaterialien vor Implantierung, wobei jedes unter Verwendung von Matrigel und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde. 31A zeigt eine Probe mit HE-Färbung (20-fache Vergrößerung). 31B zeigt eine Probe mit TB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 31C zeigt eine Probe mit AB-Färbung (20-fache Vergrößerung). 31D zeigt eine Probe mit SO-Färbung (20-fache Vergrößerung).
31E zeigt eine Röntgenaufnahme einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Matrigel und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings nicht bestätigt.
31F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur Gewinnung der 31E verwendet wurde, erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings nicht bestätigt.
32A bis 32D zeigen vollständige Abbildungen von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem ein Verbundmaterial, das unter Verwendung von Matrigel und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde.
32A zeigt die implantierte Region mit HE-Färbung (35-fache Vergrößerung). 32B zeigt die implantierte Region mit TB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 32C zeigt die implantierte Region mit AB-Färbung (35-fache Vergrößerung). 32D zeigt die implantierte Region mit SO-Färbung (35-fache Vergrößerung).
33A bis 33D zeigen vergrößerte Ansichten (4-fache Vergrößerung) von Geweben, die jeweils erhalten wurden, indem das Verbundmaterial, das unter Verwendung von Matrigel und nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde und jeweils in 31A bis 31D gezeigt ist, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde. 33A bis 33D entsprechen 32A bis 32D.
34A zeigt eine Röntgenaufnahme einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem nur Hydroxylapatit unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde. In 34A beträgt die Länge des links oben gezeigten Balkens 100,00 μm. 34B zeigt eine vergrößerte Ansicht (20-fache Vergrößerung) von 34A.
34C zeigt eine Röntgenaufnahme einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem nur Collagengel unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde.
34D zeigt eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur Gewinnung der 34C verwendet wurde, erhalten wurde.
34E zeigt eine Röntgenaufnahme einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem nur Alginsäure unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde. 34F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur Gewinnung der 34E verwendet wurde, erhalten wurde.
34G zeigt eine Röntgenaufnahme einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem nur Matrigel unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde. 34H zeigt eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur Gewinnung der 34G verwendet wurde, erhalten wurde.
Hier ist in jeder 34C bis 34H die kreisförmige Abbildung eine Abbildung des Siliconrings. Eine Calcifizierung ist bei sämtlichen Gerüsten nicht bestätigt.
35A zeigt von Ratten-Costa stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten, die zu einem Pellet geformt und kultiviert wurden (35-fache Vergrößerung). In 35A wird ein vergrößertes Gewebe beobachtet. 35B zeigt aus Ratten-Costa stammende nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten, die zu einem Pellet geformt und kultiviert wurden (35-fache Vergrößerung). In 35B wird bestätigt, dass die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten nicht vergrößert sind.
35C zeigt eine Röntgenaufnahme einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Pellet von Ratten-Costa stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gebildet, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings bestätigt.
35D zeigt eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur Gewinnung der 35C verwendet wurde, erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings bestätigt.
35E zeigt eine Röntgenaufnahme einer implantierten Region, die erhalten wurde, indem ein Pellet von Ratten-Costa stammenden nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gebildet, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert und 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings nicht bestätigt.
35F zeigt eine Aufnahme einer computerisierten Mikrotomographie, die durch Abbildung der gleichen Probe, die zur Gewinnung der 35E verwendet wurde, erhalten wurde. Hier ist die kreisförmige Abbildung eine Abbildung eines Siliconrings und eine Calcifizierung ist an dem inneren Mittelteil des Rings nicht bestätigt.
36A bis 36D zeigen Gewebe, das jeweils erhalten wurde, indem ein Pellet von Ratten-Costa stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gebildet, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert, 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde.
36A zeigt die implantierte Region mit HE-Färbung (4-fache Vergrößerung). 36B zeigt die implantierte Region mit TB-Färbung (4-fache Vergrößerung). 36C zeigt die implantierte Region mit AB-Färbung (4-fache Vergrößerung). 36D zeigt die implantierte Region mit SO-Färbung (4-fache Vergrößerung).
37A bis 37D zeigen vergrößerte Ansichten (10-fache Vergrößerung) von Gewebe, das jeweils erhalten wurde, indem das Pellet, das von Ratten-Costa stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gebildet wurde und in 35A gezeigt ist, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert, 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde. 37A bis 37D entsprechen 36A bis 36D.
38A bis 38D zeigen Gewebe, das jeweils erhalten wurde, indem ein Pellet von Ratten-Costa stammenden nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gebildet, unter die dorsale Haut einer Ratte implantiert, 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt und anschließend angefärbt wurde.
38A zeigt die implantierte Region mit HE-Färbung (4-fache Vergrößerung). 38B zeigt die implantierte Region mit TB-Färbung (4-fache Vergrößerung). 38C zeigt die implantierte Region mit AB-Färbung (4-fache Vergrößerung). 38D zeigt die implantierte Region mit SO-Färbung (4-fache Vergrößerung).
39(1) zeigt eine Aufnahme einer alkalischen Phosphatase-Färbung von menschlichen undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen, die kultiviert wurden, indem ein Überstand eines einen Wirkstoff erzeugenden Mediums zugegeben wurde, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden (Wirkstoff-haltiges Differenzierungsmedium). Es wurde bestätigt, dass die menschlichen undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen rot gefärbt wurden.
39(2) zeigt eine Aufnahme einer alkalischen Phosphatase-Färbung von menschlichen undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen, die kultiviert wurden, indem nur ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium, d. h. ein Medium, das keinen Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung, sondern Dexamethason (Osteoblasten-Differenzierungsmedium nach Maniatopoulos) beinhaltet, zugegeben wurde. Es wurde bestätigt, dass die menschlichen undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen schwach rot gefärbt wurden.
39(3) zeigt eine Aufnahme einer alkalischen Phosphatase-Färbung von menschlichen undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen, die kultiviert wurden, indem nur ein MEM-Wachstumsmedium (ohne Wirkstoff und ohne Dexamethason) zugegeben wurde. Es wurde bestätigt, dass die menschlichen undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen kaum angefärbt wurden. Hier wurde jeder der vorstehenden Abläufe dreimal durchgeführt.
40A zeigt eine Aufnahme, die durch Implantieren eines Verbundmaterials, das ein konzentriertes gefriergetrocknetes Produkt eines vorhandenen Wirkstoffs und Collagengel enthält, in eine fehlerhafte Femurregion und anschließendes Emporwachsenlassen der Region 4 Wochen nach der Implantation erhalten wurde.
40B zeigt eine Aufnahme, die durch Implantieren nur eines Collagengels in eine fehlerhafte Femurregion und anschließendes Emporwachsenlassen der Region 4 Wochen nach der Implantation erhalten wurde.
41A zeigt Aufnahmen, die jeweils durch Implantieren einer Probe in eine Region mit Knochendefekt, die die einen Durchmesser von 3,0 mm hat und in Ratten-Femur ausgebildet ist, und anschließendes Emporwachsenlassen der Region 4 Wochen nach der Implantation erhalten wurde. Die linke und die rechte Seite der Aufnahmen werden jeweils durch Implantieren eines Verbundmaterials, das ein konzentriertes gefriergetrocknetes Produkt eines vorhandenen Wirkstoffs und Collagengel gemäß der vorliegenden Erfindung als Probe enthält, in die Region mit fehlerhaften Knochen erhalten.
Jede der Proben wurde 4 Wochen nach der Implantation operativ entfernt und dann mit 10% neutralem Formalinpuffer (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.) fixiert. Es wurde unter Verwendung eines Micro-CT-Scanners röntgenographiert. Die Micro-CT wurde unter Verwendung eines hochauflösenden Röntgen-Micro-CT-Scanners (”SKYSCAN1172” hergestellt von TOYO Corporation) durchgeführt, um röntgenografische Daten zu erhalten.
Nach der Röntgengraphie wurde die röntgengrafischen Daten unter Verwendung der Rekonstruktionssoftware ”NRecon” rekonstruiert, auf den Scanner gebündelt, um ein Rekonstruktionsbild zu erhalten. Weiterhin wurde das Rekonstruktionsbild unter Verwendung einer dreidimensionalen Volume-Rendering-Software (”VGStudio Max” hergestellt von Nihon Visual Science, Inc.) sichtbar gemacht. Jedes der Oberseitenbilder ist ein Tomogramm, das entlang einer horizontalen Richtung des Femurs, ein zentralen Teils der Region mit Knochendefekt, geschnitten, restrukturiert und nach der Mikro-CT-Röntgenographie sichtbar gemacht wurde. Jedes der Unterseitenbilder ist ein Stereobild der gleichen Region.
41B zeigt das Ergebnis der HE-Färbung der in 41A gezeigten Proben. Nach der Röntgengraphie der Proben unter Verwendung des Micro-CT-Scanners wurden sie entfettet und decalzifiziert und dann in Paraffin eingebettet. Anschließend wurden dünne Scheibeproben hergestellt und dann mit HE-Färbung gefärbt.
Die Figur auf der linken Seite ist eine Aufnahme einer HE-Probe, die durch Implantieren nur des Collagengels in die Region mit Knochendefekt erhalten wurde. Die Figur auf der rechten Seite ist eine Aufnahme einer HE-Probe, die durch Implantieren eines Verbundmaterials, das das konzentrierte gefriergetrocknetes Produkt des vorhandenen Wirkstoffs und das Collagengel enthält, in die Region mit Knochendefekt erhalten wurde. Ein aktives Osteoblastenbild wird in der Figur auf der rechten Seite in Vergleich zu der Figur auf der linken Seite festgestellt.
42A zeigt Aufnahmen, die jeweils durch Implantieren einer Probe in eine Region mit Knochendefekt, die die einen Durchmesser von 2,5 mm hat und in Ratten-Femur ausgebildet ist, und anschließendes Emporwachsenlassen der Region 4 Wochen nach der Implantation erhalten wurde. Die Aufnahmen auf der linken Seite werden durch Implantieren nur von Collagengel als die Probe in die Region mit Knochendefekt erhalten. Die Aufnahmen auf der rechten Seite werden durch Implantieren eines Verbundmaterials, das ein konzentrierte gefriergetrocknetes Produkt des vorhandenen Wirkstoffs und Collagengel enthält, als die Probe in die Region mit Knochendefekt erhalten.
Jede der Proben wurden 4 Wochen nach der Implantierung operativ entfernt und dann mit 10% neutralem Formalinpuffer (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.) fixiert. Es wurde unter Verwendung eines Micro-CT-Scanners röntgenographiert. Die Micro-CT wurde unter Verwendung eines hochauflösenden Röntgen-Micro-CT-Scanners (”SKYSCAN1172” hergestellt von TOYO Corporation) durchgeführt, um röntgengrafische Daten zu erhalten.
Nach der Röntgengraphie wurde die röntgengrafischen Daten unter Verwendung der Rekonstruktionssoftware ”NRecon” rekonstruiert, auf den Scanner gebündelt, um ein Rekonstruktionsbild zu erhalten. Weiterhin wurde das Rekonstruktionsbild unter Verwendung einer dreidimensionalen Volumen-Wiedergabe-Software (”VGStudio Max” hergestellt von Nihon Visual Science, Inc.) sichtbar gemacht. Jedes der Oberseitenbilder ist ein Tomogramm, das entlang einer horizontalen Richtung des Femurs, ein zentralen Teils der Region mit Knochendefekt, geschnitten, restrukturiert und nach der Mikro-CT Röntgengraphie sichtbar gemacht wurde. Jedes der Unterseitenbilder ist ein Stereobild der gleichen Region.
42B zeigt ein Ergebnis des HE-Färbens der in 42A gezeigten Proben. Nach der Röntgenographie der Proben unter Verwendung des Micro-CT-Scanners wurden sie entfettet und decalzifiziert und dann in Paraffin eingebettet. Anschließend wurden dünne Scheibeproben hergestellt und dann mit HE-Färbung gefärbt.
Eine gute Reparatur der Region mit Knochendefekt wird in der Figur auf der rechten Seite (eine HE-Probe, die durch Implantieren des Verbundmaterials, das das konzentrierte gefriergetrocknetes Produkt des vorhandenen Wirkstoffs und das Collagengel gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, in die Region mit Knochendefekt) im Vergleich mit der Figur auf der linken Seite (eine HE-Probe, die durch Implantieren nur des Collagengels in die Region mit Knochendefekt erhalten wurde) festgestellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden beschrieben. Es wird verstanden, außer es ist anders angegeben, dass die Darstellungen in der Einzahl in der vorliegenden Beschreibung den Plural davon einschließen. Deshalb wird verstanden, außer es ist spezifisch beschrieben, dass Einzahlartikel (zum Beispiel ”a”, ”an” und ”the” und dergleichen in der englischen Sprache) den Plural einschließen.
Es wird ebenfalls verstanden, dass die hier verwendeten Begriffe die Definitionen aufweisen, die herkömmlich im Stand der Technik verwendet werden, außer es ist anders angegeben. Deshalb haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, außer es ist anders angegeben, dieselbe Bedeutung, wie sie der Fachmann füh gewöhnlich versteht. Ansonsten geht die vorliegende Anmeldung (einschließlich der Definitionen) vor.
(Definition von Begriffen)
Die Definitionen der Begriffe, die hier insbesondere verwendet werden, sind im Folgenden aufgezählt.
Ein ”Verbundmaterial”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Material, das Zellen und ein Gerüst einschließt.
Beispiele füh einen ”Knochendefekt”, so wie hier verwendet, beinhalten Läsionen, wie Knochentumore, Osteoporose, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Osteomyelitis und Osteonekrosis; Korrekturen, wie Immobilisierung des Knochens, Foraminotomie und Osteotomie; Trauma, wie eine komplexe Fraktur; Knochendefekte, die von einer Entnahme aus Hüftknochen stammen; und dergleichen, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt.
Förderung” der Osteogenese, so wie hier verwendet, bedeutet die Steigerung der Rate der Osteogenese in dem Fall, wo eine gewünschte Veränderung in einer Region vorgenommen wurde, wo die Osteogenese bereits eingesetzt hat. ”Induzieren” der Osteogenese bedeutet, dass die Osteogenese in dem Fall induziert wird, wo eine gewünschte Veränderung in einer Region vorgenommen wurde, wo die Osteogenese noch nicht induziert wurde.
”Reparatur” einer Region mit Knochendefekt bedeutet, dass die Region mit Knochendefekt einen normalen Zustand erlangt oder einem solchen Zustand nahe kommt.
Eine ”Größe, die nicht durch Immobilisierung allein repariert werden kann”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Größe, die die Verwendung eines Implantats oder Knochenersatzmaterials erfordert.
(Zellen)
”Wachsende Knorpelzellen” oder ”wachsende Chondrozyten” werden hier austauschbar verwendet und betreffen Zellen in einem Gewebe (d. h. wachsender Knorpel), das während einer Entwicklungs- oder Wachstumsstufe und eines Zeitraums der Erholung und Proliferation des Knochens Knochen bildet. Der wachsende Knorpel bezieht sich auf allgemein ein Gewebe, das den Knochen während der Wachstumsstufe bildet, während es hier ein Gewebe bedeutet, das den Knochen während der Entwicklungs- oder Wachstumsstufe und des Zeitraums der Proliferation oder Erholung des Knochens bildet.
Die wachsenden Knorpelzellen (wachsende Chondrozyten) werden auch als hypertrophierungsfähige Chondrozyten, calcifizierungsfähige Chondrozyten oder Chondrozyten aus Epiphyse(nlinie) bezeichnet. Werden die wachsenden Knorpelzellen beim Menschen verwendet, sind aus Menschen stammende Zellen bevorzugt, allerdings ist es auch möglich, nicht-menschliche Zellen zu verwenden, da Probleme, wie Immunabstoßung, unter Verwendung von wohl bekannten Verfahren des Standes der Technik vermieden werden können.
Die wachsenden Knorpelzellen gemäß der vorliegenden Erfindung stammen aus einem Säugetier, vorzugsweise aus Menschen, Mäusen, Ratten oder Kaninchen.
Die wachsenden Knorpelzellen gemäß der vorliegenden Erfindung können aus einer Knorpel-Knochen-Verbindung der Costa, einer Epiphysenlinie von Röhrenknochen (z. B. Femur, Tibia, Fibula, Numerus, Ulna und Radius), einer Epiphysenlinie von Wirbeln, einer Knorpel-Proliferationszone von Handknochen, Fußknochen, Brustknochen und anderen, Perichondrium, aus Fötus-Knorpel gebildetem Knochen-Primordium, einer Callus-Region einer heilenden Knochenfraktur und einem kartilaginären Teil einer Knochen-Proliferationsphase gewonnen werden. Diese wachsenden Knorpelzellen können beispielsweise unter Verwendung der in den Beispielen der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
”Hypertrophierungsfähige Chondrozyten”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf Zellen, die hypertrophisches Wachstum in der Zukunft durchlaufen können. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten beinhalten beliebige andere hypertrophierungsfähige Zellen, die mit einem Verfahren zur Bestimmung einer ”Fähigkeit zur Hypertrophierung” bestimmt werden, das nachstehend definiert ist, zusätzlich zu ”wachsenden Knorpelzellen”, die aus einem biologischen Organismus gewonnen werden.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gemäß der vorliegenden Erfindung stammen von einem Säugetier, vorzugsweise Menschen, Mäusen, Ratten oder Kaninchen. Werden die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten beim Menschen verwendet, sind aus Menschen stammende Zellen bevorzugt, allerdings ist es auch möglich, nicht-menschliche Zellen zu verwenden, da Probleme, wie Immunabstoßung, unter Verwendung von wohl bekannten Verfahren des Standes der Technik vermieden werden können.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gemäß der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel aus einer Knorpel-Knochen-Verbindung der Costa, einer Epiphysenlinie von Röhrenknochen (z. B. Femur, Tibia, Fibula, Humerus, Ulna und Radius), einer Epiphysenlinie von Wirbeln, einer Knorpel-Proliferationszone von Handknochen, Fußknochen, Brustknochen und anderen, Perichondrium, aus Fetus-Knorpel gebildetem Knochen-Primordium, einer Callus-Region einer heilenden Knochenfraktur und einem kartilaginären Teil einer Knochen-Proliferationsphase gewonnen werden. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gemäß der vorliegenden Erfindung können ferner durch Induzieren der Differenzierung von undifferenzierten Zellen gewonnen werden.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gemäß der vorliegenden Erfindung können Chondrozyten sein, die aus beliebigen von den vorstehend beschriebenen Regionen verschiedenen Regionen gewonnen werden. Da Knochen, der durch endochondrale Ossifikation (enchondrale Ossifikation) gebildet wurde, unabhängig von Körperregionen über den gleichen Mechanismus gebildet wird. Mit anderen Worten wird Knorpel gebildet und durch Knochen ersetzt.
Ein Großteil der von dem Cranium und Clavicula verschiedenen Knochen wird durch endochondrale Ossifikation (enchondrale Ossifikation) gebildet. Daher sind die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem größten Teil der von dem Cranium und Clavicula verschiedenen Knochen des Körpers vorhanden. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten besitzen die Fähigkeit zur Induzierung der Osteogenese.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten können morphologisch durch Hypertrophie gekennzeichnet sein.
”Hypertrophie”, so wie hier verwendet, kann morphologisch unter einem Mikroskop bestimmt werden. Wenn Zellen zur Bildung einer Wachstumsschicht säulenartig angeordnet sind, wird die Hypertrophie der Zellen benachbart zur Wachstumsschicht beobachtet. Wenn die Zellen nicht säulenförmig angeordnet sind, bedeutet andererseits die Hypertrophie der Zellen einen Zustand, in dem sie größer sind als marginale Zellen.
Die Fähigkeit zur Hypertrophie wird wie folgt bestimmt: Zentrifugieren einer HAM-F12 Kulturlösung, das 5 × 10⁵ Zellen enthält, zur Bildung eines Pellets aus den Zellen, Kultivieren des Pellets für einen vorbestimmten Zeitraum und Vergleichen der Größen der Zellen vor und nach der Zellkultur unter einem Mikroskop. Wenn bei diesem Vergleich eine signifikante Zunahme der Größen beobachtet wird, besitzen die Zellen die Fähigkeit zur Hypertrophie.
”Ruhende Knorpelzellen” oder ”ruhende Chondrozyten” werden hier austauschbar verwendet und betreffen Knorpelzellen oder Chondrozyten, die in einer Region beabstandet von der Knorpel-Knochen-Verbindung der Costa (Knorpel-Proliferationszone) angeordnet sind. Die Region ist ein Gewebe, das während der gesamten Lebensdauer als Knorpel existiert. In dem ruhenden Knorpel befindliche Zellen werden als ruhende Knorpelzellen bezeichnet. ”Gelenkknorpelzellen”, so wie hier verwendet, betreffen Zellen in einem kartilaginären Gewebe (Gelenkknorpel), das auf einer Gelenkoberfläche liegen.
Die Chondrozyten, so wie hier verwendet, werden durch Identifizierung der Expression von mindestens einem Marker, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Typ-II-Collagen, Knorpel-Proteoglycan (Aglycan) oder Komponenten davon, Hyaluronsäure, Typ-IX-Collagen, Typ-XI-Collagen und Chondromodulin, bestimmt.
Unter den Chondrozyten werden hypertrophierungsfähige Zellen weiterhin durch Identifizieren der Expression von mindestens einem Marker, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Typ-X-Collagen, alkalischer Phosphatase und Osteonectin, bestimmt. Chondrozyten, die keines von Typ-X-Collagen, alkalischer Phosphatase oder Osteonectin exprimieren, werden als nich-hypertrophierungsfähig bestimmt.
Darum können die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, so wie hier verwendet, auch durch Identifizieren der Expression von mindestens einem, ausgewählt aus Chondrozyten-Markern, und mindestens einem, ausgewählt aus Marker für hypertrophierungsfähige Chondrozyten, anstelle der Feststellung der morphologischen Hypertrophie bestimmt werden. Die Lokalisierung oder Expression dieser Marker wird durch jedes beliebige Verfahren der Analyse von aus Kulturzellen extrahierten Proteinen oder RNA, wie spezifisches Färben, immunhistochemische Verfahren, in situ Hybridisierung, Western-Blotting oder PCR, identifiziert.
Ein ”Chondrozyten-Marker (Marker für Chondrozyten)”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf jede Substanz, deren Lokalisierung oder Expression in den Chondrozyten die Identifikation davon unterstützt. Vorzugsweise bezeichnet er eine beliebige Substanz, die zur Identifizierung des Chondrozyten durch ihre Lokalisierung oder Expression (beispielsweise Lokalisierung oder Expression von Typ-II-Collagen, Knorpel-Proteoglycan (Aglycan) oder von Komponenten davon, Hyaluronsäure, Typ-IX-Collagen, Typ-XI-Collagen oder Chondromodulin) verwendet werden kann.
Ein ”Marker für hypertrophierungsfähige Chondrozyten”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf jede Substanz, deren Lokalisierung oder Expression in den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten die Identifizierung davon unterstützt. Vorzugsweise bezieht er sich auf jede Substanz, die zur Identifizierung der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten durch ihre Lokalisierung oder Expression (beispielsweise Lokalisierung oder Expression von Typ-X-Collagen, alkalischer Phosphatase oder Osteonectin) verwendet werden kann.
”Knorpel-Proteoglycan”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Makromolekül, das aus einem Kernprotein und einer Vielzahl von Glucosaminoglycanen, die mit dem Kernprotein verbunden sind, zusammengesetzt ist. Beispiele für Glucosaminoglycane beinhalten Chondroitintetrasulfat, Chondroitinhexasulfat, Keratansulfat, O-verknüpftes Oligosaccharid, N-verknüpftes Oligosaccharid und dergleichen. Das Knorpel-Proteoglycan bindet ferner über ein Verknüpfungsprotein unter Bildung von Knorpel-Proteoglycan-Aggregaten an Hyaluronsäure. In dem kartilaginären Gewebe ist das Glucosaminoglycan reichlich vorhanden und nimmt 20 bis 40% des Trockengewichts des Gewebes ein. Knorpel-Proteoglycan wird auch als Aglycan bezeichnet.
”Knochen-Proteoglycan”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Makromolekül, das ein geringeres Molekulargewicht aufweist als Knorpel-Proteoglycan, und aus einem Kernprotein und Glucosaminoglycanen, die mit dem Kernprotein verbunden sind, zusammengesetzt ist. Beispiele für Glucosaminoglycane beinhalten Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, O-verknüpfte Oligosaccharide, N-verknüpfte Oligosaccharide und dergleichen. In dem Knochengewebe nimmt Glucosaminoglycan 1% oder weniger des Trockengewichts des decalcifizierten Knochens ein. Beispiele füh Knochen-Proteoglycan beinhalten Decorin und Biglycan.
”Osteoblasten”, so wie hier verwendet, beziehen sich auf Zellen, die auf der Knochenmatrix liegen und die Knochenmatrix bilden und sie calcifizieren. Osteoblasten sind Zellen mit einer Größe von 20 bis 30 μm und von würfelförmiger oder säulenförmiger Form. So wie hier verwendet, können Osteoblasten ”Präosteoblasten” einschließen, der Vorläuferzellen für die Osteoblasten sind.
Die Osteoblasten werden durch Identifizieren der Expression von mindestens einem Marker, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Typ-I-Collagen, Knochen-Proteoglycan (z. B. Decorin, Biglycan), alkalischer Phosphatase, Osteocalcin, Matrix-Gla-Protein, Osteoglycin, Osteopontin, Knochenprotein mit Sialinsäure, Osteonectin und Pleiotrophin, bestimmt. Zusätzlich können die Osteoblasten durch Identifizieren einer fehlenden Expression von Chondrozyten-Markern, wie Typ-II-Collagen, Knorpel-Proteoglycan (Aglycan) oder von Komponenten davon, Hyaluronsäure, Typ-IX-Collagen, Typ-XI-Collagen oder Chondromodulin, bestimmt werden.
Die Lokalisierung oder Expression dieser Marker wird durch beliebige Verfahren zur Analyse von aus Kulturzellen extrahierten Proteinen oder RNA, wie spezifisches Färben, immunhistochemische Verfahren, in situ Hybridisierung, Western-Blotting oder PCR, identifiziert.
Ein ”Osteoblasten-Marker (Marker füh Osteoblasten)”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf jede Substanz, deren Lokalisierung oder Expression in den Osteoblasten die Identifizierung davon unterstützt. Vorzugsweise bezeichnet er jede Substanz, die zur Identifizierung der Osteoblasten durch ihre Lokalisierung oder Expression (beispielsweise Lokalisierung oder Expression von Typ-I-Collagen, Knochen-Proteoglycan (z. B. Decorin, Biglycan), alkalischer Phosphatase, Osteocalcin, Matrix-Gla-Protein, Osteoglycin, Osteopontin, Knochenprotein mit Sialinsäure, Osteonectin oder Pleiotrophin) verwendet werden kann.
Osteoglycin wird als osteoinduktiver Faktor (OIF) bezeichnet. Osteopontin wird als BSP-I oder 2ar bezeichnet. Knochenprotein mit Sialinsäure wird als BSP-II bezeichnet. Pleiotrophin wird als Osteoblastenspezifisches Protein oder Osteoblastenspezifischer Faktor-1 (OSF-1) bezeichnet. Osteonectin wird als SPARC oder BM-40 bezeichnet.
Die Osteoblasten können beispielsweise folgendermaßen identifiziert werden: Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der nur Osteoblasten identifiziert; Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der Osteoblasten und hypertrophierungsfähige Chondrozyten identifiziert, während er Chondrozyten nicht identifiziert, und Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der Osteoblasten und Chondrozyten identifiziert, während er hypertrophierungsfähige Chondrozyten nicht identifiziert; Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der Osteoblasten und hypertrophierungsfähige Chondrozyten identifiziert, jedoch als negativ für einen Marker, der Osteoblasten nicht identifiziert, während er hypertrophierungsfähige Chondrozyten identifiziert; oder Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der Osteoblasten und Chondrozyten identifiziert, jedoch als negativ für einen Marker, der Osteoblasten nicht identifiziert, während er Chondrozyten identifiziert.
Hypertrophierungsfähige Chondrozyten können beispielsweise identifiziert werden durch: Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der nur hypertrophierungsfähige Chondrozyten identifiziert; Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der hypertrophierungsfähige Chondrozyten und Osteoblasten identifiziert, während er Chondrozyten nicht identifiziert, und Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der hypertrophierungsfähige Chondrozyten und Chondrozyten identifiziert, während er Osteoblasten nicht identifiziert; Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der hypertrophierungsfähige Chondrozyten und Osteoblasten identifiziert, jedoch als negativ für einen Marker, der hypertrophierungsfähige Chondrozyten nicht identifiziert, während er Osteoblasten identifiziert; oder Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der hypertrophierungsfähige Chondrozyten und Chondrozyten identifiziert, jedoch als negativ für einen Marker, der hypertrophierungsfähige Chondrozyten nicht identifiziert, während er Chondrozyten identifiziert.
(Nicht-hypertrophierungsfähige) Chondrozyten können beispielsweise identifiziert werden durch: Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der nur Chondrozyten identifiziert; Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der Chondrozyten und Osteoblasten identifiziert, während er hypertrophierungsfähige Chondrozyten nicht identifiziert und Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der Chondrozyten und hypertrophierungsfähige Chondrozyten identifiziert, während er Osteoblasten nicht identifiziert; Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der Chondrozyten und Osteoblasten identifiziert, jedoch als negativ für einen Marker, der Chondrozyten nicht identifiziert, während er Osteoblasten identifiziert; oder Bestimmen von Zellen als positiv für einen Marker, der Chondrozyten und hypertrophierungsfähige Chondrozyten identifiziert, jedoch als negativ für einen Marker, der Chondrozyten nicht identifiziert, während er hypertrophierungsfähige Chondrozyten identifiziert.

In der vorliegenden Beschreibung können die Chondrozyten, die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten und die Osteoblasten und die induzierte Osteoblasten beispielsweise unter Verwendung von Kombinationen der nachstehend aufgeführten Marker identifiziert werden.

