DE69837212T2 - Verfahren zur induzierung der osteoblastischen differenzierung der zellen des menschlichen extramedullären fettgewebes - Google Patents
Verfahren zur induzierung der osteoblastischen differenzierung der zellen des menschlichen extramedullären fettgewebes Download PDFInfo
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Description
- Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit welchem Zellen des osteoblastischen Phänotyps aus Zellen, die im humanen extramedullären Fettgewebe vorhanden sind, erhalten werden. Die erhaltenen Zellen können bei der Herstellung von Knochenimplantaten verwendet werden.
- Um Verlusten an Knochengewebe, wie sie in Folge von Verletzungen oder chirurgischen Operationen auftreten, entgegenzuwirken, können bekanntermaßen Ersatz- oder Füllmaterialien implantiert werden. Bei diesen Materialien kann es sich um Knochenimplantate oder künstliche Produkte wie etwa poröse keramische Stoffe oder auch um natürliche Produkte wie etwa Korallenskelettstoffe handeln.
- Die Durchführung von Allotransplantationen birgt insbesondere das Risiko der Übertragung bestimmter schwerer Viruserkrankungen. In dieser Hinsicht ist die Durchführung von Autotransplantationen zufriedenstellender, wobei indes die Entnahme des Implantats einen chirurgischen Eingriff erfordert, der mit einem erheblichen Sterblichkeitsrisiko einhergeht.
- Aus diesen Gründen wird die Verwendung von Implantaten auf Basis von bioverträglichen, möglicherweise biologisch abbaubaren Materialien wie etwa Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, Gips, Korallensubstanz oder Polymerstoffen auf Basis von Polymilchsäure usw. empfohlen. Großporige Materialien sind von besonderem Interesse, denn das Vorhandensein von Poren begünstigt das Nachwachsen der Knochen.
- Seit einigen Jahren zielen die Forschungsanstrengungen auf die Verwendung von Zellen mit osteogenem Potenzial ab, wobei diese mit Biomaterialien kombiniert sein können oder nicht; es sei beispielsweise auf die französische Patentschrift Nr. 2 679 250 verwiesen, in welcher vorgesehen ist, Osteoblasten auf einem dreidimensionalen, porösen feststofflichen Träger aus Korallenskelettstoff zu züchten, um sie Patienten implantieren zu können, bei denen Verlusten an Knochensubstanz bereits eingetreten oder vorherzusehen sind (wenn eine chirurgische Resektion vorgesehen ist).
- Der Nutzwert solcher Verfahren liegt offensichtlich darin, die Herstellung von Implantaten mit Hilfe autologer Zellen zu ermöglichen.
- Auf diesem Gebiet zielt die Forschung darauf ab, Knochenmarkzellen zu verwenden, die dazu befähigt sind, sich zu Osteoblasten auszudifferenzieren, insbesondere unter dem Einfluß bestimmter Wachstumsfaktoren, die eine osteoinduzierende Wirkung ausüben; In der Tat ist bekannt, daß Kulturen von Knochenmarkzellen dazu befähigt sind, sich in Richtung osteoblastischer Phänotypen zu entwickeln.
- Die Entnahme von Knochenmark ist indes mit denselben Nachteilen vermacht wie die Entnahme von Knochenimplantaten.
- Studien, die am Kaninchen durchgeführt wurden, haben gezeigt, daß Zellen aus der stroma-vaskulären Fraktion des extramedullären Fettgewebes dazu befähigt sind, sich in in-vitro-Kulturen, und zwar in Gegenwart des osteoinduzierenden Faktors BMP2 sowie von Dexamethason, zu Osteoblasten auszudifferenzieren; siehe L. Lecoeur et al., Cellular Engineering; Vol 2, Nr. 2, 1–7 (1997). Dexamethason allein ermöglicht diese Ausdifferenzierung nicht.
- Es ist jetzt im Gegenteil entdeckt worden, daß die in-vitro-Kultur bestimmter Zellen des humanen extramedullären Fettgewebes zu einer osteoblastischen Ausdifferenzierung führen kann, wenn lediglich ein Glukokortikoid, beispielsweise lediglich Dexamethason, zugegen ist, das heißt ohne, daß darüber hinaus ein osteoinduzierender Faktor vorhanden wäre. Die Verwendung solcher Faktoren, bei denen es sich um kostspielige Produkte handelt, ist nicht erforderlich.
- Von den osteoinduzierenden Faktoren wäre das Signalprotein mit der Bezeichnung "Bone Morphogenetic Protein" (BMP) zu nennen, welches von URIST M.R. et al., P.N.A.S. USA 76 :1828–1832 (1979) beschrieben wird. Tatsächlich umfaßt diese Bezeichnung mehrere osteoinduzierende Proteinfaktoren (von BMP2 bis BMP9); siehe zum Beispiel YAMAGUCHI et al., Sem.Cell.Biol. 6, 165–173 (1993).
