WO2008156221A1

WO2008156221A1 - 肥大化能を有する軟骨細胞の産生する因子と足場による骨欠損の修復と治療

Info

Publication number: WO2008156221A1
Application number: PCT/JP2008/061692
Authority: WO
Inventors: Hiroyuki Okihana
Original assignee: Hoya Corporation
Priority date: 2007-06-20
Filing date: 2008-06-20
Publication date: 2008-12-24
Also published as: US20100297210A1; JPWO2008156221A1; DE112008001641T5

Abstract

本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を提供する。この複合材料は、Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子、およびＢ）生体適合性を有する足場を含む。本発明はまた、この複合材料を生産するための方法、ならびに生体内の骨形成を促進または誘発するための方法を提供する。

Description

明細書

肥大化能を有する軟骨細胞の産生する因子と足場による骨欠損の修復と治療技術分野

本発明は、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料ならびにその製造法およびその利用法に関する。背景技術

骨形成の低下する病気や骨の損傷または骨の欠損に対しては、骨形成が好ましい治療法である。骨組織が骨折などの損傷や骨腫瘍などによる切除を受けると、骨を作る細胞である骨芽細胞が増殖、分化し、骨が形成して、骨折部や骨欠損部が治癒する。損傷の軽度な症例においては、患部を固定することによって骨芽細胞が有効に機能し、治癒に至る。複雑骨折や骨切除術による大きな欠損、さらに骨髄炎の併発などにより骨芽細胞が有効に機能し得ない環境では、損傷または欠損を修復するための標準的な方法として、自家骨移植が一般に考えられてきた。骨欠損部位が大きくて自家骨では補填できない場合は、人工骨を使用するとしても、自家骨を一部混ぜる方法が多く採られている。し力、し、ヒトの場合には自家骨の供給源は限られており、採取できる量に限りがある。また採取のためには余分な手術が必要であり、高額な費用および苦痛を伴い、さらに骨の採取部位（本来正常部位）には新たな骨欠損が生じるという数々の欠点が存在する。

そこで、人工骨のインプラントおよび骨補填材料の使用などさまざまな外科的処置が利用されてきた。外傷や骨腫瘍摘出等により生じた骨等の生体組織欠損部に、骨補填材等の生体組織補填材を補填することにより、骨等の生体組織欠損部を補填修復することが可能になってきている。骨補填材料としては、ハイドロキシアパタイト（HA P ) やリン酸三カルシウム（T C P ) が主として知られている。

し力し、この従来の人工骨のインプラントおよび骨補填材料には、自家骨と比ベて、骨形成能が低く骨ができにくく、また靭性が低く衝撃で割れやすいという欠点があった。したがって、外科的処置の予後は必ずしも良好ではなく、複数回の手術を必要とすることも多い。これらの理由により、人工骨の使用割合は増えつつあるものの、未だ 3割程度で、残りの 6〜 7割は自家骨が使用されている。米国では同種骨が多く使用されている。し力し、日本では、死体を利用することは習慣として馴染みにくく、そのため利用されることは多くない。骨バンクも存在しているが、現在のところその整備は不十分である。

上記の従来の人工骨のこれらの欠点を改良するために、細胞の再生力を利用した再生医療の試みが行われ始めており、骨折部や骨欠損部に対する治療にも応用されている。また、術後の骨欠損部の修復速度を高めるためにも利用されている。この再生医療には骨髄由来の幹細胞が主に使用され、患者から採取した骨髄幹細胞ゃ分化させた骨芽細胞を骨補填材料とともに培養することにより製造される培養骨等の生体組織補填体を使用することが提案されている。培養されることにより骨補填材料を足場にして増殖した多くの骨髄間葉系幹細胞やさらに分化した骨芽細胞を含む骨補填体を骨欠損部に補填するので、骨補填材料のみを移植する方法と比較すると、上記の人工骨の欠点を補うことができ、また骨が形成されるまでの日数を短縮することができる。

従来の再生医療の方法では、骨髄由来の間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させるには、 Maniatopoulosらが提唱した方法（デキサメサゾン、 /3—グリセロホスフエートおよびァスコルビン酸の 3化合物を使用する方法）もしくはぞの使用濃度を修正した方法が利用されているが、これらの方法は人工的なもので、自然のものではない（非特許文献 1 =Maniatopoulos, Cら： Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Ί issue Res, 254： 317-330， 1988. ) 。さらに、幹細胞の中には、この 3化合物混合物によっては分化しない細胞が存在する。その結果、分化誘導された骨芽細胞の性質や機能に不安が存在する。

そこで、骨形成の低下する病気や骨の損傷または骨の欠損に対する治療のために利用される骨芽細胞を、安全に、安価に、かつ安定して提供することが必要とされている。

これまで、骨形成は、骨芽細胞を誘導させると考えられている BMP (骨形成因子） — 2、 BMP— 4、 BMP— 7が重要な役割を果たすと考えられてきた。 BMPファミリーには多くのファミリーメンバ一が存在するが、 BMP— 2、 B MP— 4および BMP— 7以外の分子は、初期から知られていた BMP 2の配列をもとにして、機能については考慮せずに取得したホモログであり、骨芽細胞を分化誘導するという能力は必ずしも有していない。 BMP— 2、 BMP— 4および BMP— 7は、マウス、ラットにおいて骨芽細胞を有効に誘導するが、ヒトでは 1 000分の 1ほどの効果しかないことが報告されている（非特許文献 2〜 5 =Wozney, j. M. ら： Novel Regulators of Bone Formation: Molecular Clones and Activities. Science, 242： 1528-1534, 1988.； Wuerzler KKら： Radiatio n-Induced Impairment of Bone Healing Can Be overcome by Recombinant Huma n Bone Morphogenetic Protein 2. J. Craniofacial Surg. , 9： 131—137, 1998； Govender Sら： Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein- 2 for treatm ent of Open Tibial Fractures. J. Bone Joint Surg. , 84A: 2123-2134, 2002.； Johnsson Rら： Randomized Radiostereometric Study Comparing Osteogenic Pr otein-1 (BMP— 7) and Autograft Bone in Human Noninstrumented Posterolater al Lumber Fusion. Spine, 27： 2654-2661， 2002. ) 。

本発明者は、 BMPを異所に移植すると、内軟骨性骨化による骨形成が生じることを観察した。 BMPをクローニングした Wozneyらも BMPの活性を測定した際に、 cartilage— inducing activityという言葉を使用している（非特許文献 2 =Wozney, J. M. ら： Novel Regulators of Bone Format ion '· Molecular Clones and Activities. Science, 242： 1528—1534, 1988) 。この観察により、 BMP 一 2、 BMP— 4および BMP— 7は、骨を直接的に分化誘導させるのではなく、肥大化能を有する軟骨細胞を誘導させ、この肥大化能を有する軟骨細胞が産生する因子が骨芽細胞を分化誘導させて骨形成を導くと考察した（非特許文献 6およぴ非特許文献 7 =沖花裕行：成長軟骨の産生する骨形成因子、医学のあゆみ、 16 5: 419、 1993; Okihana, H. & Shimomura, Y: Osteogenic Activity of Growth C artilage Examined by Implanting Decalcified and Devitalized RIDS and Cos tal Cartilage Zone, and Living Growth Cartilage Cells. Bone, 13: 387—393, 1992.)。骨芽細胞の誘導、走化、活性化に直接作用する、分子量 5 0， 0 0 0以上のぺプチド性あるいは生体由来の因子は知られていない。

特許文献 1 (特開 2004- 305259号公報）は、生体組織補填材に幹細胞を付着させ、付着させた幹細胞を分化誘導させることにより生体組織補填材を足場として生体組織形成作用を生じさせ、形成された組織細胞を死滅させる処理工程とを備えることを特徴とする生体組織補填体の製造方法を開示している。特許文献 1には、生体組織補填材に幹細胞を付着させ、付着された幹細胞を骨芽細胞に分化させることが記載されている。この培養に用いる培地には、最小必須培地、ゥシ胎仔血清（F B S) 、デキサメタゾン、）3グリセ口ホスフェートのような分化誘導因子、ビタミン Cのような栄養剤が混合されていることが記載されており、最小必須培地、ゥシ胎仔血清（F B S) 、デキサメタゾンを混合した培地を分化誘導に使用している。特許文献 1には、本発明の骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料も、この複合材料が生体内の骨形成を促進または誘発することも記載されていない。

特許文献 2 (特開 2004-305260号公報）は、生体組織補填材に幹細胞を付着させ、付着させた幹細胞を分化誘導させることにより生体組織補填材を足場として生体組織形成作用を生じさせ、形成された組織細胞を死滅させる処理工程を備え、この処理工程が、生体組織補填材を凍結してさらに乾燥する工程であることを特徴とする生体組織補填体の製造方法を開示している。特許文献 2には、生体組織補填材に幹細胞を付着させ、付着された幹細胞を骨芽細胞に分化させることが記載されている。この培養に用いる培地には、最小必須培地、ゥシ胎仔血清（F B S ) 、デキサメタゾン、 ]3グリセ口ホスフェートのような分化誘導因子、ビタミン Cのような栄養剤が混合されていることが記載されており、最小必須培地、ゥシ胎仔血清（F B S ) 、デキサメタゾンを混合した培地を分ィヒ誘導に使用している。特許文献 2には、本発明の骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料も、この複合材料が生体内の骨形成を促進または誘発することも記載されていない。特許文献 3 (特開 2004- 49142号公報）は、患者から採取した骨髄細胞を所定の培地内で培養することにより間葉系幹細胞を取得する一次培養ステップと、培養された間葉系幹細胞を所定の骨形成培地内で培養することにより骨芽細胞へ分化誘導させる二次培養ステップと、分化誘導された骨芽細胞および産生された骨基質を回収する回収ステップと、回収された骨芽細胞および骨基質を骨補填材顆粒と混合する混合ステップとを備える培養骨の製造方法を開示している。特許文献 3には、最小必須培地、ゥシ胎仔血清（F B S ) 、デキサメタゾン、）3グリセ口ホスフエ一トのような分化誘導因子、ビタミン Cのような栄養剤が混合されている培地を用いて、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることが記載されている。特許文献 3にば、本発明の骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料も、この複合材料が生体内の骨形成を促進または誘発することも記載されていない。特許文献 4 (特開 2005-205074号公報）は、患者から採取した細胞を培養して得た間葉系幹細胞を骨補填材に担持させ、骨補填材に担持させた前記間葉系幹細胞を培養して骨芽細胞へと分化誘導させる培養骨、もしくは患者から採取した細胞をもとに得た間葉系幹細胞を培養して骨芽細胞へと分化誘導させた後に骨芽細胞を骨補填材に担持させる培養骨の製造方法を開示している。特許文献 4には、最小必須培地、ゥシ胎仔血清（F B S ) 、デキサメタゾン、 3グリセロホスフヱートのような分化誘導因子、ビタミン Cのような栄養剤が混合されている培地を用いて、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることが記載されている。この方法では、患者から採取した細胞を培養する培養液、または前記間葉系幹細胞を培養する培養液、もしくは前記骨芽細胞へと分化誘導させた後の培養液に多血小板血漿を添加することが必要である。特許文献 4には、本発明の骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料も、この複合材料が生体内の骨形成を促進または誘発することも記載されていない。

特許文献 5 (特表 2003-531604号公報）は、出生後のヒト包皮組織などの出生後のヒト組織から、間葉幹細胞を単離する方法、ならびに単離した間葉幹細胞を、骨形成、脂肪生成、および軟骨形成細胞系譜などの、多様な細胞系譜に分化誘導させる方法が開示されている。特許文献 5には、ゥシ胎仔血清（F B S ) 、抗生物質、骨形成補足剤（デキサメタゾン、 3グリセ口ホスフェートおよびァスコルビン酸— 2—リン酸）を含む培地を用いて、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることが記載されている。特許文献 5には、本発明の骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料も、この複合材料が生体内の骨形成を促進または誘発することも記載されていない。

特許文献 6 (特開 2006-289062号公報）は、肥大化能を有する軟骨細胞と足場を用いた骨補填材料を開示している。特許文献 6には、本発明の骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料も、この複合材料が生体内の骨形成を促進または誘発することも記載されていない。発明の開示

発明が解決しょうとする課題

本発明は、骨形成の低下する病気の治療や骨の損傷または骨の欠損に対する処置、特に骨腫瘍および複雑骨折などの治療において使用することができる、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料ならびにその製造法およびその利用法を提供することを課題とする。

本発明は、周辺に骨がない部位に骨を形成させるために使用することができる、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料を提供することを課題とする。課題を解決するための手段

上記課題は、一部、本発明において、本発明による骨芽細胞分化誘導因子と足場とを使用することによって、予想外に骨形成が進展するという性質をもつ複合材料を見出したことによって解決された。本発明による骨芽細胞分化誘導因子は、該因子単独では、生体に移植しても散逸してしまうため、未分化細胞を骨芽細胞に誘導することはできない。本発明は、この骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場を組み合せることによって、生体内の骨形成を促進または誘発することに初めて成功した。

上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。

(項目 1 )

A) 肥大化能を有する軟骨細胞を、ダルココルチコイド、ーグリセ口ホスフエ一トおよびァスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも 1つを含む分化因子産生培地において培養することによって得ることができる、誘導骨芽細胞分化誘導因子、および

B ) 生体適合性を有する足場、

を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料。

(項目 1 A)

A) 肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、 ]3—グリセ口ホスフエ一ト、ァスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子、および B ) 生体適合性を有する足場、

(項目 1 B )

前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、（1 ) 前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地に存在するか、または（2 ) 該肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、分子量 5 0， 0 0 0の限外濾過に供することにより得られる分子量 5 0， 0 0 0以上の画分に存在する、上記項目に記載の複合材料。

(項目 2 )

前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が濃縮されたものである、上記項目の複合材料。

(項目 3 )

前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が凍結乾燥されたものである、上記項目に記載の複合材料。

(項目 3 A)

前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が濃縮または凍結乾燥されたものである、上記項目に記載の複合材料。

(項目 4 )

前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、前記生体適合性を有する足場に付着されている、上記項目に記載の複合材料。

(項目 5 )

前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、前記生体適合性を有する足場に分散されている、上記項目に記載の複合材料。

(項目 6 )

前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、生体適合性を有する足場の表面おょぴ該生体適合性を有する足場の内部孔内からなる群より選択される領域に付着または分散している、上記項目に記載の複合材料。

(項目 7 ) 前記生体適合性を有する足場が、ゲル状足場および 3次元状足場からなる群より選択される、上記項目に記載の複合材料。

(項目 7 A)

前記生体適合性を有する足場が、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコユア、アパタイト一ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フイブリン、ヒアルロン酸、細胞外基質混合物、絹、セルロース、デキストラン、ァガロース、寒天、合成ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリロイシン、ァルギン酸、ポリダリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシァノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビュル共重合体、ナイロンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む、上記項目に記載の複合材料。

(項目 8 )

前記生体適合性を有する足場が、多孔質ヒドロキシァパタイト、超多孔質ヒドロキシァパタイト、ァパタイトコラーゲン混合体、ァパタイトコラーゲン複合体、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ゼラチンスポンジ、フイブリンゲル、合成ペプチド、細胞外基質混合物、アルギン酸、ァガロース、ポリダリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸 Zポリ乳酸共重合体およびそれらの組合せからなる群より選択される物質を含む、上記項目に記載の複合材料。

(項目 8 A)

前記生体適合性を有する足場が、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、アルギン酸、およびラミニンとコラーゲン I Vとェンタクチンとの混合物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される物質を含む、上記項目に記載の複合材料。 (項目 9 )

前記分化因子産生培地が、 ]3—グリセ口ホスフエ一卜およびァスコルビン酸の両方を含む、上記項目に記載の複合材料。 (項目 1 o)

前記分化因子産生培地が、血清成分をさらに含む、上記項目に記載の複合材料。

(項目 1 O A)

前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、凍結乾燥した状態でコラーゲン溶液と混合され、かつ前記分化因子産生培地が、基礎成分として最小必須培地（MEM) を含む、上記項目に記載の複合材料。

(項目 1 1 )

前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、凍結乾燥した状態でコラーゲン溶液と混合され、かつ前記分化因子産生培地が、基礎成分として、最小必須培地（MEM) を含み、さらにダルココルチコイド、 3—グリセ口ホスフェートおよびァスコルビン酸を含む、上記項目に記載の複合材料。

(項目 1 1 A)

前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、ヒドロキシァパタイ卜に付着または分散されており、かつ前記分化因子産生培地が、基礎成分として最小必須培地（MEM) を含む、上記項目に記載の複合材料。

(項目 1 2 )

前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、ヒドロキシァパタイ卜に付着または分散されており、かつ前記分化因子産生培地が、基礎成分として、最小必須培地（M E M) を含み、さらにダルココルチコイド、 ]3—グリセ口ホスフェートおよぴァスコルビン酸を含む、上記項目に記載の複合材料。

(項目 1 3 )

前記骨形成が、骨の欠損を修復または治療するためのものである、上記項目に記載の複合材料。

(項目 1 4 )

前記欠損は、固定のみでは修復できない大きさを有する、上記項目に記載の複合材料。 (項目 1 5 )

前記骨形成が、周辺に骨がない部位に骨を形成させるためのものである、上記項目に記載の複合材料。

(項目 1 6 )

生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を製造するための方法であつて、以下の工程：

A) 肥大化能を有する軟骨細胞を、ダルココルチコイド、 i3—グリセ口ホスフエ一トおよびァスコルビン酸からなる群より選択される少なぐとも 1つを含む分化因子産生培地において培養する工程；

B ) 該培養によって得られた上清と、該生体適合性を有する足場とを合わせる工程、を包含する、方法。

(項目 1 6 A)

A) 肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、 —グリセ口ホスフエ一ト、ァスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子を提供する工程、および

B ) 該誘導骨芽細胞分化誘導因子と、生体適合性を有する足場とを合わせる工程、を包含する、方法。

(項目 1 6 B )

前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、（1 ) 前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地に存在するか、または（2 ) 該肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、分子量 5 0， 0 0 0の限外濾過に供することにより得られる分子量 5 0， 0 0 0以上の画分に存在する、上記項目に記載の方法。

(項目 1 6 C) 前記 A) 工程が、前記肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、 e -グリセロホスフヱート、ァスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養し、該培養した上清を採取することを含む、上記項目に記載の方法。

(項目 1 7 )

前記 A) 工程の後に、前記上清を濃縮する工程をさらに包含する、上記項目に記載の方法。

(項目 1 8 )

前記上清を凍結乾燥する工程をさらに包含する、上記項目に記載の方法。

(項目 1 8 A)

前記 A) 工程が、前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、限外濾過に供し、分子量 5 0， 0 0 0以上の画分に分離することを含む、上記項目に記載の方法。

(項目 1 8 B )

前記 A) 工程の後に、前記上清を濃縮または凍結乾燥する工程をさらに包含する、上記項目に記載の方法。

(項目 1 9 )

前記 B ) 工程が、前記上清を、前記生体適合性を有する足場に接触させる工程を包含する、上記項目に記載の方法。

(項目 2 0 )

前記 B ) 工程は、

前記上清から因子を得る工程、および

該因子を前記生体適合性を有する足場と混合する工程、

を包含する、上記項目に記載の方法。

(項目 2 1 )

前記 B ) 工程は、

前記濃縮によって得られた上清濃縮物を、前記生体適合性を有する足場と接触させるのに十分な体積に希釈し、該生体適合性を有する足場を接触させる工程を包含する、上記項目に記載の方法。

(項目 2 1 A

前記生体適合性を有する足場が、ゲル状足場および 3次元状足場からなる群より選択される、上記項目に記載の方法。

(項目 2 2 )

前記生体適合性を有する足場が、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニァ、ァパタイト一ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィプリン、ヒアルロン酸、細胞外基質混合物、絹、セルロース、デキストラン、ァガロース、寒天、合成ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリロイシン、ァルギン酸、ポリダリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシァノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビエル、エチレン酢酸ビエル共重合体、ナイロンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む、上記項目に記載の方法。

(項目 2 3 )

前記生体適合性を有する足場が、多孔質ヒドロキシァパタイト、超多孔質ヒドロキシァパタイト、ァパタイトコラーゲン混合体、ァパタイトコラーゲン複合体、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ゼラチンスポンジ、フイブリンゲル、合成ペプチド、細胞外基質混合物、アルギン酸、ァガロース、ポリダリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸/ポリ乳酸共重合体およびそれらの組合せからなる群より選択される物質を含む、上記項目に記載の方法。

(項目 2 3 A)

前記生体適合性を有する足場が、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、アルギン酸、およびラミニンとコラーゲン I Vとェンタクチンとの混合物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される物質を含む、上記項目に記載の方法。

(項目 2 4 ) 前記 B ) 工程は、

前記濃縮によって得られた上清濃縮物を凍結乾燥する工程、および

該上清濃縮物を前記生体適合性を有する足場と接触させるのに十分な体積に希釈し、該希釈した上清濃縮物と生体適合性を有する足場とを接触させる工程を包含し、ここで、該生体適合性有する足場が、多孔質ヒドロキシァパタイト、超多孔質ヒドロキシァパタイト、ァパタイトコラーゲン混合体、ァパタイトコラーゲン複合体、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ゼラチンスポンジ、フイブリンゲル、合成ペプチド、細胞外基質混合物、アルギン酸、ァガロース、ポリダリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸 Zポリ乳酸共重合体およびそれらの組合せからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。

(項目 2 4 A)

前記 B ) 工程が、

前記凍結乾燥した状態の上清とコラーゲン溶液とを合わせる工程を包含する、上記項目に記載の方法。

(項目 2 4 B )

前記 B ) 工程が、

前記濃縮した上清とヒドロキシァパタイトとを接触させる工程を包含する、上記項目に記載の方法。

(項目 2 5 )

前記分化因子産生培地が、 i3—グリセ口ホスフェートおよびァスコルビン酸の両方を含む、上記項目に記載の方法。

(項目 2 6 )

前記分化因子産生培地が、血清成分をさらに含む、上記項目に記載の方法。

(項目 2 7 )

生体内の骨形成を促進または誘発するための方法であって、該方法は、誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを含む複合材料を、生体内の骨形成を促進または誘発する必要のある部位に移植する工程を包含する、方法。

(項目 2 8 )

前記骨形成が、骨の欠損を修復または治療するためのものである、上記項目に記載の方法。

(項目 2 9 )

前記欠損は、固定のみでは修復できない大きさを有する、上記項目に記載の方法。

(項目 3 0 )

前記骨形成が、周辺に骨がない部位に骨を形成させるためのものである、上記項目に記載の方法。

(項目 3 1 )

A) 肥大化能を有する軟骨細胞、および

B ) アルギン酸

(項目 3 2 )

A) 肥大化能を有する軟骨細胞、および

B ) ラミニンとコラーゲン I Vとェンタクチンとの混合物

を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料。本発明によって、生体内の骨形成を促進または誘発することができる、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料ならびにその製造法およびその利用法が提供される。このような複合材料は、生体内の骨形成を促進または誘発することができ、この複合材料を用いることによって、周辺に骨がない部位にまで骨形成を導くことができるようになった。このような複合材料は、従来技術では提供されるものではなく、初めて提供されるものである。図面の簡単な説明

図 1 Aは、肥大化能を有する軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシァパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。 1 X 1 0⁶細胞 Zm 1でヒドロキシァパタイトに播種し、 3 7°Cにて、 5%C0₂ィンキュベータ一中で 1週間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、ヒドロキシアパタイトは赤く染まった。左下のバーは、 3 0 0. 0 0 μ m。

図 I Bは、図 1 Aのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジ、青染色では同一部分が青く染まり、細胞が存在することが分かる。左下のバーは、 300. 0 0 /x m。

図 1 Cは、静止軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシァパタイトに播種し、アル力リホスファターゼ染色した結果を示す。 1 X 1 0⁶細胞/ m 1でヒドロキシアパタイトに播種し、 3 7°Cにて、 5%C0₂インキュベータ一中で 1週間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、ヒドロキシアパタイトは染まらなかった。左下のバーは、 3 0 0. 00 μ m₀

図 I Dは、図 1 Cのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では、ヒドロキシアパタイトは青く染まり、細胞が存在することが確認された。左下のバーは、 3 0 0. 00 //m。図 I Eは、関節軟骨部由来の軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシァパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。 1 X 1 0⁶細胞/ m 1でヒドロキシアパタイトに播種し、 3 7°Cにて、 5%C0₂インキュベーター中で 1週間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、ヒドロキシアパタイトは染まらなかった。左下のバーは、 3 0 0. 00 μ m。

図 I Fは、図 1 Eのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では、ヒドロキシアパタイトは青く斑点状に染まり、細胞が存在することが確認された。左下のバーは、 300. 00 図 2は、肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地および MEM増殖培地でそれぞれ培養し、各培養上清をマウス C 3H 10 T 1Z2細胞に添加して培養した場合のアル力リホスファターゼ活性を示す。 M EM分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、 MEM分化因子産生培地のみを添加した場合を 1とすると、 4週齢のラット群では、 4日後に採取した培養上清を添加すると約 4. 1倍、 1週後に採取した培養上清では約 5. 1倍、 2週後に採取した培養上清では約 5. 4倍、 3週後に採取した培養上清では約 4. 9倍にまで上昇した。 8週齢のラット群では、 4日後に採取した培養上清を添加すると約 2. 9倍、 1週後に採取した培養上清では約 3. 1倍、 2週後に採取した培養上清では約 3. 8倍、 3週後に採取した培養上清では約 4. 2倍にまで上昇した。 MEM増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、 4 週齢おょぴ 8週齢のラット群におけるアルカリホスファターゼ活性は、 MEM增殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。以下の略称は添加した培養上清を示す。 4週齢分化上清： 4週齢ラット由来の肥大化軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清、 8週齢分化上清： 8週齢ラット由来の肥大化軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清、 4週齢増殖上清： 4 週齢ラット由来の肥大化軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清、 8週齢増殖上清： 8週齢ラット由来の肥大化軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清。

図 3 Aは、肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地または MEM増殖培地でそれぞれ培養し、各上清をマウス C3H10T 1 Z 2細胞に添加して培養した場合のアル力リホスファターゼ染色の結果を示す。マウス C3H10T 1/2細胞を 24穴プレート上に播種し（BME培地）、 1 8時間後に各培養上清を添加し、 72時間後にアルカリホスファターゼ染色をした。上段： MEM分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合、試料は赤く染まり、活性が有ることが確認された。下段： MEM増殖培地で培養した培養上清を添カ卩した場合、試料は染まらず、活性がないことが確認された。

図 3 Bは、肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養し、その培養上清をマウス C 3H 1 OT 1Z2細胞に添カ卩して培養した場合のアルカリホスファターゼ染色の結果を示す。マウス C3H10T 1Z 2細胞をヒドロキシアパタイト上に播種し（BME培地）、 18時間後に培養上清を添加し、 72時間後にアルカリホスファターゼ染色をした。 MEM分化因子産生培地で培養した上清を添加した場合、試料は赤く染まり、活性が有ることが確認された。左下のバーは、 500. 00 μ m。

図 3 Cは、肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養し、その培養上清をマウス C 3H 1 OT 1Z2細胞に添加して培養した場合のトルイジン青染色の結果を示す。マウス C 3H 10 T 1Z2細胞をヒドロキシアパタイト上に播種し（BME培地）、 18時間後に培養上清を添加し、 72時間後にトルィジン青染色をした。トルイジン青染色で青く染まることより、試料に細胞は存在することが確認された。左下のバーは、 500. 00 μπι。図 3 Dは、肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養し、その培養上清をマウス C 3H1 OT 1Z2細胞に添カ卩して培養した場合のアル力リホスファターゼ染色の結果を示す。マウス C 3H 10 T 1/2細胞をヒドロキシアパタイト上に播種し（BME培地）、 18時間後に培養上清を添加し、 72時間後にアルカリホスファターゼ染色をした。 MEM増殖培地で培養した上清を添加した場合、試料は染まらず、活性がないことが確認された。左下のバーは、 500. 00 μπι。

図 3 Eは、肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培で培養し、その培養上清をマウス C 3H 10T 1/2細胞に添加して培養した場合のトルイジン青染色の結果を示す。マウス C 3 H 1 0 T 1 Z 2細胞をヒドロキシァパタイト上に播種し（B ME培地）、 1 8時間後に培養上清を添加し、 7 2時間後にトルイジン青染色をした。トルイジン青染色で青く染まることより、試料に細胞は存在することが確認された。左下のバーは、 5 0 0 . 0 0 μ m。

図 4は、肋軟骨由来の静止軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地および MEM 増殖培地でそれぞれ培養し、その培養上清をマウス C 3 H 1 0 T 1 Z 2細胞に添加して培養した場合のアル力リホスファターゼ活性を示す。 MEM分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添カ卩した場合、および M E M増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 MEM分化因子産生培地のみおよび MEM増殖培地のみを添加した場合ととんど変わらなかった。以下の略称は添加した培養上清を示す。 8週齢分化上清： 8週齢ラット由来の静止軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清、 8週齢増殖上清： 8週齢ラット由来の静止軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清。各値は、 MEM分化因子産生培地のみおよび MEM増殖培地のみを添加した場合を 1として表した。

図 5 Aは、関節軟骨部由来の軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地および ME M増殖培地でそれぞれ培養し、その培養上清をマウス C 3 H 1 0 T 1 Z 2細胞に添加して培養した場合のアル力リホスファターゼ活性を示す。関節軟骨部由来の軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合、およぴ MEM増殖培地で培養した培養上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性は、 M E M分化因子産生培地のみおよぴ M EM増殖培地のみ添加した場合とほとんど変わらなかった。以下の略称は添加した培養上清を示す。 8週齢分化上清： 8週齢ラット由来の関節軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清、 8週齢増殖上清： 8週齢ラット由来の関節軟骨細胞を MEM增殖培地で培養した培養上清。各値は、 MEM分化因子産生培地のみおよび MEM増殖培地のみを添加した場合を 1として表した。図 5 Bは、肋骨 ·肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を HAM分化因子産生培地で培養し、その上清をマウス C3H1 OT 1Z2細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ活性を示す。値は、 HAM分化因子産生培地のみを添加した場合を 1とした。肋骨 ·肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を HAM分化因子産生培地で培養した上清を添加した場合、アル力リホスファターゼの活性が上昇した。

図 5 Cは、肋骨 ·肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を HAM増殖培地で培養し、その上清をマウス C 3H 1 OT 1ノ 2細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ活性を示す。値は、 HAM増殖培地のみを添加した場合を 1とした。肋骨 ·肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を HAM増殖培地で培養した上清を添カ卩した場合、アル力リホスファターゼの活性が上昇しなかつた。

図 6 Aは、 MEM分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清には、 3T3— Sw i s s a l b i n。細胞、 BAL B/3 T 3細胞においてアル力リホスファターゼ活性を上昇させ、これらの未分化細胞を骨芽細胞に分化誘導する因子が存在することを示す。一方、 MEM増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、これらの培養上清にはこの因子は存在しないことを示す。さらに、 MEM分化因子産生培地または ME M増殖培地を用いて肥大化能を有さない軟骨細胞を培養した場合には、これらの培養上清にはこの因子は存在しないことを示す。

図 6Bは、従来型骨芽細胞分化誘導成分として、デキサメサゾン、 ]3—グリセ口ホスフェート、ァスコルビン酸またはこれらの組み合せを培地に添加して肥大化能を有する軟骨細胞を培養し、その培養上清をマウス C3H10T1/2細胞に添加して培養した場合のアル力リホスファターゼ活性を示す。 D e X ：デキサメサゾン、 J3GP ： /3—グリセ口ホスフェート、 As c ：ァスコルビン酸。図 7 Aは、肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養し、その上清の分子量 50， 000以上の画分を、 24穴プレート上に播種したマウス C 3H 10T 1ノ2細胞に添加して培養した場合のアル力リホスファターゼ染色の結果を示す。試料は赤く染まり、この上清の分子量 50， 000以上の画分には、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有する因子が存在することが分かった。

図 7 Bは、肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養し、その上清の分子量 50， 000以上の画分を、ヒドロキシァパタイト上に播種したマウス C 3H 1 OT 1Z2細胞に添カ卩して培養した場合のァルカリホスファターゼ染色の結果を示す。ヒドロキシァパタイトは赤く染まり、この上清の分子量 50， 000以上の画分には、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有する因子が存在することが分かった。