	Chondrozyten	Hypertrophierungsfähige Chondrozyten	Osteoblasten, induzierte Osteoblasten
Typ-II-Collagen, Knorpel-Proteoglycan (Aglycan), Hyaluronsäure Typ-IX-Collagen, Typ-XI-Collagen, Chondromodulin	+:Expression	+:Expression	–: keine Expression
Typ-X-Collagen	–: keine Expression	+: Expression	–: keine Expression
Alkalische Phosphatase, Osteonectin	–: keine Expression	+: Expression	+: Expression
Typ-I-Collagen, Knochen-Proteoglycan (z. B. Decorin, Biglycan), Osteocalcin, Matrix-Gla-Protein, Osteoglycin, Osteopontin, Knochenprotein mit Sialinsäure, Pleiotrophin	–: keine Expression	–: keine Expression	+: Expression

Ferner können in der vorliegenden Beschreibung die Chondrozyten, die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten und die Osteoblasten zusätzlich zu dem vorstehenden Nachweis der Marker auch durch Beobachtung der Morphologien davon oder verschiedener angefärbter Zustände davon identifiziert werden.
Die Chondrozyten sind Zellen, deren Aggregatszustand unter einem Mikroskop beobachtet wird. Die Zellen zeigen Metachromasie bei der sauren Toluidinblau-Färbung, werden bei der Alcianblau-Färbung blau gefärbt, werden bei der Safranin-O-Färbung rot gefärbt und werden bei der alkalischen Phosphatase-Färbung nicht gefärbt.
Wenn Zellen zur Bildung einer Wachstumsschicht säulenartig angeordnet sind, werden unter dem Mikroskop die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten als Zellen benachbart zur Wachstumsschicht beobachtet, wobei sie größer sind als die Zellen, die die Wachstumsschicht bilden. Wenn die Zellen nicht säulenförmig angeordnet sind, werden unter dem Mikroskop die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten als Zellen beobachtet, die größer sind als marginale Zellen.
Die Zellen zeigen Metachromasie bei der sauren Toluidinblau-Färbung, werden bei der Alcianblau-Färbung blau gefärbt, werden bei der Safranin-O-Färbung rot gefärbt und werden bei der alkalischen Phosphatase-Färbung gefärbt.
Die Osteoblasten sind Zellen mit einer Größe von 20 bis 30 μm, von würfelförmiger oder säulenförmiger Form und besitzen eine alkalische Phosphatase-Aktivität.
Die alkalische Phosphatase-Aktivität wird durch die folgenden Schritte bestimmt: A) Bestimmen von zwei Extinktionen bei 405 nm einer Probe, wobei eine Extinktion wie folgt gemessen wird: zu 100 μl der Probe werden 50 μl 4 mg/ml p-Nitrophenylphosphatlösung und 50 μl Alkalipuffer (”A9226”, hergestellt von Sigma) zugegeben, bei 37°C füh 15 min umgesetzt und anschließend werden der Probe 50 μl 1N NaOH zum Stoppen der Reaktion zugegeben, und wobei die andere Extinktion wie folgt gemessen wird: zusätzlich werden der Probe, deren eine Extinktion bereits bestimmt wurde, 20 μl konzentrierte Salzsäure zugegeben; und B) Berechnen der Differenz zwischen den Extinktionen vor und nach Zugabe der konzentrierten Salzsäure.
Hier ist der Extinktionsunterschied ein Indikator für die alkalische Phosphatase-Aktivität. Wenn ein absoluter Wert des Extinktionsunterschieds steigt, besitzen die Osteoblasten spezifisch die alkalische Phosphatase-Aktivität.
Diese alkalische Phosphatase-Aktivität kann auch durch die folgenden Schritte bestimmt werden: A) Bestimmen von zwei Extinktionen bei 405 nm einer Probe, wobei eine Extinktion wie folgt gemessen wird: zu 100 μl der Probe werden 50 μl 4 mg/ml p-Nitrophenylphosphatlösung und 50 μl Alkalipuffer (”A9226”, hergestellt von Sigma) zugegeben, bei 37°C für 15 min umgesetzt und anschließend werden der Probe 50 μl 1N NaOH zum Stoppen der Reaktion zugegeben, und wobei die andere Extinktion wie folgt gemessen wird: zusätzlich werden der Probe, deren eine Extinktion bereits bestimmt wurde, 20 μl konzentrierte Salzsäure zugegeben; und B) Berechnen der Differenz zwischen den Extinktionen vor und nach Zugabe der konzentrierten Salzsäure.
Hier ist der Extinktionsunterschied ein Indikator füh die alkalische Phosphatase-Aktivität. Wenn ein relativer Wert des Extinktionsunterschieds um mehr als das etwa 1-Fache steigt, besitzen die Osteoblasten spezifisch die alkalische Phosphatase-Aktivität.
0 bis 10 mM p-Nitrophenollösungen werden bei jeder Untersuchung hergestellt, die Extinktionen werden unter Verwendung der p-Nitrophenollösungen gemessen und anschließend werden die gemessenen Werte mit der x-Achse als Konzentration und der y-Achse als Extinktion aufgetragen, um eine lineare Kalibrierungskurve der Werte zu erstellen. Der absolute Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität kann aus der Extinktion basierend auf dieser linearen Kalibrierungskurve berechnet werden.
”Induzierte Osteoblasten”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf Zellen, die aus undifferenzierten Zellen mit einem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung induziert wurden. Diese induzierten Osteoblasten können unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt werden, das folgendes einschließt: A) einen Schritt der Bereitstellung eines Überstandes, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem einen Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium erhalten wird, das mindestens eines ausgewählt aus der Gruppe umfassend ein Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure, oder einen die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden Wirkstoff beinhaltet, der in dem Überstand vorliegt; und B) einen Schritt der Kultivierung der undifferenzierten Zellen in einem Kulturmedium füh undifferenzierte Zellen, das den Überstand oder den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff und eine Mediumkomponente beinhaltet, bei einer ausreichenden Bedingung, um die undifferenzierten Zellen zu den induzierten Osteoblasten zu differenzieren.
Die vorstehenden induzierten Osteoblasten können auch unter Verwendung eines Verfahrens induziert werden, das folgendes einschließt: A) einen Schritt der Bereitstellung eines die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium erhalten wird, das Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure und eine Serumkomponente beinhaltet; und B) einen Schritt der Kultivierung der undifferenzierten Zellen in einem Kulturmedium für undifferenzierte Zellen, das den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff und eine Mediumkomponente beinhaltet, um die undifferenzierten Zellen zu den induzierten Osteoblasten zu differenzieren.
Die induzierten Osteoblasten der vorliegenden Erfindung zeigen keine Metachromasie bei der sauren Toluidinblau-Färbung und könnten sich bei der Safranin-O-Färbung negativ verhalten.
Ein ”induzierter Osteoblasten-Marker (Marker für induzierte Osteoblasten)”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf jede Substanz, deren Lokalisierung oder Expression in den induzierten Osteoblasten die Identifizierung davon unterstützt, zum Beispiel jede Substanz, die zur Identifizierung der induzierten Osteoblasten über ihre Lokalisierung oder Expression verwendet werden kann. Die induzierten Osteoblasten sowie natürliche Osteoblasten können durch Lokalisierung oder Expression der folgenden Marker identifiziert werden (beispielsweise Lokalisierung oder Expression von Typ-I-Collagen, Knochen-Proteoglycan (z. B. Decorin, Biglycan), alkalischer Phosphatase, Osteocalcin, Matrix-Gla-Protein, Osteoglycin, Osteopontin, Knochenprotein mit Sialinsäure, Osteonectin oder Pleiotrophin).
”Induzieren der Differenzierung”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf den Entwicklungsprozess von Teilen in einem biologischen Organismus, wie Zellen, Gewebe und Organe, wobei der Entwicklungsprozess ein Prozess der Induktion der Bildung von Geweben oder Organen mit speziellen Merkmalen ist. Die Begriffe ”Differenzierung” und ”Induzieren der Differenzierung” werden hauptsächlich in der Embryologie, der Entwicklungsbiologie und dergleichen verwendet.
Die Gewebe und Organe in einem biologischen Organismus werden durch die Teilungen eines befruchteten Eis, das aus einer einzigen Zelle besteht, bis zum Erreichen des Erwachsenenalters gebildet. Es ist schwierig, zwischen Zellen und Zellpopulationen in der frühen Entwicklung eines biologischen Organismus zu unterscheiden, der sich vor der Differenzierung befindet oder nicht gut differenziert ist, da die Zellen und Zellpopulationen keinerlei morphologische oder funktionelle Merkmale aufweisen. Ein solcher Zustand wird als ”undifferenziert” bezeichnet.
Außerdem erfolgt die ”Differenzierung” in einem Organ, und dadurch entwickeln sich verschiedene Zellen, aus denen das Organ besteht, zu spezifischen Zellen und Zellpopulationen. Dies wird als Differenzierung innerhalb des Organs bei der Organogenese bezeichnet. Eine solche Induzierung der Entwicklung wird auch als Induzierung der Differenzierung bezeichnet.
Eine ”Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung undifferenzierter Zellen, vorzugsweise embryonaler Stamm-(ES)-Zellen, embryonaler Keim-(EG)-Stammzellen oder Gewebestammzellen, stärker bevorzugt mesenchymaler Stammzellen, zu den induzierten Osteoblasten der vorliegenden Erfindung. Als ein Indikator für die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten kann ein induzierter Osteoblasten-Marker (z. B. alkalische Phosphatase) verwendet werden.
Spezifisch besitzt der Wirkstoff Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten, wenn die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität von C3H10T1/2-Zellen, die einem in der vorliegenden Erfindung verwendeten Wirkstoff in einem Eagle-Basalmedium ausgesetzt werden, oder die alkalische Phosphatase-Aktivität von mesenchymalen Stammzellen, die dem Wirkstoff in essenziellem Minimalmedium (MEM) ausgesetzt werden, um mehr als das etwa 1-fache der Aktivität der jeweiligen Zellen steigt, die in Eagle-Basalmedium oder essenziellen Minimalmedium ohne Wirkstoff kultiviert wurden (z. B. alkalische Phosphatase-Aktivität von Ganzzellen).
Die alkalische Phosphatase-Aktivität wird durch die folgenden Schritte bestimmt: A) Bestimmen von zwei Extinktionen bei 405 nm einer Probe, wobei eine Extinktion wie folgt gemessen wird: zu 100 μl der Probe, mit oder ohne Wirkstoff, werden 50 μl 4 mg/ml p-Nitrophenylphosphatlösung und 50 μl Alkalipuffer (”A9226”, hergestellt von Sigma) zugegeben, bei 37°C für 15 min umgesetzt und anschließend werden der Probe 50 μl 1N NaOH zum Stoppen der Reaktion zugegeben, und wobei die andere Extinktion wie folgt gemessen wird: zusätzlich werden der Probe, deren eine Extinktion bereits bestimmt wurde, 20 μl konzentrierte Salzsäure zugegeben; und B) Berechnen der Differenz zwischen den Extinktionen vor und nach Zugabe der konzentrierten Salzsäure. Hier ist der Extinktionsunterschied ein Indikator für die alkalische Phosphatase-Aktivität.
Ferner besitzt der Wirkstoff Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten, wenn die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität von C3H10T1/2-Zellen, die einem in der vorliegenden Erfindung verwendeten Wirkstoff in einem Eagle-Basalmedium ausgesetzt werden, oder die alkalische Phosphatase-Aktivität von mesenchymalen Stammzellen, die dem Wirkstoff in essenziellem Minimalmedium (MEM) ausgesetzt werden, im Vergleich mit der Aktivität der jeweiligen Zellen steigt, die in Eagle-Basalmedium oder essenziellen Minimalmedium ohne Wirkstoff kultiviert wurden (z. B. alkalische Phosphatase-Aktivität von Ganzzellen).
Diese alkalische Phosphatase-Aktivität wird durch die folgenden Schritte bestimmt: A) Bestimmen von zwei Extinktionen bei 405 nm einer Probe, wobei eine Extinktion wie folgt gemessen wird: zu 100 μl der Probe, mit oder ohne Wirkstoff, werden 50 μl 4 mg/ml p-Nitrophenylphosphatlösung und 50 μl Alkalipuffer (”A9226”, hergestellt von Sigma) zugegeben, bei 37°C für 15 min umgesetzt und anschließend werden der Probe 50 μl 1N NaOH zum Stoppen der Reaktion zugegeben, und wobei die andere Extinktion wie folgt gemessen wird: zusätzlich werden der Probe, deren eine Extinktion bereits bestimmt wurde, 20 μl konzentrierte Salzsäure zugegeben; und B) Berechnen der Differenz zwischen den Extinktionen vor und nach Zugabe der konzentrierten Salzsäure. Hier ist der Extinktionsunterschied ein Indikator für die alkalische Phosphatase-Aktivität.
0 bis 10 mM p-Nitrophenollösungen werden bei jeder Untersuchung hergestellt, die Extinktionen werden unter Verwendung der p-Nitrophenollösungen gemessen und anschließend werden die gemessenen Werte mit der x-Achse als Konzentration und der y-Achse als Extinktion aufgetragen, um eine lineare Kalibrierungskurve der Werte zu erstellen. Der absolute Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität kann aus der Extinktion basierend auf dieser linearen Kalibrierungskurve berechnet werden.
Bisher wurde diese alkalische Phosphatase-Aktivität als Indikator für Osteogenese verwendet. Wenn die alkalische Phosphatase-Aktivität steigt, wird die Osteogenese als fortgeschritten bestimmt (Suds Tatsuo Hrsg., "kotsukeisei to kotsukyushu oyobi sorera no tyosetsuinshi 1 [osteogenesis, osteoclasis and regulators thereof 1" Kabushiki Kaisya Hirokawa Shoten [Hirokawa Shoten Co.], 1995, 30. März, S. 39–44.).
In der vorliegenden Beschreibung bezieht sich ”Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten” für undifferenzierte Zellen (z. B. embryonale Stammzellen, embryonale Keimstammzellen, mesenchymale Stammzellen, hämatopoietische Stammzellen, vaskuläre Stammzellen, hepatische Stammzellen, pankreatische (allgemeine) Stammzellen, neurale Stammzellen) auf die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung der undifferenzierten Zellen zu den induzierten Osteoblasten.
Beispielsweise kann die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen einschließen, die nicht durch ein Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure zu den induzierten Osteoblasten induziert wurden.
Die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten kann durch das folgende Experiment bestimmt werden: gleichmäßiges Impfen von Zielzellen in einer 24-Well-Platte (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte von 1,25 × 10⁴ Zellen/cm² (d. h., 2,5 × 10⁴ Zellen/Loch), Kultivieren der Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C für 72 h und anschließendes Messen des Ausmaßes einer induzierten oder erhöhten Expression von mindestens einem der induzierten Osteoblasten-Marker.
”Undifferenzierte Zellen”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf Zellen, die die Enddifferenzierung noch nicht erreicht haben, oder auf Zellen, die die Fähigkeit zur Differenzierung besitzen. In der vorliegenden Beschreibung können die undifferenzierten Zellen Stammzellen (z. B. embryonale Stammzellen, embryonale Keimstammzellen oder Gewebestammzellen) sein. Zum Beispiel können die Stammzellen mesenchymale Stammzellen (z. B. aus Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen), hämatopoietische Stammzellen, vaskuläre Stammzellen, hepatische Stammzellen, pankreatische (allgemeine) Stammzellen oder neurale Stammzellen sein. Die undifferenzierten Zellen beinhalten weiterhin sämtliche Zellen auf dem Weg zur Differenzierung. Solche undifferenzierte Zellen können C3H10T1/2-Zellen, ATDC5-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen, BALB/3T3-Zellen, NIH3T3-Zellen, PT-2501-Zellen oder aus primärem Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen sein.
Diese Zellen können von ansässigen und ausländischen Firmen bezogen werden, wie Sanko Junyaku Co., Ltd., Cosmo Bio Co., Ltd., Takara Bio Inc., Toyobo Co., Ltd., Summit Pharma Biomedical, Cambrex Corporation, Stem Cell Technology, Invitrogen Corporation, eine Zellbank und dergleichen zusätzlich zu Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten undifferenzierten Zellen können beliebige Zellen sein, die zu den induzierten Osteoblasten differenziert werden können. Ferner können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten undifferenzierten Zellen aus einem Säugetier (z. B. Mensch, Ratte, Maus, Kaninchen) stammende Zellen sein. Beispiele füh diese Zellen können aus Ratten-Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen einschließen.
”Stammzellen”, so wie hier verwendet, beziehen sich auf zur Selbstreplikation und Pluripotenz (d. h. Multipotenz) fähige Zellen. Typischerweise können Stammzellen ein verletztes Gewebe regenerieren. Hier verwendete Stammzellen können embryonale Stammzellen (ES), embryonale Keimstammzellen (EG) oder Gewebestammzellen (auch als gewebliche Stammzellen oder gewebespezifische Stammellen bezeichnet) sein, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Stammzellen können ferner künstlich hergestellte Zellen (z. B. Fusionszellen oder reprogrammierte Zellen, wie in der vorliegenden Beschreibung beschrieben) sein, solange sie die oben beschriebenen Fähigkeiten aufweisen können.
Embryonale Stammzellen beziehen sich auf pluripotente Stammzellen, die aus frühen Embryonen stammen. Embryonale Stammzellen wurden zuerst 1981 entwickelt und seit 1989 bei der Herstellung von Knockout-Mäusen angewandt. 1998 wurden menschliche embryonale Stammzellen entwickelt und werden derzeit der Regenerationsmedizin zur Verfügung gestellt. Es wird angenommen, dass embryonale Keimstammzellen durch Dedifferenzierung von Urgeschlechtszellen durch Exposition gegenüber einem spezifischen umgebenden Wirkstoff gebildet werden. Während embryonale Keimstammzellen eine Eigenschaft als embryonale Stammzellen besitzen, tragen embryonale Keimzellen einen Teil einer Eigenschaft der Urgeschlechtszellen, aus denen sie stammen.
Gewebestammzellen sind in Gewebe vorhanden, besitzen einen geringeren Pluripotenzgrad als embryonale Stammzellen und besitzen im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen ein relativ eingeschränktes Differenzierungsniveau. Im Allgemeinen haben Stammzellen eine undifferenzierte intrazelluläre Struktur, ein hohes Nukleus/Zytoplasma-Verhältnis und wenige intrazelluläre Organellen. Wie hier verwendet, können Stammzellen vorzugsweise mesenchymale Stammzellen sein, obwohl Gewebestammzellen, embryonale Keimzellen oder embryonale Stammzellen, in Abhängigkeit von den Umständen, ebenfalls als Stammzellen verwendet werden können.
Gewebestammzellen werden in Kategorien von Stellen aufgetrennt, aus denen die Zellen stammen, wie das Hautsystem, Verdauungssystem, Knochenmarksystem und Nervensystem. Beispiele für Gewebestammzellen im Hautsystem umfassen epidermale Stammzellen, Haarfollikel-Stammzellen und dergleichen. Beispiele für Gewebestammzellen im Verdauungssystem umfassen pankreatische Stammzellen, hepatische Stammzellen und dergleichen. Beispiele für Gewebestammzellen im Knochenmarksystem umfassen hämatopoietische Stammzellen, mesenchymale Stammzellen und dergleichen. Beispiele für Gewebestammzellen im Nervensystem umfassen neurale Stammzellen, retinale Stammzellen und dergleichen.
Stammzellen können anhand ihres Ursprungs eingeteilt werden und werden insbesondere in aus Ektoderm, Endoderm oder Mesoderm stammende Stammzellen eingeteilt. Stammzellen ektodermalen Ursprungs sind hauptsächlich im Gehirn vorhanden, einschließlich neuraler Stammzellen und dergleichen. Stammzellen endodermalen Ursprungs sind hauptsächlich im Knochenmark vorhanden, einschließlich vaskulärer Stammzellen, hämatopoietischer Stammzellen, mesenchymaler Stammzellen und dergleichen. Stammzellen mesodermalen Ursprungs sind hauptsächlich in Organen vorhanden, einschließlich hepatischer Stammzellen, pankreatischer Stammzellen und dergleichen.
”Mesenchymale Stammzellen”, so wie hier verwendet, beziehen sich auf Stammzellen, die in einem mesenchymalen Gewebe beobachtet werden. Beispiele für mesenchymales Gewebe umfassen Knochenmark, Fettgewebe, vaskuläres Endothel, glatte Muskulatur, Herzmuskel, Skelettmuskel, Knorpel, Knochen und ein Band, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Mesenchymale Stammzellen stammen typischerweise aus Knochenmark, Fettgewebe, Synovialgewebe, Muskelgewebe, peripherem Blut, Placentagewebe, Menstruationsblut oder Nabelschnurblut (vorzugsweise Knochenmark).
Ein ”Wachstumsmedium”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Medium, das ein Basalmedium, Antibiotika (z. B. Penicillin und Streptomycin), ein antibakterielles Mittel (z. B. Amphotericin B) und eine Serumkomponente (z. B. Humanserum, Rinderserum, fetales Rinderserum) enthält. Typischerweise kann die Serumkomponente bis zu 20% des Wachstumsmediums ausmachen. Wenn das Basalmedium ein essenzielles Minmalmedium (MEM) ist, wird außerdem das Medium als ”MEM-Wachstumsmedium” bezeichnet, und wenn das Basalmedium ein HAM-F12-Medium (HAM) ist, wird das Wachstumsmedium als ”HAM-Wachstumsmedium” bezeichnet.
Ein ”den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Medium, das ein Basalmedium und mindestens eine herkömmliche die Differenzierung von Osteoblasten induzierende Komponente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure, umfasst. Das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium kann mindestens eine herkömmliche die Differenzierung von Osteoblasten induzierende Komponente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure, umfassen. Das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium kann sämtliche aus Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure als herkömmliche die Differenzierung von Osteoblasten induzierende Komponente umfassen.
Vorzugsweise beinhaltet das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium essenzielles Minmalmedium (MEM) als Basiskomponente, und β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure als die herkömmlichen die Differenzierung von Osteoblasten induzierende Komponenten. Vorzugsweise kann ”den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium” außerdem eine Serumkomponente (z. B. Humanserum, Rinderserum, fetales Rinderserum) beinhalten. Typischerweise kann die Serumkomponente bis zu 20% des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums ausmachen. Stärker bevorzugt kann das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium das Glucocorticoid, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure und die Serumkomponente beinhalten.
Wenn zudem das Basalmedium ein essenzielles Minmalmedium (MEM) ist, wird das Medium als ”den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium” bezeichnet, und wenn das Basalmedium ein HAM-F12-Medium (HAM) ist, wird das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium als ”den Differenzierungswirkstoff erzeugendes HAM-Medium” bezeichnet.
Es wurde nicht gezeigt, dass das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium an sich die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung von C3H10T1/2-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen, Balb-3T3-Zellen oder NIH3T3-Zellen zu Osteoblasten aufweist. Darum wird angenommen, dass der erfindungsgemäße Wirkstoff von den Komponenten, die in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium eingeschlossen sind, verschieden ist.
Eine ”herkömmliche die Differenzierung von Osteoblasten induzierende Komponente”, so wie hier verwendet, wurde von Maniatopoulos et al. (Maniatopoulos, C et. al.: Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res., 254: 317–330, 1988) vorgeschlagen. Darum ist die herkömmliche die Differenzierung von Osteoblasten induzierende Komponente eine zur Induzierung der Differenzierung von Knochenmarkszellen zu Osteoblasten verwendete Komponente und bezieht sich auf eine Kombination von einem Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure.
”Glucocorticoid”, so wie hier verwendet, ist ein Nebennierenrindenhormon und ist der generische Name eines mit dem Zuckermetabolismus zusammenhängenden Steroidhormons. Das Glucocorticoid ist als eine Komponente zur Induzierung der Differenzierung von Knochenmarkszellen zu Osteoblasten bekannt (Maniatopoulos, C. et al.: Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res., 254: 317–330, 1988). Allerdings ist es nicht bekannt, dass das Glucocorticoid eine Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung der vorstehend beschriebenen Zellen zu Osteoblasten besitzt.
Das Glucocorticoid wird auch als Kohlenhydratcorticoid bezeichnet. Typische Beispiele füh das Glucocoricoid beinhalten Dexamethason, Betamethason, Prednisolon, Prednison, Cortison, Cortisol, Corticosteron und dergleichen, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Vorzugsweise wird Dexamethason als das Glucocorticoid verwendet. Beispiele füh das Glucocorticoid können ferner eine chemisch synthetisierte Substanz mit der gleichen Wirkung wie natives Glucocorticoid einschließen.
Wenn diese typischen Glucocorticoide bei der Kultur von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zusammen mit β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure verwendet werden, wird ein Wirkstoff mit der Aktivität zur Induzierung der Differenzierung von C3H10T1/2-Zellen zu Osteoblasten erzeugt. Darum können in der vorliegenden Erfindung diese typischen Glucocorticoide in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium enthalten sein. Das Glucocorticoid kann in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium bei einer Konzentration von 0,1 nM bis 10 mM und vorzugsweise bei einer Konzentration von 10 bis 100 nM enthalten sein.
”β-Glycerophosphat”, so wie hier verwendet, ist ein generischer Name eines Salzes, das mit einer Phosphatgruppe in der β-Position von Glycerophosphorsäure (C₃H₅(OH)₂OPO₃H₂) gebunden ist. Beispiele für das Salz beinhalten ein Calciumsalz, Natriumsalz und dergleichen. Das β-Glycerophosphat ist als eine zur Induzierung der Differenzierung von Knochenmarkszellen zu Osteoblasten fähige Komponente bekannt (Maniatopoulos, C. et al.: Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res., 254: 317–330, 1988). Allerdings ist es nicht bekannt, dass das β-Glycerophosphat eine Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung der vorstehend beschriebenen Zellen zu Osteoblasten besitzt.
Wenn das β-Glycerophosphat bei der Kultur von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zusammen mit Glucocorticoid und Ascorbinsäure verwendet wird, wird ein Wirkstoff mit der Aktivität zur Induzierung der Differenzierung von C3H10T1/2-Zellen zu Osteoblasten erzeugt. Darum kann in der vorliegenden Erfindung β-Glycerophosphat in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium enthalten sein. β-Glycerophosphat kann in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium bei einer Konzentration von 0,1 mM bis 1 M und vorzugsweise bei einer Konzentration von 10 mM enthalten sein.
”Ascorbinsäure”, so wie hier verwendet, ist ein weißes, kristallines, wasserlösliches Vitamin. Die Ascorbinsäure ist in den meisten Pflanzen, insbesondere Zitrusfrüchten, enthalten. Die Ascorbinsäure wird auch als Vitamin C bezeichnet. Ascorbinsäure ist als eine zur Induzierung der Differenzierung von Knochenmarkszellen zu Osteoblasten fähige Komponente bekannt (Maniatopoulos, C. et al.: Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res., 254: 317–330, 1988). Allerdings ist es nicht bekannt, dass die Ascorbinsäure eine Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung der vorstehend beschriebenen Zellen zu Osteoblasten besitzt.
In der vorliegenden Erfindung kann Ascorbinsäure und Derivate davon einschließen.
Beispiele für die Ascorbinsäure beinhalten L-Ascorbinsäure, L-Ascorbinsäurenatrium, L-Ascorbylpalmitat, L-Ascorbylstearat, L-Ascorbinsäure-2-glucosid, Ascorbinsäurephosphatmagnesium und Ascorbinsäureglucosid, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Beispiele für die Ascorbinsäure können chemisch synthetisierte Substanzen mit der gleichen Wirkung wie native Ascorbinsäure einschließen.
Wenn diese typischen Ascorbylsäuren bei der Kultur eines hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zusammen mit Glucocorticoid und β-Glycerophosphat verwendet werden, wird dadurch ein Wirkstoff mit der Aktivität zur Induzierung der Differenzierung von C3H10T1/2-Zellen zu Osteoblasten erzeugt. Darum können in der vorliegenden Erfindung diese typischen Ascorbinsäuren in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium enthalten sein. Die Ascorbinsäure kann in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium bei einer Konzentration von 0,1 μg/ml bis 5 mg/ml und vorzugsweise bei einer Konzentration von 10 bis 50 μg/ml enthalten sein.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die besten Weisen für die vorliegende Erfindung sind nachstehend beschrieben. Es wird davon ausgegangen, dass die nachstehend bereitgestellten Ausführungsformen für den Zweck des besseren Verständnisses der Erfindung bereitgestellt sind. Der Umfang der Erfindung sollte nicht auf die folgenden Beschreibungen beschränkt werden. Es ist darum offensichtlich, dass die Fachleute die Beschreibungen hier lesen und sie entsprechend im Rahmen der vorliegenden Erfindung modifizieren können.
(Verbundmaterial)
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verbundmaterial zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus bereit. Das Verbundmaterial kann folgendes beinhalten: A) einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem Medium, das mindestens eines ausgewählt aus der Gruppe umfassend Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure beinhaltet, erhalten werden, und B) ein biokompatibles Gerüst.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verbundmaterial zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus bereit. Das Verbundmaterial kann folgendes beinhalten: A) einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem Medium, das mindestens eines ausgewählt aus der Gruppe umfassend Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure und eine Serum-Komponente beinhaltet, und B) ein biokompatibles Gerüst.
In einer Ausführungsform kann der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in folgendem vorliegen: (1) in dem Medium, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden, oder (2) in einer Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder höher, erhalten durch Ultrafiltration des Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden, unter Verwendung eines Filters mit einer molekularen Trenngrenze von 50.000.
In einer Ausführungsform kann der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff, der in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, konzentriert sein. „Konzentriert”, wie hierin verwendet, bedeutet Erhöhen einer Konzentration des Überstands. Der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff kann in dem Überstand mehr als einmal konzentriert vorhanden sein. Vorzugsweise kann der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in dem Überstand mehr als zweimal konzentriert vorhanden sein.
In einer Ausführungsform kann der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff, der in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, fest (d. h. ein gefriergetrocknetes Produkt) sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Dies deshalb, weil in dem Fall, wo das Gerüst flüssig ist, der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff durch Herstellen von Kontakt mit dem Gerüst in die Flüssigkeit verbracht werden kann. Dies auch deshalb, weil in dem Fall, wo das Gerüst flüssig ist, damit der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff, einen ausreichenden Kontakt mit dem Gerüst herstellt, eine Lösung, die den Wirkstoff enthält, unter Verwendung eines Lösungsmittels hergestellt werden kann.
„Gefriergetrocknet”, wie hierin verwendet, bedeutet Verbringen in einen getrockneten Zustand durch Tiefkühlen einer wässrigen Lösung, um ein gefrorenes Produkt zu erhalten, und dann direktes Sublimieren des Wassers aus dem gefrorenen Produkt unter Verwendung einer Vakuumanlage.
In einer Ausführungsform kann in dem erfindungsgemäßen Verbundmaterial der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff an dem biokompatiblen Gerüst haften. „Haftung”, wie hierin verwendet, bedeutet das gegenseitige Zusammenhalten oder das gegenseitige Zusammenkleben.
Ein „Zustand, dass der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff an dem biokompatiblen Gerüst haftet”, wie hierin verwendet, bedeutet einen Zustand, dass der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff mit dem biokompatiblen Gerüst Kontakt herstellt, wodurch er an einer Oberfläche des biokompatiblen Gerüsts oder an einer internen Pore davon (z. B: ein Zustand der Adsorption, der Imprägnierung, der Immersion, der Bindung, der Adhäsion, der Verankerung).
„Kontakt”, wie hierin verwendet, bedeutet, dass gegenseitiger Kontakt hergestellt wird oder eine gegenseitige Berührung. Der „die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff stellt Kontakt mit dem biokompatiblen Gerüst her” bedeutet, dass der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff das biokompatible Gerüst in einem Ausmaß berührt, dass ersterer an letzterem haftet.
In einer Ausführungsform kann in dem erfindungsgemäßen Verbundmaterial der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in dem biokompatiblen Gerüst dispergiert sein. Beispielweise kann ein „Zustand, dass der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in dem biokompatiblen Gerüst dispergiert ist” ein Zustand sein, dass ersterer in letzteren so vorhanden ist, dass Trennung an mehr als einem Punkt vorliegt.
In einer Ausführungsform kann in dem erfindungsgemäßen Verbundmaterial der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in einer vorbestimmten Region des biokompatiblen Gerüsts haften oder darin dispergiert sein, wie einer Oberfläche davon oder eine interne Pore davon.
In einer Ausführungsform kann das in dem erfindungsgemäßen Verbundmaterial verwendete biokompatible Gerüst ein gelatineartiges Gerüst oder ein dreidimensionales Gerüst sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Dies deshalb, weil jedes biokompatible Gerüst verwendet werden kann, solange der vorhandene Wirkstoff daran haftet oder darin dispergiert ist, oder daran haften kann oder darin dispergiert sein kann.
In einer Ausführungsform kann das in dem erfindungsgemäßen Verbundmaterial verwendete biokompatible Gerüst Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Aluminiumoxid, Zirconiumoxid, Apatit-Wollastonit enthaltendes Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix, Seide, Cellulose, Dextran, Agarose, Agar, synthetisches Polypeptid, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglycolsäure, Polymethylmethacrylat, Polycyanoacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, ein Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, Nylon und eine Kombination davon sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Dies deshalb, weil jedes biokompatible Gerüst verwendet werden kann, solange der vorhandene Wirkstoff daran haftet oder darin dispergiert ist, oder daran haften kann oder darin dispergiert sein kann.
Vorzugsweise kann das biokompatible Gerüst beispielsweise poröses Hydroxylapatit (z. B. ”APACERAM mit Porosität 50%”, hergestellt von HOYA CORPORATION), super-poröses Hydroxylapatit (z. B. ”APACERAM mit Porosität 85%”, hergestellt von HOYA CORPORATION, ”3D Scaffold”, hergestellt von BD Corporation), ein Apatit-Collagen-Gemisch (z. B. ein Gemisch aus ”APACERAM GRANULE”, hergestellt von HOYA CORPORATION, und ”Collagen Gel”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.), ein Apatit-Collagen-Komplex (z. B. ”APACOLLA”, hergestellt von HOYA CORPORATION), Collagengel (z. B. ”Collagen Gel”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.), Collagenschwamm (z. B. ”Collagen Sponge”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.), Gelatineschwamm (z. B. ”Hemostatic Gelatin Sponge”, hergestellt von Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.), Fibringel (”Beriplast P”, hergestellt von Nipro), synthetisches Peptid (z. B. ”Pramax”, hergestellt von 3D Matrix Corporation), ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix (z. B. ”Matrigel”, hergestellt von BD Corporation), Alginsäure (”Kelton LVCR”, hergestellt von Kelco Corporation), Agarose (”Agarose”, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Polyglycolsäure, Polymilchsäure, ein Polyglycolsäure-Polymilchsäure-Copolymer und eine Kombination davon sein. Stärker bevorzugt kann das biokompatible Gerüst der Hydroxylapatit, das Collagengel und das Gemisch aus extrazellulärer Matrix.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann das biokompatible Gerüst Hydroxylapatit, das Collagen, die Alginsäure, ein Gemisch aus Laminin, Typ-IV-Collagen und Entactin und dergleichen sein.
In einer Ausführungsform kann das zum Kultivieren der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung verwendete Medium (in der vorliegenden Beschreibung als ein ”den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium” bezeichnet) mindestens eines aus einem Glucocorticoid (z. B. Dexamethason, Predonisolon, Predonison, Cortison, Betamethason, Cortisol, Corticosteron), β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure und dergleichen enthalten. Vorzugsweise kann dieses Medium sowohl β-Glycerophosphat als auch Ascorbinsäure enthalten. Stärker bevorzugt beinhaltet dieses Medium das Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure.
Zusätzlich kann dieses Medium weiterhin andere Komponenten einschließen, wie Transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β), Knochen-morphogenetischen Faktor (BMP), Leukämie-inhibitorischen Faktor (LIF), Kolonien-stimulierenden Faktor (CSF), Insulin-artigen Wachstumsfaktor (IGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), plättchenreiches Plasma (PRP), aus Plättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF). Es kann brauchbar sein, dass dieses Medium ferner eine Serumkomponente (z. B. Humanserum, Rinderserum, fetales Rinderserum) beinhaltet. Typischerweise kann die Serumkomponente in dem Medium bis zu 20% davon ausmachen.
Weitere Beispiele für das zum Kultivieren der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung verwendete Medium können Ham-F12-Medium (HAM-F12), modifiziertes Eagle-Medium nach Dulbecco (DMEM), essenzielles Minimalmedium (MEM), essenzielles Minimalmedium α (αMEM), Eagle-Basalmedium (BME), ein modifiziertes Medium nach Fitton-Jackson (BGJb) beinhalten, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Dieses Medium kann jede Substanz enthalten, die die Proliferation und Induzierung der Differenzierung von Zellen fördern kann. Hier wurde noch nicht gezeigt, dass dieses Medium die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung von C3H10T1/2-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen oder Balb-3T3-Zellen oder N1H3T3-Zellen zu Osteoblasten besitzt.
In einer Ausführungsform kann in dem Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in einem gefriergetrockneten Zustand mit einer Collagenlösung vermischt werden, das Medium kann das Minimal Essential Medium (MEM) als Basiskomponente beinhalten und das Medium kann weiterhin das Glucocorticoid, das β-Glycerophosphat und die Ascorbinsäure beinhalten
In einer anderen Ausführungsform kann in dem Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff an dem Hydroxylapatit anhaften oder darin dispergiert sein, das Medium kann das Minimal Essential Medium (MEM) als Basiskomponente beinhalten und das Medium kann weiterhin das Glucocorticoid, das β-Glycerophosphat und die Ascorbinsäure beinhalten.
In einer Ausführungsform kann das Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung bei der Osteogenese zur Reparatur oder Behandlung von Knochendefekten verwendet werden. Beispiele für solche Knochendefekte beinhalten Läsionen, wie Knochentumore, Osteoporose, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Osteomyelitis und Osteonekrosis; Korrekturen, wie Immobilisierung des Knochens, Foraminotomie und Osteotomie; Trauma, wie eine komplexe Fraktur; Knochendefekte, die von einer Entnahme aus Hüftknochen stammen; und dergleichen, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Der Knochendefekt kann jeweils so groß sein, dass er nur durch Immobilisierung des Knochens nicht behandelt werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung bei der Osteogenese zur Knochenbildung in einer Region verwendet werden, in deren Umgebung kein Knochen vorhanden ist. Eine solche Region, in deren Umgebung kein Knochen vorhanden ist, kann Weichgewebe, wie subkutanes Gewebe, Muskelgewebe und Fettgewebe, Verdauungsorgane, Atmungsorgane, Harnorgane, Geschlechtsorgane, endokrine Organe, vaskuläre Systeme, Nervensysteme und Sinnesorgane einschließen, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff besitzt die Fähigkeit zur Steigerung der alkalischen Phosphatase-(ALP)-Aktivität von C3H10T1/2-Zellen, die dem Wirkstoff in Eagle-Basalmedium ausgesetzt werden, um mehr als das etwa 1-fache der Aktivität der jeweiligen Zellen, die in Eagle-Basalmedium oder essenziellen Minimalmedium ohne Wirkstoff kultiviert wurden (z. B. alkalische Phosphatase-Aktivität von Ganzzellen).
Die alkalische Phosphatase-Aktivität wird durch die folgenden Schritte bestimmt: A) Bestimmen von zwei Extinktionen bei 405 nm einer Probe, wobei eine Extinktion wie folgt gemessen wird: zu 100 μl der Probe, mit oder ohne Wirkstoff, werden 50 μl 4 mg/ml p-Nitrophenylphosphatlösung und 50 μl Alkalipuffer (”A9226”, hergestellt von Sigma) zugegeben, bei 37°C für 15 min umgesetzt und anschließend werden der Probe 50 μl 1N NaOH zum Stoppen der Reaktion zugegeben, und wobei die andere Extinktion wie folgt gemessen wird: zusätzlich werden der Probe, deren eine Extinktion bereits bestimmt wurde, 20 μl konzentrierte Salzsäure zugegeben; und B) Berechnen der Differenz zwischen den Extinktionen vor und nach Zugabe der konzentrierten Salzsäure. Hier ist der Extinktionsunterschied ein Indikator für die alkalische Phosphatase-Aktivität.
Die alkalische Phosphatase-Aktivität zeigt vorzugsweise eine mindestens 2-fache, mindestens 3-fache, mindestens 4-fache, mindestens 5-fache, mindestens 6-fache, mindestens 7-fache, mindestens 8-fache, mindestens 9-fache, mindestens 10-fache, mindestens 11-fache, mindestens 12-fache oder mindestens 13-fache Steigerung.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff besitzt die Fähigkeit zur Steigerung der alkalischen Phosphatase-(ALP)-Aktivität von C3H10T1/2-Zellen, die dem Wirkstoff in Eagle-Basalmedium ausgesetzt werden, oder der alkalischen Phosphatase-Aktivität von mesenchymalen Stammzellen, die dem Wirkstoff in essenziellem Minimalmedium (MEM) ausgesetzt werden, im Vergleich zu der Aktivität der jeweiligen Zellen, die in Eagle-Basalmedium oder essenziellen Minimalmedium ohne Wirkstoff kultiviert wurden (z. B. alkalische Phosphatase-Aktivität von Ganzzellen).
Die alkalische Phosphatase-Aktivität wird durch die folgenden Schritte bestimmt: A) Bestimmen von zwei Extinktionen bei 405 nm einer Probe, wobei eine Extinktion wie folgt gemessen wird: zu 100 μl der Probe, mit oder ohne Wirkstoff, werden 50 μl 4 mg/ml p-Nitrophenylphosphatlösung und 50 μl Alkalipuffer (”A9226”, hergestellt von Sigma) zugegeben, bei 37°C füh 15 min umgesetzt und anschließend werden der Probe 50 μl 1N NaOH zum Stoppen der Reaktion zugegeben, und wobei die andere Extinktion wie folgt gemessen wird: zusätzlich werden der Probe, deren eine Extinktion bereits bestimmt wurde, 20 μl konzentrierte Salzsäure zugegeben; und B) Berechnen der Differenz zwischen den Extinktionen vor und nach Zugabe der konzentrierten Salzsäure. Hier ist der Extinktionsunterschied ein Indikator für die alkalische Phosphatase-Aktivität.
Die alkalische Phosphatase-Aktivität zeigt vorzugsweise eine mindestens 2-fache, mindestens 3-fache, mindestens 4-fache, mindestens 5-fache, mindestens 6-fache, mindestens 7-fache, mindestens 8-fache, mindestens 9-fache, mindestens 10-fache, mindestens 11-fache, mindestens 12-fache oder mindestens 13-fache Steigerung.
In einer Ausführungsform kann der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff, der in dem Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, fest (d. h. ein gefriergetrocknetes Produkt) sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Dies deshalb, weil in dem Fall, wo das Gerüst flüssig ist, der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff durch Herstellen von Kontakt mit dem Gerüst in die Flüssigkeit verbracht werden kann. Dies auch deshalb, weil in dem Fall, wo das Gerüst flüssig ist, damit der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff, einen ausreichenden Kontakt mit dem Gerüst herstellt, eine Lösung, die den Wirkstoff enthält, unter Verwendung eines Lösungsmittels hergestellt werden kann.