- Die Erfindung hat somit die Aufgabe, eine Verfahren zum Induzieren einer osteoblastischen Ausdifferenzierung und/oder zum Erhalten von Zellen, welche diese Ausdifferenzierungsrichtung eingeschlagen haben, bereitzustellen, wobei als Ausgangsmaterial Zellen des humanen extramedullären Fettgewebes dienen und das Verfahren einen Schritt umfaßt, der darin besteht, die Ausgangszellen in einem flüssigen Nährmedium für eine Zeitdauer zu inkubieren, die ausreicht, um die Entwicklung der Zellen zu ermöglichen, wobei in dem Nährmedium mindestens ein Glukokortikoid gelöst ist, während es frei von adipogenen Faktoren, insbesondere von Insulin, sowie von osteoinduzierenden Faktoren ist.
- Anders ausgedrückt, handelt es sich bei dem Verfahren der Erfindung um ein Verfahren, bei welchem die Ausgangszellen gezüchtet werden, wobei dem Kulturmedium mindestens ein Glukokortikoid zugesetzt wird, um eine osteoblastische Ausdifferenzierung zu induzieren und/oder Zellen zu erhalten, welche diese Ausdifferenzierungsrichtung eingeschlagen haben.
- HAUNER H. et al., J. Clin. Invest. 84 :1663–1670 (1989) haben die Ausdifferenzierung von humanen Zellen des subkutanen Fettgewebes zu Adipozyten beschrieben, wobei diese durch Kultur in Gegenwart von Insulin und Glukokortikoiden erfolgt.
- Bei den Zellen, welche im Verfahren der Erfindung aus Ausgangszellen verwendet werden, handelt es sich um Zellen, die, im Gegensatz zu Knochenmarkzellen, dazu befähigt sind, sich in Gegenwart von Insulin zu Adipozyten auszudifferenzieren; siehe insbesondere GREENBERGER J.S., IN VITRO, vol. 15, Nr. 10, 823–828 (1979).
- Bei den Zellen, welche gemäß dem Verfahren der Erfindung die osteoblastische Ausdifferenzierungsrichtung einschlagen, handelt es sich nicht um reife Adipozyten, die bereits ausdifferenziert sind. Aus diesem Grunde wird es bevorzugt, Ausgangszellen zu verwenden, die aus Zellverbänden gewählt sind, aus denen die reifen Adipozyten entfernt wurden. Es handelt sich um stroma-vaskuläre Zellen, die insbesondere erhalten werden können, indem das Fettgewebe mit Hilfe von Collagenase zersetzt wird, woraufhin die reifen Adipozyten beispielsweise durch Zentrifugation entfernt werden: in der Tat weisen die reifen Adipozyten eine Dichte auf, die geringer ist als diejenige der übrigen Zellen, die im Ausgangsfettgewebe enthalten sind, und somit können sie durch Zentrifugation entfernt werden.
- In der Praxis können als Ausgangszellen solche Zellen verwendet werden, die, beispielsweise nach einer Zersetzung des Fettgewebes durch eine Collagenase und Entfernung der reifen Adipozyten, dazu befähigt sind, auf Polystyroloberfläche zu haften.
- Die Zellen werden im Kulturmedium inkubiert, und zwar unter Standardbedingungen, die es ihnen ermögliche, sich zu entwickeln, das heißt nicht nur zu überleben, sondern auch sich zu vervielfältigen und/oder auszudifferenzieren. Die Standardbedingungen für die Kultur humaner Zellen sind bekannt: eine Temperatur von, zum Beispiel, ungefähr 37°C; Luft-CO2-Atmosphäre 95:5; pH-Wert nahe dem Neutralpunkt.
- Bei dem verwendeten Kulturmedium handelt es sich um ein herkömmliches flüssiges Nährmedium, welches die Bestandteile enthält, die für die Entwicklung von Säugetierzellen erforderlich sind. Diese Bestandteile sind bekannt. Es handelt sich hauptsächlich um Mineralsalze (insbesondere Na, K, Mg, Ca und möglicherweise CU, Fe, Zn), um Aminosäuren, um Vitamine sowie um Kohlenstoffquellen (zum Beispiel Glucose). Es kann insbesondere ein Nährmedium wie etwa EAGLE's "minimal essential medium" (MEM), ergänzt durch fötales Kälberserum oder, vorzugsweise, durch humanes autologes Serum, verwendet werden.
- Es können ebenfalls komplexere Nährmedien des Typs DME (DULBECCO's modifiziertes EAGLE-Medium), möglicherweise in Mischung mit dem Medium F12 von HAM, verwendet werden, und zwar mit oder ohne Serum, vorzugsweise jedoch in Gegenwart von autologem Serum.
- Diesen Kulturmedien können osteoinduzierende Faktoren wie etwa die BMP-Faktoren zugesetzt werden, wobei diese Faktoren aber, wie oben dargelegt wurde, sind notwendig sind, um die osteoblastische Ausdifferenzierung der humanen Zellen, welche im Verfahren der Erfindung verwendet werden, zu induzieren. Gemäß den Ergebnissen, die im nachstehend aufgeführten experimentellen Teil erhalten wurden, kann die Gegenwart eines osteoinduzierenden Faktors (zumindest bei einigen dieser Faktoren) sogar eine ungünstige Wirkung haben. Es können also Medien verwendet werden, die frei von osteoinduzierenden Faktoren sind.
