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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet des "tissue engineering" im allgemeinen und insbesondere die
Identifizierung von Skelett-Vorläuferzell-Populationen
für die
Reparatur von Bindegeweben, einschließlich Skelettgeweben in vivo.
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Hintergrund
der Erfindung
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Knorpel
ist ein Gewebe, bestehend aus einem zellulären Bestandteil, Chondrozyten
und einer extrazellulären
Matrix, die typischerweise reich an Collagen-Typ-II sowie hoch sulfatierten,
hochmolekularen Proteoglycan-Aggregaten ist. Die letztere Eigenschaft
verleiht dem Knorpel seine besonderen histochemischen Eigenschaften,
die die folgenden sind: starke Anfärbung mit Elsassblau bei niedrigem
pH (von 0,2 bis 2,5) und Metachromasie mit Toluidinblau und Safranin
O. Der Überfluss
an Typ-II-Collagen, Bindungsprotein (link protein), und Proteoglycan-Aggrekan,
zusammen mit der Gegenwart von selteneren Collagenen, wie z.B. Typ-IX- und
Typ-XI-Collagen sind typische Eigenschaften von Knorpelgewebe. Bei
postnatalen Säugern
trägt Knorpel zu
der Struktur etlicher Organe und Systeme bei, wie z.B. der artikulären Oberfläche von
Diarthroidal-Gelenken und anderen Gelenk-assoziierten Strukturen,
wie z.B. dem Meniskus, dem Ohr, der Nase, dem Kehlkopf, der Trachea,
den Bronchien, Strukturen der Herzventile, Teile der Rippen, Synchondrosen,
Enthesen usw. An einigen der erwähnten
Stellen (z.B. den Enthesen, dem Annulus fibrosus der Intervertebralscheiben,
dem Meniskus, der Insertion von Ligamenten usw.) wird er im Hinblick
auf den Überfluss
an Collagenen (im wesentlichen Typ-I-Collagen) als Faserknorpel
bezeichnet. An anderen Stellen (z. B. der Ohrmuschel, Epiglottis
usw .) ist der Knorpel besonders reich an Elastin und wird elastischer
Knorpel genannt. Bei allen anderen Strukturen, einschließlich artikulärem Knorpel,
wird er aufgrund seines semitransparenten klaren Aussehens hyaliner Knorpel
genannt.
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Während der
Embryogenese der langen Knochen aggregieren und differenzieren Mesenchymzellen, um
Knorpelanlagen zu bilden, die die Form der zukünftigen langen Knochen bereitstellen.
Diese Knorpel-Matrizen entwickeln sich in der Entwicklung weiter,
durchlaufen eine endochondrale Knochenbildung über eine Kaskade von Ereignissen,
einschließlich
einer Chondrozyten-Hypertrophie, vaskulärer Invasion, Mineralisierung
und werden schließlich
durch Knochen ersetzt, außer
einer dünnen
Schicht an den Extremitäten
der Knochenelemente, die sich in die artikuläre Oberfläche von Diarthroidalgelenken
differenzieren wird. An diesen Stellen bleibt Knorpelgewebe über die
gesamte Lebenszeit eines Individuums hyalin. Es ist bekannt, dass
im Alter der artikuläre
Knorpel einen Prozess der Alterung durchläuft, was seine mechanischen
Eigenschaften und seine innewohnende Elastizität beeinflusst.
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Die
gängige
Therapie für
einen Verlust von Knorpelgewebe ist der Ersatz mit einem Prothesematerial, wie
z.B. Silikon, für
kosmetische Reparaturen oder Metallegierungen für eine Gelenksverbesserung.
Die Platzierung prothetischer Vorrichtungen ist jedoch ein sehr
künstlicher
Weg der Reparatur und ist in der Regel mit einem Verlust von darunterliegendem
Knochen assoziiert, ohne Wiedergewinnung der vollständigen Funktion, die
das ursprüngliche
Knorpelgewebe ermöglicht
hat. Schwerwiegende Langzeit-Komplikationen,
assoziiert mit der Gegenwart eines ständig vorliegenden Fremdkörpers, können eine
Infektion, Erosion und Instabilität beinhalten. Die Implantation
von sterilisierten Knochen Oder Knochenpulver mit chirurgischem
Stahl, eingesät mit
Knochenzellen, war im wesentlichen nicht erfolgreich und zwar aufgrund
der nicht degradierbaren Natur der Zellträger.
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Das
US-Patent Nr. 4,609,551 offenbart, dass Fibroblasten, die in vitro
mindestens drei Tage gegenüber
einem löslichen
Knochenprotein exponiert wurden, in der Lage sind, eine chondrogene
Reaktion in vitro und/oder in vivo zu stimulieren. Die aktivierten
Fibroblasten werden dann, indem sie mit einer bioabbaubaren Matrix
kombiniert werden oder durch intraartikuläre Injektion oder Anheftung
an Eigentransplantate und prothetische Vorrichtungen in vivo übertragen.
Der Nachteil dieses Verfahrens ist der, dass sich die Chondrogenese
nicht in Kurzzeitkulturen entwickeln kann und man muss sich in unerwünscht deutlicher
Weise auf die exponierten Fibroblasten an der Implantationsstelle
für die
Knorpelsynthese verlassen. EP-A-739,631 offenbart die Erzeugung
eines biologischen Materials, umfassend rekonstituiertes Knorpelgewebe
durch Anzüchten von
Chondrozyten auf einem flexiblen Blatt aus entmineralisierten natürlichen
Knochen mit einer Dicke von 1,5 mm. Dies wird sich jedoch nur dann
als nützlich
erweisen, wenn der Knochen nicht selbst abgeleitet ist, da die Ernte
von selbst abgeleitetem Knochen komplizierte und schmerzhafte Eingriffe
erforderlich macht.
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Gelenkoberflächen-Defekte
können
das Ergebnis verschiedener Äthiologien
sein, wie z.B. entzündlicher
Prozesse, Neoplasien, posttraumatischer und degenerativer Ereignisse
usw. Was immer der Grund sein mag, heilt Knorpel aufgrund seiner
begrenzten Fähigkeit
zur Reparatur nur schlecht mit bestenfalls Narbenbildung oder faserknorpeligem
Gewebe. Diese Teilreparatur der artikulären Oberfläche führt zu einer Osteoarthritis
und einer schweren funktionellen Dysfunktion. Basierend auf der
Tiefe der Verletzung werden zwei Arten von Gelenkoberflächendefekten
definiert, nämlich
die osteochondralen (oder "full-thickness" oder vollschichtigen)
und die oberflächlichen
(oder teilschichtigen).
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Osteochondrale
(oder vollschichtige) Gelenk-Oberflächendefekte
beinhalten Schäden
an dem artikulären Knorpel,
dem darunterliegenden subchondralen Knochengewebe und der verkalkten
Schicht des Knorpels, lokalisiert zwischen dem artikulären Knorpel
und dem subchondralen Knochen. Sie ergeben sich typischerweise durch
schwere Traumata der Gelenke oder während der späten Stufen
von degenerativen Gelenkerkrankungen, z.B. während der Osteoarthritis. Da
das subchondrale Knochengewebe sowohl innerviert als auch vaskularisiert
ist, kann ein Schaden an diesem Gewebe schmerzhaft sein. Osteochondrale
Defekte verlassen sich auf extrinsische Mechanismen für ihre Reparatur.
Die extrinsische Heilung verlässt
sich auf mesenchymale Elemente aus dem subchondralen Knochen oder
Gelenk-assoziierten Geweben zur Teilnahme an der Bildung von neuem
Bindegewebe, einschließlich
Skelettgewebe. Dieses Reparaturgewebe kann zur Bildung von Faserknorpel
metaplastische Veränderungen
durchlaufen, der jedoch dann nicht dieselbe biochemische Zusammensetzung
oder mechanischen Eigenschaften, wie gewöhnlicher artikulärer Knorpel
oder subchondraler Knochen zeigt und mit der Verwendung degeneriert.
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Oberflächliche
oder teilschichtige Verletzungen von artikulärem Knorpel, die nicht in den
subchondralen Knochen vordringen, können sich nur auf einen intrinsischen
Mechanismus für
die Reparatur verlassen. Chondrozyten, die den verletzten Oberflächen benachbart
sind, zeigen kurz nach einer oberflächlichen Verletzung einen kurzen
Ausbruch mitotischer Aktivität,
assoziiert mit einem Anstieg der Stoffwechsel-Aktivität und Matrixsynthese.
Trotz dieser Reparaturversuche gibt es keinen deutlichen Anstieg
der Masse von Knorpelmatrix und der Reparaturprozess ist bei der
Heilung der Defekte nur selten effektiv. Obwohl sie anfänglich manchmal
schmerzlos sind, können
teilschichtige Defekte häufig
zu einer Osteoarthritis des betroffenen Gelenks degenerieren.