Ein ”Mittel” oder ”Faktor” wird hier austauschbar verwendet und kann jede beliebige Substanz oder Komponente sein, solange sie das beabsichtigte Ziel erreicht.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff kann beispielsweise ein Protein, ein Polypeptid, ein Oligopeptid, ein Peptid, eine Aminosäure, eine Nukleinsäure, ein Polysaccharid, ein Lipid, ein organisches niedermolekulares Molekül oder ein Komplex davon sein.
Ein ”die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierender Wirkstoff', so wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Wirkstoff, der die Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, und kann einfach oder komplex sein, solange er die Aktivität selbst aufweisen kann. Der die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff kann durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium erhalten werden, das mindestens eines ausgewählt aus der Gruppe enthält, die ein Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure umfasst.
Es ist selbstverständlich, dass ein durch ein anderes Verfahren erhaltener Wirkstoff oder ein Wirkstoff aus einer unterschiedlichen Bildung austauschbar in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, solange der Wirkstoff die gleiche Aktivität des in der vorliegenden Erfindung verwendeten die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs aufweist, der zur Induktion der Differenzierung undifferenzierter Zellen zu induzierten Osteoblasten in der Lage ist. Ein solcher Wirkstoff kann unter Verwendung des allgemeinen Fachwissens auf der Grundlage der Offenbarung der vorliegenden Beschreibung identifiziert werden, zusätzlich zu den Wirkstoffen, die grundsätzlich in den Beispielen angegeben sind.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff besitzt die Fähigkeit zur Steigerung der Expression einer für induzierte Osteoblasten spezifischen Substanz, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Typ-I-Collagen, Knochen-Proteoglycan (z. B. Decorin, Biglycan), alkalische Phosphatase, Osteocalcin, Matrix-Gla-Protein, Osteoglycin, Osteopontin, Knochenprotein mit Sialinsäure, Osteonectin und Pleiotrophin.
Darum ist das hier verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff durch die Steigerung der alkalischen Phosphatase-Aktivität von undifferenzierten Zellen bei der Enzymaktivität gekennzeichnet. Ferner ist der die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff ein Wirkstoff mit der Fähigkeit zur Expression von mindestens einem Osteoblasten-Marker in den undifferenzierten Zellen auf dem Niveau der Genexpression oder Proteinexpression gekennzeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der in der vorliegenden Erfindung verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff durch Messen der Zunahme der alkalischen Phosphatase-Aktivität und durch die Expression oder Lokalisierung eines induzierten Osteoblasten-Markers in undifferenzierten Zellen identifiziert werden.
In einer weiteren Ausführungsform verliert der in der vorliegenden Erfindung verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung undifferenzierter Zellen zu induzierten Osteoblasten durch Erwärmen für 3 min in siedendem Wasser (im Allgemeinen einschließlich etwa 96 bis 100°C, z. B. etwa 96°C, etwa 97°C, etwa 98°C, etwa 99°C und etwa 100°C). Das Sieden wird durch Beobachten bestätigt. Der Verlust der Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten bedeutet einen Zustand, der die Lokalisierung oder Expression eines induzierten Osteoblasten-Markers nicht wesentlich erhöht.
In einer weiteren Ausführungsform verliert der in der vorliegenden Erfindung verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff die Fähigkeit zur Induzierung der alkalischen Phosphatase-Aktivität von undifferenzierten Zellen durch Erwärmen füh 3 min in siedendem Wasser gehindert. Der Verlust der Fähigkeit zur Induzierung der alkalischen Phosphatase-Aktivität von undifferenzierten Zellen bedeutet einen Zustand, der die alkalische Phosphatase-Aktivität darin nicht wesentlich erhöht.
Die Begriffe ”Protein”, ”Polypeptid”, ”Oligopeptid” und ”Peptid”, so wie hier verwendet, besitzen die gleiche Bedeutung und beziehen sich auf ein Aminosäurepolymer mit beliebiger Länge. Die chemische Struktur dieses Polymers kann geradkettig, verzweigt oder zyklisch sein. Die Aminosäure kann eine natürlich oder nicht natürlich vorkommende Aminosäure oder eine modifizierte Aminosäure sein. Da das hier verwendete Aminosäurepolymer vorzugsweise eine Form aufweist, die basierend auf einem Nukleinsäuremolekül translatiert wurde, besitzt es eine lineare chemische Struktur und besteht nur aus natürlichen Aminosäuren, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt. Der Begriff kann diejenigen einschließen, die zu einem Komplex aus einer Vielzahl von Polypeptidketten zusammengefügt wurden.
Der Begriff umfasst auch ein natürlich vorkommendes oder ein künstlich modifiziertes Aminosäurepolymer. Beispiele füh eine solche Modifikation umfassen Disulfidbrückenbildung, Glycosylierung, Lipidierung, Acetylierung, Phosphorylierung oder jede andere beliebige Manipulation oder Modifikation (z. B. Verknüpfung mit einer Markierungsgruppe). Diese Definition umfasst ein Polypeptid, das mindestens ein Aminosäureanalog (z. B. eine nicht-natürliche Aminosäure), eine peptidartige Verbindung (z. B. Peptoid) und Verbindungen beinhaltet, die unter Verwendung von anderen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren modifiziert wurden.
Es sollte selbstverständlich sein, dass, wie insbesondere hier erwähnt, ”Protein” sich auf ein Aminosäurepolymer mit relativ hohem Molekulargewicht oder auf ein modifiziertes Polymer davon bezieht, und dass sich ”Peptid” auf ein Aminosäurepolymer mit relativ niedrigem Molekulargewicht oder auf ein modifiziertes Polymer davon bezieht.
(Hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten hypertrophierungsfähigen Chondrozyt stammen aus einem Säugetier, vorzugsweise Mensch, Maus, Ratte oder Kaninchen. Es gibt zwei Arten der Ossifikation, die membranöse Ossifikation und die chondrale Ossifikation, die in einem Säugetier vorkommen.
Die membranöse Ossifikation ist eine Art, die bei der Bildung von Plattenknochen (z. B. Großteil des Schädels und Clavicula) nahe der Oberfläche fungiert. Bei der membranösen Ossifikation wird membranöser Knochen direkt gebildet, ohne dass Bindegewebe Knorpel durchläuft. Die membranöse Ossifikation wird auch als intramembranöse Ossifikation oder Bindegewebsossifikation bezeichnet.
Andererseits ist die chondrale Ossifikation ist eine Art, die bei der Bildung des Endoskeletts (z. B Wirbel, Costa, Gliedmaßenknochen) im Körperinneren fungiert. Bei der chondralen Ossifikation bildet sich zunächst Knorpel, Blutgefäße infiltrieren in das Grundgerüst des Knorpels und anschließend wird der Knorpel unter Bildung von calcifiziertem Knorpel calcifiziert. Der gebildete calcifizierte Knorpel wird vorübergehend zerschlagen, und anschließend wird die Ossifikation unter Bildung von Knochen und primordialem Knochenmark eingeleitet.
Bei diesem Vorgang wird Knorpel-Primordium innerhalb des Knorpels gebildet und anschließend wird das Knorpel-Primordium durch ein Wachstumshormon und dergleichen beeinflusst. Dadurch verlängert sich der Knorpel und nimmt in seiner Größe in der Längsachse und der kleineren Achse zu. Anschließend infiltrieren Blutgefäße die Epiphyse, um die Ossifikation zu induzieren.
Die chondrale Ossifikation wird auch als endochondrale oder enchondrale Ossifikation bezeichnet (siehe Fujita Hisao, Fujita Tsuneo, "hone no hassei" hyojun soshikigaku, Seite 127 ["the development of bone" standard histological review, Seite 127]; kososhiki no kigen to shinka-josetsu-, Suda Tateo, The BONE, 18 kan, Seiten 421–426, 2004 [The origin and evolution of the hard tissue-introduction-, Suda Tateo, The BONE, 18. Ausg., Seiten 421–426, 2004; nainankotsusei kotsukeisei no katei, Suzuki Fujio, "hone wa donoyonishite dekiruka" Osaka Daigaku Shuppankai, Seite 21, 2004 [The process of endochondral ossification, Suzuki Fujio, "How does bone formation?" Osaka University Press, Seite 21, 2004]; Suzuki Takao et al. edit, "Hone no jiten", Asakura shoten [Suzuki Takao et al. Hrsg., "The dictionary of bone", Asakura shoten]).
Darum existieren die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, die einen zur Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten fähigen Wirkstoff erzeugen können, gleichmäßig in einem Säugetier, einschließlich Ratte, Maus, Kaninchen, Menschen und dergleichen. Der Wirkstoff spielt bei der Ossifikation eine bedeutende Rolle. Somit kann der Wirkstoff der vorliegenden Erfindung von den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten unter Verwendung des gleichen Vorgangs in einem Säugetier und dergleichen, bei denen die endochondrale Ossifikation induziert wird, ohne Rücksicht auf die Spezies hergestellt werden.
Unter Verwendung molekularbiologischer Verfahren wurde gezeigt, dass die Osteogenese durch Implantation eines menschlichen rekombinanten BMP-Proteins in Ratten induziert wird und daher das von Menschen stammende BMP auf die gleiche Weise wie das aus Ratten stammende BMP-Protein funktioniert (siehe Wozney, J. M. et al., Science, 242: 1528–1534, 1988, und Wuerzler K. K. et al., J. Craniofacial Surg., 9: 131–137, 1998). Es wurde auch bewiesen, dass der mit der Ossifikation assoziierte Wirkstoff austauschbar zwischen Mensch und Ratte verwendet werden kann. Es ist bekannt, dass diese BMPs auf dem Niveau ihrer Aminosäuresequenzen verschieden, jedoch in ihren Eigenschaften als Protein (d. h. Eigenschaften im festen Zustand bei Bedingungen der Induzierung und dergleichen) im Wesentlichen identisch sind.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten gemäß der vorliegenden Erfindung können beispielsweise aus einer Region wie der Knorpel-Knochen-Verbindung der Costa, der Epiphysenlinie von Röhrenknochen (z. B. Femur, Tibia, Fibula, Numerus, Ulna und Radius), der Epiphysenlinie von Wirbeln, der Knorpel-Proliferationszone kleiner Knochen (z. B. von Handknochen, Fußknochen und Brustknochen), Perichondrium, aus Fötus-Knorpel gebildetem Knochen-Primordium, der Callus-Region einer heilenden Knochenfraktur und dem kartilaginären Teil einer Knochen-Proliferationsphase isoliert oder induziert werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten hypertrophierungsfähigen Chondrozyten können Chondrozyten sein, die aus beliebigen Regionen erhalten wurden, solange sie die Fähigkeit zur Hypertrophierung aufweisen. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten können auch durch Induzieren der Differenzierung erhalten werden.
Wenn der die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff von den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird, können in der vorliegenden Erfindung die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten typischerweise auf eine Zelldichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² eingestellt werden. Die Zelldichte wird normalerweise auf einen Wert in dem Bereich von 10⁴ bis 10⁶ Zellen/cm² eingestellt, kann jedoch auf weniger als 10⁴ Zellen/cm² oder auf mehr als 10⁶ Zellen/cm² eingestellt werden.
In der vorliegenden Erfindung wird das Kultivieren der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten unter Verwendung von Zellen durchgeführt, die mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren isoliert oder induziert wurden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten hypertrophierungsfähigen Chondrozyten können Zellen sein, die in einem beliebigen Medium kultiviert wurden, das Ham-F12-Medium (HAM-F12), modifiziertes Eagle-Medium nach Dulbecco (DMEM), essenzielles Minimalmedium (MEM), essenzielles Minimalmedium α (αMEM), Eagle-Basalmedium (BME), ein modifiziertes Medium nach Fitton-Jackson (BGJb) beinhaltet, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten können in einem Medium kultivierte Zellen sein, das jede Substanz enthalten kann, die die Proliferation und Induzierung der Differenzierung von Zellen fördern kann.
In der vorliegenden Erfindung kann ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium mindestens eine herkömmliche die Differenzierung von Osteoblasten induzierende Komponente ausgewählt aus der Gruppe umfassend ein Glucocorticoid (z. B. Dexamethason, Predonisolon, Predonison, Cortison, Betamethason, Cortisol, Corticosteron), β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure enthalten. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Wirkstoff wird ferner unter Verwendung des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums hergestellt, das nur β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure enthält. Vorzugsweise enthält das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium das Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure.
In der vorliegenden Erfindung kann das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium weiterhin andere Komponenten beinhalten, wie Transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β), Knochen-morphogenetischen Faktor (BMP), Leukämie-inhibitorischen Faktor (LIF), Kolonien-stimulierenden Faktor (CSF), Insulin-artigen Wachstumsfaktor (IGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), plättchenreiches Plasma (PRP), aus Plättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF). Es kann brauchbar sein, dass das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium ferner eine Serumkomponente (z. B. Humanserum, Rinderserum, fetales Rinderserum) beinhaltet. Typischerweise kann die Serumkomponente in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium bis zu 20% davon ausmachen.
In der vorliegenden Beschreibung kann eine Zeitspanne zum Kultivieren der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten eine Zeitspanne sein, in der der Wirkstoff in einer ausreichenden Menge hergestellt werden kann (z. B. mehrere Monate bis zu einem halben Jahr, oder 3 Tage bis 3 Wochen (z. B. 3 Tage, 4 Tage, 5 Tage, 6 Tage, 7 Tage, 8 Tage, 9 Tage, 10 Tage, 20 Tage, mehr als 1 Monat, ein halbes Jahr, 5 Monate, 4 Monate, 3 Monate, 2 Monate, 1 Monat, 3 Wochen oder weniger, und mögliche Kombinationen davon in einem beliebigen Bereich). Wenn die Zeitspanne des Kultivierens fortgeschritten ist und die Zellen in einem Kulturgefäß konfluent sind, werden die Zellen bevorzugt umgesetzt.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verbundmaterial zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus bereit. Das Verbundmaterial beinhaltet: A) hypertrophierungsfähige Chondrozyten und B) Alginsäure.
In einem unterschiedlichen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verbundmaterial zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus bereit. Das Verbundmaterial beinhaltet: A) hypertrophierungsfähige Chondrozyten und B) ein Gemisch von Laminin, Typ-IV-Collagen und Entactin.
In dem Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung kann jedes, das vorstehend unter (hypertrophierungsfähige Chondrozyten) und dergleichen bei der vorliegenden Spezifikation verwendet werden.
(Herstellungsverfahren)
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren Herstellung eines Verbundmaterials zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus bereit. Das Verfahren kann folgendes einschließen: A) einen Schritt des Kultivierens von hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einem Medium, das mindestens eines enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend Glucocorticoid, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure; und B) einen Schritt des Mischens des Überstands des Mediums nach Kultur mit einem biokompatiblen Gerüst.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Verbundmaterials zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus bereit. Das Verbundmaterial kann folgendes beinhalten: A) einen Schritt der Bereitstellung eines die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem Medium, das mindestens eines ausgewählt aus der Gruppe umfassend Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure und eine Serum-Komponente beinhaltet, und B) eine Schritt des Mischens des die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs mit einem biokompatiblen Gerüst.
In einer Ausführungsform kann der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff, de bei diesem Herstellungsverfahren verwendet wird, in folgendem vorliegen: (1) in dem Medium, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden, oder (2) in einer Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder höher, erhalten durch Ultrafiltration des Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden, unter Verwendung eines Filters mit einer molekularen Trenngrenze von 50.000.
In einer Ausführungsform kann bei diesem Herstellungsverfahren der Schritt A) folgendes umfassen: Kultivieren der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium, das das Dexamethason, das β-Glycerophosphat, die Ascorbinsäure und die Serum-Komponente beinhaltet, und Sammeln des Überstands des Mediums nach Kultur.
In einer Ausführungsform kann bei diesem Herstellungsverfahren der Schritt A) folgendes umfassen: Durchführen einer Ultrafiltration mit dem Überstand des Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden, um es in eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder höher aufzutrennen.
In einer Ausführungsform kann dieses Herstellungsverfahren einen Schritt des Mischens des Überstands in einem gefriergetrockneten Zustand mit einer Collagenlösung.
In einer Ausführungsform kann dieses Herstellungsverfahren einen Schritt des in Kontakt Bringens mit Hydroxylapatit umfassen.
In einer Ausführungsform kann dieses Herstellungsverfahren weiterhin einen Schritt des Konzentrierens des Überstands nach Schritt A) umfassen. In diesem Konzentrierungsschritt kann der Überstand um mehr als das Einfache konzentriert werden. Vorzugsweise kann der Überstand um mehr als das Zweifache konzentriert werden.
In einer Ausführungsform kann das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung weiterhin einen Schritt des Gefriertrocknens des Überstands umfassen. Zum Beispiel wird dieser Gefriertrocknungsschritt durch Gefriertrocknen des Überstands durchgeführt, um ein gefriergetrocknetes Produkt zu erhalten, und dann Trocknen des gefrorenen Produkts über Nacht bei Raumtemperatur bei etwa 40°C (vorzugsweise Raumtemperatur) unter Vakuum (–80 bis 100 kPa), während es zentrifugiert wird, ist aber nicht darauf geschränkt.
In einer Ausführungsform kann diese Herstellungsverfahren sowohl einen Schritt des Konzentrierens des Überstands als auch einen Schritt des Gefriertrocknens des Überstands umfassen.
In einer Ausführungsform kann bei diesem Herstellungsverfahren Schritt B) einen Schritt des in Kontakt Bringens des Überstands mit dem biokompatiblen Gerüst umfassen. Beispielsweise kann dieser Kontaktschritt durch Eintauchen des biokompatiblen Gerüsts in den Überstand durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann dieser Kontaktschritt durch Auftropfen von Tropfen des Überstands auf das biokompatible Gerüst, durch Hindurchsaugen des Überstands durch das biokompatible Gerüst, durch Pressen des Überstands zu dem biokompatiblen Gerüst oder durch koexisitierenlassen des Überstands mit dem biokompatiblen Gerüst unter Vakuum durchgeführt werden.
In einer Ausführungsform kann bei diesem Herstellungsverfahren Schritt B) einen Schritt des Erhaltens des Wirkstoffs aus dem Überstand und einem Schritt des Mischen des Wirkstoffs mit dem biokompatiblen Gerüst umfassen.
In einer Ausführungsform kann bei diesem Herstellungsverfahren Schritt B) einen Schritt des in Kontakt Bringen eines Überstand-konzentrierten Produkts, das durch Konzentrieren des Überstands erhalten wurde, mit dem biokompatiblen Gerüst, nachdem das Überstand-konzentrierte Produkt verdünnt wurde, damit genug Volumen vorhanden ist, um Kontakt mit dem biokompatiblen Gerüst herzustellen.
Beispielsweise wird das konzentrierte Produkt 2- bis 10-fach unter Verwendung eines einen Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, eines Wachtumsmediums, von Wasser, einer physiologischen Kochsalzlösung, einer Dulbecco's Phosphatpufferlösung (DPBS) oder dergleichen verdünnt.
In einer Ausführungsform kann bei diesem Herstellungsverfahren Schritt B) einen Schritt folgendes umfassen: einen Schritt des Gefriertrocknens eines Überstand-konzentrierten Produkts, das durch Konzentrieren des Überstands erhalten wurde, und einen Schritt des Schritt des in Kontakt Bringen des Überstand-konzentrierten Produkts mit dem biokompatiblen Gerüst, nachdem das Überstand-konzentrierte Produkt verdünnt wurde, damit genug Volumen vorhanden ist, um Kontakt mit dem biokompatiblen Gerüst herzustellen.
In einer Ausführungsform kann das bei dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendete biokompatible Gerüst ein gelatineartiges Gerüst, ein dreidimensionales Gerüst oder dergleichen sein, ist aber nicht darauf beschränkt.
In einer Ausführungsform kann das bei dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendete biokompatible Gerüst Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Aluminiumoxid, Zirconiumoxid, Apatit-Wollastonit enthaltendes Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix, Seide, Cellulose, Dextran, Agarose, Agar, synthetisches Polypeptid, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglycolsäure, Polymethylmethacrylat, Polycyanoacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, ein Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, Nylon und eine Kombination davon sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Dies deshalb, weil jedes biokompatible Gerüst verwendet werden kann, solange der vorhandene Wirkstoff daran haftet oder darin dispergiert ist, oder daran haften kann oder darin dispergiert sein kann.
Vorzugsweise kann das biokompatible Gerüst zum Beispiel sein poröser Hydroxylapatit (z. B. ”APACERAM mit Porosität 50%”, hergestellt von HOYA CORPORATION), super-poröses Hydroxylapatit (z. B. ”APACERAM mit Porosität 85%”, hergestellt von HOYA CORPORATION, ”3D Scaffold”, hergestellt von BD Corporation), ein Apatit-Collagen-Gemisch (z. B. ein Gemisch aus ”APACERAM GRANULE”, hergestellt von HOYA CORPORATION, und ”Collagen Gel”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.), ein Apatit-Collagen-Komplex (z. B. ”APACOLLA”, hergestellt von HOYA CORPORATION), Collagengel (z. B. ”Collagen Gel”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.), Collagenschwamm (z. B. ”Collagen Sponge”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.), Gelatineschwamm (z. B. ”Hemostatic Gelatin Sponge”, hergestellt von Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.), Fibringel (”Beriplast P”, hergestellt von Nipro), synthetisches Peptid (z. B. ”Pramax”, hergestellt von 3D Matrix Corporation), ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix (z. B. ”Matrigel”, hergestellt von BD Corporation), Alginsäure (”Kelton LVCR”, hergestellt von Kelco Corporation), Agarose (”Agarose”, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Polyglycolsäure, Polymilchsäure, ein Polyglycolsäure-Polymilchsäure-Copolymer und eine Kombination davon. Stärker bevorzugt kann das biokompatible Gerüst der Hydroxylapatit, das Collagengel und das Gemisch aus extrazellulärer Matrix sein.
In einer Ausführungsform kann das biokompatible Gerüst der Hydroxylapatit, das Collagen, die Alginsäure, ein Gemisch von Laminin, Typ-IV-Collagen und Entactin, und dergleichen sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
In einer Ausführungsform kann ein zur Kultivierung der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bei dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendetes Medium (in der vorliegenden Spezifikation als ein ”einen Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium” bezeichnet) mindestens eines von Glucocoricoid (z. B. Dexamethason, Betamethason, Prednisolon, Prednison, Cortison, Cortisol, Corticosteron), β-Glycerophosphat , Ascorbinsäure und dergleichen beinhalten. Vorzugsweise kann dieses Medium das β-Glycerophosphat und die Ascorbinsäure beinhalten. Stärker bevorzugt beinhaltet dieses Medium alle dem Glucocoricoid, dem β-Glycerophosphat und der Ascorbinsäure.
Dieses Medium kann weiterhin weitere Komponenten beinhalten, wie Transformierender Wachstumsfaktor-β (TGF-β), Knochen-morphogenetischer Faktor (BMP), Leukämie-inhibitorischer Faktor (LIF), Kolonien-stimulierender Faktor (CSF), Insulin-artiger Wachstumsfaktor (IGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), plättchenreiches Plasma (PRP), aus Plättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) und vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF). Es kann geeignet sein, dass dieses Medium weiterhin eine Serumkomponente (z. B. Humanserum, Rinderserum, fetales Rinderserum) enthaltet. Typischerweise kann die Serumkomponente bis zu 20% des Wachstumsmediums ausmachen.
Weitere Beispiele füh das zur Kultivierung der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bei dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Medium können beinhalten: Ham-F12-Medium (HAM-F12), modifiziertes Eagle-Medium nach Dulbecco (DMEM), essenzielles Minimalmedium (MEM), essenzielles Minimalmedium α (αMEM), Eagle-Basalmedium (BME), ein modifiziertes Medium nach Fitton-Jackson (BGJb) beinhalten, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Dieses Medium kann jede Substanz enthalten, die die Proliferation und Induzierung der Differenzierung von Zellen fördern kann. Hier wurde noch nicht gezeigt, dass dieses Medium die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung von C3H10T1/2-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen oder Balb-3T3-Zellen oder N1H3T3-Zellen zu Osteoblasten besitzt.
Bei dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann alles, was vorstehend unter (Verbundmaterial) beschrieben ist, und dergleichen bei der vorliegenden Spezifikation verwendet werden.
(Gerüst)
Ein ”Gerüst”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Material zum Tragen von Zellen. Das Gerüst weist konstante Stärke und Bioverträglichkeit auf. So wie hier verwendet, wird das Gerüst aus biologischen Materialien, natürlich bereitgestellten Materialien oder natürlich vorkommenden Materialien oder synthetisch bereitgestellten Materialien hergestellt.
In einem spezifisch beschriebenen Fall wird das Gerüst aus anderen Materialien als Organismen, wie Geweben oder Zellen (d. h. nicht-zelluläres Material) gebildet. So wie hier verwendet, ist das Gerüst eine Zusammensetzung, die aus anderen Materialien als Organismen, wie Geweben oder Zellen gebildet wird, einschließlich Materialien, die von einem biologischen Organismus abgeleitet sind, wie Collagen oder Hydroxylapatit. Ein ”Organismus”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Materialsystem, das derart organisiert ist, dass es eine lebende Funktion aufweist. Dies bedeutet, dass der Begriff ”Organismus” Lebewesen von anderen Materialsystemen unterscheidet. Das Konzept des Organismus umfasst Zellen, Gewebe oder andere, während Materialien, die von Lebewesen stammen und aus dem Organismus extrahiert sind, nicht umfasst werden.
Beispiele für den Gerüstbereich, an den die Zellen fixiert sind, schließen eine Oberfläche des Gerüsts und eine innere Pore des Gerüsts ein (wenn es eine solche innere Pore aufweist, die Zellen aufnehmen kann). Zum Beispiel schließt ein aus Hydroxylapatit hergestelltes Gerüst viele Poren ein, die normalerweise Zellen in ausreichender Weise aufnehmen können.
Ein Material, aus dem das Gerüst besteht, kann Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Aluminiumoxid, Zirconiumoxid, Apatit-Wollastonit enthaltendes Glas, Gelatine, Collagen, Chitin, Fibrin, Hyaluronsäure, ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix, Seide, Cellulose, Dextran, Agarose, Agar, synthetisches Polypeptid, Polymilchsäure, Polyleucin, Alginsäure, Polyglycolsäure, Polymethylmethacrylat, Polycyanoacrylat, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polypropylen, Polyethylen, Polyvinylchlorid, ein Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, Nylon, eine Kombination davon und dergleichen sein, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt. Das ist deshalb der Fall, da ein beliebiges biokompatibles Gerüst verwendet werden kann, solange der vorliegende Wirkstoff daran anhaftet oder darin dispergiert wird, oder daran anhaften oder darin dispergiert werden kann.
Vorzugsweise kann das biokompatible Gerüst zum Beispiel folgendes sein: poröses Hydroxylapatit (z. B. ”APACERAM mit Porosität 50%”, hergestellt von HOYA CORPORATION), super-poröses Hydroxylapatit (z. B. ”APACERAM mit Porosität 85%”, hergestellt von HOYA CORPORATION, ”3D Scaffold”, hergestellt von BD Corporation), ein Apatit-Collagen-Gemisch (z. B. ein Gemisch aus ”APACERAM GRANULE”, hergestellt von HOYA CORPORATION, und ”Collagen Gel”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.), ein Apatit-Collagen-Komplex (z. B. ”APACOLLA”, hergestellt von HOYA CORPORATION), Collagengel (z. B. ”Collagen Gel”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.), Collagenschwamm (z. B. ”Collagen Sponge”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.), Gelatineschwamm (z. B. ”Hemostatic Gelatin Sponge”, hergestellt von Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.), Fibringel (”Beriplast P”, hergestellt von Nipro), synthetisches Peptid (z. B. ”Pramax”, hergestellt von 3D Matrix Corporation), ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix (z. B. ”Matrigel”, hergestellt von BD Corporation), Alginat (”Kelton LVCR”, hergestellt von Kelco Corporation), Agarose (”Agarose”, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Polyglycolsäure, Polymilchsäure, ein Polyglycolsäure-Polymilchsäure-Copolymer und eine Kombination davon. Stärker bevorzugt kann das biokompatible Gerüst Hydroxylapatit, Collagengel und ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix sein.
Diese Gerüste können in jeder beliebigen Form bereitgestellt werden, wie eine granuläre Form, eine Blockform oder eine Schwammform. Diese Gerüste können porös oder nicht-porös sein. Für solche Gerüste können die im Handel erhältlichen z. B. von HOYA CORPORATION, Olympus Corporation, Kyocera Corporation, Mitsubishi Pharma Corporation, Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd., Kobayashi Pharmaceuticals Co. Ltd., Zimmer Inc. verwendet werden. Standardverfahren zur Herstellung und Charakterisierung von Gerüsten sind auf dem Fachgebiet bekannt, die nur routinemäßige Untersuchungen und das allgemeine Fachwissen erfordern. Siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 4,975,526 ; Nr. 5,011,691 ; Nr. 5,171,574 ; Nr. 5,266,683 ; Nr. 5,354,557 ; und Nr. 5,468,845 , die hier als Literaturhinweise mit eingeschlossen sind.
Weitere Gerüste sind ebenfalls beschrieben, beispielsweise in den folgenden Dokumenten: Artikel über biokompatible Materialien, wie LeGeros und Daculsi, Handbook of Bioactive Ceramics, II S. 17–28 (1990, CRC Press); andere veröffentlichte Beschreibungen, wie Yang Cao, Jie Weng, Biomaterials 17 (1996), S. 419–424; LeGeros, Adv. Dent. Res. 2, 164 (1988); Johnson et al., J. Orthopaedic Research, 1996; Bd. 14, S. 351–369; und Piattelli et al., Biomaterials 1996, Bd. 17, S. 1767–1770, deren Offenbarungen hier als Literaturhinweise mit eingeschlossen sind.
”Calciumphosphat”, so wie hier verwendet, ist der generische Name für Phosphate des Calciums. Beispiele für die Calciumphosphate beinhalten Verbindungen, die durch die folgenden chemischen Formeln dargestellt sind: CaHPO₄, Ca₃(PO₄)₂, Ca₄O(PO₄)₂, Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, CaP₄O₁₁, Ca(PO₃)₂, Ca₂P₂O₇, und Ca(H₂PO₄)₂·H₂O, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt.
”Hydroxylapatit”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Verbindung, deren allgemeine Zusammensetzung Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ ist. Dieses Hydroxylapatit ist ein Hauptbestandteil des harten Gewebes von Säugetieren (Knochen und Zähne), wie Collagen. Obwohl Hydroxylapatit eine Reihe der vorstehend beschriebenen Calciumphosphate enthält, sind die Bestandteile PO₄ und OH innerhalb des Apatits in den harten Geweben von biologischen Organismen häufig mit einem CO₃-Bestandteil in Körperflüssigkeiten substituiert.
Weiterhin ist Hydroxylapatit ein Material, dessen Sicherheit durch das Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt in Japan und die FDA (US Nahrungs- und Arzneimittelzulassung) festgestellt wurde. Obwohl viele im Handel erhältliche Hydroxylapatite im biologischen Organismus nicht absorbierbar sind und im biologischen Organismus kaum absorbiert verbleiben, sind andere vom biologischen Organismus absorbierbar.
Ein ”Gemisch aus extrazellulärer Matrix”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Gemisch aus extrazellulärer Matrix und einem Wachstumsfaktor. Beispiele für die extrazelluläre Matrix beinhalten Laminin, Collagen und dergleichen, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Die extrazelluläre Matrix kann aus einem biologischen Organismus stammen oder synthetisch sein.
(Verfahren zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus)
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus bereit. Das Verfahren kann folgendes einschließen: einen Schritt der Implantierung eines Verbundmaterials, das einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff und ein biokompatibles Gerüst beinhaltet, in eine Region, in der die Osteogenese in dem biologischen Organismus gefördert oder induziert werden muss.
In einer Ausführungsform kann in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung die Osteogenese zur Reparatur oder Behandlung von Knochendefekten verwendet werden. Der Knochendefekt kann jeweils so groß sein, dass er nur durch Immobilisierung des Knochens nicht behandelt werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Osteogenese ferner zur Knochenbildung in einer Region verwendet werden, in deren Umgebung kein Knochen vorhanden ist.
Bei dem Verfahren zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus kann jedes, das vorstehend in (Verbundmaterial), (Induktionsverfahren von induzierten Osteoblasten) beschrieben ist und dergleichen in der vorliegenden Spezifikation verwendet werden.
Ein ”Subjekt”, so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Lebewesen, bei dem eine Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung vorgenommen wird. Es wird auch als ein ”Patient” bezeichnet. Das Subjekt oder der Patient kann ein Hund, eine Katze oder ein Pferd, vorzugsweise ein Mensch sein.
Ein subkutaner Test für Osteogenese ist ein Test zum Bewerten der osteogenen Fähigkeit zur Knochenbildung in einer Region, in der ursprünglich kein Knochen vorhanden ist. Diese osteogene Fähigkeit wird auch als Prosthesis bezeichnet. Weil dieser Test einfach durchgeführt werden kann, wird er auf dem Fachgebiet weitreichend verwendet. Im Falle einer Knochenbehandlung kann ein Knochendefekttest als ein Testverfahren verwendet werden.
In diesem Test erfolgt die Osteogenese in einer Umgebung, in dem dafür induzierungsfähige Bedingungen vollendet wurden. Ferner wird die Osteogenese von Osteoblasten, die bereits in der Nähe einer Region mit Knochendefekt vorhanden sind, oder von Osteoblasten, die induziert wurden/dorthin gewandert sind, induziert. Somit wird normalerweise angenommen, dass eine Rate der Osteogenese in dem Knochendefekttest besser als in dem subkutanen Test ist.
Es ist wohl bekannt, dass das Ergebnis des subkutanen Tests mit der Rate der Osteogenese bei einem tatsächlichen Knochendefekt übereinstimmt (siehe z. B. Urist, M. R., Science, 150: 893–899 (1965); Wozney, J. M. et al., Science, 242: 1528–1532 (1988); Johnson, E. E. et al., Clin. Orthop., 230: 257–265 (1988); Ekelund, A. et al., Clin. Orthop., 263: 102–112 (1991); und Riley, E. H. et al., Clin. Orthop., 324: 39–46 (1996)). Wenn deshalb Osteogenese als das Ergebnis des subkutanen Tests beobachtet wird, versteht der Fachmann, dass Osteogenese auch in dem Knochendefekttest induziert werden sollte.
Wenn ein Verbundmaterial, das einen von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten der vorliegenden Erfindung erzeugten Wirkstoff enthält, und ein biokompatibles Gerüst unter die Haut und in eine Region mit Knochendefekt implantiert wird, wird vorhergesagt, dass die Osteogenese induziert wird. Wenn das Gerüst unabhängig unter die Haut implantiert wird, wird vorhergesagt, dass die Osteogenese nicht festgestellt wird.
Wenn das Gerüst unabhängig in eine Region mit Knochendefekt implantiert wird, wird vorhergesagt, dass die Osteogenese zu einem weitaus geringeren Ausmaß induziert wird, im Vergleich zu dem Fall, dass das Verbundmaterial, das den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthält, der von den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird, und das biokompatible Gerüst dort hinein implantiert werden.
Das Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung kann mittels Implantation zum Reparieren und Rekonstruieren von Knochen verwendet werden. Beispiele für eine Region, in die das Verbundmaterial implantiert wird, beinhalten Regionen mit Knochendefekt, die aufgrund von Läsionen, Exzision von Knochentumoren oder dergleichen entstanden sind, bei denen eine Reparatur und Rekonstruktion des Knochens normalerweise erforderlich ist, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Das Verbundmaterial der vorliegenden Erfindung kann zur Bildung von Knochen in einer Region verwendet werden, in deren Umgebung kein Knochen vorhanden ist. Die Implantation kann auf die gleiche Art und Weise wie die bekannte Implantation unter Verwendung von aus Knochenmark stammenden Stammzellen durchgeführt werden. Die Menge des zu implantierenden Verbundmaterials wird zweckmäßig in Abhängigkeit von Größen der Regionen mit Knochendefekt, Symptomen und dergleichen ausgewählt.
Die vorliegende Erfindung kann wahlweise zusammen mit einer physiologisch aktiven Substanz, wie einem Cytokin, verwendet werden.
Eine ”Physiologisch aktive zelluläre Substanz” oder ”physiologisch aktive Substanz” wird hier austauschbar verwendet und bezieht sich auf eine Substanz, die Zellen oder Gewebe beeinflusst. Beispiele für solche Wirkungen umfassen die Kontrolle oder Modifikation der Zellen oder Gewebe, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Die physiologisch aktive Substanz umfasst ein Cytokin oder einen Wachstumsfaktor. Die physiologisch aktive Substanz kann eine natürlich vorkommende oder synthetisierte Substanz sein.
Vorzugsweise kann die physiologisch aktive Substanz eine Substanz sein, die von einer Zelle hergestellt wird, oder eine modifizierte Substanz sein, die eine ähnliche Funktion zu der aufweist, die in einer Zelle hergestellt wird. Die physiologisch aktive Substanz, so wie hier verwendet, kann in Form von Proteinen, einschließlich Peptiden, in Form von Nukleinsäuren oder in anderen Formen vorliegen.
”Cytokin”, so wie hier verwendet, wird mit der gleichen Bedeutung definiert, die der weitläufigsten Bedeutung auf dem Fachgebiet entspricht. Es bezieht sich auf eine physiologisch aktive Substanz, die in einer Zelle hergestellt wird, die die gleiche oder eine unterschiedliche Zelle beeinflusst. Im Allgemeinen ist ein Cytokin ein Protein oder Polypeptid und besitzt Wirkungen, die die Immunantwort steuern, das endokrine System modulieren, das Nervensystem modulieren, die Anti-Tumor-Wirkung beeinflussen, die antivirale Wirkung beeinflussen, das Zellwachstum modulieren, die Zelldifferenzierung modulieren, die Zellfunktion modulieren und dergleichen. Das Cytokin, so wie hier verwendet, kann in Form des Proteins, in Form der Nukleinsäure oder in anderen Formen vorliegen. Allerdings liegt zum Zeitpunkt der tatsächlichen Beeinflussung von Zellen das Cytokin oft in Form des Proteins, einschließlich des Peptids, vor.
Ein ”Wachstumsfaktor” oder ”Zellwachstumsfaktor” wird hier austauschbar verwendet und bezieht sich auf eine Substanz, die die Proliferation und Induktion der Differenzierung von Zellen fördert oder steuert. Der Wachstumsfaktor wird auch als ein Proliferations- oder Entwicklungsfaktor bezeichnet. In einer Zellkultur oder Gewebekultur kann der Wachstumsfaktor dem Medium zugegeben werden und die Funktion von Serum-Makromolekülen substituieren. Es ist bewiesen, dass, zusätzlich zum Zellwachstum, viele Wachstumsfaktoren als Faktoren fungieren, die einen Differenzierungszustand regulieren.
Typische Beispiele für ein Cytokin, das mit Osteogenese assoziiert ist, beinhaltet Faktoren, wie Transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β), Knochen-morphogenetischen Faktor (BMP), Leukämie-inhibitorischen Faktor (LIF), Kolonien-stimulierenden Faktor (CSF), Insulin-artigen Wachstumsfaktor (IGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), plättchenreiches Plasma (PRP), aus Plättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF); und Verbindungen, wie Ascorbinsäure, Glucocorticoid und Glycerophosphorsäure.
Da die physiologisch aktive Substanz, wie das Cytokin oder der Wachstumsfaktor, im Allgemeinen redundant sind, können Cytokine oder Wachstumsfaktoren, die unter anderem Namen und unter einer anderen Funktion (wie Zelladhäsionsaktivität oder Zell-Matrix-Adhäsionsaktivität) bekannt sind, ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange sie die Aktivität der in der vorliegenden Erfindung verwendeten physiologisch aktiven Substanz aufweisen.
Cytokine oder Wachstumsfaktoren können bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange sie die bevorzugten Aktivitäten, wie Wachstumsaktivität für Stammzellen, Induzierungsaktivität der Differenzierung zu Osteoblasten und Förderungsaktivität der Herstellung des die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs der vorliegenden Erfindung auf die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten aufweisen.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierende Wirkstoff kann aus Zellen stammen, die aus einem Individuum, das in einem syngenen Verhältnis zu einem biologischen Organismus steht, einem Individuum, das in einem allogenen Verhältnis zu einem biologischen Organismus steht, oder einem Individuum, das in einem heterologen Verhältnis zu einem biologischen Organismus steht, gewonnen wurden.
”Aus einem Individuum mit syngenem Verhältnis zu einem biologischen Organismus”, so wie hier verwendet, bedeutet eine Abstammung von einer autologen, reinen Linie oder Inzuchtlinie.
”Aus einem Individuum mit allogenem Verhältnis zu einem biologischen Organismus”, so wie hier verwendet, bedeutet eine Abstammung von einem anderen Individuum der gleichen Spezies, die sich genetisch unterscheiden.
”Aus einem Individuum mit heterologem Verhältnis zu einem biologischen Organismus”, so wie hier verwendet, bedeutet eine Abstammung von einem heterologen Individuum. Wenn zum Beispiel der Empfänger ein Mensch ist, stammen somit Zellen aus einer Ratte ”aus einem Individuum mit heterologem Verhältnis zu einem biologischen Organismus”.
Hiernach wird die vorliegende Erfindung anhand verschiedener Beispiele beschrieben. Die nachstehend beschriebenen Beispiele sind lediglich für erläuternde Zwecke bereitgestellt. Dementsprechend wird der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht durch die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen oder die nachstehenden Beispiele eingeschränkt, sondern wird stattdessen nur durch die angefügten Ansprüche eingeschränkt.
BEISPIELE
In den nachstehend beschriebenen Beispielen wurden mit einigen Ausnahmen Reagenzien verwendet, die von Wako Pure Chemical Industries Ltd., Invitrogen Corporation, Cambrex Corporation, Aldrich-Sigma Corporation und dergleichen bezogen wurden.
(Herstellung der Medien)