図 7 Cは、肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養し、この上清の分子量 50， 000未満の画分を、 24穴プレート上に播種したマウス C3H10T 1/2細胞に添加して培養した場合のアル力リホスファターゼ染色の結果を示す。分子量 50， 000未満の画分には、アル力リホスファターゼ活性を上昇させる活性を有する因子は認められなかった。左下のバーは、 500. 00 /zm。

図 7 Dは、肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養し、この上清の分子量 50， 000未満の画分を、ヒドロキシァパタイト上に播種したマウス C3H1 OT 1Z2細胞に添加して培養した場合のァルカリホスファターゼ染色の結果を示す。分子量 50， 000未満の画分には、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有する因子は認められなかった。左下のバーは、 500. 00 Ζ ΠΙ。

図 8は、マウスの肋骨 ·肋軟骨から採取した肥大化能を有する軟骨細胞および肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を、 M E M分化因子産生培地および M E M増殖培地でそれぞれ培養し、各培養上清をマウス C 3H10T 1/2細胞に添加して培養した場合のアル力リホスファターゼ活性を示す。肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性は、 3. 1倍に上昇した。肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清を添加した場合、肋軟骨由来の静止軟骨細胞を MEM分化因子産生培地および M E M増殖培地で培養した培養上清をそれぞれ添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 MEM増殖培地のみおよぴ MEM分化因子産生培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。以下の略称は添加した培養上清を示す。 GC分化上清：肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清、 GC増殖上清：肥大化能を有する軟骨細胞を MEM 増殖培地で培養した培養上清、 RC分化上清：静止軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清、 RC増殖上清：静止軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清。各値は、 MEM分化因子産生培地のみおよび MEM増殖培地のみを添加した場合を 1として表した。

図 9は、未分化細胞を培養する培地が、未分化細胞の骨芽細胞への分化誘導に与える影響を示す。肥大化能を有する軟骨細胞、静止軟骨細胞、および関節軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地および MEM増殖培地でそれぞれ培養した。それぞれの培養上清をマウス C 3H 10 T 1Z2細胞に添加して培養した場合のァルカリホスファターゼ活性を測定した。マウス C3H10T1Z2細胞を培養する培地として、 HAM培地または MEM培地を使用した。 C3H10T 1 2細胞の培養に HAM培地を用いた場合、肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合のみ、アル力リホスファターゼ活性の上昇が認められた。 C3H10 T 1Z2細胞の培養に MEM培地を用いた場合も同様の結果が得られた。以下の略称は添加した培養上清を示す。 GC分化上清：肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清、 GC増殖上清：肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清、 RC分化上清：静止軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清、 . R. C増殖上清：静止軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清、 AC分化上清：関節軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清、 AC増殖上清：関節軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清。各値は、 MEM分化因子産生培地のみおよび MEM増殖培地のみを添加した場合を 1として表した。図 10は、肥大化能を有する軟骨細胞によって産生された、未分化細胞を骨芽細胞に分化誘導させる因子を加熱処理したときのアルカリホスファターゼ活性を示す。肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清を，沸騰水中で 3分間加熱処理した。加熱処理をしていない培養上清、加熱処理した培養上清、 MEM分化因子産生培地のみを、マウス C3H10T 1 2細胞にそれぞれ添加し、 72時間後にアルカリホスファターゼ活性を測定した。培養上清を加熱処理した場合、アルカリホスファターゼ活性は上昇しなかった。未分化細胞を骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子は、加熱処理により熱変性する（失活する）ことが確認された。以下の略称は添加した培養上清を示す。 G C熱処理：肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清を加熱処理したもの、 GC分化上清：肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清、分化上清のみ： MEM分化因子産生培地のみ。各値は、 MEM分化因子産生培地のみを添加した場合を 1として表した。図 1 1Aは、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む MEM分化因子産生培地上清における TGF j3の活性を示す。

図 1 1 Bは、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む MEM分化因子産生培地上清における BMPの活性を示す。

図 12は、試験試料液を超多孔体ヒドロキシァパタイト（アバセラム AXフィラー）に付着させ、 18時間培養したマウス C3H1 OT 1Z2細胞に添カ卩した。 72時間後にァパタイトを取り出し、アルカリホスファターゼ活性を測定した。添加した超多孔体ヒドロキシァパタイトを以下に示す。 HApAXGC/分化浸漬：ァパセラム AXフィラーに、肥大化能を有する軟骨細胞を ΜΈΜ分化因子産生培地で培養した培養上清を付着させたもの； HAp AX分化培地浸漬：ァパセラム AXフィラーに、 MEM分化因子産生培地を付着させたもの； HAp AXのみ：ァパセラム AXフィラー単独；分化培地のみ（MEM) ： MEM分化因子産生培地のみ（ァパセラム AXフィラー無し）

図 13A〜Dは、移植前のコラーゲンゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料を示す。図 13 Aは、 HE染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 13Bは、 TB染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 13Cは、 AB染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 13Dは、 SO染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 13Eは、コラーゲンゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円形のものは移植部位を特定するために埋入したシリコンリングである。リングの中央部には、石灰化が認められる。図 13Fは、図 13 Eと同じ標本をマイクロ CT撮影した図である。円形のものは移植部位を特定するために埋入したシリコンリングである。リング中央部には、石灰化が認められる。

図 14は、コラーゲンゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織の全体像を示す。図 14Aは、 HE染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 14Bは、 TB染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 14Cは、 AB染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 14Dは、 SO染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。

図 15は、図 13に示すコラーゲンゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率 4倍視野）を示す。図 15A〜図 1 5Dは、図 1 4 A〜図 14 Dに対応する。図 16は、図 13に示すコラーゲンゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率 10倍視野）を示す。図 16A〜図 16Dは、図 14 A〜図 14 Dに対応する。

図 1 7A〜Dは、移植前のアルギン酸と肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料を示す。図 17 Aは、 HE染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 1 7Bは、 TB染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 1 7C は、 AB染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 17Dは、 SO 染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 1 7Eは、アルギン酸と肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められる。図 1 7 Fは、図 17Eと同じ標本をマイクロ CT撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められる。

図 18は、アルギン酸と肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織の全体像を示す。図 18 Aは、 HE染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 18Bは、 TB 染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 18Cは、 AB染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 18Dは、 SO染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。

図 19は、図 17に示すアルギン酸と肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率 4倍視野）を示す。図 19A〜図 19Dは、図 18 A 〜図 18 Dに対応する。

図 20は、図 17に示すアルギン酸と肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率 10倍視野）を示す。図 2 OA〜図 20Dは、図 18 A〜図 18 Dに对応する。

図 21 A〜Dは、移植前のマトリゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料を示す。図 21 Aは、 HE染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 21 Bは、 TB染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 21 C は、 AB染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 21Dは、 SO 染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 21 Eは、マトリゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められる。図 21 Fは、図 21 Eと同じ標本をマイクロ CT撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められる。

図 22は、マトリゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織の全体像を示す。図 22Aは、 HE染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 22Bは、 TB 染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 22Cは、 AB染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 22Dは、 SO染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。

図 23は、図 22に示すマトリゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率 4倍視野）を示す。図 23A〜図 23Dは、図 22A 〜図 22Dに対応する。

図 24は、図 22に示すマトリゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率 10倍視野）を示す。図 24A〜図 24Dは、図 22 A〜図 22Dに対応する。図 25 A〜Dは、移植前のコラーゲンゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料を示す。図 25 Aは、 HE染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 25Bは、 TB染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 25Cは、 AB染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 25D は、 SO染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 25Eは、コラ一ゲンゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化は認められない。図 25 Fは、図 25 Eと同じ標本をマイクロ CT撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化は認められない。

図 26は、コラーゲンゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織の全体像を示す。図 26Aは、 HE染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 26B は、 TB染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 26Cは、 AB染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 26Dは、 SO染色（拡大レンズ倍率 35 倍視野）である。

図 27は、図 26に示すコラーゲンゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率 4倍視野）を示す。図 27 A〜図 27 Dは、図 26 A〜図 26 Dに対応する。

図 28 A〜Dは、移植前のアルギン酸と肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料を示す。図 28 Aは、 HE染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 28Bは、 TB染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 2 8Cは、 A B染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 28Dは、 SO染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 28Eは、アルギン酸と肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化は認められない。図 28Fは、図 28E と同じ標本をマイクロ CT撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化は認められない。

図 29は、アルギン酸と肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織の全体像を示す。図 29Aは、 HE染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 29 Bは、 TB染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 29Cは、 AB染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 29Dは、 SO染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。

図 30は、図 28に示すアルギン酸と肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率 4倍視野）を示す。図 3 OA〜図 30Dは、図 29 A〜図 29 Dに対応する。

図 31A〜Dは、移植前のマトリゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料を示す。図 31 Aは、 HE染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 31 Bは、 TB染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 3 1 Cは、 AB染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 31Dは、 SO染色した標本（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 31 Eは、マトリグルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化は認められない。図 31 Fは、図 31 E と同じ標本をマイクロ CT撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化は認められない。

図 32は、マトリゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織の全体像を示す。図 32Aは、 HE染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 32Bは、 TB染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 32Cは、 AB染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。図 32Dは、 SO染色（拡大レンズ倍率 35倍視野）である。

図 33は、図 31に示すマトリゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率 4倍視野）を示す。図 33A〜図 33Dは、図 32 A〜図 32Dに対応する。

図 34 Aは、ヒドロキシァパタイトのみをラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。左上のバーは、 100 0. 00 jum。図 34Bは、図 34 Aの拡大図（接眼レンズ倍率 20倍視野）である。図 34Cは、コラーゲルのみをラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。図 34Dは、図 34Cと同じ標本をマイクロ CT撮影した図である。図 34Eは、アルギン酸のみをラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。図 34Fは、図 34 Eと同じ標本をマイクロ CT撮影した図である。図 34 Gは、マトリゲルのみをラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。図 34Hは、図 34 Gと同じ標本をマイク口 CT撮影した図である。図 34 C〜Hにおける円状のものはシリコンリングである。すべての足場において石灰化は認められないことが確認された。

図 35 Aは、ペレット状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を示す（拡大レンズ倍率 35倍視野）。肥大化した細胞形態が観察される。図 35Bは、ペレツト状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞を示す（拡大レンズ倍率 35倍視野）。肥大化能を有さない軟骨細胞は肥大化していないことが観察される。図 35Cは、ペレット状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められる。図 35Dは、図 35Cと同じ標本をマイクロ CT撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められる。図 35Eは、ペレツト状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められない。図 35Fは、図 35Eと同じ標本をマイクロ CT撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められない。

図 36は、ペレツト状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織像を示す。図 36 Aは、 HE染色（接眼レンズ倍率 4倍視野）である。図 36 Bは、 TB染色（接眼レンズ倍率 4倍視野）である。図 36Cは、 AB染色（接眼レンズ倍率 4倍視野）である。図 36Dは、 SO染色（接眼レンズ倍率 4倍視野）である。

図 37は、図 35に示すペレツト状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率 10倍視野）を示す。図 37 A〜図 37Dは、図 36 A〜図 36Dに対応する。

図 38は、ペレット状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞をラット背部皮下に移植し、移植 4週間後に移植部位を摘出して染色した組織像を示す。図 38 Aは、 HE染色（接眼レンズ倍率 4倍視野）である。図 3 8Bは、 TB染色（接眼レンズ倍率 4倍視野）である。図 38Cは、 AB染色 (接眼レンズ倍率 4倍視野）である。図 38Dは、 SO染色（接眼レンズ倍率 4 倍視野）である。図 39 (1) は、肥大化能を有する軟骨細胞を因子産生培地で培養した上清 (因子を含む分化培地）を添加したヒト未分ィ匕間葉系幹細胞をアル力リホスファターゼ染色した写真である。ヒト未分化間葉系幹細胞が赤く染色されることが確認された。図 39 (2) は、（2) MEM分化因子産生培地のみ；本発明による因子を含まないが、デキサメサゾンを含む培地（Ma n i a t o p o o r u sの骨芽細胞分化培地）を添加したヒト未分化間葉系幹細胞をアルカリホスファタ一ゼ染色した写真である。ヒト未分化間葉系幹細胞はわずかに赤く染色された。図 39 (3) は、（3) MEM増殖培地のみ（因子もデキサメサゾンも含まない M EM増殖培地）を添加したヒト未分化間葉系幹細胞をアルカリホスファターゼ染色した写真である。ヒト未分化間葉系幹細胞はほとんど染色されなかった。 n = 3で行った。

図 4 OAは、大腿骨欠損部に、該因子の濃縮凍結乾燥物をコラーゲンゲルの複合材料を移植し、 4週間経過したものの写真である。

図 40Bは、大腿骨欠損部にコラーゲンゲルのみを移植し、 4週間経過したものの写真である。

図 41 Aは、ラット大腿骨に作製した直径 3. Ommの骨欠損に移植した 4週後の結果である。左列はコラーゲンゲルのみを移植した結果であり、右列は本発明による因子の濃縮凍結乾燥物とコラーゲンゲルとからなる複合材料を移植した結果である。移植後 4週目に試料を摘出して、 10%中性緩衝ホルマリン液（和光純薬株式会社）で固定した。この試料をマイクロ CTスキャナで撮影した。マイク口 CTは、東陽テク二力社製 SKY SCAN 1 1 72高分解能 X線マイクロ CTスキャナを使用した。撮影後、同スキャナに付属の再構成ソフトウェア NR e c o nを用いて再構成した。さらに、この再構成画像を三次元ボリュームレンダリングソフト VG S t u d i o Ma x (日本ビジュアルサイエンス株式会社）を用いて可視化した。上段は、マイクロ CT撮影後再構成し可視化した移植中心部の断層画像で、大腿骨に対する水平断層図。下段は、同部分の立体画像。図 4 I Bは、 41 A試料の HE染色結果である。図 41 Aでのマイクロ C T撮影後、脱脂脱灰を行い、パラフィン包埋して、薄切標本を作製し、 HE染色した。左図はコラーゲンゲルのみを移植した H E標本であり、右図は該因子の凍結乾燥物とコラーゲンゲルから成る複合材料を移植した HE標本である。右図においては左図に比べて、旺盛な骨形成像が診られる。

図 42Aは、大腿骨に作製した骨欠損のサイズが直径 2. 5mmの骨欠損に移植した 4週後の結果である。左列はコラーゲンゲルのみを移植した結果であり、右列は該因子の濃縮凍結乾燥物とコラーゲンゲルから成る複合材料を移植した結果である。移植後 4週目に試料を摘出して、 10%中性緩衝ホルマリン液（和光純薬株式会社）で固定した。この試料をマイクロ CTスキャナで撮影した。マイクロ CTは、東陽テク二カネ土製 SKY SCAN 1 1 72高分解能 X線マイクロ C Tスキャナを使用した。撮影後、同スキャナに付属の再構成ソフトウェア NRe c o nを用いて再構成した。さらに、この再構成画像を三次元ボリュームレンダリングソフト VGS t u d i o Ma x (日本ビジュアルサイエンス株式会社）を用いて可視化した。上段は、マイクロ CT撮影後再構成し可視化した移植中心部の断層画像で、大腿骨に対する水平断層図。下段は、同部分の立体画像。

. 図 42Bは、図 42 A試料の HE染色結果である。図 42 Aでのマイクロ CT 撮影後、脱脂脱灰を行い、パラフィン包埋して、薄切標本を作製し、 HE染色した。右図（本発明による因子の凍結乾燥物とコラーゲンゲルとからなる複合材料を移植した HE標本）においては左図（コラーゲンゲルのみを移植した HE標本）に比べて、良好な骨欠損の修復が診られる。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「a」、「a n」、 . 「 t h e」など) は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

(用語の定義）

以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

本明細書において「複合材料」とは、細胞と足場を含む材料をいう。

本明細書における「骨欠損」には、骨腫瘍、骨粗しょう症、リウマチ性関節炎、変形性関節症、骨髄炎および骨壊死などの病変；骨固定術、椎間拡張術および骨切術などの矯正手術；複雑骨折などの外傷および腸骨採取などによって生じる骨の欠損などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において使用される場合、骨形成の「促進」とは、すでに骨形成が起こっている場合に、目的とする変化を加えると、その骨形成の速度が増加することをいう。骨形成の「誘発」とは、骨形成が起こっていない場合に、目的とする変化を加えると骨形成が生じることをいう。

骨の欠損部位の「修復」とは、その欠損部位が健常状態になるか、またはそれに近づくことをいう。

本明細書において「固定のみでは修復できない大きさ」とは、インプラントおよび骨補填材料の使用が不可欠である大きさをいう。

(細胞）

本明細書において「成長軟骨細胞（growth cartilage cell) 」とは、発生期または成長期および骨折修復期または骨増殖期に、骨を形成する組織（すなわち成長軟骨）にある細胞をいう。成長期に骨を形成する組織を成長軟骨と呼ぶのが一般的であるが、本明細書では、発生期、成長期、骨増殖期または骨折修復期に骨を形成する組織を意味する。成長軟骨細胞はまた、肥大（化）軟骨細胞、石灰化軟骨細胞、または骨端（線）軟骨細胞ともいわれる。成長軟骨細胞がヒトに対して用いられる場合、この成長軟骨細胞はヒト由来であることが好ましいが、周知技術により拒絶反応等の問題が克服できることから、ヒト以外に由来する細胞でも用いることができる。

本発明における成長軟骨細胞は、哺乳類動物、好ましくは、ヒト、マウス、ラットまたはゥサギ由来である。

本発明における成長軟骨細胞は、肋骨の骨軟骨移行部、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨などの長管骨の骨端線部、脊椎骨の骨端線部、手骨、足骨および胸骨などの成長軟骨帯、軟骨膜、胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部、ならびに骨増殖期の軟骨部から採取され得る。これらの成長軟骨細胞は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法によって調製され得る。

本明細書において「肥大化能を有する軟骨細胞」とは、将来的に肥大化する能力のある細胞をいう。肥大化能を有する軟骨細胞は、天然でとれる「成長軟骨細胞」に加えて、本明細書において以下に定義される「肥大化能」の判定法により肥大化能を有する任意の細胞を含む。

本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、哺乳類動物、好ましくは、ヒト、マウス、ラットまたはゥサギ由来である。肥大化能を有する軟骨細胞がヒトに対して用いられる場合、この肥大化能を有する軟骨細胞はヒト由来であることが好ましいが、周知技術により拒絶反応等の問題が克服できることから、ヒト以外に由来する細胞でも用いることができる。本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、例えば、肋骨の骨軟骨移行部、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨などの長管骨の骨端線部、脊椎骨の骨端線部、手骨、足骨および胸骨などの成長軟骨帯、軟骨膜、胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部、ならびに骨増殖時の軟骨部から採取され得る。本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、未分化細胞を分化誘導させて得ることも可能である。

本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、上記部位に限らずどのような場所から採取されたものであってもよい。なぜなら、内軟骨性骨化（軟骨内骨化）によって形成される骨は、体の部位に依らず、すべて同じ機序で形成されるからである。すなわち、軟骨が形成されて、それが骨に置換される。頭蓋骨と鎖骨を除く体のほとんどの骨は、この内軟骨性骨化（軟骨内骨化）によって形成される。したがって、頭蓋骨と鎖骨を除く体のほとんどの骨には、肥大化能を有する軟骨細胞が存在し、その細胞は骨形成を行なう能力を有する。

肥大化能を有する軟骨細胞は、形態学的には肥大化することを特徴とする。本明細書において「肥大化」とは、検鏡卞で形態学的に判断され得る。細胞の肥大化は、細胞が柱状配列をしている場合には増殖層に続いて観察され、柱状配列していない場合には、周囲細胞と比較してより大きい状態をいう。

肥大化能は、 5 X 1 0 ⁵個の前記細胞を含む HAM， s F 1 2培養液を遠心することにより該細胞のペレツトを作製し、該細胞ペレツトを一定期間培養し、顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較し、有意な成長が確認されたときに、肥大化能を有すると判定される。

本明細書において、「静止軟骨細胞」とは、肋軟骨の肋骨移行部（成長軟骨部）から離れた部分に位置する軟骨をいい、生涯に亘つて軟骨として存在する組織である。静止軟骨部にある細胞を静止軟骨細胞という。本明細書において、「関節軟骨細胞」とは、関節面に存在する軟骨組織（関節軟骨）にある細胞をい Ό ο

本明細書において、軟骨細胞は、マーカーとして、 I I型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカン（ァダリカン）またはその成分、ヒアルロン酸、 I X型コラーゲン、 X I型コラーゲンまたはコドロモジュリンからなる群より選択される少なくとも 1つを発現していることを確認することにより判定される。軟骨細胞のうち、肥大化能を有する細胞は、さらに X型コラーゲン、アルカリホスファタ一ゼ- およびォステオネクチンからなる群より選択される少なくとも 1つを発現していることを確認することによって判定される。 X型コラーゲン、アルカリホスファターゼまたはォステオネタチンのいずれも発現していない軟骨細胞は、肥大化能を有していないと判定される。従って、本明細書における肥大化能を有する軟骨細胞は、形態学的に肥大化することを確認する代わりに、軟骨細胞マーカー群より選択される少なくとも 1つおよぴ肥大化能を有する軟骨細胞マーカー群より選択される少なくとも 1つを発現していることを確認することによつても判定され得る。マーカーは、特異的な染色法、免疫組織化学的な手法、 i n s i t uハイブリダィゼーシヨン法、ウェスタンブロッティング法または P C R法などの培養細胞から抽出したタンパク質または R N Aを解析する手法で、局在または発現が同定される。

本明細書において「軟骨細胞マーカー」とは、軟骨細胞において、その局在または発現が軟骨細胞を同定するにおいて補助となるものをいう。好ましくは、その局在または発現（例えば、 I I型コラーゲン、軟骨型プロテオダリカン（ァグリカン）またはその成分、ヒアルロン酸、 I X型コラーゲン、 X I型コラーゲンまたはコドロモジュリンの局在または発現）によって軟骨細胞であることが同定できるものをいう。本明細書において「肥大化能を有する軟骨細胞マーカー」とは、肥大化能を有する軟骨細胞において、その局在または発現が軟骨細胞を同定するにおいて補助となるものをいう。好ましくは、その局在または発現（例えば、 X型コラーゲン、アルカリホスファターゼまたはォステオネクチンの局在または発現）によつて肥大化能を有する軟骨細胞であることが同定できるものをいう。本明細書において、「軟骨型プロテオダリカン」とは、コアタンパク質にコンドロイチン 4硫酸、コンドロイチン 6硫酸、ケラタン硫酸、 0—結合オリゴ糖、 N—結合オリゴ糖などのダルコサミノダリカンが多数結合した高分子をいう。この軟骨型プロテオダリカンは、さらにリンクタンパクを介してヒアルロン酸と結合して軟骨型プロテオダリカン集合体を形成する。軟骨組織においてダルコサミノグリカンは豊富で、乾燥重量の 2 0〜4 0 %を占める。軟骨型プロテオグリカンは、ァグリカンとも称される。

本明細書において、「骨型プロテオダリカン」とは、軟骨型プロテオダリカンより分子量が小さく、コアタンパク質にコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、 O—結合オリゴ糖、 N—結合オリゴ糖などのダルコサミノダリカンが結合した高分子をいう。骨組織におけるダルコサミノダリカンは、脱灰骨の乾燥重量の 1 % 以下である。骨型プロテオダリカンとしては、例えば、デコリン、バイグリカンが挙げられ得る。

本明細書において「骨芽細胞」とは、骨基質上に存在し、骨基質形成およびその石灰化を行う細胞である。骨芽細胞は、 2 0〜3 0 μ πιで、立方体または円柱状の細胞である。本明細書において使用される場合、骨芽細胞は、骨芽細胞の前駆体細胞である「前骨芽細胞」を含み得る。

骨芽細胞は、マーカーとして、 I型コラーゲン、骨型プロテオダリカン（例えば、デコリン、バイグリカン）、アルカリホスファターゼ、ォステオカルシン、基質 G 1 aタンパク質、ォステオグリシン、ォステオポンチン、骨シアル酸タンパク質、ォステオネタチンまたはプレイオト口フィン（P 1 e i o t r o p h i n ) からなる群より選択される少なくとも 1つを発現することによって判定される。加えて、骨芽細胞は、軟骨細胞マーカーである I I型コラーゲン、軟骨型プ口テオダリカン（ァダリカン）またはその成分、ヒアルロン酸、 I X型コラーゲン、 X I型コラーゲンまたはコドロモジュリンを発現していないことを確認することによって確定され得る。マーカーは、特異的な染色法、免疫組織化学的な手法、 i n s i t uハイブリダィゼーシヨン法、ウェスタンブロッテイング法または P C R法などの培養細胞から抽出したタンパク質または R N Aを解析する手法で、局在または発現が同定される。

本明細書において「骨芽細胞マーカー」とは、骨芽細胞において、その局在または発現が骨芽細胞を同定するにおいて補助となるものをいう。好ましくは、その局在または発現（例えば、 I型コラーゲン、骨型プロテオダリカン（例えば、デコリン、バイグリカン）、アルカリホスファターゼ、ォステオカルシン、基質

G 1 aタンパク質、ォステオグリシン、ォステオポンチン、骨シアル酸タンパク質、ォステオネタチンまたはプレイオト口フィンの局在または発現）によって骨芽細胞であることを確認することができるものをいう。ォステオグリシンは、骨誘導因子（O I F ) ともいわれる。ォステオポンチンは、 BSP-I、2arともいわれる。骨シアル酸タンパク質は、 BSP-IIともいわれる。プレイオト口フィンは、 osteob last specific protein(OSF-l)、骨芽細胞特異的因子- 1ともいわれる。ォステオネクチンは、 SPARC. B -40ともいわれる。

骨芽細胞であると認定するためには、骨芽細胞のみを陽性と識別するマーカーで陽性であることを示すか：骨芽細胞と肥大化能を有する軟骨細胞とを陽性と識別し、軟骨細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であり、かつ骨芽細胞と軟骨細胞とを陽性と識別し、肥大化能を有する軟骨細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であることを示すか；骨芽細胞と肥大化能を有する軟骨細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、骨芽細胞を陰性と識別し肥大化能を有する軟骨細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることを示すか；または骨芽細胞と軟骨細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、骨芽細胞を陰性と識別し軟骨細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることなどを示せばよい。

肥大化能を有する軟骨細胞であると認定するためには、肥大化能を有する軟骨細胞のみを陽性と識別するマーカーで陽性あることを示すか；肥大化能を有する軟骨細胞と骨芽細胞とを陽性と識別し軟骨細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、肥大化能を有する軟骨細胞と軟骨細胞とを陽性と識別し骨芽細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であることを示すか；肥大化能を有する軟骨細胞と骨芽細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、肥大化能を有する軟骨細胞を陰性と識別し骨芽細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることを示すか；または肥大化能を有する軟骨細胞と軟骨細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、肥大化能を有する軟骨細胞を陰性と識別し軟骨細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることなどを示せばよい。

(肥大化能を有しない）軟骨細胞であると認定するためには、軟骨細胞のみを陽性と識別するマーカーで陽性あることを示すか；軟骨細胞と骨芽細胞とを陽性と識別し肥大化能を有する軟骨細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、軟骨細胞と肥大化能を有する軟骨細胞とを陽性と識別し骨芽細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であることを示すか；軟骨細胞と骨芽細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、軟骨細胞を陰性と識別し骨芽細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることを示すか；または軟骨細胞と肥大化能を有する軟骨細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、軟骨細胞を陰性と識別し肥大化能を有する軟骨細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることなどを示せばよい。

本明細書において、軟骨細胞、肥大化能を有する軟骨細胞、骨芽細胞および誘導骨芽細胞を認定するためには、例えば、以下の表に列挙される細胞マーカーの組み合わせが用いられ得る。

本明細書において、軟骨細胞と、肥大化能を有する軟骨細胞と、骨芽細胞とは、前記マーカー以外にも細胞の形態、各種染色を観察することにより識別することができる。

軟骨細胞は、検鏡下では、数個の細胞が集まり、酸性トルイジン青染色でメタクロマジ一を示し、アルシアン青染色で青く染まり、サフラニン 0染色で赤く染まり、かつアル力リホスファターゼ染色されない細胞である。

肥大化能を有する軟骨細胞は、検鏡下では、細胞が柱状配列をしている場合には増殖層に続いて観察されて増殖層細胞より大きい状態を示し、柱状配列していない場合には、周囲細胞と比較してより大きい状態を示し、酸性トルイジン青染色でメタクロマジ一を示し、アルシアン青染色で青く染まり、サフラニン 0染色で赤く染まり、かつアル力リホスファターゼ染色される細胞である。

骨芽細胞は、 20〜30 μπιで、立方体または円柱状の形態を示し、かつアル力リホスファターゼ活性を示す細胞である。

上記アルカリホスファターゼ活性は、 Α) サンプル 100 1に、 50 / lの 4mg m 1の p—二トロフエ-ルリン酸を含む溶液おょぴアルカリバッファー

(シグマ社、 A9226) を加え、 37 °Cで 15分間反応させ、 IN N a OH を 50 μ 1添加することによって反応を止めたときの吸光度と、その後濃塩酸を 20 μ 1添加したときの 405 nmの吸光度とを測定する工程；および B) 該濃塩酸の添加前後の該吸光度の差を計算する工程によって決定される。この吸光度の差が該アルカリホスファターゼ活性の指標であり、吸光度の差の絶対値を増加させたときに、活性があることを示すと判断される。

このアルカリホスファターゼ活性はまた、 A) サンプル 100 // 1に、 50 μ 1の 4mgZm 1の p—二トロフエ二ルリン酸を含む溶液およびアルカリバッファー（シグマ社、 A9226) を加え、 37°Cで 15分間反応させ、 IN N a OHを 50 μ 1添加することによって反応を止めたときの吸光度と、その後濃塩酸を 20 μ 1添カ卩したときの 405 nmの吸光度とを測定する工程；および B) 濃塩酸の添加前後の吸光度の差を計算する工程によって決定される。この吸光度の差が該ァルカリホスファターゼ活性の指標であり、吸光度の差の相対値を少なくとも約 1倍より高く上昇させたときに、活性があることを示すと判断される。実験ごとに p—二トロフヱノール濃度が 0〜1 O mMの溶液を作製し、その吸光度を測定し、横軸に濃度を、縦軸に吸光度を取り、それらの値を一次直線で近似したものを検量線とする。吸光度から絶対値は、この検量線より算出することができる。

本明細書において「誘導骨芽細胞」とは、本発明による誘導骨芽細胞分化誘導因子によって未分化細胞から誘導された細胞をいう。この誘導骨芽細胞は、 A) 肥大化能を有する軟骨細胞を、ダルココルチコイド、 ]3—グリセロホスフヱートおよびァスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも 1つを含む分化因子産生培地において培養して得られる上清または該上清中に存在する誘導骨芽細胞分化誘導因子を提供する工程；および B ) 該上清または該誘導骨芽細胞分化誘導因子と、培地成分とを含む未分化細胞培養培地で、未分化細胞を誘導骨芽細胞への誘導に充分な条件下で培養する工程を包含する方法によって産生され得る。上記誘導骨芽細胞はまた、 A) 肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、 β —グリセ口ホスフェート、ァスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子を提供する工程；および Β ) 該誘導骨芽細胞分化誘導因子と培地成分とを含む未分化細胞培養培地で、未分化細胞を培養して誘導骨芽細胞へ分化させる工程を包含する方法によっても誘導され得る。本発明の誘導骨芽細胞は、酸性トルイジン青染色により異染性を示さず、かつサフラニン Ο染色において陰性を示し得る。

本明細書において「誘導骨芽細胞マーカー」とは、誘導骨芽細胞において、その局在または発現が誘導骨芽細胞を同定するにおいて補助となるものをいう。例えば、その局在または発現によって誘導骨芽細胞であることを確認することができるものをいう。誘導骨芽細胞は、天然の骨芽細胞と同様に、以下のようなマーカーの局在または発現（例えば、 I型コラーゲン、骨型プロテオダリカン（例えば、デコリン、バイグリカン）、アルカリホスファターゼ、ォステオカルシン、基質 G 1 aタンパク質、ォステオグリシン、ォステオポンチン、骨シアル酸タンパク質、ォステオネタチンまたはプレイオト口フィンの局在または発現）によつて誘導骨芽細胞であることを確認することができる。

本明細書において「分化誘導」とは、細胞、組織または器官のような生物の部分の状態の発達過程であって、特徴のある組織または器官の形成を誘導する過程をいう。「分化」、「分化誘導」は、主に発生学（embryology) 、発生生物学

