EP2125052A2 - Therapeutische zusammensetzung und verwendung einer zellfreien substanz - Google Patents

Therapeutische zusammensetzung und verwendung einer zellfreien substanz

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Publication number
EP2125052A2
EP2125052A2 EP08706849A EP08706849A EP2125052A2 EP 2125052 A2 EP2125052 A2 EP 2125052A2 EP 08706849 A EP08706849 A EP 08706849A EP 08706849 A EP08706849 A EP 08706849A EP 2125052 A2 EP2125052 A2 EP 2125052A2
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
cell
cells
therapeutic composition
bone
free
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08706849A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Thie
ÖZER Degistirici
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Stiftung Caesar Center of Advanced European Studies and Research
Original Assignee
Stiftung Caesar Center of Advanced European Studies and Research
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Filing date
Publication date
Application filed by Stiftung Caesar Center of Advanced European Studies and Research filed Critical Stiftung Caesar Center of Advanced European Studies and Research
Publication of EP2125052A2 publication Critical patent/EP2125052A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3612—Cartilage, synovial fluid
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
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    • A61L27/3608—Bone, e.g. demineralised bone matrix [DBM], bone powder
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Definitions

  • the invention relates to a therapeutic composition, a method for producing a therapeutic composition and the use of a cell-free substance, in particular a cell-free bone or cartilage matrix.
  • stem cells From stem cells, additional stem cells can be created by division and / or differentiated cells emerge, ie stem cells are able to divide asymmetrically.
  • a stem cell retains its ability to divide over a very long period, often even throughout the life of the organism. Triggered by specific signals during the development of the organism, a stem cell can differentiate into different cell types, which then form the organism. A distinction is generally made between embryonic and adult stem cells.
  • Embryonic stem cells obtained from an embryo up to the 8-cell stage are termed totipotent. From these cells develops the complete organism (human). Embryonic stem cells from later stages of blastocysts are said to be pluripotent, since they can generally be used to differentiate all types of endoderm body cells (wall cells of the digestive tract), mesoderms (muscles, bones, blood cells), and ectoderms (skin cells and nerve tissue). but no complete organism anymore. However, for ethical reasons and because of problems with the molecular control of cell differentiation, ES cells have not yet been therapeutically applicable.
  • a cells are undifferentiated cells that are located in a differentiated tissue and that produce specialized cells that correspond to those of the differentiated tissue.
  • ES cells can also differentiate into cell types that are associated with another tissue.
  • Adult stem cells that are found in organs, in the bone marrow or even in the umbilical cord can no longer differentiate as freely as embryonic stem cells.
  • adult stem cells do not have the same potential for differentiation as embryonic stem cells, they nevertheless have potential for ciliary leaf differentiation. One calls it therefore as multipotent.
  • mesenchymal stem cells derived from the mesoderm may also differentiate into neuronal cells that otherwise develop from the ectoderm.
  • AS cells are able to differentiate into a cell type that does not correspond to that of their parent tissue after relocation to another tissue type.
  • Adult stem cells are available in every organ, for example in the bone marrow. However, the removal of bone marrow is a complicated and risky surgical technique.
  • the production of stem cells from tooth tissue is a less expensive alternative, as described for AS cells from dental follicles in WO 03/066840 A2.
  • Such stem cells from readily available tissue, for example, open the perspective of tissue replacement by the body's own cells.
  • the tendency for malignant degeneration in implantation of adult stem cells seems to be smaller than in embryonic stem cells.
  • Adult stem cells are therefore of increasing importance for the development of innovative therapeutic approaches.
  • EP 0 957 944 B1 discloses a method for producing a bone matrix populated with osteogenic cells which, after implantation in vivo, is intended to stimulate new bone formation by inducing differentiation processes in the cells of the surrounding tissue.
  • first osteogenic progenitor cells from explants of somatic cells of the skin, cartilage, bone or the dental apparatus, in particular human stem cells from the iliac crest, isolated.
  • the isolated cells are stimulated in vitro by the addition of growth factors, such as Bone Morpho-genetic Proteins (BMPs), thereby stimulating the synthesis of bone matrix.
  • BMPs Bone Morpho-genetic Proteins
  • the bone matrix can then be separated from the cells by enzymatic treatment or freezing and subsequent washing to form a cell-free bone matrix.
  • This cell-free bone matrix is then repopulated with fresh osteogenic cells, creating an autologous cell-loaded bone substitute.
  • osteogenic cells and bone matrix are prepared separately and then brought together again to produce a bone substitute material.
  • the use of a cellular bone substitute has the disadvantage that this due to the antigenic properties of the living cells can lead to immunogenic rejection reactions, if the cells are not derived from the person to be treated. Such a cell-loaded bone matrix is therefore not universally applicable in therapy.
  • a therapeutic composition which consists of at least one cell-free substance, which has emerged from stimulated stem and / or progenitor cells. Because the therapeutic composition is cell-free and does not contain any typically antigenic cell components, immunogenic reactions do not occur in vivo in the therapeutic application. Independently of the origin of the parent and / or precursor cells, the composition according to the invention can therefore be used universally for therapy and use its natural regenerative potency for tissue replacement, for example a suitable bone and / or cartilage assembly, in a highly efficient manner.
  • the therapeutic composition of the invention can stimulate the regeneration of destroyed tissue in vitro and in vivo, although it itself no longer contains stem cells.
  • the substances contained in the stimulated stem and / or progenitor cells or produced by these cells are sufficient to enable or at least support effective tissue replacement therapy.
  • the composition of the invention contains no antigenic cell components and can thus be used in all patients without the risk of immunogenic reactions. This allows industrial production of the preparation and thus ensures constant availability.
  • the cell-free substance is a cell culture in which the living cells are killed and / or cell components are at least partially removed.
  • all antigenic components such as cell surface antigens or other proteins, must be effectively removed.
  • Nucleic acids should also be removed or at least completely degraded to eliminate any risk of introducing genetic material.
  • the cell-free substance comprises cell extract and / or cell secretions, d. H. antigen-free cell components, cell contents and / or substances produced by the stimulated cells.
  • the cell-free substance is a developing bone matrix.
  • the formation of this matrix takes place on the basis of ectomesenchymal progenitor cells and is similar in its essence to that of embryonic bone formation, so that the composition according to the invention can be used or used with regard to growth-promoting modulators in bone replacement therapy (catalyst in bone formation).
  • the cell-free bone matrix allows a targeted stimulation of bone formation in vivo, without the possibility of immunogenic reactions.
  • patients who due to deficiencies in bone structure, or only with difficulty with implants, eg. As dental implants can be prepared by introducing the therapeutic composition into the defective tissue in a simple manner and without risk.
  • the cell-free substance can also be cartilage matrix, so that defective cartilage tissue can also be regenerated by means of the composition according to the invention.
  • the therapeutic composition can also be used to treat injuries or degenerative diseases in joints.
  • stem and / or progenitor cells that form the cell-free substance in an advantageous embodiment of the invention multipotent cells from a
  • stem cells of follicle or pulp may be used.
  • stem cells from a cushion-like soft tissue which is located directly on the apical side of a extracted immature tooth below the papilla is localized.
  • the cushion-like soft tissue is advantageously a cell composite consisting of a plant of an impacted and / or retained tooth in the developmental phase between the occurrence of the bony alveolar fundus and the completion of the rooting.
  • the cushion-like soft tissue should be separated from the tooth .
  • the tissue selected in this way makes it possible to isolate ectomesenchymal stem or progenitor cells which, because of their multipotency, can be differentiated into different cell types, for example bone or cartilage cells.