- Vorzugsweise werden den verwendeten Kulturmedien Faktoren, welche die Knochenbildung fördern, wie dies etwa bei Ascorbinsäure und den beta-Glycerophosphaten (zum Beispiel an Form von Natrium- oder Calciumsalzen) der Fall ist, zugesetzt.
- Darüber hinaus sind die Kulturmedien, die im Verfahren der Erfindung verwendet werden, frei von adipogenen Faktoren, und insbesondere sind sie frei von Insulin. Diesbezüglich sei darauf hingewiesen, daß die Glukokortikoide ausschließlich in Gegenwart von Insulin eine adipogene Wirkung auf die Zellen der stroma-vaskulären Fraktion des extramedullären Fettgewebes ausüben; siehe HAUNER et al. im oben zitierten Artikel.
- Die Kultur kann in herkömmlichen Kulturschalen durchgeführt werden. Die Kultur kann auch auf einem festen, dreidimensionalen bioverträglichen Träger, der in das flüssige Kulturmedium eingetaucht ist, durchgeführt werden.
- Die Zellen können entweder bereits zu Beginn der Kultur, unmittelbar nach dem Beimpfen, oder später, zum Beispiel nach der Konfluenz der Zellen, oder aber zu einem beliebigen Zeitpunkt zwischen diesen beiden Ereignissen mit dem Glukokortikoid inkubiert werden.
- Bei den geeigneten Glukokortikoiden handelt es sich um solche, die es nach ausreichend langer Inkubation der Zellen in Gegenwart des untersuchten Glukokortikoids ermöglichen, Kulturen zu erhalten, die Zellen enthalten, welche eine osteoblastische Ausdifferenzierungsrichtung eingeschlagen haben.
- In der vorliegenden Anmeldung wird davon ausgegangen, daß die Zellen eine osteoblastische Ausdifferenzierungsrichtung eingeschlagen haben, wenn sie mindestens die beiden ersten der folgenden Bedingungen erfüllen:
- – Produktion von alkalischer Phosphatase des Typs Knochen-Leber-Niere,
- – Produktion von Typ-I-Kollagen,
- – Produktion von Osteocalcin.
- Derartige Zellen, die auch als "Zellen des osteoblastischen Phänotyps" bezeichnet werden, haben die osteoblastische Ausdifferenzierungsrichtung in einem Ausmaß eingeschlagen, das dafür ausreicht, daß beim Weiterführen der Inkubation im Nährmedium und/oder beim Implantieren mindestens ein Teil der Zellen die Ausdifferenzierung bis zum Endstadium (mit Produktion einer mineralisierten extrazellulären Matrix) fortsetzen kann. Der Nachweis der kennzeichnenden Eigenschaften dieser Zellen (nämlich der Produktion von alkalischer Phosphatase, von Typ-I-Kollagen und möglicherweise auch von Osteocalcin) kann auf herkömmliche Art und Weise erfolgen, zum Beispiel mit Hilfe der Tests, die im nachstehenden experimentellen Teil erwähnt sind.
- Es sollte in Erinnerung gerufen werden, daß beim Menschen drei Isoenzyme der alkalischen Phosphatase vorkommen, welche durch drei verschiedene Gene codiert werden, und zwar:
- – ein Isoenzym des Typs Knochen-Leber-Niere,
- – ein Isoenzym des Typs Plazenta,
- – ein Isoenzym des Typs Dünndarm,
- Die alkalische Phosphatase des Typs Knochen-Leber-Niere ist sehr empfindlich gegen Levamisol.
- Die Levamisol-Konzentration, die zu einer 50%igen Hemmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase des Typs Knochen-Leber-Niere führt, liegt in der Größenordnung von 0,03 mM, während bei den übrigen alkalischen Phosphatasen die 50%ige Hemmung der Aktivität erst bei Levamisol-Konzentrationen in der Größenordnung von 1 mM für den Typ Plazenta und von 3 mM für den Typ Dünndarm erreicht wird.
- Der Hemmungstest mit Levamisol ermöglicht also eine eindeutige Unterscheidung der alkalischen Phosphatase des Typs Knochen-Leber-Niere. Dieser Test kann folgendermaßen durchgeführt werden. Es werden Zellextrakte (50 Mikroliter) entnommen und in 100 Mikrolitern einer Lösung, die 1,5 mM an 2-Amino-2-methyl-1-propanol bei einem pH-Wert von 10,3 enthält, sowie 100 Mikrolitern einer Lösung (14 mM) von para-Nitrophenolphosphat inkubiert, und zwar in Gegenwart steigender Konzentrationen von Levamisol im Bereich von 10–6 M bis 10–4 M. Die Reaktion wird bei 37°C durchgeführt und wird nach 20 Minuten durch Zusatz von 100 Mikrolitern einer Lösung (0,33 M) von NaOH gestoppt. Auf diese Weise kann die diejenige Levamisol-Konzentration bestimmt werden, welche eine 50%ige Hemmung hervorruft.
- Mit Hilfe der Tests, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben sind, kann somit in Routineversuchen bestimmt werden, welche der natürlichen Glukokortikoide oder ihrer synthetischen Analoga geeignet sind, welche Glukokortikoid-Konzentrationen zu verwenden sind und wie lange die Zellen in Gegenwart des Glukokortikoids inkubiert werden müssen.