(developmental biology) などにおいて使用されている。 1個の細胞からなる受精卵が分裂を行い成体になるまで、生物は種々の組織および器官を形成する。分化前または分化が十分でない場合のような生物の発生初期は、一つ一つの細胞または細胞群が何ら形態的または機能的特徴を示さず区別することが困難である。このような状態を「未分化」であるという。「分化」は、器官のレベルでも生じ、器官を構成する細胞がいろいろの違った特徵的な細胞または細胞群へと発達する。これも器官形成における器官内での分化といい、このような発達を誘導することも、分化誘導という。

本明細書において、「誘導骨芽細胞分化誘導能」とは、未分化細胞、好ましくは、胚性幹（E S ) 細胞、胚性生殖（E G) 細胞または体性幹細胞、より好ましくは、間葉系幹細胞を本発明の誘導骨芽細胞に分化誘導する能力をいう。この誘導骨芽細胞分化誘導能の一つの指標として、誘導骨芽細胞マーカー（例えば、ァルカリホスファターゼ）が使用され得る。具体的には、本発明において使用される因子は、イーグル基礎培地中で C 3 H 1 0 T 1 / 2細胞にこの因子を曝露した場合あるいは最小必須培地（M E M) 中で間葉系幹細胞にこの因子を曝露した場合、因子を含まない各培地において各細胞を培養した場合と比較して、各細胞のアルカリホスファターゼ（A L P ) 活性（例えば、この細胞全体におけるアル力リホスファターゼ活性）を、少なくとも約.1倍より高く上昇させたときに誘導骨芽細胞分化誘導能を有すると判断される。このアル力リホスファターゼ活性は、 A) 該因子を含むかまたは含まないサンプル 1 0 0 μ 1に、それぞれ 5 0 μ 1の 4mg m 1の p—二トロフエニノレリン酸を含む溶液およびアルカリバッファー (シグマ社、 A9 2 2 6) を加え、 3 7 °Cで 1 5分間反応させ、 I N N a OH を 5 0 /X 1添加することによって反応を止めたときの吸光度と、その後濃塩酸を 2 0 μ 1添加したときの 4 0 5 nmの吸光度とを測定する工程；および B) 該濃塩酸の添加前後の該吸光度の差を計算する工程であって、該吸光度の差が、該ァルカリホスファターゼ活性の指標である、工程によって決定される。また、本発明において使用される因子は、イーグル基礎培地中で C 3 H 1 0 T 1Z2細胞にこの因子を曝露した場合あるいは最小必須培地（MEM) 中で間葉系幹細胞にこの因子を曝露した場合、各細胞のアルカリホスファターゼ（AL P) 活性（例えば、この細胞全体におけるアルカリホスファターゼ活性）を増加させたときに誘導骨芽細胞分化誘導能を有すると判断される。このアル力リホスファターゼ活性は、 A) 該因子を含むかまたは含まないサンプル 1 0 0 μ 1に、それぞれ 5 0 μ 1の 4mgZm 1の p—-トロフエ二ルリン酸を含む溶液およびアルカリバッファー（シグマ社、 A9 2 2 6) を加え、 3 7 °Cで 1 5分間反応させ、 I N N a OHを 5 0 μ 1添加することによって反応を止めたときの吸光度と、その後濃塩酸を 2 0 _μ 1添カ卩したときの 4 0 5 nmの吸光度とを測定する工程；および B) 濃塩酸の添加前後の吸光度の差を計算する工程であって、吸光度の差が、アル力リホスファターゼ活性の指標である、工程によって決定される。実験ごとに p— ニトロフエノール濃度が 0〜1 OmMの溶液を作製し、その吸光度を測定し、横軸に濃度を、縦軸に吸光度を取り、それらの値を一次直線で近似したものを検量線とする。吸光度から絶対値は、この検量線より算出することができる。

このアルカリホスファターゼ活性は、骨形成の指標として従来使用されており、アルカリホスファターゼ活性が上昇すると、一般に骨形成が促進したと判断されている（須田立雄編、「骨形成と骨吸収及びそれらの調節因子 1」、株式会社廣川書店、平成 7年、 3月 30日、 p. 39-44) 。

本明細書において、未分化細胞（例えば、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、血管幹細胞、肝幹細胞、脖幹細胞、神経幹細胞など）に対する「誘導骨芽細胞分化誘導能」とは、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力をいう。例えば、誘導骨芽細胞分化誘導能は、ダルココルチコイド、 3—グリセ口ホスフエ一トおよびァスコルビン酸によって分化誘導されない未分化細胞を、誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を含み得る。誘導骨芽細胞分化誘導能は、対象とする細胞を、 1. 25 X 10⁴細胞/ cm²で 24穴プレート

(ベタトン .ディッキンソン社製、 2. 5 X 10⁴ 穴）に均一に播種し、 3

7°Cにて 5% C0₂インキュベータ一中で 72時間培養した場合、誘導骨芽細胞マーカーの少なくとも一種を発現誘導また発現上昇を測定することによって判定され得る。

本明細書において「未分化細胞」とは、最終分化に至っていない細胞、まだ分化し得る細胞をいう。本明細書で使用する場合、未分化細胞は幹細胞（例えば、胚性幹細胞、胚性生殖細胞または体性幹細胞）であり得、例えば、間葉系幹細胞

(例えば、骨髄由来間葉系幹細胞など）、造血幹細胞、血管幹細胞、肝幹細胞、脖幹細胞または神経幹細胞であり得る。さらに、未分化細胞は、分化経路にあるすべての細胞を含み、例えば、 C3H10T 1/2細胞、 ATDC5細胞、 3T 3— Sw i s s a l b i n o細胞、 BALB/3T3細胞、 N I H 3 T 3細胞、

PT— 2501、初代ラット骨髄由来幹細胞であり得る。これらの細胞は、大日本住友製薬だけでなく、国内外の販売会社（三光純薬、コスモバイオ社、タカラバイオ社、東洋紡績社、住商ファーマバイオメディカル社、 Cambrex社、 StemCell Technology社、 Invitrogen社）や細胞バンク等からも入手可能である。本発明において使用される未分化細胞は、誘導骨芽細胞への分化を達成することができる限りどのような細胞でもあってもよレ、。本発明において使用される未分化細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ゥサギなど）に由来する細胞であり得る。これらとしては、例えば、ラット骨髄から採取した間葉系幹細胞が挙げられ得る。

本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「pluripot_enCy」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹 (E S ) 細胞、胚性生殖（E G) 幹細胞または体性幹細胞（組織幹細胞、組織特異的幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、 1 9 8 1年に初めて樹立され、 1 9 8 9年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。 1 9 9 8年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。胚性生殖幹細胞は、始原生殖細胞が特定の環境因子にさらされることにより脱分化して形成されると考えられている細胞であり、胚性幹細胞としての性質をもちながら、由来した始原生殖細胞の性質も一部保持している。体性幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、組織中に存在し、胚性幹細胞より多能性のレベルが低く、分化の方向性が限定されている細胞である。一般に幹細胞は未分化な細胞内構造をしており、核細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。本明細書において使用される場合は、幹細胞は好ましくは間葉系幹細胞であり得るが、状況に応じて他の体性幹細胞、胚性生殖細胞または胚性幹細胞も使用され得る。

由来する部位により分類すると、体性幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の体性幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の体性幹細胞としては、瞵幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の体性幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の体性幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。

細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に内臓器に存在し、肝幹細胞、腌幹細胞などが含まれる。

本明細書において「間葉系幹細胞」とは、間葉系の組織に見出される幹細胞をいう。間葉系の組織としては、骨髄、脂肪、血管内皮、平滑筋、心筋、骨格筋、軟骨、骨、じん帯が挙げられるが、これらに限定されない。間葉系幹細胞は、代表的には、骨髄、脂肪組織、滑膜組織、筋組織、末梢血、胎盤組織、月経血または臍帯血（好ましくは、骨髄）に由来する幹細胞であり得る。

本明細書において「増殖培地」とは、基礎培地、抗生物質（例えば、ベニシリンおよびストレプトマイシン）、抗菌剤（例えば、アンホテリシン B ) および血清成分（例えば、ヒト血清、ゥシ血清、ゥシ胎仔血清）を含んでいる培地をいう。代表的には、血清成分は、 0〜2 0 %程度添加され得る。さらに、基礎培地が最小必須培地（ME M) である場合、「ME M増殖培地」といい、基礎培地が H a m' s F 1 2培地（HAM) である場合、「HAM増殖培地」という。

本明細書において「分化因子産生培地」とは、基礎培地を含み、かつダルココルチコイド、 ]3—グリセ口ホスフェートおよぴァスコルビン酸からなる群より選択される従来型骨芽細胞分化誘導成分の少なくとも 1つを含んでいる培地をいう。分化因子産生培地は、 i3—グリセ口ホスフエ一トおよびァスコルビン酸からなる群より選択される従来型骨芽細胞分化誘導成分の少なくとも 1つを含んでいてもよい。分化因子産生培地は、従来型骨芽細胞分化誘導成分として、ダルココルチコイド、 ]3—グリセ口ホスフェートおよぴァスコルビン酸のすべてを含んでいてもよい。好ましくは、分^ i因子産生培地は、基礎成分として、最小必須培地（M E M) を含み、従来型骨芽細胞分化誘導成分として ]3—グリセ口ホスフェートおよびァスコルビン酸のすべてを含む。好ましくは、「分化因子産生培地」は、血清成分（例えば、ヒト血清、ゥシ血清、ゥシ胎仔血清）をさらに含んでいてもよレ、。代表的には、血清成分は、 0〜 2 0 %程度添加され得る。分化因子産生培地は、より好ましくは、ダルココルチコイド、）3—グリセ口ホスフェート、ァスコルビン酸および血清成分を含み得る。さらに、基礎培地が最小必須培地（M E M) である場合、「M E M分化因子産生培地」といい、基礎培地が H a m， s F 1 2培地（H AM) である場合、「H AM分化因子産生培地」という。この分化因子産生培地自体には、 C 3 H 1 0 T 1 / 2細胞、 3 T 3— S w i s s a 1 b i n o細胞、 B a 1 b 3 T 3細胞、 N I H 3 T 3細胞を骨芽細胞に分化誘導させる能力は見出されていない。従って、本発明による因子は、分化因子産生培地中に含まれる成分とは異なると考えられる。

本明細書において「従来型骨芽細胞分化誘導成分」とは、 Maniatopoulosらによつ" 提口昌^れ 7こもので (Maniatopou丄 os, Cら： Bone formation in vitro by st romal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue R es， 254： 317-330, 1988. ) 、以来、骨髄細胞から骨芽細胞を分化誘導させる場合に使用されている成分であって、ダルココルチコイド、 j3—グリセ口ホスフエートおよぴァスコルビン酸の組み合わせをいう。

本明細書において「ダルココルチコイド」とは、副腎皮質ホルモンであり、糖質代謝に関係するステロイドホルモンの総称である。ダルココルチコイドは、骨髄細胞が骨芽細胞に分化誘導するための成分としても知られている（Maniatopou los, C · Bone iormation in vitro by stromal cells obtained from bone mar row of young adult rats. Cell Tissue Res, 254： 317-330， 1988. ) 力上記の細胞に対する分化誘導の効果は知られていない。ダルココルチコイドは、糖質コルチコイドとも称される。代表的には、デキサメサゾン、ベタメタゾン、プレドニソロン、プレドニソン、コルチゾン、コルチゾル、コルチコステロンなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、デキサメサゾンが使用される。天然のダルココルチコイドと同様な作用を有する化学合成物質も含まれ得る。これらの代表的なダルココルチコィドは、 J3—グリセ口ホスフェートおよぴァスコルビン酸とともに、肥大化能を有する軟骨細胞の培養に使用されると、 C 3H 1 0T 1/2細胞を骨芽細胞へと分化誘導する活性を有する因子を産生することから、本発明においていずれも分化因子産生培地中に含ませることができる。グルココルチコイドは、分化因子産生培地中に、 0. 1 nM〜l OmMの濃度で含ませることができ、好ましくは、 1 0〜 1 00 nMの濃度である。

本明細書において「ーグリセ口ホスフェート」とは、グリセ口リン酸（C₃ H₅ (OH) ₂OP0₃H₂) のうちリン酸基が ]3位に結合したものの塩の総称である。塩としては、カルシウム塩、ナトリウム塩などを挙げることができる。 ]3 ーグリセ口ホスフェートは、骨髄細胞が骨芽細胞に分化誘導するための成分とし t>知りれてレヽる (Maniatopoulos, Cら： Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Ceil Tissue Res, 2 54： 317-330, 1988. ) 力上記の細胞に対する分化誘導の効果は知られていない。

)3—グリセ口ホスフェートは、ダルココルチコィドおよびァスコルビン酸とともに、肥大化能を有する軟骨細胞の培養に使用されると、 C 3H1 0T 1Z2細胞を骨芽細胞へと分化誘導する活性を有する因子を産生すること力ら、本発明においていずれも分化因子産生培地中に含ませることができる。 —グリセ口ホスフエートは、分化因子産生培地中に、 0. lmM〜lMの濃度で含ませることができ、好ましくは、 l OmMの濃度である。

本明細書において「ァスコルビン酸」とは、白色、結晶性の水溶性ビタミンであり、多くの植物体とくに柑橘類に含まれている。ビタミン Cとも称される。ァスコルビン酸は、骨髄細胞が骨芽細胞に分化誘導するための成分としても知られ飞レヽ (Maniatopoulos, しら： Bone iormation in vitro by stromal cells obta ined from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res, 254 3iJ— 330, . 1988. ) I 上記の細胞に対する分化誘導の効果は知られていない。本発明において、ァスコルビン酸は、ァスコルビン酸およびその誘導体を含み得る。ァスコルビン酸としては、例えば、 L—ァスコルビン酸、 L—ァスコルビン酸ナトリウム、 L—ァスコルビン酸パルミチン酸エステル、 Lーァスコルビン酸ステアリン酸エステノレ、 Lーァスコルビン酸 2—ダルコシド、ァスコノレビン酸リン酸エステルマグネシウム、ァスコルビン酸ダルコシドが挙げられるが、これらに限定されなレ、。天然のァスコルビン酸と同様な作用を有する化学合成物質も含まれ得る。これらの代表的なァスコルビン酸は、ダルココルチコイド、 i3—グリセロホスフヱートとともに、肥大化能を有する軟骨細胞の培養に使用されると、 C 3 H 1 0 T 1 Z 2細胞を骨芽細胞へと分化誘導する活性を有する因子を産生することから、本発明においていずれも分化因子産生培地中に含ませることができる。ァスコルビン酸は、分化因子産生培地中に、 0 . 1 μ g Zm 1〜5 m _{g /} m 1の濃度で含ませることができ、好ましくは、 1 0〜5 0 μ g Zm 1の濃度である。

(好ましい実施形態の説明）

以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。

(複合材料）

1つの局面において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を提供する。この複合材料は、 A) 肥大化能を有する軟骨細胞を、ダルココルチコィド、一グリセ口ホスフェートおよびァスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも 1つを含む培地において培養することによって得ることができる、誘導骨芽細胞分化誘導因子、および B ) 生体適合性を有する足場を含み得る。 - . 一つの実施形態において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を提供する。この複合材料は、 A) 肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、一グリセ口ホスフェート、ァスコルビン酸おょぴ血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子、および B ) 生体適合性を有する足場を含み得る。

一つの実施形態において、前記誘導骨芽細胞分化誘導因子は、（1 ) 前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地に存在し得る力 \ または（2 ) 該肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、分子量 5 0， 0 0 0の限外濾過に供することにより得られる分子量 5 0， 0 0 0以上の画分に存在し得る。

一つの実施形態において、本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、濃縮されたものであり得る。本明細書において「濃縮された」とは、濃度を濃くされた状態をいう。この誘導骨芽細胞分化誘導因子は、 1倍以上に濃縮されたものであり得る。好ましくは、この上清は、 2倍以上に濃縮されたものであり得る。

一つの実施形態において、本発明において使用され得る誘導骨芽細胞分化誘導因子は、固体（例えば、凍結乾燥されたもの）であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、足場が溶液である場合には、その足場と接触させることにより液体になり得る。また、足場が固体である場合には充分に接触させるために、溶媒を用いて溶液にすることもあり得るからである。本明細書において「凍結乾燥された」とは、水溶液を凍結させ、凍結状態のまま真空装置で水分を直接昇華させて乾燥させた状態をいう。

一つの実施形態において、本発明の複合材料では、誘導骨芽細胞分化誘導因子は、前記生体適合性を有する足場に付着され得る。本明細書において、「付着」とは、ものがついて離れないこと、くっつくことをいう。本明細書において、誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性有する足場とが「付着されている状態」とは、誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性有する足場とが接触し、誘導骨芽細胞分ィヒ誘導因子が生体適合性を有する足場の表面または内部孔内について離れない状態（例えば、吸着、含浸、浸漬、接着、粘着、固着等している状態）をいう。本明細書において「接触」とは、ものが接すること、触れることをいう。誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを「接触させる」とは、誘導骨芽細胞分化誘導因子が生体適合性を有する足場に付着する程度、触れることをいう。

一つの実施形態において、本発明の複合材料では、誘導骨芽細胞分化誘導因子は、前記生体適合性を有する足場に分散され得る。例えば、上記誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とが分散されている状態とは、一箇所以上の場所に分かれて存在している状態であり得る。

一つの実施形態において、本発明の複合材料では、前記誘導骨芽細胞分化誘導因子は、例えば、生体適合性を有する足場の表面、該生体適合性を有する足場の内部孔内等の領域に、付着または分散され得る。

一つの実施形態において、本発明の複合材料において使用される生体適合性を有する足場は、ゲル状足場、 3次元状足場であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、該因子が付着または分散するもの、もしくは付着または分散させることが出来るものであれば、どんなものでも使用できるからである。

一つの実施形態において、本発明の複合材料において使用される生体適合性を有する足場は、例えば、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニァ、アパタイト一ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フイブリン、ヒアルロン酸、細胞外基質混合物、絹、セルロース、デキストラン、ァガロース、寒天、合成ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリダリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシァノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、またはそれらの組み合わせ等であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、該因子が付着または分散するもの、もしくは付着または分散させることが出来るものであれば、どんなものでも使用できるからである。

好ましくは、前記生体適合性を有する足場は、例えば、多孔質ヒドロキシアバタイト（例えば、 HO Y A社製ァパセラム気孔率 5 0 %等）、超多孔質ヒドロキシアパタイト（例えば、 H O Y A社製ァパセラム気孔率 8 5 %、 B D社製 3 Dスキヤホールド等）、アパタイトコラーゲン混合体（例えば、 H O Y A社製ァパセラム顆粒と新田ゼラチン社製コラーゲンゲルとの混合物等）、アパタイトコラーゲン複合体（例えば、 H O Y A社製アバコラ等）、コラーゲンゲル（例えば、新田ゼラチン社製等）、コラーゲンスポンジ（例えば、新田ゼラチン社製等）、ゼラチンスポンジ（例えば、山之内製薬社製止血用ゼラチンスポンジ等）、フイブリンゲル（例えば、二プロ社製ベリプラスト P等）、合成ペプチド（例えば、 3 Dマトリックス社製ブラマックス等）、細胞外基質混合物（例えば、 B D社製マトリゲル等）、アルギン酸（例えば、ケルコ社製ケルトン L V C R等）、ァガロース (例えば、和光純薬社製ァガロース等）、ポリダリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸ポリ乳酸共重合体、それらの組合せであり得る。より好ましくは、前記生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンゲル、細胞外基質であり得る。

好ましい実施形態において、前記生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアバタイト、コラーゲン、アルギン酸、ラミニンとコラーゲン I Vとェンタクチンとの混合物等であり得る。

一つの実施形態において、本発明の複合材料において肥大化能を有する軟骨細胞を培養するのに使用される培地（本明細書では、分化因子産生培地ともいう。）は、ダルココルチコイド（例えば、デキサメサゾン、プレドニソロン、プレドニソン、コノレチゾン、ベタメタゾン、コノレチゾノレ、コノレチコステロン）、 β —グリセ口ホスフェート、ァスコルビン酸等の少なくとも 1つを含んでいてもよい。好ましくは、この培地は、 J3—グリセ口ホスフヱートおよぴァスコルビン酸の両方を含み得る。好ましくは、この培地は、ダルココルチコイド、 3—グリセ口ホスフェートおよびァスコルビン酸のすべてを含む。この培地は、さらに、例えば、トランスフォーミング增殖因子一 i3 (TGF- β) 、骨形成因子（BM P) 、白血病阻止因子（L I F) 、コロニー刺激因子（C S F) 、インスリン様成長因子（I GF) 、線維芽細胞増殖因子（FGF) 、多血小板血漿（PR P) 、血小板由来増殖因子（PDGF) 、血管内皮増殖因子（VEGF) などのような他の成分を含んでいてもよい。この培地は、血清成分（例えば、ヒト血清、ゥシ血清、ゥシ胎仔血清）をさらに含むことが有用であり得る。代表的には、血清成分は、 0〜 20 %程度添加され得る。

また、本発明の複合材料において肥大化能を有する軟骨細胞を培養するのに使用される培地としては、例えば、 HAM' s F 1 2 (Ha mF 1 2) 、ダルべッコ改変イーグル培地（DMEM) 、最小必須培地（MEM) 、 αΜΕΜ、ィーダル基礎培地（ΒΜΕ) 、フィットン一ジャクソン改変培地（BG J b) のような培地が挙げられるが、これらに限定されない。この培地は、細胞の増殖および分化誘導を促進する物質を含んでいてもよい。この培地には、 C 3H 1 0 T 1 2細胞、 3 T 3— Sw i s s a l b i n o細胞、 B a 1 b/3 T 3細胞を骨芽細胞に分化誘導させる能力は見出されていない。

一つの実施形態において、本発明の複合材料では、前記誘導骨芽細胞分化誘導因子は、凍結乾燥した状態でコラーゲン溶液と混合され、かつ前記培地は、基礎成分として、最小必須培地（MEM) を含んでいてもよく、さらにダルココルチコィド、 ]3—グリセ口ホスフェートおよびァスコルビン酸を含んでいてもよい。他の実施形態において、本発明の複合材料では、前記誘導骨芽細胞分化誘導因子は、ヒドロキシァパタイ卜に付着または分散され、かつ前記培地は、基礎成分として、最小必須培地（MEM) を含んでいてもよく、さらにダルココルチコィド、 ]3—グリセ口ホスフェートおよびァスコルビン酸を含んでいてもよい。

一つの実施形態において、. 本発明の複合材料は、骨の欠損を修復または治療するための骨形成において使用され得る。このような骨の欠損としては、例えば、骨腫瘍、骨粗しょう症、リウマチ性関節炎、変形性関節症、骨髄炎および骨壊死などの病変；骨固定術、椎管拡張術および骨切術などの矯正手術；複雑骨折などの外傷およぴ腸骨採取などによって生じる骨の欠損などが挙げられるが、これらに限定されない。前記欠損は、固定のみでは修復できない大きさを有するものであってもよい。

他の実施形態において、本発明の複合材料は、周辺に骨がない部位に骨を形成させるための骨形成において使用され得る。周辺に骨がない部位とは、例えば、皮下、筋肉や脂肪などの軟部組織、消化器、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器、脈管、神経、感覚器であり得るが、これらに限定されない。

本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、イーグル基礎培地中で C 3H 1 OT 1 2細胞にこの因子を曝露した場合、該因子を含まないィーグル基礎培地において培養した場合と比較して、 C 3H1 OT 1Z2細胞のアル力リホスファターゼ（ALP) 活性（例えば、この細胞全体におけるアルカリホスファターゼ活性）を、少なくとも約 1倍より高く上昇させる能力を有し、アル力リホスファターゼ活性は、 A) 該因子を含むかまたは含まないサンプル 100 μ 1に、それぞれ 50 μ 1の 4mgZm 1の p—二ト口フエ二ルリン酸を含む溶液およびアルカリバッファー（シグマ社、 A9226) を加え、 37°Cで 15分間反応させ、 IN NaOHを 50 μ 1添加することによって反応を止めたときの吸光度と、その後濃塩酸を 20 X 1添加したときの 405 nmの吸光度とを測定する工程；および B) 該濃塩酸の添加前後の該吸光度の差を計算する工程であつて、該吸光度の差が、該アルカリホスファターゼ活性の指標である、工程によつて決定される。好ましくは、アルカリホスファターゼ活性は、少なくとも 2倍、少なくとも 3倍、少なくとも 4倍、少なくとも 5倍、少なくとも 6倍、少なくとも 7倍、少なくとも 8倍、少なくとも 9倍、少なくとも 10倍、少なくとも 1 1 倍、少なくとも 1 2倍または少なくとも 13倍の増加を示す。本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子はまた、イーグル基礎培地中で C3H10T 1 2細胞に該因子を曝露した場合、 C3H1 OT1Z2細胞のアルカリホスファターゼ（ALP) 活性（例えば、この細胞全体におけるァルカリホスファターゼ活性）を増加させる能力を有し、このアルカリホスファターゼ活性は、 A) 該因子を含むかまたは含まないサンプル 100 μ 1に、それぞれ 50 μ 1の 4mg/m 1の p—ニトロフエ二ルリン酸を含む溶液およびアル力リバッファー（シグマ社、 A9226) を加え、 37 °Cで 15分間反応させ、 1 N Na OHを 50 1添加することによって反応を止めたときの吸光度と、その後濃塩酸を 20 μ 1添加したときの 405 nmの吸光度とを測定する工程；および B) 該濃塩酸の添加前後の該吸光度の差を計算する工程であって、該吸光度の差が、該アルカリホスファターゼ活性の指標である、工程によって決定される。好ましくは、アル力リホスファターゼ活性は、少なくとも 2倍、少なくとも 3倍、少なくとも 4倍、少なくとも 5倍、少なくとも 6倍、少なくとも 7倍、少なくとも 8倍、少なくとも 9倍、少なくとも 10倍、少なくとも 1 1倍、少なくとも 1 2倍または少なくとも 13倍の増加を示す。

一つの実施形態において、本発明の複合材料において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、固体（好ましくは、凍結乾燥されたもの）であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、足場が溶液である場合には、その足場と接触させることにより液体になり得る。また、足場が固体である場合には充分に接触させるために、溶媒を用いて溶液にすることもあり得るからである。

本明細書において「因子」（factor, agent) とは、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素でもあってもよい。本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、例えば、タンパク質、ポリべプチド、オリゴペプチド、ペプチド、アミノ酸、核酸、ポリサッカライド、脂質、有機低分子、またはそれらの複合体であり得る。

本明細書において「誘導骨芽細胞分化誘導因子」とは、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化させる因子をいい、その活性を保持する限り単体であっても複合体であってもよい。この誘導骨芽細胞分化誘導因子は、肥大化能を有する軟骨細胞を、ダルココルチコィド、）3—グリセ口ホスフェートおよぴァスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも 1つを含む分化因子産生培地において培養することによって得ることができる。本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子と同一の生物学的活性を有する因子であれば、別の手法で得られた因子または別の形態の因子であっても、本発明において未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化させる因子と交換可能に用いられ得ることが理解される。このような因子は、実施例において基本的に同定されたもの以外であっても、本明細書における開示に基づいて、当該分野における技術常識を用いることによって同定することができる。本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、 I型コラーゲン、骨型プロテオダリカン（例えば、デコリン、バイグリカン）、アルカリホスファターゼ、ォステオカルシン、基質 G 1 aタンパク質、ォステオグリシン、ォステオポンチン、骨シアル酸タンパク質、ォステオネタチンおよびプレイオト口フィンからなる群より選択される誘導骨芽細胞に特異的な物質の発現を増大させる能力を有する。従って、本明細書における誘導骨芽細胞分化誘導因子は、酵素活性においては、未分化細胞のアル力リホスファターゼ活性を上昇させることを特徴とし、または遺伝子発現レベルもしくはタンパク質レベルにおいては、未分化細胞において骨芽細胞のマーカー群より選択させる少なくとも 1つを発現させる能力を有する因子である。好ましい実施形態において、本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、未分化細胞の、アルカリホスファターゼ活性の上昇、誘導骨芽細胞マーカーの局在または発現を確認することによって同定され得る。別の実施形態において、本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、沸騰水中（通常、約 9 6 °C〜約 1 0 0 °C、例えば、約 9 6 °C、約 9 7 °C、約 9 8 °C、約 9 9 °Cおよぴ約 1 0 0 °Cが挙げられる）で 3分間の加熱処理により未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する活性が消失する。沸騰しているかどうかは目視にて確認する。未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する活性の消失は、誘導骨芽細胞マーカーの局在または発現が実質的に増加しない状態をいう。別の実施形態において、本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、沸騰水中で 3分間の加熱処理により未分化細胞のアル力リホスファターゼ活性の上昇を誘導する活性が消失する。未分化細胞のアル力リホスファターゼ活性の上昇を誘導する活性の消失は、アルカリホスファターゼ活性が実質的に上昇しない状態をいう。

本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。本明細書において用いられる場合、この用語は、好ましくは、核酸分子によって翻訳された形態であることから、通常、直鎖であり、天然のアミノ酸のみから構成されるがそれに限定されない。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体にアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたァミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフイド結合形成、グリコシル化、脂質化、ァセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）がある。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1または 2以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のァミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ぺプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。

本明細書では、特に言及するときは、「タンパク質」は、比較的大きな分子量を有するアミノ酸のポリマーまたはその改変体を指し、「ペプチド」というときは、比較的小さな分子量を有するアミノ酸のポリマーまたはその改変体を指すことがある.ことが理解されるべきである。 (肥大化能を有する軟骨細胞）

本発明において使用される肥大化能を有する軟骨細胞は、哺乳類動物、好ましくは、ヒト、マウス、ラット、またはゥサギ由来である。哺乳類動物において骨化方式は共通しており、膜性骨化（membranous ossification)と軟骨性骨化（chon dral ossification)の二種類の方式がある。膜性骨化は、頭蓋骨の大部分または鎖骨のように体表面の近くにあって平板な骨が形成されるときに機能する様式である。膜性骨化では、軟骨を経ないで結合組織中に直接、膜状の骨が形成される。膜性骨化は、膜内骨化（intramembraous ossification)または結合組織性骨化とも呼ばれる。軟骨性骨化は、椎骨、肋骨、肢骨などのよ §な体の内側にある内骨格の形成されるときに機能する様式である。軟骨性骨化では、まず軟骨が形成され、その骨幹部に血管が侵入して軟骨が石灰化し、石灰化軟骨 (calcified cartilage)が形成される。この石灰化軟骨は、形成されると直ぐに破壊され、骨化が起こり、骨および原始骨髄が形成される。この際、軟骨内部に軟骨原基が形成された後、これに成長ホルモン等が作用して長軸おょぴ短軸方向へと軟骨が伸長、拡大する。その後、骨端部にも血管が侵入して骨化が生じる。軟骨性骨化は、内軟骨性骨化、endochondra丄 ossification)ま 7こは軟' 內骨ィ匕 (enchondral ossification)と t> 呼ばれる。（藤田尚男、藤田恒夫、「骨の発生」、標準組織学総論、 1 2 7頁；硬組織の起源と進化一序説—、須田立夫、 T h e B O N E , 1 8卷、 4 2 1— 4 2 6頁、 2 0 0 4 ;内軟骨性骨形成の過程、鈴木不二男、「骨はどのようにしてできるか」鈴木不二男著、大阪大学出版会、 2 1頁、 2 0 0 4 ;鈴木隆雄ら編「骨の事典」、朝倉書店を参照のこと。）。従って、本件の未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する能力を有する因子を産生する能力を有する、肥大化能を有する軟骨細胞は、ラット、マウス、ゥサギ、ヒト等を含む哺乳類動物に一様に存在し、骨化において重要な役割を果たしている。このように、本件因子は、内軟骨性骨形成を行う哺乳類動物等であれば種にかかわらず、肥大化能を有する軟骨細胞から同様の手順を用いて生成することができる。ラットにヒト組換え BMPタンパク質を移植すると骨形成を誘導され、ヒト由来 BMPがラット由来 BMPと同様に機能することが分子生物学的に実証され