  • the choice of the correct tissue of origin for the isolation of the stem cells by the method according to the invention is an essential factor for a high yield of multipotent stem cells.
  • the isolated cells are ektomesenchymale stem and / or progenitor cells, which can be stimulated osteogenically and / or chondrogenically after isolation from the tissue composite.
  • the cell-free substance has a defined ratio of calcium to phosphate.
  • a defined Calcuim / Phopshat ratio for example, bone matrix can be produced, which corresponds to a young bone or an old bone.
  • the cell-free substance according to the invention can thus be tailored specifically for the desired application.
  • the calcium / phosphate ratio provides evidence of the age of the bone (Dorozhkin, SV, Epple, M. 2002).
  • a therapeutic composition comprising a cell-free substance having a defined calcium / phosphate ratio, preferably a calcium / phosphate ratio of between 0.5 and 2.0 so as to provide a curative optimized for the desired therapy, which has defined properties.
  • the cell-free substance can also be a defined The ratio of calcium phosphate to collagen, so that the quality of the therapeutic composition can be precisely adjusted.
  • the object is further achieved according to the invention by a process for preparing a therapeutic composition in which stem and / or progenitor cells are isolated, cultured in vitro and stimulated for subsequent differentiation, wherein the cells are killed after differentiation to produce a cell-free substance and / or at least partially removed, and wherein the cell-free substance is prepared for therapeutic use.
  • a cell-free substance which has emerged or was produced from stimulated stem and / or progenitor cells, is directly brought into a therapeutic application form, without colonizing them again with stem cells.
  • the therapeutic composition prepared according to the method of the invention can stimulate the regeneration of destroyed tissue in vitro and in vivo, although it is not populated with fresh stem cells. It appears that the substances contained in the stimulated stem and / or progenitor cells or produced by these cells are sufficient to enable or at least support effective tissue replacement therapy. The production process is thereby considerably simplified and moreover cost-effective, since parallel to the production of the cell-free substance no stem or progenitor cells have to be cultivated any more.
  • the cell-free substance is preferably comminuted, pulverized and / or freeze-dried, so that an easily handled and processed product is formed.
  • the cell-free substance can then be prepared according to the invention, for example in the form of a paste, ointment or suspension.
  • the cell-free substance or the therapeutic composition can be easily introduced into the tissue to be treated. This gentle type of application is derem advantage, as this additional, the patents incriminating interventions can be avoided.
  • the stem and / or progenitor cells osteogenically and / or chondrogenically.
  • the stem and / or progenitor cells can be stimulated in such a way that they form or produce a bone or cartilage matrix.
  • This matrix and any other substance which is produced in vitro without additional aids such as, for example, carrier materials can then be freed by enzymatic, chemical or mechanical treatment of living cells and / or antigenic cell constituents and subsequently used to prepare the composition according to the invention.
  • Living cells should at least be killed and / or antigenic cell components should be removed as completely as possible. Nucleic acids should also be removed or at least completely degraded to eliminate any risk of introducing genetic material.
  • the intact or minced bone mass is treated with a hypotonic solution (eg, deionized water) and / or treated in liquid nitrogen for ice nucleation to destroy the cell membranes and lyse the cells.
  • a hypotonic solution eg, deionized water
  • the samples are washed out with shaking in saline solution (eg 3M NaCl) and / or acid / base (eg 0.15-1% per acidic acid PAA), and / or extracted in Triton-X100 (0.1% -1%) and / or SDS (0.1% -1%) for different times.
  • saline solution eg 3M NaCl
  • acid / base eg 0.15-1% per acidic acid PAA
  • Triton-X100 0.1% -1%)
  • SDS 0.1% -1%)
  • RNA and DNA released nucleic acids
  • the bone matrix is treated with RNAse and DNAse.
  • the cell-free bone matrix substance is washed with buffer solution (eg PBS), dialyzed and lyophilized, pulverized and prepared in the form of a paste, ointment or suspension.
  • buffer solution eg PBS
  • the duration of the stimulation for adjusting certain properties of the cell-free substance can be varied.
  • a defined ratio of calcium to phosphate and / or of calcium phosphate to collagen can be set, for example, by the choice of a specific stimulation duration.
  • the duration of stimulation ie the duration of the cultivation of the stem cells in the presence of the stimulating substances, is according to the invention between 15 and 50 days, preferably between 20 and 45 days, particularly preferably between 21 and 42 days.
  • the degree of maturation and the quality of the cell-free substance can be influenced and thus set in a defined manner.
  • the shorter the stimulation time the lower the degree of maturity or mineralization (small calcium / phosphate ratio) of the generated bone matrix or cell-free substance.
  • the longer the stimulation time the higher the degree of maturity or mineralization (large calcium / phosphate ratio) of the generated bone matrix or cell-free substance.
  • the method according to the invention thus makes it possible in a particularly advantageous manner to selectively adjust the properties of the process product by selecting a specific stimulation duration.
  • the stem cells are isolated from a soft tissue of a tooth, such as, for example, follicles or pulp.
  • the stem cells are isolated from a pillow-like soft tissue that is directly localizable on the apical side of an extracted immature tooth underneath the papilla.
  • the cushion-like soft tissue results from an implantation of an impacted and / or retained tooth in the development phase between the occurrence of the bony alveolar fundus and the Conclusion of rooting is won.
  • the cushion-like soft tissue In order to be able to isolate the desired multipotent stem cells, after the surgical removal of the tooth, the cushion-like soft tissue should be located along a macroscopically visible boundary between the tooth pincushion soft tissue and the papilla, preferably below an imaginary line between the developing root processes, are separated from the tooth.
  • the tissue selected in this way allows the isolation of ectomesenchymal stem or precursor cells, which can be differentiated into different cell types, for example bone or cartilage cells, because of their multipotency.
  • the choice of the correct tissue of origin for the isolation of the stem cells by the method according to the invention is an essential factor for a high yield of multipotent stem cells.
  • the tissue composite can be dissolved for further cultivation of the cells by enzymatic treatment, preferably with collagenase / dispase.
  • the cells can also be separated after the extraction from the tissue composite.
  • the cells isolated by the method according to the invention are ectomesenchymal stem and / or progenitor cells, which can be stimulated osteogenically and / or chondrogenically in vitro after isolation from the tissue composite.
  • Each therapeutic composition prepared by the method according to the invention is also an object of the invention.
  • the cell-free substance described above can, as already explained, be used for therapeutic purposes in the context of a tissue replacement therapy.
  • the invention further encompasses the use of a cell-free cell extract and / or cell secretion for therapeutic purposes in tissue replacement therapy and the use of a cell-free bone or cartilage matrix for therapeutic purposes in tissue replacement therapy.
  • FIG. 1 (a) is a photograph of an extracted wisdom tooth with apical soft tissue (apical pillow) and (b) a micrograph of cells isolated from the apical pillow;
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of bone formations after 28 days of incubation of the isolated cells after glutaraldehyde fixation (coated with gold), (a) control, (b) external view and (c) sectional view,
  • Figure 1 shows a surgically removed wisdom tooth with apical pad (a).
  • the apical pad is separated from the tooth along the macroscopically visible boundary between the soft tissue of the pillow and the papilla below the imaginary line between the tooth roots, washed several times with PBS (sterile), and then minced with a scalpel.
  • the tissue thus obtained is disrupted with collagenase / dispase.
  • the cultures are cultured at 37 ° C. in DMEM LG 10% FCS.
  • the isolated cells grow as fibroblastoid cells in cultures (b).