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Dia
Reparatur von artikulären
Knorpeldefekten mit Suspensionen von Chondrozyten wurde bei einer Vielzahl
von Tiermodellen durchgeführt
und wird nun bei Menschen verwendet (Brittberg et al. N Engl J Med.; 331
(14): 889–95).
Autologe Chondrozyten, die von dem nicht betroffenen Bereich des
Gelenks erhalten wurden, werden freigesetzt, in vitro in Gegenwart
von autologem Serum expandiert und darauffolgend unter einen Periostlappen
injiziert, vernäht,
um den Knorpeldefekt abzudecken. Dieses Verfahren hat zu einer bewiesenen, zumindest
symptomatischen Verbesserung geführt.
Dieser vielversprechende Ansatz hat jedoch immer noch weite Bereiche,
die verbessert werden können,
da bekannt ist, dass die in-vitro-Expansion von Chondrozyten nach
einer begrenzten Anzahl von Zellteilungen zu einem Verlust ihrer
phänotypischen
Stabilität
führt (definiert durch
die Fähigkeit
von Chondrozyten, in vitro, aber auch in vivo hyalinen Knorpel zu
bilden), was dazu führt, dass
die zu injizierende Zellsuspension nicht verlässlich ist.
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Drei
alternative Ansätze
wurden in einem Versuch entwickelt, die Erfolgsrate bei der Behandlung
von artikulären
Knorpeldefekten bei Säugern
zu verbessern. Bei dem ersten Ansatz werden synthetische Trägermatrizes
mit Chondrozyten imprägniert
und dann in den Knorpeldefekt implantiert, wo man hofft, dass sie
Bestandteile produzieren und sezernieren, die zur extrazellulären Matrix
gehören,
um artikulären
Knorpel an der Stelle des Defekts zu bilden. Eine Vielzahl synthetischer
Trägermatrizes
wurde bis jetzt verwendet und diese beinhalten dreidimensionale
Collagengele (z.B. US-Patent Nr. 4,846,835), rekonstituierte Fibrin-Thrombin-Gele
(z.B. US-Patent Nrn. 4,642,120; 5,053,050 und 4,904,259), synthetische
Polymermatrizes, enthaltend Polyanhydrid, Polyorthoester, Polyglykolsäure und
Copolymere davon (US-Patent Nr. 5,041,138) und auf Hyaluronsäure basierende
Polymere. Sobald eine mitotisch expandierte Population von Chondrozyten
erhalten wird, können
die Zellen entweder zurück
in dasselbe Subjekt implantiert werden, von dem die Elternzellen
ursprünglich
abstammten (autologe Implantation), oder in ein anderes Subjekt
(heterologe Implantation). Zusätzlich kann die
heterologe Implantation Chondrozyten verwenden, die von verwandten
oder nicht verwandten Individuen derselben Art (allogen), oder von
einer anderen Art (xenogen) erhalten wurden. Alternativ können Chondrozyten
von einer etablierten Langzeitzellinie, die entweder allogen oder
xenogen ist, erhalten werden.
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Die
autologe Implantation macht es nötig,
dass Chondrozyten von einem nicht betroffenen Bereich der Gelenkoberfläche von
dem Patienten geerntet und dann in einer in-vitro-Kultur zu einer
ausreichenden Zahl oder Dichte für
eine effektive Implantation expandiert werden. Die benötigte Zeitmenge
für eine
solche ausreichende Expansion kann jedoch die effektive Verwendung
einer autologen Kultur ausschließen, da einige Knorpelreparaturen
sofort oder innerhalb einer kurzen Zeitspanne nach dem Auftreten
der traumatischen Verletzung durchgeführt werden sollten. Eine andere
Begrenzung ist das mitotische Potenzial der Zellen, da es eine Begrenzung
der Anzahl von Malen gibt, die Zellen expandiert werden können und
da die ultimative Quantität von
Zellen, die für
eine Therapie erzeugt werden, begrenzt sein kann. Wenn zusätzlich eine
schwere schädigende
Gelenkstörung
zu einem generellen Abbau von Knorpelgewebe im gesamten Körper des
Patienten führt,
nämlich
z.B. bei älteren
Leuten, kann nur sehr wenig nicht betroffenes Knorpelgewebe zur
Verfügung
stehen, von dem aus man eine Chondrozytenkultur beginnen könnte. Die
Einführung
heterologer Chondrozyten in einen Patienten kann andererseits eine
unerwünschte
Immunreaktion stimulieren, die gegen das implantierte Material gerichtet
ist, was zu einer potenziellen Abstoßung des neu gebildeten und
transplantierten Knorpelgewebes führen kann. Zusätzlich beinhaltet
die heterologe Implantation das Risiko einer Übertragung infektiöser Mittel,
die in dem Gewebe oder der Zellinie vorliegen können, an den Betroffenen.
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Wenn
außerdem
synthetische Trägermatrizes
verwendet werden, kann Neoknorpel um die Peripherie des Implantats
gebildet werden und verhindert dadurch die Integration des Implantats
in den Knorpeldefekt. Die Überwachung
der Bildung und Entwicklung des resultierenden synthetischen Knorpels
in situ ist in der Durchführung
schwierig und involviert in der Pegel eine arthroskopische oder
offene Gelenküberprüfung. Weiterhin
können
Implantate, die synthetische Polymerbestandteile enthalten, für die Reparatur
großer
Knorpeldefekte ungeeignet sein, da die in-situ-Polymerhydrolyse
die Bildung von Knorpel und/oder seine Integration in den Defekt
inhibiert.
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In
dem zweiten Ansatz wird der Defekt mit einer biokompatiblen, bioabbaubaren
Matrix gefüllt,
die chemotaktische und mitogene Wachstumsfaktoren enthält, um das
Einwandern von Chondrozyten-Vorläuferzellen in
die Matrix in situ zu stimulieren. Die Matrizes enthalten optimalerweise
Poren von ausreichenden Dimensionen, um das Einwandern und die Proliferation
der Chondrozyten-Vorläufer
in die Matrix zu erlauben. Die Matrix kann auch Wachstumsfaktoren
enthalten, um die Differenzierung von Chrondrozyten-Vorläuferzellen
zu Chondrozyten zu stimulieren, die wiederum extrazelluläre Matrixbestandteile
sezernieren, um Knorpel an der Stelle des Defekts in situ zu bilden
(z.B. US-Patente Nrn. 5,206,023 und 5,270,300 und EP-A-530,804).
Dieser Ansatz führt
jedoch zu ähnlichen
Problemen wie denen, die mit dem oben beschriebenen ersten Ansatz
assoziiert sind. Weiterhin gibt es bis jetzt keine Daten, dass artikulärer Knorpel
chondrozytische Vorläufer
enthält, die
für eine
Reparatur von teilschichtigen Defekten zur Verfügung stünden.
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In
einem dritten Ansatz können
die Chondrozyten in vitro kultiviert und expandiert werden, um dadurch synthetisches
knorpelähnliches
Material zu bilden, das darauffolgend in den Knorpeldefekt implantiert
wird. Dies hat gegenüber
den vorherigen Verfahren den Vorteil, dass die Entwicklung von synthetischem
Knorpelmaterial durch morphologische und biochemische Charakterisierung
vor der Implantation überwacht
werden kann. Das Anzüchten
chondrogener Zellen kann entweder in anchor-abhängiger oder anchor-unabhängiger Weise
geschehen. Bei dem letzteren können
die chondrogenen Zeilen als Kolonien in einem Agarosegel kultiviert
werden. Bis jetzt wurden nur kleine Stücke von Knorpelgewebe von undefinierter
Form unter Verwendung dieser Möglichkeit
erzeugt. Weiterhin verbleibt der resultierende Knorpel in einer
Gelmatrix eingebettet, was ihn für
eine Implantation bei Säugern
weniger geeignet macht. In einem weiteren, anchorunabhängigen Verfahren
können
die Chondrozyten als Kolonien in Suspensionskultur gezüchtet werden.
Die resultierenden Teilchen, enthaltend synthetisches, Knorpel-ähnliches
Material, sind jedoch in der Regel klein und von undefinierter Form,
was sie für
eine Implantation und Reparatur eines bestimmten Knorpeldefekts
unbrauchbar macht. Dies würde
statt dessen zu etlichen kleinen Stücken von Knorpel führen, die
vollständig
voneinander getrennt sind und weit davon entfernt, untereinander
und in dem umgebenden knorpelartigen Gewebe gut integriert zu sein.