(Wozney, J. M.ら、 Science, 242： 1528 - 1534, 1988.および Wuerzler KKら、 J. Craniof acial Surg.， 9: 131 - 137， 1998を参照のこと。）、ヒトとラットでは、骨化に関連する因子が交換可能に使用されていることが判明している。 BMP自体は互いにアミノ酸配列レベルでは異なっているが、他方でタンパク質としての性質（すなわち生成の条件等の物性値）は実質的に同一といえる。本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、肋骨の骨軟骨移行部、長管骨の骨端線部（例えば、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨）、脊椎骨の骨端線部、小骨の成長軟骨帯 (例えば、手骨、足骨または胸骨）、軟骨膜または胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部ならびに骨増殖時の軟骨部のような部位から分離または誘導され得る。本発明において使用される肥大化能を有する軟骨細胞は、月巴大化能を有する限り、どのような部位から得られた軟骨細胞であってもよレ、。月巴大化能を有する軟骨細胞は、分化誘導によっても得られ得る。

本発明において誘導骨芽細胞分化誘導因子を、肥大化能を有する軟骨細胞に産生させるときには、この肥大化能を有する軟骨細胞は、代表的に、 4X 10⁴細胞 Z cm²の細胞密度に調整され得る。通常、 10⁴細胞 Zcm²〜l 0⁶細胞 Z cm²の間で用いられるが、 10⁴細胞 Z cm²未満または 10⁶細胞 cm²より多い密度に調整されていてもよい。

本発明において、肥大化能を有する軟骨細胞の培養は上述のようにして分離または誘導された細胞を用いて行われる。

本発明において用いられる肥大化能を有する軟骨細胞は、どのような培地で培養されてもよく、例えば、 HAM' s F 12 (HamF 12) 、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM) 、最小必須培地（MEM) 、最小必須培地 α (αΜ EM) 、イーグル基礎培地（BME) 、フィットン一ジャクソン改変培地（BG J b) のような培地中で培養された細胞であるが、これらに限定されない。肥大化能を有する軟骨細胞は、細胞の増殖および分化誘導を促進する物質を含んでいる培地で培養された細胞であってもよい。本発明において、分化因子産生培地は、ダルココルチコイド（例えば、デキサメサゾン、プレドニソロン、プレドニソン、コノレチゾン、ベタメタゾン、コノレチゾノレ、コノレチコステロン）、 ]3—グリセロホスフェートおよびァスコルビン酸からなる群より選択される従来型骨芽細胞分化誘導成分の少なくとも 1つを含んでいてもよい。本発明において使用される因子は、 3—グリセ口ホスフヱートおよびァスコルビン酸のみを含む分化因子産生培地によっても産生される。好ましくは、この分化因子産生培地は、ダルココルチコイド、 ]3—グリセ口ホスフェートおよびァスコルビン酸のすべてを含む。本発明において、分化因子産生培地は、さらに、例えば、トランスフォーミング增殖因子— /3 (TGF— ) 3) 、骨形成因子（BMP) 、白血病阻止因子（L I F) 、コロニー刺激因子（CSF) 、インスリン様成長因子（I GF) 、線維芽細胞増殖因子（FGF) 、多血小板血漿（PRP) 、血小板由来増殖因子（PDGF) 、血管内皮増殖因子（VEGF) などのような他の成分を含んでいてもよい。分化因子産生培地は、血清成分（例えば、ヒト血清、ゥシ血清、ゥシ胎仔血清）をさらに含むことが有用であり得る。代表的には、血清成分は、 0〜20%程度添加され得る。

本明細書において、肥大化能を有する軟骨細胞の培養期間は、十分量の因子が産生される期間（例えば、数ケ月〜半年、あるいは 3日〜 3週間（例えば、 3日、 4日、 5日、 6日、 7日、 8日、 9日、 10日、 20日、 1ヶ月以上であり、半年、 5ヶ月、 4ヶ月、 3ヶ月、 2ヶ月、 1ヶ月、 3週間以下の任意の範囲の可能な組み合わせ））であり得る。培養期間が進み、細胞が培養容器にコンフルェン卜になれば、継代することが好ましい。

一つの局面において、本発明は、 A) 肥大化能を有する軟骨細胞、および B) アルギン酸を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を提供する。別の局面において、本発明は、 A) 肥大化能を有する軟骨細胞、および B ) ラミニンとコラーゲン I Vとェンタクチンとの混合物を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を提供する。

これらの複合材料には、上述の（肥大化能を有する軟骨細胞）等に記載される任意の形態が使用され得る。

(製造方法）

一つの局面において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を製造するための方法を提供する。この製造方法は、以下の工程： A) 肥大化能を有する軟骨細胞を、ダルココルチコイド、 3—グリセ口ホスフェートおよびァスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも 1つを含む培地において培養する工程； B ) 該培養によって得られた上清と、該生体適合性を有する足場とを合わせる工程、を包含し得る。

一つの実施形態において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を製造するための方法を提供する。本製造方法は、以下の工程： A) 肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、ーグリセ口ホスフェート、ァスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子を提供する工程、および B ) 該誘導骨芽細胞分化誘導因子と、生体適合性を有する足場とを合わせる工程を包含し得る。

一つの実施形態において、本製造方法において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、（1 ) 前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地に存在し得るか、または（2 ) 該肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、分子量 5 0， 0 0 0の限外濾過に供することにより得られる分子量 5 0， 0 0 0以上の画分に存在し得るが、これらに限定されない。

一つの実施形態において、本製造方法では、前記 A) 工程は、前記肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、 ]3—グリセロホスフヱート、ァスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養し、該培養した上清を採取することを含み得る。

別の実施形態において、本製造方法では、 A) 工程は、前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、限外濾過に供し、分子量 5 0 , 0 0 0以上の画分に分離することを含み得る。

一つの実施形態において、本製造方法は、前記凍結乾燥した状態の上清とコラ一ゲン溶液とを合わせる工程を包含し得る。

一つの実施形態において、本製造方法は、前記上清とヒドロキシァパタイトとを接触させる工程を包含し得る。

一つの実施形態において、本発明の製造方法は、前記 A) 工程の後に、前記上清を濃縮する工程をさらに包含してもよい。この濃縮する工程では、前記上清は、 1倍以上に濃縮されたものであり得る。好ましくは、この上清は、 2倍以上に濃縮されたものであり得る。

一つの実施形態において、本発明の製造方法は、前記上清を凍結乾燥する工程をさらに包含してもよい。例えば、この凍結乾燥する工程は、前記上清を凍結し、室温〜約 4 0 °C (好ましくは、室温）、ー晚、真空下（一 8 0〜1 0 0 k P a ) で、遠心乾燥する工程であり得るが、これに限定されない。なぜなら、因子が変性しない温度以下（約 4 0 °C以下）で乾燥出来れば充分できさえすれば充分だからである。

一つの実施形態において、本製造方法は、前記上清を濃縮する工程と、上清を凍結乾燥する工程の両方を包含していてもよい。

一つの実施形態において、本発明の製造方法は、前記 B ) 工程において、前記上清を、前記生体適合性を有する足場に接触させる工程を包含してもよい。例えば、この接触させる工程は、前記上清に、前記生体適合性を有する足場を漬けることによって達成され得る。他の実施形態において、この接触させる工程は、前記上清を上部から滴下させること、一方向から吸引すること、一方向から加圧すること、該上清と該足場とを陰圧下で共存させることによつても達成され得る。一つの実施形態において、本発明の製造方法は、前記 B ) 工程において、前記上清から因子を得る工程、および該因子を前記生体適合性を有する足場と混合する工程を包含し得る。

一つの実施形態において、本発明の製造方法の前記 B ) 工程は、前記濃縮によつて得られた上清濃縮物を、前記生体適合性を有する足場と接触させるのに十分な体積に希釈し、該生体適合性を有する足場を接触させる工程を包含し得る。例えば、上記濃縮物は、分化因子産生培地、増殖培地、水、生理食塩水、ダルべッコリン酸緩衝液（D P B S ) などにより、 2〜1 0倍に希釈され得る。

一つの実施形態において、本発明の製造方法の前記 B ) 工程は、前記濃縮によつて得られた上清濃縮物を凍結乾燥する工程、および該上清濃縮物を前記生体適合性を有する足場と接触させるのに十分な体積に希釈し、該希釈した上清濃縮物と生体適合性を有する足場とを接触させる工程を包含し得る。

一つの実施形態において、本発明の製造方法において使用される生体適合性を有する足場は、ゲル状足場、 3次元状足場等であり得るが、これらに限定されなレ、。

一つの実施形態において、本発明の製造方法において使用される生体適合性を有する足場は、例えば、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコユア、アパタイト一ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フイブリン、ヒアルロン酸、細胞外基質混合物、絹、セルロース、デキストラン、ァガロース、寒天、合成ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリダリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシァノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビュル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、またはそれらの組み合わせ等であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、該因子が付着または分散するもの、もしくは付着または分散させることが出来るものであれば、どんなものでも使用できるからである。

好ましくは、前記生体適合性を有する足場は、例えば、多孔質ヒドロキシアバタイト（例えば、 H O Y A社製ァパセラム気孔率 5 0 %等）、超多孔質ヒドロキシアパタイト（例えば、 H O Y A社製ァパセラム気孔率 8 5 %、 B D社製 3 Dスキヤホールド等）、アパタイトコラーゲン混合体（例えば、 HO Y A社製ァパセラム顆粒と新田ゼラチン社製コラーゲンゲルとの混合物等）、アパタイトコラーゲン複合体（例えば、 H O Y A社製アバコラ等）、コラーゲンゲル（例えば、新田ゼラチン社製等）、コラーゲンスポンジ（例えば、新田ゼラチン社製等）、ゼラチンスポンジ（例えば、山之内製薬社製止血用ゼラチンスポンジ等）、フイブリンゲル（例えば、二プロ社製ベリプラスト P等）、合成ペプチド（例えば、 3 Dマトリックス社製ブラマックス等）、細胞外基質混合物（例えば、 B D社製マトリゲル等）、アルギン酸（例えば、ケルコ社製ケルトン L V C R等）、ァガロース（例えば、和光純薬社製ァガロース等）、ポリダリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸ポリ乳酸共重合体、それらの組合せであり得る。より好ましくは、前記生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンゲル、細胞外基質であり得る。

好ましい実施形態において、前記生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアバタイト、コラーゲン、アルギン酸、ラミニンとコラーゲン I Vとェンタクチンとの混合物等であり得るがこれらに限定されない。

—つの実施形態において、本発明の製造方法において肥大化能を有する軟骨細胞を培養するのに使用される培地（分化因子産生培地ともいう。）は、ダルココルチコイド（例えば、デキサメサゾン、プレドニソロン、プレドニソン、コルチゾン、ベタメタゾン、コルチゾル、コノレチコステロン）、 J3—グリセ口ホスフエート、ァスコルビン酸等の少なくとも 1つを含んでいてもよい。好ましくは、この培地は、）3—グリセ口ホスフェートおよぴァスコルビン酸の両方を含み得る。好ましくは、この培地は、ダルコュルチコイド、 . ) 3—グリセ口ホスフェートおよびァスコルビン酸のすべてを含む。この培地は、さらに、例えば、トランスフォ一ミング增殖因子— i3 (TGF-J3) 、骨形成因子（BMP) 、白血病阻止因子 (L I F) 、コロニー刺激因子（CSF) 、インスリン様成長因子（I GF) 、線維芽細胞増殖因子（FGF) 、多血小板血漿（PRP) 、血小板由来増殖因子 (PDGF) 、血管内皮増殖因子（VEGF) などのような他の成分を含んでいてもよい。この培地は、血清成分（例えば、ヒト血清、ゥシ血清、ゥシ胎仔血清）をさらに含むことが有用であり得る。代表的には、血清成分は、 0〜20% 程度添加され得る。

また、本発明の製造方法において肥大化能を有する軟骨細胞を培養するのに使用される培地としては、例えば、 HAM' s F 12 (HamF 12) 、ダルべッコ改変イーグル培地（DMEM) 、最小必須培地（MEM) 、最小必須培地 α (αΜΕΜ) 、イーグル基礎培地（ΒΜΕ) 、フィットン一ジャクソン改変培地 (BGJ b) のような培地が挙げられるが、これらに限定されない。この培地は、細胞の増殖および分化誘導を促進する物質を含んでいてもよい。この培地には、 C3H10T 1/2細胞、 3T3— Sw i s s a l b i n o細胞、 B a 1 b Z 3 T 3細胞を骨芽細胞に分化誘導させる能力は見出されていない。

本発明の製造方法には、上述の（複合材料）、（肥大化能を有する軟骨細胞）等に記載される任意の形態が使用され得る。

(足場）

本明細書において「足場（scaffold) 」とは、細胞を支持するための材料を意味する。足場は、一定の強度、生体適合性を有する。本明細書中で使用される場合、足場は、生物学的物質または天然から供給される物質、天然に存在する物質または合成で供給される物質から製造される。特に言及する場合、足場は、有機体（例えば、組織、細胞）以外の物質（非細胞物質）から形成される。本明細書で使用される場合、足場は、有機体（例えば、組織、細胞）以外の物質から形成された構成物（生物由来の材料（例えば、コラーゲン、ヒドロキシァパタイトも含む）である。本明細書で使用する場合、「有機体」とは、生活機能をもつように組織された物質系をいう。すなわち、有機体は、生物を他の物質系と区別していう。細胞、組織などは有機体の概念に含まれるが、有機体から取り出した生物由来の材料は、有機体には含まれない。細胞が定着する足場の部分としては、足場の表面のほか、内部に孔が存在し、その孔が細胞を収容し得る場合、その内部孔を挙げることができる。例えば、ヒドロキシァパタイトで作製した足場には、通常、細胞を充分に収容し得る孔が多数存在する。

足場の材料としては、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニァ、アパタイト一ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラ一ゲン、キチン、フイブリン、ヒアルロン酸、細胞外基質混合物、絹、セルロース、デキストラン、ァガロース、寒天、合成ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリダリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシァノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビエル、エチレン酢酸ビュル共重合体、ナイロン、またはそれらの組み合わせ等であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、該因子が付着または分散するもの、もしくは付着または分散させることが出来るものであれば、どんなものでも使用できるからである。

好ましくは、生体適合性を有する足場は、例えば、多孔質ヒドロキシァパタイト（例えば、 H O Y A社製ァパセラム気孔率 5 0 %等）、超多孔質ヒドロキシァパタイト（例えば、 HO Y A社製ァパセラム気孔率 8 5 %、 B D社製 3 Dスキャホールド等）、アパタイトコラーゲン混合体（例えば、 H O Y A社製ァパセラム顆粒と新田ゼラチン社製コラーゲンゲルとの混合物等）、アパタイトコラーゲン複合体（例えば、 H O Y A社製アバコラ等）、コラーゲンゲル（例えば、新田ゼラチン社製等）、コラーゲンスポンジ（例えば、新田ゼラチン社製等）、ゼラチンスポンジ（例えば、山之内製薬社製止血用ゼラチンスポンジ等）、フイブリンゲル (例えば、二プロ社製ベリプラスト P等）、合成ペプチド（例えば、 3 Dマトリックス社製ブラマックス等）、細胞外基質混合物（例えば、 B D社製マトリゲル等）、アルジネート（例えば、ケルコ社製ケルトン L V C R等）、ァガロース（例えば、和光純薬社製ァガロース等）、ポリダリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸 Zポリ乳酸共重合体、それらの組合せであり得る。より好ましくは、前記生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンゲル、細胞外基質である。

これらの足場は、顆粒形態、ブロック形態、スポンジ形態などの任意の形態で提供され得る。これらの足場は、孔があってもなくてもよい。このような足場は、市販されているものを使用してもよく、例えば、 H O Y A株式会社、ォリンパス株式会社、京セラ株式会社、三菱ゥェルファーマ株式会社、大日本住友製薬株式会社、小林製薬株式会社、ジンマー株式会社などから市販されている。一般的な足場の調製および特徴付けは当該分野において公知であり、そして慣用的な実験および当該分野の技術常識しか必要としない。例えば、米国特許第 4， 975， 526号；同第 5, 011, 691号；同第 5， 171, 574号；同第 5， 266, 683号；同第 5, 354, 557号および同第 5, 468, 845号を参照のこと（これらの開示は本明細書中に参考として援用される）。他の足場はまた、例えば、以下の文献において記載されている： LeGeros および Daculsi Handbook of Bioactive Ceramics, II 17-28頁 (1990, CRC Pres s)のような生体適合物質論文；および、 Yang Cao, Jie Weng Biomaterials 17, (1 996) 419-424頁のような他の公開された記載； LeGeros, Adv. Dent. Res. 2, 164 (1988) ; Johnsonら、 J. Orthopaedic Research, 1996, 14卷、 351- 369頁；ならぴに Piattelliら、 Biomaterials 1996、 17卷、 1767 - 1770頁を参照のこと（これらの開示は本明細書中に参考として援用される）。

本明細書において「リン酸カルシウム」とは、カルシウムリン酸塩の総称である。例えば、 CaHP0₄、 Ca₃ (P0₄) ₂、 Ca₄0 (P0₄) ₂、 Ca₁₀ (P0₄) ₆ (OH) ₂、 CaP₄0_n, Ca (P0₃) ₂、 Ca₂P₂0₇、 Ca (H₂P0₄) ₂'H₂0などの化学式で示される化合物が挙げられるが、これらに限定されない。 - 本明細書において「ヒドロキシアパタイト」とは、一般組成を C a _{1 0} ( P O ₄ ) 6 (O H) ₂とする化合物であり、コラーゲンとともに哺乳類動物の硬組織 (骨おょぴ歯）の主要構成成分である。ヒドロキシアパタイトは、上記の一連のリン酸カルシウムを含むが、生体硬組織中のァパタイトの P 0₄および O H成分は体液中の C 0₃成分と置換していることが多い。また、ヒドロキシアパタイトは、厚生労働省おょぴ米国連邦食品医薬品局（FDA (U. S. Food and Drug Admini stration) ) により安全性が承認されている物質である。ヒドロキシアパタイトは、市販のものは生体非吸収性材料であるものが多く、生体内にほとんど吸収されず残存するが、吸収性のものもある。

本明細書において、「細胞外基質混合物」とは、細胞外基質と成長因子の混合物をいう。細胞外基質としては、ラミニン、コラーゲンなどが挙げられるが、これらに限定されない。この細胞外基質は、生体由来であっても、合成されたものであってもよい。

(生体内の骨形成を促進または誘発するための方法）

一つの局面において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための方法を提供する。この方法は、誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを含む複合材料を、生体内の骨形成を促進または誘発する必要のある部位に移植する工程を包含し得る。

一つの実施形態において、本発明の方法では、前記骨形成は、骨の欠損を修復または治療するためのものであり得る。前記欠損は、例えば、固定のみでは修復できない大きさを有するものであってもよい。

他の実施形態において、前記骨形成は、周辺に骨がない部位に骨を形成させるためのものであってもよい。

本発明の生体内の骨形成を促進または誘発するための方法には、上述の（複合材料）、（肥大化能を有する軟骨細胞）等に記載される任意の形態が使用され得る。本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は、ィヌ、ネコ、またはゥマ、好ましくは、ヒトであり得る。

骨形成の皮下試験は、本来骨の無い部分に骨を形成（異所性骨形成とも呼ばれる）させ、骨形成能を評価する試験である。この試験は容易に実施できるので、当該分野で広く使用されている。骨を治療するときの試験方法には、骨欠損試験が用いられ得る。この試験における骨形成は、骨形成の条件が準備されている環境下で起こり、既に近傍に存在する骨芽細胞おょぴ誘導 ·遊走した骨芽細胞によつて骨が形成されるので、通常、皮下試験よりも骨形成率は良いと考えられている。皮下試験の結果は、実際の骨欠損における骨形成の結果によく一致することが知られている（例えば、 Urist, M. R.： Science, 150 : 893-899 (1965)、Wozne y, J. M. ら： Scienece, 242： 1528 - 1532 (1988)、 Johnson, E. E. ら： Clin. Or thop. , 230： 257-265 (1988)、Ekelund, A. ら： Clin. Orthop.， 263： 102 - 112 (1991)、および Riley, E. H. ら： Clin. Orthop. , 324： 39—46 (1996)を参照のこと）。従って、皮下試験の結果で骨形成が得られる場合、当業者は、骨欠損試験において当然に骨形成が得られることを理解する。

本発明の肥大化能を有する軟骨細胞の産生する因子と生体適合性を有する足場とを含む複合材料は、皮下に移植した場合も、骨欠損部に移植した場合も、骨形成が生じることが予測される。足場単独を皮下に移植すると、骨形成は観察されないことが予測される。足場単独を骨欠損部位に移植すると、骨形成は生じるが、その量は、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子と足場との複合材料を移植したときに比べてはるかに少ないと予測される。

本発明の複合材料は、移植することにより骨の修復および再構成に用いることができる。移植する部位としては、特に限定されないが、通常、骨の修復および再構成が望まれる、外傷または骨腫瘍の除去等に起因する骨欠損部が挙げられる。本発明の複合材料は、周辺に骨がない部位に骨を形成させるためにも使用され得る。移植は、公知の骨髄由来幹細胞移植と同様に行うことができる。移植する複合材料の量は、骨欠損部の大きさおよび症状等に応じて適宜選択される。

本発明はまた、必要に応じて、生理活性物質、サイト力インなどとともに使用することができる。

本明細書において「細胞生理活性物質」または「生理活性物質」（physiologi cally active substance) とは、細胞または組織に作用する物質をいう。そのような作用としては、例えば、その細胞または組織の制御、変化などが挙げられるがそれらに限定されない。生理活性物質には、サイト力インおよび増殖因子が含まれる。生理活性物質は、天然に存在するものであっても、合成されたものでもよい。好ましくは、生理活性物質は、細胞が産生するものまたはそれと同様の作用を有するものであるが改変された作用を持つものであってもよい。本明細書では、生理活性物質は、ペプチドを含むタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得る。

本明細書において使用される「サイト力イン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイト力インは、一般にタンパク質またはポリべプチドであり、免疫応答の制御作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウィルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用、細胞機能の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に細胞に作用する時点において、サイトカインは、通常、ペプチドを含むタンパク質形態であることが多い。

本明細書において用いられる「増殖因子」または「細胞増殖因子」とは、本明細書では互換的に用いられ、細胞の増殖および分化誘導を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多ぐの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。

骨形成関連のサイト力インには、代表的には、トランスフォーミング増殖因子一 β (TGF- β) 、骨形成因子（BMP) 、白血病阻止因子（L I F) 、コロニー刺激因子（C S F) 、インスリン様成長因子（I GF) 、線維芽細胞増殖因子（FGF) 、多血小板血漿（PRP) 、血小板由来増殖因子（PDGF) および血管内皮增殖因子（VEGF) などの因子、ならびにァスコルビン酸、ダルココルチコィド、グリセ口リン酸などの化合物が挙げられる。

サイトカインおよび増殖因子などの生理活性物質は一般に、機能重複現象 (re dundancy) があることから、他の名称および機能（例えば、細胞接着活性または細胞一基質間の接着活性など）で知られるサイト力インまたは増殖因子であっても、本発明に使用される生理活性物質の活性を有する限り、本発明において使用され得る。また、サイト力インまたは増殖因子は、本発明における好ましい活性 (例えば、幹細胞を増殖させる活性あるいは誘導骨芽細胞を形成させる活性、肥大化能を有する軟骨細胞に本発明による因子の産生を促す活性）を有してさえいれば、本発明の実施において使用することができる。

本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、同系に由来する細胞に由来してもよく、生体と同種異系の関係にある個体由来であってもよく、生体と異種の関係にある個体由来であってもよい。

本明細書において「同系に由来する」とは、自己（自家）、純系または近交系に由来することをいう。

本明細書において「生体と同種異系の関係にある個体由来」とは、同種であつても遺伝的には異なる他の個体を起源とすることをいう。

本明細書において「生体と異種の関係にある個体由来」とは、異種個体を起源とすることをいう。従って、例えば、ヒトがレシピエントである場合、ラット由来の細胞は「生体と異種の関係にある個体由来」である。 - 以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。実施例

以下の実施例に用いられる試薬は、例外を除き、和光純薬社、 Invitrogen社、 C ambr ex社、 Aldrich S i gma社などから巿販されるものを用いた。

(培地の調製）

本明細書の実施例では、特に言及する場合を除き、以下の培地を使用した。

(各 iffl胞について甩ぃた培地〉

HAM培地、 B ME培地、 D— MEM培地、 MEM増殖培地および M S C GM (増殖培地）は、下記表に示す組成となるように調製した。

水 HAM培地、 BME培地、 D -MEM培地 · · ·井 ¾

培地：各培地について基礎培地として使用した培地

HAM： HAM' s F 1 2培地

B ME ：イーグル基礎培地 D— MEM：ダルベッコ改変イーグル培地

Fungizone： 250 μ g/ral アンホテリシン B、 Invitrogen社、 15290-018

木 MEM增ϋ培地

Fungizone 2 5 0 μ g/m 1 アンホテリシン B、 Invitrogen社、 15290—018 MSCB ： Cambrex社、 PT-3238

MSCGS： Cambrex社、 PT- 3001

(実施例 1 ：肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）

(肋骨 ·肋軟骨部からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製） 4週齢雄性ラット（W i s t a r系）および 8週齢雄性ラット（W i s t a r 系）をそれぞれのグループとして本実施例において実験した。ラットは、クロ口ホルムを使用して屠殺した。ラットの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液 (1 0倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋骨 ·肋軟骨部を採取した。この肋骨 ·肋軟骨部の境界部分より半透明の成長軟骨部を採取した。この成長軟骨部を細切し、 0. 25%トリプシン一 EDTA/D— PB S (D u 1 b e c c o s Ph o s p h a t e Bu i f e r e d S a l i n e) 中で、 37でで 1時間攪拌した。次いで、遠心分離 1 70 X gで 3分間により洗浄し、その後 0. 2 %コラゲナーゼ（Co 1 1 a g e n a s e ：インビトロジェン社製） ZD— PBSとともに 37°Cで、 2. 5時間攪拌した。遠心分離（ 170 X gで 3分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で 0. 2%デイスパーゼ（D i s p a s e ：インビトロジェン社製） / (HAM+ 10% FB S) とともに、 37°Cにて、 1晚攪拌した。翌日、濾過し、遠心分離（1 70 X gで 3分間）により洗浄した。細胞をトリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数を力ゥントした。

評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。

(肥大化能を有する軟骨細胞の確認）

実施例 1によって得られた細胞は、分離の際に使用した酵素（トリプシン、コラゲナーゼ、デイスパーゼ）によって障害を受けているので、培養によって障害を回復させ、肥大化能を有する軟骨細胞を、軟骨細胞マーカーの局在、マーカーの発現、および顕微鏡下で形態学的な肥大化を確認することによって同定した。

(肥大化能を有する軟骨細胞特異的マーカーの発現）

上記の操作により得られた細胞の溶解物を S D S (ドデシル硫酸ナトリウム) で処理する。 SDS処理した溶液を SDSポリアクリルアミド電気泳動に供する。その後、転写用膜にブロッテイング（ゥヱスタンプ口ティング）し、軟骨細胞マ一力一に対する一次抗体を反応させて、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ダルコシダーゼなどの酵素またはフルォレセィンィソチオシァネート（F I TC) 、フィコエリトリン（PE) 、テキサスレッド、 7—アミノー 4—メチルクマリン— 3—酢酸（AMCA) 、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。

(肥大化能を有する軟骨細胞マーカー遺伝子の発現）

前記の操作により得られた細胞から RN Aを抽出して、 PCRでマーカーの発現を検出することもできる。本実施例では、アルカリホスファターゼ、 I I型コラーゲン、ァグリカン、ォステオカルシンの発現量について、リアルタイム PC Rで測定した。内在性コントロール遺伝子として、 GAPDHを用いた。

試料として、本実施例において調製した肥大化能を有する軟骨細胞（5 X 10 一 5個）を遠心分離（1 70〜200 X gで3〜5分間）することによりペレツトにして、 37°C、 5% C0₂インキュベータ一中で 1週間培養したもの（G 1ぉょび0 2) を用いた。培地には、 HAM培地 + 10%FB Sまたは ME M培地 + 15%FB Sを用いた。

(全 RNAの抽出）

培養物（培養面積 1 2 cm²) に対して、 I SOGEN (和光純薬） 1mlを加えた。セルスクレイパーを使って細胞を剥がして、 2m lチューブに回収し、室温で 10分放置した。クロ口ホルム 0. 2m lを加え、激しく Vo r t e Xし、 4°Cで 5分静置した。 12， 000 X g、 4 °Cで 15分遠心し、上清の水相を 1. 5m 1チューブに採取した。イソプロパノール 0. 5m lを加えて、 Vo r t e -Xし、室温で 10分放置した。 12， 000 X g、 4でで 15分遠心し、上清を充分に除き、 70%エタノール 1 m 1を加え V o r t e Xした。約 20 // 1の R N a s eフリ一水に溶かし、 ― 80°Cに保存した。

全 RN Aから High— Capacity cDNA Archive Kit (アプライドバイオシステムズ社）を用いて、 cDNAを合成した。上記 c DNAをテンプレートとして、アルカリホスファターゼ、 I I型コラーゲン、軟骨型プロテオダリカン（ァグリカン）、ォステオカルシン、および GAP DHの発現を、 Taqmanアツセィ法（Ta qman (登録商標） Gene Expression Assays (アプライドバイオシステムズ社） ) を用いて確認した。

次いで、リアルタイム PCR機器（AB I社、 PR I SM 7900HT) にて測定を行った。リアルタイム P C R反応液（ 25 μ Lの 2 XTaqMan Universal PCR Master Mix、2.5μ Lの 20XTaqman (登録商標） Gene Expression Assay Mix、21. 5/xLの R ase-free water、l Lのテンプレート c DNA) を調製し、 96ウエノレ反応プレートに分注した。 50°Cで 2分、および 95°Cで 10分の後、 95°Cで 15秒、および 60°C、 1分を 40サイクルで PCRを行った。 PCR反応後、しきい値の設定および到達サイクルの算出を、機器 (PR I SM 790 OH T) 内蔵の解析ソフトにより実施した。各細胞マーカーの値を、 GAPDHの値で除して発現量の平均値を算出した。その結果、肥大化能を有する軟骨細胞はァルカリホスファターゼ、 I I型コラーゲンおよびァグリカンを発現するが、ォステオカルシンは発現していなかった（表 I) 。

(表 I )

アル iiUホスファターゼ

I [型コラーゲン

ァグりカン

ォステ才 tlルシン

G p 1および G p 2 ：肥大化能を有する軟骨細胞のペレツトを 1週間培養したもの

X型コラーゲン、 I型コラーゲン、基質 G l aタンパク質、プレイオトロフィン、デコリン、バイグリカンについても本実施例と同様の方法により、発現の有無を観察することができる。 (肥大化能を有する軟骨細胞特異的マーカーの局在）

上記の操作により得られた細胞培養物を、 1 0 %中性ホルマリン緩衝液で固定し、軟骨細胞マーカーに对する一次抗体を反応させて、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ダルコシダーゼなどの酵素または F I T C、 P E、テキサスレッド、 AMC A、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。アル力リホスファターゼについては染色法で検出することもできる。上記の操作によって得られた細胞培養物を、 6 0 %アセトン/クェン酸バッファーで固定し、蒸留水で洗浄後、ファーストバイオレット Bとナフトール A S— MXとのを混合液に浸漬し、室温喑所で 3 0分反応させることにより、呈色させた。

肥大化能を有する軟骨細胞を希釈した細胞液に、肥大化能を有する軟骨細胞が存在するか否かを確認するために、以下の実験を行った。 1 X 1 0 ⁶細胞 Zm 1 でヒドロキシアパタイト上に播種し、 3 7 °Cにて、 5 % C 0 ₂インキュベータ一中で 1週間培養した。次いで、この試料（細胞を播種したヒドロキシァパタイト）をアルカリホスファターゼ染色した後、トルイジン青染色した。アルカリホスファターゼ染色は、試料を 6 0 %アセトン/クェン酸バッファ一中に 3 0秒浸漬して固定し、水洗後、アルカリホスファターゼ染色液（2 m lの 0 . 2 5 %ナフトール A S—MXリン酸アル力リ溶液（シグマアルドリツチ社） + 4 8 m 1の 2 5 %ファーストバイオレット B塩溶液（シグマアルドリッチ社））とともに、室温、遮光下で 3 0分間インキュベートすることにより行い、トルイジン青染色は、トルイジン青染色液（ 0 . 2 5 %トルィジン青溶液、 p H 7 . 0、和光純薬工業）とともに室温、 5分間インキュベートすることにより行った。アルカリホスファターゼ染色では、試料は、赤く斑点状に染まった（図 1 Aを参照のこと）。トルイジン青では同一部分が青く斑点状に染まり、細胞が存在することが分かる (図 1 Bを参照のこと）。従って、ヒドロキシアパタイト上に存在する細胞がァルカリホスファターゼ活性を有することが分かつた。 (軟骨細胞の肥大化能に関する形態学的検索）