  • FIG. 2 shows scanning electron micrographs of bone formations after 28 days of incubation of the isolated cells.
  • the cells are cultured in control medium (a) and in osteogenic stimulating medium (b).
  • the cells cultured in osteogenic stimulating medium form a bone-like formation (b) that organizes bone-like organized from the inside is (c) while the cells treated with control medium alone do not form bone formation and grow as an adherent dressing (a).
  • FIG. 3 shows microscopic images of osteogenic stimulated cultures.
  • the osteogenically stimulated cultures are stopped after 42 days and fixed with 4% PFA. Subsequently, the formed bone formations are embedded in paraffin and then cut.
  • the sections are immunohistochemically stained with a first antibody against osteocalcin or collagen type I (both are bone markers). The bound antibodies are detected with the DAB kit according to the manufacturer's instructions (R & D). To detect calcification, sections are stained with alizarin red (1.2% alizarin red to pH4.2). The strongly red colored areas are calcified or bone-like areas.
  • Dental stem cells have a specific pattern of active substances that control the structure of different types of tissue.
  • a specially isolated subpopulation of human dental stem cells in a cell biological process is stimulated to develop a tissue similar to the young bone.
  • the resulting highly specific matrix is then processed into a non-cellular product that significantly accelerates the bone formation and thus the course of the healing phase and the ingrowth behavior of implants.
  • the special property of this matrix is used to stimulate the complex bone structure physiologically correct in a wound due to their composition.
  • stem / progenitor cells are osteogenically stimulated under suitable conditions to give rise to a bone-like tissue bandage.
  • the osteogenic stimulation can be carried out, for example, by incubation or cultivation of the stem cells with 10 -7 M dexamethasone, 50 ⁇ g / ml ascorbic acid 2-phosphate and 10 mM ⁇ -glycerol phosphate. make bones comparable.
  • the matrix is processed and processed into a product. The entire process is purely biological and does not require any scaffold.
  • the starting material is a differentiated bone tissue, which can only be formed from young dental stem cells, the so-called dNC-PCs, which are osteogenically stimulated, in a self-generating culture system.
  • the culture system is particularly advantageous because the three-dimensional bone tissue together with its specifically formed intercellular substances is organized exclusively by dNC PCs themselves and in its structure and function is subject exclusively to its own formative and ordering principles.
  • the bone tissue is thus developing, immature bone tissue, which is of special construction in its structure and strength, its degree of mineralization and its composition of basic substance components.
  • This bone tissue is processed into a non-cellular product (basic bone substance), which accelerates the bone formation and thus the course of the healing phase and the ingrowth of implants (scaffolds) in the patient.
  • This bone tissue can be harvested at different levels of ripeness, following phases of matrix and mineralization, and processed in ripeness-dependent processes.
  • the maturity levels are determined by the differentiation states of the dNC PCs or the structuring and composition of the matrix
  • the removal of the cells and the production of a cell-free substance is carried out by physical, chemical and biological methods.
  • a hypotonic solution eg deionized water
  • the intact or crushed bone mass is treated with a hypotonic solution (eg deionized water) and / or treated in liquid nitrogen for ice crystal formation.
  • the samples are washed out with shaking in saline solution (eg 3M NaCl) and / or acid / base (eg 0.15-1% per acetic acid PAA), and / or Triton X100 (0.1% -1%) and / or SDS (0.1% -1%) extracted for different times.
  • the cell-free substance is thus based in principle on the synthesis performance of a neural crest cell.
  • We isolate these cells from the cells of a cushion-like soft tissue, which is located immediately on the apical side of an extracted immature tooth below the papilla (where they have settled in their niche) and describe their properties as multipotent dNC PCs ( dental neural crest-derived progenitor cells).
  • dNC PCs dental neural crest-derived progenitor cells.
  • This aggregate which is completely self-contained, basically consists of a "core” and a "shell".
  • the nucleus is formed by inner cells, the shell by outer cells.
  • Both cell types can be distinguished phenotypically, but are initially derived from dNC PCs as a common precursor.
  • the core of the aggregate consists of vital cells, all of which are related to each other and belong to the family of osteoblasts and osteoblast helper cells.
  • the shell of the aggregate consists of vital cells.
  • the inner cells begin to separate an embryonic matrix with increasing culture duration, which is initially not mineralized. Only at long culture times, there is a successive storage of mineral (variants of Ca phosphates up to the hydroxylappatite) and thus the formation of hard substance.
  • the process of mineralization occurs only inside the aggregate and is likely bound to the presence of the shell. Mineralization is an active process, ie it is dependent from the inner cells and the specific milieu of the nucleus.
  • the interior of the aggregate is the starting product for the cell-free substance according to the invention, which can be harvested at different degrees of ripeness. For harvest, the aggregate is broken up.
  • the outer cells are removed by enzyme treatment or Immunosurgery. What remains is the core of the unit, which is not used directly but is still being processed.
  • the cells are isolated with enzyme and detergent. What remains can be separated into an organic and an inorganic phase. Each phase can be further modified - the organic with enzyme, the inorganic with acid and / or base. Depending on the degree of maturity of the unit and depending on the process of preparation results in each case a different product.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine therapeutische Zusammensetzung, ein Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung sowie die Verwendung einer zellfreien Substanz, insbesondere einer zellfreien Knochen- oder Knorpelmatrix. Die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung besteht zumindest aus einer zellfreien Substanz, welche aus stimulierten Stamm- und/oder Vorläuferzellen hervorgegangen ist. Dadurch, dass die therapeutische Zusammensetzung frei von Zellen ist und keine typischerweise antigenen Zellbestandteile enthält, kommt es bei der therapeutischen Anwendung in vivo nicht zu immunogenen Reaktionen. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann also unabhängig von der Herkunft der Stamm- und/oder Vorläuferzellen universell zur Therapie eingesetzt werden und ihre natürliche regenerative Potenz für den Gewebeersatz, beispielsweise einen geeigneten Knochen- und/oder Knorpelaufbau hocheffizient nutzen.

Description

Therapeutische Zusammensetzung und Verwendung einer zellfreien Substanz
Erfindungsgebiet
Die Erfindung betrifft eine therapeutische Zusammensetzung, ein Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung sowie die Verwendung einer zellfreien Substanz, insbesondere einer zellfreien Knochen- oder Knorpelmatrix.
Hintergrund der Erfindung
Die Rekonstitution größerer knöcherner Defekte und kleinerer Defekte in der Kieferchirurgie/Orthopädie ist noch immer ein gravierendes therapeutisches Problem. Das Einbringen von künstlich hergestellten Ersatzmaterialien (Biomaterialien) in die knöcherne Defektzone führte in der Vergangenheit nur zu unbefriedigenden Ergebnissen. So sind größere, mit Hydroxylapatit (HA) aufgefüllte ossäre Bereiche biochemisch instabil und bergen das Risiko einer Fraktur. Wei- tere unerwünschte Wirkungen von implantierten Biomaterialien sind eine chronisch aseptische Entzündungsreaktion und ein erhöhtes lokales Infektionsrisiko durch Störung der körpereigenen Immunitätslage (Vacanti et ai, 1998).