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Bei
dem anchor-abhängigen
Verfahren werden Primärkulturen
von chondrogenen Zellen, isoliert aus Primärgewebe, als Monolayer, angehaftet
an die Oberfläche
einer Zellkulturflasche, gezüchtet
(z.B. US-Patent Nr. 4,356,261). Die direkt von Explantatgewebe abgeleiteten
Primärzellen
behalten ihre Fähigkeit,
extrazelluläre
Bestandteile zu produzieren und zu sezernieren, die für natürlichen
Knorpel charakteristisch sind, insbesondere Typ-II-Collagen und
sulfatierte Proteoglycane. Es ist jedoch wohlbekannt, dass während der
in-vitro-Expansion in Monolayer die Chondrozyten dedifferenzieren
und ihre Fähigkeit
zur in-vivo-Organisation von hyalinem Knorpel verlieren. Bis jetzt
war es nicht möglich,
große
Stücke
von artikuläre
Knorpeln aus kleinen Stücken
von Biopsiegewebe während
der anchor-abhängigen
Verfahren von US-Patent Nr. 4,356,261 herzustellen.
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Um
die obigen Probleme zu lösen,
stellt US-Patent Nr. 5,723,331 ein Verfahren zur in-vitro-Herstellung von
großen Mengen
synthetischer Knorpel aus kleinen Proben von Biopsiegewebe bereit,
das, basierend auf der Entdeckung, dass chondrogene Zellen aus einer
Vielzahl von Geweben isoliert werden können, z.B. vorher existierendem
Knorpel, perichondrialem Gewebe oder Knochenmark und in-vitro vor
der Knorpelbildung expandiert werden können, eine erste Aussaat beinhaltet
und zwar von nackten (d.h. von enzymatisch oder mechanisch desaggregiertem
Gewebe isolierten) chondrogenen Zellen, proliferiert ex vivo, in
eine vorher geformte Vertiefung mit einer zellkontaktierenden, zell-adhäsiven Oberfläche und
dann Kultivierung der proliferierenden chondrogenen Zellen in der
Vertiefung für
eine ausreichende Zeit, damit die Zellen eine extrazelluläre Matrix
sezernieren können,
um dadurch einen dreidimensionalen, vielzellschichtigen Flecken
aus synthetischem Knorpel zu bilden.
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Ein
weiterer Nachteil dieser Verfahren ist derjenige, dass die Chondrozyten
von dem Patienten, typischerweise durch eine Biopsie erhalten, in
Kultur expandiert und dann auf eine Matrix implantiert werden müssen. Dies
ist bei Labortieren relativ einfach, führt jedoch beim Menschen zu
größeren logistischen
Problemen, wenn ein Defekt durch eine Biopsie erzeugt wird, die
benötigt
wird, um Zellen für
eine Reparatur eines anderen Defekts bereitzustellen. Wenn der Defekt
weiterhin einen Teil des darunterliegenden Knochens beinhaltet,
wird dies unter Verwendung von Chondrozyten nicht korrigiert, die
bereits differenziert sind und keine neuen Knochen bilden werden.
Der Knochen ist nötig,
um den neuen Knorpel zu stützen.
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Die
Verwendung von Mesenchymzellen wurde ebenfalls für die Reparatur etlicher Gewebe,
einschließlich
Knorpel, vorgeschlagen. Mesenchymstammzellen sind eine potenzielle
alternative Quelle für
Knorpel-produzierende Zellen. Sie sind im allgemeinen als pluripotente
Zellen anerkannt, die sich vielfach teilen können, um Vorläuferzellen
zu erzeugen, die schließlich
zu Bindegeweben werden können,
einschließlich Knorpel,
Knochen, Sehnen, Ligamenten, Knochenmarkstroma. Per definitionem
sind sie nicht auf eine bestimmte Anzahl mitotischer Teilungen begrenzt.
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Stammzellen
sind als Zellen definiert, die nicht differenziert sind, die sich
ohne Begrenzung teilen können,
um Zellen zu ergeben, die entweder Stammzellen sind oder Zellen,
die sich weiter differenzieren, um verschiedene Arten von Vorläuferzellen,
einschließlich
Mesenchym-Stammzellen zu ergeben. Diese Mesenchym-Stammzellen sind
pluripotente Zellen, die in der Lage zu einer Differenzierung zu
jeder Art von spezifischen Mesenchym- oder Bindegeweben sind, einschließlich Skelettgeweben.
Mesenchym-Stammzellen wurden aus Knochenmark oder anderen Quellen,
wie z.B. dem Periost, der Plazenta, der Nabelschnur, der Haut und
dem Blut (z.B. in US-Patent Nr. 5,811,094) isoliert. Pluripotente
Mesenchym-Stammzellen
wurden auch aus dem Muskel (Pate et al., Proc. 49th Ann. Sess. Forum
Fundamental Surg. Problems Oktober 1993, 587-9), dem Herzen (Dalton
et al., J. Cell Biol. 1993, 119 R202) und Granulierungsgewebe (Lucas
et al., J. Cell. Biochem. 1993, 122 R212) isoliert. Die Pluripotenz
wurde unter Verwendung eines nicht-spezifischen Induktors, Dexamethason,
demonstriert, der eine Differenzierung der Stammzellen zu Chondrozyten
(Knorpel), Osteoblasten (Knochen), Myoblasten (myotubes) (Muskeln),
Adipozyten (Fett) und Bindegewebszellen hervorruft.
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Unglücklicherweise
gibt es keinen bekannten spezifischen Induktor der Mesenchym-Stammzellen,
der nur Knorpel ergibt, obwohl es sehr wünschenswert wäre, Stammzellen
zu haben, die aus einer Muskel- oder Hautbiopsie einfach erhalten
werden können,
kultiviert werden können,
um große
Anzahlen zu ergeben und dann verwendet werden können als Quelle für Chondrozyten
oder Osteoblasten oder Myozyten, In-vitro-Studien, worin eine Differenzierung
erreicht wird, ergeben eine Mischung von Zelltypen. In den US-Patenten
Nrn. 5,226,914 und 5,197,985 wurden die Zellen in poröse Keramikblöcke ausgesät und – subkutan
in Nacktmäuse implantiert – ergaben
sie im wesentlichen Knochen. US-Patent Nr. 5,906,934 offenbart jedoch,
dass unter sehr spezifischen Bedingungen Mesenchym-Stammzellen in
einem geeigneten polymeren Träger
(wie z.B. einem Polyglykolsäuresieb),
implantiert in einen Knorpel und/oder Knochendefekt, genau nach
Wunsch, zur Bildung von Knorpel und/oder Knochen differenzieren.
Außerdem
offenbart US-Patent Nr. 5,919,702 Chondrozyten-Vorläuferzellen,
isoliert aus Nabelschnurquellen, z.B. von Wharton's Jelly, die kultiviert
werden, um zu Chondrozyten zu werden, die Knorpelgewebe produzieren
können.
In einem weiteren Versuch, die Nachteile von den gegenwärtigen Knorpel-
und Knochen-Reparaturtechniken zu vermeiden, die zu Blutungen führen und die
Verwendung von mechanisch schwachen, nicht selbst abgeleitetem Material
involvieren, schlägt
US-Patent Nr. 5,866,415 die Behandlung von Knorpel- oder Knochendefekten
mit einem biologischen Material vor, erhalten durch in-vitro-Anbindung
von Knorpel- oder
Knochen-bildenden Zellen an ein Periost von geeigneter Größe, um den
Defekt zu behandeln.
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WO/96/41523
und WO96/41620 beschreiben die Verwendung von FGFR3 als Marker für Mesenchym-skelettalen
Vorläuferzellen.
Solche Zellen exprimieren jedoch FGFR3, von dem durch die gegenwärtigen Erfinder
festgestellt wurde, dass er eine Differenzierung in nicht-pluripotente
Zellen vom Prächondroblastentyp beim
Menschen indiziert. Daher unterscheiden sich durch diese bekannten
Verfahren selektierte Zellen von den Vorläuferzellen, die gemäß der vorliegenden
Erfindung selektiert werden.
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1 zeigt
die hierarchische Kaskade von Zellen im Differenzierungsprozess
schematisch, ausgehend von den nichtdifferenzierten Mesenchym-Stammzellen,
bis hin zu den vollständig
differenzierten Skelettzellen. US-Patent Nr. 5,811,094 beschreibt
Verfahren zur Identifikation, selektiven Isolierung und Anreicherung von
mesenchymalen Stammzellen durch Kulturexpansion. Dieses Patent stellt
keine Verfahren für
eine Isolierung, Reinigung und kulturelle Expansion von skelettalen
Vorläuferzellen
bereit, den Verfahren, die der Zweck der vorliegenden Erfindung
sind. Unsere Bemühungen
fokussierten sich auf die skelettalen Vorläuferzellen, wie hiernach definiert,
wobei die molekulare Kaskade von Ereignissen, die den Differenzierungswegen
zugrunde liegen, die zu den spezialisierten Zellen der Skelettgewebe
führen,
aufgedeckt wurden, wobei der Erzeugung stabiler Chondrozyten besondere
Aufmerksamkeit gewidmet wurde. Es wird angenommen, dass stabile Chondrozyten
stabile Knorpel in vivo und/oder in vitro unter den geeigneten Bindungen
bilden können.