5 X 10⁵個の細胞を含む HAM， s F 12培養液を遠心することにより細胞のペレットを作製し、この細胞ペレットを一定期間培養し、顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較する。有意な成長が確認されたときに、細胞を肥大化能を有すると判定した。

(結果）

実施例 1によって得られた細胞は、軟骨細胞マーカーを発現しており、形態学的には肥大化していることを確認した。このことにより、実施例 1によって得られた細胞は、肥大化能を有する軟骨細胞であることが確認された。この細胞を以下の実験に用いた。

(肋骨 ·肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞によって産生された因子の検出）

実施例 1により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地（最小必須培地（MEM培地）および 15% FBS (ゥシ胎仔血清）、デキサメサゾン 10 nM、一グリセ口ホスフェート 1 OmM、ァスコルビン酸 50 μ g/m 1 , 10 OUZm 1ペニシリン、 0. 1 m g 1ストレプトマイシンおよび 0. 25 μ gZm 1アンホテリシン B) に加えて 4 X 10⁴細胞/ cm² に希釈した。この細胞液を、ディッシュ（ベタトン 'ディッキンソン社製）に均一に播種し、 37°Cにて、 5% C0₂インキュベータ一中で培養し、経時的に (4日目、 7日目、 11日目、 14日目、 18日目、 21日目に）培地の上清を回収した。 (回収した培養上清が、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する活性を有するか否かの検討）マウス C3H10T 1Z2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL- 226) を、 1. 25 X 10⁴細胞 _ cm²で 24穴プレート（べクトン .ディッキンソン社製、 2. 5 X 10⁴Z穴）に均一に播種した。これらの細胞は、大日本住友製薬だけでなく、国内外の販売会社（三光純薬、コスモバイオ社、タカラバイオ社、東洋紡績社、住商ファーマバイオメディカル社、ステムセル際センス社、 Carabre X社、 StemCell TechnologyStem社、 Invitrogen社、 Osiris社）や組織資源活用機関（組織細胞バンク）（ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンク、理化学研究所細胞開発バンク、厚生省国立医薬品食品衛生研究所細胞バンク、東北大学加齢医学研究所などの国内機関、および I I AM、 ATCCなどの海外機関など）よりからも入手可能である。播種から 18時間後に、上記の培養上清 lm l を添加して、 37°Cにて 5% C0₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、以下に示す手順を用いてアル力リホスファターゼ活性を測定した。

(アル力リホスファターゼ活性の測定）

アルカリホスファターゼ活性を測定するために、該因子を含むかまたは含まないサンプノレ 100 μ 1に、それぞれ 50 μ 1の 4mgZm 1の p—二トロフエ- ルリン酸を含む溶液およびアルカリバッファー（シグマ社、 A9226) を加え、 37 °Cで 15分間反応させた。その後、 IN NaOHを 5 1添加することによって反応を止めて、吸光度（405 nm) を測定した。次いで、濃塩酸を 2 0 μ 1添加し、吸光度（405 nm) を測定した。これらの吸光度の差を「絶対活性値」と呼び（表では「絶対値」と表示する。）、アルカリホスファターゼ活性の一つの指標として用いた。 4週齢において、 5回の実験を行い、 1回の実験では 3試行を行った。 8週齢では、 3回の実験を行い、 1回目 2試行、 2回目 2 試行、 3回目 1試行を行った。各試料の絶対活性値を、対照となる培地のみの絶対値（対照となる培地のみを同様にマウス C 3H 10T 1 2細胞に加えて測定した絶対活性値）で除した値を、本明細書で「相対活性値」（表では「相対値」と表示する）と呼び、本明細書においてアルカリホスファターゼの別の指標として用いた。本実施例では、マウス C 3H 10 T 1 2細胞に本因子含む培地を添加した場合、本因子を含まない培地を添加して培養した場合と比較して、マウス C3H10T 1ノ 2細胞の細胞全体のアルカリホスファターゼ（ALP) 活性の値を、少なくとも約 1. 5倍より高く上昇させる能力を有するときに、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有すると判断した。

相対活性値レベルで評価した場合、 MEM分化因子産生培地のみを添加した場合のアルカリホスファターゼ活性を 1とすると、 4週齢のラット群では、 4日後に採取した培養上清を添加すると約 4. 1倍、 1週後に採取した培養上清では約 5. 1倍、 2週後に採取した培養上清では約 5. 4倍、 3週後に採取した培養上清では約 4. 9倍にまで上昇した。 8週齢のラット群では、 4日後に採取した培養上清を添加すると約 2. 9倍、 1週後に採取した培養上清では約 3. 1倍、 2 週後に採取した培養上清では約 3. 8倍、 3週後に採取した培養上清では約 4. 2倍にまで上昇した。（表 1上段および図 2を参照のこと）。

(誘導骨芽細胞の確認）

(アルカリホスファターゼの染色）

(肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地で培養した上清を添加した場合）

マウス C 3H 1 OT 1Z2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL- 226) を、 1. 25 X 10⁴細胞 /cm² (すなわち、 2. 5 X 10⁴Z穴）で 24穴プレート（べクトン 'ディッキンソン社製）および 1 X 10⁶細胞 Zm 1でヒドロキシァパタイト上に均一に播種した。播種から 18時間後に、肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清 1 m 1を添加して、 37°Cにて 5% C0₂インキュベータ一中で培養した。この細胞培養物を、 60%ァセトンクェン酸バッファーで固定し、蒸留水で洗浄後、ファーストバイオレツト Bとナフトール AS— MXとのを混合液に浸漬し、室温喑所で 30分反応させることにより、呈色させた。

(肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM増殖培地で培養した上清を添加した場合）

マウス C3H10T 1/2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL-226) を、 1. 25 X 10⁴細胞ノ cm² (すなわち、 2. 5 X 10⁴/穴）で 24穴プレート（ベタトン 'ディッキンソン社製）および 1 X 10⁶細胞 Zm 1でヒドロキシァパタイト上に均一に播種した。播種から 18時間後に、肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地（最小必須培地（MEM培地）および 15% FB S、 1 O OU/m lペニシリン、 0. 1 mgZm 1ストレプトマイシン、および 0. 2 5 μ g/m 1アンホテリシン B) で培養した培養上清 lmlを添加して、 37°C にて 5% C0₂インキュベータ一中で培養した。この細胞培養物を、 60%ァセトン/タエン酸バッファーで固定し、蒸留水で洗浄後、ファーストバイオレツト Bとナフトール AS— MXとのを混合液に浸漬し、室温喑所で 30分反応させることにより、呈色させた。

上に示したように、誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子によって、誘導骨芽細胞マーカーの一つである、マウス C 3H 10 T 1Z2細胞のアル力リホスファターゼ（ALP) 活性が上昇することが示された。さらに C3H10T 1Z2細胞のアルカリホスファターゼ染色においても、この誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子を C3H10 T 1Z2細胞に添加すると、 C3H1 OT 1 2細胞は著しい赤色を示した。このことにより、染色法によってもアルカリホスファターゼが発現していることが示された。この結果、 C 3H1 OT 1Z2細胞が誘導骨芽細胞に分化したことが確認された（表 1上段、図 2、図 3 A上段および図 3 Bを参照のこと）。また、前記の方法により細胞のペレットを作製し、酸性トルイジン青およびサフラニン Oでこの細胞を染色すると、..異染性（メタクロマジ一）は示さず、サフラニンには陰性であった。従って、この細胞は、軟骨細胞ではないことが確認された。従って、分ィ匕した細胞は、肥大化能を有する軟骨細胞ではないことが確認できた。

(比較例 1 A：肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製およぴ検出）

実施例 1と同様の方法により、肋骨，肋軟骨部から肥大化能を有する軟骨細胞を採取した。肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM増殖培地（最小必須培地（M EM培地）および 15% FBS、 10 OUZni 1ペニシリン、 0. 1 m g 1ストレプトマイシン、および 0. 25 μ g/m 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞 Z cm²に希釈し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 1 1日目、 14日目、 18日目、 21日目に）培地の上清を回収した。

マウス C 3H10T 1/2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL- 226) を、 1. 25 X 10⁴細胞 cm²で 24穴プレート（べクトン .ディッキンソン社製、 2. 5 X 10⁴/穴）に均一に播種した。播種から 18時間後に、上記の培養上清 lmlを添加して、 37°Cにて 5% C O ₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。 MEM増殖培地のみを添加した場合を 1とすると、 4週齢のラット群では、 4日後に採取した培養上清を添加すると約 1. 0倍、 1週後に採取した培養上清では約 1. 3倍、 2週後に採取した培養上清では約 1. 1倍、 3週後に採取した培養上清では約 1. 0倍であった。 8週齢のラット群では、 4日後に採取した培養上清を添加すると約 1. 2倍、 1週後に採取した培養上清では約 1. 0 倍、 2週後に採取した培養上清では約 1. 0倍、 3週後に採取した培養上清では約 0. 9倍であった（表 1下段および図 2を参照のこと）。 MEM増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、 4週齢および 8週齢のラット群におけるアルカリホスファターゼ活性は、 MEM増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。

(誘導骨芽細胞の確認）

(アル力リホスファターゼの染色）

マウス C 3 H 1 0 T 1 2細胞を 2 4穴プレートおよびヒドロキシァパタイト上に播種し（B M E培地）、 1 8時間培養した。次いで、この細胞培養物に、肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を M E M增殖培地で培養した培養上清を添加し、 7 2時間後にアルカリホスファターゼ染色をした。 MEM増殖培地で培養した上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ染色は染まらず、活性がないことが確認された（図 3 A下段および図 3 Dを参照のこと）。

(表， .肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産^ ¾地およ t MEM¾殖培地で培養した上清を添加した場合のアルカリホス: ?7ター" t¾性）

匕因子産生培地 (平均値）

0曰 A曰 1週間 2週間 3週間

4週齡相対植 1 4.1 5.1 5.4

铯対值 (上清添加） 0077 0.098 0.103 0.095 絶対 <g (培地のみ添

加） 0.023 0.023 0.024 0.023 0.021

8週齡相対値 1 2_9 3.1 3.6 42 艳対値 (上清添加） 0.065 0.066 0.077 0.079 絶対 fl (培地のみ添

加） 0.021 0.021 0.021 0.019 0.019

MEM增殖培地 (平均値）

0曰 4曰 1週間 2遘間 3週間

4適齢相対值 1 1.0 1.3 1.1 1.0 絶対値 (上清添加） 0.020 0.023 0.027 0.024 絶対值 (培地のみ添

加） 0.022 0.022 0.020 0.024 0.024

8週齢相対 tl 1 1.2 1.0 1.0 0.9 絶対値 (上清添加） 0.023 0021 0.019 0.017 絶対但 (培地のみ添

加〉 0.020 0.020 0.021 0.019 0.019

4週齢： 5回実験を行った。 1回の実験で 3試行した。

8週齢： 3回実験を行った。 1回目 2試行、 2回目 2試行、 3回目 1試行した。実施例 1と同様の方法を用いて、上記の操作により得られた肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清は、 C 3 H 1 0 T 1 2細胞の骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを確認することができる。

(実施例 1および比較例 1 Aのまとめ）

MEM分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清には、未分化細胞であるマウス C 3H1 OT 1Z2細胞のアル力リホスファターゼ活性を上昇させ、誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在することが確認された。一方、 MEM増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清にはこの因子が存在しないことが確認された。肥大化能を有する軟骨細胞は、 MEM分化因子産生培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生することが見出された。従来、このような因子は知られておらず、その因子の存在自体が予想外な効果といえる。なお、従来知られている BMPは、別の場所で詳述するように、直接的に誘導骨芽細胞へと分化誘導させる効果はないようである。

(比較例 1 B ：肋軟骨由来の静止軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）

(肋軟骨からの静止軟骨細胞の調製）

4週齢雄性ラット（Wi s t a r系）および 8週齢雄性ラット（W i s t a r 系）をクロ口ホルムを使用して屠殺した。ラットの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（10倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋軟骨部を採取した。この肋軟骨部分より不透明の静止軟骨部を採取した。この静止軟骨部を細切し、 0. 25%トリプシン— EDTAノ D— PB S (D u 1 b e c c o' s Ph o s p h a t e Bu f f e r e d S a l i n e) 中で、 37 °C で 1時間攪拌した。次いで、遠心分離（170 X gで 3分間）により洗浄し、その後 0. 2 %コラゲナーゼ（Co l 1 a g e n a s e ：インビトロジェン社製） ZD— PBSとともに 37°Cで、 2. 5時間攪拌した。遠心分離（ 1 70 X gで 3分間）により洗浄した後、撩拌用フラスコ中で 0. 2%デイスパーゼ（D i s p a s e ：インビトロジェン社製） / (HAM+ 10% F B S ) とともに、 3 7°Cにて、 1晚攪拌した。 0. 2%デイスパーゼでの 1晚処理を除く場合もある。翌日、濾過し、遠心分離（170 X gで 3分間）により洗浄した。細胞をトリバンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。

評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。 (肋軟骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞の確認）

肋軟骨由来の静止軟骨細胞を希釈した細胞液に、肥大化能を有する軟骨細胞が存在するか否かを、実施例 1と同様の手順を用いて確認した。アルカリホスファターゼ染色では、ヒドロキシアパタイトは染まらなかった（図 1 Cを参照のこと）。トルイジン青染色では、ヒドロキシアパタイトは青く斑点状に染まり、細胞が存在することが確認された（図 1Dを参照のこと）。ヒドロキシアパタイト上に存在する細胞にはアルカリホスファターゼ活性がないことが確認された。このことにより、本比較例で使用する細胞液には、肥大化能を有さない軟骨細胞が存在することが確認できた。 (肥大化能を有する軟骨細胞マーカー遺伝子の発現の確認）

本比較例では、実施例 1と同様の方法を用いて、アルカリホスファターゼ、 I I型コラーゲン、ァグリカン、ォステオカルシンの発現量について、リアルタイム PCRで測定した。内在性コントロール遺伝子として、 GAPDHを用いた。試料として、本比較例において調製した肥大化能を有なさい軟骨細胞（5 X 1 0— 5個）を遠心分離（1 70〜200 X gで 3〜 5分間）することによりペレット.にして、 37°C、 5% C0.₂インキュベーター中で 1週間培養したもの (1 1ぉょぴ1^ 2) を用いた。培地には、 HAM培地 + 10%FB Sまたは MEM培地 + 15%FB Sを用いた。

実施例 1と同様の方法を用いて、リアルタイム PCR反応を行い、リアルタイム PCR機器（AB I社、 PR I SM 7900HT) にて各細胞マーカーの発現量の測定を行った。 PCR反応後、しきい値の設定および到達サイクルの算出を、機器 (PR I SM 7900HT) 内蔵の解析ソフトにより実施した。各細胞マーカーの値を、 GAPDHの値で除して発現量の平均値を算出した。その結果、肥大化能を有さない軟骨細胞は I I型コラーゲンおよびァグリカンを発現するが、アル力リホスファターゼおよびォステオカルシンはいずれも発現しなかつた（表 I I ) 。

(表 I I )

アル ¾りホスファターゼ

I型コラ一ン

ァグりカン

ォステ才ゎルシン

R p 1および R p 2 ：肥大化能を有さない軟骨細胞のペレツトを 1週間培養したもの実施例 1と同様の方法を使用して軟骨細胞マーカーの局在または発現を検出し、形態学的にも検索して、得られた細胞が肥大化能を有さない軟骨細胞であることを確認した。 (肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の検出）

肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地（最小必須培地 (MEM培地）、 1 5% FBS (ゥシ胎仔血清）、デキサメサゾン 10 nM、 )3—グリセ口ホスフェート 10mM、ァスコルビン酸 50 /X gZm 1、 100U ノ mlペニシリン、 0. lmgZm 1ストレプトマイシン、および 0. 25 μ g ノ mlアンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞/ cm²に希釈し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 1 1日目、 14日目、 18日目、 21日目に）各培地の上清を回収した。

マウス C3H10T 1 2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL- 226) を 2 4穴プレートに播種し、 18時間後に上記の培養上清 1 m lを添加して、 37°C にて 5% C0₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定した。相対活性値レベルで評価した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 MEM分化因子産生培地のみを添加した場合を 1とすると、 4日後に採取した培養上清を添加すると約 0. 9倍、 1週後に採取した培養上清では約 1. 1倍、 2週後に採取した培養上清では約 1. 0倍、 3週後に採取した培養上清では約 1. 1倍であった（表 2上段および図 4 を参照のこと） ₀

MEM分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性は、 MEM分化因子産生培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、 C3H10T 1 2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例 1と同様の方法および判定基準で確認することができる。 (比較例 1 C ：肋軟骨由来の静止軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）比較例 1 Bと同様の方法により、肋軟骨から静止軟骨細胞を採取した。静止軟骨細胞を、 MEM増殖培地（最小必須培地（MEM培地）、 15% FBS、 1 O OUZmlペニシリン、 0. 1 mgZrn 1ストレプトマイシン、および 0. 2 5 μ g/m 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞 Z c m²に希釈し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 11日目、 14日目、 18日目、 21日目に）培地の上清を回収した。

マウス C3H10T1Z2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL- 226) を 2 4穴プレートに均一に播種し、 18時間後に上記の培養上清 lm 1を添カ卩して、 37°Cにて 5% C0₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。相対活性値レべルで評価した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 MEM增殖培地のみを添加した場合を 1とすると、 4日後に採取した培養上清を添加すると約 1. 0倍、 1 週後に採取した培養上清では約 1. 0倍、 2週後に採取した培養上清では約 0. 9倍、 3週後に採取した培養上清では約 1. 1倍であった（表 2下段および図 4 を参照のこと）。

MEM増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性は、 MEM増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかつた

(表 2下段および図 4を参照のこと）。上記の操作により得られた細胞培養物の培養上清が、 C3H10T 1 2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例 1と同様の方法および判定基準で確認することができる。 (表 2：肋軟骨由来の静 h¾骨細胞を、ヒ B÷産生培地および MEM増殖培地て養した上清を添加したのアル力リホスタ→ί活性）

ME 分化因子産 i¾地 (平均值)

0曰 4曰 1週間 2週間 3週間

8遇齢相対値 1 0.9 1.1 1.0 1.1

絶対値 (±清細 0.014 0.015 0.015 0.014 絶対値 (培地のみ添

加） 0.015 0.015 0.014 0.014 0.014

ME 増殖培地 (平均値）

0曰曰 1週間 2週間 3週間

8週齢相対値 1 1.0 1.0 0.9 1.1

絶対値 (上清細 0.014 0.012 0.012 0.012 絶対値 (培地のみ添

加） 0.013 0.013 0.012 0.011 0.011 8週齢： 3回実験を行った。 1回目 3試行、 2回目 1試行、 3回目 3試行した。

(比較例 1 Bおよび比較例 1 Cのまとめ）

肋軟骨から採取した肥大化能を有さない静止軟骨細胞は、 MEM分化因子産生培地で培養しても、 MEM増殖培地で培養しても、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないことが確認された。

(比較例 1D ：関節軟骨由来の軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）

(関節軟骨からの軟骨細胞の調製）

8週齢雄性ラット（Wi s t a r系）をクロ口ホルムを使用して屠殺した。ラットの膝関節周囲をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（10倍希釈）に全身を浸し消毒した。膝関節部を切開し、無菌的に関節軟骨を採取した。この関節軟骨を細切し、 0. 25%トリプシン— EDTA D—PB S中で、 37°Cで 1時間攪拌した。次いで、遠心分離（ 1 70 X gで 3分間）により洗浄し、その後 0. 2 % コラゲナーゼ ZD— PB Sとともに 37°Cで、 2. 5時間攪拌した。遠心分離 (1 70 X gで 3分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で 0. 2%デイスパーゼ/ (HAM+ 10% FBS) とともに、 37°Cにて、 1晚攪拌した。 0. 2%デイスパーゼでの 1晚処理を省く場合もある。翌日、濾過し、遠心分離（1 70 X gで 3分間）により洗浄した。細胞を、トリパンブルーにより染色し、頭微鏡を用いて細胞数を力ゥントした。

(関節軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞の確認）

関節軟骨部由来の軟骨細胞を希釈した細胞液に、肥大化能を有する軟骨細胞が存在するか否かを、実施例 1と同様の手順を用いて確認した。アルカリホスファターゼ染色では、ヒドロキシアパタイトは染まらなかった（図 1 Eを参照のこと）。トルイジン青染色では、ヒドロキシアパタイトは青く斑点状に染まり、細胞が存在することが確認された（図 1 Fを参照のこと）。ヒドロキシアパタイト上に存在する細胞にはアル力リホスファターゼ活性がないことが確認された。このことにより、本比較例で使用する細胞液には、肥大化能を有さない軟骨細胞が存在することが確認できた。

実施例 1と同様の方法おょぴ判定基準を使用して軟骨細胞マーカーの局在または発現を検出し、形態学的にも検索して、得られた細胞が肥大化能を有さない軟骨細胞であるか否かを確認する。

(関節軟骨部から採取した軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の検出）

関節軟骨部から採取した軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地（最小必須培地 (MEM培地）、 15% FBS (ゥシ胎仔血清）、デキサメサゾン 10 nM、 ]3—グリセ口ホスフェート 10 mM、ァスコノレビン酸 50 μ g/m 1、 100 U /m lペニシリン、 0. 1 mgZm 1ストレプトマイシン、および 0. 25 μ g /m 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞 cm²に希釈し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 1 1日目、 14日目、 18日目、 21日目に）各培地の上清を回収した。

マウス C3H10T 1/2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL—226) を 2 4穴プレートに播種し、 18時間後に上記の培養上清 lm 1を添加して、 37°C にて 5% C0₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定した。相対活性値レベルで評価しだ場合、アルカリホスファターゼ活性は、 MEM分化因子産生培地のみを添加した場合を 1とすると、 4日後に採取した培養上清を添加すると約 1. 4倍、 1週後に採取した培養上清では約 1. 1倍、 2週後に採取した培養上清では約 1. 1倍、 3週後に採取した培養上清では約 1. 1倍であった（表 3上段および図 5 Aを参照のこと）。

MEM分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性は、 MEM分化因子産生培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、 C3H10T 1 / 2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例 1と同様の方法および判定基準で確認することができる。

(比較例 1 E ：関節軟骨部から採取した軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）

比較例 1Dと同様の方法により、関節軟骨部から軟骨細胞を採取した。軟骨細胞を、 MEM増殖培地（最小必須培地（MEM培地）、 15% FBS、 100 UZm lペニシリン、 0. 1 mgZm 1ストレプトマイシン、および 0. 25 μ g/m 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞/ cm ²に希釈し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 1 1日目、 14日目、 18日目、 21日目に）培地の上清を回収した。マウス C3H10T 1 2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL- 226) を 2 4穴プレートに播種し、 18時間後に上記の培地 1 m 1を添加して、 37°Cにて 5% C0₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定した。相対活性値レベルで評価した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 MEM増殖培地のみを添加した場合を 1とすると、 4日後に採取した培養上清を添加すると約 1. 1倍、 1週後に採取した培養上清では約 1. 0倍、 2週後に採取した培養上清では約 1. 1倍、 3週後に採取した培養上清では約 1. 2倍であった（表 3下段および図 5 Aを参照のこと）。

関節軟骨部由来の軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 MEM増殖培地のみ添加した場合とほとんど変わらなかった（表 3および図 5 Aを参照のこと）。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、 C3H10 T 1 2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例 1と同様の方法および判定基準で確認することができる。

(表 3:関節軟骨部由来の軟骨細胞を MEM分化因子産生培地および MEM増殖培地で培養した上清を添加した場合のアルカリホスターセ *¾性）

M EM分化因子産^地 (平均値）

0曰 4曰 1週間 2週間 3週間

8週齢相対値 1 1.4 1.1 1.1 1.1 絶対値 (上清添加） 0.020 0.019 0.019 0.020 絶対値 (培地のみ添

加） 0.016 0.016 0.017 0.016 0.017

8週齢： 6回実験した。 1回目 1 ϋΕίϊ、 2回目 1試行、 3回目 3|ίίϊ、 4回目 2試行、 5回目 1 |ίίϊ、 6 回目 1試行した。

MEM増殖培地 (平均値）

0曰 4曰 1週間 2週間 3週間

8週齢相対値 1 1.1 1.0 1.1 1.2 絶対値 (±«添加） 0.019 0.017 0.017 0.019 絶対値 (培地のみ添加） 0.018 0018 0.018 0.014 0.017

8週齢： 5回実験した。 1回目 2¾ίϊ、 2回目 2試行、 3回目 3|ΐίϊ、 4回目 1試行、 5回目 1 ϋ£ίϊした。 (比較例 1 Dおよび 1 Eのまとめ）

関節軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞は、 M E M分化因子産生培地で培養しても、 MEM増殖培地で培養しても、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないことが確認された。

(実施例 2 ：胸骨軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）

(胸骨軟骨部からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製）

8週齢雄性ラット（Wi s t a r系）をクロ口ホルムを使用して屠殺する。ラットの胸部をバリ力ンで剃毛し、ヒビテン液（ 1 0倍希釈）に全身を浸し消毒する。胸部を切開し、無菌的に胸骨軟骨部体下部および剣状突起部を採取する。この胸骨軟骨部体下部および剣状突起部より半透明の成長軟骨部を採取する。これらの成長軟骨部を細切し、 0. 25 %トリプシン— EDTA/Dulbecco's phosphate buffered saline (D- PBS)中で、 37°Cで 1時間攪拌する。次いで、遠心分離（1 70 X gで 3分間）により洗浄し、その後 0. 2%コラゲナーゼ（インビトロジヱン社製） ZD— PBSとともに 37 で、 2. 5時間攪拌する。遠心分離（1 70 X gで 3分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で 0. 2%デイスパーゼ（インビトロジェン社製） / (HAM+ 10% FBS) とともに、 37°Cにて、 1晚攪拌した。 0. 2%デイスパーゼでの 1晚処理を省く場合もある。翌日、濾過し、遠心分離（1 70 X gで 3分間）により洗浄する。細胞を、トリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントする。

評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とする。 (肥大化能を有する軟骨細胞の確認）

実施例 1と同様の方法および判定基準を使用して、採取した細胞が肥大化能を有する軟骨細胞であるか否かを確認する。

(胸骨軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を M E M分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の検出）

胸骨軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地（最小必須培地（MEM培地）、 1 5% F B S (ゥシ胎仔血清）、デキサメサゾン 1 0 nM、 /3—グリセ口ホスフェート 1 OmM、ァスコルビン酸 5 0 // g m 1、 1 0 OU/m 1ペニシリン、 0. 1 mg/m 1ストレプトマイシン、および 0. 2 5 μ g/m 1アンホテリシン Bを加えて 4 X 1 0⁴細胞 Z c m²に希釈し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 1 1 日目、 1 4日目、 1 8日目、 2 1 日目に）培地の上清を回収する。

マウス C 3 H 1 O T 1Z2細胞（大日本住友製薬社製、 CC L— 2 2 6) を 2 4穴プレートに播種し、 1 8時間後に上記の培養上清 1 m 1を添カ卩して、 3 7°C にて 5% C0₂インキュベータ一中で培養する。 7 2時間後に、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定する。

MEM分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性は、 MEM分化因子産生培地のみを添加した場合と比べて上昇する。

(誘導骨芽細胞の確認）

実施例 1と同様の方法および判定基準を用いて、上記の操作により得られた細胞培養物の培養上清は、マウズ C 3 H 1 O T 1Z2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させることを確認する。 (比較例 2 ：胸骨軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製）

実施例 2と同様の方法により、胸骨軟骨部より肥大化能を有する軟骨細胞を採取する。肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM増殖培地（最小必須培地（MEM 培地）、 15% FBS、 10 OUZni 1ペニシリン、 0. lmgZtnlストレプトマイシンおよび 0. 25 μ gZm 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴ 細胞 Z cm²に希釈し、培養し、経時的に培地の上清を回収する。

マウス C3H10T 1 2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL— 226) を 2 4穴プレートに播種し、 18時間後に上記の培養上清 1 m 1を添加して、 37°C にて 5% C0₂インキュベータ一中で培養する。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定する。

MEM増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性は、 MEM増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらない。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、 C3H10T 1/2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例 1と同様の方法および判定基準で確認することができる。

(実施例 2および比較例 2のまとめ）

MEM分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清が、マウス C 3H 10 T 1Z2細胞のアル力リホスファターゼ活性を上昇させたとき、誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在すると判定される。一方、 MEM増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清が、マウス C3H10T 1 2細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させないときとき、この因子が存在しないこと判定される。この場合、肥大化能を有する軟骨細胞は、 MEM分化因子産生培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生すると判定される。 (実施例 3 ：肋骨 ·肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を HAM分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）

(肋骨 ·肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞によって生産された因子の検出）

実施例 1により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を、 HAM分化因子産生培地（HAM培地、 1 0% F B S (ゥシ胎仔血清）、デキサメサゾン 1 0 nM、 ]3—グリセ口ホスフェート 1 OmM、ァスコルビン酸 5 0 /i g/m 1、 1 0 0U ノ m lペニシリン、 0. 1 mgZm 1ストレプトマイシン、および 0. 2 5 g /m 1アンホテリシン Bを加えて 4 X 1 0⁴細胞 Zc m²に希釈し、播種し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 1 1 日目、 1 4日目、 1 8日目、 2 1 日目に）培地の上清を回収した。

マウス C 3 H 1 0 T 1/2細胞（大日本住友製薬社製、 CC L— 2 2 6) を 2 4穴プレートに播種し、 1 8時間後に上記の培養上清 l m 1を添加して、 3 7°C にて 5% C0₂インキュベータ一中で培養した。 7 2時間後に、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定した。相対活性値レベルで評価した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 HAM分化因子産生培地のみを添加した場合を 1とすると、 4日後に採取した培養上清を添加すると約 1. 2倍、 1週後に採取した培養上清では約 2. 3倍、 2週後に採取した培養上清では約 3. 1倍、 3週後に採取した培養上清では約 2. 2倍であった（表 3— 2上段および図 5 Bを参照のこと）。

誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子によって、誘導骨芽細胞マーカーの一つである、 C 3 H 1 0 T 1/2細胞のアルカリホスファターゼ（AL P) 活性が上昇することが示された（表 3— 2および図 5 B) 。さらにアルカリホスファタ一ゼ染色法によってもアルカリ.ホスファターゼが発現していることが示された。この結果、 C 3 H 1 0 T 1/2細胞が誘導骨芽細胞に分化したことが確認された。 (表 3— 2：肥大化能を有する軟骨細胞を HAM分化因子産生培地および HAM 増殖培地で培養した上清を添加した場合のアル力リホスファタ一ゼ活性)

HAM分化因子産生培地（平均値)

0曰 4曰 1通間 2週間 3遇間

相対値 1 1.2 2.3 3.1 2.2 絶対値 (上清添加） 0.015 0.018 0.033 0.047 0.037 絶対値 (培地のみ添加） 0.015 0.014 0.015 0.017

3回実験を行った。 1回につき 3試行した。

HAM增殖培地（平均値）

0曰曰 1週間 2週間 3週間

相対値 1 1.0 0.9 1.2 1.2 絶対植 (上清添加） 0.026 0.025 0.023 0.020 0.024 絶対值 (培地のみ添加） 0.026 0.024 0.021 0.023

5回実験を行った。 1~4回目： 3試行、 5回目： 2試行した。

(比較例 3 A：肋骨 ·肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を HAM増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）

実施例 1と同様の方法により、肋骨 ·肋軟骨部から肥大化能を有する軟骨細胞を採取した。肥大化能を有する軟骨細胞を、 HAM増殖培地（HAM培地、 1 0% FBS、 10 OUZm 1ペニシリン、 0. 1 m g 1ストレプトマイシンおよび 0. 25 μ g/m 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞 Zc m ²に希釈し、培養し、経時的に培地の上清を回収した。