Aufgrund mangelnder Alternativen (wie z.B. der alleinige Einsatz von Biomate- rialien mit niedriger biologischer Wertigkeit) sind autologe Knochen- und Knochenmarktransplantate (Spongiosa) noch immer Standard (Gerngross et ai, 1982; Jerosch & Plewka, 1992; Rueger, 1998). Dieses Verfahren erfordert jedoch einen zweiten Eingriff und führt bei ca. 55% aller Operationen zu dauerhaften Beschwerden. Die deutlich längeren Heilungszeiten dieser Therapie füh- ren zu einer zusätzlichen Belastung des Gesundheitswesens. Ferner steht au- tologer Knochensubstanz nur sehr begrenzt zur Verfügung (Wippermann et ai, 1997). Als Stammzellen bezeichnet man Körperzellen, die nicht differenziert sind, d. h. Stammzellen sind noch nicht für eine Aufgabe im Organismus spezialisiert, beispielsweise als Haut- oder Leberzelle. Aus Stammzellen können durch Teilung weitere Stammzellen entstehen und/oder ausdifferenzierte Zellen hervorgehen, d. h. Stammzellen sind in der Lage sich asymmetrisch zu teilen. Eine Stammzelle behält ihre Teilungsfähigkeit dabei über einen sehr langen Zeitraum, oft sogar während des gesamten Lebens des Organismus. Ausgelöst durch spezifische Signale während der Entwicklung des Organismus kann eine Stammzelle in unterschiedliche Zelltypen differenzieren, die dann den Organismus bilden. Man unterscheidet im Allgemeinen zwischen embryonalen und adulten Stammzellen.
Embryonale Stammzellen (ES - Zellen), die aus einem Embryo bis zum 8-ZeII- Stadium gewonnen werden, werden als totipotent bezeichnet. Aus diesen ZeI- len entwickelt sich der vollständige Organismus (Mensch). Embryonale Stammzellen aus späteren Blastozysten-Stadien bezeichnet man als pluripotent, da sich aus ihnen in der Regel noch sämtliche Arten von Körperzellen des Endoderms (Wandzellen des Verdauungstraktes), Mesoderms (Muskeln, Knochen, Blutzellen) und Ektoderms (Hautzellen und Nervengewebe) differenzieren kön- nen, aber kein vollständiger Organismus mehr. Aus ethischen Gründen und aufgrund von Problemen mit der molekularen Kontrolle der Zelldifferenzierung sind ES - Zellen aber bisher therapeutisch nicht anwendbar.
Adulte Stammzellen (AS - Zellen) dagegen entstehen nach dem embryonalen Stadium, sind also undifferenzierte Zellen, die in einem differenzierten Gewebe angesiedelt sind und aus denen spezialisierte Zellen hervorgehen, die denen des differenzierten Gewebes entsprechen. ES - Zellen können aber auch in Zelltypen differenzieren, die einem anderen Gewebe zuzuordnen sind. Adulte Stammzellen, die in Organen, im Knochenmark oder auch in der Nabelschnur zu finden sind, können sich aber nicht mehr so frei differenzieren wie embryonale Stammzellen. Obwohl adulte Stammzellen nicht das gleiche Differenzierungspotential wie embryonale Stammzellen besitzen, haben sie dennoch keimblattüberschreitendes Differenzierungspotential. Man bezeichnet sie daher als multipotent. So können sich zum Beispiel mesenchymale Stammzellen, die aus dem Mesoderm stammen, auch zu neuronalen Zellen differenzieren, welche sich sonst aus dem Ektoderm entwickeln. AS - Zellen sind also in der Lage, nach Übersiedlung in einen anderen Gewebetyp in einen Zelltyp zu differenzie- ren, der nicht dem ihres Stammgewebes entspricht. Adulte Stammzellen sind in jedem Organ verfügbar, beispielsweise im Knochenmark. Die Entnahme von Knochenmark ist aber eine komplizierte und riskante Operationstechnik. Die Gewinnung von Stammzellen aus Zahngewebe ist im Gegensatz hierzu eine weniger aufwendige Alternative, wie für AS - Zellen aus Zahnfollikel in der WO 03/066840 A2 beschrieben. Solche Stammzellen aus leicht zugänglichem Gewebe eröffnen beispielsweise die Perspektive des Gewebeersatzes durch körpereigene Zellen. Auch scheint die Neigung zur malignen Entartung bei Implantation adulter Stammzellen kleiner zu sein als bei embryonalen Stammzellen. Adulte Stammzellen sind also für die Entwicklung innovativer therapeutischer Ansätze von steigender Bedeutung.
Aus der EP 0 957 944 B1 ist ein Verfahren zur Herstellung einer mit osteogenen Zellen besiedelten Knochenmatrix bekannt, die nach Implantation in vivo die Knochenneubildung durch Induktion von Differenzierungsvorgängen in den Zellen des umgebenden Gewebes stimulieren soll. Zu diesem Zweck werden zunächst osteogene Vorläuferzellen aus Explantaten somatischer Zellen der Haut, des Knorpels, des Knochens oder des Zahnapparates, insbesondere humane Stammzellen aus dem Beckenkamm, isoliert. Die isolierten Zellen werden in vitro durch Zugabe von Wachstumsfaktoren, beispielsweise Bone Morphoge- netic Proteins (BMPs), stimuliert und dadurch zur Synthese von Knochenmatrix angeregt. Die Knochenmatrix kann dann durch enzymatische Behandlung oder Einfrieren und anschließendes Waschen von den Zellen getrennt werden, so dass eine zellfreie Knochenmatrix entsteht. Diese zellfreie Knochenmatrix wird dann wieder mit frischen osteogenen Zellen neu besiedelt, wodurch ein autolo- ger, zellbeladener Knochenersatz entsteht. Bei diesem Verfahren werden also osteogene Zellen und Knochenmatrix getrennt hergestellt und anschließend zur Herstellung eines Knochenersatzmaterials wieder zusammengebracht. Der Einsatz eines zellhaltigen Knochenersatzes hat aber den Nachteil, dass dieser aufgrund der antigenen Eigenschaften der lebenden Zellen zu immunogenen Abstoßungsreaktionen führen kann, wenn die Zellen nicht von der zu behandelnden Person selbst stammen. Eine solche zellbeladene Knochenmatrix ist folglich in der Therapie nicht universell einsetzbar.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine therapeutische Zusammensetzung zur hocheffizienten Vorbereitung von Patienten, die aufgrund von Defiziten im Gewebeaufbau nicht oder nur unter Schwierigkeiten mit Implantaten versorgt wer- den können, zu schaffen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine therapeutische Zusammensetzung gelöst, die zumindest aus einer zellfreien Substanz besteht, welche aus stimulierten Stamm- und/oder Vorläuferzellen hervorgegangen ist. Dadurch, dass die therapeutische Zusammensetzung frei von Zellen ist und keine typischerweise antigenen Zellbestandteile enthält, kommt es bei der therapeutischen Anwendung in vivo nicht zu immunogenen Reaktionen. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann also unabhängig von der Herkunft der Stamm- und/oder Vorläuferzellen universell zur Therapie eingesetzt werden und ihre natürliche regenerative Potenz für den Gewebeersatz, beispielsweise einen geeigneten Knochen- und/oder Knorpelaufbau hocheffizient nutzen. Die erfin- dungsgemäße therapeutische Zusammensetzung kann die Neubildung von zerstörtem Gewebe in vitro und in vivo stimulieren, obwohl sie selbst keine Stammzellen mehr enthält. Offenbar sind die in den stimulierten Stamm- und/oder Vorläuferzellen enthaltenen oder durch diese Zellen produzierten Stoffe ausreichend, um eine effektive Gewebeersatztherapie zu ermöglichen oder zumindest zu unterstützen. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält dabei keine antigenen Zellbestandteile und kann somit bei allen Patienten ohne das Risiko immunogener Reaktionen angewandt werden. Dies ermöglicht eine industrielle Produktion des Präparats und sichert somit ständige Verfügbarkeit.