Unter stabilem Knorpel wird verstanden, dass keinerlei Zeichen einer
Knochenbildung vorliegen, selbst nach längeren Zeitspannen.
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Transformations-Wachstumsfaktor-beta
("TGF-β") bezeichnet eine
Familie verwandter dimerer Proteine, die das Wachstum und die Differenzierung
vieler Zelltypen regulieren. Mitglieder dieser Familie beinhalten TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF-β5, morphogene
Proteine ("MP") wie z.B. MP-121
und MP-52, Inhibine/Aktivine (wie offenbart z.B. in EP-A-222,491),
osteogene Proteine ("OP"), Knochenmorphogenetische Proteine
(hiernach bezeichnet als "BMP"), Wachstums/Differenzierungsfaktoren
("GDF"), wie z.B. GDF-1, GDF-3,
GDF-9 und Nodal. TGF-β wurde
zunächst
im Hinblick auf seine Wirkungen auf die Zellproliferation charakterisiert.
Es stimulierte das anchor-unabhängige
Wachstum von Rattennieren-Fibroblasten
und inhibierte auch das Wachstum von Affen-Nierenzellen. Es wurde gezeigt, dass
TGF-β-Familienmitglieder
viele unterschiedliche biologische Wirkungen zeigen, z.B. regulieren
sie die Knochenbildung, induzieren Patten-Muskelzellen zur Produktion von knorpelspezifischen
Makromolekülen,
inhibieren das Wachstum früher
hämatopoetischer
Vorläuferzellen,
T-Zellen, B-Zellen, Maus-Keratinozyten
und etlicher menschlicher Krebszellinien. TGF- β-Familienmitglieder
erhöhen
die Synthese und Sekretion von Collagen und Fibronektin, beschleunigen die
Heilung von Schnittwunden, unterdrücken die Caseinsynthese bei
Maus-Brust-Explantaten,
inhibieren die DNA-Synthese bei Rattenleber-Epithelzellen, stimulieren
die Produktion von BFGF-Bindungs-Proteoglykanen, modulieren die
Phosphorylierung des epidermalen Wachstumsfaktor ("EGF") -Rezeptors und
die Proliferation von Epidermoid-Karzinomzellen und können zu
einer Apoptose bei Gebärmutter-Epithelzellen,
kultivierten Hepatozyten und sich rückbildender Leber führen. TGF-βs können eine
Kardioprotektion gegen eine Reperfusionsverletzung durch Inhibition
der neutrophilen Adhärenz
an das Endothel vermitteln und schützen gegen experimentelle Autoimmunerkrankungen
bei Mäusen.
Insgesamt sind die Proteine der TGF-β-Familie multifunktionelle,
hormonell aktive Wachstumsfaktoren und weisen auch verwandte biologische
Aktivitäten
auf, wie z.B. eine chemotaktische Attraktion von Zellen, eine Unterstützung der
Zelldifferenzierung und gewebsinduzierende Fähigkeiten. Unterschiede in
ihrer Struktur und in ihrer Affinität für Rezeptoren führen zu
bemerkenswerten Variationen im Hinblick auf ihre exakte biologische
Funktion.
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Gegenüber den
vorstehenden Berichten über
die Fähigkeit
von TGF-β zur
Induktion der Erzeugung von Knorpel-spezifischen Makromolekülen in Muskelzellen
und Chondrozyten wurde festgestellt, dass TGF-β synergistisch mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor zur
Inhibition der Synthese von Collagen-Typ-II durch Hühner Sternum-Chondrozyten und
bei Ratten-Chondrozyten
wirkt. Tatsächlich
hat sich TGF-β als
prototypischer Inhibitor der Proliferation der meisten normalen
Zelltypen in vitro wie auch in vivo erwiesen und übt eine bemerkenswerte
Diversität
einer biologischen Aktivität
aus. TGF-β 1
wurde aus menschlichen und Schweineblut-Thrombozyten gereinigt und rekombinantes
TGF-β 1
ist zur Zeit erhältlich.
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Innerhalb
der Subfamilie von BMPs wurden die Strukturen von BMP-1 bis BMP-13
bereits früher
erhellt. Die einzigartigen induktiven Aktivitäten dieser Proteine, zusammen
mit ihrer Gegenwart im Knochen, legen nahe, dass sie wichtige Regulatoren
von Knochen-Reparaturprozessen sind und an dem normalen Erhalt von
Knochengewebe beteiligt sein könnten.
Kürzlich
wurde gezeigt, dass die BMP-12-verwandte Unterfamilie von Proteinen,
einschließlich
BMP-13 und MP52 (siehe z.B. WO93/16099 und US-Patent Nr. 5,658,882)
in Zusammensetzungen für
die Induktion von Sehnen/Ligament-ähnlicher
Gewebsbildung und Reparatur geeignet sind. Das US-Patent Nr. 5,902,785
offenbart, dass BMP-12-verwandte Proteine insbesondere für die Induktion von
Knorpelgewebe nützlich
sind und dass BMP-9 für
die Erhöhung
der Proteoglykan-Matrix-Synthese und daher den Erhalt von Knorpelgewebe
nützlich
ist. Es beschreibt auch Zusammensetzungen, umfassend ein BMP-12-verwandtes
Protein und zusätzlich
beinhaltend ein oder mehr TGF-β-Proteine,
die sich als osteogen erwiesen haben, vorzugsweise BMP-2, -4, -5,
-6 und/oder BMP-7 als nützlich
für die
Regeneration von multiplen Gewebstypen (z.B. einer Grenzfläche oder
Bindung zwischen Geweben) und insbesondere für die Behandlung von artikulärem Knorpel,
worin die artikuläre
Oberfläche,
Knorpel, subchondraler Knochen und/oder "Tidemark"-Grenzfläche zwischen
Knorpel und Knochen repariert werden müssen. Dasselbe Patent beschreibt weiterhin
Zusammensetzungen, umfassend ein BMP-12-verwandtes Protein, zusammen
mit einem Protein, das für
den Erhalt von Chondrozyten oder Knorpelgewebe geeignet ist, wie
z.B. BMP9, wobei diese Zusammensetzungen insbesondere für die Induktion
und den Erhalt von Knorpelgewebe an einer Stelle, die einer Knorpelreparatur
bedarf, wie z.B. an einem artikulären Knorpeldefekt, nützlich sind.
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W096/14335
offenbart unter Verwendung einer mRNA, hergestellt von artikulärem Knorpel
von Neugeborenen, die Isolierung von zwei Mitgliedern der BMP-Familie,
bezeichnet als Knorpel abgeleitete morphogenetische Proteine-1 und
-2 (CDMP-1, CDMP-2). Insbesondere offenbart W096/14335 einen gereinigten Knorpelextrakt,
der eine lokali Knorpelbildung stimuliert, wenn er mit einer Matrix
kombiniert und in einen Säuger
implantiert wird, wobei der Extrakt durch den Erhalt von Knorpelgewebe,
Homogenisieren des Knorpelgewebes in Gegenwart von chaotropen Agenzien
unter solchen Bedingungen, die eine Abtrennung der Proteine aus
Protoglykanen ermöglicht,
Abtrennen der Proteine von den Proteoglykanen und Erhalt der Proteine
erzeugt wird. Es offenbart auch ein isoliertes DNA-Molekül, kodierend
ein Protein mit einer chondrogenen Aktivität in vivo, jedoch substanziell
ohne osteogene in-vivo-Aktivität. Die Rolle
von CDMP-1 als Regulator des Skelettwachstums ist nun gut dokumentiert.
Storm et al. (1994) in Nature 368, 639-43 und Chang et al. (1994) in
J. Biol. Chem. 269, 28227-34 etablierten unabhängig, dass CDMP-1 nahe an dem
Brachypodismus locus auf Chromosom 2 bei Mäusen kartiert werden konnte
und an dem Brachypodismus-Phänotyp
beteiligt sein kann. Die Expressionsmuster von CDMP's legen auch eine
wichtige Rolle für
diese Gene in der Gelenk-Morphogenese
nahe. W098/59035 offenbart auch ein Verfahren zum Erhalt eines knorpelartigen
Phänotyps
in Chondrozyten in vitro, umfassend das Kultivieren der Chondrozyten
in serumfreiem Medium, enthaltend ein CDMP und/oder BMP. Tabelle
1 unten fasst die BMP-Superfamilienmitglieder bei Säugern zusammen
(Reddi AH, Nature Biotechnol. 1998, 16: 247-52).