マウス C3H10T1Z2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL- 226) を 2 4穴プレートに播種し、 18時間後に上記の培養上清 lm 1を添加して、 37°C にて 5% C0₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定した。相対活性値レベルで評価した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 HAM増殖培地のみを添加した場合を 1とすると、 4日後に採取した培養上清を添加すると約 1. 0倍、 1週後に採取した培養上清では約 0. 9倍、 2週後に採取した培養上清では約 1. 2倍、 3週後に採取した培養上清では約 1. 2倍であった（表 3— 2下段および図 5 C を参照のこと）。

HAM増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アル力リホスファタ一ゼ活性は、 H. AM増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった (表 3— 2下段および図 5 Cを参照のこと）。上記の操作により得られた細胞培養物の上清は、 C3H10T1Z 2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させないことを確認した。

(実施例 3および比較例 3 Aのまとめ）

HAM分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清には、未分化細胞であるマウス C 3H 1 OT 1/2細胞のアル力リホスファターゼ活性を上昇させ、誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在することが確認された。一方、 HAM増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清にはこの因子が存在しないことが確認された。肥大化能を有する軟骨細胞は、 HAM分化因子産生培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生することが見出された。

(比較例 3B ：肋軟骨由来の静止軟骨細胞を、 HAM分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の調製およぴ検出）

比較例 1 Bと同様の方法を使用して肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を、 HA M分化因子産生培地（HAM培地、 10% FBS (ゥシ胎仔血清）、デキサメサゾン 10 nM、 J3—グリセ口ホスフェート 10mM、ァスコルビン酸 50 /x g ノ m 1、 10 OU/m 1ペニシリン、 0. 1 m g /m 1ストレプトマイシン、おょぴ 0. 25 μ gZm 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞 Zc m²に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収する。

マウス C3H10T1Z2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL一 226) を 2 4穴プレー卜に均に播種し、 18時間後に上記の培養上清 1 m 1を添カ卩して、培養する。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性をそれぞれ測定する。

HAM分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性が、 HAM分化因子産生培地のみまたは HAM増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わず、上記の操作により得られた細胞培養物の培養上清が、 C3H10T 1/2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させなければ、誘導骨芽細胞に分化していないと判定する。この場合、肋軟骨由来の静止軟骨細胞は、 HAM分化因子産生培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないと判定される。

(比較例 3C ：肋軟骨由来の静止軟骨細胞を、 HAM増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）

比較例 1 Bと同様の方法を使用して肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を、 HA M増殖培地（HAM培地、 10% FBS、 100 U,m 1ペニシリン、 0. 1 mgZm 1ストレプトマイシン、および 0. 25 μ gZm 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞 Zcm²に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収する。

マウス C3H10T 1 2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL— 226) を 2 4穴プレートに均一に播種し、 18時間後に上記の培養上清 lm 1を添加して、培養する。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性をそれぞれ測定する。

HAM増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性が、 HAM分化因子産生培地のみまたは HAM増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらず、上記の操作により得られた細胞培養物の培養上清が、 C 3H1 OT 1Z2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させなければ、誘導骨芽細胞に分化していないと判定する。この場合、肋軟骨由来の静止軟骨細胞は、 H- AM増殖培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないと判定される。

(実施例 1、実施例 3、比較例 1 A〜l E、 3 A〜3 Cのまとめ）

上記実施例より、肥大化能を有する軟骨細胞は、分化因子産生培地に含まれる基礎培地の種類にかかわらず、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生する。肥大化能を有する軟骨細胞は、いずれの増殖培地でも、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生しない。さらに、肥大化能を有さない静止軟骨細胞および関節軟骨細胞は、いずれの培地で培養しても未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生しない。このことより、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子は、肥大化能を有する軟骨細胞を分化因子産生培地中で培養することによってのみ産生されることが示唆される。さらに、培地中に含まれる基礎培地は、通常、細胞培養に用いられ得る培地であれば、誘導骨芽細胞分化誘導因子の産生には影響を及ぼさず、本方法において使用可能であると考えられる。

(実施例 4 ：ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞を ME M分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）

(ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞による因子の検出）

多肢症、腫瘍、提供軟骨組織などのヒト組織由来の肥大化能を有する軟骨細胞を、ヒト組織資源活用機関（ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンク、理化学研究所細胞開発バンク、厚生省国立医薬品食品衛生研究所細胞バンク、東北大学加齢医学研究所などの国内機関、および I I AM、 A T C Cなどの海外機関、 O s i r i s社などの細胞提供業者）より入手する。入手した肥大化能を有する軟骨細胞を、 M E M分化因子産生培地（ME M培地、 1 5 % F B S (ゥシ胎仔血清) 、デキサメサゾン 1 0 n M、 ]3—グリセ口ホススヱート 1 O mM、ァスルビン酸 50 μ gZm 1、 10 OUZm 1ペニシリン、 0. lmgZm lストレプトマイシン、および 0. 25 μ gZm 1アンホテリシン Bを加えて 4 X 10⁴ 細胞 Z cm²に希釈し、播種し、培養し、経時的に培地の上清を回収する。

研究用ヒト間葉系幹細胞を前記機関から入手し、 24穴プレートに均一に播種し、 18時間後に上記の培養上清 lmlを添加して、培養する。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定する。

誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子によって、誘導骨芽細胞マーカーの一つである、研究用ヒト未分化細胞のアルカリホスファターゼ（ALP) 活性が上昇することが示されるとき、未分化細胞が誘導骨芽細胞に分化したと判定される。さらにアル力リホスファターゼ染色においても、アル力リホスファターゼが発現しているとき、未分化細胞が誘導骨芽細胞に分化したことと判定される。

(比較例 4 A：ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）

実施例 4と同様に入手した肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM増殖培地（M EM培地および 15% FBS、 10 OUZm 1ペニシリン、 0. lmgZm l ストレプトマイシン、および 0. 25 μ gZm 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞 Z cm²に希釈し、培養し、経時的に培地の上清を回収する。

研究用ヒト未分化細胞を 24穴プレートに播種し、 18時間後に上記の培養上清 lm lを添カ卩して培養する。 72時間後に、実施例 1と同じ方法を用いてアルカリホスファターゼ活性を測定する。

MEM増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性が、 MEM増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなければ、未分化細胞を誘導骨芽細胞へ分化誘導させる因子を生成しないと判定される。ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞は、 MEM分化因子産生培地で培養する場合、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生すると予測される。一方、ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞は、 MEM増殖培地で培養する場合には、未分化細胞を誘導骨芽細胞へ分化誘導させる因子を生成しないことと予測される。 (比較例 4 B ：ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地および MEM増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞を前記機関から入手する。この軟骨細胞に、 M EM分化因子産生培地および MEM増殖培地をそれぞれ加えて 4 X 1 0 ⁴細胞/ c m ²に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収する。研究用ヒト未分化細胞を 2 4穴プレートに播種し、 1 8時間後に上記の培養上清 l m 1をそれぞれ添加して、培養する。 7 2時間後に実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定する。

ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞は、 ME M分化因子産生培地で培養する場合、アルカリホスファターゼ活性がほとんど変わらなければ、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないと判定される。また、 M EM増殖培地で培養する場合、アルカリホスファターゼ活性がほとんど変わらなければ、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないと判定される。

ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞は、 ME M分化因子産生培地で培養しても、 M E M増殖培地で培養しても、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないと予測される。

(実施例 5 ：ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞を、 HAM分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）

実施例 4と同様に入手したヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞に、 HAM分化因子産生培地を加えて 4 X 1 0 ⁴細胞 Z c m ²に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収する。研究用ヒト未分化細胞を 2 4穴プレートに播種し、 1 8 時間後に上記の培養上清 l m 1を添加して、培養する。 7 2時間後に実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定する。

ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞は、 HAM分化因子産生培地で培養する場合、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を誘導することを実施例 1と同様の方法および判定基準で確認することができる。

(比較例 5 A：ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞を、 HAM増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）

ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞に、 H AM増殖培地を加えて 4 X 1 0 ⁴ 細胞 Z c m ²に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収する。研究用ヒト未分化細胞を 2 4穴プレートに播種し、 1 8時間後に上記の培養上清 l m 1を添加して、培養する。 7 2時間後に実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する。

ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞は、 HAM増殖培地で培養する場合には、未分化細胞を誘導骨芽細胞へ分化誘導させる因子を生成しないことを実施例 1と同様の方法および判定基準で確認することができる。

(比較例 5 B ：ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞を、 HAM分化因子産生培地および HAM増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）比較例 4 Bと同様に入手したヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞に、 HA M分化因子産生培地おょぴ HAM増殖培地をそれぞれ加えて 4 X 1 0 ⁴細胞 c m ²に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収する。研究用ヒト未分化細胞を 2 4穴プレートに播種し、 1 8時間後に上記の培養上清 l m 1をそれぞれ添加して、培養する。 7 2時間後に実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する。 · ―. … ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞を HAM分化因子産生培地、 HAM增殖培地を用いた細胞培養物の培養上清を添加した場合、得られた細胞培養物の培養上清が、未分化細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例 1と同様の方法および判定基準で確認することができる。

(実施例 4〜 5および比較例 4 A〜 5 Bのまとめ）

上記実施例より、ヒト由来肥大化能を有する軟骨細胞が、分化因子産生培地に含まれる基礎培地の種類にかかわらず、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生するか否かを検討することができる。実施例 1、 3および比較例 1A〜1 E、 3A〜3Cより、ラット由来の肥大化能を有する軟骨細胞は、いずれの増殖培地でも、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生しないことが実証されている。さらに、ラット由来の肥大化能を有さない軟骨細胞は、いずれの培地で培養しても未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生しないことが実証されている。このことより、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子は、肥大化能を有する軟骨細胞を分化因子産生培地中で培養することによってのみ産生されることが示唆されている。従って、ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞においても、培地中に含まれる基礎培地が、通常、細胞培養に用いられ得る培地であれば、誘導骨芽細胞分化誘導因子の産生には影響を及ぼさず、本方法において使用可能であると推測される。

(実施例 6 ：肥大化能を有する軟骨細胞の産生する因子が、マウス C3H10 T 1Z2細胞以外の未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する活性を有するか否かの検討）

実施例 1と同様の方法を使用して、 MEM分化因子産生培地または MEM増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養したときの各培養上清を得た。未分化細胞として、 B ALB/3 T 3細胞、 3T3— Sw i s s a l b i n o細胞および N ΙΉ3Τ3細胞を用いた。これらの細胞をそれぞれ 24穴プレートに播種し、 18時間後に上記の培養上清 lm 1をそれぞれ添加して、 37°Cにて 5% C0₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定した。

MEM分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 MEM分化因子産生培地のみを添加した場合を 1とすると、 B ALBZ3 T 3細胞では約 5. 9倍（表 4左および図 6 Aを参照のこと）であり、 3T3— Sw i s s a 1 b i n o細胞では約 13. 8倍（表 4中および図 6 Aを参照のこと）であり、 N I H3T3細胞では約 5. 4倍であった（表 4右および図 6 Aを参照のこと）。

MEM増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 MEM増殖培地のみを添加した場合を 1とすると、 BALBノ 3T3細胞では約 1. 3倍（表 4左おょぴ図 6Aを参照のこと）であり、 3T3_Sw i s s a 1 b i n o細胞では約 1. 1倍（表 4中おょぴ図 6 Aを参照のこと）であり、 N I H3T3細胞では約 0. 9倍であつた（表 4右および図 6 Aを参照のこと）。

(表 4 BALB/3T3細胞、 3T3 - Swiss albino細胞および NIH- 3T3細胞に対する骨芽細胞分化誘導能）

BALB/3T3 3T3-Swiss albino NIH-3T3 相対値絶対値相対値絶対値相対値絶対値

GC分化上清 5.9 0.107 13.8 0.174 5.4 0.097 分化培地のみ 1 0.018 1 0.013 1 0.018 GC増殖上清 1.3 0.021 1.1 0.013 0.9 0.016 増殖培地のみ 1 0.016 1 0.013 1 0.018

GC (4週齢）： 1回実験を行った。 3試行した。

GC分化上清：成長軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清 GC増殖上清：.成長軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清 . 分化培地のみ： MEM分化培地そのもの

増殖培地のみ： MEM増殖培地そのもの

MEM分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清には、 3T3— Sw i s s a l b i n o細胞、 BALB/3T3 細胞おょぴ N I H3T3細胞においてアルカリホスファターゼ活性を上昇させ、これらの未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在することが確認された。一方、 MEM増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、これらの培養上清にはこの因子は存在しないことが確認された。 (比較例 6 ：肥大化能を有さない静止軟骨細胞の培養上清に存在する成分が、マウス C 3H1 OT 1Z2細胞以外の未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する活性を有するか否かの検討）

比較例 1 Bと同様の方法を使用して、 MEM分化因子産生培地または MEM増殖培地を用いて肥大化能を有さない静止軟骨細胞を培養したときの各培養上淸を得た。未分化細胞として、 BALBZ3T3細胞、 3 T3— Sw i s s a l b i n o細胞および N I H3 T 3細胞を用いた。これらの細胞をそれぞれ 24穴プレートに播種し、 18時間後に上記の培養上清 1 m 1をそれぞれ添加して、 3 7°Cにて 5% . CO₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1 と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。

MEM分化因子産生培地を用いて肥大化能を有さない静止軟骨細胞を培養した培養上清を添カ卩した場合、 MEM分化因子産生培地のみを添加した場合を 1とすると、アルカリホスファターゼ活性は、 8八し8 3丁3細胞では約1. 0倍 (表 5左および図 6 Aを参照のこと）であり、 3T3— Sw i s s a l b i n o細胞では約 1. 1倍（表 5中および図 6 Aを参照のこと）であり、 N I H3T 3細胞では約 1. 0倍であった（表 5右および図 6 Aを参照のこと）。

MEM増殖培地を用いて肥大化能を有さない静止軟骨細胞を培養した培養上清を添加した場合、 MEM増殖培地のみを添加した場合を 1とすると、アルカリホスファターゼ活性は、 B ALB/3 T 3細胞では約 1. 3倍（表 5左および図 6 Aを参照のこと）であり、 3 T 3— Sw i s s a 1 b i n o細胞では約 0. 9 倍（表 5中および図 6 Aを参照のこと）であり、 N I H 3 T 3細胞では約 1. 0 倍であった（表 5右および図 6 Aを参照のこと）。

(表 5 BALB/3T3細月包、 3T3— Swiss albino細胞および NIH— 3T3細胞に対する骨芽細胞分化誘導能）

RC分化上清 1.0 0.018 1.1 0.014 1.0 0.018 分化培地のみ 1 0.018 1 0.013 1 0.018

RC増殖上清 1.3 0.020 0.9 0.012 1.0 0.019 増殖培地のみ 1 0.016 1 0.013 1 0.018

RC (8週齢）： 1回実験を行つ 7こ 3試行した。

RC分化上清：静止軟骨細胞を MEM分化因子摩生培地で培養した培養上清 R C増殖上清：静止軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清

分化培地のみ： MEM分化培地そのもの

増殖培地のみ： MEM増殖培地そのもの

MEM分化因子産生培地を用いて肥大化能を有さない静止軟骨細胞を培養した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 BALB/3 T 3細胞、 3 T 3— Sw i s s a 1 b i n o細胞および N I H3 T 3細胞において、 MEM分化因子産生培地のみを添加した場合とほとんど変わらず、この培養上清には、これらの未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在しないことが確認された。 ME M増殖培地を用いて肥大化能を有さない静止軟骨細胞を培養した場合もまた、これらの培養上清にはこの因子は存在しないことが確認された。 (実施例 7 ：肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を種々の従来型骨芽細胞分化誘導成分を含む培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）

実施例 1と同様の方法により得られた肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM増殖培地（MEM培地および 1 5% FB S、 100U/m lぺニシリン、 0. lmg/m 1ストレプトマイシン、および 0. 25 /z gZm lアンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞 Z cm²に希釈し、さらに、従来型骨芽細胞分化誘導成分として、デキサメサゾン、）3—グリセ口ホスフェート、ァスコルビン酸またはこれらの組み合せを添加して培養し、経時的に培地の上清を回収し

Dex:デキサメサゾン、 iSGP: )3—グリセ口ホスフェート、 Asc:ァスコルビン酸それぞれの培養上清 1m lをマウス C3H10T 1Z2細胞（ 1. 25 X 10 ⁴細胞/ cm²) に添加して、 37°Cにて 5% C O ₂インキュベータ一中で培養した場合のアル力リホスファターゼ活性を測定した。アル力リホスファターゼ活性の測定は、実施例 1と同様の方法を使用した。その結果、以下の表および図 6 Bに示されるように、 MEM分化因子産生培地（D e x + ]3 GP+A s c) を添加した培地では、アルカリホスファタ一ゼ活性は、 0. 041であり、 MEM增殖培地に GP+A s cを添加した培地では、アルカリホスファターゼ活性は 0. 044であった。増殖培地に従来型骨芽細胞分化誘導成分の各々を単独で添加した培地では、アルカリホスファターゼ活性は、 De x単独では 0. 016であり、 i3 GP単独では 0. 015であり、 A s cでは 0. 016であった。増殖培地に D e X + G Pを添加した培地では、 0. 022であり、 De x+As cを添加した培地では 0. 01 7であった。対照として増殖培地のみで肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地の上清を、 C3H10T 1 2細胞に添加した場合、ァルカリホスファターゼは 0. 014であった。 MEM分化因子産生培地のみ、 M EM増殖培地のみを C 3H 10 T 1Z2細胞に添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、それぞれ、 0. 016ぉょぴ0. 014であった。

(誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子の産生に対する従来型骨芽細胞分化誘導成分の効果）

平均 SD

Dex+i8 GP+Asc 0.041 0.008

Dex 0.016 0.004 β GP 0.015 0.004

Asc 0.016 0.001

Dex+BGP 0.022 0.004

Dex+Asc 0.017 0.002 β GP+Asc 0.044 0.016 増殖培地 0.014 0.002 分化培地のみ 0.016 0.002 増殖培地のみ 0.014 0.001

Dex：デキサメサゾン

]3GP : )3—グリセ口ホスフェート

Asc：ァスコノレビン酸

分化培地のみ： MEM分化因子産生培地そのもの（軟骨細胞を培養していないもの）

増殖培地のみ： MEM増殖培地そのもの（軟骨細胞を培養していないもの）肥大化能を有する軟骨細胞を培養する M E M増殖培地に、従来型骨芽細胞分化誘導成分の各々を単独で添加した場合、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子は産生されなかった。 j3—グリセ口ホスフエ一トおよびァスコルビン酸を添カ卩した場合、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子は産生された。デキサメサゾン、 i3—グリセ口ホスフヱートおよぴァスコルビン酸のすべてを添加した場合（MEM分化因子産生培地と同じ場合）にも、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子の産生が促進されることが確認された。

(実施例 8 ：肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地中で培養することにより得られる培養上清に含まれる因子の検討）

実施例 1と同様の方法により、肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養し、 4日から 3週間経時的に集めた上清を遠心フィルターに入れ、 4000 X g、 4°Cにて 30分間遠心し、高分子分画と低分子分画を分離する条件下の遠心式限外濾過により、上清を分子量 50， 000以上の画分と分子量 5 0， 000未満の画分に分離させた。次いで、マウス C 3 H 1 0 T 1 Z2細胞 (BME培地中) を 24穴プレート（1. 25 X 10⁴細胞/ cm²) およびヒドロキシアパタイト（1 10⁶細胞_//1111 ) に播種し、 1 8時間後に、各培地上清の画分（1m l ) をそれぞれ添加して 37 °Cにて 5% C0₂インキュベーター中で培養した。 72時間後に実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する。

分子量 50， 000以上の画分を添加した場合、 24穴プレートに播種したときもヒドロキシァパタイトに播種したときも両方とも、マウス C3H10T 1 2細胞は赤く染まった（図 7 Aおよび 7 Bを参照のこと）。この培養上清の分子量 50， 000以上の画分には、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有する因子が存在することが分かった。分子量 50， 000未満の画分を添加した場合、 24穴プレートに播種したときもヒドロキシァパタイトに播種したときもどちらでも C 3H1 OT 1Z2細胞は染色されず、アルカリホスファターゼ活性は認められなかった（図 7 Cおよび 7 Dを参照のこと）。

以上の結果より、マウス C 3H1 0T 1Z2細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子は、肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地中で培養した培養上清の、分子量 50， 000以上の画分に存在することが分かつ 7こ o

(実施例 9 ：マウス肋骨，肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM 分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）

(マウス肋骨 ·肋軟骨部からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製）

8週齢雄性マウス（B a 1 b/cA) を本実施例において実験した。マウスは、クロ口ホルムを使用して屠殺した。マウスの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（1 0倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋骨 ·肋軟骨部を採取した。この肋骨 ·肋軟骨部の境界部分より半透明の成長軟骨部を採取した。この成長軟骨部を細切し、 0. 2 5%トリプシン一 EDTAZD— PB S (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) 中で、 3 7 °Cで 1時間攪拌した。次いで、遠心分離（1 70 X gで 3分間）により洗浄し、その後 0. 2%コラゲナーゼ（Collagenase：インビトロジェン社製） /Ό— PB Sとともに 3 7でで、 2. 5時間攪拌した。遠心分離（1 70 X gで 3分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で 0. 2 %ディスパーゼ（Dispase：インビトロジェン社製） /

(HAM+ 1 0% FB S) とともに、 3 7°Cにて、 1晚攪拌した。翌日、濾過し、遠心分離（1 70 X gで 3分間）により洗浄した。細胞をトリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。

評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。 (肥大化能を有する軟骨細胞の確認）

実施例 9によって得られた細胞は、分離の際に使用した酵素（トリプシン、コラゲナーゼ、デイスパーゼ）によって障害を受けているので、培養によって障害を回復させた。肥大化能を有する軟骨細胞を、軟骨細胞マーカーの局在または発現、および顕微鏡下で形態学的な肥大化を確認することによって同定する。

(肥大化能を有する軟骨細胞特異的マーカーの局在または発現）

上記の操作により得られた細胞の溶解物を S D S (ドデシル硫酸ナトリウム）で処理する。 S D S処理した溶液を S D Sポリアクリルアミド電気泳動に供する。その後、転写用膜にブロッテイング（ウェスタンプロティング）し、軟骨細胞マ一力一に対する一次抗体を反応させて、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ダルコシダーゼなどの酵素またはフルォレセインイソチオシァネート（F I T C) 、フィコエリトリン（P E ) 、テキサスレッド、 7—ァミノ _ 4—メチルクマリン _ 3 _酢酸（AMC A) 、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。

上記の操作により得られた細胞培養物を、 1 0 %中性ホルマリン緩衝液で固定し、軟骨細胞マーカーに対する一次抗体を反応させて、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ダルコシダーゼなどの酵素または F I T C、 P E、テキサスレッド、 AM C A、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。アルカリホスファターゼについては染色法で検出することもできる。上記の操作によって得られた細胞培養物を、 6 0 %ァセトン/タエン酸バッファーで固定し、蒸留水で洗浄後、ファーストバイオレット Bとナフトール A S— MXとのを混合液に浸漬し、室温喑所で 3 0分反応させることにより、呈色させる。

(軟骨細胞の肥大化能に関する組織学的検索）

5 X 1 0 ⁵個の細胞を含む H AM' s F 1 2培養液を遠心すること【胞のペレットを作製し、この細胞ペレットを一定期間培養し、顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較する。有意な成長が確認されたときに、細胞を肥大化能を有すると判定する。

実施例 9によって得られた細胞が、軟骨細胞マーカーの発現しているか否か、形態学的に肥大化しているか否かを検討することにより、これらの細胞が、肥大化能を有する軟骨細胞であるか否かを確認することができる。

(マウス肋骨 ·肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞によって産生された因子の検出）

実施例 9により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地（最小必須培地（MEM培地）、 15% FBS (ゥシ胎仔血清）、デキサメサゾン 10 nM、 3—グリセ口ホスフェート 1 OmM、ァスコルビン酸 50ju g m 1、 10 OUZm 1ペニシリン、 0. 1 m g Zm 1ストレプトマイシン、および 0. 25 μ g/m 1アンホテリシン Bを加えて 4 X 10⁴細胞 /cm²に希釈した。この細胞液を、ディッシュ（ベタトン 'ディッキンソン社製）に均一に播種し、 37°Cにて、 5% C0₂インキュベータ一中で培養し、経時的に（4 日目、 7日目、 11日目、 14日目、 18日目、 21日目に）培地の上清を回収した。

(回収した培養上清が、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する活性を有するか否かの検討）

マウス C3H10T1Z2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL- 226) を、 1. 25 X 10⁴細胞/ c m²で 24穴プレート（ベタトン 'ディッキンソン社製、 2. 5 X 10⁴/穴）に均一に播種した。播種から 18時間後に、上記の培養上清 lmlを添加して、 37°Cにて 5% C O ₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。本実施例では、マウス C 3H 10 T 1/2細胞に本因子含む培地を添加した場合、本因子を含まない培地を添加して培養した場合と比較して、 C3H 10T1Z2細胞の細胞全体のアルカリホスファターゼ（ALP) 活性の値を、少なくとも約 1. 5倍より高く上昇させる能力を有するときに、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有すると判断した。

MEM分化因子産生培地のみを添加した場合のアル力リホスファターゼ活性を 1とすると、アルカリホスファターゼ活性は、約 3. 1倍にまで上昇した（表 6 上段および図 8を参照のこと）。 (誘導骨芽細胞の確認）

上に示したように、誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子によって、誘導骨芽細胞マーカーの一つである、 C 3 H 10 T 1Z 2細胞のアル力リホスファターゼ (ALP) 活性が上昇することが示された。さらに C3H10T1Z2細胞のァルカリホスファターゼ染色においても、この誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子を C3H10T1/2細胞に添加して 72時間培養すると、 C3H10T 1Z 2細胞は著しい赤色を示す。このことにより、染色法によってもアルカリホスファターゼが発現していることが示される。この結果、 C3H10T1 2細胞が誘導骨芽細胞に分化したことが確認された。 (比較例 9 A：マウス肋骨 ·肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を ME

M増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）

実施例 9と同様の方法により、マウス肋骨 ·肋軟骨部から肥大化能を有する軟骨細胞を採取した。肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM増殖培地（最小必須培地（MEM培地）および 15% FBS、 100 UZm 1ペニシリン、 0. 1 m g/m 1ストレプトマイシン、および 0. 25 μ gZm 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞 Zcm²に希釈し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 1 1日目、 14日目、 18日目、 21日目に）培地の上清を回収した。

マウス C 3H1 OT 1 2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL-226) を、 1. 25 X 10⁴細胞 Zc m²で 24穴プレート（ベタトン 'ディッキンソン社製、 2. 5 X 10⁴ノ穴）に均一に播種した。播種から 18時間後に、上記の培養上清 lm lを添加して、 37°Cにて 5% C O ₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。 MEM増殖培地のみを添加した場合のアルカリホスファターゼ活性を 1とすると、アルカリホスファターゼ活性は約 1. 6倍であった（表 6下段および図 8を参照のこと）。

MEM増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 MEM増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった (図 8を参照のこと）。

(誘導骨芽細胞の確認）

実施例 9と同様の方法を用いて、上記の操作により得られた細胞培養物の上清は、 C3H10T 1 2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させなかったことを確認した。

(比較例 9B ：マウス肋軟骨由来の静止軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）

(肋軟骨からの静止軟骨細胞の調製）

8週齢雄性マウス（B a l bZcA) をクロ口ホルムを使用して屠殺した。マウスの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（10倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋軟骨部を採取した。この肋軟骨部分より不透明の静止軟骨部を採取した。この静止軟骨部を細切し、 0. 25%トリプシン_£0 T A/D- P B S (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) 中で、 37°Cで 1 時間攪拌した。次いで、遠心分離（1 70 X gで 3分間）により洗浄し、その後 0. 2 %コラゲナーゼ（Collagenase：インビトロジェン社製） ZD— P B Sとともに 37°Cで、 2. 5時間攪拌した。遠心分離（1 70 X gで 3分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で 0. 2 %ディスパーゼ（Dispase：インビトロジェン社製） / (HAM+ 10% FBS) とともに、 37°Cにて、 1晚攪拌した。 0. 2%デイスパーゼでの一晩処理を除く場合もある。翌日、濾過し、遠心分離（1 70 X gで 3分間）により洗浄した。細胞をトリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。

(肋軟骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞の確認）

実施例 9と同様の方法を使用して軟骨細胞マーカーの局在または発現を検出することができる。また、細胞を形態学的に検索して、得られた細胞が肥大化能を有する軟骨細胞であるか否かを確認することができる。

(肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の検出）

肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地（最小必須培地 (MEM培地）、 15% FBS (ゥシ胎仔血清）、デキサメサゾン 10 nM、 j3—グリセ口ホスフェート 10mM、ァスコルビン酸 50 μ gZm 1、 100U m lペニシリン、 0. 1 mg/m 1ストレプトマイシン、および 0. 25 μ g /m 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞 Zcm²に希釈し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 1 1日目、 14日目、 18日目、 21日目に）各培地の上清を回収した。

マウス C3H10T 1Z2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL— 226) を 2 4穴プレートに播種し、 1 8時間後に上記の培養上清 1 m 1を添カ卩して、 3 7°C にて 5% C0₂インキュベータ一中で培養した。 7 2時間後に、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定した。 MEM分化因子産生培地のみを添加した場合を 1とすると、アルカリホスファターゼ活性は約 0. 8倍であった（表 6上段および図 8を参照のこと）。

MEM分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性は、 MEM分化因子産生培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった（表 6上段および図 8を参照のこと）。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、 C 3 H 1 0 T 1 2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例 1と同様の方法および判定基準で確認することができる。

(比較例 9 C ：マウス肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）

比較例 9 Bと同様の方法により、肋軟骨から静止軟骨細胞を採取した。静止軟骨細胞を、 MEM増殖培地（最小必須培地（MEM培地）、 1 5% F B S、 1 O OUZm lペニシリン、 0. 1 mgZm 1ストレプトマイシン、および 0. 2 5 μ g/m 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 1 0⁴細胞 c m²に希釈し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 1 1日目、 1 4日目、 1 8日目、 2 1日目に）培地の上清を回収した。

マウス C 3 H 1 0 T 1 Z 2細胞（大日本住友製薬社製、 CC L一 2 2 6) を 2

4穴プレートに播種し、 1 8時間後に上記の培地 l m 1を添カ卩して、 3 7°Cにて 5% C0₂インキュベータ一中で培養した。 7 2時間後に、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定した。 MEM増殖培地のみを添加した場合を 1とすると、アルカリホスファターゼ活性が約 1. 0倍であった（表 6下段おょぴ図 8を参照のこと）。

肋軟骨由来の静止軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 MEM増殖培地のみ添加した場合とほとんど変わらなかった（表 6下段および図 8を参照のこと）。上記の操作により得られた細胞培養物の上清は、 C 3 H 1 0 T 1 Z 2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させないことを確認した。

(表 6 :マウス由来の軟骨繊を、 MEM分化因子産生培地およ ΙΛ ΕΜ增殖培地で培養し fc± 清を添加した実施例 9および比棚 9A~9C©アルカリホスファタ→f活性の比較）

MEM分化因子産生培地 (平均値)

相対値絶対値

GC上清 3.1 0.038

RC上清 0.8 0.011

分化培地のみ 1 0.012

MEM増殖培地 (平均値）

相対値絶対値

GC上清 1.6 0.021

RC上清 1.0 0.013

増殖培地のみ 1 0.014

8週齢： 1回実験した。 2試行した。

G C上清：肥大化能を有する軟骨細胞をそれぞれの培地で培養した培養上清 R C上清：静止軟骨細胞をそれぞれの培地で培養した培養上清

分化培地のみ： MEM分化因子産生培地そのもの

増殖培地のみ： MEM増殖培地そのもの

(実施例 9およぴ比較例 9 A〜9 Cのまとめ）

マウス肋骨 ·肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地を用いて培養した場合、この培養上清には、マウス C 3 H 1 0 T 1 Z 2細胞のアル力リホスファターゼ活性を上昇させ、誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在することが確認された。一方、 MEM増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清にはこの因子が存在しないことが確認された。肥大化能を有する軟骨細胞は、 MEM分化因子産生培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生することが見出されマウス肋軟骨部由来の静止軟骨細胞は、 MEM分化因子産生培地で培養しても、 M E M增殖培地で培養しても、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないことが確認された。

(実施例 10 ：ゥサギ肋骨 ·肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を ME M分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）

(ゥサギ肋骨 ·肋軟骨部からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製）

8週齢雄性ゥサギ（日本白色種）を本実施例において実験した。ゥサギは、クロロホルムを使用して屠殺した。ゥサギの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液