In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die zellfreie Substanz eine Zellkultur ist, in der die lebenden Zellen abgetötet und/oder Zell- bestandteile zumindest teilweise entfernt sind. Dabei müssen alle antigenen Bestandteile, beispielsweise Antigene der Zelloberfläche oder andere Proteine, effektiv entfernt werden. Nukleinsäuren sollten ebenfalls entfernt oder zumindest vollständig degradiert werden, um etwaige Risiken durch das Einbringen von genetischem Material auszuschließen.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfasst die zellfreie Substanz Zellextrakt und/oder Zellsekret, d. h. antigenfreie Zellbestandteile, Zellin- haltsstoffe und/oder Stoffe, die durch die stimulierten Zellen produziert wurden.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist die zellfreie Substanz sich entwickelnde Knochenmatrix. Die Bildung dieser Matrix erfolgt auf der Basis ektomesenchymaler Vorläuferzellen und kommt in ihrem Wesen der der embryonalen Knochenbildung nahe, so dass die erfindungsgemäße Zusam- mensetzung hinsichtlich der wachstumsfördernden Modulatoren in einer Knochenersatztherapie eingesetzt bzw. verwendet werden kann (Katalysator beim Knochenaufbau). Die zellfreie Knochenmatrix ermöglicht dabei eine gezielte Stimulation des Knochenaufbaus in vivo, ohne dass mit immunogenen Reaktionen zu rechnen ist. So können beispielsweise Patienten, die aufgrund von Defi- ziten im Knochenaufbau nicht oder nur unter Schwierigkeiten mit Implantaten, z. B. Zahnimplantaten, versorgt werden können, durch Einbringen der therapeutischen Zusammensetzung in das defekte Gewebe auf einfache Weise und ohne Risiko vorbereitet werden. Zusätzlich oder alternativ kann die zellfreie Substanz auch Knorpelmatrix sein, so dass mittels der erfindungsgemäßen Zusammen- setzung auch defektes Knorpelgewebe regeneriert werden kann. Die therapeutische Zusammensetzung kann also auch zur Behandlung von Verletzungen oder degenerativen Erkrankungen in Gelenken verwendet werden.
Die Stamm- und/oder Vorläuferzellen, die die zellfreie Substanz bilden, können in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung multipotente Zellen aus einem
Weichgewebe eines Zahns sein. Vorzugsweise können Stammzellen aus Follikel oder Pulpa eingesetzt werden. Besonders bevorzugt sind Stammzellen aus einem kissenartigen Weichgewebe, das unmittelbar an der apikalen Seite eines extrahierten unreifen Zahns unterhalb der Papille lokalisierbar ist. Das kissenartige Weichgewebe ist vorteilhafter Weise ein Zellverbund aus einer Anlage eines impaktierten und/oder retinierten Zahns in der Entwicklungsphase zwischen dem Auftreten des knöchernen Alveolarfundus und dem Abschluss der Wurzel- bildung. Um die gewünschten multipotenten Stammzellen isolieren zu können, sollte das kissenartige Weichgewebe nach dem chirurgischen Entfernen des Zahns entlang einer makroskopisch sichtbaren Grenze zwischen dem kissenartigen Weichgewebe und der Papille, vorzugsweise unterhalb einer gedachten Linie zwischen den sich entwickelnden Wurzelfortsätzen, von dem Zahn ge- trennt werden. Das derart ausgewählte Gewebe ermöglicht die Isolierung ekto- mesenchymaler Stamm- bzw. Vorläuferzellen, die sich aufgrund ihrer Multipo- tenz in unterschiedliche Zelltypen, beispielsweise Knochen- oder Knorpelzellen, differenzieren lassen. Die Wahl des richtigen Ursprungsgewebes für die Isolierung der Stammzellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein wesent- licher Faktor für eine hohe Ausbeute an multipotenten Stammzellen. Die isolierten Zellen sind ektomesenchymale Stamm- und/oder Vorläuferzellen, die nach der Isolierung aus dem Gewebeverbund osteogen und/oder chondrogen stimuliert werden können.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung weist die zellfreie Substanz ein definiertes Verhältnis von Calcium zu Phosphat auf. Durch das gezielte Einstellen eines definierten Calcuim/Phopshat-Verhältnisses kann beispielsweise Knochenmatrix hergestellt werden, die einem jungen Knochen oder einem alten Knochen entspricht. Je nach dem wie lange die Stammzellen unter osteogener Stimulation kultiviert werden, kann die erfindungsgemäße zellfreie Substanz also gezielt für die gewünschte Anwendung konfektioniert werden. Das Calcium/Phosphat-Verhältnis liefert Hinweise auf das Alter des Knochens (Dorozhkin, S.V., Epple, M. 2002). Erfindungsgemäß kann folglich eine therapeutische Zusammensetzung bereitgestellt werden, die eine zellfreie Substanz mit einem definierten Calcium/Phosphat-Verhältnis umfasst, vorzugsweise ein Calcium/Phosphat-Verhältnis zwischen 0,5 und 2,0, so dass ein für die gewünschte Therapie optimiertes Heilmittel vorliegt, welches definierte Eigenschaften aufweist. Darüber hinaus kann die zellfreie Substanz auch ein definier- tes Verhältnis von Calciumphosphat zu Kollagen aufweisen, so dass auch die Qualität der therapeutischen Zusammensetzung genau eingestellt werden kann.
Die Aufgabe wird ferner erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung einer therapeutische Zusammensetzung gelöst, bei dem Stamm- und/oder Vorläuferzellen isoliert, in vitro kultiviert und zur anschließenden Differenzierung stimuliert werden, wobei die Zellen nach der Differenzierung zur Herstellung einer zellfreien Substanz abgetötet und/oder zumindest teilweise entfernt wer- den, und wobei die zellfreie Substanz für die therapeutische Verwendung hergerichtet wird. Erfindungsgemäß wird also im Gegensatz zum Stand der Technik eine zellfreie Substanz, die aus stimulierten Stamm- und/oder Vorläuferzellen hervorgegangen ist bzw. produziert wurde, direkt in eine therapeutische Anwendungsform gebracht, ohne sie erneut mit Stammzellen zu besiedeln. Ll- berraschender Weise hat sich nämlich herausgestellt, dass die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte therapeutische Zusammensetzung die Neubildung von zerstörtem Gewebe in vitro und in vivo stimulieren kann, obwohl sie nicht mit frischen Stammzellen besiedelt wird. Offenbar sind die in den stimulierten Stamm- und/oder Vorläuferzellen enthaltenen oder durch diese ZeI- len produzierten Stoffe ausreichend, um eine effektive Gewebeersatztherapie zu ermöglichen oder zumindest zu unterstützen. Das Herstellungsverfahren wird dadurch erheblich vereinfacht und zudem kostengünstiger, da parallel zur Erzeugung der zellfreien Substanz keine Stamm- oder Vorläuferzellen mehr kultiviert werden müssen.