- Von den Glukokortikoiden wären insbesondere Dexamethason, Hydrokortison, Prednisolon, Methylprednisolon, Prednison, Triamcinolon, Kortikosteron, Fluocinolon, Kortison, Betamethason usw. zu nennen.
- Die Inkubationszeit ist mindestens so lang wie die Zeit, die erforderlich ist, um Zellen zu erhalten, die mindestens den ersten beiden der oben erwähnten Bedingungen entsprechen. Diese Zeitspanne liegt im Allgemeinen in der Größenordnung von 15 Tagen. Um Zellen zu erhalten, die darüber hinaus Osteocalcin produzieren, liegt die Zeitdauer der Behandlung im Bereich von 30 Tagen. Um Zellen zu erhalten, bei denen die Ausdifferenzierung noch weiter vorangeschritten ist, so daß diese eine mineralisierte extrazelluläre Matrix produzieren, sind unter den Bedingungen der Studie Im Allgemeinen 35 bis 50 Tage erforderlich.
- Die Konzentrationen an Glukokortikoid hängen insbesondere von der Art des Glukokortikoids ab. Diese Konzentrationen können für den jeweils vorliegenden Fall durch einfache Routineversuche im Voraus bestimmt werden. Im Allgemeinen werden Konzentrationen in der Größenordnung von 10–5 bis 10–10 M, insbesondere von 10–6 bis 10–8 M verwendet.
- Das Verfahren der Erfindung kann durch Anlegen der Kultur in herkömmlichen Kulturschalen durchgeführt werden, oder aber durch Anlegen derselben auf einen festen dreidimensionalen bioverträglichen Träger, der porös ist oder nicht und der in ein flüssiges Medium eingetaucht ist. Das Verfahren kann ebenfalls durch Vorkultur in herkömmlichen Kulturschalen (möglicherweise in Gegenwart eines Glukokortikoids) mit anschließender Übertragung der erhaltenen Zellen auf einen festen dreidimensionalen Träger, der in ein flüssiges Kulturmedium eingetaucht ist, durchgeführt werden.
- Bevor sie eine Ausdifferenzierungsrichtung einschlagen, beginnen die Ausgangszellen im Allgemeinen damit, sich zu vervielfältigen, und zwar bis zum Erreichen von Konfluenz. Während dieser Vervielfältigungsphase ist es möglich, dem Kulturmedium ein Glukokortikoid zuzusetzen, was im Allgemeinen eine Beschleunigung des Ausdifferenzierungsvorgangs bewirkt. Nach Erreichen der Konfluenz, sofern diese beobachtet werden kann (im Falle einer Kultur in Kulturschalen oder auf einem festen dreidimensionalen Träger, der nicht porös ist), oder aber nach einer zuvor festgelegten Kulturzeit (im Falle einer Kultur auf einem porösen festen dreidimensionalen Träger), beginnt die Ausdifferenzierungsphase im engeren Sinne, während derer die Zellen in Gegenwart eines Glukokortikoids, welches in diesem Stadium vorhanden sein muß, inkubiert werden.
- Die Zellen in den Kulturschalen, die sich vervielfältigt haben oder auf dem Wege der Ausdifferenzierung sind, können auf die festen dreidimensionalen Träger übertragen werden, damit sie sich durch Inkubation des festen Trägers in einem flüssigen Nährmedium, welches erforderlichenfalls ein Glukokortikoid enthält, weiter vervielfältigen und/oder den Ausdifferenzierungsvorgang fortsetzen. Die Zellen, welche die osteoblastische Ausdifferenzierungsrichtung eingeschlagen haben und in Kulturschalen erhalten wurden, können auf einen festen dreidimensionalen Träger übertragen werden, indem der Träger mit einer flüssigen Suspension, welche die Zellen enthält, durchtränkt wird. Die durchtränkten Träger, die auf diese Weise erhalten wurden, können einem Menschen implantiert werden (insbesondere dem Spender des Fettgewebes, welches als Ausgangsstoff verwendet wurde). Die durchtränkten Träger können auch in ein flüssiges Kulturmedium eingetaucht werden, um die Kultur fortzuführen, wobei möglicherweise ein Glukokortikoid zugegen ist (insbesondere, wenn die übertragenen Zellen noch Zellen enthalten, die nicht ausdifferenziert sind), bevor sie schlußendlich implantiert werden.
- Der feste dreidimensionale Träger muß bioverträglich sein, damit er einem Menschen implantiert werden kann. Er kann jede geeignete Form aufweisen, wie etwa eine Zylinder-, Kugel- oder Plattenform oder Teile von beliebiger Form bilden.
- Von den Materialien für den festen dreidimensionalen bioverträglichen Träger wären insbesondere Calciumcarbonat und ganz besonders Aragonit, insbesondere in Form von Korallenskelettstoff zu erwähnen, sowie poröse keramische Stoffe auf Basis von Aluminiumoxid, Zirkoniumdioxid, Tricalciumphosphat und/oder Hydroxyapatit, Nachbildungen von Korallenskelettstoff, die durch hydrothermale Austauschvorgänge, welche die Umwandlung von Calciumcarbonat in Hydroxyapatit ermöglichen, erhalten wurden (französische Patentschrift Nr. 2 223 325), oder aber glasartige keramische Apatit-Wollastonit-Stoffe, sowie bioaktive glasartige keramische Stoffe wie etwa die Bioglass®-Produkte (KITSUGI et al., J. Biomed. Mater. Res. 21 :1255–1271 (1987) usw.