(10倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋骨 ·肋軟骨部を採取した。この肋骨 ·肋軟骨部の境界部分より半透明の成長軟骨部を採取した。この成長軟骨部を細切し、 0. 25%トリプシン一 EDTA/D— PB S (D u l b e c c o s Ph o s p h a t e Bu f f e r e d s a l i n e) 中で、 37°Cで 1時間攪拌した。次いで、遠心分離（170 X gで 3分間）により洗浄し、その後 0. 2 %コラゲナーゼ（Co l 1 a g e n a s e ：インビトロジェン社製） ZD— PBSとともに 37°Cで、 2. 5時間攪拌した。遠心分離（1 70X gで 3分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で 0. 2%デイスパーゼ（D i s p a s e ：インビトロジヱン社製）ノ（HAM+ 10% F B S) とともに、 37°Cにて、 1晚攪拌した。翌日、濾過し、遠心分離（170X gで 3 分間）により洗浄した。細胞をトリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。

評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とし (肥大化能を有する軟骨細胞の確認）

実施例 1 0によって得られた細胞は、分離の際に使用した酵素（トリプシン、コラゲナーゼ、デイスパーゼ）によって障害を受けているので、培養によって障害を回復させた。肥大化能を有する軟骨細胞を、軟骨細胞マーカーの局在または発現、および顕微鏡下で形態学的な肥大化を確認することによって同定する。

上記の操作により得られた細胞の溶解物を S D S (ドデシル硫酸ナトリウム）で処理する。 S D S処理した溶液を S D Sポリアクリルアミド電気泳動に供する。その後、転写用膜にブロッテイング（ウェスタンプロティング）し、軟骨細胞マ一力一に対する一次抗体を反応させて、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ダルコシダーゼなどの酵素またはフルォレセインイソチオシァネート（F I T C) 、フィコエリトリン（P E ) 、テキサスレツド、 7—ァミノ _ 4—メチルクマリン一 3—酢酸（AM C A) 、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。

上記の操作により得られた細胞培養物を、 1 0 %中性ホルマリン緩衝液で固定し、軟骨細胞マーカーに対する一次抗体を反応させて、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ダルコシダーゼなどの酵素または F I T C、 P E、テキサスレッド、 AM C A、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。アルカリホスファターゼについては染色法で検出することもできる。上記の操作によって得られた細胞培養物を、 6 0 %アセトン/クェン酸バッファーで固定し、蒸留水で洗浄後、ファーストバイオレット Bとナフトール A S— MXとのを混合液に浸漬し、室温暗所で 3 0分反応させることにより、呈色させる。 (軟骨細胞の肥大化能に関する組織学的検索）

5 X 1 0 ⁵個の細胞を含む H AM' s F 1 2培養液を遠心することにより細胞のペレットを作製し、この細胞ペレットを一定期間培養し、顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較する。有意な成長が確認されたときに、細胞を肥大化能を有すると判定する。

(結果）

実施例 10によって得られた細胞が、軟骨細胞マーカーを発現しているか否力、、形態学的には肥大化しているか否かを確認することにより、これらの細胞が、月巴大化能を有する軟骨細胞であるか否かを確認することができる。

(ゥサギ肋骨 ·肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞によって産生された因子の検出）

実施例 10により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地（最小必須培地（MEM培地）、 1 5% FB S (ゥシ胎仔血清）、デキサメサゾン 10 nM、 j3—グリセ口ホスフェート 10πιΜ、ァスコルビン酸 50 μ gZml、 100 UZm 1ペニシリン、 0. 1 m g Zm 1ストレプトマイシン、および 0. 25 μ g/m 1アンホテリシン Bを加えて 4 X 10⁴細胞/ c m²に希釈した。この細胞液を、ディッシュ（べクトン ·ディッキンソン社製）に均一に播種し、 37°Cにて、 5% CO₂インキュベータ一中で培養し、経時的に

(4日目、 7日目、 1 1日目、 14日目、 18日目、 21日目に）培地の上清を回収した。

(回収した培養上清が、未分化細胞を誘導骨芽細胞を分化誘導する活性を有十るか否かの検討）

マウス C3H10T 1/2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL- 226) を、 1. 25 X 10⁴細胞/ c m²で 24穴プレート（べクトン 'ディッキンソン社製、 2. 5 X 10⁴ 穴）に均一に播種した。播種から 18時間後に、上記の培養上清 lmlを添加して、 37°Cにて 5% C O ₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。本実施例では、マウス C3H10T 1 2細胞に本因子含む培地を添加した場合、本因子を含まない培地を添加して培養した場合と比較して、 C3H 10T1Z2細胞の細胞全体のアルカリホスファターゼ（ALP) 活性の値を、少なくとも約 1. 5倍より高く上昇させる能力を有するときに、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有すると判断した。

MEM分化因子産生培地のみを添加した場合を 1とすると、培養上清を添加すると、アルカリホスファターゼ活性が上昇する。

(誘導骨芽細胞の確認）

上に示したように、誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子によって、誘導骨芽細胞マーカーの一つである、 C3H10T 1/2細胞のアルカリホスファターゼ (ALP) 活性が上昇することが示された。さらに C 3H10T 1/2細胞のァルカリホスファターゼ染色においても、この誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子を C3H10 T 1/2細胞に添カ卩して 72時間培養すると、 C3H10T1/ 2細胞は著しい赤色を示す。このことにより、染色法によってもアルカリホスファターゼが発現していることが示される。この結果、 C3H10T1/2細胞が誘導骨芽細胞に分化したことが確認された。

(比較例 1 OA：ゥサギ肋骨 ·肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を M EM増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）

実施例 10と同様の方法により、ゥサギ肋骨 ·肋軟骨部から肥大化能を有する軟骨細胞を採取した。肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM増殖培地（最小必須培地（MEM培地）および 15% FBS、 100 UZm 1ペニシリン、 0. 1 mgZm 1ストレプトマイシン、および 0. 25 gZm 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 1 0⁴細胞 Zc m²に希釈し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 1 1日目、 14日目、 18日目、 21日目に）培地の上清を回収した。

マウス C 3H10T 1/2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL- 226) を、 1. 25 X 10⁴細胞/ cm²で 24穴プレート（べクトン 'ディッキンソン社製、 2. 5 X 10⁴ 穴）に均一に播種した。播種から 18時間後に、上記の培養上清 lm lを添加して、 37°Cにて 5% C O ₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。

MEM増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性は、 MEM増殖培地のみを添カ卩した場合とほとんど変わらなかった。

(誘導骨芽細胞の確認）

実施例 10と同様の方法および判定基準を用いて、上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、 C3H10T 1ノ2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを確認することができる。

(比較例 10B ：ゥサギ肋軟骨由来の静止軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）

(肋軟骨からの静止軟骨細胞の調製）

8週齢雄性ゥサギ（日本白色種）をクロ口ホルムを使用して屠殺した。ゥサギの胸部をバリ力ンで剃毛し、ヒビテン液（ 10倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋軟骨部を採取した。この肋軟骨部分より不透明の静止軟骨部を採取した。この静止軟骨部を細切し、 0. 25%トリプシン一 EDT A ZD— PB S (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) 中で、 37°Cで 1時間攪拌した。次いで、遠心分離（170 X gで 3分間）により洗浄し、その後 0.

2 %コラゲナーゼ（Collagenase：インビトロジェン社製） ZD—PB Sとともに 37°Cで、 2. 5時間攪拌した。遠心分離（1 70 X gで 3分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で 0. 2 %ディスパーゼ（Dispase：インビトロジェン社製） / (HAM+ 10% FBS) とともに、 37°Cにて、 1晚攪拌した。 0. 2%デイスパーゼでの一晩処理を除く場合もある。翌日、濾過し、遠心分離 (1 70 X gで 3分間）により洗浄した。細胞をトリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。

実施例 10と同様の方法および判定基準を使用して軟骨細胞マーカーの局在または発現を検出し、形態学的にも検索して、得られた細胞が肥大化能を有さない軟骨細胞であるか否かを確認することができる。 (肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の検出）

肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地（最小必須培地 (MEM培地）、 1 5% FBS (ゥシ胎仔血清）、デキサメサゾン 10 nM、 /3—グリセ口ホスフェート 1 OmM、ァスコルビン酸 50 μ g/m 1、 100U /m lペニシリン、 0. 1 rngZm 1ストレプトマイシン、および 0. 25 g /m 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞 Zcm²に希釈し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 1 1日目、 14日目、 18日目、 21日目に）各培地の上清を回収した。

マウス C3H10T 1/2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL - 226) を 2 4穴プレートに播種し、 18時間後に上記の培養上清 lm 1を添加して、 37°C にて 5% CO₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定した。

MEM分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添カ卩した場合、アル力リホスファターゼ活性は、 ME M分化因子産生培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、 C3H10T 1 2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例 1と同様の方法および判定基準で確認することができる。

(比較例 10 C ：肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）

比較例 10Bと同様の方法により、肋軟骨から静止軟骨細胞を採取した。静止軟骨細胞を、 MEM増殖培地（最小必須培地（MEM培地）、 15% FB S、 10 OUZm 1ペニシリン、 0. 1 mgZm 1ストレプトマイシン、および 0. 25 g/m 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 10⁴細胞 c m²に希釈し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 1 1 日目、 14日目、 18日目、 21日目に）培地の上清を回収した。

マウス C3H10T1/2細胞（大日本住友製薬社製、 CCL— 226) を 2 4穴プレートに播種し、 18時間後に上記の培地 lm 1を添加して、 37°Cにて 5% C0₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定した。

肋軟骨由来の静止軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、 MEM増殖培地のみ添加した場合とほとんど変わらなかった。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、 C 3H10 T 1Z2細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例 1と同様の方法およぴ判定基準で確認することができる。 (実施例 10および比較例 10 A〜 10 Cのまとめ）

MEM分化因子産生培地を用いて、ゥサギ肋骨 ·肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清には、マウス C3H10T1 / 2細胞のアル力リホスファターゼ活性を上昇させ、誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在することが確認された。一方、 MEM増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清にはこの因子が存在しないことが確認された。肥大化能を有する軟骨細胞は、 MEM分化因子産生培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生することが見出された。

ゥサギ肋軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞は、 MEM分化因子産生培地で培養しても、 MEM増殖培地で培養しても、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないことが確認された。

(実施例 11 ：未分化細胞を培養する培地（未分化細胞培養培地）力未分化細胞の誘導骨芽細胞への分化誘導に与える影響の検討）

実施例 1、比較例 1 Bおよび 1Dと同様の方法をそれぞれ使用して、肥大化能を有する軟骨細胞、もしくは肥大化能を有さない静止軟骨細胞および関節軟骨細胞を採取した。これらの細胞を、 MEM分化因子産生培地および MEM増殖培地にそれぞれ 4 X 10⁴細胞/ cm²で播種し、 37°Cにて 5% C0₂インキュべ一ター中で培養し、経時的に（4日目、 7日目、 11日目、 14日目、 18日目、 21日目に）各培養上清を得た。未分化細胞として、マウス C3H10T1Z2 細胞を用いた。 HAM培地または MEM培地の入った 24穴プレートに、これらの細胞を 1. 25 X 10⁴細胞 Zc m²で播種し、 18時間後に上記の培養上清 1 m 1をそれぞれ添加して、 37°Cにて 5% C〇 ₂インキュベータ一中で培養した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。 C3H1 OT 1 2細胞を MEM培地で培養した場合、 MEM分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培養上清を添カ卩したもののアル力リホスファターゼ活性は、 MEM分化因子産生培地のみを添加したものと比較して約 10. 8倍高いアルカリホスファターゼ活性の上昇が認められた。 MEM 増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培養上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性の上昇は認められなかった。肥大化能を有さない静止軟骨細胞および関節軟骨由来の軟骨細胞を用いた場合は、 MEM分化因子産生培地を用いて培養した培養上清を添加しても MEM増殖培地を用いて培養した培養上清を添加しても、いずれもアルカリホスファターゼ活性の上昇は認められなかった。 C 3H 10T 1Z2細胞の培養に用いる基礎培地は、 C3H10T 1/ 2細胞の誘導骨芽細胞への分化誘導に影響を与えないことが分かった（表 7および図 9を参照のこと）。

(表 7：未分化細胞の培 ¾こ用い ¾S磋培地が、未分化細胞の骨芽細胞への分化誘導 I える影響）

HAM培地 (平均:

相対値絶対値

GC分化上清 6.7 0.058

GC增 ® 清 1.1 0.010

RC分化上滑 1.2 0.011

RC増殖上清 1.1 0.010

AC分化上清 1.2 0.010

AC増殖上清 1.2 0.011

分化培地のみ 1 0.009

増殖培地のみ 1 0.009

MEM培地（平均）

相対値絶対値

GC分化上清 10.8 0.085

GC増清 1.3 0.015

RC分化上滑 1.5 0.012

RC増殖上清 0.7 0.008

AC分化上清 1.3 0.010

AC増 ¾|±滑 0.6 0.007

分化培地のみ 1 0.008

増殖培地のみ 1 0.011

GC (4週齢）： 1回実験した。 3試行した。

RC (8週齢）： 1回実験した。 3試行した。 AC (8週齢）： 1回実験した。 3試行した。

GC分化上清：肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清 GC増殖上清：肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清

R C分化上清：静止軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清

RC増殖上清：静止軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清

AC分化上清：関節軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清 AC増殖上清：関節軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した培養上清

分化培地のみ： MEM分化因子産生培地そのもの

増殖培地のみ： MEM増殖培地そのもの

C3H10T 1/2細胞を HAM培地で培養した場合、 MEM分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培養上清を添カ卩したもののアル力リホスファターゼ活性は、 MEM分化因子産生培地のみを添加したものと比較して約 6. 7倍高いアルカリホスファターゼ活性の上昇が認められた。 MEM增殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性の上昇は認められなかった。肥大化能を有さない静止軟骨細胞および関節軟骨由来の軟骨細胞を用いた場合は、 MEM分化因子産生培地を用レ、て培養した培養上清を添加しても M E M増殖培地を用レ、て培養した培養上清を添加しても、いずれもアルカリホスファターゼ活性の上昇は認められなかった（表 7および図 9を参照のこと）。

(実施例 12 ：肥大化能を有する軟骨細胞によって産生された、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子の熱による変性）

実施例 1と同様の方法を使用して、肥大化能を有する軟骨細胞を採取した。 M EM分化因子産生培地（最小必須培地（MEM培地）、 15% FBS (ゥシ胎仔血清）、デキサメサゾン 10 nM、 ]3—グリセ口ホスフェート 1 OmM、ァスコルビン酸 50 μ gZm 1、 10 OUZm 1ペニシリン、 0. l mg/m lストレプトマイシン、および 0. 25 μ g/m 1アンホテリシン Bを加えて 4 X 10 ⁴細胞/ cm²に希釈し、培養し、経時的に（4日目、 7日目、 1 1日目、 14 日目、 18日目、 21日目に）培地の上清を回収した。この培養上清を、沸騰水中で 3分間、加熱処理した。

マウス C 3H 10 T 1/2細胞（1. 25 X 10⁴細胞 Zcm²) を BME培地で培養し、 18時間後に、加熱処理をしていない培養上清、加熱処理した培養上清、 MEM分化因子産生培地のみをそれぞれ 1 m 1を添加した。 72時間後に、実施例 1と同様の方法を使用してアル力リホスファターゼ活性を測定した。

MEM分化因子産生培地のみを添加して培養したときのアル力リホスファタ一ゼ活性を 1とすると、加熱処理していない肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合、アル力リホスファターゼ活性は、約 1 2. 8倍であつたが、該培養上清を加熱処理した場合には、アルカリホスファターゼ活性は、約 1. 6倍に減少した（表 8および図 10を参照のこと）。この結果より、肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清に存在する、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子は、加熱処理により熱変性する（失活する）ことが確認された。

(表 8：未分化細胞を骨芽細胞に分化誘導させる因子の靓こよる変性）

ALP活性 (平均）

相対値絶対値

熱処理 1.6 0.014

非処理 12.8 0.111

分化培地のみ 1 0.009

4週齢： 1回実験した。 3試行した。

熱処理：肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清を加熱処理したもの

非処理：肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清

分化培地のみ： MEM分化因子産生培地そのもの

(実施例 13 ：誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子を産生する能力を有する、肥大化能を有する軟骨細胞と生体適合性足場とを用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）、実施例 1と同様の方法により、肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を調製した。調製した肥大化能を有する軟骨細胞に、 MEM分化因子産生培地を加えて 1 X 10⁶細胞 Zm 1に希釈した。この細胞液を、コラーゲンゲル、アルギン酸およびマトリゲル ^TM (ベタトン 'ディッキンソン社製）のそれぞれに均一に播種し、 37°Cにて、 5% CO₂インキュベータ一中で 1週間培養し、複合材料を作製した。培養は、 MEM分化因子産生培地を用いた。

これらの複合材料を同系動物の背部皮下に移植した。移植の 4週間後、これらの同系動物を屠殺して移植部位を摘出し、 10%中性緩衝ホルマリンで固定し、レントゲン撮影およびマイクロ CT撮影を行い、パラフィン包埋した。常法に従つて薄切標本を作製し、へマトキシリン—ェォジン（HE) 染色、トルイジン青 (TB) 染色、アルシアン青（AB) 染色、サフラニン O (SO) 染色し、移植部位の状態を確認した。

各実験は以下のように行った。

レントゲン撮影：マイクロ CT撮影機器（東陽テク二力社、高分解能 X線マイクロ CTスキャナ SKYSCAN1 1 72) を用い、 100KVで垂直方向よりレントゲンを撮影した。

マイクロ CT撮影：同マイクロ CT機器を用い、 1001：で0. 4度ずつ回転させて各レントゲンを撮影し、添付ソフト NR e c o nにより再構成し、三次元ボリュームレンダリングソフト VGS t u d i o Ma xにより三次元画像を得た。 HE染色：薄切、脱パラした切片を、へマトキシリン液に 5— 10分浸漬、水洗、色出し後、ェォジン液で 3— 5分浸漬。

TB染色：薄切、脱パラした切片を 0. 05%トルイジン青液に 1 5_30分浸漬。 .

AB染色：薄切、脱パラした切片を 3%酢酸液に 3— 5分浸漬し、次いでアルシアン青液に 20— 30分浸漬、水洗後、ケルンェヒトロート（ヌクレアファーストレツド）液に 10— 1 5分浸漬。

SO染色：薄切、脱パラした切片を鉄へマチキシリン液に 5 _15分浸漬、水洗、分別（塩酸アルコール）、色出し、 1%酢酸液、ファーストグリーン液 1— 5分、 1%酢酸液、サフラニン O液 3— 5分浸漬。

MEM分化産生培地で培養することにより誘導骨芽細胞分化誘導能因子を産生する能力を有するようになった、肥大化能を有する軟骨細胞を含む複合材料の全てにおいて骨形成が観察された（図 13〜24) 。

コントロールとして、移植に用いた複合材料の一部を 10%中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。薄切切片を作製し、染色した。

本実施例と同様の方法を使用して、実施例 2〜3 (ラット）、 4〜5 (ヒト）、 7 (ラット）、 9 (マウス）、 10 (ゥサギ）により調製された肥大化能を有する軟骨細胞を用いて複合材料を製造し、同系動物もしくは免疫不全動物の皮下に移植した場合を効果を検討することができる。さらに、生体適合性を有する足場として、例えば、ヒドロキシァパタイト、 Pu r aMa t r i x^TM (べクトン ·ディッキンソン社製、カタログ番号 354250, BD Pu r aMa t r i xペプチドハイドロゲル）、コラーゲン（スポンジ）、ゼラチン（スポンジ）、ァガロースを用いて複合材料を製造し、同系動物もしくは免疫不全動物の皮下に移植した場合の効果を検討することができる。 (比較例 13 A：肥大化能を有さない軟骨細胞と生体適合性足場とを用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）

比較例 1 B (ラット）と同様の方法により調製された肥大化能を有さない軟骨細胞を用いた。この肥大化能を有さない軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地または MEM増殖培地のいずれかに希釈し、実施例 13と同様の方法により複合材料を作製した。生体適合性を有する足場として、コラーゲンゲル、マトリゲル ^τ ^Μ (べクトン .ディッキンソン社製）およびアルギン酸を用いた。これらの複合材料を同系動物の背部皮下に移植した。移植の 4週間後、これらの同系動物を屠殺して移植部位を摘出し、 10%中性緩衝ホルマリンで固定し、レントゲン撮影とマイクロ CT撮影を行い、パラフィン包埋した。薄切標本を作製し、へマトキシリン—ェォジン（HE) 染色、トルイジン青（TB) 染色、アルシアン青（A B) 染色、サフラニン O (SO) 染色し、移植部位の状態を確認した。肥大化能を有さない軟骨細胞を用いた場合、いずれの生体適合性を有する足場を用いる複合材料においても骨形成は観察されなかった。 MEM分化因子産生培地を用いた結果を図 25〜33に示す。

本比較例と同様の方法を使用して、比較例 1D (ラット）、 3B (ラット）、 4 B (ヒト）、 5B (ヒト）、 9B (マウス）および 10 B (ゥサギ）により調製された肥大化能を有さない軟骨細胞を用いて複合材料を製造し、同系動物もしくは免疫不全動物の皮下に移植した場合を効果を検討することもできる。さらに、生体適合性を有する足場として、例えば、ヒドロキシァパタイト、 Pu r aMa t r i x™ (ベタトン .ディッキンソン社製、カタログ番号 354250、 B D Pu r aMa t r i xペプチドハイドロゲル）、コラーゲン（スポンジ）、ゼラチン（スポンジ）、ァガロースを用いて複合材料を製造し、皮下に移植した場合の効果を検討することもできる。 (比較例 13 B ：足場を単独で皮下に移植した場合の効果）足場を単独で移植すること以外、実施例 13と同様の方法を用いた。足場であるヒドロキシアパタイト、コラーゲンゲル、アルギン酸、またはマトリゲル ^TM

(ベタトン .ディッキンソン社製）のそれぞれを単独で同系動物の背部皮下に移植した。その結果、骨形成は観察されなかった（図 34) 。

本比較例と同様の方法を使用して、例えば、 Pu r aMa t r i x^TM (ベタトン 'ディッキンソン社製、カタログ番号 354250, BD Pu r aMa t r i xペプチドハイドロゲル）、コラーゲン（スポンジ）、ゼラチン（スポンジ）を単独で同系動物もしくは免疫不全動物の皮下に移植し、各足場についての効果を検討する。

(実施例 14 ：誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子を産生する能力を有する、肥大化能を有する軟骨細胞のぺレットを皮下に移植した場合の効果）

(誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子を産生する能力を有する、肥大化能を有する軟骨細胞ペレツトの調製）

実施例 1と同様の方法により、肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を調製した。この細胞（5 X 10⁵個）に、 MEM分化因子産生培地を加えて 5 X 10⁵個 Z 0. 5m lに希釈した。この細胞液を、遠心分離（ 1000 r p m (1 70 X g) X 5分間）することにより、誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子を産生する能力を有する、肥大化能を有する軟骨細胞ペレットを調製し、 3 7 °Cにて 1週間培養した（図 35A) 。

このペレットを 37 °Cにて 1週間培養した後、同系動物の背部皮下に移植した。培養は、 MEM分化因子産生培地を用いた。移植の 4週間後、これらの同系動物を屠殺して移植部位を摘出し、 10%中性緩衝ホルマリンで固定し、レントゲン撮影とマイクロ CT撮影を行い、パラフィン包埋.した。常法に従って薄切標本を作製した。実施例 13と同様の方法を用いて、へマトキシリン一ェォジン（H E) 染色、トルイジン青（TB) 染色、アルシアン青（AB) 染色、サフラニン O (SO) 染色し、移植部位の状態を確認した。その結果、誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子を産生する能力を有する、肥大化能を有する軟骨細胞ペレツトを移植した場合、移植部位において骨形成が観察された（図 35C〜D、図 36 および 37) 。

本実施例と同様の方法を使用して、実施例 2〜3 (ラット）、 4〜5 (ヒト）、 7 (ラット）、 9 (マウス）、 10 (ゥサギ）により調製された肥大化能を有する軟骨細胞を用いて細胞ペレツトを調製し、同系動物もしくは免疫不全動物の皮下に移植した場合の効果を検討することができる。

(比較例 14 A：肥大化能を有さない軟骨細胞のペレツトを皮下に移植した場合の効果）

比較例 1 B (ラット）と同様の方法により調製された肥大化能を有さない軟骨細胞を用いた。この細胞（5 X 10⁵個）に、 MEM分化因子産生培地を加えて 5 X 1 0⁵個/ 0. 5 m 1に希釈した。遠心分離（l O O O r pm (1 70 X g) X 5分間）することにより、肥大化能を有さない軟骨細胞ペレットを作製し、

37 °Cにて 1週間培養した（図 35B) 。次いで、このペレットを同系ラットの背部皮下に移植した。実施例 14と同様の方法を用いて、移植部位における、肥大化能を有さなレ、軟骨細胞と生態適合性足場とを用いる複合材料を移植した場合の影響を観察した。その結果、移植部位に骨形成は認められなかった（図 35E 〜Fおよぴ図 38) 。

本比較例と同様の方法を使用して、比較例 1D (ラット）、 3B (ラット）、

4 B (ヒト）、 5 B (ヒト）、 9 B (マウス）および 10 B (ゥサギ）により調製された肥大化能を有さない軟骨細胞を用いて細胞ペレツトを調製する。次いで、同系動物もしくは免疫不全動物の皮下に移植する。移植後、実施例 14と同様の方法を用いて、移植部位における、肥大化能を有さない軟骨細胞の細胞ペレットを移植した場合の影響を観察することができる。

(実施例 1 5. 肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子と、 BMP、 TGF との関係）

実施例 1と同様の方法を用いて、ラット肋骨 ·肋軟骨部から肥大化能を有する軟骨細胞を採取した。この肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM分化因子産生培地（最小必須培地（MEM培地）および 1 5% F B S (ゥシ胎仔血清）、デキサメサゾン 1 0 nM、 ]3—グリセ口ホスフェート 1 OmM、ァスコルビン酸 5 0 μ g/m 1 , 1 0 OUZm 1ペニシリン、 0. 1 m g 1ストレプトマイシン、および 0. 2 5 ju g/m 1アンホテリシン B) を加えて 4 X 1 0⁴細胞 Zc m² に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収した。その後、以下のアツセィを行い、アル力リホスファターゼの活性を測定した。

(TGF j3アツセィ）

β ツセは、 Nagano, T. et al.： Effect of heat treatment on bio activities of enamel matrix derivatives in human periodontal ligament (H PDL) cells. J. Periodont. Res. , 39: 249-256， 2004. に記載の方法を用いて行った。 HPD L細胞を 5 X 1 0⁴/穴で 9 6穴プレートに播種し、 2 4時間培養した。培養液を Ι Ο ηΜ 1 a, 2 5—ジヒドロキシビタミン D 3と検査試料を含む培地に交換した。 9 6時間培養後、 . P B Sで洗浄し、アルカリホスファターゼ活性を測定した。具体的には、 1 0mM p—ニトロフヱニルリン酸を基質とし、 5mM Mg C 1 ₂を含む 1 0 OmM 2—ァミノ一 2—メチル _ 1， 3 プロパンジオール塩酸緩衝液（p H I 0. 0) 中で、 3 7°Cにて、 1 0分間反応させた。 N a OHを添加した後、 4 0 5 nmの吸光度を測定した。

肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合、吸光度は、約 0. 1 5 1 5、約 0. 2 5 4 5、約 0. 1 24 2 (表 9および図 1 1 Aを参照のこと。）であった。 (表 9 TGFp活性)

(BMPアツセィ） ' BMPアツセィは、 Iwata, T. et al.： Noggin Blocks Osteoinductive Activ ity of Porcine Enamel Extracts. J. Dent. Res. , 81： 387-391, 2002.に記載の方法を用いて実施した。 ST 2細胞を 5 X 1 0⁴/穴で 9 6穴プレートに播種し、 24時間培養した。培養液を 200 nM a 1 1—トランスレチノイン酸と検査試料を含む培地に交換した。 7 2時間培養後、 PB Sで洗浄した。次いで、アルカリホスファターゼ活性を測定した。具体的には、 l OmM p—ニトロフェニルリン酸を基質とし、 5mM Mg C 1 ₂を含む 1 0 OmM 2—ァミノ一 2—メチル— 1， 3プロパンジオール塩酸緩衝液（ρΗ Ι Ο. 0) 中で、 3 7°C にて、 8分間反応させた。 Na OHを添加した後、 405 nmの吸光度を測定した。

肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合、吸光度は、約 0. 05、約 0. 0 75、約 0. 075 (表 1 0およぴ図 1 1 Bを参照のこと。）であった。

(表 10 BMP活性)

誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む MEM分化因子産生培地上清には、 T G F j3 の活性が認められた。つまり、この分化因子産生培地には TGF /3が存在することが証明された（図 1 1 Aを参照のこと。）。また、 BMPの活性もわずかに観察された（図 1 1 Bを参照のこと。）。 BMPの系は TGF j3の存在で抑制がかかる。それにもかかわらず、 TGF ]3が存在する分化因子産生培地上清においてアルカリホスファターゼ活性が上昇した。以上の結果より、このアルカリホスファターゼ活性の上昇は、 BMPではない誘導骨芽細胞分化誘導因子により誘導されたと考えられる。

(実施例 16. 骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを用いる複合材料が、未分化細胞を骨芽細胞に誘導する能力の検討）

本実施例では、実施例 1と同様の方法により、肥大化能を有する軟骨細胞を M EM分化因子産生培地で培養し、 4日から 3週間、経時的に集めた上清を遠心フィルターに入れ、 4000 X g、 4 °Cにて 30分間遠心分離し、高分子分画と低分子分画を分離する条件下の遠心式限外濾過により、上淸を分子量 50， 000 以上の画分と分子量 50， 000以下の画分に分離すると同時に、分子量 50， 000以上の画分を 10倍濃縮した。この濃縮した培地上清を、分化因子産生培地で 5倍に希釈した。この遠心分離には、 50K膜（ミリポア社製、アミコンゥルトラ 15、 50， 000NMWL, カタログ番号 U F C 905024 ) を用いた。

超多孔体ヒドロキシアパタイト（ァパセラム AXフィラー： L o t . 0323 1 710、 3 mm角）と充分に該ァパタイトが浸漬する量の希釈液（例えば、該アパタイト顆粒 10粒に対して希釈液 lm 1 ) を、注射筒に入れて引くことにより、脱気した。この際、約 0. 3m 1の希釈液がヒドロキシアパタイトに付着された。

次いで、 18時間前に 24ゥヱルプレートに播種したマウス C 3H10T 1/ 2細胞（1. 25 X 10⁴細胞/ cm²) に、上記のようにして作製した骨芽細胞誘導因子を付着させた超多孔体ヒドロキシァパタイヒドロキシァパタイトをゥエル当り 10粒添加した。マウス C3H10 T 1/2細胞を培養する培地として、 BME培地を用いた。 72時間後にアバタイトを取り出し、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定した。

(比較例 1 1 )

比較例として、実施例 16と同様の方法で、ァパセラム AXを分化因子産生培地に浸漬したもの、ァパセラム AX単独、分化因子産生培地単独（1m l) を調製した。次いで、実施例 1 1と同様に、 18時間前に、播種したマウス C3H1 0T 1Z2細胞（BME培地中、 1. 25 X 10⁴細胞 Zcm²) に、分化因子産生培地にァパセラム AXを浸漬したもの（10粒 Zwe 1 1 ) 、ァパセラム A X単独、分化因子産生培地単独（1m l) を添カ卩し、 72時間後にこれらを取り出した。次いで、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。さらに、実施例 16と同様の方法により RNAを抽出した。

その結果、分化因子産生培地を 1とした場合、アル力リホスファターゼ活性は、骨芽細胞分化誘導因子を含む培養上清にァパセラム AXを浸漬したものでは、 5. 8であり、ァパセラム AXを分化因子産生培地に浸漬したものでは、 1. 4であり、ァパセラム AX単独では、 1. 4であった（表 1 1および図 1 2) 。

(表:！ 1)

因子 +ァパタイト：骨芽細胞分化誘導因子を含む培養上清にァパセラム AXを浸漬したもの

分化培地 +ァパタイト：ァパセラム AXを分化因子産生培地に浸漬したものァパタイト単独：ァパセラム AX単独

分化培地のみ： MEM分化因子産生培地そのもの

以上の結果より、骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを用いる複合材料は、未分化細胞を骨芽細胞に誘導し、骨芽細胞を産生することが確認された。