-
-
Andere
Familien von Wachstumsfaktoren spielen offensichtlich eine Rolle
bei der Knorpel-Differenzierung und ihrem Erhalt. Unter diesen sind
die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) eine Familie von Polypeptid-Wachstumsfaktoren,
die in einer Vielzahl von Aktivitäten involviert sind. Einer
ihrer Rezeptoren, FGF-Rezeptor 3 (FGFR-3) (Keegan K. et al., 1991
Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 1095-99) spielt bekanntlich eine Schlüsselrolle
bei der Chondrogenese. Punktmutationen im fgfr3-Gen, die zu einem
Liganden-unabhängigen konstitutiv
aktiven Protein führen
(was bedeutet, dass die FGF-Signalbildung
auch in Abwesenheit des Liganden immer aktiv ist) führen zu
Skelett-Abnormalitäten,
wie einer Achondroplasie und einer thanatophoren Dysplasie.
-
Wie
bereits oben ausgeführt,
hat die autologe Chondrozyten-Transplantation
("ACT"), obwohl sie zu einer
breit akzeptierten Technik zur Reparatur von Gelenkoberflächen-Defekten ("JSD") führt, immer
noch etliche Nachteile. Im Detail impliziert dieses Verfahren eine
in-vitro-Expansion – in
Gegenwart von autologem Serum – von
autologen Chondrozyten, erhalten aus einem nicht betroffenen Bereich
der Gelenkoberfläche,
gefolgt von einer Implantation der Chondrozyten-Suspension, unter
einem Periostlappen vernäht,
um den Gelenkoberflächen-Defekt
zu versiegeln. Eine Zellexpansion ist notwendig, um aus einer kleinen
Knorpel-Biopsie eine
Anzahl von Zellen zu erhalten, die für die Reparatur des Knorpeldefekts
ausreicht. Es ist jedoch, wie vorher erklärt, wohlbekannt, dass die in-vitro-Expansion
von Chondrozyten zu einer Zell-De-Differenzierung führt. Dies
legt nahe, dass die Chondrozyten-Expansion den Preis für den Verlust
der phänotypischen
Stabilität zahlt.
Daher ist eine Qualitätskontrolle
für expandierte
Chondrozyten, die für
eine ACT verwendet werden sollen, nötig. Am Ende der Zellexpansion
besteht die Chondrozyten-Population aus einigen Zellen, die ihre
phänotypische
Stabilität
beibehalten haben und anderen, die noch immer proliferieren können, jedoch
nicht mehr zur Knorpelreparatur beitragen werden. Um eine konsistente
Zellsuspension für
ACT zu erhalten ist es wünschenswert,
stabile Chondrozyten innerhalb der expandierten Zellpopulation zu
selektieren. Chondrozyten sind Skelettzellen, die in der Lage sind,
in anchor-unabhängigen
Agarosekulturen zu wachsen. Die Fähigkeit von Chondrozyte zum
Wachstum unter anchor-unabhängigen
Bedingungen ist kritisch für
diese Zellen zum Überleben
und zum Organisieren von Knorpelgewebe, sobald sie als Zellsuspension
für eine
Reparatur von JSD injiziert wurden, ist jedoch vermutlich nicht
das einzige nötige
phänotypische
Kennzeichen.
-
Daher
besteht ein Bedarf auf dem Gebiet an einer Identifikation und Selektion
einer einfach zugänglichen
und expandierbaren Quelle pluripotenter skelettaler Vorläuferzellen.
Es besteht ein Bedarf auf dem Gebiet zur Lösung der verschiedenen Probleme,
die bei den bekannten Knorpel-Reparaturverfahren angetroffen werden.
Es besteht auch ein Bedarf auf dem Gebiet zur Entwicklung von Reparaturtechniken
für Bindegewebe einschließlich Knorpel,
z.B. für
medizinische Probleme, wie z.B. die rheumatoide Arthritis und die
Osteoarthritis und ein lang gespürter
Bedarf an einer Qualitätskontrolle
für Chondrozyten-Populationen, die
für solche
Zwecke verwendet werden. Es gibt eine Anzahl von Vorschlägen im Stand
der Technik, dass einige Mesenchym-Stammstellen spezifisch Knorpel
ergeben könnten
oder, falls nötig,
andere Bindegewebe. Knochenmark enthält z.B. Populationen pluripotenter
Mesenchym-Stammzellen mit einer Fähigkeit zur Differenzierung
in einen breiten Bereich von Zelltypen der mesenchymalen, hämatopoetischen
und Stroma-Zellinien.
Es ist auch bekannt, dass in vitro kultivierte Mesenchym-Stammzellen
zu einer Differenzierung in Knorpel oder Knochen in vivo und in
vitro induziert werden können,
abhängig
von der Gewebsumgebung oder dem Kulturmedium, in das die Zellen
platziert werden. Bis jetzt wurden jedoch nur sehr wenige gemeinsame
Zellmarker oder Differenzierungsantigene identifiziert. Beispiele
für solche
Marker beinhalten Ly-6-Antigene
für murine
Osteoblasten (siehe Horowitz et al. (1994) in Endocrinology, 135,
1032-43) und CD34 für
menschliche hämatopoetische Zelltypen.
Andererseits ist es bekannt, dass das Periost und Knochenmark die
gewöhnlichsten
Quellen für
Vorläuferzellen
mit osteogenem Potenzial sind. Insbesondere wurde gezeigt, dass
Zellen aus dem Knochenmark, wenn sie durch das Kulturverfahren von
Friedenstein isoliert und expandiert wurden, Knochen, Knorpel und fibröses Gewebe bilden
werden, wenn sie implantiert werden. Friedenstein gab jedoch in
Calcif. Tiss. Int. (1995) 56(S):S 17 zu, dass Hindernisse, wie z.
B. der Bedarf an einer Kultivierung über etliche Passagen und der
Entwicklung eines Verfahrens zur Transplantation solcher Zellen überwunden
werden müssen,
bevor die klinische Nützlichkeit
dieser Entdeckung bestätigt
werden kann. Daher besteht ein Bedarf auf dem Gebiet für eine gute
Identifizierung pluripotenter skelettaler Vorläuferzellen in einem breiten
Bereich von einfach zugänglichen
und expandierbaren Quellen. Diese Ziele und andere Zwecke werden
durch die folgenden Aufgaben der vorliegenden Erfindung erreicht.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Eine
erste Ausgabe der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung
und Charakterisierung von skelettaler Vorläuferzellen in einem breiten
Bereich von einfach zugänglichen
und expandierbaren Quellen. Einfach zugängliche Gewebe beinhalten unter
anderem Periost, Knochenmark und die Synovialmembran. Die Lösung für dieses
Problem gemäß der vorliegenden
Erfindung ist die Verwendung von einem Satz molekularer Marker.
Diese molekularen Marker können
entweder positive Marker sein, die Vorläuferzellen anzeigen, die pluripotent
sind oder negative Marker, die anzeigen, dass die Zellen sich differenziert
haben und nicht mehr pluripotent sind. Die Abwesenheit eines negativem
Markers kann als positiver Marker verwendet werden. Eine zweite
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung solcher skelettaler
Vorläuferzellen
und molekularer Marker für
die Reparatur eines breiten Bereichs von Bindegeweben. Eine dritte
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung solcher skelettaler
Vorläuferzellen
als Quelle für
Transformations-Wachstumsfaktoren
("TGF"), verbunden mit
der phänotypischen
Stabilität
einer bestimmten Zellpopulation, die in einem bestimmten Differenzierungsweg
involviert ist, wie z.B. Mitglieder der TGF-β-Familie, die positiv mit der phänotypischen
Chondrozyten-Stabilität
assoziiert sind. Eine vierte Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist die Verwendung solcher skelettaler Vorläuferzellen und molekularer
Marker als Matrix, die Zellen bei tissue-engineering-Verfahren erzeugt.
Eine fünfte
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Coimplantation von expandierten
skelettalen Vorläuferzellen
und Chondrozyten für
eine in-vivo-Knorpelreparatur.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine schematische Darstellung der hierarchischen Kaskade von Zellen
in den Differenzierungswegen.
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2 ist
ein Bild, das die skelettalen Vorläuferzellen zeigt, die CDMP-1
exprimieren.
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3 zeigt,
wie der Phänotyp
von skelettalen Vorläuferzellen
nicht von der Zellpassagenzahl oder dem Alter des Donors abhängt. Periost-abgeleitete
Zellen bei P5 und P15 von vier Donoren mit unterschiedlichem Alter
zeigen ein vergleichbares molekulares Profil, wie bewertet durch
eine semiquantitative RT-PCR.
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4 besteht
aus zwei histologischen Bildern, die zeigen, dass skelettale Vorläuferzellen
anchorunabhängig
wachsen können
und ihre phänotypische
Stabilität
in vivo beibehalten.