Erfindungsgemäß wird die zellfreie Substanz vorzugsweise zerkleinert, pulverisiert und/oder gefriergetrocknet, so dass ein leicht zu handhabendes und zu verarbeitendes Produkt entsteht. Die zellfreie Substanz kann dann erfindungsgemäß beispielsweise in Form einer Paste, Salbe oder Suspension hergerichtet werden. In dieser oder ähnlicher Form kann die zellfreie Substanz bzw. die therapeutische Zusammensetzung auf einfache Weise in das zu behandelnde Gewebe eingebracht werden. Diese schonende Art der Applikation ist von beson- derem Vorteil, da hierdurch zusätzliche, den Patenten belastende Eingriffe vermieden werden können.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, die Stamm- und/oder Vorläuferzellen osteogen und/oder chondro- gen zu stimulieren. Dabei können die Stamm- und/oder Vorläuferzellen derart stimuliert werden, dass sie eine Knochen- oder Knorpelmatrix bilden bzw. produzieren. Diese Matrix und jede andere Substanz, die in vitro ohne zusätzliche Hilfsmittel wie beispielsweise Trägermaterialen entsteht, kann dann durch en- zymatische, chemische oder mechanische Behandlung von lebenden Zellen und/oder antigenen Zellbestandteilen befreit und anschließend zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendet werden. Lebenden Zellen sollten dabei zumindest abgetötet und/oder antigene Zellbestandteile möglichst vollständig entfernt werden. Nukleinsäuren sollten ebenfalls entfernt oder zumindest vollständig degradiert werden, um etwaige Risiken durch das Einbringen von genetischem Material auszuschließen. Vorzugsweise wird die intakte oder zerkleinerte Knochenmasse mit einer hypotonen Lösung (z.B. deionisiertes Wasser) behandelt und/oder in flüssigen Stickstoff zur Eiskristallbildung behandelt, um die Zellmembranen zu zerstören und die Zellen zu lysieren. Abhängig vom Reifegrad des Knochengewebes und der damit gewünschten Zusammensetzung des späteren Produktes werden die Proben unter Schütteln in Salzlösung (z.B. 3M NaCI) und/oder Säure/Base (z.B. 0,15-1 % per acidic acid-PAA) ausgewaschen, und/oder in Triton-X100 (0,1%-1%) und/oder SDS (0,1%-1%) für unterschiedliche Zeiten extrahiert. Zwischenschritte zur bioche- mischen Veränderung der organischen Knochengrundsubstanz mit Enzymen (z.B. Trypsin-EDTA) sind wahlweise möglich. Zwischenschritte zur chemischen Veränderung der anorganischen Grundsubstanz mit Säuren/Basen sind ebenso möglich. Um freigesetzte Nukleinsäuren (RNA und DNA) zu entfernen, wird die Knochengrundsubstanz mit RNAse und DNAse behandelt. Anschließend wird die zellfreie Knochengrundsubstanz mit Pufferlösung (z.B. PBS) gewaschen, dialysiert und lyophilisiert, pulverisiert und in Form einer Paste, Salbe oder Suspension hergerichtet. Erfindungsgemäß kann die Dauer der Stimulation zur Einstellung bestimmter Eigenschaften der zellfreien Substanz variiert werden. In besonders vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann beispielsweise durch die Wahl einer bestimmten Stimulationsdauer ein definiertes Verhältnis von Calcium zu Phosphat und/oder von Calciumphosphat zu Kollagen eingestellt werden. Die Stimulationsdauer, d. h. die Dauer der Kultivierung der Stammzellen in Anwesenheit der stimulierenden Substanzen, liegt erfindungsgemäß zwischen 15 und 50 Tagen, vorzugsweise zwischen 20 und 45 Tagen, besonders bevorzugt zwischen 21 und 42 Tagen. Durch die gezielte Wahl einer bestimmten Stimulationsdauer kann der Reifegrad und die Qualität der zellfreien Substanz beeinflusst und somit definiert eingestellt werden. Je kürzer die Stimulationsdauer ist, umso geringer ist der Reife- bzw. Mineralisierungsgrad (kleines Calcium/Phosphat-Verhältnis) der erzeugten Knochenmatrix bzw. zellfreien Substanz. Je länger die Stimulationsdauer ist, umso höher ist der Reife- bzw. Mineralisierungsgrad (großes Calcium/Phosphat-Verhältnis) der erzeugten Knochenmatrix bzw. zellfreien Substanz. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht also in besonders vorteilhafter Weise die gezielte Einstellung der Eigenschaften des Verfahrensproduktes durch die Wahl einer bestimmten Stimulationsdauer.
In weiterer besonders vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Stammzellen aus einem Weichgewebe eines Zahns, wie beispielsweise Follikel oder Pulpa, isoliert werden. Bevorzugt werden die Stammzellen aus einem kissenartigen Weichgewebe, das unmittelbar an der apikalen Seite eines extrahierten unreifen Zahns unterhalb der Papille lokalisierbar ist, isoliert. Im Hinblick auf die Multipotenz der im Zuge des erfin- dungsgemäßen Verfahrens zu isolierenden Stammzellen ist es besonders vorteilhaft, wenn das kissenartige Weichgewebe aus einer Anlage eines impaktier- ten und/oder retinierten Zahns in der Entwicklungsphase zwischen dem Auftre- ten des knöchernen Alveolarfundus und dem Abschluss der Wurzelbildung gewonnen wird. Um die gewünschten multipotenten Stammzellen isolieren zu können, sollte das kissenartige Weichgewebe nach dem chirurgischen Entfernen des Zahns entlang einer makroskopisch sichtbaren Grenze zwischen dem kissenartigen Weichgewebe und der Papille, vorzugsweise unterhalb einer gedachten Linie zwischen den sich entwickelnden Wurzelfortsätzen, von dem Zahn getrennt werden. Das derart ausgewählte Gewebe ermöglicht die Isolierung ektomesenchymaler Stamm- bzw. Vorläuferzellen, die sich aufgrund ihrer Multipotenz in unterschiedliche Zelltypen, beispielsweise Knochen- oder Knorpelzellen, differenzieren lassen. Die Wahl des richtigen Ursprungsgewebes für die Isolierung der Stammzellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein wesentlicher Faktor für eine hohe Ausbeute an multipotenten Stammzellen. Der Gewebeverbund kann zur weiteren Kultivierung der Zellen durch enzymatische Behandlung, vorzugsweise mit Collagenase/Dispase, aufgelöst werden. Dabei können die Zellen nach der Gewinnung aus dem Gewebeverbund auch vereinzelt werden. Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens isolierten Zellen sind ektomesenchymale Stamm- und/oder Vorläuferzellen, die nach der Isolierung aus dem Gewebeverbund in vitro osteogen und/oder chondrogen stimuliert werden können.
Jede mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte therapeutische Zusammensetzung ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Insbesondere jede mittels des zuvor beschriebenen Verfahrens hergestellte zellfreie Knochen- und/oder Knorpelmatrix.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung kann die zuvor beschriebene zellfreien Substanz wie bereits erläutert für therapeutische Zwecke im Rahmen einer Gewebeersatztherapie verwendet werden. Die Erfindung um- fasst ferner die Verwendung eines zellfreien Zellextrakts und/oder Zellsekrets für therapeutische Zwecke im Rahmen einer Gewebeersatztherapie sowie die Verwendung einer zellfreien Knochen- oder Knorpelmatrix für therapeutische Zwecke im Rahmen einer Gewebeersatztherapie.
Die Erfindung wird im Weiteren anhand der Abbildungen und Ausführungsbeispiele beispielhaft näher erläutert. Kurze Beschreibung der Abbildungen In den Abbildungen zeigt
Figur 1 (a) eine photographische Aufnahme eines extrahierten Weisheits- zahns mit apikalem Weichgewebe (apikalem Kissen) und (b) eine mikroskopische Aufnahme von aus dem apikalen Kissen isolierten Zellen,
Figur 2 rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Knochenformati- onen nach 28 Tagen Inkubation der isolierten Zellen nach Gluta- raldehyd-Fixierung (mit Gold beschichtet), (a) Kontrolle, (b) Außenansicht und (c) Schnittansicht,
Figur 3 mikroskopische Aufnahmen osteogen stimulierter Kulturen nach immunohistochemischer Detektion von (a) Osteocalcin (Fa. Acris),
(b) Kollagen Typ I (Fa. Abcam) und (c) nach Färbung mit Alizarin rot.