In den Beispielen der vorliegenden Beschreibung wurden mit Ausnahme eines spezifisch beschriebenen Falls die folgenden Medien verwendet. (Für Zellen verwendete Medien)

Zelltyp		Verwendetes Medium
Chondrozyten		HAM-Medium
C3H10T1/2-Zellen		BME-Medium
3T3	Swiss-Albino-Zellen	D-MEM-Medium
	BALB-Zellen	D-MEM-Medium
	NIH-Zellen	D-MEM-Medium
Knochenmarkzellen		MEM-Wachstumsmedium
Menschliche mesenchymale Stammzellen (h-MSC)		MSCGM (Wachstumsmedium)

Ein HAM-Medium, BME-Medium, D-MEM-Medium, MEM-Wachstumsmedium und MSCGM (Wachstumsmedium) wurde hergestellt, um Zusammensetzungen davon zu erhalten, die in der folgenden Tabelle angegeben sind. * HAM-Medium, BME-Medium, D-MEM-Medium ^... herkömmlich

Medium (HAM, BME, D-MEM) 88,9%

Fötales Rinderserum 10%

Penicillin·Streptomycin 1%

Fungizon 0,1%

Summe 100%

Medium: Basismedium, das zur Herstellung der einzelnen Medien verwendet wurde
HAM: HAM-F12-Medium
BME: Eagle-Basismedium
D-MEM: modifiziertes Eagle-Medium nach Dulbecco
Fungizon: 250 μg/ml Amphotericin B (”15290-018”, hergestellt von Invitrogen Corporation)

Essenzielles Minimalmedium	83,9%
Fötales Rinderserum	15%
Penicillin·Streptomycin	1%
Fungizon	0,1%
Summe	100%

Essenzielles Minimalmedium	80,9%
Fötales Rinderserum	15%
Penicillin·Streptomycin	1%
Fungizon	0,1%
β-Glycerophosphat	1%
Dexamethason	1%
Ascorbinsäure	1%
Summe	100%

MSCGM	88%
MSCGS	10%
L-Glutamin	2%
Penicillin·Streptomycin	0,1%
Summe	100%

Fungizon: 250 μg/ml Amphotericin B (”15290-018”, hergestellt von Invitrogen Corporation)
MSCBM: ”PT-3238”, hergestellt von Cambrex Corporation
MSCGS: ”PT-3001”, hergestellt von Cambrex Corporation

(Beispiel 1: Herstellung und Nachweis eines zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, hergestellt durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten aus Costa/costal-Knorpeln in dem Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium)
(Herstellung von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten aus Costa/costal-Knorpeln)
Gruppen von 4 Wochen alten männlichen Ratten (Wistar) bzw. von 8 Wochen alten männlichen Ratten (Wistar) wurden in dem vorliegenden Beispiel untersucht. Diese Ratten wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Der Brustkorb der Ratten wurde unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung (10-fach verdünnt) eingetaucht. Der Brustkorb der Ratten wurde eingeschnitten und die Costa/costal-Knorpel aseptisch entnommen.
Die durchscheinende Wachstumsknorpelregion wurde aus der Grenzregion der Costa/costal-Knorpel gesammelt. Der Wachstumsknorpel wurde zerschnitten und in 0,25% Trypsin-EDTA/Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung nach Dulbecco (D-PBS) bei 37°C für 1 Stunde gerührt. Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Collagenase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/D-PBS bei 37°C für 2,5 h gerührt.
Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Dispase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/(HAM + 10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei 37°C gerührt. Am folgenden Tag wurden die Zellen filtriert und durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
Die Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden, wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
(Identifizierung von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten)
Da die in Beispiel 1 erhaltenen Zellen durch die bei der Zelltrennung verwendeten Enzyme (z. B. Trypsin, Collagenase und Dispase) beeinträchtigt waren, wurden sie zur Erholung kultiviert. Hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden unter Verwendung der Lokalisierung und Expression von Chondrozyten-Markern und ihrer morphologischen Hypertrophien unter einem Mikroskop identifiziert.
(Expression von spezifischen Markern für hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
Ein unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens hergestelltes Lysat wurde mit Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt, um eine SDS-behandelte Lösung zu erhalten. Mit der SDS-behandelten Lösung wurde eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Das in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendete Gel wurde anschließend auf eine Transfermembran aufgetragen (Western-Blotting), mit einem primären Antikörper auf einen Chondrozyten-Marker umgesetzt und mit einem sekundären Antikörper nachgewiesen, der mit einem Enzym, wie Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Glucosidase, oder einem Fluoreszenzmarker, wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Texas-Rot, 7-Amino-4-methylcoumarin-3-acetat (AMCA) oder Rhodamin, markiert ist.
(Expression eines Marker-Gens für hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
Die Expression der Marker kann ferner durch Extraktion von RNA aus den Zellen, die unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens erhalten wurden, und anschließendes Testen der RNA unter Verwendung eines PCR-Verfahrens nachgewiesen werden. In diesem Beispiel wurden die Expressionsniveaus von alkalischer Phosphatase, Typ-II-Collagen, Aglycan und Osteocalcin unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Verfahrens gemessen. GAPDH wurde als integrales Kontroll-Gen verwendet.
Proben (Gp1 und Gp2) wurden durch Zentrifugation von 5 × 10 hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, die in diesem Beispiel hergestellt wurden, bei 170 bis 200 × g für 3 bis 5 min unter Bildung von Pellets hergestellt und anschließend wurden die Pellets in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C für 1 Woche kultiviert und verwendet. Als Medium wurde HAM-Medium + 10% FBS oder HEM-Medium + 15% FBS verwendet.
(Extraktion von Gesamt-RNA)
1 ml ISOGEN (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.) wurde einer Kultur (Zellkultur) mit einer Kulturfläche von 12 cm² zugegeben. Die Zellen wurden mit einem Zellschaber entfernt, in ein 2 ml Röhrchen gegeben und bei Raumtemperatur für 10 min belassen. 0,2 ml Chloroform wurden dem Röhrchen zugegeben, es wurde kräftig gevortext (gerührt) und anschließend bei 4°C für 5 min belassen. Das Röhrchen wurde bei 12.000 × g und bei 4°C für 15 min zentrifugiert und anschließend wurde der Überstand, der eine flüssige Phase war, in ein 1,5 ml Röhrchen gegeben.
0,5 ml Isopropanol wurden dem Röhrchen zugegeben und es wurde kräftig gevortext und bei Raumtemperatur für 10 min belassen. Das Röhrchen wurde bei 12.000 × g und bei 4°C für 15 min zentrifugiert, der Überstand wurde vollständig entferntet, 1 ml 70% Ethanol wurden dem Röhrchen zugegeben und anschließend wurde das Röhrchen gevortext, um die Gesamt-RNA zu erhalten. Die erhaltene Gesamt-RNA wurde in etwa 20 μl RNase-freies Wasser gelöst und anschließend bei – 80°C gelagert.
cDNA wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung eines High-Capacity cDNA Archive Kit (hergestellt von Applied Biosystems, Inc.) synthetisiert. Expressionen von alkalischer Phosphatase, Typ-II-Collagen und Knorpelproteoglycan (Aglycan), Osteocalcin und GAPDH wurden unter Verwendung der cDNA als Template mit dem Verfahren des Taqman Assays (”Taqman^® Gene Expression Assays”, hergestellt von Applied Biosystems, Inc.) getestet.
Anschließend wurden die Expressionsniveaus von alkalischer Phosphatase, Typ-II-Collagen, Knorpelproteoglycan (Aglycan), Osteocalcin und GAPDH unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Geräts (”PRISM 7900HT”, hergestellt von Applied Biosystems, Inc.) gemessen. Spezifisch wurde eine Echtzeit-PCR-Reaktionslösung (enthaltend 25 μl 2 × TaqMan Universal PCR Master Mix, 2,5 μ 20 × Taqman^® Gene Expression Assay Mix, 21,5 μl RNase-freies Wasser und 1 Templat-cDNA) hergestellt und anschließend in eine 96-Well-Reaktionsplatte gegeben.
Nach Erwärmen der Echtzeit-PCR-Reaktionslösung bei 50°C für 2 min und bei 95°C füh 10 min wurde eine PCR über 40 Zyklen der Wärmebehandlung durchgeführt, von denen jeder ein Erwärmen bei 95°C für 15 s und bei 60°C für 1 min beinhaltete. Nach Abschluss der PCR wurden das Festsetzen der Grenzwerte und das Berechnen der Leistungszyklen unter Verwendung der analytischen Software, die mit dem Gerät (”PRISM 7900 HT”) bereitgestellt wurde, durchgeführt.
Die Expressionsniveaus jedes Zell-Markers wurden durch das Expressionsniveau von GAPDH zur Berechnung von Korrekturwerten geteilt und anschließend wurde ein mittleres Expressionsniveau durch Mittelung der Korrekturwerte erhalten. Im Ergebnis exprimierten die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten alkalische Phosphatase, Typ-II-Collagen und Aglycan, exprimierten jedoch kein Osteocalcin (siehe Tabelle I).
(Tabelle I)
Alkalische Phosphatase

Niveau (Korrekturwert mit GAPDH) Durchschnittswert

Probe 1 2 3 gemittelt

Gp1 0,0455 0,0490 0,0596 0,0514

Gp2 0,0656 0,0571 0,0650 0,0626

Typ-II-Collagen

Niveau (Korrekturwert mit GAPDH) Durchschnittswert

Probe 1 2 3 gemittelt

Gp1 0,2574 0,2576 0,2628 0,2593

Gp2 0,3724 0,4158 0,5251 0,4378

Aglycan

Niveau (Korrekturwert mit GAPDH) Durchschnittswert

Probe 1 2 3 gemittelt

Gp1 0,6254 0,6284 0,6227 0,6255

Gp2 0,9471 0,9735 1,0005 0,9737

Osteocalcin

Niveau (Korrekturwert mit GAPDH) Durchschnittswert

Probe 1 2 3 gemittelt

Gp1 0,0006 0,0007 0,0005 0,0006

Gp2 0,0065 0,0062 0,0087 0,0071

Gp1 und Gp2: Pellets von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, 1 Woche kultiviert.

Es wurde bestätigt, dass jeweils Typ-X-Collagen, Typ-I-Collagen, Matrix-Gla-Protein, Pleiotrophin, Decorin und Biglycan ebenfalls auf die gleiche Art und Weise wie dieses Beispiel exprimiert wurden.
(Lokalisierung von spezifischen Markern für hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
Die Kultur, die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten wurde, wurde mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert, mit einem primären Antikörper auf einen Chondrozyten-Marker umgesetzt und anschließend mit einem sekundären Antikörper nachgewiesen, der mit einem Enzym, wie Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Glucosidase, oder einem Fluoreszenzmarker, wie FITC, PE, Texas-Rot, AMCA oder Rhodamin markiert ist.
Die alkalische Phosphatase kann ferner durch Färben nachgewiesen werden. Die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhaltene Kultur wurde gefärbt, indem sie mit 60% Aceton/Citronensäure-Puffer fixiert, mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend in ein Gemisch aus First Violet B und Naphthol AS-MX bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 min zur Umsetzung eingetaucht wurde.
Zur Bestimmung, ob hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einer Zellsuspension vorlagen, in der die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten verdünnt vorlagen, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden auf Hydroxylapatit bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml geimpft und in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C für eine Woche inkubiert. Diese Probe (mit Zellen geimpftes Hydroxylapatit) wurde anschließend mit alkalischer Phosphatase und dann mit Toluidinblau gefärbt.
Für die alkalische Phosphatase-Färbung wurde die Probe durch Eintauchen in 60% Aceton/Citronensäure-Puffer für 30 s fixiert, mit Wasser gespült und anschließend mit alkalischer Phosphatase-Färbelösung (2 ml 0,25% Naphthol AS-MX alkalische Phosphatase (Sigma-Aldrich Corporation) + 48 ml 25% First Violet B Salzlösung (Sigma Aldrich Corporation) bei Raumtemperatur in der Dunkelheit für 30 min inkubiert.
Für die Toluidinblau-Färbung wurde die Probe mit Toluidinblau-Färbelösung (”0,25% Toluidinblau-Lösung: pH 7,0”, hergestellt von Wake Pure Chemical Industries Ltd.) bei Raumtemperatur für 5 min. inkubiert. Mit der alkalischen Phosphatase-Färbung zeigte die Probe rot gefleckte Färbungen (siehe 1A). Mit der Toluidinblau-Färbung wurden die gleichen Bereiche der Probe blau gefärbt, wodurch das Vorhandensein von Zellen angezeigt wurde (siehe 1B). Somit wurde beobachtet, dass auf dem Hydroxylapatit vorhandene Zellen eine alkalische Phosphatase-Aktivität aufweisen.
(Morphologische Bewertung der Fähigkeit zur Hypertrophie in Chondrozyten)
Ein HAM-F12-Medium, enthaltend 5 × 10⁵ Zellen, wurde zur Bildung eines Pellets aus den Zellen zentrifugiert. Das Pellet (Zellpellet) wurde für eine vorbestimmte Zeitspanne kultiviert. Die Zellgrößen vor und nach dem Kultivieren wurden unter einem Mikroskop verglichen. Wurde eine signifikante Zunahme der Größe festgestellt, wurden die Zellen als hypertrophierungsfähig bestimmt.
(Ergebnisse)
Die in Beispiel 1 erhaltenen Zellen exprimierten einen Chondrozyten-Marker und wurden als morphologisch hypertroph bestimmt. Das zeigt, dass die in Beispiel 1 erhaltenen Zellen hypertrophierungsfähige Chondrozyten waren. Diese Zellen wurden in den folgenden Untersuchungen verwendet.
(Nachweis des Wirkstoffs, der von aus Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde)
Hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zur Herstellung einer Zellsuspension bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben.
Die Zellsuspension wurde gleichmäßig auf eine Schale (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) geimpft, die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert und anschließend wurde ein Überstand (Kulturüberstand) des Mediums über einen Zeitraum (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung von partiellen Überständen gesammelt.
(Untersuchungen, ob der gewonnene Überstand die Fähigkeit der Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten aufweist)
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte von 1,25 × 10⁴ Zellen/cm² (d. h. 2,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) geimpft.
Diese Zellen können von ansässigen und ausländischen Firmen bezogen werden, wie Sanko Junyaku Co., Ltd., Cosmo Bio Co., Ltd., Takara Bio Inc., Toyobo Co., Ltd., Summit Pharma Biomedical, Stem Cell Sciences, Cambrex Corporation, Stem Cell Technologies, Invitrogen Corporation und Osiris Therapeutic Inc. oder von Spendenorganisationen (Gewebezellbanken), wie ansässige Organisationen (z. B. Health Science Research Resources Bank; Cell Bank, RIKEN BioResource Center; Cell Bank, National Institute of Health Sciences; Institute of Development, und Aging, Cancer at Tohoku University), und ausländische Organisationen (z. B. IIAM, ATCC), zusätzlich zu Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.
18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C zur Gewinnung von Proben und einer Kontrollprobe kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität unter Verwendung der folgenden Vorgehensweisen gemessen.
(Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität)
Zur Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität wurden zu 100 μl jeder Probe mit Wirkstoff oder der Kontrollprobe ohne Wirkstoff 50 μl 4 mg/ml p-Nitrophenylphosphatlösung und 50 μl Alkalipuffer (”A9226”, hergestellt von Sigma) zugegeben und anschließend wurde bei 37°C für 15 min umgesetzt. Anschließend wurden der Probe 50 μl 1N NaOH zum Stoppen der Reaktion zugegeben und ihre Extinktion (bei 405 nm) wurde gemessen. Danach wurden der Probe 20 μl konzentrierte Salzsäure zugegeben und ihre Extinktion (bei 405 nm) wurde gemessen.
Der Unterschied dieser Extinktionen wurde als ”absoluter aktiver Wert” (als ”absoluter Wert” in der Tabelle angegeben) bezeichnet und wurde als Indikator für die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen verwendet. In der 4 Wochen alten Gruppe wurden fünf Experimente durchgeführt, und drei Versuche wurden pro Experiment durchgeführt. In der 8 Wochen alten Gruppe wurden drei Experimente durchgeführt, und in dem ersten Experiment wurden zwei Versuche, in dem zweiten Experiment zwei Versuche und in dem dritten Experiment ein Versuch durchgeführt.
Der absolute Wert jeder Probe, dividiert durch den absoluten Wert der Kontrollprobe, dem nur das Medium zugegeben wurde, (d. h. absoluter aktiver Wert der Kontrollprobe, der erhalten wurde, indem nur das Medium den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde) wird in der vorliegenden Beschreibung als ”relativer aktiver Wert” (in der Tabelle als ”relativer Wert” angegeben) bezeichnet und wurde als weiterer Indikator für die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen verwendet.
In diesem Beispiel wurde der vorliegende Wirkstoff mit der Fähigkeit zur Steigerung der alkalischen Phosphatase-Aktivität bestimmt, wenn ein Wert der alkalischen Phosphatase-(ALP)-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen (Ganzzellen), die durch Zugabe des Überstands mit dem vorliegenden Wirkstoff kultiviert wurden, um mehr als das 1,5-Fache des Wertes der Maus-C3H10T1/2-Zellen zunahm, die durch Zugabe des Mediums ohne den vorliegenden Wirkstoff kultiviert wurden.
Für den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde, bei der 4 Wochen alten Rattengruppe: der relative aktive Wert erhöhte sich auf das etwa 4,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 5,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 5,4-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde; und auf das etwa 4,9-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde.
Für den vorstehenden gleichen Fall bei der 8 Wochen alten Rattengruppe: der relative Wert der Aktivität erhöhte sich auf etwa das 2,9-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 3,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 3,8-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde; und auf das etwa 4,2-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde (siehe obere Spalte in Tabelle 1 und 2).
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
(Alkalische Phosphatase-Färbung)
(Zugabe von Überständen eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden)
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte von 1,25 × 10⁴ Zellen/cm² (d. h. 2,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) und auf Hydroxylapatit bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml geimpft. 18 h nach dem Impfen wurden der Platte und dem Hydroxylapatit 1 ml eines Überstands (Kulturüberstand) des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dm hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden, zugegeben und anschließend wurden die Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C zur Gewinnung von Kulturen (Zellkulturen) kultiviert.
Die Kulturen wurden gefärbt, indem sie mit 60% Aceton/Citronensäure-Puffer fixiert, mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend in ein Gemisch aus First Violet B und Naphthol AS-MX bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 min eingetaucht wurden.
(Zugabe von Überständen eines MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden)
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte von 1,25 × 10⁴ Zellen/cm² (d. h. 2,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) und auf Hydroxylapatit bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml geimpft. 18 h nach dem Impfen wurden der Platte und dem Hydroxylapatit 1 ml eines Überstands (Kulturüberstand) des MEM-Wachstumsmediums (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B), in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden, zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C zur Gewinnung von Kulturen (Zellkulturen) kultiviert.
Die Kulturen wurden gefärbt, indem sie mit 60% Aceton/Citronensäure-Puffer fixiert, mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend in ein Gemisch aus First Violet B und Naphthol AS-MX bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 min eingetaucht wurden.
Wie vorstehend beschrieben ist, wurde gezeigt, dass die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität, die eine von den induzierten Osteoblasten-Markern ist, der Maus-C3H10T1/2-Zellen von dem Wirkstoff gesteigert wird, der die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren kann. Außerdem wurde ebenfalls gezeigt, dass die Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten fähigen Wirkstoffs kultiviert wurden, bei der alkalischen Phosphatase-Färbung rot gefärbt wurden.
Somit wurde die Expression der alkalischen Phosphatase unter Verwendung des Färbeverfahrens ebenfalls angezeigt. Folglich wurde bestätigt, dass die Maus-C3H10T1/2-Zellen zu den induzierten Osteoblasten differenziert wurden (siehe obere Spalte in Tabelle 1, 2, obere Spalte in 3A und 3B).
Außerdem wurde ein Pellet der differenzierten Zellen auf die gleiche Art und Weise hergestellt, wie vorstehend beschrieben, und anschließend mit saurem Toluidinblau und Safranin O angefärbt. Im Ergebnis zeigte sich keine Metachromasie und die Safranin-Färbung war negativ. Somit wurde bestätigt, dass diese differenzierten Zellen keine Chondrozyten waren. Damit konnte bestätigt werden, dass die differenzierten Zellen nicht die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten waren.
(Vergleichsbeispiel 1A: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte von 1,25 10⁴ Zellen/cm² (d. h. 2,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Für den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde, bei der 4 Wochen alten Rattengruppe: der relative aktive Wert erhöhte sich auf das etwa 1,0-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 1,3-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde; und auf das etwa 1,0-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde.
Für den vorstehenden gleichen Fall bei der 8 Wochen alten Rattengruppe: der relative Wert der Aktivität erhöhte sich auf etwa das 1,2-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 1,0-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; auf das etwa 1,0-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde; und auf das etwa 0,9-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde (siehe untere Spalte in Tabelle 1 und 2).
In jeder der 4 und 8 Wochen alten Ratten-Gruppen gab es einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden (Zellkultur), und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden.
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
(Alkalische Phosphatase-Färbung)
Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden in eine 24-Well-Platte und Hydroxylapatit (in einem BME-Medium) geimpft und für 18 h zur Gewinnung von Kulturen (Zellkulturen) kultiviert. Anschließend wurde ein Überstand (Kulturüberstand) eines MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden, den Kulturen zugegeben und nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Färbung durchgeführt. Es wurde bestätigt, dass die durch Zugabe des Überstands kultivierten Maus-C3H10T1/2-Zellen mit der alkalischen Phosphatase-Färbung nicht gefärbt wurden und somit keine alkalische Phosphatase-Aktivität aufwiesen (siehe untere Spalte in 3A und 3D).
(Tabelle 1: alkalische Phosphatase-Aktivität bei Zugabe eines Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums oder MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden)

Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (Mittelwert)

		0 Tage	4 Tage	1 Woche	2 Wochen	3 Wochen
alt 4 Wochen	Relativer Wert	1	4,1	5,1	5,4	4,9
	Absoluter Wert (Zugabe von Überstand)		0,077	0,098	0,103	0,095
	Absoluter Wert (nur Zugabe von Medium)	0,023	0,023	0,024	0,023	0,021
alt 8 Wochen	Relativer Wert	1	2,9	3,1	3,8	4,2
	Absoluter Wert (Zugabe von Überstand)		0,065	0,066	0,077	0,079
	Absoluter Wert (nur Zugabe von Medium)	0,021	0,021	0,021	0,019	0,019

MEM-Wachstumsmedium (Mittelwert)

		0 Tage	4 Tage	1 Woche	2 Wochen	3 Wochen
4 Wochen alt	Relativer Wert	1	1,0	1,3	1,1	1,0
	Absoluter Wert (Zugabe von Überstand)		0,020	0,023	0,027	0,024
	Absoluter Wert (nur Zugabe von Medium)	0,022	0,022	0,020	0,024	0,024
8 Wochen alt	Relativer Wert	1	1,2	1,0	1,0	0,9
	Absoluter Wert (Zugabe von Überstand)		0,023	0,021	0,019	0,017
	Absoluter Wert (nur Zugabe von Medium)	0,020	0,020	0,021	0,019	0,019

4 Wochen alt: fünf Experimente wurden durchgeführt, und 3 Versuche wurden pro Experiment durchgeführt.
8 Wochen alt: drei Experimente wurden durchgeführt. In dem ersten Experiment wurden zwei Versuche, in dem zweiten Experiment zwei Versuche und in dem dritten Experiment ein Versuch durchgeführt.

Auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 kann bestätigt werden, ob ein Überstand (Kulturüberstand) eines MEM-Wachstumsmediums, in dem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden, die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten wurden, Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
(Schlussfolgerung aus Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1A)
Wenn hypertrophierungsfähige Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass in dem Überstand des Mediums (Kulturüberstand) der Wirkstoff vorhanden war, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die undifferenzierte Zellen waren, steigern und die Differenzierung der Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann. Wenn andererseits die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass in dem Überstand des Mediums kein Wirkstoff vorhanden war.
Somit wurde festgestellt, dass die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten einen Wirkstoff erzeugten, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, indem sie in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert wurden. Ein solcher Wirkstoff war bisher unbekannt. Daher wird angenommen, dass die Existenz des Wirkstoffs selbst überraschend ist. Außerdem weist das bisher bekannte BMP die Wirkung der direkten Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten nicht auf, wie in anderen Teilen beschrieben.
(Vergleichsbeispiel 1B: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
(Herstellung von ruhenden Knorpelzellen aus Costal-Knorpel)
4 Wochen alte männliche Ratten (Wistar) und 8 Wochen alte männliche Ratten (Wistar) wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Der Brustkorb der Ratten wurde unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung (10-fach verdünnt) eingetaucht. Der Brustkorb der Ratten wurde eingeschnitten und die Costa/costal-Knorpel aseptisch entnommen. Durchsichtige ruhende Knorpel Regionen wurden aus dem Costal-Knorpel entnommen.
Der ruhende Knorpel wurde zerschnitten und in 0,25% Trypsin-EDTA/D-PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung nach Dulbecco) bei 37°C für 1 Stunde gerührt. Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Collagenase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/D-PBS bei 37°C für 2,5 h gerührt. Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Dispase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/(HAM + 10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei 37°C gerührt. Wahlweise wurde die Behandlung 0,2% Dispase über Nacht weggelassen. Am folgenden Tag wurden die Zellen filtriert und durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
Die Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden, wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
(Identifizierung von aus Costal-Knorpel stammenden nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten)
Es wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 bestimmt, ob hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einer Zellsuspension vorhanden waren, die durch Verdünnen von aus Costal-Knorpel stammenden ruhenden Knorpelzellen erhalten wurde. Hydroxylapatit wurde mit der alkalischen Phosphatase-Färbung nicht gefärbt (siehe 1C). Gefleckte Bereiche des Hydroxylapatits wurden mit der Toluidinblau-Färbung blau gefärbt, wodurch das Vorhandensein von Zellen angezeigt wurde (siehe 1D).
Somit wurde bestätigt, dass die auf dem Hydroxylapatit vorhandenen Zellen keine alkalische Phosphatase-Aktivität aufweisen, was zeigt, dass nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten (Chondrozyten ohne die Fähigkeit zur Hypertrophie) in der Zellsuspension vorhanden waren, die in diesem Vergleichsbeispiel verwendet wurde.
(Identifizierung der Expression eines Marker-Gens für hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
In diesem Vergleichsbeispiel wurden die Expressionsniveaus von alkalischer Phosphatase, Typ-II-Collagen, Aglycan und Osteocalcin unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Verfahrens auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen. GAPDH wurde als integrales Kontroll-Gen verwendet.
Proben (Rp1 und Rp2) wurden durch Zentrifugation von 5 × 10⁵ nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, die in diesem Vergleichsbeispiel hergestellt wurden, bei 170 bis 200 × g für 3 bis 5 min unter Bildung von Pellets hergestellt und anschließend wurden die Pellets in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C für 1 Woche kultiviert und verwendet. Als Medium wurde HAM-Medium + 10% FBS oder HEM-Medium + 15% FBS verwendet.
Eine Echtzeit-PCR wurde durchgeführt und die Expressionsniveaus von jedem Zell-Marker wurde unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Geräts (”PRISM 7900HT”, hergestellt von Applied Biosystems, Inc.) auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Nach Abschluss der PCR wurden das Festsetzen der Grenzwerte und das Berechnen der unter Verwendung der analytischen Software, die mit dem Gerät (”PRISM 7900 HT”) bereitgestellt wurde, durchgeführt.
Die Expressionsniveaus jedes Zell-Markers wurden durch das Expressionsniveau von GAPDH zur Berechnung von Korrekturwerten geteilt und anschließend wurde ein mittleres Expressionsniveau durch Mittelung der Korrekturwerte erhalten. Im Ergebnis exprimierten die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten Typ-II-Collagen und Aglycan, exprimierten jedoch keine alkalische Phosphatase und kein Osteocalcin (siehe Tabelle II).
(Tabelle II)
Alkalische Phosphatase

Niveau (Korrekturwert mit GAPDH) Durchschnittswert

Probe 1 2 3 gemittelt

Rp1 0,0002 0,0003 0,0003 0,0002

Rp2 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

Typ-II-Collagen

Niveau (Korrekturwert mit GAPDH) Durchschnittswert

Probe 1 2 3 gemittelt

Rp1 0,3448 0,4111 0,4168 0,3909

Rp2 0,2838 0,2762 0,2877 0,2826

Aglycan

Niveau (Korrekturwert mit GAPDH) Durchschnittswert

Probe 1 2 3 gemittelt

Rp1 1,0586 1,1427 1,1478 1,1164

Rp2 1,0437 0,8835 0,9133 0,9468

Osteocalcin

Niveau (Korrekturwert mit GAPDH) Durchschnittswert

Probe 1 2 3 gemittelt

Rp1 0,0001 0,0001 0,0002 0,0001

Rp2 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

Rp1 und Rp2: Pellets von nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, 1 Woche kultiviert.

Durch Nachweis der Lokalisierung oder Expression der Chondrozyten-Marker mit dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 und der morphologischen Bewertung der Zellen wurde bestimmt, dass die erhaltenen Zellen nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten waren.
(Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Für den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde: der relative aktive Wert betrug das etwa 0,9-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,0-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde; und das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde (siehe obere Spalte in Tabelle 2 und 4).
Es gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die ruhenden Knorpelzellen (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden.
Mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten wurde, die induzierten Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
(Vergleichsbeispiel 1C: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Aus Costal-Knorpel stammende ruhende Knorpelzellen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 1B erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Für den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde: der relative aktive Wert betrug das etwa 1,0-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,0-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 0,9-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde; und das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde (siehe untere Spalte in Tabelle 2 und 4).
Es gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die ruhenden Knorpelzellen (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden (siehe untere Spalte in Tabelle 2 und 4).
Mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten wurde, die induzierten Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
(Tabelle 2: alkalische Phosphatase-Aktivität bei Zugabe eines Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums oder MEM-Wachstumsmediums, in dem aus Costal-Knorpel stammende ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden)

Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (Mittelwert)

			0 Tage	4 Tage	1 Woche	2 Wochen	3 Wochen
8 Wochen alt	Relativer Wert	1	0,9	1,1	1,0	1,1
	Absoluter Wert (Zugabe von Überstand)		0,014	0,015	0,015	0,014
	Absoluter Wert (nur Zugabe von Medium)	0,015	0,015	0,014	0,014	0,014

MEM-Wachstumsmedium (Mittelwert)

			0 Tage	4 Tage	1 Woche	2 Wochen	3 Wochen
8 Wochen alt	Relativer Wert	1	1,0	1,0	0,9	1,1
	Absoluter Wert (Zugabe von Überstand)		0,014	0,012	0,012	0,012
	Absoluter Wert (nur Zugabe von Medium)	0,013	0,013	0,012	0,011	0,011

8 Wochen alt: drei Experimente wurden durchgeführt. In dem ersten Experiment wurden drei Versuche, in dem zweiten Experiment ein Versuch und in dem dritten Experiment drei Versuche durchgeführt.

(Schlussfolgerung aus Vergleichsbeispiel 1B und Vergleichsbeispiel 1C)
Sogar wenn die aus Costal-Knorpel gewonnenen nicht-hypertrophierungsfähigen ruhenden Knorpelzellen in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium oder MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass sie keinen Wirkstoff erzeugten, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
(Vergleichsbeispiel 1D: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Gelenkknorpel gewonnenen Chondrozyten in den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
(Herstellung von Chondrozyten aus Gelenkknorpel)
8 Wochen alte männlichen Ratten (Wistar) wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Die Kniegelenke der Ratten wurden unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung (10-fach verdünnt) eingetaucht. Die Kniegelenke der Ratten wurden eingeschnitten und die Gelenkknorpel aseptisch entnommen.
Die Gelenkknorpel wurden zerschnitten und in 0,25% Trypsin-EDTA/D-PBS bei 37°C füh 1 Stunde gerührt. Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Collagenase/D-PBS bei 37°C füh 2,5 h gerührt. Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Dispase/(HAM + 10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei 37°C gerührt.
Wahlweise wurde die Behandlung 0,2% Dispase über Nacht weggelassen. Am folgenden Tag wurden die Zellen filtriert und durch Zentrifugation (bei 170 × g füh 3 min) gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
Die Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden, wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
(Identifizierung von aus Gelenkknorpel stammenden nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten)
Es wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 bestimmt, ob hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einer Zellsuspension vorhanden waren, die durch Verdünnen von aus Gelenkknorpel stammenden Chondrozyten erhalten wurde. Hydroxylapatit wurde mit der alkalischen Phosphatase-Färbung nicht gefärbt (siehe 1E). Gefleckte Bereiche des Hydroxylapatits wurden mit der Toluidinblau-Färbung blau gefärbt, wodurch das Vorhandensein von Zellen angezeigt wurde (siehe 1F).
Somit wurde bestätigt, dass die auf dem Hydroxylapatit vorhandenen Zellen keine alkalische Phosphatase-Aktivität aufweisen, was zeigt, dass nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten in der Zellsuspension vorhanden waren, die in diesem Vergleichsbeispiel verwendet wurde.
Durch Nachweis der Lokalisierung oder Expression der Chondrozyten-Marker mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 und der morphologischen Bewertung der Zellen wurde bestimmt, dass die erhaltenen Zellen nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten waren.
(Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Gelenkknorpel gewonnenen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den aus Gelenkknorpel stammenden Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Für den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde: der relative aktive Wert betrug das etwa 1,4-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde; und das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde (siehe obere Spalte in Tabelle 3 und 5A).
Es gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die Chondrozyten (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden.
Mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten wurde, die induzierten Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
(Vergleichsbeispiel 1E: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Gelenkknorpel gewonnenen Chondrozyten in MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Aus Gelenkknorpel gewonnene Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 1D erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums (Kulturüberstand) in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Für den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde: der relative aktive Wert betrug das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,0-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde; und das etwa 1,2-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde (siehe untere Spalte in Tabelle 3 und 5A).
Es gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die aus Gelenkknorpel stammenden Chondrozyten kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden (siehe untere Spalte in Tabelle 3 und 5A).
Mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten wurde, die induzierten Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
(Tabelle 3: alkalische Phosphatase-Aktivität bei Zugabe eines Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums oder MEM-Wachstumsmediums, in dem aus Gelenkknorpel stammende Chondrozyten kultiviert wurden)

Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (Mittelwert)

			0 Tage	4 Tage	1 Woche	2 Wochen	3 Wochen
8 Wochen alt	Relativer Wert	1	1,4	1,1	1,1	1,1
	Absoluter Wert (Zugabe von Überstand)		0,020	0,019	0,019	0,020
	Absoluter Wert (nur Zugabe von Medium)	0,016	0,016	0,017	0,016	0,017

8 Wochen alt: sechs Experimente wurden durchgeführt. In dem ersten Experiment wurde ein Versuch, in dem zweiten Experiment ein Versuch, in dem dritten Experiment drei Versuche, in dem vierten Experiment zwei Versuche, in dem fünften Experiment ein Versuch und in dem sechsten Experiment ein Versuch durchgeführt.

			0 Tage	4 Tage	1 Woche	2 Wochen	3 Wochen
8 Wochen alt	Relativer Wert	1	1,1	1,0	1,1	1,2
	Absoluter Wert (Zugabe von Überstand)		0,019	0,017	0,017	0,019
	Absoluter Wert (nur Zugabe von Medium)	0,018	0,018	0,018	0,014	0,017

8 Wochen alt: fünf Experimente wurden durchgeführt. In dem ersten Experiment wurden zwei Versuche, in dem zweiten Experiment zwei Versuche, in dem dritten Experiment drei Versuche, in dem vierten Experiment ein Versuch und in dem fünften Experiment ein Versuch durchgeführt.

(Schlussfolgerung aus Vergleichsbeispiel 1D und Vergleichsbeispiel 1E)
Sogar wenn die aus Gelenkknorpel gewonnenen nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium oder MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass sie keinen Wirkstoff erzeugten, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
(Beispiel 2: Herstellung und Nachweis des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Sternum-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
(Herstellung von hypertrophierungsfähige Chondrozyten aus Sternum-Knorpel)
8 Wochen alte männliche Ratten (Wistar) wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Der Brustkorb der Ratten wurde unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung (10-fach verdünnt) eingetaucht. Der Brustkorb der Ratten wurde eingeschnitten und untere Abschnitte von Sternum-Knorpel und Schwertfortsatz wurden aseptisch entnommen. Die durchscheinende Wachstumsknorpelregion wurde aus den unteren Abschnitten von Sternum-Knorpel und Schwertfortsatz gewonnen.
Der Wachstumsknorpel wurde zerschnitten und in 0,25% Trypsin-EDTA/ Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung nach Dulbecco (D-PBS) bei 37°C für 1 Stunde gerührt. Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Collagenase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/D-PBS bei 37°C füh 2,5 h gerührt. Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Dispase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/(HAM + 10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei 37°C gerührt. Wahlweise wurde die Behandlung 0,2% Dispase über Nacht weggelassen. Am folgenden Tag wurden die Zellen filtriert und durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
Die Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden, wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
(Identifizierung von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten)
Es wurde mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 bestimmt, ob die gewonnenen Zellen hypertrophierungsfähige Chondrozyten sind.
(Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Sternum-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den aus Sternum-Knorpel stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität von Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden (Zellkultur), steigt im Vergleich zu dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden.
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
Mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 wurde bestätigt, dass der Überstand des Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten wurde, die induzierten Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
(Vergleichsbeispiel 2: Herstellung des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Sternum-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Aus Sternum-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 2 erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums (Kulturüberstand) in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Es gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden.
Mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten wurde, die induzierten Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
(Schlussfolgerung aus Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2)
Wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, steigt, wurde bestimmt, dass in dem Überstand der Wirkstoff vorhanden ist, der die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
Wenn andererseits der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, nicht steigt, wurde bestimmt, dass in dem Überstand kein Wirkstoff vorhanden ist, der die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
In diesem Fall wurde bestimmt, dass die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, die in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert wurden, den Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
(Beispiel 3: Herstellung und Nachweis des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Medium hergestellt wurde)
(Nachweis des Wirkstoffs, der von aus Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde)
Aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes HAM-Medium (enthaltend HAM-Medium, 10% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums (Kulturüberstand) in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Für den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde: der relative aktive Wert betrug das etwa 1,2-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 2,3-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 3,1-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde; und das etwa 2,2-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde (siehe obere Spalte in Tabelle 3-2 und 5B).
Es wurde gezeigt, dass die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität, die eine von den induzierten Osteoblasten-Markern ist, der Maus-C3H10T1/2-Zellen von dem Wirkstoff gesteigert wird, der die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren kann (siehe Tabelle 3-2 und 5B). Außerdem wurde die Expression der alkalischen Phosphatase unter Verwendung der alkalischen Phosphatase-Färbung ebenfalls angezeigt. Folglich wurde bestätigt, dass die Maus-C3H10T1/2-Zellen zu den induzierten Osteoblasten differenziert wurden.
(Tabelle 3-2: alkalische Phosphatase-Aktivität bei Zugabe eines Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums oder HAM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden)

Differenzierungswirkstoff erzeugendes HAM-Medium (Mittelwert)

	0 Tage	4 Tage	1 Woche	2 Wochen	3 Wochen
Relativer Wert	1	1,2	2,3	3,1	2,2
Absoluter Wert (Zugabe von Überstand)	0,015	0,018	0,033	0,047	0,037
Absoluter Wert (nur Zugabe von Medium)	0,015		0,014	0,015	0,017

Drei Experimente wurden durchgeführt. Drei Versuche wurden pro Experiment durchgeführt.

HAM-Wachstumsmedium (Mittelwert)

	0 Tage	4 Tage	1 Woche	2 Wochen	3 Wochen
Relativer Wert	1	1,0	0,9	1,2	1,2
Absoluter Wert (Zugabe von Überstand)	0,026	0,025	0,023	0,020	0,024
Absoluter Wert (nur Zugabe von Medium)	0,026		0,024	0,021	0,023

Fünf Experimente wurden durchgeführt. In dem ersten Experiment wurden drei Versuche, in dem zweiten Experiment drei Versuche, in dem dritten Experiment drei Versuche, in dem vierten Experiment drei Versuche und in dem fünften Experiment zwei Versuche durchgeführt.
(Vergleichsbeispiel 3A: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in HAM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Ein HAM-Wachstumsmedium (enthaltend HAM-Medium, 10% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Für den Fall der Bewertung der alkalischen Phosphatase-Aktivität unter Verwendung des relativen aktiven Werts, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des HAM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde: der relative aktive Wert betrug das etwa 1,0-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 4 Tage nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 0,9-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 1 Woche nach dem Kultivieren gesammelt wurde; das etwa 1,2-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 2 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde; und das etwa 1,2-Fache durch Zugabe des partiellen Überstands, der 3 Wochen nach dem Kultivieren gesammelt wurde (siehe untere Spalte in Tabelle 3-2 und 5C).
Es gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des HAM-Wachstumsmediums kultiviert wurden (siehe untere Spalte in Tabelle 3-2 und 5C).
Es wurde bestätigt, dass der Überstand der Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten wurde, keine induzierte Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimierte.
(Schlussfolgerung aus Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 3A)
Wenn hypertrophierungsfähige Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Medium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass in dem Überstand des Mediums der Wirkstoff vorhanden war, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die undifferenzierte Zellen waren, steigern und die Differenzierung der Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
Wenn andererseits die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem HAM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass in dem Überstand des Mediums kein Wirkstoff vorhanden war. Somit wurde festgestellt, dass die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, die in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Medium kultiviert wurden, den Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
(Vergleichsbeispiel 3B: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Medium hergestellt wurde)
Aus Costal-Knorpel stammende ruhende Knorpelzellen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 1B erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes HAM-Medium (enthaltend HAM-Medium, 10% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Wenn die beiden nachstehend beschriebenen Bedingungen erfüllt waren, wurde bestimmt, dass die Maus-C3H10T1/2-Zellen nicht zu induzierten Osteoblasten differenziert wurden. Erstens gab es nämlich einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums kultiviert wurden, in dem die ruhenden Knorpelzellen (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums oder des HAM-Wachstumsmediums kultiviert wurden. Zweitens exprimiert der Überstand des Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten wurde, nicht die induzierten Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen.
In diesem Fall wurde bestimmt, dass die aus Costal-Knorpel stammenden ruhenden Knorpelzellen, die in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Medium kultiviert wurden, keinen Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
(Vergleichsbeispiel 3C: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem HAM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Aus Costal-Knorpel stammende ruhende Knorpelzellen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 1B erhalten. Ein HAM-Wachstumsmedium (enthaltend HAM-Medium, 10% FBS (fötales Rinderserum), 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Wenn die beiden nachstehend beschriebenen Bedingungen erfüllt waren, wurde bestimmt, dass die Maus-C3H10T1/2-Zellen nicht zu induzierten Osteoblasten differenziert wurden. Erstens gab es nämlich einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands des HAM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die ruhenden Knorpelzellen (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums oder des HAM-Wachstumsmediums kultiviert wurden. Zweitens exprimiert der Überstand des Mediums (Zellkultur), der unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten wurde, nicht die induzierten Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen.
In diesem Fall wurde bestimmt, dass die aus Costal-Knorpel stammenden ruhenden Knorpelzellen, die in dem HAM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, keinen Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
(Schlussfolgerung aus Beispiel 1, Beispiel 3, Vergleichsbeispielen 1A bis 1E und 3A bis 3C)
Gemäß den vorstehend beschriebenen Beispielen erzeugen die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, die in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium kultiviert wurden, den Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, unabhängig von der Art des in dem Medium enthaltenen Basismediums. Selbst wenn die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem beliebigen Wachstumsmedium kultiviert wurden, erzeugen sie nicht den Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
Selbst wenn nicht-hypertrophierungsfähige ruhende Knorpelzellen und nicht-hypertrophierungsfähige Gelenkknorpelzellen in einem beliebigen Medium kultiviert wurden, erzeugen sie nicht den Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
Deshalb wird vorgeschlagen, dass der Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, nur durch Kultivieren der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium erzeugt wird. Da außerdem das in dem Medium enthaltene Basismedium die Erzeugung des die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs unwahrscheinlich beeinträchtigt, solange es in einer Zellkultur normal verwendet werden kann, wird angenommen, dass ein beliebiges Basismedium in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden kann.
(Beispiel 4: Herstellung und Nachweis des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
(Nachweis des Wirkstoffs, der von menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde)
Aus menschlichen Geweben stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten (z. B. Polydactylie, Tumor, vorausgesetzt kartilaginäres Gewebe) wurden von Spendenorganisationen für menschliches Gewebe, wie ansässige Organisationen (z. B. Health Science Research Resources Bank; Cell Bank, RIKEN BioResource Center; Cell Bank, National Institute of Health Sciences; Institute of Development, Aging and Cancer at Tohoku University), und ausländische Organisationen (z. B. IIAM, ATCC), und Herstellungsfirmen für Zellen, wie Osiris, bezogen.
Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den erhaltenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Menschliche mesenchymale Stammzellen füh Prüfzwecke wurden von den vorstehend beschriebenen Organisationen bezogen. Die menschlichen mesenchymalen Stammzellen wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend wurden die menschlichen mesenchymalen Stammzellen kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen mesenchymalen Stammzellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Wenn die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität, die eine von den induzierten Osteoblasten-Markern ist, der menschlichen undifferenzierten Zellen für Prüfzwecke von dem Wirkstoff gesteigert wird, der die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, wurde bestimmt, dass die undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten differenziert wurden. Wenn außerdem die Expression der alkalischen Phosphatase mit der alkalischen Phosphatase-Färbung nachgewiesen wurde, wurde ferner bestimmt, dass die undifferenzierten Zellen zu den induzierten Osteoblasten differenziert wurden.
(Vergleichsbeispiel 4A: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 4 erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Menschliche undifferenzierte Zellen für Prüfzwecke wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend wurden die menschlichen undifferenzierten Zellen kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen undifferenzierten Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Bei Vorhandensein eines geringfügigen Unterschieds zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der menschlichen undifferenzierten Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, wurde bestimmt, dass die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten keinen Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
Wenn menschliche hypertrophierungsfähige Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert wurden, wird vorhergesagt, dass sie den Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann. Wenn andererseits die menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wird vorhergesagt, dass sie nicht den Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
(Vergleichsbeispiel 4B: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von menschlichen nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium oder MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Menschliche nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden von der vorstehend beschriebenen Organisation bezogen. Jeweils ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium und ein MEM-Wachstumsmedium wurde den nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Menschliche undifferenzierte Zellen für Prüfzwecke wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend wurden die menschlichen undifferenzierten Zellen kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen undifferenzierten Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der menschlichen undifferenzierten Zellen, die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die menschlichen nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, kaum verändert wurde, wurde bestimmt, dass die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten keinen Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
Wenn ferner die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen undifferenzierten Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, kaum verändert wurde, wurde ebenfalls bestimmt, dass die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten keinen Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
Selbst wenn die menschlichen nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium oder MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wird vorhergesagt, dass sie nicht den Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
(Beispiel 5: Herstellung und Nachweis des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Medium hergestellt wurde)
Hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 4 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes HAM-Medium wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Menschliche undifferenzierte Zellen für Prüfzwecke wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend wurden die menschlichen undifferenzierten Zellen kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen undifferenzierten Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Wenn die menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Medium kultiviert wurden, kann mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 bestätigt werden, dass sie einen Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
(Vergleichsbeispiel 5A: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in HAM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurde ein HAM-Wachstumsmedium bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Menschliche undifferenzierte Zellen für Prüfzwecke wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend wurden die menschlichen undifferenzierten Zellen kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen undifferenzierten Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Wenn die menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem HAM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, kann mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 bestätigt werden, dass sie keinen Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
(Vergleichsbeispiel 5B: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von menschlichen nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Medium oder HAM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Menschliche nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 4B erhalten. Jeweils ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes HAM-Medium und ein HAM-Wachstumsmedium wurde den nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Menschliche undifferenzierte Zellen für Prüfzwecke wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand zugegeben und anschließend wurden die menschlichen undifferenzierten Zellen kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen undifferenzierten Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 kann bestätigt werden, ob die menschlichen undifferenzierten Zellen, die durch Zugabe eines Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums oder HAM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in denen die menschlichen nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), induzierte Osteoblasten-Marker exprimieren.
(Schlussfolgerung aus Beispiel 4 und 5 sowie Vergleichsbeispiel 4A bis 5B)
Gemäß den vorstehend beschriebenen Beispielen kann untersucht werden, ob die menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten den Wirkstoff erzeugen, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, unabhängig von der Art des in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums enthaltenen Basismediums.
Gemäß Beispiel 1 und 3 sowie Vergleichsbeispiel 1A bis 1E und 3A bis 3C gilt: Selbst wenn die aus Ratten stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem beliebigen Wachstumsmedium kultiviert wurden, erzeugen sie nachweislich nicht den Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann. Selbst wenn aus Ratten stammende nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einem beliebigen Medium kultiviert wurden, erzeugen sie nachweislich nicht den Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
Deshalb wird vorgeschlagen, dass der Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, nur durch Kultivieren der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium erzeugt wird. Da außerdem das in dem Medium enthaltene Basismedium die Erzeugung des die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs unwahrscheinlich durch die menschlichen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten beeinträchtigt, solange es in einer Zellkultur normal verwendet werden kann, wird angenommen, dass ein beliebiges Basismedium in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden kann.
(Beispiel 6: Untersuchung, ob der Wirkstoff, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde, die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung von Maus-C3H10T1/2-Zellen verschiedenen undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten aufweist)
Ein Überstand eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums oder MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten. BALB/3T3-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen und NIH3T3-Zellen wurden als undifferenzierte Zellen verwendet. Jeder Zelltyp wurde in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Für den Fall der Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, zu jedem Zelltyp, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde: der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der BALB/3T3-Zellen betrug das etwa 5,9-Fache (siehe linke Seite der Tabelle 4 und 6A), der 3T3-Swiss-Albino-Zellen das etwa 13,8-Fache (sie Mitte der Tabelle 4 und 6A) und der NIH3T3-Zellen das etwa 5,4-Fache (siehe rechte Seite der Tabelle 4 und 6A).

Für den Fall der Zugabe des MEM-Wachstumsmediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, zu jedem Zelltyp, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde: der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der BALB/3T3-Zellen betrug das etwa 1,3-Fache (siehe linke Seite der Tabelle 4 und 6A), der 3T3-Swiss-Albino-Zellen das etwa 1,1-Fache (sie Mitte der Tabelle 4 und 6A) und der NIH3T3-Zellen das etwa 0,9-Fache (siehe rechte Seite der Tabelle 4 und 6A). (Tabelle 4: Fähigkeit der Induzierung der Differenzierung von BALB/3T3-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen oder NIH3T3-Zellen zu Osteoblasten)

	BALB/3T3		3T3-Swiss-Albino		NIH3T3
	Relativer Wert	Absoluter Wert	Relativer Wert	Absoluter Wert	Relativer Wert	Absoluter Wert
GC-Differenzierungsüberstand	5,9	0,107	13,8	0,174	5,4	0,097
Nur Differenzierungs-Medium	1	0,018	1	0,013	1	0,018
GC-Wachstums-Überstand	1,3	0,021	1,1	0,013	0,9	0,016
Nur Wachstumsmedium	1	0,016	1	0,013	1	0,018

GC (4 Wochen alt): ein Experiment wurde durchgeführt. Drei Versuche wurden durchgeführt.
GC-Differenzierungs-Überstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
GC-Wachstums-Überstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
Nur Differenzierungs-Medium: MEM-Differenzierungsmedium allein.
Nur Wachstumsmedium: MEM-Wachstumsmedium allein.

Wenn hypertrophierungsfähige Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass in dem Überstand des Mediums (Kulturüberstand) der Wirkstoff vorhanden war, der die alkalische Phosphatase-Aktivität von jedem Typ der 3T3-Swiss-Albino-Zellen, BALB/3T3-Zellen und NIH3T3-Zellen steigern und die Differenzierung der Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann. Wenn andererseits die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass in dem Überstand des Mediums kein Wirkstoff vorhanden war.
(Vergleichsbeispiel 6: Untersuchung, ob die in einem Überstand des Mediums vorhandene Komponente, in dem nicht-hypertrophierungsfähige ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden, die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung von Maus-C3H10T1/2-Zellen verschiedenen undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten aufweist)
Ein Überstand eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums oder MEM-Wachstumsmediums, in dem nicht-hypertrophierungsfähige ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden, wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 1B erhalten. BALB/3T3-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen und NIH3T3-Zellen wurden als undifferenzierte Zellen verwendet. Jeder Zelltyp wurde in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Für den Fall der Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen ruhenden Knorpelzellen kultiviert wurden, zu jedem Zelltyp, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde: der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der BALB/3T3-Zellen betrug das etwa 1,0-Fache (siehe linke Seite der Tabelle 5 und 6A), der 3T3-Swiss-Albino-Zellen das etwa 1,1-Fache (sie Mitte der Tabelle 5 und 6A) und der NIH3T3-Zellen das etwa 1,0-Fache (siehe rechte Seite der Tabelle 5 und 6A).

Für den Fall der Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums, in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen ruhenden Knorpelzellen kultiviert wurden, zu jedem Zelltyp, wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde: der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der BALB/3T3-Zellen betrug das etwa 1,3-Fache (siehe linke Seite der Tabelle 5 und 6A), der 3T3-Swiss-Albino-Zellen das etwa 0,9-Fache (sie Mitte der Tabelle 5 und 6A) und der NIH3T3-Zellen das etwa 1,0-Fache (siehe rechte Seite der Tabelle 5 und 6A). (Tabelle 5: Fähigkeit der Induzierung der Differenzierung von BALB/3T3-Zellen, 3T3-Swiss-Albino-Zellen oder NIH3T3-Zellen zu Osteoblasten)

	BALB/3T3		3T3-Swiss-Albino		NIH3T3
	Relativer Wert	Absoluter Wert	Relativer Wert	Absoluter Wert	Relativer Wert	Absoluter Wert
RC-Differenzierungsüberstand	1,0	0,018	1,1	0,014	1,0	0,018
Nur Differenzierungsmedium	1	0,018	1	0,013	1	0,018
RC-Wachstumsüberstand	1,3	0,020	0,9	0,012	1,0	0,019
Nur Wachstumsmedium	1	0,016	1	0,013	1	0,018

RC (8 Wochen alt): ein Experiment wurde durchgeführt. Drei Versuche wurden durchgeführt.
RC-Differenzierungsüberstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden.
RC-Wachstumsüberstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden.
Nur Differenzierungs-Medium: MEM-Differenzierungsmedium allein.
Nur Wachstumsmedium: MEM-Wachstumsmedium allein.

Es gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität bei jedem Typ von 3T3-Swiss-Albino-Zellen, BALB/3T3-Zellen und NIH3T3-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen ruhenden Knorpelzellen kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden.
Somit wurde bestätigt, dass in dem Überstand des Mediums (Kulturüberstand) kein Wirkstoff vorhanden war, der die Differenzierung von jedem Typ dieser undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann. Es wurde ferner bestätigt, dass in dem Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem nicht-hypertrophierungsfähige ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden, kein Wirkstoff vorhanden war.
(Beispiel 7: Herstellung und Nachweis des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem Medium mit verschiedenen Arten herkömmlicher die Osteoblasten-Differenzierung induzierender Komponenten hergestellt wurde)

Aus Costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben und anschließend wurde Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure oder eine Kombination davon als eine herkömmliche Osteoblasten-Differenzierungskomponente dem Medium zugegeben. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.

Zugegebene Komponente	Konzentration der jeweils zugegebenen die Osteoblasten-Differenzierung induzierenden Komponente
Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium	Dex: 10 nM, βGP: 10 mM, Asc: 50 μg/ml
Dex	Dex: 10 nM
βPGP	βPGP: 10 mM
Asc	Asc: 50 μg/ml
Dex + βPGP	Dex: 10 nM, βPGP: 10 mM
Dex + Asc	Dex: 10 nM, Asc: 50 μg/ml
βPGP + Asc	βPGP: 10 mM, Asc: 50 μg/ml
Wachstumsmedium	Keine die Osteoblasten-Differenzierung induzierende Komponente

Dex: Dexamethason, βGP: β-Glycerophosphat, Asc: Ascorbinsäure

1 ml von jedem partiellen Überstand wurde Maus-C3H10T1/2-Zellen (1,25 × 10⁴ Zellen/cm²) zugegeben, sie wurden in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert und anschließend wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Wie in der nachstehenden Tabelle und 6B gezeigt ist, betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums, enthaltend Dex, βGP und Asc (Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium) kultiviert wurden, 0,041, und der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums, enthaltend βGP und Asc betrug 0,044.
Ferner betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums, enthaltend nur Dex, 0,016, der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums, enthaltend nur BGP, 0,015 und der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums, enthaltend nur Asc, 0,016. Der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums, enthaltend Dex und BGP, betrug 0,022 und der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums, enthaltend Dex und Asc, 0,017.