- Gemäß der Erfindung können die Zellen, welche die osteoblastische Umwandlungsrichtung eingeschlagen haben, entweder an der Oberfläche der festen dreidimensionalen Träger erhalten und/oder gezüchtet werden, wenn letztere nicht porös sind, oder aber an der Oberfläche und in der Poren von porösen dreidimensionalen Feststoffen.
- Die Verwendung eines Trägers auf Basis von Korallensubstanz ist besonders interessant. Es ist in der Tat bekannt, daß Korallensubstanz eine allmählich biologisch abbaubare Knochenprothese darstellen kann, wobei die erneute Bildung von Knochensubstanz, die im gleichen Ausmaß wie der Abbau voranschreitet (siehe beispielsweise die französische Patentschrift Nr. 2 460 657) durch die Zellen des osteoblastischen Phänotyps, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, begünstigt wird. Die Kultur von Zellen auf einem Träger aus Korallensubstanz ist insbesondere in der französischen Patentschrift Nr. 2 679 250 und in der entsprechenden US-Patentschrift Nr. 5480827 beschrieben.
- Vorzugsweise wird als poröses Trägermaterial ein Material verwendet, dessen Poren einen Durchmesser zwischen 50 und 250 μm aufweisen, wobei die Porosität im Allgemeinen zwischen 20 und 80 % liegt. Dies ist insbesondere bei Korallensubstanz der Familien Porites, Acropora, Goniopora, Lobophyllia, Symphillia und Millipora der Fall.
- Die Erfindung hat weiterhin die Aufgabe, ein Glukokortikoid zur Verwendung als Zusatzstoff in einem flüssigen Kulturmedium, welches die Entwicklung humaner Zellen in Kultur ermöglicht, bereitzustellen, wobei das Glukokortikoid dazu bestimmt ist, bei Zellen aus dem humanen extramedullären Fettgewebe, die in dem Medium gezüchtet werden, die osteoblastische Ausdifferenzierung zu induzieren. Selbstverständlich ist das Kulturmedium frei von adipogenen Faktoren.
- Die Erfindung betrifft ebenfalls Zellen, welche die osteoblastische Ausdifferenzierungsrichtung eingeschlagen haben und gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurden, wobei diese Zellen mindestens den ersten beiden der folgenden Bedingungen entsprechen müssen:
- – Produktion von alkalischer Phosphatase des Typs Knochen-Leber-Niere,
- – Produktion von Typ-I-Kollagen,
- – möglicherweise Produktion von Osteocalcin,
- – und möglicherweise Produktion einer mineralisierten extrazellulären Matrix.
- Diese Zellen können in Form einer Kultur vorliegen, welche die Poren und/oder der Oberfläche eines festen dreidimensionalen bioverträglichen Träger gemäß den vorstehenden Angaben auskleidet/bedeckt.
- Wenn sie in Form von Zellen vorliegen, die in herkömmlichen Kulturschalen erhalten wurden, können sie dazu verwendet werden, derartige poröse, feste dreidimensionale bioverträgliche Träger zu beimpfen. Es können ebenfalls solche festen dreidimensionalen Träger beimpft werden, auf denen bereits eine erste Schicht von Zellen wie etwa Fibroblasten gezüchtet wurde, wobei letztere autologer Herkunft sein können (siehe insbesondere die französische Patentschrift Nr. 2 679 250) und wobei diese erste Schicht den Zellen des osteoblastischen Phänotyps, welche erhalten und/oder gezüchtet werden sollen, als Unterlage dient.
- Die Zellen, welche erfindungsgemäß erhalten wurden, und zwar insbesondere in Form eines dreidimensionalen Trägers, der mit einer Suspension, welche die Zellen enthält, durchtränkt wurde, können zur Herstellung eines Knochenimplantats verwendet werden. Zu diesem Zwecke können die porösen dreidimensionalen bioverträglichen Träger, die mit Zellen beladen sind, als knochenbildende Implantate eingesetzt werden. Sie können beispielsweise implantiert werden, um Knochengewebe zu ersetzen oder auszufüllen, woraufhin sie allmählich von neu gebildetem Knochengewebe besiedelt werden. Derartige Träger können auch dem Menschen implantiert werden, insbesondere dem Spender der Zellen aus dem adipösen extramedullären Gewebe, welche als Ausgangszellen verwendet wurden, wobei dies vorzugsweise geschieht, nachdem der poröse, feste dreidimensionale Träger mit einem osteoinduzierenden Wachstumsfaktor durchtränkt wurden, und zwar an einer nicht verknöcherten Stelle, beispielsweise in einem Bindegewebe, wo sie zur Entstehung von Knochengewebe führen, das später als Material für eine Autotransplantation von Knochenmasse verwendet werden kann.