Figur 1 zeigt einen chirurgisch entfernten Weisheitszahn mit apikalem Kissen (a). Das apikale Kissen wird entlang der makroskopisch sichtbaren Grenze zwischen dem kissenaφgen Weichgewebe und der Papille unterhalb der gedachten Linie zwischen den Zahnwurzeln von dem Zahn getrennt, mit PBS (steril) mehrmals gewaschen und dann mit einem Skalpell zerkleinert. Das so gewonnene Gewebe wird mit Collagenase/Dispase aufgeschlossen. Nach der Be- handlung des apikalen Weichgewebes mit Kollagenase/Dispase werden die Kulturen bei 37°C in DMEM LG 10% FCS kultiviert. Die isolierten Zellen wachsen als fibroblastoide Zellen in Kulturen (b).
Figur 2 zeigt rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Knochenformati- onen nach 28 Tagen Inkubation der isolierten Zellen. Die Zellen werden in Kontrollmedium (a) und in osteogen stimulierendem Medium (b) kultiviert. Die in osteogen stimulierendem Medium kultivierten Zellen bilden eine Knochenähnliche Formation (b), die von innen organisiert Knochen-ähnlich strukturiert ist (c), während die Zellen, die nur mit Kontrollmedium behandelt wurden, keine Knochenformation bilden und als adhärenter Verband wachsen (a).
Figur 3 zeigt mikroskopische Aufnahmen osteogen stimulierter Kulturen. Die osteogen stimulierten Kulturen werden nach 42 Tagen gestoppt und mit 4 % PFA fixiert. Anschließend wird die gebildete Knochenformationen in Paraffin eingebettet und dann geschnitten. Um die Knochen-ähnliche Formationen zu detektieren, werden die Schnitte immunohistochemisch mit einem ersten Antikörper gegen Osteocalcin oder Kollagen Typ I (beide sind Knochenmarker) ge- färbt. Die gebundenen Antikörper werden mit dem DAB Kit nach Herstellerangaben (Fa. R&D) detektiert. Um die Kalzifizierung zu detektieren, werden die Schnitte mit Alizarin rot (1,2 %Alizarin rot in pH4,2) gefärbt. Die stark rot gefärbten Areale sind kalzifizierte bzw. Knochen-ähnliche Bereiche.
Bevorzugte und beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung
Dentale Stammzellen verfügen über ein spezifisches Muster von aktiven Stoffen, die den Aufbau verschiedener Gewebearten steuern. Zur Nutzung dieser Potenz wird eine speziell isolierte Subpopulation humaner dentaler Stammzellen in einem zellbiologischen Verfahren dazu angeregt, einen dem jungen Kno- chen ähnlichen Gewebeverband zu entwickeln. Die dabei gebildete hochspezifische Matrix wird anschließend zu einem nicht-zellulären Produkt aufbereitet, das den Knochenaufbau und damit den Verlauf der Einheilungsphase und das Einwachsverhalten von Implantaten deutlich beschleunigt. Damit wird die spezielle Eigenschaft dieser Matrix genutzt, aufgrund ihrer Zusammensetzung den komplexen Knochenaufbau physiologisch korrekt in einer Wunde zu stimulieren.
Im ersten Schritt werden Stamm-/Progenitorzellen unter geeigneten Bedingungen osteogen stimuliert, um aus sich heraus einen knochenähnlichen Gewebe- verband entstehen zu lassen. Die osteogene Stimulation kann beispielsweise durch Inkubation bzw. Kultivierung der Stammzellen mit 10"7 M Dexamethason, 50 μg/ml Ascorbinsäue-2-Phosphat und 10 mM ß-Glycerolphosphat erfolgen. Dieses biologische Konstrukt ist in seiner Zusammensetzung mit dem sich bil- denden Knochen vergleichbar. Im zweiten Schritt wird deshalb die Matrix aufbereitet und zu einem Produkt verarbeitet. Das gesamte Verfahren ist ein rein biologisches und kommt ohne jegliches Trägermaterial (Scaffold) aus.
Als Ausgangsmaterial dient ein differenziertes Knochengewebe wie es nur aus jungen dentalen Stammzellen, den sogenannten dNC-PCs, die osteogen stimuliert werden, in einem sich selbst generierenden Kultursystem geformt werden kann. Das Kultursystem ist besonders vorteilhaft, weil das dreidimensionale Knochengewebe samt seiner spezifisch gebildeten Interzellularsubstanzen aus- schließlich von dNC-PCs selbst organisiert wird und in seiner Struktur und Funktion ausschließlich den eigenen formenden und ordnenden Prinzipien unterliegt. Bei dem Knochengewebe handelt sich somit um werdendes, unreifes Knochengewebe, das in seiner Struktur und Festigkeit, seinem Mineralisationsgrad sowie seiner Zusammensetzung an Grundsubstanzkomponenten von be- sonderer Bauweise ist. Dieses Knochengewebe wird zu einem nicht-zellulären Produkt (Knochengrundsubstanz) aufbereitet, das den Knochenaufbau und damit den Verlauf der Einheilungsphase und das Einwachsen von Implantaten (Scaffolds) im Patienten beschleunigt. Dieses Knochengewebe kann in unterschiedlichen Reifegraden, die sich nach Phasen des Aufbaus der Matrix und der Mineralisierung richten, geerntet und in vom Reifegrad abhängigen Verfahren aufbereitet werden. Die Reifegrade werden anhand der Differenzierungszu- stände der dNC-PCs bzw. der Strukturierung und Zusammensetzung der Matrix bestimmt.
Die Entfernung der Zellen und das Herstellen einer zellfreien Substanz erfolgt mit physikalischen, chemischen und biologischen Methoden. Um die Zellmembranen zu zerstören und die Zellen zu lysieren, wird die intakte oder zerkleinerte Knochenmasse mit einer hypotonen Lösung (z.B. deionisiertes Wasser) behandelt und/oder in flüssigen Stickstoff zur Eiskristallbildung behandelt. Abhängig vom Reifegrad des Knochengewebes und der damit gewünschten Zusammensetzung des späteren Produktes werden die Proben unter Schütteln in Salzlösung (z.B. 3M NaCI) und/oder Säure/Base (z.B. 0,15-1 % per Essigsäure-PAA) ausgewaschen, und/oder in Triton-X100 (0,1%-1%) und/oder SDS (0,1%-1%) für unterschiedliche Zeiten extrahiert. Zwischenschritte zur biochemischen Veränderung der organischen Knochengrundsubstanz mit Enzymen (z.B. Trypsin- EDTA) und/oder der chemischen Veränderung der anorganischen Grundsubstanz mit Säuren/Basen sind wahlweise möglich. Um freigesetzte Nukleinsäu- ren (RNA und DNA) zu entfernen, wird die Knochengrundsubstanz mit RNAse und DNAse behandelt. Anschließend wird die zellfreie Knochengrundsubstanz mit Pufferlösung (z.B. PBS) gewaschen, dialysiert und lyophilisiert, pulverisiert und in Form einer Paste, Salbe oder Suspension hergerichtet.