Wenn ein Überstand des Wachstumsmediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, den Maus-C3H10T1/2-Zellen als Kontrolle zugegeben wurde, betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen 0,014. Wenn nur das den Differenzierungswirkstoff erzeugende MEM-Medium und das MEM-Wachstumsmedium den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde, betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen 0,016 bzw. 0,014. (Wirkung der herkömmlichen Osteoblasten-Differenzierung induzierenden Komponenten auf die Erzeugung des Wirkstoffs, der die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren kann)

	Mittelwert	SA
Dex + βGP + Asc	0,041	0,008
Dex	0,016	0,004
βGP	0,015	0,004
Asc	0,016	0,001
Dex + βGP	0,022	0,004
Dex + Asc	0,017	0,002
βGP + Asc	0,044	0,016
Wachstumsmedium	0,014	0,002
Nur Differenzierungsmedium	0,016	0,002
Nur Wachstumsmedium	0,014	0,001

Dex: Dexamethason
βGP: β-Glycerophosphat
Asc: Ascorbinsäure
Nur Differenzierungsmedium: Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium allein (in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten nicht kultiviert wurden)
Nur Wachstumsmedium: MEM-Wachstumsmedium allein (in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten nicht kultiviert wurden)

Wenn jede der herkömmlichen Osteoblasten-Differenzierung induzierenden Komponenten dem MEM-Wachstumsmedium unabhängig zugegeben wurde, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, wurde der Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, nicht erzeugt. Wenn β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure dem MEM-Wachstumsmedium zugegeben wurde, wurde der Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, hergestellt.
Wenn gemeinsam Dexamethason, β-Glycerophosphat und Ascorbinsäure dem MEM-Wachstumsmedium zugegeben wurde (d. h. das den Differenzierungswirkstoff erzeugende MEM-Medium wurde verwendet), wurde bestätigt, dass die Erzeugung des Wirkstoffs, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, gefördert wurde.
(Beispiel 8: Untersuchung des in einem Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums enthaltenen Wirkstoffs, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden)
Hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 kultiviert und ein Überstand des Mediums wurde zur Gewinnung von partiellen Überständen in einer Zeitspanne von 4 Tagen bis 3 Wochen gesammelt. Jeder partielle Überstand wurde in ein Zentrifugenfilter gegeben und anschließend eine Zentrifugen-Ultrafiltration bei 4.000 × g und bei 4°C für 30 min unter einer solchen Bedingung durchgeführt, dass eine hochmolekulare Fraktion und eine niedermolekulare Fraktion von einander getrennt wurden. So wurde der partielle Überstand in eine hochmolekulare Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder höher und eine niedermolekulare Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder weniger aufgetrennt.
Dann wurden Maus-C3H10T1/2-Zellen (in einem BME-Medium) in eine 24-Well-Platte bei einer Dichte von 1,25 × 10⁴ Zellen/cm² und auf Hydroxylapatit bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte und dem Hydroxylapatit 1 ml der hochmolekularen Fraktion und der niedermolekularen Fraktion zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Wenn die hochmolekulare Fraktion mit dem Molekulargewicht von 50.000 oder höher, die aus jedem partiellen Überstand abgetrennt wurde, den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde, die auf die 24-Well-Platte und auf Hydroxylapatit geimpft wurden, wurden sie rot gefärbt (siehe 7A und 7B). Es wurde angezeigt, dass der Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen steigern kann, in der hochmolekularen Fraktion vorhanden war.
Wenn andererseits die niedermolekulare Fraktion mit dem Molekulargewicht von 50.000 oder weniger, die aus jedem partiellen Überstand abgetrennt wurde, den Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde, die auf die 24-Well-Platte und auf Hydroxylapatit geimpft wurden, wurden sie nicht gefärbt. D. h. die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen (siehe 7C und 7D).
Gemäß den vorstehenden Ergebnissen wurde festgestellt, das der Wirkstoff, der die Differenzierung der Maus-C3H10T1/2-Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, in der hochmolekularen Fraktion mit dem Molekulargewicht von 50.000 oder höher, die aus jedem partiellen Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums abgetrennt wurde, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, vorhanden war.
(Beispiel 9: Herstellung und Nachweis des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Maus-Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
(Herstellung von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten aus Maus-Costa/costal-Knorpel)
8 Wochen alte männliche Mäuse (Balb/cA) wurden in diesem Beispiel untersucht. Die Mäuse wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Der Brustkorb der Mäuse wurde unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung (10-fach verdünnt) eingetaucht. Der Brustkorb der Mäuse wurde eingeschnitten und die Costa/costal-Knorpel aseptisch entnommen.
Die durchscheinende Wachstumsknorpelregion wurde aus der Grenzregion der Costa/costal-Knorpel gesammelt. Der Wachstumsknorpel wurde zerschnitten und in 0,25% Trypsin-EDTA/ Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung nach Dulbecco (D-PBS) bei 37°C für 1 Stunde gerührt. Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Collagenase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/D-PBS bei 37°C für 2,5 h gerührt.
Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Dispase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/(HAM + 10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei 37°C gerührt. Am folgenden Tag wurden die Zellen filtriert und durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
Die Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden, wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
(Identifizierung von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten)
Da die in Beispiel 9 erhaltenen Zellen durch die bei der Zelltrennung verwendeten Enzyme (z. B. Trypsin, Collagenase und Dispase) beeinträchtigt waren, wurden sie zur Erholung kultiviert. Hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden unter Verwendung der Lokalisierung und Expression von Chondrozyten-Markern und ihrer morphologischen Hypertrophien unter einem Mikroskop identifiziert.
(Lokalisierung oder Expression von spezifischen Markern für hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
Ein unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens hergestelltes Lysat wurde mit Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt, um eine SDS-behandelte Lösung zu erhalten. Mit der SDS-behandelten Lösung wurde eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Das in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendete Gel wurde anschließend auf eine Transfermembran aufgetragen (Western-Blotting), mit einem primären Antikörper auf einen Chondrozyten-Marker umgesetzt und mit einem sekundären Antikörper nachgewiesen, der mit einem Enzym, wie Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Glucosidase, oder einem Fluoreszenzmarker, wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Texas-Rot, 7-Amino-4-methylcoumarin-3-acetat (AMCA) oder Rhodamin, markiert ist.
Die Kultur (Zellkultur), die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten wurde, wurde mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert, mit einem primären Antikörper auf einen Chondrozyten-Marker umgesetzt und anschließend mit einem sekundären Antikörper nachgewiesen, der mit einem Enzym, wie Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Glucosidase, oder einem Fluoreszenzmarker, wie FITC, PE, Texas-Rot, AMCA oder Rhodamin markiert ist.
Die alkalische Phosphatase kann ferner durch Färben nachgewiesen werden. Die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhaltene Kultur wurde gefärbt, indem sie mit 60% Aceton/Citronensäure-Puffer fixiert, mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend in ein Gemisch aus First Violet B und Naphthol AS-MX bei Raumtemperatur im Dunkeln füh 30 min zur Umsetzung eingetaucht wurde.
(Morphologische Bewertung der Fähigkeit zur Hypertrophie in Chondrozyten)
Ein HAM-F12-Medium, enthaltend 5 × 10⁵ Zellen, wurde zur Bildung eines Pellets aus den Zellen zentrifugiert. Das Pellet (Zellpellet) wurde füh eine vorbestimmte Zeitspanne kultiviert. Die Zellgrößen vor und nach dem Kultivieren wurden unter einem Mikroskop verglichen. Wurde eine signifikante Zunahme der Größe festgestellt, wurden die Zellen als hypertrophierungsfähig bestimmt.
Es kann bestätigt werden, ob die in Beispiel 9 erhaltenen Zellen hypertrophierungsfähige Chondrozyten sind, indem bestimmt wird, ob diese Zellen einen Chondrozyten-Marker exprimieren oder morphologisch hypertroph sind.
(Nachweis des Wirkstoffs, der von aus Maus-Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde)
Hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 9 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zur Herstellung einer Zellsuspension bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben.
Die Zellsuspension wurde gleichmäßig auf eine Schale (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) geimpft, die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums (Kulturüberstand) über einen Zeitraum (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung von partiellen Überständen gesammelt.
(Untersuchung, ob der gewonnene Überstand die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten aufweist)
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte von 1,25 × 10⁴ Zellen/cm² (d. h. 2,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
In diesem Beispiel wurde der vorliegende Wirkstoff mit der Fähigkeit zur Steigerung der alkalischen Phosphatase-Aktivität bestimmt, wenn ein Wert der alkalischen Phosphatase-(ALP)-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen (Ganzzellen), die durch Zugabe des Überstands mit dem vorliegenden Wirkstoff kultiviert wurden, um mehr als das 1,5-Fache des Wertes der Maus-C3H10T1/2-Zellen zunahm, die durch Zugabe des Mediums ohne den vorliegenden Wirkstoff kultiviert wurden.
Wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde, erhöhte sich der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands kultiviert wurden, auf das etwa 3,1-Fache (siehe obere Spalte in Tabelle 6 und 8).
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
Wie vorstehend beschrieben ist, wurde gezeigt, dass die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität, die eine von den induzierten Osteoblasten-Markern ist, der Maus-C3H10T1/2-Zellen von dem Wirkstoff gesteigert wird, der die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren kann. Außerdem wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten fähigen Wirkstoffs für 72 h kultiviert wurden, bei der alkalischen Phosphatase-Färbung signifikant rot gefärbt.
Somit wurde die Expression der alkalischen Phosphatase unter Verwendung des Färbeverfahrens ebenfalls angezeigt. Folglich wurde bestätigt, dass die Maus-C3H10T1/2-Zellen zu den induzierten Osteoblasten differenziert wurden.
(Vergleichsbeispiel 9A: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Maus-Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Aus Maus-Costa/costal-Knorpel gewonnene hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 9 erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte von 1,25 × 10⁴ Zellen/cm² (d. h. 2,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde, betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands kultiviert wurden, das etwa 1,6-Fache (siehe untere Spalte in Tabelle 6 und 8).
Es gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden (siehe 8).
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
In dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 9 wurde bestätigt, dass der Überstand des Mediums (Zellkultur), der durch die vorstehend beschriebene Vorgehensweise erhalten wurde, keine induzierten Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimierte.
(Vergleichsbeispiel 9B: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Maus-Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
(Herstellung von ruhenden Knorpelzellen aus Costal-Knorpel)
8 Wochen alte männliche Mäuse (Balb/cA) wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Der Brustkorb der Mäuse wurde unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung (10-fach verdünnt) eingetaucht. Der Brustkorb der Mäuse wurde eingeschnitten und die Costa/costal-Knorpel aseptisch entnommen.
Die durchscheinenden ruhenden Knorpelregionen wurden aus den Costal-Knorpeln gesammelt. Die ruhenden Knorpelregionen wurden zerschnitten und in 0,25% Trypsin-EDTA/D-PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung nach Dulbecco) bei 37°C für 1 Stunde gerührt. Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Collagenase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/D-PBS bei 37°C für 2,5 h gerührt.
Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Dispase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/(HAM + 10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei 37°C gerührt. Wahlweise wurde die Behandlung 0,2% Dispase über Nacht weggelassen. Am folgenden Tag wurden die Zellen filtriert und durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
Die Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden, wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
(Identifizierung von aus Costal-Knorpel stammenden nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten)
In dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 9 kann die Lokalisierung oder Expression von Chondrozyten-Markern nachgewiesen werden. Ferner kann bestätigt werden, ob die erhaltenen Zellen hypertrophierungsfähige Chondrozyten sind, indem sie morphologisch untersucht werden.
(Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde, betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands kultiviert wurden, das etwa 0,8-Fache (siehe obere Spalte in Tabelle 6 und 8).
Es gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die ruhenden Knorpelzellen (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden (siehe obere Spalte in Tabelle 6 und 8).
Mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des Mediums (Zellkultur), der durch die vorstehend beschriebene Vorgehensweise erhalten wurde, induzierte Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
(Vergleichsbeispiel 9C: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Maus-Costa/costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Aus Costal-Knorpel stammende ruhende Knorpelzellen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 9B erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde, betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands kultiviert wurden, das etwa 1,0-Fache (siehe untere Spalte in Tabelle 6 und 8).
Es gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die ruhenden Knorpelzellen kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden (siehe untere Spalte in Tabelle 6 und 8).
Es wurde bestätigt, dass der Überstand des Mediums (Zellkultur), der durch die vorstehend beschriebene Vorgehensweise erhalten wurde, keine induzierten Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimierte.
(Tabelle 6: Vergleich der alkalischen Phosphatase-Aktivitäten von Beispiel 9 und Vergleichsbeispiel 9A bis 9C, wobei in jedem ein Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums oder MEM-Wachstumsmediums, in denen murine Chondrozyten kultiviert wurden, Maus-C3H10T1/2-Zellen zugegeben wurde)
Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (Mittelwert)

Relativer Wert Absoluter Wert

GC-Überstand 3,1 0,038

RC-Überstand 0,8 0,011

Nur Differenzierungsmedium 1 0,012

MEM-Wachstumsmedium (Mittelwert)

Relativer Wert Absoluter Wert

GC-Überstand 1,6 0,021

RC-Überstand 1,0 0,013

Nur Differenzierungsmedium 1 0,014

8 Wochen alt: ein Experiment wurde durchgeführt. Zwei Versuche wurden durchgeführt.
GC-Überstand: Überstand jedes Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
RC-Überstand: Überstand jedes Mediums, in dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden.
Nur Differenzierungsmedium: den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium allein.
Nur Wachstumsmedium: MEM-Wachstumsmedium allein.

(Schlussfolgerung aus Beispiel 9 und Vergleichsbeispiel 9A bis 9C)
Wenn aus Maus-Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass in dem Überstand des Mediums (Kulturüberstand) der Wirkstoff vorhanden war, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen und die Differenzierung der Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
Wenn andererseits die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass in dem Überstand des Mediums (Kulturüberstand) kein Wirkstoff vorhanden war. Somit wurde festgestellt, dass die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten einen Wirkstoff erzeugten, der die Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, indem sie in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert wurden.
Sogar wenn die aus Maus-Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium oder MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass sie keinen Wirkstoff erzeugten, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
(Beispiel 10: Herstellung und Nachweis des zellfunktionsregulierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Kaninchen-Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
(Herstellung von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten aus Kaninchen-Costa/costal-Knorpel)
8 Wochen alte männliche Kaninchen (Japanese White) wurden in diesem Beispiel untersucht. Die Kaninchen wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Der Brustkorb der Kaninchen wurde unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung (10-fach verdünnt) eingetaucht. Der Brustkorb der Kaninchen wurde eingeschnitten und die Costa/costal-Knorpel aseptisch entnommen.
Die durchscheinende Wachstumsknorpelregion wurde aus der Grenzregion der Costa/costal-Knorpel gesammelt. Der Wachstumsknorpel wurde zerschnitten und in 0,25% Trypsin-EDTA/D-PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung nach Dulbecco) bei 37°C für 1 Stunde gerührt. Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Collagenase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/D-PBS bei 37°C für 2,5 h gerührt.
Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Dispase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/(HAM + 10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei 37°C gerührt. Am folgenden Tag wurden die Zellen filtriert und durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
Die Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden, wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
(Identifizierung von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten)
Da die in Beispiel 10 erhaltenen Zellen durch die bei der Zelltrennung verwendeten Enzyme (z. B. Trypsin, Collagenase und Dispase) beeinträchtigt waren, wurden sie zur Erholung kultiviert. Hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden unter Verwendung der Lokalisierung und Expression von Chondrozyten-Markern und ihrer morphologischen Hypertrophien unter einem Mikroskop identifiziert.
(Lokalisierung oder Expression von spezifischen Markern für hypertrophierungsfähige Chondrozyten)
Ein unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens hergestelltes Lysat wurde mit Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt, um eine SDS-behandelte Lösung zu erhalten. Mit der SDS-behandelten Lösung wurde eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Das in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendete Gel wurde anschließend auf eine Transfermembran aufgetragen (Western-Blotting), mit einem primären Antikörper auf einen Chondrozyten-Marker umgesetzt und mit einem sekundären Antikörper nachgewiesen, der mit einem Enzym, wie Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Glucosidase, oder einem Fluoreszenzmarker, wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Texas-Rot, 7-Amino-4-methylcoumarin-3-acetat (AMCA) oder Rhodamin, markiert ist.
Die Kultur (Zellkultur), die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhalten wurde, wurde mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert, mit einem primären Antikörper auf einen Chondrozyten-Marker umgesetzt und anschließend mit einem sekundären Antikörper nachgewiesen, der mit einem Enzym, wie Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Glucosidase, oder einem Fluoreszenzmarker, wie FITC, PE, Texas-Rot, AMCA oder Rhodamin markiert ist.
Die alkalische Phosphatase kann ferner durch Färben nachgewiesen werden. Die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhaltene Kultur wurde gefärbt, indem sie mit 60% Aceton/Citronensäure-Puffer fixiert, mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend in ein Gemisch aus First Violet B und Naphthol AS-MX bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 min zur Umsetzung eingetaucht wurde.
(Morphologische Bewertung der Fähigkeit zur Hypertrophie in Chondrozyten)
Ein HAM-F12-Medium, enthaltend 5 × 10⁵ Zellen, wurde zur Bildung eines Pellets aus den Zellen zentrifugiert. Das Pellet (Zellpellet) wurde für eine vorbestimmte Zeitspanne kultiviert. Die Zellgrößen vor und nach dem Kultivieren wurden unter einem Mikroskop verglichen. Wurde eine signifikante Zunahme der Größe festgestellt, wurden die Zellen als hypertrophierungsfähig bestimmt.
(Ergebnisse)
Es kann bestätigt werden, ob die in Beispiel 10 erhaltenen Zellen hypertrophierungsfähige Chondrozyten sind, indem bestimmt wird, ob diese Zellen einen Chondrozyten-Marker exprimieren oder morphologisch hypertroph sind.
(Nachweis des Wirkstoffs, der von aus Kaninchen-Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wurde)
Hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 10 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zur Herstellung einer Zellsuspension bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben.
Die Zellsuspension wurde gleichmäßig auf eine Schale (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) geimpft, die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert und anschließend wurde ein Überstand (Kulturüberstand) des Mediums über einen Zeitraum (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung von partiellen Überständen gesammelt.
(Untersuchung, ob der gewonnene Überstand die Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten aufweist)
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte von 1,25 × 10⁴ Zellen/cm² (d. h. 2,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
In diesem Beispiel wurde der vorliegende Wirkstoff mit der Fähigkeit zur Steigerung der alkalischen Phosphatase-Aktivität bestimmt, wenn ein Wert der alkalischen Phosphatase-(ALP)-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen (Ganzzellen), die durch Zugabe des Überstands mit dem vorliegenden Wirkstoff kultiviert wurden, um mehr als das 1,5-Fache des Wertes der Maus-C3H10T1/2-Zellen zunahm, die durch Zugabe des Mediums ohne den vorliegenden Wirkstoff kultiviert wurden.
Wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde, erhöhte sich der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des Überstands kultiviert wurden.
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
Wie vorstehend beschrieben ist, wurde gezeigt, dass die alkalische Phosphatase-(ALP)-Aktivität, die eine von den induzierten Osteoblasten-Markern ist, der Maus-C3H10T1/2-Zellen von dem Wirkstoff gesteigert wird, der die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren kann. Außerdem wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten fähigen Wirkstoffs für 72 h kultiviert wurden, bei der alkalischen Phosphatase-Färbung signifikant rot gefärbt.
Somit wurde die Expression der alkalischen Phosphatase unter Verwendung des Färbeverfahrens ebenfalls angezeigt. Folglich wurde bestätigt, dass die Maus-C3H10T1/2-Zellen zu den induzierten Osteoblasten differenziert wurden.
(Vergleichsbeispiel 10A: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Kaninchen-Costa/costal-Knorpel gewonnenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Aus Kaninchen-Costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 10 erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden gleichmäßig in eine 24-Well-Platte (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bei einer Dichte von 1,25 × 10⁴ Zellen/cm² (d. h. 2,5 × 10 Zellen/Vertiefung) geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Es gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden.
(Identifizierung von induzierten Osteoblasten)
Mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 10 kann bestätigt werden, ob der Überstand des Mediums (Zellkultur), der durch die vorstehend beschriebene Vorgehensweise erhalten wurde, induzierte Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
(Vergleichsbeispiel 10B: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Kaninchen-Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
(Herstellung von ruhenden Knorpelzellen aus Costal-Knorpel)
8 Wochen alte männliche Kaninchen (Japanese White) wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Der Brustkorb der Kaninchen wurde unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung (10-fach verdünnt) eingetaucht. Der Brustkorb der Kaninchen wurde eingeschnitten und die Costa/costal-Knorpel aseptisch entnommen.
Die durchscheinenden ruhenden Knorpelregionen wurden aus den Costal-Knorpeln gesammelt. Die ruhenden Knorpelregionen wurden zerschnitten und in 0,25% Trypsin-EDTA/D-PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung nach Dulbecco) bei 37°C für 1 Stunde gerührt. Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Collagenase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/D-PBS bei 37°C für 2,5 h gerührt.
Die Schnitte wurden anschließend durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen und anschließend zusammen mit 0,2% Dispase (hergestellt von Invitrogen Corporation)/(HAM + 10% FBS) in einem Rührkolben über Nacht bei 37°C gerührt. Wahlweise wurde die Behandlung 0,2% Dispase über Nacht weggelassen. Am folgenden Tag wurden die Zellen filtriert und durch Zentrifugation (bei 170 × g für 3 min) gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und ihre Anzahl wurde unter einem Mikroskop gezählt.
Die Zellen, die als nicht gefärbte Zellen bewertet wurden, wurden als lebende Zellen betrachtet und die Zellen, die blau gefärbt wurden, wurden als tote Zellen betrachtet.
(Identifizierung von aus Costal-Knorpel stammenden nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten)
Mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 10 kann bestätigt werden, ob die erhaltenen Zellen nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten sind, indem die Lokalisierung oder Expression von Chondrozyten-Markern nachgewiesen wird und sie morphologisch untersucht werden.
(Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium hergestellt wurde)
Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden kultiviert und anschließend wurde ein Kulturüberstand des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Es gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die ruhenden Knorpelzellen (Zellkultur) kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden.
Mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des Mediums (Zellkultur), der durch die vorstehend beschriebene Vorgehensweise erhalten wurde, induzierte Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
(Vergleichsbeispiel 10C: Herstellung und Nachweis des Wirkstoffs, der durch Kultivieren von aus Costal-Knorpel gewonnenen ruhenden Knorpelzellen in MEM-Wachstumsmedium hergestellt wurde)
Aus Costal-Knorpel stammende ruhende Knorpelzellen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 10B erhalten. Ein MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den ruhenden Knorpelzellen bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die ruhenden Knorpelzellen wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen (”CCL-226”, hergestellt von Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) wurden in eine 24-Well-Platte geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Es gab einen geringfügigen Unterschied zwischen dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des Überstands des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden, in dem die aus Costal-Knorpel stammenden ruhenden Knorpelzellen kultiviert wurden, und dem Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die nur durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums kultiviert wurden.
Mit dem gleichen Verfahren und den gleichen Kriterien wie in Beispiel 1 kann bestätigt werden, ob der Überstand des Mediums (Zellkultur), der durch die vorstehend beschriebene Vorgehensweise erhalten wurde, induzierte Osteoblasten-Marker in den Maus-C3H10T1/2-Zellen exprimiert.
(Schlussfolgerung aus Beispiel 10 und Vergleichsbeispiel 10A bis 10C)
Wenn aus Kaninchen-Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass in dem Überstand des Mediums (Kulturüberstand) der Wirkstoff vorhanden war, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen und die Differenzierung der Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
Wenn andererseits die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass in dem Überstand des Mediums (Kulturüberstand) kein Wirkstoff vorhanden war. Somit wurde festgestellt, dass die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten einen Wirkstoff erzeugten, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, indem sie in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert wurden.
Sogar wenn die aus Kaninchen-Costal-Knorpel gewonnenen nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium oder MEM-Wachstumsmedium kultiviert wurden, wurde bestätigt, dass sie keinen Wirkstoff erzeugten, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann.
(Beispiel 11: Untersuchung der Wirkung eines Mediums zum Kultivieren von undifferenzierten Zellen (Kulturmedium für undifferenzierte Zellen) auf die Induzierung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten)
Hypertrophierungsfähige Chondrozyten, nicht-hypertrophierungsfähige ruhende Knorpelzellen und nicht-hypertrophierungsfähige Gelenkknorpelzellen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1, Vergleichsbeispiel 1B bzw. Vergleichsbeispiel 1D erhalten. Jeweils ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium und ein MEM-Wachstumsmedium wurde jeder Art der Zellen bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die Zellen wurden in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums (Kulturüberstand) in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden als undifferenzierte Zellen verwendet. Die Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden in eine 24-Well-Platte, enthaltend ein HAM-Medium oder MEM-Medium, bei einer Dichte von 1,25 × 10⁴ Zellen/cm² geimpft. 18 h nach dem Impfen wurde der Platte 1 ml von jedem partiellen Überstand und das Medium zugegeben und anschließend wurden die Maus-C3H10T1/2-Zellen in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C kultiviert. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Es wurde festgestellt, dass der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in dem MEM-Medium kultiviert wurden, dem der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums zugegeben wurde, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, um das etwa 10,8-Fache des Wertes der Maus-C3H10T1/2-Zellen zunahm, die in dem MEM-Medium kultiviert wurden, dem nur das den Differenzierungswirkstoff erzeugende MEM-Medium zugegeben wurde.
Es wurde festgestellt, dass der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in dem MEM-Medium kultiviert wurden, dem der Überstand des MEM-Wachstumsmediums zugegeben wurde, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), nicht zunahm. Es wurde ferner festgestellt, dass die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in dem MEM-Medium kultiviert wurden, dem der Überstand von jeweils dem Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium zugegeben wurde, in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen ruhenden Knorpelzellen oder die nicht-hypertrophierungsfähigen Gelenkknorpel-Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), nicht zunahm.
Somit wurde belegt, dass das zum Kultivieren der Maus-C3H10T1/2-Zellen verwendete Basismedium die Induzierung der Differenzierung der Zellen zu induzierten Osteoblasten nicht beeinträchtigte (siehe Tabelle 7 und 9).
(Tabelle 7: Wirkung des zum Kultivieren von undifferenzierten Zellen verwendeten Basismediums auf die Induzierung der Differenzierung der Zellen zu induzierten Osteoblasten)

HAM-Medium (Mittelwert)

	Relativer Wert	Absoluter Wert
GC-Differenzierungsüberstand	6,7	0,058
GC-Wachstumsüberstand	1,1	0,010
RC-Differenzierungsüberstand	1,2	0,011
RC-Wachstumsüberstand	1,1	0,010
AC-Differenzierungsüberstand	1,2	0,010
AC-Wachstumsüberstand	1,2	0,011
Nur Differenzierungsmedium	1	0,009
Nur Wachstumsmedium	1	0,009

MEM-Medium (Mittelwert)

	Relativer Wert	Absoluter Wert
GC-Differenzierungsüberstand	10,8	0,085
GC-Wachstumsüberstand	1,3	0,015
RC-Differenzierungsüberstand	1,5	0,012
RC-Wachstumsüberstand	0,7	0,008
AC-Differenzierungsüberstand	1,3	0,010
AC-Wachstumsüberstand	0,6	0,007
Nur Differenzierungsmedium	1	0,008
Nur Wachstumsmedium	1	0,011

GC (4 Wochen alt): ein Experiment wurde durchgeführt. Drei Versuche wurden durchgeführt.
RC (8 Wochen alt): ein Experiment wurde durchgeführt. Drei Versuche wurden durchgeführt.
AC (8 Wochen alt): ein Experiment wurde durchgeführt. Drei Versuche wurden durchgeführt.
GC-Differenzierungs-Überstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
GC-Wachstums-Überstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
RC-Differenzierungsüberstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden.
RC-Wachstumsüberstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem ruhende Knorpelzellen kultiviert wurden.
AC-Differenzierungs-Überstand: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem Gelenkknorpelzellen kultiviert wurden.
AC-Wachstums-Überstand: Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem Gelenkknorpelzellen kultiviert wurden.
Nur Differenzierungs-Medium: den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium allein.
Nur Wachstumsmedium: MEM-Wachstumsmedium allein.

Es wurde festgestellt, dass der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in dem HAM-Medium kultiviert wurden, dem der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums zugegeben wurde, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, um das etwa 6,7-Fache des Wertes der Maus-C3H10T1/2-Zellen zunahm, die in dem HAM-Medium kultiviert wurden, dem nur das den Differenzierungswirkstoff erzeugende MEM-Medium zugegeben wurde.
Es wurde festgestellt, dass der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in dem HAM-Medium kultiviert wurden, dem der Überstand des MEM-Wachstumsmediums zugegeben wurde, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), nicht zunahm. Es wurde ferner festgestellt, dass die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die in dem HAM-Medium kultiviert wurden, dem der Überstand von jeweils dem Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium und dem MEM-Wachstumsmedium zugegeben wurde, in dem die nicht-hypertrophierungsfähigen ruhenden Knorpelzellen oder die nicht-hypertrophierungsfähigen Gelenkknorpel-Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), nicht zunahm (siehe Tabelle 7 und 9).
(Beispiel 12: Hitzedenaturierung des von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugten Wirkstoffs, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann)
Hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/m1 Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben. Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums (Kulturüberstand) in einer Zeitspanne (4 Tage, 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage, 18 Tage, 21 Tage) zur Gewinnung partieller Überstände gesammelt. Ein Teil von jedem partiellen Überstand wurde für 3 min in siedendem Wasser erwärmt.
Maus-C3H10T1/2-Zellen wurden in einem BME-Medium bei einer Dichte von 1,25 × 10⁴ Zellen/cm² kultiviert. Nach 18 h wurde dem Medium jeweils 1 ml der nicht-erwärmten partiellen Überstände, der erwärmten partiellen Überstände und des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums allein zugegeben. Nach 72 h wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Wenn der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, auf ”1” festgelegt wurde, betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen, die durch Zugabe des nicht-erwärmten Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums kultiviert wurden, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, das etwa 12,8-Fache (siehe Tabelle 8 und 10).
Andererseits betrug der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe des erwärmten Überstands kultiviert wurden, das etwa 1,6-Fache (siehe Tabelle 8 und 10). Gemäß den Ergebnissen wurde bestätigt, dass der Wirkstoff, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, der in dem Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums vorhanden war, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, durch die Wärmebehandlung denaturiert (deaktiviert) wurde. Tabelle 8: Hitzedenaturierung des Wirkstoffs, der die Differenzierung von undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten induzieren kann) ALP-Aktivität (Mittelwert)

Relativer Wert Absoluter Wert

Erwärmt 1,6 0,014

Nicht-erwärmt 12,8 0,111

Nur Differenzierungsmedium 1 0,009

4 Wochen alt: ein Experiment wurde durchgeführt. Drei Versuche wurden durchgeführt.
Erwärmt: wärmebehandelter Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
Nicht-behandelt: Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
Nur Differenzierungs-Medium: den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium allein.

(Beispiel 13: Auswirkung der subkutanen Implantierung eines Verbundmaterials, das unter Verwendung von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten mit der Fähigkeit zur Erzeugung eines zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten fähigen Wirkstoffs und eines biokompatiblen Gerüsts hergestellt wurde)
Aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium wurde den erhaltenen hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zur Herstellung einer Zellsuspension bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/cm² zugegeben. Die Zellsuspension wurde gleichmäßig auf Collagengel, Alginsäure bzw. Matrigel^TM (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) geimpft und anschließend wurden die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zur Herstellung der Verbundmaterialien in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C für 1 Woche kultiviert. Bei dem Kultivieren wurde ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium verwendet.
Diese Verbundmaterialien wurden unter die dorsale Haut syngener Tiere implantiert. 4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere getötet und anschließend wurden die implantierten Regionen chirurgisch entfernt und mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert. Nachdem die implantierten Regionen röntgenografisch und mittels computerisierter Mikrotomographie untersucht wurden, wurden sie in Paraffin eingebettet. Dünne Schnittproben der implantierten Regionen wurden mit einer routinemäßigen Vorgehensweise erzeugt und dann mit Hämatoxylin-Eosin (HE), Toluidinblau (TB), Alcianblau (AB) und Safranin O (SO) angefärbt. Anschließend wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet.
Jedes der folgenden Experimente wurde durchgeführt.

Röntgenographie: die implantierte Region wurde röntgenografisch aus einer senkrechten Richtung dazu bei 100 KV unter Verwendung eines computerisierten Mikrotomographie-Geräts (”High Resolution X-ray micro-CT scanner SKYSCAN1172”, hergestellt von TOYO Corporation) untersucht.
Computerisierte Mikrotomographie: die implantierte Region wurde röntgengrafisch bei 100 KV unter Verwendung des gleichen Geräts wie das vorstehende computerisierte Mikrotomographie-Gerät, während es bei jedem 4. Grad zur Gewinnung röntgengrafischer Daten gedreht wurde, und anschließend wurden die röntgengrafischen Daten unter Verwendung von NRecon, die eine gebündelte Software ist, umstrukturiert und ein dreidimensionales Bild wurde unter Verwendung von VGStudio Max, die eine dreidimensionale Volumendarstellungssoftware ist, erhalten.
HE-Färbung: die dünne Schnittprobe wurde von Paraffin befreit und in eine Hämatoxylin-Lösung für 5 bis 10 min eingetaucht und danach gewaschen. Nachdem die dünne Schnittprobe eine Färbung zeigte, wurde sie in eine Eosin-Lösung für 3 bis 5 min eingetaucht.
TB-Färbung: die dünne Schnittprobe wurde von Paraffin befreit und in eine 0,05% Toluidinblau-Lösung für 15 bis 30 min eingetaucht.
AB-Färbung: die dünne Schnittprobe wurde von Paraffin befreit und in eine 3% Essigsäure-Lösung für 3 bis 5 min eingetaucht. Danach wurde sie in eine Alcianblau-Lösung für 20 bis 30 min eingetaucht, gewaschen und anschließend in eine Kernechtrot-Lösung für 10 bis 15 min eingetaucht.
SO-Färbung: die dünne Schnittprobe wurde von Paraffin befreit, in eine Eisen-Hämatoxylin-Lösung für 5 bis 15 min eingetaucht, gewaschen und danach fraktioniert (mit salzsaurem Alkohol). Nachdem die dünne Schnittprobe eine Färbung zeigte, wurde sie in eine 1% Essigsäure, in eine Fast-Green-Lösung für 1 bis 5 min, in eine 1% Essigsäure und danach in eine Safranin-O-Lösung für 3 bis 5 min eingetaucht.