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5 ist
ein Bild, das zeigt, dass das aus einem Maus-Muskel gewonnene Implantat durch menschliche
Zellen gebildet wird.
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6 besteht
aus Bildern, die demonstrieren, dass die chondrogene Differenzierung
unabhängig
vom Altern der Donoren erhalten wird,
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7 zeigt
histologische Bilder von aus menschlichen skelettalen Vorläuferzellen
in vitro erhaltenem Knorpelgewebe.
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8A–8F zeigen
die histochemische und immunhistochemische Analyse von entweder
unbehandelten (A, B, H) oder mit TGF-β-1 behandelten Mikromassen.
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9 zeigt
die Genexpressionsdynamik durch RT-PCR während der Chodrogenese in CDMP-1-markierten
skelettalen Vorläuferzellen.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
Bezeichnungen,
die in dieser Offenbarung verwendet werden, sind wie folgt definiert:
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Chondrozyten-Stabilität
-
Die
Fähigkeit
einer Zellsuspension (entweder von einem Knorpelgewebe oder von
irgendeinem anderen Gewebe erhalten, das Zellen mit chondrogenem
Potenzial enthält),
um bei Injektion in einen nicht-menschlichen Säuger (in vivo), wie z.B. immundefizienten
Mäusen
in einem Zeitrahmen von 2–3
Wochen ein echtes (hyalines) Knorpelimplantat ohne Zeichen einer
vaskulären
Invasion oder einer endochondralen Knochenformation oder in vitro
zu erzeugen.
-
Chondrogen
-
Die
Fähigkeit,
das Knorpelwachstum zu unterstützen
oder zu stimulieren, wie angewandt auf Chondrozyten und auf Zellen,
die sich in Chondrozyten differenzieren. Die Bezeichnung betrifft
auch bestimmte Wachstumsfaktoren, wie z.B. TGF-β, die die Knorpel-Differenzierung
unterstützen.
-
Co-Expression
-
Unter
Co-Expression wird im Kontext der vorliegenden Erfindung verstanden,
dass ein Faktor immer dann exprimiert wird, wenn ein anderer Faktor
oder Marker in oder auf einer Zelle exprimiert wird. Wenn z.B. ein
morphogenes Protein als Marker verwendet wird und insbesondere das
Knorpelabgeleitete morphogene Protein CDMP-1 oder ein Homolog davon
exprimiert wird/werden, benötigt
die Co-Expression, dass ein co-exprimierter Marker nur vorliegt
oder exprimiert wird, wenn der morphogene Marker exprimiert wird.
Der Faktor ist daher mit demselben spezifischen postnatalen Differenzierungsweg
wie das morphogene Protein, mit dem es co-exprimiert wird, wie z.B.CDMP-1,
verbunden. Es wird vorzugsweise zusammen mit dem Marker auf- oder
abreguliert. Es wird z.B. herabreguliert, wenn die Vorläuferzellen
eine Differenzierung, wie z.B. zu dem chondrozytischen Phänotyp, durchlaufen.
Ein solcher co-Expressionsmarher wird weiterhin vorzugsweise in detektierbaren
Niveaus exprimiert. Ein solcher co-exprimierter Faktor kann ein
erkennbarer Zelloberflächenmarker
sein, nachweisbar über
polyklonale oder monoklonale Antikörper und/oder spezifische Liganden.
Der co-exprimierte
Faktor kann auch jedes funktionelle oder strukturelle Homolog von
CDMP-1 beinhalten.
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Bindegewebe
-
Wie
hier verwendet jede Zahl von Strukturgeweben im Körper eines
Säugers,
einschließlich
Knochen, Knorpel, Ligamenten, Sehnen, Meniskus, Dermis, Hyperdermis
und Gelenkkapsel.
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Differenzierung
-
Ein
biologischer Prozess, durch den primitive, nicht spezialisierte
Zellen durch Zellteilungen zu Nachkommen mit spezialisierteren Funktion(en)
werden. Terminale Differenzierung stellt eine hoch spezialisierte Zelle
mit einzigartigen funktionellen, genetischen und phänotypischen
Eigenschaften bereit.
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Heterolog
-
Betrifft
jedes Gen, Promotor, Polypeptid oder andere Molekül, das in
einer Wildtyp-Version einer bestimmten Zelle nicht natürlich vorliegt,
oder nicht nativ ist. Ein E. coli-β-Galactosidasegen
wird z.B. als heterolog für
eine menschliche Skelett-Vorläuferzelle
betrachtet.
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Mesenchymale
Stammzelle
-
Ein
primitiver Zelltyp mit einer Fähigkeit
zur Selbstregeneration und zur Differenzierung durch eine Reihe
von Zellinien zur Erzeugung von Nachkommenschaftszellen mit einer
breiten phänotypischen
Vielfältigkeit, einschließlich Bindegeweben,
Knochenmarkstroma, Adipozyten, Dermis und Muskeln.
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Marleerprotein
-
Ein
Polypeptid, das eine Zelle (oder einen Satz von Zellen) von einer
anderen Zelle (oder einem Satz von Zellen) in einer Population von
Zellen unterscheidet. Ein Polypeptid, das z.B. auf der Oberfläche von
skelettalen Vorläuferzellen,
jedoch nicht auf anderen Zellen einer Zellpopulation exprimiert
wird (entweder natürlich
oder künstlich,
z.B. durch Gentechnik eingeführt)
dient als Markerprotein für
die skelettalen Vorläuferzellen.
Typischerweise ist das Markerprotein ein Zelloberflächenantigen
ist, wie z.B. ein Wachstumshormonrezeptor, so dass Antikörper, die
das Markerprotein binden, in Zellsortierungsverfahren verwendet
werden können,
um z.B. eine Population von Zellen zu produzieren, die für Zellen
angereichert sind, die das Markerprotein exprimieren. Alternativ
können
intrazelluläre
Proteine als Markerproteine verwendet werden. Fluoreszierende oder
lumineszierende Proteine, wie z.B. grün fluoreszierendes Protein,
z.B. Aequorin (GFP von Aequoria victoria) (Tanahashi et al (1990),
Gene 96:249–255)
kann z.B. als Markerprotein verwendet werden und kann die Zellsortierung
erleichtern, z.B. durch FACS. Es können auch Enzyme verwendet
werden, unter der Voraussetzung, dass die Aktivität des Enzyms
nachgewiesen werden kann. β-Galactosidase
ist z.B. gut zur Verwendung als Markerprotein geeignet; dieses Enzym
kann durch Einführung
eines Substrats (von Substraten) in die Zelle nachgewiesen werden,
das ein fluoreszierendes Produkt (Produkte) bei Spaltung durch das
Enzym freisetzt (erhältlich
z.B. von Molecular Probes). Ein anderes geeignetes Enzym ist Catechol-2,3-dioxygenase,
das von xylE von Pseudomonas putida kodiert wird (Domen et al (1986),
Anal Biochem 155:379–384).
-
Operabel gebunden
-
Die
Verbindung einer Kodierungssequenz und (einer) regulatorischen Sequenz
(Sequenzen) (z.B. einem Promotor) auf derartige Weise, dass eine
Genexpression möglich
wird, wenn die geeigneten Moleküle (z.B.
transkriptionale Aktivatorproteine) an die regulatorische Sequenz
(Sequenzen) gebunden sind.
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Osteogen
-
Die
Fähigkeit,
die Produktion von Knochen zu unterstützen oder zu erzeugen. Die
Bezeichnung kann auf Osteoblasten angewendet werden, die die Fähigkeit
zur Unterstützung
des Knochenwachstums aufweisen oder auf Zellen, die selbst in der
Lage sind, sich in Osteoblasten zu differenzieren. Die Bezeichnung
würde auch
auf Wachstumsfaktoren angewandt werden, die die Fähigkeit
zur Unterstützung
des Knochenwachstums aufweisen.
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Phänotypische
Stabilität
-
Erhalt
der Fähigkeit
von jeder Zelle, in vivo oder in vitro die Struktur eines spezifischen
Gewebes zu organisieren oder wieder zu organisieren, entweder des
ursprünglichen
Gewebes, aus dem die Zellen genommen wurden oder eines anderen Gewebes,
das die Zellen unter spezifischen Bedingungen gezwungen werden,
zu bilden.
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Vorläuferzelle
-
Eine
Zelle mit der Fähigkeit,
eine Differenzierung zur Leistung einer spezifischen Funktion zu
durchlaufen.