- Die Zellen, welche die osteoblastische Ausdifferenzierungsrichtung eingeschlagen haben und gemäß der Erfindung erhalten wurden, können somit verwendet werden, um ein feststoffliches dreidimensionalen Produkt zu erhalten, das gemäß der obigen Beschreibung als Knochenimplantat dienen kann. Eine solche Verwendung ist Teil der Erfindung.
- Im Folgenden werden einige Versuche beschrieben, auf denen die vorliegende Erfindung beruht.
- Die Fettgewebeproben wurden im Rahmen von plastischen Operationen des Unterleibs entnommen, welche bei gesunden Patienten im Alter von 25 bis 50 Jahren vorgenommen wurden.
- Die entnommenen Gewebestücke werden zu kleinen Fragmenten zerschnitten und 90 Minuten lang bei 37°C mit Collagenase (2 mg/ml) in Krebs-Ringer-Puffer verdaut. Es wird über ein Filter mit einer Porenweite von 100 μm filtriert, woraufhin das erhaltene Filtrat 5 min. lang bei 1.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert wird. Der Überstand wird verworfen, und das Zellpellet wird mehrmals in Krebs-Ringer-Puffer gewaschen. Die Schritte des Waschens und Zentrifugierens werden mehrmals wiederholt, wobei jedesmal der Überstand, der die reifen Adipozyten enthält, verworfen wird. Die erhaltenen Zellen werden im Kulturmedium DME/F12 (SIGMA CHEMICAL Co., St Louis, Mo, USA; Referenz D-6905) in Suspension gebracht, wobei dieses 10 % fötales Kälberserum, 100 μg/ml an Streptomycin und 100 U/ml an Penicillin enthält.
- Kulturbehälter aus Polystyrol ("Tissue culture flasks", vertrieben von BECTON-DICKINSON unter den Referenznummern 3013, 3028 und 3084) werden mit der Zellsuspension, die auf diese Weise erhalten wurde, beimpft und bei 37 °C unter feuchter Luftatmosphäre, der 5 % CO2 zugesetzt wurden, inkubiert.
- Nach 12 Stunden werden die nicht anhaftenden Zellen entfernt, indem mit PBS-Puffer gewaschen wird.
- Anschließend werden die anhaftenden Zellen im oben genannten Kulturmedium bis zum Erreichen von Konfluenz gezüchtet, wobei das Medium alle drei Tage gewechselt wird.
- Die Zellen werden anschließend trypsiniert und in einer Menge von 2.104 Zellen/ml zum erneuten Beimpfen von Schalen mit mehreren Kavitäten eingesetzt, und zwar in einem DME/F12-Medium, welches 10 % fötales Kälberserum enthält und welches mit 50 μg/ml an Ascorbinsäure und mit Dinatrium-betaglycerophosphat einer Konzentration von 10 mM angereichert wurde und welches Streptomycin und Penicillin in den vorstehend angegebenen Konzentrationen enthält. Es wird bei 37°C inkubiert.
- Nach dem Erreichen von Konfluenz erhalten die Zellen eine der folgenden Behandlungen:
- – Behandlung Nr. 1: Zusatz von rhBMP2 (humanes rekombinantes BMP2, geliefert von GENETIC INSTITUTE, Cambridge, Massachusetts, USA), in einer Menge von 200 ng/ml,
- – Behandlung Nr. 2: Zusatz von Dexamethason bis zu einer Konzentration von 10–7 M
- – Behandlung Nr. 3: Zusatz von 200 ng/ml an rhBMP2 + 10–7 M an Dexamethason,
- – Nicht behandelte Kontrollansätze: Inkubation im Kulturmedium (frei von rhBMP2 und frei von Dexamethason).
- Die Kulturen werden über einen Zeitraum von 30 Tagen oder länger fortgeführt, wobei die Kulturmedien oder die Behandlung alle 3 Tage erneuert werden.
- Die Proben aus den behandelten und aus den nicht behandelten Kulturen sind untersucht worden, um die Aktivität der alkalischen Phosphatase sowie die Expression von Typ-I-Kollagen und Osteocalcin zu bestimmen. Darüber hinaus wurde untersucht, ob möglicherweise eine Mineralisierung der extrazellulären Matrix stattgefunden hat.
- Bei der Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde para-Nitrophenolphosphat als Substrat eingesetzt, und zwar gemäß der Technik, die von L.
- Lecoeur et J. P. Ouhayoun, Biomaterials 18, 989–993 (1997) beschrieben wurde. Die Menge an para-Nitrophenol, die durch die Hydrolyse des Substrats gebildet wird, wird bestimmt, indem die Absorption bei 410 nm gemessen wird, um diese daraufhin mit Hilfe einer Kalibrierkurve, die anhand von bekannten Konzentrationen an para-Nitrophenol erstellt wurde, in Nanomol des Enzyms umzurechnen.
- Es wurde weiterhin ein Test durchgeführt, der es ermöglicht, die Aktivität der alkalische Phosphatase in situ nachzuweisen, und zwar in Zellkulturen, die mit Hilfe von Formaldehyd fixiert wurden, wobei ein Kit (vertrieben von SIGMA CHEMICAL Co., Referenz-Nr. 86R) für den halbquantitativen histochemischen Nachweis der alkalischen Phosphatase verwendet wurde. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wird auf der Zellschicht durch eine rötliche Färbung sichtbar gemacht.