Bei sämtlichen Verbundmaterialien, die die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten enthielten, von denen jede mit der Fähigkeit zur Erzeugung eines des zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten fähigen Wirkstoffs durch Kultivieren in dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium erhalten hat, wurde die Osteogenese beobachtet (siehe 13 bis 24).
Kontrollen, die ein Teil der zur Implantierung zu verwendenden Verbundmaterialien waren, wurden mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert und danach in Paraffin eingebettet. Anschließend wurde eine dünne Schnittprobe von jeder Kontrolle hergestellt und danach angefärbt.
Auf die gleiche Art und Weise wie in diesem Beispiel wurden die Verbundmaterialien unter Verwendung der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt, die in Beispiel 2 und 3 (Ratte), Beispiel 4 und 5 (Mensch), Beispiel 7 (Ratte), Beispiel 9 (Maus) bzw. Beispiel 10 (Kaninchen), hergestellt wurden, anstatt der vorstehenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, und wurden danach unter die Haut von syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert. Auf diese Weise kann die Auswirkung der subkutanen Implantierung jedes Verbundmaterials bewertet werden.
Ferner wurden auf die gleiche Art und Weise wie in diesem Beispiel weitere Verbundmaterialien unter Verwendung von zum Beispiel Hydroxylapatit, PuraMatrix^TM (”catalog number 354250: BD PuraMatrix peptide hydrogel” hergestellt von Becton, Dickinson and Company), Collagen (Schwamm), Gelatine (Schwamm) bzw. Agarose als biokompatible Gerüste anstatt des vorstehenden Collagengels, der Alginsäure und des Matrigel^TM hergestellt und unter die Haut von syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert. Auf diese Weise kann die Auswirkung der subkutanen Implantierung jedes Verbundmaterials bewertet werden.
(Vergleichsbeispiel 13A: Wirkung der subkutanen Implantierung von Verbundmaterial, das unter Verwendung von nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten und einem biokompatiblen Gerüst hergestellt wurde)
Nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten, die auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 1B (Ratte) hergestellt wurden, wurden verwendet. Die nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium oder einem MEM-Wachstumsmedium verdünnt und anschließend wurden Verbundmaterialien auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 13 hergestellt. Als biokompatible Gerüste wurden Collagengel, Matrigel^TM (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bzw. Alginsäure verwendet.
Diese Verbundmaterialien wurden unter die dorsale Haut syngener Tiere implantiert. 4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere getötet und anschließend wurden die implantierten Regionen chirurgisch entfernt und mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert. Nachdem die implantierten Regionen röntgengrafisch und mittels computerisierter Mikrotomographie untersucht wurden, wurden sie in Paraffin eingebettet. Dünne Schnittproben der implantierten Regionen wurden erzeugt und dann mit Hämatoxylin-Eosin (HE), Toluidinblau (TB), Alcianblau (AB) und Safranin O (SO) angefärbt. Anschließend wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet.
Wenn nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten verwendet wurden, wurde keine Osteogenese in dem Verbundmaterial beobachtet, das unter Verwendung eines beliebigen biokompatiblen Gerüsts hergestellt wurde. Die Ergebnisse, die bei Verwendung des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums erhalten wurden, sind in 25 bis 33 gezeigt.
Auf die gleiche Art und Weise wie in diesem Vergleichsbeispiel wurden die Verbundmaterialien unter Verwendung der nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt, die in Vergleichsbeispiel 1D (Ratte), Vergleichsbeispiel 3B (Ratte), Vergleichsbeispiel 4B (Mensch), Vergleichsbeispiel 5B (Mensch), Vergleichsbeispiel 9B (Maus) bzw. Vergleichsbeispiel 10B (Kaninchen) hergestellt wurden, anstatt der vorstehenden nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, und wurden danach unter die Haut von syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert. Auf diese Weise kann die Auswirkung der subkutanen Implantierung jedes Verbundmaterials bewertet werden.
Ferner wurden auf die gleiche Art und Weise wie in diesem Vergleichsbeispiel weitere Verbundmaterialien unter Verwendung von zum Beispiel Hydroxylapatit, PuraMatrix^TM (”catalog number 354250: BD PuraMatrix peptide hydrogel” hergestellt von Becton, Dickinson and Company), Collagen (Schwamm), Gelatine (Schwamm) bzw. Agarose als biokompatible Gerüste anstatt des vorstehenden Collagengels, des Matrigel^TM und der Alginsäure hergestellt und unter die Haut von syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert. Auf diese Weise kann die Auswirkung der subkutanen Implantierung jedes Verbundmaterials bewertet werden.
(Vergleichsbeispiel 13B: Auswirkung der unabhängigen subkutanen Implantierung eines Gerüsts)
Dieses Vergleichsbeispiel wurde auf die gleiche Art und Weise wie Beispiel 13 mit der Ausnahme durchgeführt, dass die Gerüste unabhängig implantiert wurden. Hydroxylapatit, Collagengel, Alginsäure und Matrigel^TM (hergestellt von Becton, Dickinson and Company), die die Gerüste waren, wurden unabhängig unter die Haut syngener Tiere implantiert. Im Ergebnis wurde keine Osteogenese beobachtet (siehe 34).
Auf die gleiche Art und Weise wie in diesem Vergleichsbeispiel wurden zum Beispiel PuraMatrix^TM (”catalog number 354250: BD PuraMatrix peptide hydrogel” hergestellt von Becton, Dickinson and Company), Collagen (Schwamm) und Gelatine (Schwamm) unabhängig unter die Haut von syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren anstatt des vorstehenden Hydroxylapatits, Collagengels, der Alginsäure und des Matrigel^TM implantiert. Auf diese Weise kann die Auswirkung jedes Gerüsts bewertet werden.
(Beispiel 14: Auswirkung der subkutanen Implantierung eines Pellets aus hypertrophierungsfähigen Chondrozyten mit der Fähigkeit zur Erzeugung eines zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten fähigen Wirkstoffs)
(Herstellung des Pellets aus hypertrophierungsfähigen Chondrozyten mit der Fähigkeit zur Erzeugung eines zur Induzierung der Differenzierung zu induzierten Osteoblasten fähigen Wirkstoffs)
Aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium wurde 5 × 10⁵ hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zur Herstellung einer Zellsuspension bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/0,5 ml zugegeben. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert (bei 1000 Upm (170 × g) für 5 min), um Pellets aus den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten mit der Fähigkeit zur Herstellung des Wirkstoffs zu bilden, die die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren können. Diese Pellets wurden bei 37°C für 1 Woche kultiviert (siehe 35A). In dieser Kultur wurde das den Differenzierungswirkstoff erzeugende MEM-Medium verwendet.
Danach wurden diese Pellets unter die dorsale Haut syngener Tiere implantiert. 4 Wochen nach Implantierung wurden die syngenen Tiere getötet und anschließend wurden die implantierten Regionen chirurgisch entfernt und mit 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert. Nachdem die implantierten Regionen röntgengrafisch und mittels computerisierter Mikrotomographie untersucht wurden, wurden sie in Paraffin eingebettet.
Dünne Schnittproben der implantierten Regionen wurden mit einer routinemäßigen Vorgehensweise erzeugt und dann mit Hämatoxylin-Eosin (HE), Toluidinblau (TB), Alcianblau (AB) und Safranin O (SO) auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 13 angefärbt. Anschließend wurde der Zustand der implantierten Regionen bewertet. Wenn die Pellets der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten mit der Aktivität zur Erzeugung des Wirkstoffs, der die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren kann, implantiert wurden, wurde im Ergebnis die Osteogenese in den implantierten Regionen beobachtet (siehe 35C, 35D, 36 und 37).
Auf die gleiche Art und Weise wie in diesem Beispiel wurden die Pellets unter Verwendung der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt, die in Beispiel 2 und 3 (Ratte), Beispiel 4 und 5 (Mensch), Beispiel 7 (Ratte), Beispiel 9 (Maus) bzw. Beispiel 10 (Kaninchen), hergestellt wurden, anstatt der vorstehenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten, und wurden danach unter die Haut von syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert. Auf diese Weise kann die Auswirkung der subkutanen Implantierung jedes Pellets bewertet werden.
(Vergleichsbeispiel 14A: Auswirkung der subkutanen Implantierung eines Pellets aus nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten)
Nicht-hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden verwendet, die auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 1B (Ratte) erhalten wurden. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium wurde 5 × 10⁵ nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zur Herstellung einer Zellsuspension bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/0,5 ml zugegeben. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert (bei 1000 Upm (170 × g) für 5 min), um Pellets aus den nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten zu bilden. Diese Pellets wurden bei 37°C für 1 Woche kultiviert (siehe 35B).
Danach wurden diese Pellets unter die dorsale Haut syngener Tiere implantiert. Ferner wurde die Auswirkung der Implantierung des Pellets aus den nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in jeder implantierten Region auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 14 beobachtet. Im Ergebnis wurde keine Osteogenese in den implantierten Regionen beobachtet (35E, 35F und 38).
Auf die gleiche Art und Weise wie in diesem Vergleichsbeispiel wurden die Pellets unter Verwendung der nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt, die in Vergleichsbeispiel 1D (Ratte), Vergleichsbeispiel 3B (Ratte), Vergleichsbeispiel 4B (Mensch), Vergleichsbeispiel 5B (Mensch), Vergleichsbeispiel 9B (Maus) bzw. Vergleichsbeispiel 10B (Kaninchen) hergestellt wurden, anstatt der vorstehenden nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten. Danach wurden diese Pellets unter die Haut von syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren implantiert. Nach der Implantierung kann die Auswirkung der Implantierung des Pellets aus den nicht-hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in jeder implantierten Region auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 14 beobachtet werden.
(Beispiel 15: Verhältnis zwischen Wirkstoff, der die Differenzierung zu induzierten Osteoblasten induzieren kann und von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten hergestellt wird, und BMP oder TGFβ)
Aus Ratten-Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurde den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten bis zu einer Verdünnung mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² zugegeben.
Die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten wurden kultiviert und anschließend wurde ein Überstand des Mediums in einer Zeitspanne gesammelt. Die TGFβ- und BMP-Assays des Überstands wurden wie folgt durchgeführt und die TGFβ- und BMP-Aktivitäten wurden durch Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität nachgewiesen.
(TGFβ-Assay)
Der TGFβ-Assay des Überstands wurde unter Verwendung eines Verfahrens durchgeführt, das in Nagano, T. et al.: Effect of heat treatment an bioactivities of enamel matrix derivatives in human periodontal ligament (HPDL) cells. J. Periodont. Res., 39: 249–256, 2004, beschrieben ist. HPDL-Zellen wurden in eine 96-Well-Platte bei einer Dichte von 5 × 10 Zellen/Vertiefung geimpft und für 24 h kultiviert. Danach wurde das Kulturmedium durch ein Medium, das 10 nM 1α,25-Dihydroxy-Vitamin D3 enthielt, und den Überstand als Testprobe ersetzt.
Danach wurden die HPDL-Zellen füh 96 h kultiviert, mit PBS gewaschen und anschließend wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität davon gemessen. Spezifisch wurden die HPDL-Zellen mit 10 mM p-Nitrophenylphosphat als Substrat in einem 100 mM 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol-Salzsäure-Puffer (pH 10,0), enthaltend 5 mM MgCl₂, bei 37°C für 10 min umgesetzt. Danach wurde dem Puffer NaOH zugegeben und die Extinktion bei 405 nm gemessen.
Wenn der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden (Kulturüberstand), der 96-Well-Platte als Testprobe zugegeben wurde, betrug die Extinktion etwa 0,1515, etwa 0,2545 und etwa 0,1242 (siehe Tabelle 9 und 11A). (Tabelle 9: TGFβ-Aktivität)

405 nm (OD) SA

1 0,1515 0,01818

2 0,2545 0,00303

3 0,1242 0,03030
(BMP-Assay)
Der BMP-Assay des Überstands wurde unter Verwendung eines Verfahrens durchgeführt, das in Iwata, T. et al.: Noggin Blocks Osteoinductive Activity of Porcine Enamel Extracts. J. Dent. Res., 81: 387–391, 2002, beschrieben ist. ST2-Zellen wurden in eine 96-Well-Platte bei einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung geimpft und für 24 h kultiviert. Danach wurde das Kulturmedium durch ein Medium, das 200 nM all-trans-Retinolsäure enthielt, und den Überstand als Testprobe ersetzt.
Danach wurden die ST2-Zellen für 72 h kultiviert, mit PBS gewaschen und anschließend wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität davon gemessen. Spezifisch wurden die ST2-Zellen mit 10 mM p-Nitrophenylphosphat als Substrat in einem 100 mM 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol-Salzsäure-Puffer (pH 10,0), enthaltend 5 mM MgCl₂, bei 37°C für 8 min umgesetzt. Danach wurde dem Puffer NaOH zugegeben und die Extinktion bei 405 nm gemessen.
Wenn der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, der 96-Well-Platte als Testprobe zugegeben wurde, betrug die Extinktion etwa 0,05, etwa 0,075 und etwa 0,075 (siehe Tabelle 10 und 11B). (Tabelle 10: BMP-Aktivität)

405 nm (OD) SA

1 0,0500 0,0188

2 0,0750 0,0125

3 0,0750 0,0063
Die TGFβ-Aktivität wurde in dem Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums beobachtet, das einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthielt. Es wurde belegt, das TGFβ in diesem Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums vorhanden war (siehe 11A). Andererseits wurde die BMP-Aktivität nur mäßig beobachtet (siehe 11B).
Obwohl der BMP-Pfad bei Vorhandensein von TGFβ unterdrückt wird, stieg die alkalische Phosphatase-Aktivität der Zellen, sogar wenn der Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, enthaltend das TGFβ, den Zellen zugegeben wurde. Gemäß dem Ergebnis wird angenommen, dass die Steigerung der alkalischen Phosphatase-Aktivität der Zellen durch den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff induziert wurde, der nicht das BMP war.
(Beispiel 16: Untersuchung der Fähigkeit zur Induktion undifferenzierter Zellen zu Osteoblasten in Verbundmaterial, das unter Verwendung von die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierendem Wirkstoff und biokompatiblem Gerüst hergestellt wurde.)
In diesem Beispiel wurden hypertrophierungsfähige Chrondrozyten in einem den MEM-Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium kultiviert, und dann wurde der Überstand davon im Laufe von 4 Tagen bis 3 Wochen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gesammelt, um Überstandsfraktionen zu erhalten. Als Nächstes wurden die Überstandfraktionen jeweils in ein Zentrifugenfilter verbracht und dann bei 4000 × g und bei 4°C 30 Minuten unter einer solchen Bedingung zentrifugiert, dass eine hochmolekulare Fraktion und eine niedermolekulare Fraktion voneinander getrennt wurden.
Auf diese Weise wurde jede Überstandfraktion in eine hochmolekulare Fraktion und eine niedermolekulare Fraktion von 50000 oder höher und einer niedermolekularen Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50000 oder niedriger aufgetrennt, und gleichzeitig wurde die hochmolekulare Fraktion 10fach konzentriert. Anschließend wurde diese konzentrierte hochmolekulare Fraktion (Mediumüberstand) unter Verwendung eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums 5- bis 6fach verdünnt, um einen verdünnte Lösung zu erhalten. Bei der Zentrifugation wurde ein 50K-Fil („Amicon Ultra 15, 50000 NMVVL, Katalog-Nr. UFC905024”, hergestellt von Millipore-Corporation) verwendet.
Die superporösen Hydroxylapatitteilchen mit jeweils einer Größe von 3 mm² (APACERAM AX Füllstoff: Charge 03231710) und die Verdünnungslösung mit einer solchen Menge, dass der APACERAM AX vollständig darin eingetaucht ist (z. B. 1 ml der verdünnten Lösung auf 10 Hydroxylapatitteilchen) wurden in eine Spritze aufgezogen. In diesem Zustand wurde der Kolben der Spritze so gezogen, dass die Hydroxylapatitteilchen entgast wurden. Dann wurden die Hydroxylapatitteilchen mit etwa 0,3 ml der verdünnten Lösung imprägniert.
Als Nächstes wurden Maus-C3H10T1/2-Zellen in eine 94-Well-Platte bei einer Dichte von 1,25 × 10⁴ Zellen/cm² überimpft. 18 Stunden nach der Beimpfung wurden die superporösen Hydroxylapatitteilchen, an denen der vorstehend erzeugte, die Osteoblastendifferenzierung induzierende Wirkstoff anhaftete, der 24-Well-Platte in einer Menge von 10 Teilchen pro 1 Well zugesetzt. Als Medium zur Kultivierung der Maus-C3H10T1/2-Zellen wurde ein BME-Medium verwendet. Nach 72 Stunden wurden die Hydroxylapatitteilchen aus der 24-Well-Platte entnommen, und dann wurde die alkalische Phosphataseaktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
(Vergleichsbeispiel 11)
APACERAM AX, eingetaucht nur in ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium (1 ml), wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 16 hergestellt. Als Nächstes wurden Maus-C3H10T1/2-Zellen (in BME-Medium) in eine 24-Well-Platte bei einer Dichte von 1,25 × 10⁴ Zellen/cm auf die gleiche Weise wie Beispiel 11 überimpft. 18 Stunden nach der Beimpfung wurden die APACERAM AX, eingetaucht in das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium (10 Teilchen/Well), die APACERAM AX allein und das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium allein der 24-Well-Platte zugesetzt.
Nach 72 Stunden wurden sie aus der 24-Well-Platte entnommen, und dann wurde die alkalische Phosphataseaktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Weiterhin wurden RNAs daraus auf die gleiche Weise wie in Beispiel 16 extrahiert.

Als ein Ergebnis betrug, wenn ein Wert der alkalischen Phosphataseaktivität der Maus-C3H10T1/2-Zellen, die durch Zugabe nur des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums kultiviert wurden, als ”1” definiert wurde, ein Wert der alkalischen Phosphataseaktivität 5,8 durch Zugabe der APACERAM AX, eingetaucht in einen Überstand eines Mediums, das einen die Differenzierung von induzierten Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthielt (Kulturüberstand), er betrug 1,4 durch Zugabe der APACERAM AX, eingetaucht in das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium, und er betrug 1,4 durch Zugabe nur der APACERAM AX (siehe Tabelle 11, 12). Tabelle 11

	1	2	3	Mittelwert	SD	Relativwert
Wirkstoff + Apatit	0,107	0,086	0,105	0,099	0,012	5.8
Differenzierungsmedium + Apatit	0,024	0,025	0,024	0,024	0,001	1.4
Nur Apatit	0,023	0,024	0,024	0,024	0,001	1.4
Nur Differenzierungsmedium	0,011	0,019	0,021	0,017	0,005	1

Wirkstoff + Apatit: APACERAM AX, eingetaucht in den Überstand des Mediums, das den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthielt (Kulturüberstand)
Differenzierungsmedium + Apatit: APACERAM AX, eingetaucht in das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium
Nur Apatit: APACERAM AX allein
Nur Differenzierungsmedium: MEM-Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium allein

(Beispiel 17: Auswirkung der Implantation von Kompositmaterial, das unter Verwendung des die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs und von biokompatiblem Gerüst hergestellt wurde, in eine Region mit Knochendefekt und unter die Haut.
Herstellung des Verbundmaterials
Hypertrophierungsfähige Chrondrozyten wurden aus 4 Wochen alten männlichen Ratten (Wistar) bzw. 8 Wochen alten männlichen Ratten (Wistar) auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gesammelt. Die hypertrophierungsfähigen Chrondrozyten wurden in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium kultiviert, und dann wurde ein Überstand davon gesammelt.
Dieser Überstand wurde bei 4000 × g und bei 4°C 30 Minuten unter Verwendung einer 50K-Folie („Amicon Ultra 15, 50000NMWL, Katalog-Nr. UFC905024”, hergestellt von Millipore-Corporation) zentrifugiert. Auf diese Weise wurde eine niedermolekulare Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50000 oder geringer entfernt, und eine hochmolekulare Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50000 oder höher wurde 10fach konzentriert, um eine konzentrierte Lösung zu erhalten.
Diese konzentrierte Lösung wurde gefriergetrocknet, um ein gefrorenes Produkt zu erhalten, und dann wurde das gefrorene Produkt getrocknet, während es zentrifugiert wurde, und unter Verwendung einer elektrischen Mahlanlage zerkleinert („Cryo Press CP-100W”, hergestellt von Microtec Nition), um ein zerkleinertes trockenes Produkt zu erhalten. Anschließend wurden 30 mg des zerkleinerten trockenen Produkts gesammelt und zur Herstellung von Verbundmaterialien verwendet.
Als Gerüst wurde Collagen-Gel, das unter Verwendung eines Collagen-Kits („Collagen Gel Culture Kit”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.) hergesstellt wurde, verwendet. Speziell wurden die Verbundmaterialien durch Mischen von 0,8 ml einer sauren Collagen-Lösung, 0,1 ml eines Puffers zur Rekonstitution (enthaltend 260 mM NaHCO₃, 20 mM HEPES und 50 mM NaOH), und 30 mg des zerkleinerten Produkts miteinander vermischt, um ein Gemisch zu erhalten, und dann Erhitzen des Gemisches bei 37°C hergestellt. Die Größe der Verbundmaterialien betrug 1 bis 1,5 cm³. Die Verbundmaterialien wurde jeweils der Größe einer defekten, zu implantierenden Region entsprechend zugeschnitten.
(Bildung einer Region mit Knochendefekt)
Jedes der zur Implantierung vorgesehenen syngenen Tiere oder immundefizienten Tiere wurde betäubt. Anschließend wurde die Haut über dem Femur oder der Tibia aseptisch eingeschnitten und danach wurde ein kartilaginäres Gewebe weggeklappt, um die vorgesehene Region mit Knochendefekt zu exponieren, oder die Haut über dem Schädel wurde eingeschnitten, um die vorgesehene Region mit Knochendefekt zu exponieren. Eine perforative oder disjunktive Region mit Knochendefekt wurde in jedem Tier unter Verwendung einer Bohrstange oder -scheibe eines Dentalbohrers gebildet.
(Implantierung in eine Region mit Knochendefekt)
In diesem Beispiel wurde der Femur 4 Wochen nach Implantierung chirurgisch entfernt. Danach wurde eine osteogene Fähigkeit durch Messung mittels computerisierter Mikrotomographie und Herstellung von Präparaten bewertet.
Unter Verwendung des obigen Verfahrens wurde eine Region mit Knochendefekt mit einem Durchmesser von 3 mm und einer Tiefe von 1 bis 2 mm im Femur von 12 Wochen alten männlichen Wistar-Ratten gebildet. Das obige Verbundmaterial wurde in die Region mit Knochendefekt implantiert. Das Ergebnis davon ist in 40A gezeigt.
(Verfahren zur Bildung einer subkutanen Tasche)
Jedes der zur Implantierung vorgesehenen syngenen Tiere oder immundefizienten Tiere wurde betäubt und die Haut zur Bildung einer offenen Wunde aseptisch eingeschnitten. Eine Rundschere wurde subkutan durch die offene Wunde eingeführt, um die Haut von dem subkutanen Gewebe zu trennen. Auf diese Weise wurde eine subkutane Tasche in jedem Tier gebildet.
(Implantierung unter die Haut]
Unter Verwendung des obigen Verfahrens wurde eine subkutane Tasche mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm unter der Haut von 10 Wochen alten männlichen Wistar-Ratten gebildet. Das obige Verbundmaterial wurde unter deren Haut implantiert. Anschließende wurde deren osteogene Fähigkeit bewertet.
(Micro-CT)
Auf der Grundlage eines Routineverfahrens wurde operativ entfernte Proben mit einem 10% neutralen Formalinpuffer fixiert, um fixierte Proben zu erhalten. Die fixierten Proben werden durch Micro-CT abgebildet, um CT-Bilder zu erhalten, und dann werden die CT-Bilder unter Verwendung einer neuen Knochenmasse-Meßsoftware ausgewertet.
(Präparation)
Auf der Grundlage eines Routineverfahrens wurden die fixierten Proben in Paraffin eingebettet, und dann wurden Scheibenproben davon hergestellt.. Die Osteogenese wurde durch Anfärben der erzeugten dünnen Scheibenproben bestimmt.
Weiterhin wurden Verbundmaterialien unter Verwendung der in der folgenden Tabelle 12 angegebenen Gerüste nach dem obigen Verfahren hergestellt und dann unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekten von Ratten implantiert.

In jedem der unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekten implantierten Verbundmaterialien wurde deren ostengen Fähigkeit bewertet. (Tabelle 12)

Gerüst	Zusammensetzung
Poröses Hydroxylapatit	”APACERAM mit Porosität 50%”, hergestellt von HOYA CORPORATION
Super-poröses Hydroxylapatit	”APACERAM mit Porosität 85%”, hergestellt von HOYA CORPORATION
Super-poröses Hydroxylapatit	”3D Scaffold”, hergestellt von BD Corporation
Apatit-Collagen-Gemisch	”APACERAM GRANULE”, hergestellt von HOYA CORPORATION + ”Collagen Gel”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.
Apatit-Collagen-Komplex	”APACOLLA”, hergestellt von HOYA CORPORATION
Collagen-Gel	”Collagen Gel”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.
Collagen-Schwamm	”Collagen Sponge”, hergestellt von Nitta Gelatin Inc.
Gelatine-Schwamm	”Hemostatic Gelatin Sponge”, hergestellt von Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
Fibrin-Gel	”Beriplast P”, hergestellt von Nipro
Synthetisches Peptid	”Pramax”, hergestellt von 3D Matrix Corporation
Gemisch aus extrazellulärer Matrix	”Matrigel, hergestellt von BD Corporation
Alginat	”Kelton LVCR”, hergestellt von Kelco Corporation
Agarose	”Agarose”, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
Polyglycolsäure	”Polyglycolsäure”, hergestellt von COREFRONT Corporation
Polymilchsäure	”Polymilchsäure”, hergestellt von COREFRONT Corporation
PolyglycolsäurePolymilchsäure-Copolymer	”Polyglycolsäure-Polymilchsäure-Copolymer”, hergestellt von COREFRONT Corporation

In jedem Verbundmaterialien, die unter Verwendung der in Tabelle 12 genannten und unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekten implantierten Gerüste hergestellt wurden, kann die Osteogenese unter bewertet werden.
(Vergleichsbeispiel A: Auswirkung der unabhängigen subkutanen Implantierung eines Gerüsts unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt von syngen eine Region mit Knochendefekt))
Die in Tabelle 12 aufgeführten Gerüste werden unabhängig unter die Haut und in Regionen mit Knochendefekt von syngenen Tieren oder immundefizienten Tieren auf die gleiche Weise wie in Beispiel 17 implantiert. Auf diese Weise kann bestimmt werden, ob Osteogenese festgestellt wird.
Wenn das Gerüst unabhängig in die Region mit Knochendefekt implantiert wird, wird Osteogenese induziert. Eine osteogene Menge davon wird mit derjenigen eines Falls verglichen, dass das Verbundmaterial, das den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff, der von den hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird, und das Gerüst enthält, auf die gleiche Weise wie Beispiel 17 hinein implantiert wird.
(Beispiel 18: Induktion von Osteoblasten unter Verwendung des die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird)
(Herstellung des die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird) In diesem Beispiel wurden die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium kultiviert und anschließend wurde ein Überstand davon wurde zur Gewinnung von Überstandsfraktionen in einer Zeitspanne von 4 Tagen bis 3 Wochen gesammelt. Als nächstes wurden die Überstandsfraktionen jeweils in ein Zentrifugenfilter gegeben und anschließend bei 4.000 × g und bei 4°C für 30 min unter einer solchen Bedingung zentrifugiert, dass eine hochmolekulare Fraktion und eine niedermolekulare Fraktion von einander getrennt wurden.
So wurde jeder partielle Überstand in eine hochmolekulare Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder höher und eine niedermolekulare Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder weniger aufgetrennt und gleichzeitig wurde die hochmolekulare Fraktion 10-fach konzentriert. Danach wurde diese konzentrierte hochmolekulare Fraktion (Mediumüberstand) mit einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium auf das 5-Fache verdünnt. Bei der Zentrifugation wurde eine 50K-Folie (”Amicon Ultra 15, 50,000NMWL, catalog number: UFC905024”, hergestellt von Millipore Corporation) verwendet.
(Herstellung von undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmark)
4 Wochen alte männliche Wistar-Ratten wurden unter Verwendung von Chloroform getötet. Die Oberschenkel der Ratten wurden unter Verwendung eines Rasierapparates rasiert, und ihre ganzen Körper wurden zur Desinfizierung in Hibitan-Lösung (10-fach verdünnt) eingetaucht. Die Oberschenkel der Ratten wurden eingeschnitten und die Femora chirurgisch aseptisch entnommen. Danach wurden beide Epiphysen-Regionen jedes Femurs zur Gewinnung der Diaphysen entfernt.
10 bis 15 ml eines MEM-Wachstumsmediums (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) wurden in eine Spritze mit Nadel gegeben und anschließend in die gewonnenen Diaphysen über die Nadel eingespritzt, so dass das Knochenmark darin mit dem Medium ausgespült wurde, um eine Knochenmarklösung zu gewinnen.
Die Knochenmarksuspension wurde in einen T-75-Kolben (hergestellt von Becton, Dickinson and Company) bis zur Einstellung einer Endmenge von 30 ml geimpft. Diese Knochenmarksuspension wurde für 1 Woche bei 37°C kultiviert. Als Medium wurde ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium verwendet. Eine Hälfte des Mediums wurde zweimal pro Woche durch ein neues Medium ersetzt. 1 Woche nach dem Kultivieren wurden die an der Bodenfläche des T-75-Kolbens anhaftenden Zellen als undifferenzierte mesenchymale Stammzellen bestimmt.
Diese Zellen wurden mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung nach Dulbecco (”D-PBS, catalog number: 14190”, hergestellt von Invitrogen Corporation) gewaschen und aus dem T-75-Kolben mit einer 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung (hergestellt von Invitrogen Corporation) abgetrennt. Danach wurden die Zellen gesammelt und durch Zentrifugation bei 170 × g für 3 min gewaschen und anschließend verwendet.
(I: Direkte Zugabe des die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird)
Die in diesem Beispiel hergestellten und aus Knochenmark stammenden undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen wurden in Vertiefungen bei einer Dichte von 1 × 10^–5 Zellen/ml/Vertiefung geimpft und dann in einem MEM-Wachstumsmedium (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) über Nacht (für 18 h) kultiviert.
Nach dem Kultivieren wurde 1 ml eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums (enthaltend essenzielles Minimalmedium (MEM), 15% FBS (fötales Rinderserum), 10 nM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B) mit dem Wirkstoff oder eines den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums ohne Wirkstoff (den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium allein) den Vertiefungen zugegeben und anschließend wurden die mesenchymalen Stammzellen für 72 h weiter kultiviert.
Danach wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität, die eine von den Osteoblasten-Markern ist, der mesenchymalen Stammzellen gemessen. Die Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 13 gezeigt. (Tabelle 13)

1 2 3 Mittelwert Relativer Wert

Wirkstoff (+) 0,208 0,226 0,299 0,244 2,17

Wirkstoff (–) 0,120 0,111 0,107 0,113 1

Wirkstoff (+): Gruppe mit dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium mit Wirkstoff.
Wirkstoff (–): Gruppe mit dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium ohne Wirkstoff (den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium allein).

Es wurde bestätigt, dass ein die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierender Wirkstoff, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird, die alkalische Phosphatase-Aktivität der aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen steigern konnte.
(II: Zugabe des die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird, der auf Hydroxylapatit imprägniert ist)
(Herstellung von Hydroxylapatit)
Als Hydroxylapatit wurde APACERAM AX (hergestellt von HOYA CORPORATION, Artificial bone AB-01, GA-3) verwendet. Eine verdünnte Lösung mit einer solchen Menge, dass das APACERAM AX vollständig darin eingetaucht wurde (z. B. 1 ml der verdünnten Lösung pro 10 Hydroxylapatit-Teilchen), und das APACERAM AX wurden in eine Spritze gegeben. In diesem Zustand wurde der Kolben der Spritze derart angezogen, dass das APACERAM AX entgast wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurden etwa 0,3 ml der verdünnten Lösung in die Hydroxylapatit-Teilchen imprägniert.
Die in diesem Beispiel hergestellten und aus Knochenmark stammenden undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen wurden in Vertiefungen bei einer Dichte von 1 × 10^–5 Zellen/ml/Vertiefung geimpft und dann in einem MEM-Wachstumsmedium über Nacht (für 18 h) kultiviert. Danach wurde ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium mit dem Wirkstoff oder ein den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium ohne Wirkstoff (den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium allein), das in das APACERAM AX imprägniert wurde, den Vertiefungen zugegeben, in die in diesem Beispiel kultivierten mesenchymalen Stammzellen geimpft wurden, und anschließend wurden sie für 72 h weiter kultiviert.
Danach wurde die alkalische Phosphatase-Aktivität, die eine von den Osteoblasten-Markern ist, der mesenchymalen Stammzellen gemessen. Die Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 14 gezeigt. (Tabelle 14)

1 2 3 Mittelwert Relativer Wert

Wirkstoff (+) 0,169 0,153 0,191 0,171 2,15

Wirkstoff (–) 0,085 0,077 0,077 0,080 1

Wirkstoff (+): Gruppe mit dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium mit Wirkstoff, das in APACERAM AX imprägniert wurde.
Wirkstoff (–): Gruppe mit dem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium ohne Wirkstoff (den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium allein), das in APACERAM AX imprägniert wurde.