(実施例 1 7. 骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを用いる複合材料を骨欠損部位および皮下に移植した場合の効果）

(複合材料の作製）

実施例 1と同様の方法を用いて、 4週齢雄性ラット（Wi s t a r系）および 8週齢雄性ラット（Wi s t a r系）力ら肥大化能を有する細胞を得た。この肥大化能を有する軟骨細胞を、分化因子産生培地で培養し、その培養上清を得た。この培養上清を 50K膜（ミリポア社製、アミコンウルトラ 15、 50， 000 NMWL、カタログ番号 UFC 905024) を用いて、 4000 X g、 4でにて 30分間遠心分離し、分子量 50， 000以下の成分を除去すると共に分子量 50， 000以上の成分を 10倍濃縮した。

この濃縮液を凍結させ、遠心乾燥させ、電動式粉砕装置（クライオプレス CP — 100 W、マイクロテックニチオン社）で粉砕した。この粉碎乾燥物 30 m g を採取し、足場に複合化した。

足場として、コラーゲンキット（コラーゲンゲル培養キット、新田ゼラチン社）を用いてコラーゲンゲルを作製した。具体的には、コラーゲンゲルは、酸性コラーゲン溶液 0. 8m 1、再構成用緩衝液（26 OmM NaHC03、 20 OmM HEPES、 5 OmM N a OH) 0. 1 m 1、粉碎乾燥物 30 m gを混合し、温度を 3 7度にすることにより作製した。複合材料の大きさは 1〜1 . 5 c m ³であった。この複合材料を、埋入する欠損の大きさにあわせて切削した。

(骨の欠損部位の作製方法）

移植する同系動物もしくは免疫不全動物を麻酔し、無菌的に大腿骨または脛骨の皮膚を切開し、軟部組織をそらせて、大腿骨または脛骨の骨欠損作製部位を露出させた。あるいは、頭蓋骨の皮膚を切開し、頭蓋骨の骨欠損作製部位を露出させる。歯科用穿孔器にトレフィンバールまたはディスクを装着し、穿孔骨欠損または離断骨欠損を作製した。

(骨欠損部位への移植）

本実施例では、移植の 4週間後に大腿骨を摘出し、マイクロ C T測定および組織標本作製によって、骨形成を評価する。

上記方法を用いて、ラット（W i s t a r系、 1 2週齢、ォス）の大腿骨に、直径 3 mm X深さ l〜2 mmの骨欠損を作製し、上記の複合材料を埋入した。その結果を図 4 O Aに示す。

(皮下ポケットの作製方法）

移植する同系動物もしくは免疫不全動物を麻酔し、無菌的に皮膚を切開する。開創部に丸先はさみを挿入し、皮膚を皮下組織と剥離することにより、ポケットを作製する。

(皮下への移植）

上記方法を用いて、ラット（W i s t a r系、 1 0週齢、ォス）の背部皮下に、直径 1〜2 c mの皮下ポケットを作製し、上記の複合材料を埋入する。その後、骨形成能を評価する。 (マイクロ C T)

常法に従い、摘出した試料を 1 0 %中性ホルマリン緩衝液で固定する。固定試料をマイクロ C Tにかけて得た C T画像を新生骨量測定ソフトで解析する。

(組織標本）

常法に従い、固定試料をパラフィン包埋し、薄切切片を作製する。作製した薄切切片を染色することで、骨形成を判定する。

さらに、以下の表 1 2に列挙した足場を用い、上記方法により複合材料を作製し、ラットの骨欠損部位および皮下に移植する。移植した部位について骨形成能を評価する。

(表 1 2)

足場として表 1 2に列挙した足場を用いた複合材料を用いて皮下および骨欠損部位に移植しマイク口 C Tおよび組織標本を用いて、骨形成を判定することができる。

(比較例 A：足場を単独で皮下および骨欠損部位に移植した場合の効果）実施例 1 7と同様の方法を用いて、表 1 2に列挙した足場を、それぞれ単独で同系動物もしくは免疫不全動物の皮下および骨欠損部位に移植し皮下に移植した場合、骨形成は観察されないかどうかを判定することができる。骨欠損部位に移植した場合、足場単独でも骨形成は生じるが、その量についても、実施例 1 7の方法を用いて、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子と足場との複合材料を移植したときに比べることができる。

(実施例 1 8 . 肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子による骨芽細胞の誘導）

(肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子の調製）本実施例では、実施例 1と同様の方法により、肥大化能を有する軟骨細胞を M EM分化因子産生培地で培養し、 4日から 3週間、経時的に集めた上清を遠心フィルターに入れ、 4 0 0 0 X g、 4 °Cにて 3 0分間遠心分離し、高分子分画と低分子分画を分離する条件下の遠心式限外濾過により、上清を分子量 5 0， 0 0 0 以上の画分と分子量 5 0， 0 0 0以下の画分に分離すると同時に、分子量 5 0， 0 0 0以上の画分を 1 0倍濃縮した。この濃縮した培地上清を、分化因子産生培地で 5倍に希釈した。この遠心分離には、 5 0 K膜（ミリポア社製、アミコンゥノレトラ 1 5、 5 0， 0 0 0 NMWL、カタログ番号 U F C 9 0 5 0 2 4 ) を用いた。

(骨髄由来未分化間葉系幹細胞の調製） 4週齢 Wi s t a r系雄性ラットをクロ口ホルムを使用して屠殺した。ラットの大腿部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（10倍希釈）に全身を浸し消毒した。大腿部を切開し、大腿骨を無菌的に摘出した後、両端を切除して骨幹部を採取した。注射針をつけた注射筒に MEM増殖培地（最小必須培地（MEM培地）および 15% FBS、 10 OU/m 1ペニシリン、 0. lmgZmlストレプトマイシン、および 0. 25 μ g/m 1アンホテリシン B) を 10〜15ml入れて、骨髄をフラッシュアウトした。この骨髄液を T— 75フラスコ（ベタトンディキンソン社）に播種し、最終培養液量を 3 Om 1とした。この骨髄液を 37 °Cで、 1週間培養した。培地として、 MEM分化因子産生培地を用いた。培養液は 2回 /週、半量を交換した。 1週間後に底面に接着した細胞を未分化間葉系細胞とした。この細胞を、 Du l b e c c o ' s Ph o s p h a t e Bu f f e r e d S a l i n e、インビトロゲン社、カタ口グ番号 14190 (D— PBS) で洗浄後、 0. 05 %トリプシン液（インビト口ゲン社）で剥離し、遠心（ 17 0 X g、 3分間）により回収洗浄して、使用した。

( I . 肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子の直接添加）

本実施例において調製した骨髄由来未分化間葉系幹細胞（1 X 1 0-⁵ m 1 /we l l) をゥエルに播種し、 MEM増殖培地（最小必須培地（MEM培地）および 15% FBS、 10 OUZm 1ペニシリン、 0. lmgZrnlストレプトマイシン、および 0. 25 μ g/m 1アンホテリシン B) でー晚（18時間）培養した。培養後、因子を含む MEM分化因子産生培地（最小必須培地（MEM 培地）および 15% FB S (ゥシ胎仔血清）、デキサメサゾン 10 ηΜ、 β— グリセ口ホスフェート 1 OmM、ァスコルビン酸 50 μ gZm 1、 10 OU/m 1ペニシリン、 o. 1 mg/m 1ストレプトマイシン、および 0. 25 μ g Zm 1アンホテリシン B) または因子を含まない分化因子産生培地（分化因子産生培地そのもの）を lm 1ゥエルに添カ卩し、さらに 72時間培養した。その後、骨芽細胞のマーカーであるアル力リホスファターゼ活性を測定した。アル力リホスファターゼ活性の測定は実施例 1と同様の方法を用いた。その結果を以下の表に示す。

(表 13 )

1 2 3 平 ¾ιΙ ί目 ill 因子（+ ) 0.208 0.226 0.299 0.244 2.17 因子（-） 0.120 0.111 0.107 0.113 1 因子（+ ) ：因子を含む MEM分化因子産生培地を添加した群

因子（一）：因子を含まない分化因子産生培地（分化因子産生培地そのもの）を添加した群肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子は、初代ラット骨髄由来未分化間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させることが確認された。

(I I. 肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子をヒドロキシァパタイトに含浸させた後に添加）

(ヒドロキシアパタイトの調製）

ヒドロキシアパタイトとして、ァパセラム AX (HOYA社製、人工骨 AB— 01、 GA— 3を用いた。ァパセラム AXが浸漬する量の希釈液（例えば、該ァパタイト顆粒 10粒に対して希釈液 lm 1) とァパセラム AXとを、注射筒に入れて引くことにより、脱気した。この際、約 0. 3m 1の希釈液がヒドロキシァパタイトに付着した。本実施例において調製した骨髄由来未分化間葉系幹細胞（1 X 10-⁵ m 1 /we 1 1) をゥヱルに播種し、 MEM増殖培地でー晚（18時間）培養した。次に、因子を含む MEM分化因子産生培地または因子を含まない分化因子産生培地（分化因子産生培地そのもの）を含浸させたァパセラム AXを、本実施例において培養した細胞の入ったゥエルに添加し、さらに 72時間培養した。その後、骨芽細胞のマーカーであるアル力リホスファターゼの活性を測定した。アル力リホスファターゼ活性の測定は実施例 1と同様の方法を用いた。その結果を以下の表に示す。

(表 14)

1 2 3 平均 i

因子（ + ) 0.169 0.153 0.1 1 0.171 2.15

因子（一） 0.085 0.077 0.077 0.080 1 因子（+ ) ：因子を含む分化因子産生培地を含浸させたァパセラム AXを添加した群

因子（一）：因子を含まない分化因子産生培地（分化因子産生培地そのもの）を含浸させたァパセラム AXを添加した群

肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子は、初代ラット骨髄由来未分化間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させることが確認された。

(実施例 1 9. 骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを用いる複合材料を骨欠損部位に移植した場合の効果）

(複合材料の作製）

実施例 1と同様の方法を用いて、 4週齢雄性ラット（Wi s t a r系）および

8週齢雄性ラット（Wi s t a r系）力ら肥大化能を有する細胞を得た。この肥大化能を有する軟骨細胞を、分化因子産生培地で培養し、その培養上清を得た。この培養上清を 50K膜（ミリポア社製、アミコンゥノレトラ 15、 50， 000 NMWL、カタログ番号 UFC 905024) を用いて、 4000 X g、 4でにて 30分間遠心分離し、分子量 50， 000以下の成分を除去すると共に分子量 50， 000以上の成分を 10倍濃縮した。

この濃縮液を凍結させ、遠心乾燥させ、電動式粉砕装置（クライオプレス CP — 100W、マイクロテックニチオン社）で粉砕した。この粉砕乾燥物 30mg を採取し、足場に複合化した。

0. 8mlコラーゲン液（セルマトリックス、コラーゲンゲル培養キット、新田ゼラチン社、大阪）、 0. 1m l再構成用緩衝液（260 mM NaHC〇3、

20 OmM HEPES、 50 mM Na OH) に対して、 30 m gの凍結乾燥物を混合し（最終約 lm l) 、 24穴培養プレート内のセルカルチャーインサート（PET膜、 0. 4 umポアサイズ、 F a 1 c o n、べクトンディキンス社、 Au c k l a n d, NZ) に 3分して入れ、固化させた。次いで、下部に MEM 増殖培地（インビトロジヱン社、 F r a n k l i n， N J) を満たした後、ー晚

37 °Cで保存した。

翌日、 1 2週齢の雄性ラット（Wi s t a r系）（日本医科学動物資材研究所、東京）に麻酔をし、無菌的に大腿骨の皮膚を切開し、軟部組織をそらせて、大腿骨の骨欠損作製部位を露出させた。このラットの大腿骨（遠位の外側上果に近い骨幹部）に、トレフィンバール（ミクロ精エネ土、東京）で、直径 3. 0もしくは 2. 5 mmの骨欠損を作製した。 '

(骨欠損部位への移植）

上記のようにして作製した骨欠損部位に、凍結乾燥物とコラーゲンゲルとの混合物を埋入した。反対側の大腿骨の外側上果に近い骨幹部には、同じサイズの骨欠損を作成し、コラーゲンゲルのみを（凍結乾燥物の代りに 0. 1m l MEM液を使用して、一晩 37 °Cで保存したものを）埋入した。

(マイクロ CT撮影）

マイクロ CT機器は、東陽テク二力社製 SKYSCAN1 1 72高分解能 X線マイクロ CTスキャナを使用した。 1001：で0. 4度ずつ回転させて各レントゲンを撮影し、添付ソフト NR e c o nにより再構成し、三次元ボリユームレンダリングソフト VGS t u d i o Ma x (日本ビジュアルサイエンス株式会社）により三次元画像を得た（図 41〜42) 。

(形態学的観察）

HE染色：薄切、脱パラした切片を、へマトキシリン液に 5— 10分浸漬、水洗、色出し後、ヱォジン液で 3— 5分浸漬。 (比較例）

反対側の大腿骨の外側上果に近い骨幹部には、同じサイズの骨欠損を作製し、コラーゲンゲルのみを（凍結乾燥物の代りに 0. 1m l MEM増殖培地を使用して、ー晚 37 °Cで保存したものを）埋入した。

実施例 1 9と同様の方法を使用して、マイクロ CTの測定および形態学的観察を行った。

(結果）

結果を以下の表 15に示す。骨欠損の直径 3. Ommおよび 2. 5mmのどちらにおいても、コラーゲンのみを移植した群と比べて、因子とコラーゲンゲルとを用いる複合材料を移植した群おいて新生骨の比率が高かった。 (表 15)

サンプノレ： 5回の試行を行った。サンプル 1〜 2は、直径 3. 0の骨欠損を作製した群であり、サンプル 3および 4は、直径 2. 5 mmの骨欠損を作製した群を示す。

N O . は各試行時のラットの番号を示す。試行 1〜試行 4は n = 3。

C o 1 ：同一ラットの左右の大腿骨に骨欠損を作製し、いずれか一方に C o 1 (コラーゲンのみを移植）した。

GC ：同一ラットの左右の大腿骨に骨欠損を作製し、いずれか一方に GC (因子とコラーゲンを移植）した。

R O I体積：解析した部分の体積。

(実施例 2 0 A. ラット骨髄由来未分化間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化誘導に対する因子の効果）

(ラット由来の肥大化能を有する軟骨細胞による因子の検出）

本実施例では、実施例 1と同様の方法を使用して、ラット肋骨 ·肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子を調製した。

(ラット骨髄由来未分化間葉系幹細胞の採取）

実施例 1 8と同様の方法を使用して、ラット大腿骨の骨髄より細胞を採取し、 1適間培養した。. 2 . 5 X 1 0—⁴個 m 1の上記細胞液、 1 m lを 2 4穴プレートに播種し、 MEM増殖培地で培養し、初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞を調製した。

(試料の添加およびアル力リホスファターゼ活性の測定）

上記初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞の ME M増殖培地での培養開始から 1 8 時間後に、下記試料液（各 l m l ) を初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞に添加した。さらに、 7 2時間培養し、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。

(添加した試料）

( 1 ) 肥大化能を有する軟骨細胞を分化因子産生培地で培養した上清；因子を含む分化因子産生培地 ( 2 ) MEM分化因子産生培地のみ；本発明による因子を含まないが、デキサメサゾンを含む培地； Maniatopoorusの骨芽細胞分化培地

( 3 ) MEM増殖培地のみ；因子もデキサメサゾンも含まない MEM増殖培地その結果を以下の表に示す。

誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加すると、初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞は、因子もデキサメサゾンも含まない MEM増殖培地を添加したものと比べて 2倍以上もアルカリホスファターゼ活性を上昇させた。他方、デキサメサゾンを含むが誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない分化因子産生培地のみを添加しても初代ラット骨髄細胞由来間葉系幹細胞はアル力リホスファターゼ活性を上昇させるが、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加したものとくらべるとわずかなものであった。図 8等の結果から、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清には従来型の低分子量の成分（デキサメサゾンを含む）は含まれていないと考えられ、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清の効果は、誘導骨芽細胞分化誘導因子自体の効果であると考えられることから、本実施例の結果から、誘導骨芽細胞分化誘導因子は、従来型骨芽細胞分化誘導成分であるデキサメサゾンょりも骨芽細胞への分化誘導能力が高いと考えられる。

(表 1 6 )

上清添加後 72hr(3日目）の ALP(Abs405)

添加した試料 1 2 3 平均値相対値上清添加 ( 1 ) 0.688 0.665 0.686 0.680 2.1 培地のみ (2) 0.426 0.420 0.490 0.445 1.4

(3) 0.324 0.270 0.364 0.321 1

(実施例 2 0 B ：肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した上清力ラット初代骨髄由来未分化間葉系幹細胞に与える影響）本比較例では、比較例 1 Aと同様の方法を用いて、ラット由来肥大化能を有する軟骨細胞を、 MEM増殖培地中で培養した培地の上清を回収した。

実施例 1 8と同様の方法を用いて、初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞を調製した。

(試料の添加およびアル力リホスファターゼ活性の測定）

上記初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞の MEM増殖培地での培養開始から 1 8 時間後に、下記試料液（各 l m l ) を初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞に添加した。さらに、 7 2時間培養し、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。

(添加した試料）

G C 分化：添加した試料液が、肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した上清

G CZ増殖：添加した試料液が、肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した上清

増殖：添加した試料液が、 MEM増殖培地

結果を以下の表に示す。

肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した上清には、初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞のアル力リホスファターゼ活性を上昇させる因子が存在するが、肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した上清には、初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させる因子は存在しないことが確認された。 (表 17)

細胞： rMSC (ラツト）

1 2 3 平均値相対値

GC/分化 0.688 0.665 0.686 0.680 2.120

GC/増殖 0.192 0.184 0.151 0.176 0.548

増殖のみ 0.324 0.274 0.364 0.321 1.000

HAM分化因子産生培地で培養したラット由来肥大化能を有する軟骨細胞が、ラット初代骨髄由来間葉系幹細胞に与える影響についても、本実施例と同様の方法を用いることにより、確認することができる。

(実施例 21 A. ヒト未分化間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化誘導に対する因子の効果）

(ヒト間葉系幹細胞の調製）

ヒト間葉系幹細胞株（hMSC : PT— 2501) を C amb r e x社から購入し、 1週間培養した。 2. 5 X 10— ⁴個 m 1の上記細胞液、 1mlを 24 穴プレートに播種し、 MSCGM培地（增殖培地）で培養した。

(試料の添加およびアル力リホスファターゼ活性の測定）

上記ヒト間葉系幹細胞の MS CGM培地（増殖培地）での培養開始から 18時間後に、下記試料液（各 lm l ) をヒト間葉系幹細胞に添加した。さらに、 72 時間培養し、実施例 1と同様の方法によりアル力リホスファターゼ活性を測定した。

(添加した試料）

( 1 ) 肥大化能を有する軟骨細胞を分化因子産生培地で培養した上清；因子を含む分化因子産生培地

( 2 ) ME M分化因子産生培地のみ；本発明による因子を含まないが、デキサメサゾンを含む培地； Maniatopoorusの骨芽細胞分化培地

( 3 ) ME M増殖培地のみ；因子もデキサメサゾンも含まない M E M増殖培地その結果を以下の表に示す。

誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加すると、ヒト葉系幹細胞は、因子もデキサメサゾンも含まない M E M増殖培地を添加したものと比べて 5倍以上もアルカリホスファターゼ活性を上昇させた。他方、デキサメサゾンを含むが誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない分化因子産生培地のみを添加してもヒト間葉系幹細胞はアルカリホスファターゼ活性を上昇させるが、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加したものとくらべるとわずかなものであった。図 8等の結果から、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清には従来型の低分子量の成分（デキサメサゾンを含む）は含まれていないと考えられ、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清の効果は、誘導骨芽細胞分化誘導因子自体の効果であると考えられることから、本実施例の結果から、誘導骨芽細胞分化誘導因子は、従来型骨芽細胞分化誘導成分であるデキサメサゾンょりも骨芽細胞への分化誘導能力が高いと考えられる。 (表 18)

上清添加後 72hr (3日目）の ALP (Abs405)

添加した試料 1 2 3 平均値相対値

(1) 0.83 0.73 0.84 0.80 5.2

(2) 0.20 0.35 0.26 0.27 1.8

(3) 0.13 0.14 0.18 0.15 1

(アル力リホスファターゼ染色）

上記ヒト間葉系幹細胞の MS CGM培地（増殖培地）での培養開始から 18時間後に、下記試料液（各 lm l) をヒト間葉系幹細胞に添カ卩した。さらに、 72 時間培養し、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ染色をした。

(添加した試料）

(2) MEM分化因子産生培地のみ；本発明による因子を含まないが、デキサメサゾンを含む培地； Maniatopoorusの骨芽細胞分化培地 -

(3) MEM増殖培地のみ；因子もデキサメサゾンも含まない MEM増殖培地その結果を図 39に示す。

誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加すると、ヒト間葉系幹細胞は、因子もデキサメサゾンも含まない ME M増殖培地を添加したものと比べてアルカリホスファターゼが強く発現した。他方、デキサメサゾンを含むが誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない分化因子産生培地のみを添加してもヒト間葉系幹細胞はァルカリホスファターゼを発現するが、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加したものとくらべるとわずかなものであった。図 8等の結果から、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清には従来型の低分子量の成分（デキサメサゾンを含む）は含まれていないと考えられ、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清の効果は、誘導骨芽細胞分化誘導因子自体の効果であると考えられることから、本実施例の結果から、誘導骨芽細胞分化誘導因子は、従来型骨芽細胞分化誘導成分であるデキサメサゾンょりも骨芽細胞への分化誘導能力が高いと考えられる。

(実施例 21 B ：肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した上清、ヒト未分化間葉系幹細胞に与える影響）

本比較例では、比較例 1 Aと同様の方法を用いて、ラット由来肥大化能を有する軟骨細胞を、 M E M増殖培地中で培養した培地の上清を回収した。

ヒト未分化間葉系幹細胞（hMSC : PT— 2501) を Camb r e x社から購入し、実施例 21 Aと同様の方法を用いて MS CGM培地（増殖培地）中で培養した。

(試料の添加おょぴアル力リホスファターゼ活性の測定）

上記ヒト間葉系幹細胞の MS CGM培地（増殖培地）での培養開始から 18時間後に、下記試料液（各 lm l ) をヒト間葉系幹細胞に添加した。さらに、 72 時間培養し、実施例 1と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。 (添加した試料）

GCZ分化：添加した試料液が、肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した上清

GC/増殖：添加した試料液が、肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した上清

増殖：添加した試料液が、 MEM増殖培地

結果を以下に示す。肥大化能を有する軟骨細胞を MEM分化因子産生培地で培養した上清には、ヒト間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させる因子が存在するが、肥大化能を有する軟骨細胞を MEM増殖培地で培養した上清には、ヒト間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させる因子は存在しないことが確認された。

(表 1 9 )

細胞： hMSC (ヒト)

1 2 3 平均値相対値

GC/分化 1.504 2.315 1.773 1.864 4.618

GC/増殖 0.560 0.395 0.523 0.493 1.220

増殖のみ 0.435 0.322 0.454 0.404 1.000

H AM分化因子産生培地で培養したラット由来肥大化能を有する軟骨細胞が、ヒト間葉系幹細胞に与える影響についても、本実施例と同様の方法を用いることにより、確認することができる。

(実施例 2 2 . ラット骨髄由来未分化細胞に対する誘導骨芽細胞分化誘導因子の影響）

(肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子の調製）実施例 1〜3 (ラット）、 4〜5 (ヒト）、 7 (ラット）、 9 (マウス）、 1 0 (ゥサギ）と同様の方法により誘導骨芽細胞分化誘導因子を調製する。

(ラット骨髄由来未分化細胞の調製）

ラット大腿骨を採取し、軟部組織を取り除いた後、両骨端部を切離する。培地を注射筒に取り、大腿骨の両端から骨髄内に注射針を通して、骨髄を培地で流し出す。培地は、 1 5 % F B Sを含む M E Mを用いる。得られた細胞混液をピペッティングした後、 T一 75フラスコに播種し（大腿骨 1本を T— 75フラスコ 1個）、 37°C、 C0₂インキュベーターで培養する。培地交換は週 3回、半量ずつ交換する。培養から 7〜10日後に、接着した細胞を 0. 05%トリプシン— EDTAではがす。

本実施例において調製した誘導骨芽細胞分化誘導因子を、ラット骨髄由来未分化細胞の培養物にそれぞれ添加し、さらに培養する。その後、実施例 1と同様の方法を用いて、誘導骨芽細胞分化誘導因子の、ラット骨髄由来未分化細胞を誘導骨芽細胞に誘導する能力について評価する。

従来法により骨髄由来未分化幹細胞から誘導させた骨芽細胞を用いた。具体的には、 Maniatopoulosら、 Cell Tissue Res, 254: 317-330, 1988に記載される方法に従ってラット大腿骨髄から未分化幹細胞を採取し、この未分化幹細胞を遠心分離（1 70〜200 X gで 3〜5分間）することによりペレツトにして、 3 7°C、 5% C0₂インキュベータ一中で 2週間、 Maniatopoulosによって提案された培地（本明細書において分ィヒ因子産生培地ともいう。）で培養したもの (B p) を用いた。

実施例 1と同様の方法を用いて、リアルタイム PCR反応を行い、リアノレタイム PCR機器（AB I社、 PR I SM 7900HT) にて各細胞マーカーの発現量の測定を行った。 PCR反応後、しきい値の設定および到達サイクルの算出を、機器（PR I SM 7900HT) 内蔵の解析ソフトにより実施した。各細胞マーカーの値を、 GAPDHの値で除して発現量の平均値を算出した。その結果、肥大化能を有さない軟骨細胞は I I型コラーゲンおよぴァダリカンを発現するが、アル力リホスファターゼおよびォステオカルシンはいずれも発現しなかつた（比較例 1 B、表 I I) 。

他方、従来法により骨髄由来未分化幹細胞から誘導させた骨芽細胞では、アルカリホスファターゼおよびォステオカルシンは発現するが、 I I型コラーゲンおよびァグリカンはいずれも発現しなかった（表 I I I) 。 (表 I I I )

アル tiUホスファターゼ

I型コラーゲン

ァク |J¾ン

才ステオ ftルシン

B p ：大腿骨髄から採取した未分化幹細胞のペレットを、骨芽細胞分化培地で培養したもの (比較例 2 2 A. 誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない上清がラット骨髄由来未分化細胞に与える影響）

誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清のかわりに、肥大化能を有する軟骨細胞を増殖培地で培養した上清（誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない上清）を培地に添加すること以外、実施例 2 2と同様の方法を用いる。ラット骨髄由来未分化細胞の培養物に添加し、さらに培養する。その後、実施例 1と同様の方法を用レ、て、肥大化能を有する軟骨細胞を増殖培地で培養した上清（誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない上清）がラット骨髄由来未分化細胞に与える影響について評価する。

(比較例 2 2 B . 誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない上清がラット骨髄由来未分化細胞に与える影響）

比較例 1 B (ラット）、 1 D (ラット）、 3 B (ラット）、 4 B (ヒト）、 5 B (ヒト）、 9 B (マウス）および 1 0 B (ゥサギ）により調製された肥大化能を有さない軟骨細胞を用いる。これらの細胞を分化因子産生培地で培養した上清 (誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない上清）を、ラット骨髄由来未分化細胞の培養物に添加し、さらに培養する。その後、実施例 1と同様の方法を用いて、肥大化能を有さない軟骨細胞を分化因子産生培地で培養した上清（誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない上清）がラット骨髄由来未分化細胞に与える影響について評価する。 (比較例 2 2 C . 分化因子産生培地および增殖培地がラット骨髄由来未分化細胞に与える影響）

誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加していない、分化因子産生培地のみおよび増殖培地のみを添カ卩した培地を用いて、ラット骨髄由来未分化細胞を培養する。その後、実施例 1と同様の方法を用いて、分化因子産生培地および増殖培地がラット骨髄由来未分化細胞に与える影響について評価する。以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。産業上の利用可能性

本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発することができる、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料ならびにその製造法およびその利用法が提供することにより、周辺に骨がない部位にまで骨形成を導くことができるようになった。このような複合材料は、従来技術では提供されるものではなく、初めて提供されるものである。

Claims

請求の範囲

1 . A) 肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、 3—グリセ口ホスフエ一ト、ァスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子、および

B ) 生体適合性を有する足場、

2 . 前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、（1 ) 前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地に存在するか、または（2 ) 該肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、分子量 5 0， 0 0 0の限外濾過に供することにより得られる分子量 5 0， 0 0 0以上の画分に存在する、請求項 1に記載の複合材料。

3 . 前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が濃縮または凍結乾燥されたものである、請求項 1に記載の複合材料。

4 . 前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、生体適合性を有する足場の表面および該生体適合性を有する足場の内部孔内からなる群より選択される領域に付着または分散している、請求項 1に記載の複合材料。

5 . 前記生体適合性を有する足場が、ゲル状足場および 3次元状足場からなる群より選択される、請求項 1に記載の複合材料。

6 . 前記生体適合性を有する足場が、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、アルギン酸、およびラミニンとコラーゲン I Vとェンタクチンとの混合物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される物質を含む、請求項 5に記載の複合材料。

7 . 前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、凍結乾燥した状態でコラーゲン溶液と混合され、かつ前記分化因子産生培地が、基礎成分として最小必須培地（M E M) を含む、請求項 1に記載の複合材料。

8 . 前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、ヒドロキシアパタイトに付着または分散されており、かつ前記分化因子産生培地が、基礎成分として最小必須培地（M E M) を含む、請求項 1に記載の複合材料。

9 . 前記骨形成が、骨の欠損を修復または治療するためのものである、請求項 1 に記載の複合材料。

1 0 . 前記欠損は、固定のみでは修復できない大きさを有する、請求項 9に記載の複合材料。

1 1 . 前記骨形成が、周辺に骨がない部位に骨を形成させるためのものである、請求項 1に記載の複合材料。

1 2 . 生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を製造するための方法であって、以下の工程：

A) 肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、 J3—グリセロホスフヱ一ト、ァスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子を提供する工程、および B) 該誘導骨芽細胞分化誘導因子と、生体適合性を有する足場とを合わせる工程、を包含する、方法。

13. 前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、（1) 前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地に存在するか、または（2) 該肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、分子量 50， 000の限外濾過に供することにより得られる分子量 50， 000以上の画分に存在する、請求項 12に記載の方法。

14. 前記 A) 工程が、前記肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、 β —グリセロホスフヱート、ァスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養し、該培養した上清を採取することを含む、請求項 12に記載の方法。

15. 前記 Α) 工程が、前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、限外濾過に供し、分子量 50， 000以上の画分に分離することを含む、請求項 12 に記載の方法。

16. 前記 Α) 工程の後に、前記上淸を濃縮または凍結乾燥する工程をさらに包含する、請求項 15に記載の方法。

17. 前記 Β) 工程が、

前記凍結乾燥した状態の上清とコラーゲン溶液とを合わせる工程を包含する、請求項 16に記載の方法。

1 8 . 前記 B ) 工程が、

前記濃縮した上清とヒドロキシァパタイトとを接触させる工程を包含する、請求項 1 6に記載の方法。

1 9 . 前記生体適合性を有する足場が、ゲル状足場および 3次元状足場からなる群より選択される、請求項 1 2に記載の方法。

2 0 . 前記生体適合性を有する足場が、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、ァルギン酸、およびラミニンとコラーゲン I Vとェンタクチンとの混合物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される物質を含む、請求項 1 9に記載の方法。

2 1 . 生体内の骨形成を促進または誘発するための方法であって、該方法は、誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを含む複合材料を、生体内の骨形成を促進または誘発する必要のある部位に移植する工程を包含する、方法。

2 2 . 前記骨形成が、骨の欠損を修復または治療するためのものである、請求項 2 1に記載の方法。

2 3 . 前記欠損は、固定のみでは修復できない大きさを有する、請求項 2 2に記載の方法。

2 4 . 前記骨形成が、周辺に骨がない部位に骨を形成させるためのものである、請求項 2 1に記載の方法。

2 5 . A) 肥大化能を有する軟骨細胞、および B) アルギン酸

26. A) 肥大化能を有する軟骨細胞、および

B) ラミニンとコラーゲン I Vとェンタクチンとの混合物を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料。