- Im Übrigen haben die Hemmversuche mit Levamisol gezeigt, daß es sich bei der produzierten alkalischen Phosphatase um eine des Typs Knochen-Leber-Niere handelt.
- Anhand der Zellen, die mit Formaldehyd fixiert wurden, wurde ebenfalls untersucht, ob Kollagene (des Typs I und des Typs II) und Osteocalcin vorhanden sind, ebenso wie das Vorhandensein einer möglichen Mineralisierung geprüft wurde.
- Die Untersuchung hinsichtlich der Kollagensynthese erfolgte nach 30 Tage Behandlung, und zwar mit Hilfe von Anti-Kollagen-Antikörpern (IgG), die von SOUTHERN BIOTECHNOLOGY ASSOCIATES, USA vertrieben werden.
- In gleicher Weise erfolgte die Untersuchung hinsichtlich der Osteocalcinsynthese mit Hilfe eines Anti-Osteocalcin-Antikörpers (IgG), der von BIOMEDICAL TECHNOLOGIES INC., USA vertrieben wird.
- Die Bestimmungen mittels der Antikörper wurden nach dem Prinzip der Immunfluoreszenz durchgeführt, wobei zur Sichtbarmachung ein Anti-IgG-Antikörper, die an Fluorescein gekoppelt ist, verwendet wurde.
- Für die Untersuchung hinsichtlich der möglichen Mineralisierung der extrazellulären Matrix wurde der Färbungstest nach von Kossa verwendet, wobei die Durchführung gemäß der Technik erfolgte, die von Cheng et al., Endocrinology 134: 277–285 (1994) beschrieben wurde.
- Die erzielten Ergebnisse sind nachstehend beschrieben:
- Aktivität der alkalischen Phosphatase
- Die Kulturen, die ausschließlich mit rhBMP2 einer Konzentration von 200 ng/ml behandelt wurden, zeigen keine starke Aktivität der alkalischen Phosphatase. In der Mehrzahl der Fälle ist diese Aktivität selbst nach 35tägiger Inkubation kleiner gleich derjenigen, die in den Kontrollkulturen festgestellt wurde.
- In sämtlichen Fällen wurden die stärksten Aktivitäten der alkalischen Phosphatase in denjenigen Kulturen erzielt, welche der Behandlung Nr. 2 unterzogen wurden, und in denjenigen Kulturen, welche der Behandlung Nr. 3 unterzogen wurden. Bei Anwendung der Behandlung Nr. 2 wurde in fast allen Fällen eine Aktivität festgestellt, die bei mindestens 200 Nanomol para-Nitrophenol/30 min./Kavität lag und bis zu 700 Nanomol/30 min./Kavität erreichen konnte.
- Beim zytoenzymatischen Test zum Nachweis der Aktivität der alkalischen Phosphatase anhand von Zellkulturen, die nach 30tägiger Behandlungsdauer mit Formol fixiert wurden, wurden die folgenden Ergebnisse erzielt: Bei denjenigen Kulturen, welche der Behandlung Nr. 2 oder der Behandlung Nr. 3 unterzogen wurden, zeigt eine Mehrheit der Zellen eine positive Reaktion hinsichtlich der Aktivität der alkalischen Phosphatase. Die Zellen, welche diese Aktivität aufweisen, haben eine sternförmige Morphologie. Bei denjenigen Kulturen, welche der Behandlung Nr. 1 unterzogen wurden, zeigte nur ein geringer Anteil der Zellen eine positive Reaktion hinsichtlich der alkalischen Phosphatase, und diese Zellen wiesen eine spindelartige Morphologie auf. In den Kontrollkulturen kommen Zellen, die alkalische Phosphataseaktivität exprimieren, nur selten vor.
- Typ-I-Kollagen
- Die Kulturen, die während einer Zeitdauer von 30 Tage ausschließlich mit dem Kulturmedium geführt wurden (nicht behandelte Kontrollansätze), zeigten nur eine geringe Reaktion mit dem Anti-Typ-I-Kollagen-Antikörper. Diejenigen Kulturen, welche der Behandlung Nr. 1 unterzogen wurden, haben ebenfalls kaum mit diesem Antikörper reagiert. Diejenigen Kulturen, welche der Behandlung Nr. 2 unterzogen wurden, haben stark fluoreszierende knotige Strukturen entwickelt. Die Behandlung Nr. 3 hat nicht zur Bildung solcher Strukturen geführt, und es wurde lediglich eine schwache Fluoreszenz im Bereich einiger Zellanhäufungen festgestellt.
- Typ-II-Kollagen
- Nach 30 Tagen zeigten die behandelten Kulturen ebenso wie die Kontrollkulturen nur eine schwache fluoreszierende Markierung.