Es wurde bestätigt, dass ein die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierender Wirkstoff, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird, die alkalische Phosphatase-Aktivität der aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen steigern konnte.
(Beispiel 19: Auswirkung der Implantation von Verbundmaterial, das unter Verwendung des die Osteoblastendifferenzierung induzierenden Wirkstoffs und biokompatiblem Gerüst hergestellt wurde, in eine Region mit Knochendefekt)
Herstellung des Verbundmaterials
Hypertrophierungsfähige Chrondrozyten wurden aus 4 Wochen alten männlichen Ratten (Wistar) bzw. 8 Wochen alten männlichen Ratten auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gesammelt. Die hypertrophierungsfähigen Chrondrozyten wurden in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium kultiviert, und dann wurde ein Überstand davon gesammelt.
Dieser Überstand wurde bei 4000 × g und bei 4°C 30 Minuten unter Verwendung einer 50K-Folie („Amicon Ultra 15, 50000NMWL, Katalog-Nr. UFC905024”, hergestellt von Millipore-Corporation) zentrifugiert. Auf diese Weise wurde eine niedermolekulare Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50000 oder geringer entfernt, und eine hochmolekulare Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50000 oder höher wurde 10-fach konzentriert, um eine konzentrierte Lösung zu erhalten.
Diese konzentrierte Lösung wurde gefriergetrocknet, um ein gefrorenes Produkt zu erhalten, und dann wurde das gefrorene Produkt getrocknet, während es zentrifugiert wurde, und unter Verwendung eines elektrischen Mahlgeräts („Cryo Press CP-100W”, hergestellt von Microtec Nition), zerkleinert, um ein zerkleinertes trockenes Produkt zu erhalten. Anschließend wurden 30 mg des zerkleinerten trockenen Produkts gesammelt und zur Herstellung der Verbundmaterialien verwendet.
0,8 ml einer Collagen-Lösung (Cell Matrix, Collagen Gel Culture Kit, hergestellt von Nitta Gelatin Inc., Osaka), 0,1 ml eines Rekonstitutionspuffers (enthaltend 260 mM NaHCO₃, 20 mM HEPES und 50 nM NaOH) und 30 mg zerkleinertes trockenes Produkt (gefriergetrocknetes Produkt) wurden miteinander vermischt, um etwa 1 ml eines Gemisches zu erhalten. Das Gemisch wurde dreigeteilt und in drei Zellkultureinsätze einer 24-Well-Kulturplatte (PET-Folien mit jeweils einer Porengröße von 0,4 μm, „Falcon”, hergestellt von Becton Dickinson and Company, Auckland, NZ) aufgebracht und dann verfestigt. Der Boden von jeder der Zellkultureinsätze wurde mit MEM-Wachstumsmedium (hergestellt von Invitrogen Corporation, Franklin, NJ) befüllt und dann über Nacht bei 37°C aufbewahrt.
Am folgenden Tag wurde jede der 12 Wochen alten männlichen Wistar-Ratten (von Japan Laboratory Animals, Inc. bezogen) anästhesiert. Anschließend wurde die Haut davon außerhalb des Femurs aseptisch eingeschnitten, und dann wurde das Knorpelgewebe zurückgebogen, um eine zu bildende Region mit Knochendefekt zu exponieren. Eine Region mit Knochendefekt mit einem Durchmesser von 3,0 oder 2,5 mm wurde in dem Femur (Diaphysen-naher distaler lateraler Epicondylus) unter Verwendung einer Hohlnadel (hergestellt von Micro Seiko Co., Ltd.) gebildet.
(Implantation in die Region mit Knochendefekt)
Ein Gemisch des zerkleinerten trockenen Produkts und des Collagen-Gels wurden in die vorstehend gebildete Region mit dem Knochendefekt implantiert. Eine weitere Region mit dem Knochendefekt mit der gleichen Größe wie die der obigen Region mit Knochendefekt wurde in der Diaphyse eines gegenüberliegenden Femur-nahen distalen lateralen Epicondylus gebildet. Nur das Collagen-Gel (das unter Verwendung von 0,1 ml der MEM-Lösung über Nacht bei 37°C anstelle des zerkleinerten trockenen Produkts gelagert wurde) wurde in die Region mit dem Knochendefekt des gegenüberliegenden Femurs implantiert.
Computer-Mikrotomographie
Als ein Microcomputer-Tomographiegerät wurde ein hochauflösender Röntgen-Micro-CT Scanner („SKYSCAN1172”, hergestellt von TOYO Corporation) verwendet. Die Regionen mit Knochendefekten wurden jeweils bei 100 KV röntgenografiert, während sie bei jedem 4. Grad zur Gewinnung röntgengrafischer Daten gedreht wurden, und anschließend wurden die röntgengrafischen Daten unter Verwendung von NRecon, die eine gebündelte Software ist, umstrukturiert und ein dreidimensionales Bild wurde unter Verwendung einer dreidimensionalen Volumendarstellungssoftware („VGStudio Max”, hergestellt von Nihon Visual Science, Inc.) erhalten.
(Morphologische Beobachtung)
HE-Färben: Eine dünne Scheibenprobe von jeder Region mit Knochendefekt wurde deparaffiniert und 5–10 Minuten in eine Hamatoxylin-Lösung eingetaucht und dann abgespült. Nach dem Erzeugen einer Farbe der dünnen Scheibenprobe wurde sie 3 bis 5 Minuten in eine Eosin-Lösung eingetaucht.
(Vergleichsbeispiel)
Eine weitere Region mit Knochendefekt mit der gleichen Größe wie diejenigen der obigen Region mit Knochendefekt wurde in der Diaphyse eines gegenüberliegenden Femur-nahen distal lateralen Epicondylus gebildet. Nur das Collagen-Gel (das unter Verwendung von 0,1 ml der MEM-Lösung über Nacht bei 37°C anstelle des zerkleinerten getrockneten Produkts gelagert wurde) wurde in die Region mit Knochendefekt des gegenüberliegenden Femurs implantiert.
Die Microcomputer-Tomographie und die morphologische Beobachtung wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 19 durchgeführt.
(Ergebnisse)

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 15 gezeigt. Sowohl in der Region mit Knochendefekt mit dem Durchmesser von 3,0 mm als auch in der Region mit Knochendefekt mit dem Durchmesser von 2,5 mm war der Prozentsatz von neuem Knochen von einer Gruppe, in die das unter Verwendung des Wirkstoffs und des Collagen-Gels erzeugte Kompositmaterial in die Region mit Knochendefekt implantiert wurde, höher als derjenige einer Gruppe, in die nur das Collagen-Gel in die Region mit Knochendefekt implantiert wurde. (Tabelle 15)

		ROI-Volumen _[ _mm3_]	Neues Knochenvolumen [mm³]	Prozentsatz neuer Knochen [%]
Versuch 1	Nr. 1 Col	7,29	2,24	30,73
	Nr. 1 GC	7,27	2,95	40,59
	Nr. 2 Col	7,24	2,10	29,04
	Nr. 2 GC	7,25	2,22	30,65
	Nr. 3 Col	7,29	2,02	27,68
	Nr. 3 GC	7,26	2,52	34,74
Versuch 2	Nr. 1 Col	Fraktur
	Nr. 1 GC	7,26	3,26	44,96
	Nr. 2 Col	7,22	2,01	27,90
	Nr. 2 GC	7,26	3,07	42,28
	Nr. 3 Col	7,24	2,05	28,30
	Nr. 3 GC	6,62	3,23	48,87
Versuch 3	Nr. 1 Col	4,99	1,95	39,08
	Nr. 1 GC	4,99	2,06	41,41
	Nr. 2 Col	5,01	2,49	49,66
	Nr. 2 GC	4,99	2,81	56,38
	Nr. 3 Col	4,97	2,00	40,16
	Nr. 3 GC	5,01	2,70	53,96
Versuch 4	Nr. 1 Col	4,99	1,80	36,11
	Nr. 1 GC	4,97	2,08	41,76
	Nr. 2 Col	4,99	1,91	38,29
	Nr. 2 GC	5,02	2,53	50,49
	Nr. 3 Col	5,01	2,45	48,96
	Nr. 3 GC	4,99	2,67	53,53

Probe: Es wurden vier Versuche durchgeführt. In den Versuchen 1 und 2 wurde jeweils eine Gruppe, in der Regionen mit Knochendefekt mit jeweils einem Durchmesser von 3,0 mm ausgebildet waren, verwendet. In den Versuchen 3 und 4 wurde jeweils eine Gruppe, in der die Regionen mit Knochendefekt jeweils mit einem Durchmesser von 2,5 mm gebildet wurden, verwendet.
„Nr.” bedeutet, dass in jedem Versuch eine Ratte mit der Nummer verwendet wurde. In jedem Versuch wurden drei Ratten (n = 3) verwendet.
Col: Die Regionen mit Knochendefekt wurden in den beidseitigen Oberschenkelknochen einer identischen Ratte gebildet, und dann wurde Col (nur das Collagen) in eine der Regionen mit Knochendefekt implantiert.
GC: Die Regionen mit Knochendefekt wurden in den beidseitigen Oberschenkelknochen einer identischen Ratte gebildet, und dann wurde GC (der Wirkstoff und das Collagen) in eine der Regionen mit Knochendefekt implantiert.
ROI-Volumen: Volumen der analysierten Region

Beispiel 20A: (Wirkung des Wirkstoffs auf die Induktion der Differenzierung von undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen aus Ratten-Knochenmark zu Osteoblasten)
(Nachweis des Wirkstoffs, der von aus Ratten-Knochenmark stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird)
In diesem Beispiel wurde ein zellfunktionsregulierender Wirkstoff hergestellt, indem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 kultiviert wurden.
(Gewinnung von aus Ratten-Knochenmark stammenden undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen)
Zellen wurden aus dem Femur-Knochenmark von Ratten gewonnen und auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 18 für 1 Woche zur Gewinnung einer Zelllösung kultiviert. 1 ml einer Zelllösung von 2,5 × 10^–4 Zellen/ml wurde in eine 24-Well-Platte geimpft und dann wurden die Zellen in einem MEM-Wachstumsmedium kultiviert. Auf diese Weise wurden die aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen hergestellt.
(Zugabe der Probe und Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität)
Nachdem die aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen in MEM-Wachstumsmedium für 18 h kultiviert wurden, wurde 1 ml von jeder der folgenden Probelösungen den aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen zugegeben. Anschließend wurden die aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen für 72 h kultiviert und die alkalische Phosphatase-Aktivität der Zellen wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
(Zugegebene Probenlösung)

(1) Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden; den Differenzierungswirkstoff erzeugendes Medium mit Wirkstoff.
(2) Nur den Differenzierungswirkstoff erzeugendes MEM-Medium; Medium ohne Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung, jedoch mit Dexamethason; Osteoblasten-Differenzierungsmedium nach Maniatopouros.
(3) Nur MEM-Wachstumsmedium; MEM-Wachstumsmedium ohne Wirkstoff und ohne Dexamethason.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen, die durch Zugabe des Überstands kultiviert wurden, der den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthielt, wurde um mehr als das 2-Fache des Wertes der mesenchymalen Stammzellen gesteigert, die durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums ohne Wirkstoff und ohne Dexamethason kultiviert wurden.
Wenn andererseits die aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums mit Dexamethason, jedoch ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff, kultiviert wurden, stieg die alkalische Phosphatase-Aktivität der Zellen. Allerdings war die Steigerung der alkalischen Phosphatase-Aktivität gering im Vergleich mit der der mesenchymalen Stammzellen, die durch Zugabe des Überstands mit dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff kultiviert wurden.
Aus den Ergebnissen der 8 und dergleichen ist es unwahrscheinlich, dass herkömmliche niedermolekulare Komponenten (einschließlich Dexamethason) in dem Überstand enthalten sind, der den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff beinhaltet. Deshalb wird angenommen, dass die Wirkung, die aus der Zugabe des Überstands mit dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff resultiert, von dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff selbst erzielt wurde.
Daher wird aus den Ergebnissen in diesem Beispiel angenommen, dass der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff eine stärkere Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung zu Osteoblasten besitzt als die des Dexamethasons, das eines von den herkömmlichen die Osteoblasten-Differenzierung induzierenden Komponenten ist. (Tabelle 16) ALP (Ext. 405), 72 h (3 Tage) nach Zugabe des Überstands

Zugegebene Probe 1 2 3 Mittelwert Relativer Wert

Zugabe von Überstand (1) 0,688 0,665 0,686 0,680 2,1

Nur Medium (2) 0,426 0,420 0,490 0,445 1,4

(3) 0,324 0,270 0,364 0,321 1
(Beispiel 20B: Auswirkung des Überstands des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden, auf die aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen)
In diesem Beispiel wurde der Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden, auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 1A gewonnen.
Aus primärem Ratten-Knochenmark stammende Stammzellen wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 18 hergestellt.
(Zugabe der Probe und Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität)
Nachdem die aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen in MEM-Wachstumsmedium füh 18 h kultiviert wurden, wurde 1 ml von jeder der folgenden Probelösungen den aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen zugegeben. Anschließend wurden die aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen für 72 h kultiviert und die alkalische Phosphatase-Aktivität der Zellen wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
(Zugegebene Probenlösung)

GC/Differenzierung: die zugegebene Probenlösung ist ein Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
GC/Wachstum: die zugegebene Probenlösung ist ein Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
Wachstum: die zugegebene Probenlösung ist ein MEM-Wachstumsmedium.

Die Ergebnisse davon sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Es wurde bestätigt, dass der Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen steigern kann, in dem Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, vorhanden war, aber der Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen steigern kann, war in dem Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, nicht vorhanden. (Tabelle 17) Zellen: rMSC (Ratte)

1 2 3 Mittelwert Relativer Wert

GC/Differenzierung 0,688 0,665 0,686 0,680 2,120

GC/Wachstum 0,192 0,184 0,151 0,176 0,548

Nur Wachstum 0,324 0,274 0,364 0,321 1,000
Es ist auf die gleiche Art und Weise wie in diesem Beispiel ebenfalls möglich, die Auswirkung eines Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums, in dem die aus Ratten stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, auf die aus primärem Ratten-Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen zu bestätigen.
(Beispiel 21A: Auswirkung des Wirkstoffs auf die Induzierung der Differenzierung von menschlichen undifferenzierten mesenchymalen Stammzellen zu Osteoblasten)
(Nachweis des Wirkstoffs, der von aus Ratten stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird)
In diesem Beispiel wurde ein zellfunktionsregulierender Wirkstoff hergestellt, indem aus Costa/costal-Knorpel stammende hypertrophierungsfähige Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Medium auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 kultiviert wurden.
(Herstellung von menschlichen mesenchymalen Stammzellen)
Ein menschlicher mesenchymaler Stammzellenstamm (hMSC: ”PT-2501”) wurde von Cambrex Corporation bezogen und für 1 Woche zur Gewinnung einer Zelllösung kultiviert. 1 ml einer Zelllösung von 2,5 × 10^–4 Zellen/ml wurde in eine 24-Well-Platte geimpft und dann wurden die Zellen in einem MSCGM-Medium (Wachstumsmedium) kultiviert.
(Zugabe der Probe und Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität)
Nachdem die menschlichen mesenchymalen Stammzellen in MSCGM-Medium für 18 h kultiviert wurden, wurde 1 ml von jeder der folgenden Probelösungen den menschlichen mesenchymalen Stammzellen zugegeben. Anschließend wurden die menschlichen mesenchymalen Stammzellen für 72 h kultiviert und die alkalische Phosphatase-Aktivität der Zellen wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
(Zugegebene Probenlösung)

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Der Wert der alkalischen Phosphatase-Aktivität der menschlichen mesenchymalen Stammzellen, die durch Zugabe des Überstands kultiviert wurden, der den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthielt, wurde um mehr als das 5-Fache des Wertes der menschlichen mesenchymalen Stammzellen gesteigert, die durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums ohne Wirkstoff und ohne Dexamethason kultiviert wurden.
Wenn andererseits die menschlichen mesenchymalen Stammzellen nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums mit Dexamethason, jedoch ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff, kultiviert wurden, stieg die alkalische Phosphatase-Aktivität der Zellen. Allerdings war die Steigerung der alkalischen Phosphatase-Aktivität gering im Vergleich mit der der menschlichen mesenchymalen Stammzellen, die durch Zugabe des Überstands mit dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff kultiviert wurden.
Aus den Ergebnissen der 8 und dergleichen ist es unwahrscheinlich, dass herkömmliche niedermolekulare Komponenten (einschließlich Dexamethason) in dem Überstand enthalten sind, der den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff beinhaltet. Deshalb wird angenommen, dass die Wirkung, die aus der Zugabe des Überstands mit dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff resultiert, von dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff selbst erzielt wurde.
Daher wird aus den Ergebnissen in diesem Beispiel angenommen, dass der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff eine stärkere Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung zu Osteoblasten besitzt als die des Dexamethasons, das eines von den herkömmlichen die Osteoblasten-Differenzierung induzierenden Komponenten ist. (Tabelle 18) ALP (Ext. 405), 72 h (3 Tage) nach Zugabe des Überstands

Zugegebene Probe 1 2 3 Mittelwert Relativer Wert

(1) 0,83 0,73 0,84 0,80 5,2

(2) 0,20 0,35 0,26 0,27 1,8

(3) 0,13 0,14 0,18 0,15 1
(Alkalische Phosphatase-Färbung)
Nachdem die menschlichen mesenchymalen Stammzellen in MSCGM-Medium (Wachstumsmedium) für 18 h kultiviert wurden, wurde 1 ml von jeder der folgenden Probelösungen den menschlichen mesenchymalen Stammzellen zugegeben.
Anschließend wurden die menschlichen mesenchymalen Stammzellen für 72 h kultiviert und die alkalische Phosphatase-Aktivität-Färbung der Zellen wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.
(Zugegebene Probenlösung)

Die Ergebnisse sind in 39 gezeigt.
Die menschlichen mesenchymalen Stammzellen, die durch Zugabe des Überstands kultiviert wurden, der den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthielt, exprimierten die alkalische Phosphatase stark im Vergleich zu den Zellen, die durch Zugabe des MEM-Wachstumsmediums ohne Wirkstoff und ohne Dexamethason kultiviert wurden.
Wenn andererseits die menschlichen mesenchymalen Stammzellen nur durch Zugabe des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Mediums mit Dexamethason, jedoch ohne den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff, kultiviert wurden, exprimierten sie die alkalische Phosphatase. Allerdings war das Expressionsniveau der alkalischen Phosphatase gering im Vergleich mit dem der menschlichen mesenchymalen Stammzellen, die durch Zugabe des Überstands mit dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff kultiviert wurden.
Aus den Ergebnissen der 8 und dergleichen ist es unwahrscheinlich, dass herkömmliche niedermolekulare Komponenten (einschließlich Dexamethason) in dem Überstand enthalten sind, der den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff beinhaltet. Deshalb wird angenommen, dass die Wirkung, die aus der Zugabe des Überstands mit dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff resultiert, von dem die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff selbst erzielt wurde.
Daher wird aus den Ergebnissen in diesem Beispiel angenommen, dass der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff eine stärkere Fähigkeit zur Induzierung der Differenzierung zu Osteoblasten besitzt als die des Dexamethasons, das eines von den herkömmlichen die Osteoblasten-Differenzierung induzierenden Komponenten ist.
(Beispiel 21B: Auswirkung des Überstands des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden, auf menschliche undifferenzierte mesenchymale Stammzellen)
In diesem Beispiel wurde der Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden, auf die gleiche Art und Weise wie in Vergleichsbeispiel 1A gewonnen.
Menschliche undifferenzierte mesenchymale Stammzellen (hMSC: ”PT-2501”) wurden von Cambrex Corporation bezogen und auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 21A in einem MSCGM-Medium (Wachstumsmedium) kultiviert.
(Zugabe der Probe und Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität)
Nachdem die menschlichen mesenchymalen Stammzellen in MSCGM-Medium (Wachstumsmedium) für 18 h kultiviert wurden, wurde 1 ml von jeder der folgenden Probelösungen den menschlichen mesenchymalen Stammzellen zugegeben. Anschließend wurden die menschlichen mesenchymalen Stammzellen für 72 h kultiviert und die alkalische Phosphatase-Aktivität der Zellen wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
(Zugegebene Probenlösung)

GC/Differenzierung: die zugegebene Probenlösung ist ein Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
GC/Wachstum: die zugegebene Probenlösung ist ein Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert wurden.
Wachstum: die zugegebene Probenlösung ist ein MEM-Wachstumsmedium.

Nachstehend sind die Ergebnisse gezeigt.
Es wurde bestätigt, dass der Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen mesenchymalen Stammzellen steigern kann, in dem Überstand des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden MEM-Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, vorhanden war, aber der Wirkstoff, der die alkalische Phosphatase-Aktivität der menschlichen mesenchymalen Stammzellen steigern kann, war in dem Überstand des MEM-Wachstumsmediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, nicht vorhanden. (Tabelle 19) Zellen: hMSC (menschlich)

1 2 3 Mittelwert Relativer Wert

GC/Differenzierung 1,504 2,315 1,773 1,864 4,618

GC/Wachstum 0,560 0,395 0,523 0,493 1,220

Nur Wachstum 0,435 0,322 0,454 0,404 1,000
Es ist auf die gleiche Art und Weise wie in diesem Beispiel ebenfalls möglich, die Auswirkung eines Überstands des den Differenzierungswirkstoff erzeugenden HAM-Mediums, in dem die aus Ratten stammenden hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert wurden, auf die menschlichen mesenchymalen Stammzellen zu bestätigen.
(Beispiel 22: Wirkung des die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs auf undifferenzierte, Rattenknochenmark stammende Zellen)
(Herstellung des die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der durch hypertrophierungsfähige Chondrozyten erzeugt wird)
Die die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoffe werden auf die gleiche Weise wie in den Beispielen 1 bis 3 (Ratte), den Beispielen 4 und 5 (Mensch), Beispiel 7 (Ratte), Beispiel 9 (Maus) und Beispiel 10 (Kaninchen) hergestellt.
(Herstellung von undifferenzierten, aus Rattenknochenmark stammenden Zellen)
Oberschenkelknochen wurden von Ratten gesammelt, die Weichgewebe werden davon entfernt, und dann werden die beiden Epiphysenregionen davon entfernt. Ein Medium wird in eine Spritze aufgezogen und dann in jeden der Oberschenkel von beiden Enden davon über eine Nadel der Spritze infundiert, sodass das Knochenmark im Inneren darin mit dem Medium herausgespült wird. Auf diese Weise wird eine Zellgemischlösung erhalten. Als Medium wird MEM-Medium, enthaltend 15% FBS, verwendet.
Mit der erhaltenen Zellgemischlösung wird eine Pipettierbehandlung durchgeführt, in T-75-Kolben in einer Menge davon entsprechend einem Oberschenkel pro T-75-Kolben überimpft und dann in einem CO₂-Inkubator bei 37°C kultiviert. Die Hälfte von jedem Medium wird dreimal in einer Woche durch ein neues Medium ausgetauscht. 7 bis 10 Tage nach der Kultur werden die an den T-75-Kolben anhaftenden Zellen davon mit einer 0,05% Typsin-EDTA-Lösung abgetrennt, um eine Kultur zu erhalten.
Ein Überstand, der jeweils die die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffe, die in diesem Beispiel hergestellt wurden, enthielt, wurde einem Medium zugesetzt, das die Kultur der aus Rattenknochenmark stammenden undifferenzierten Zellen enthielt, und dann wurde die Kultur weiter kultiviert. Anschließend wurde in jedem der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffe die Fähigkeit zur Induktion der sich aus Rattenknochenmark ableitenden undifferenzierten Zellen zu induzierten Osteoblasten auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 bewertet.
Aus Knochenmark stammende undifferenzierte Zellen wurden unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens zu Osteoblasten induziert, und die induzierten Osteoblasten wurden verwendet. Speziell wurden die undifferenzierten Stammzellen aus Ratten-Oberschenkelknochenmark nach einem in Maniatopoulos et al., Cell Tissue Res., 254: 317–330, 1988 beschriebenen Verfahren gesammelt. Anschließend wurden diese undifferenzierten Stammzellen bei 170 bis 200 × g 3 bis 5 Minuten zentrifugiert, um sie zu einem Pellet zu formen, und dann wurden die Pellets in einem von Maniatopoulos vorgeschlagenen Medium (hierin als ein „Differenzierungsmittel erzeugendes Medium” bezeichnet) in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C 2 Wochen inkubiert, um die Osteoblasten (Bp) zu induzieren. Diese Osteoblasten (Bp) wurden verwendet.
Eine Realzeit-PCR wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, und jeder der Zellmarker wurde unter Verwendung eines Realzeit-PCR-Gerätes („PRISM 7900HT”, hergestellt von Applied Biosystems, Inc.) gemessen. Nach Abschluss der PCR wurden die Einstellung der Schwellwerte und Berechnung der Leistungszyklen unter Verwendung einer in das Gerät eingebauten Auswertungssoftware („PRIMS 7900HT”) durchgeführt.
Die Expressionsmenge von jedem Zellmarker wurde durch eine Expressionsmenge des GAPDH zur Berechnung von Korrekturwerten davon geteilt, und dann wurde eine durchschnittliche Expressionsmenge davon durch Mitteln der Korrekturwerte erhalten.
Als ein Ergebnis exprimierten hypertrophierungsunfähige Chondrozyten Typ-II-Collagen und Aglycan, aber exprimierten keine alkalische Phosphatase und Osteocalcin (siehe Vergleichsbeispiel 1B und Tabelle II).
Andererseits exprimierten die aus den undifferenzierten Zellen induzierten Osteoblasten, die sich von Knochenmark ableiteten, unter Verwendung des herkömmlichen Verfahrens, die alkalische Phosphatase und das Osteocalcin, aber sie exprimierten nicht Typ-II-Collagen und das Aglycan (Tabelle III).
Tabelle III
Alkalische Phosphatase

Menge (Korrekturwert durch GAPDH) Mittelwert

Probe 1 2 3 Durchschnitt

Bp 0,0815 0,0776 0,0839 0,0810

Typ-II-Collagen

Menge (Korrekturwert durch GAPDH) Mittelwert

Probe 1 2 3 Durchschnitt

Bp 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

Aglycan

Menge (Korrekturwert durch GAPDH) Mittelwert

Probe 1 2 3 Durchschnitt

Bp 0,0010 0,0009 0,0013 0,0011

Osteocalcin

Menge (Korrekturwert durch GAPDH) Mittelwert

Probe 1 2 3 Durchschnitt

Bp 0,7282 0,7136 1,1064 0,8494

Bp: Pellet von undifferenzierten Stammzellen, gesammelt aus Femurmark und kultiviert in Osteoblasten differenzierendem Medium

Vergleichsbeispiel 22A: Wirkung von Überstand, der keinen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthält, auf undifferenzierte Zellen, die sich aus Rattenknochenmark ableiten.
Dieses Vergleichsexperiment wird auf die gleiche Weise wie Beispiel 22 durchgeführt, außer dass ein Überstand eines Wachstumsmediums, in dem hypertrophierungsfähige Chondrozyten kultiviert werden (Überstand, der keinen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthält) kultiviert, dem Medium zugesetzt anstelle des Überstandes, der den die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthält. Der Überstand, der keinen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthält, wird dem Medium zugesetzt, das die Kultur der undifferenzierten Zellen, die aus Rattenknochenmark stammen, enthält, und dann wird die Kultur weiter kultiviert.
Anschließend wird eine Wirkung des Überstandes des Wachstumsmedium, in dem hypertrophierungsfähige Chrondrozyten kultiviert werden (Überstand enthaltend keinen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierendes Mittel) auf die aus Rattenknochenmark stammenden undifferenzierten Zellen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 bewertet.
Vergleichsbeispiel 22B: Wirkung von Überstand, der keinen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff enthält, auf aus Rattenknochenmark stammende undifferenzierte Zellen.
Hypertrophierungsunfähige Chondrozyten, die jeweils in Vergleichsbeispiel 1B (Ratte), Vergleichsbeispiel 1D (Ratte), Vergleichsbeispiel 3D (Ratte), Vergleichsbeispiel 4B (Mensch), Vergleichsbeispiel 5B (Mensch), Vergleichsbeispiel 9B (Maus) und Vergleichsbeispiel 10B (Kaninchen) hergestellt wurden, werden verwendet. Ein Überstand eines das Differenzierungsmittel erzeugenden Mediums, in dem die Zellen, hergestellt in jedem der Vergleichsbeispiele, kultiviert werden (Überstand enthaltend keinen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff) wird dem Medium zugesetzt, das die Kultur der aus Rattenknochenmark stammenden undifferenzierten Zellen enthält, und dann wird die Kultur weiter kultiviert. Anschließend wird eine Wirkung des Überstandes des Differenzierungsmittel produzierenden Mediums, in dem die hypertrophierungsunfähigen Chondrozyten kultiviert werden (Überstand, enthaltend keinen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff) auf die aus Rattenknochenmark stammenden undifferenzierten Zellen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 bewertet.
Vergleichsbeispiel 22C: Wirkung von Differenzierungsmittel erzeugendem Medium oder Wachstumsmedium auf aus Rattenknochenmark stammende undifferenzierte Zellen.
Undifferenzierte Zellen, die aus Rattenknochenmark stammten, werden in einem Medium kultiviert, dem ein Überstand, enthaltend einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff, nicht zugesetzt, aber nur ein Differenzierungsmittel erzeugendes Medium oder ein Wachstumsmedium wird zugesetzt. Anschließend wird die Wirkung des Differenzierungsmittel erzeugenden Mediums oder des Wachstumsmediums auf die aus Rattenknochenmark stammenden undifferenzierten Stellen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 bewertet.
Wie vorstehend erläutert, wurde die vorliegende Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dargestellt. Jedoch sollte der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht durch solche Ausführungsformen eingeschränkt werden. Es wird verstanden, dass die vorliegende Erfindung nur durch den Schutzumfang der Ansprüche eingeschränkt werden sollte.
Es ist selbstverständlich, dass Fachleute Äquivalente der vorliegenden Erfindung gemäß der Beschreibung der vorliegenden Erfindung oder dem allgemeinen Fachwissen auf dem Fachgebiet herstellen können. Es ist ebenfalls selbstverständlich, dass die Inhalte von hierin zitierten Patenten, Patentanmeldungen und Dokumenten als Referenzen, wie spezifisch hierin beschrieben, mit aufgenommen werden sollten.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Die vorliegende Erfindung erzeugt in erfolgreicher Weise ein Verbundmaterial, das einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff, der von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten erzeugt wird, und ein Gerüst, das die Osteogenese in einem biologischen Organismus fördern oder induzieren kann, enthält, und ein Verfahren zur Herstellung des Verbundmaterials und ein Verfahren zur Verwendung des Verbundmaterials. Durch seine Verwendung ist die Induktion der Osteogenese auch in einer Region möglich, in deren Nähe kein Knochen vorhanden ist. Ein solches Verbundmaterial wurde unter Verwendung des bisherigen Technikstandes noch nicht bereitgestellt, sondern wird zum ersten Mal unter Verwendung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verbundmaterial zur Förderung oder Induzierung der Osteogenese in einem biologischen Organismus bereit. Das Verbundmaterial beinhaltet folgendes: A) einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium erhalten wird, das Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure und eine Serumkomponente enthält; und B) ein biokompatibles Gerüst. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung dieses Verbundmaterials und ein Verfahren zur Förderung oder Induzierung der Osteogenese in einem biologischen Organismus bereit.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Ein Verbundmaterial zur Förderung oder Induzierung der Osteogenese in einem biologischen Organismus, das folgendes umfasst: A) einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, der durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium erhalten wird, das Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure und eine Serumkomponente beinhaltet; und B) ein biokompatibles Gerüst.
Das Verbundmaterial nach Anspruch 1, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in folgendem vorliegt: (1) in dem Medium, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden, oder (2) in einer Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50.000 oder höher, erhalten durch Ultrafiltration eines Überstands des Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden, unter Verwendung eines Filters mit einer molekularen Trenngrenze von 50.000.
Das Verbundmaterial nach Anspruch 1, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff konzentriert oder gefriergetrocknet ist.
Das Verbundmaterial nach Anspruch 1, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff an einer vorbestimmten Region des biokompatiblen Gerüsts, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend eine Oberfläche davon und eine interne Pore davon, anhaftet oder darin dispergiert ist.
Das Verbundmaterial nach Anspruch 1, wobei das biokompatible Gerüst aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend ein gelatinöses Gerüst und ein dreidimensionales Gerüst.
Das Verbundmaterial nach Anspruch 5, wobei das biokompatible Gerüst ein Material beinhaltet, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Hydroxylapatit, Collagen, Alginsäure, ein Gemisch von Laminin, Typ-IV-Collagen und Entactin und eine Kombination davon.
Das Verbundmaterial nach Anspruch 1, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff in einem gefriergetrockneten Zustand mit einer Collagen-Lösung vermischt ist, und worin das den Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium ein Minimal Essential Medium (MEM) als Basiskomponente beinhaltet.
Das Verbundmaterial nach Anspruch 1, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff an Hydroxylapatit anhaftet oder darin dispergiert ist, und worin das Differenzierungswirkstoff erzeugende Medium ein Minimal Essential Medium (MEM) als Basiskomponente beinhaltet.
Das Verbundmaterial nach Anspruch 9, wobei die Osteogenese zur Reparatur oder Behandlung eines Knochendefekts verwendet wird.
Das Verbundmaterial nach Anspruch 9, wobei der Knochendefekt eine Größe aufweist, die nicht durch nur Immobilisieren von Knochen repariert werden kann.
Das Verbundmaterial nach Anspruch 1, wobei die Osteogenese zum Bilden von Knochen in einer Region verwendet wird, wo der Knochen nicht in der Nähe davon existiert.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Verbundmaterials zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus, umfassend A) einen Schritt des Bereitstellens eines die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs, erhalten durch Kultivieren von hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium, das Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure und eine Serumkomponente enthält; und B) einen Schritt des Mischens des die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoffs mit einem biokompatiblen Gerüst.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei der die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierende Wirkstoff folgendermaßen existiert (1) in dem Medium, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden, oder (2) in einer Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50000 oder höher, die durch die Durchführung einer Ultrafiltration unter Verwendung eines Filters mit einer molekularen Trenngrenze von 50000 mit einem Überstand des Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Schritt A) folgendes umfasst: A) Kultivieren der hypertrophierungsfähigen Chondrozyten in einem den Differenzierungswirkstoff erzeugenden Medium, das Dexamethason, β-Glycerophosphat, Ascorbinsäure und eine Serumkomponente beinhaltet; und Sammeln des Überstand des Mediums nach der Kultur.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Schritt A) die Ultrafiltration des Überstands des Mediums, in dem die hypertrophierungsfähigen Chondrozyten kultiviert werden, um ihn in eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 50000 oder höher aufzutrennen, umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 15, das weiterhin einen Schritt des Konzentrierens oder Gefriertrocknens des Überstands nach dem Schritt A) umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Schritt B) einen Schritt des Mischens des Überstands in einem gefriergetrockneten Zustand mit einer Collagen-Lösung umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Schritt B) einen Schritt des In-Kontakt-Bringens des konzentrierten Überstands mit Hydroxylapatit umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei das biokompatible Gerüst aus der Gruppe ausgewählt wird, die ein gelatinöses Gerüst und ein dreidimensionales Gerüst umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei das biokompatible Gerüst ein Material enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Hydroxylapatit, Collagen, Alginsäure, ein Gemisch von Laminin, Typ-IV-Collagen und Entactin, und eine Kombination davon umfasst.
Ein Verfahren zur Förderung oder Induzierung der Osteogenese in einem biologischen Organismus, das folgendes umfasst: einen Schritt des Implantieren eines Verbundmaterials, das einen die Differenzierung induzierter Osteoblasten induzierenden Wirkstoff und ein biokompatibles Gerüst beinhaltet, in eine Region, wo die Förderung oder Induzierung der Osteogenese in dem biologischen Organismus erforderlich ist.
Das Verfahren nach Anspruch 21, das zur Reparatur oder Behandlung eines Knochendefekts verwendet wird.
Das Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Knochendefekt eine Größe aufweist, die nicht durch nur Immobilisieren von Knochen repariert werden kann.
Das Verfahren nach Anspruch 21, das zur Bildung von Knochen in einer Region verwendet wird, wo der Knochen nicht in der Nähe davon existiert.
Ein Verbundmaterial zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus, umfassend A) hypertrophierungsfähige Chondrozyten; und B) Alginsäure.
Ein Verbundmaterial zur Förderung oder Induzierung von Osteogenese in einem biologischen Organismus, umfassend A) hypertrophierungsfähige Chondrozyten; und B) ein Gemisch von Laminin, Typ-IV-Collagen und Entactin.