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Promotor
-
Eine
Nukleotidsequenz, die genügt,
um eine Transkription einer Kodierungssequenz zu dirigieren und/oder
zu regulieren. Eingeschlossen innerhalb der Erfindung sind diejenigen
Promotoren, die durch externe Signale oder Mittel induzierbar sind;
solche Elemente können
in den 5'- oder
3'-nicht-translatierten Bereichen (UTR)
und den Introns des nativen Gens lokalisiert sein. Ein "CDMP-3-Promotor" ist jede Sequenz
in cis-Stellung, die ausreicht, um die Expression von CDMP-1 in
skelettalen Vorläuferzellen
zu dirigieren und/oder zu regulieren. Es wird anerkannt, dass in
genetischen Konstrukten, die einen CDMP-1-Promotor enthalten (z.B. denjenigen
Konstrukten, die auch ein Reportergen enthalten oder ein Gen, kodierend
ein Markerprotein), geringe Abweichungen (z.B. Deletionen, Punktmutationen
und ähnliches)
in der Sequenz des CDMP-1-Promotors durchgeführt werden können, ohne
seine Fähigkeit
in den skelettalen Vorläuferzellen
und nicht in anderen Chondrozyten aktiv zu sein, nachteilig zu beeinflussen.
Daher sind CDMP-1-Promotoren,
die solche geringfügige
Variationen aufweisen ohne die Spezifität des Promotors für skelettale
Vorläuferzellen
nachteilig zu beeinflussen, durch die Bezeichnung "CDMP-1-Promotor" umfasst. Zusätzlich können multiple
Kopien des CDMP-1-Promotors, die in Tandem angeordnet sind, verwendet
werden, um die Genexpression zu dirigieren.
-
Relevant
-
Relevant
bezeichnet im vorliegenden Kontext die Tatsache, dass das zur Identifizierung
von skelettalen Vorläuferzellen
verwendete Genprodukt ein Produkt sein muss, das mit dem postnatalen
Skelettweg verbunden ist, wie in dem Fall von CDMP-1.
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Reportergen
-
Jedes
Gen, für
das eine Expression überwacht
werden kann. Allgemein verwendete Reportergene beinhalten, z.B.
Gene, die die Chloramphenicol-Acetyltransferase, die alkalische
Phosphatase, die Luciferase und grün fluoreszierendes Protein
kodieren.
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Skelett-Vorläuferzelle
-
Eine
Zelle, die nicht mehr undifferenziert ist, sondern bereits in Richtung
auf einen Differenzierungsweg des Skelettgewebes festgelegt ist.
Die Zelle ist immer noch pluripotent und kann sich in irgendeines
der Bindegewebe oder eine Untergruppe davon differenzieren.
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Skelettgewebe
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Skelettgewebe
beinhalten Zähne,
Knochen, Knorpel, Meniskus, Ligamente, Intervertebralscheiben und
Muskelgewebe.
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Stabiler Knorpel
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Knorpel,
der sich nicht schließlich
in Knochen umwandelt, d.h. Knorpel, der frei ist von irgendwelchen Zeichen
einer Vaskularisierung. Im Gegensatz zu dem stabilen Knorpel wird
transienter Knorpel am Ende Knochengewebe werden. Im Kontext der
vorliegenden Erfindung wird Knorpel als stabil betrachtet, wenn
selbst nach z.B. sieben Wochen alle Zeichen einer Knochenbildung
abwesend sind.
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Stammzelle
-
Pluripotente
Vorläuferzelle
mit der Fähigkeit,
sich selbst zu erneuern und eine Vielzahl von differenzierten Zelltypen
zu erzeugen. Echte Stammzellen können
sich unbegrenzt teilen. Unter embryogenen Stammzellen werden die
pluripotenten Zellen mit normalem Karyotyp verstanden, abgeleitet
von einer inneren Zellmasse eines Säugers oder einem Blastozyst.
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Detaillierte
Beschreibung
-
Die
vorliegende Erfindung wird im wesentlichen unter Bezugnahme auf
skelettale Vorläuferzellen
beschrieben, jedoch ist die Erfindung nicht hierauf begrenzt. Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung embryonaler Marker,
die identifizieren, dass bestimmte Vorläuferzellen in einen postnatalen
Differenzierungsweg eingetreten sind. Es wird angenommen, dass die
vorliegende Erfindung nicht auf irgendeinen Zelltyp festgelegt ist,
unter der Voraussetzung, dass diese mit Organismen mit differenziert
Zellen assoziiert sind. Beispiele sind Tiere, insbesondere Säuger. Die
vorliegende Erfindung ist insbesondere im Hinblick auf Säuger-Vorläuferzellen
geeignet, insbesondere skelettale Vorläuferzellen, noch genauer skelettale
Vorläuferzellen
von Menschen und Pferden, jedoch nicht darauf begrenzt. Die vorliegende
Erfindung bedient sich tellembryonaler Marker, von denen angenommen
wird, dass sie auf allen differenzierten Zellen oder Vorläuferzellen
solcher differenzierter Zellen in jeder differenzierten Lebensform
zur Verfügung
stehen oder in diesen vorliegen. Solche embryonalen Marker werden
als notwendiger Teil eines notwendigen Teils der Embryogenese betrachtet
oder als damit assoziiert angesehen, da der wachsende Organismus
während
der Differenzierung ebenfalls eine Notwendigkeit zur Identifizierung
differenzierter oder teilweise differenzierter Zellen hat und dies
biochemisch erreichen muss. Daher hat die vorliegende Erfindung
eine breite Anwendung.
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf überraschenden Entdeckungen,
die eine allgemeine Relevanz für
die Entwicklung aller differenzierten Lebensformen, insbesondere
von Säugern,
wie Menschen oder Pferden, haben.
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Zunächst können pluripotente
menschliche skelettale Vorläuferzellen
in verlässlicher
Weise durch einen Satz molekularer Marker identifiziert werden.
Die Marker können
sowohl positiv sein und damit die Gegenwart pluripotenter Vorläuferzellen
angeben oder negativ, und damit Zellen anzeigen, die differenziert
sind und nicht mehr Vorläuferzellen
darstellen. Die Abwesenheit eines negativen Markers kann ein positiver
Marker sein. Insbesondere beinhaltet die vorliegende Erfindung Zellen
mit einer Abwesenheit eines negativen Markers, wie z.B. FGFR3, kombiniert
mit der Gegenwart eines positiven Markers. Zweitens sind solche
skelettale Vorläuferzellen
unter konsistenten und geeigneten Bedingungen in der Läge, verschiedene
Bindegewebe, einschließlich
Knorpel, zu erzeugen und zu reparieren, wenn sie entweder allein
oder in Assoziation mit Chondrozyten verwendet werden. Und drittens können solche
skelettale Vorläuferzellen
induziert werden, um Gene zu exprimieren, die mit spezifischen Geweben
verbunden sind.
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Es
werden Beweise dargelegt, dass die Expression von CDMP-1 eine bestimmte
Kultur- expandierte Zellpopulation als skelettale Vorläuferzellen
qualifiziert. Dies ist ein unerwartetes Ergebnis, da es immer bekannt
war, dass CDMP-1 die chondrogene Differenzierung unterstützt und
dieses nie mit dem Phänotyp
von skelettalen Vorläuferzellen
verbunden war. Unabhängig
von der Quelle werden die Zellen in Kultur expandiert und durch
RT-PCR-Analyse im Hinblick auf die Expression von CDMP-1 bewertet.
Nur die CDMP-1 exprimierenden Zellen können erfolgreich verarbeitet
werden, um zu einem spezifischen Differenzierungsweg von jedem Skelett-Bindegewebe aus gerichtet
zu werden, einschließlich
dem Knorpel. Interessant ist, wann immer eine Skelett-Vorläuferzelle,
wie definiert durch die Expression in RT-PCR von CDMP-1, eine Differenzierung zu
einem chondrozytischen Phänotyp
durchläuft,
geht dem Eintritt in einen spezifischen Differenzierungsweg immer
die Herabregulierung der Expression von CDMP-1 voran.