- Osteocalcin
- Die Kontrollkulturen oder auch diejenigen Kulturen, welche der Behandlung Nr. 1 unterzogen wurden, haben sehr schwach mit dem Anti-Osteocalcin-Antikörper reagiert. Diejenigen Kulturen, welche der Behandlung Nr.3 unterzogen wurden, zeigten einige Bereiche mit einer etwas intensiveren Markierung. Die stärkste Reaktion wurde bei den Kulturen, die ausschließlich mit Dexamethason behandelt wurden, erzielt. Die knotigen Strukturen, die in diesen Kulturen hervorgerufen worden sind, zeigen eine sehr starke fluoreszierende Markierung. Die umgebende Zellschicht hingegen wurde nicht markiert, und die Osteocalcinsynthese scheint sich auf die knotigen Strukturen zu beschränken.
- Untersuchung der Zellen mit dem Rasterelektronenmikroskop
- Die Kontrollzellen, die ausschließlich mit dem Kulturmedium inkubiert wurden, zeigen ein homogenes Erscheinungsbild mit einer recht kompakten Morphologie. Diejenigen Zellen, welche der Behandlung Nr. 1 unterzogen wurden, zeigen eine länglichere Morphologie. Diejenigen Kulturen, welche der Behandlung Nr. 3 unterzogen wurden, haben Zellen mit einem weniger einheitlichen Erscheinungsbild und einer unregelmäßigen Morphologie entwickelt. Bei denjenigen Kulturen, welche der Behandlung Nr. 2 unterzogen wurden, hat die Untersuchung mit dem Rasterelektronenmikroskop das Vorhandensein knotiger Strukturen aufgezeigt.
- In-vitro-Mineralisierung
- Nach 30 Tagen hatten die behandelten oder nicht behandelten Kulturen keinerlei mineralisierte extrazelluläre Matrix entwickelt.
- Nach 45 Tagen wurden bei den nicht behandelten Zellen lediglich einige sehr seltene mineralisierte Stellen beobachtet. Bei denjenigen Zellen, welche der Behandlung Nr. 1 oder der Behandlung Nr. 3 unterzogen wurden, konnte keinerlei mineralisierte Stelle nachgewiesen werden. Bei denjenigen Kulturen, welche der Behandlung Nr. 2 unterzogen wurden, wurden zahlreiche Mineralisierungsherde einschließlich mineralisierter Knötchen beobachtet.
Claims (10)
- Verfahren zur Induzierung einer osteoblastischen Ausdifferenzierung und/oder zum Erhalt von bei der osteoblastischen Ausdifferenzierung eingesetzten Zellen aus extramedullären Fettzellgewebezellen, bei dem man für eine ausreichende Zeit die Ausgangszellen in einem flüssigen Nährmedium inkubiert, das die Entwicklung der Zellen in Kultur erlaubt, wobei das Nährmedium wenigstens ein Glukokortikoid enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium frei von adipogenem Faktor und Osteoinduktionsfaktor ist, um die Zellen bei der Osteoblastenausdifferenzierung wirken zu lassen, und dadurch, daß die Ausgangszellen Humanzellen sind.
- Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Kulturmedium frei von Insulin ist.
- Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangszellen von maturierten Adipocyten befreit sind und/oder in der Lage sind, sich auf einer Polystyroloberfläche anzuheften.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem man die Zellen für eine ausreichende Zeit inkubiert, um eine Kultur zu erhalten, die wenigstens die beiden ersten der folgenden Merkmale aufweist: – Produktion von alkalischer Phosphatase vom Typ Knochen-Leber-Niere, – Produktion von Typ-I-Kollagen – Produktion von Osteocalcin, – Produktion von einer mineralisierten extrazellulären Matrix.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das Glukokortikoid gewählt ist unter Dexamethason, Hydrokortison, Prednisolon, Methylprednisolon, Prednison, Triamcinolon, Corticosteron, Fluocinolon, Kortison und Betamethason.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem man einen festen dreidimensionalen biokompatiblen Träger mit einer Suspension der Ausgangszellen imprägniert und man die Inkubation durchführt, indem man den so imprägnierten Träger in Kulturmedium eintaucht.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem man erhaltene, in der Osteoblastenausdifferenzierung eingesetzte Zellen aufnimmt und dann einen festen dreidimensionalen biokompatiblen Träger mit einer Suspension tränkt, die die aufgenommen Zellen enthält und, wenn gewünscht, die aufgenommenen Zellen kultiviert.
- Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, bei dem der feste dreidimensionale Träger wenigstens teilweise aus einem Material ausgeführt ist, das gewählt ist unter Calciumcarbonat, Hydroxyapatit, Calciumcarbonat, das auf der Oberfläche mit Hydroxyapatit bedeckt ist, und Keramiken.
- Verwendung als Zusatz zu einem flüssigen Nährmedium, das die Entwicklung von Humanzellen in Kultur erlaubt, von wenigstens einem Glukokortikoid als einzigem notwendigen Zusatz, um die osteoblastische Transformation von extramedullären Humanfettgewebezellen zu induzieren, die in dem Medium kultiviert sind, welches Kulturmedium frei von Proteinen mit Osteoinduktionswirkung und von adipogenem Faktor ist.
- Verfahren zur Herstellung eines Implantats, umfassend die folgenden Schritte: a) Erhalt von Zellen, die bei der osteoblastischen Ausdifferenzierung wirken, gemäß dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 8; b) Ausführung des Knochenimplantates aus den so erhaltenen Zellen.
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