Die zellfreie Substanz basiert also im Prinzip auf der Syntheseleistung einer Neuralleistenzelle. Diese Zellen isolieren wir aus den Zellen eines kissenartigen Weichgewebes, das unmittelbar an der apikalen Seite eines extrahierten unreifen Zahns unterhalb der Papille lokalisierbar ist (wo sie sich in ihrer Nische abgesetzt haben) und beschreiben sie in ihren Eigenschaften als multipotente dNC-PCs (= dental neural crest-derived progenitor cells). Nur dieser bestimmte Zelltyp, d.h. die dNC-PCS, kann unter osteogener Stimulation ein dreidimensionales, rein biologisches Zell-Matrix-Aggregat bilden. Dieses Aggregat, das sich völlig selbständig formiert, besteht im Prinzip aus einem „Kern" und einer „Schale". Der Kern wird von inneren Zellen, die Schale von äußeren Zellen gebildet. Beide Zelltypen lassen sich phänotypisch unterscheiden, stammen aber initial von dNC-PCs als gemeinsamem Vorläufer ab. Der Kern des Aggregats besteht aus vitalen Zellen, die alle miteinander verwandt sind und zur Familie der Osteoblasten und Osteoblasten-Helferzellen gehören. Die Schale des Aggregats besteht aus ebenfalls vitalen Zellen. Die äußeren Zellen eine haben eine Barrie- refunktion, um das Innere des Aggregats von der Außenwelt (= Medium, Faktoren, Serum) abzuschirmen und die Einstellung eines spezifischen Milieus zu ermöglichen. Die inneren Zellen beginnen mit zunehmender Kulturdauer eine embryonale Matrix abzuscheiden, die zunächst nicht mineralisiert ist. Erst bei langen Kulturzeiten kommt es zu einer sukzessiven Einlagerung von Mineral (Varianten von Ca-Phosphaten bis hin zum Hydroxylappatit) und damit zur Ausbildung von Hartsubstanz. Der Vorgang der Mineralisierung erfolgt nur im Inneren des Aggregats und ist wahrscheinlich an das Vorhandensein der Schale gebunden. Die Mineralisierung ist ein aktiver Prozess, d.h. sie ist abhängig von den inneren Zellen und dem speziellen Milieu des Kerns. Das Innere des Aggregats ist das Ausgangprodukts für die erfindungsgemäße zellfreie Substanz, die in unterschiedlichen Reifegraden geerntet werden kann. Zur Ernte wird das Aggregat aufgebrochen. Die äußeren Zellen werden über Enzymbe- handlung oder auch Immunosurgery entfernt. Zurück bleibt der Kern des Aggregats, der nicht direkt genutzt, sondern noch aufbereitet wird. Die Zellen werden mit Enzym und Detergenz isoliert. Was zurückbleibt, kann in eine organische und eine anorganische Phase getrennt werden. Jede Phase kann weiter verändert werden - die organische mit Enzym, die anorganische mit Säure und/oder Base. Je nach Reifegrad des Aggregats und je nach Verfahren der Aufbereitung ergibt sich dabei jeweils ein anderes Produkt.
Literatur
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Dorozhkin, S. V.; Epple, M. ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION 2002, 41, 3130-3146.

Claims

Patentansprüche
1. Therapeutische Zusammensetzung zumindest bestehend aus einer zellfreien Substanz, die aus stimulierten Stamm- und/oder Vorläuferzellen hervorgegangen ist.
2. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz eine Zellkultur ist, in der die lebenden Zellen abgetötet und/oder Zellbestandteile zumindest teilweise entfernt sind.
3. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz Zellextrakt und/oder Zellsekret umfasst.
4. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz Knochen- oder Knorpelmatrix ist.
5. Therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen multipotente Zellen aus einem Weichgewebe eines Zahns, vorzugsweise Follikel oder Pulpa, sind.
6. Therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen Zellen eines kissenartigen Weichgewebes sind, das unmittelbar an der apikalen Seite eines extrahier- ten unreifen Zahns unterhalb der Papille lokalisierbar ist.
7. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das kissenartige Weichgewebe ein Zellverbund aus einer Anlage eines impaktierten und/oder retinierten Zahns in der Entwicklungsphase zwischen dem Auftreten des knöchernen Alveolarfundus und dem Abschluss der Wurzelbildung ist.
8. Therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz ein definiertes Verhältnis von Calcium zu Phosphat aufweist.
9. Therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz ein definiertes Verhältnis von Calciumphosphat zu Kollagen aufweist.
10. Verfahren zur Herstellung einer therapeutische Zusammensetzung, bei dem Stamm- und/oder Vorläuferzellen isoliert, in vitro kultiviert und zur an- schließenden Differenzierung stimuliert werden, wobei die Zellen nach der
Differenzierung zur Herstellung einer zellfreien Substanz abgetötet und/oder zumindest teilweise entfernt werden, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz für die therapeutische Verwendung hergerichtet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz zerkleinert, pulverisiert und/oder gefriergetrocknet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zellfreie Substanz in Form einer Paste, Salbe oder Suspension hergerichtet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Stamm- und/oder Vorläuferzellen osteogen und/oder chondrogen sti- muliert werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Dauer der Stimulation zur Einstellung bestimmter Eigenschaften der zellfreien Substanz variiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Wahl einer bestimmten Stimulationsdauer ein definiertes Verhältnis von Calcium zu Phosphat und/oder von Calciumphosphat zu Kollagen eingestellt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Stamm- und/oder Vorläuferzellen derart stimuliert werden, dass sie eine Knochen- oder Knorpelmatrix bilden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass intakte oder zerkleinerte Knochen- oder Knorpelmatrix zum Aufschluss der Zellen mit einer hypotonen Lösung und/oder in flüssigen Stickstoff behandelt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die aufgeschlossenen Zellen unter Schütteln in Salzlösung und/oder Säure/Base ausgewaschen, und/oder mit Triton-X100 und/oder SDS behandelt werden.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die aufgeschlossenen Zellen mit RNAse und DNAse behandelt werden.
20. Verfahren nach Anspruch 17, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die aufgeschlossenen Zellen mit einer Pufferlösung gewaschen und/oder dialysiert werden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen aus einem Weichgewebe eines Zahns, vorzugsweise Follikel oder Pulpa, isoliert werden.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen aus einem kissenartigen Weichgewebe, das unmittelbar an der apikalen Seite eines extrahierten unreifen Zahns unterhalb der Papille lokalisierbar ist, isoliert werden.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das kissenartige Weichgewebe aus einer Anlage eines impaktierten und/oder retinier- ten Zahns in der Entwicklungsphase zwischen dem Auftreten des knöchernen Alveolarfundus und dem Abschluss der Wurzelbildung gewonnen wird.
24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass das kissenartige Weichgewebe nach dem chirurgischen Entfernen des Zahns entlang einer makroskopisch sichtbaren Grenze zwischen dem kissenarti- gen Weichgewebe und der Papille von dem Zahn getrennt wird.
25. Therapeutische Zusammensetzung hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 24.
26. Zellfreie Knochenmatrix, hergestellt mittels des Verfahrens nach einem der Ansprüche 10 bis 24.
27. Zellfreie Knorpelmatrix, hergestellt mittels des Verfahrens nach einem der Ansprüche 10 bis 24.
28. Verwendung einer zellfreien Substanz für therapeutische Zwecke im Rahmen einer Gewebeersatztherapie.
29. Verwendung eines zellfreien Zellextrakts und/oder Zellsekrets für thera- peutische Zwecke im Rahmen einer Gewebeersatztherapie.
30. Verwendung einer zellfreien Knochen- oder Knorpelmatrix für therapeutische Zwecke im Rahmen einer Gewebeersatztherapie.
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