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Eine
erste Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung besteht aus der Verwendung von Knorpel-abgeleitetem
morphogenem Protein CDMP-1 oder einem Transformations-Wachstumsfaktor
mit mindestens 80 % Homologie zu CDMP-1 als positivem Marker von
skelettalen Vorläuferzellen
von jedem Teil eines Säugerkörpers oder
die Verwendung eines Faktors oder Markers, der mit CDMP-1 co-exprimiert
oder co-nachweisbar ist. Anders ausgedrückt wird, unabhängig von
der Quelle der Zellen, CDMP-1 oder ein Homolog davon oder ein co-exprimierter
Marker oder Faktor selektiv durch skelettale Vorläuferzellen
exprimiert und wird herabreguliert, sobald die Skelett-Vorläuferzelle
einen Differenzierungsschritt zu irgendeiner reifen Zellinie durchläuft. Wenn
z.B. skelettale Vorläuferzellen
in die Chondrozyten differenzieren, geht der Expression von Knorpelmarkern,
wie z.B. Typ-II-Collagen, FGFR3, Typ-IX-Collagen oder Typ-XI-Collagen
immer das Verschwinden von CDMP-1 voran, Marker, wie z.B. FGFR3,
Typ-II-Collagen,
Typ-IX-Collagen oder Typ-XI-Collagen oder Marker oder Faktoren,
die mit diesen Markern co-exprimiert werden oder co-detektierbar
sind, sind negative Marker. Relevante Genprodukte, die mit CDMP-1
oder einem CDMP-1-verwandten Gen co-exprimiert werden, können gemäß der vorliegenden
Erfindung zur positiven Identifikation von skelettalen Vorläuferzellen
innerhalb einer Referenzpopulation verwendet werden. Die Abwesenheit
eines negativen Markers kann als positiver Macker gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Diese erste Ausführungsform basiert auf der
Charakterisierung von menschlichen skelettalen Vorläuferzellen
von Donoren mit unterschiedlichem Alter (im Bereich von 9 bis 95
Jahre) über
eine große
Anzahl von Passagen durch molekulare Marker. Unter Verwendung der Reversen
Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
("RT-PCR") -Analyse wurde
beobachtet, dass skelettale Vorläuferzellen über serielle
Passagen phänotypisch
stabil sind, ihren Phänotyp
und ihr Potenzial für
die Differenzierung selbst nach einem Einfrieren in flüssigem Stickstoff
für 18
Monate beibehalten. Die Identifizierung von CDMP-1-positiven Zellen
kann auf dem DNA, RNA oder Proteinniveau geschehen, direkt über das
Gen und Genprodukte von CDMP-1 oder indirekt über funktionelle Homologe oder über Faktoren
oder Macker, die mit CDMP-1 co-exprimiert
werden.
-
Eine
zweite Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung besteht aus der weiteren Verwendung von Reagenzien,
Liganden und/oder Antikörpern,
die spezifische Faktoren erkennen, die mit den in Frage stehenden
morphogenen Proteinen co-exprimiert
werden, wie Zell-Oberflächen-Marker.
Solche Marker können
für das
Sortieren eines heterogenen Säugerzellpools,
Skelett-Vorläuferzell-Subpopulation,
für die
weitere Verarbeitung durch geeignete Behandlung, wie eine weitere
Differenzierung entlang einer spezifischen Zellinie, z.B.
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Differenzierung
in Chondrozyten und vorzugsweise stabile Chondrozyten verwendet
werden. Das Zellsortieren basiert auf der Verwendung autologer oder
heterologer Markerproteine. Das heterologe Markerprotein kann von
viralem, prokaryontischem, eukaryontischem oder synthetischem Ursprung
sein. Das Markerprotein kann ein Marker sein, der, wenn er exprimiert
wird, zu einem bevorzugten Überleben
von Zellen führt, die
den Marker exprimieren, wobei eine Antibiotika-Resistenz ein solches
Beispiel ist. Der selektierbare Marker kann auch ein Marker sein,
dessen Expression zu einer bevorzugten Abtötung von Zellen führt, die
den Marker exprimieren. In diesem Fall wird der Marker in anderen
Zellen als den skelettalen Vorläuferzellen
exprimiert. Typischerweise ist das Markerprotein jedoch ein Polypeptid,
das auf der Zelloberfläche
exprimiert wird. Beispiele für
geeignete Markerproteine beinhalten CD8, β-Galactosidase, Catechol-2,3-dioxygenase, Aequorin (grün fluoreszierendes
Protein von Aequorea victoria) und Influenzavirus Hämagglutinin.
Die Gene, die diese und andere geeignete Markerproteine kodieren,
sind auf dem Gebiet bekannt. Konventionelle Zellsortierungsverfahren
(z.B. Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren (FACS)) können verwendet
werden, um jene Zellen zu isolieren, worin die Zelloberflächenmarker,
co-nachweisbar mit CDMP-1 oder einem Homolog davon, exprimiert werden.
Dann wird ein Fluoreszenz-markierter Antikörper verwendet, um spezifisch
ein Zelloberflächen-Polypeptid
zu binden, das als heterologer Marker verwendet wird. Alternativ
kann ein nichtmarkierter Antikörper
verwendet werden, um das Zelloberflächen-Polypeptid spezifisch
zu binden und ein zweiter markierter Antikörper kann verwendet werden,
um den ersten Antikörper
spezifisch zu binden. Die Fluoreszenzmarkierten Vorläuferzellen
können
dann von anderen Zellen in der Probe, z.B. durch FACS, sortiert
werden. Andere Techniken, wie z. B. die Verwendung Protein-konjugierter
magnetischer Kügelchen,
die selektiv bestimmte Zellen binden, können ebenfalls verwendet werden.
Geeignete Kits sind kommerziell erhältlich. Allgemein verwenden solche
Kits einen markierten Antikörper
(z.B. einen Biotin-markierten Antikörper), um das Zelloberflächen-Markerprotein
zu binden. Diese Antikörper-gebundenen
Zellen werden mit dem magnetische Kügelchen-Proteinkonjugat kontaktiert,
wobei der Proteinanteil des Kügelchen-Proteinkonjugats
den markierten Antikörper
spezifisch bindet. Zum Beispiel kann ein Streptavidin-magnetisches
Kügelchen-Konjugat
verwendet werden, um den Biotin-markierten Antikörper zu binden, um einen Komplex
zu produzieren, der das magnetischen Kügelchen-Protein-Konjugat, den markierten Antikörper und
die Zelle, die das Markerprotein exprimiert, enthält. Solche
Komplexe können
von anderen Zellen durch temporäre
Anhaftung des Komplexes an einen Magneten und Abtrennung der angehafteten
Zellen von anderen Zellen getrennt werden (d.h., eine Population
von Zellen, denen z.B. skelettale Vorläuferzellen fehlen). Magnetische
Kügelchen,
die kovalent an einen sekundären
Antikörper
gekoppelt sind, sind kommerziell erhältlich. Andere, auf Antikörpern basierende
Verfahren zum Sortieren von Zellen, wie z.B. der Verwendung einer
Affinitätschromatographie
oder den Rückhalt
von Zellen, die bestimmte Zolloberflächen-Proteine exprimieren, über Petri-Schalen, beschichtet
mit Antikörpern,
die gegen die letzteren gerichtet sind, sind ebenfalls auf dem Gebiet
bekannt und können
in der Erfindung verwendet werden. Ein nützliches, kommerziell erhältliches
Affinitäts-Zellseparations-Kit "CEPRATE LC" kann von CellPro
(CellPro, Inc. Bothell, WA 98021) erhalten werden. Verfahren zum
Anzüchten
von IgM- oder IgG-Antikörpern
sind auf dem Gebiet wohlbekannt und werden z.B. beschrieben in Ausubel
et al (Herausgeber), Short Protocols in Molecular Biology, 4. Auflage,
John Wiley & Sons,
New York, und insbesondere den Einheiten 11.3, 11.4 und 11.5; in
Paul (Herausgeber), Fundamental Immunology, 4. Auflage, Lippincott-Raven
Publishers, New York, und insbesondere Kapitel 4, Seite 101 ef;
de St, Groth und Scheidegger (1980), J immunol Methods 35:1–21; French
et al (1986), Immunol Today 7:344–346; Langone und Vunakis (1986),
Methods in Enzymology, Band 121, Immunochemical Techniques.
-
Teil
I, Hybridoma technology and monoclonal antibodies, Orlando: Academic
Press; Hammerling et al (1981), Monoclonal antibodies and T-cell
hybridomas. Perspectives and technical advances, Amsterdam: Elsevier/Nord-Holland
Biomedical Press; Yokoyama (1995) In Coligan et al (Herausgeber),
Current protocols in immunology, Wiley & Sons, New York, 2.5.1-2.2.17; Kohler und
Milstein (1975), Nature 256: 495–497. Es ist auch möglich, skelettale
Vorläuferzellen über Reportergene
unter der Kontrolle eines Promotors zu selektieren, der nur in den
Vorläuferzellen
exprimiert wird oder auch andererseits in allen Zellen, jedoch nicht
den betrachteten Vorläuferzellen.
Solche Reporterkonstrukte können
z.B. verwendet werden, um z.B. sicherzustellen, ob Zellen mit einem
bestimmten aktiven Promotor die gewünschten Eigenschaften besitzen.
Ein genetisches Konstrukt (Reporterkonstrukt) kann daher in die
Referenz-Population der Zellen eingeführt werden. Das genetische
Konstrukt beinhaltet dann z.B. einen CDMP-1-Promotor, der operabel
an ein Gen gebunden ist, das ein Markerprotein kodiert. Das Markerprotein
ist ein Protein, das zu den Wildtypzellen der Referenzpopulation
heterolog ist und das vorzugsweise in der Wildtyp-Referenz-Population
nicht exprimiert wird und insbesondere den skelettalen Vorläuferzellen.
Zellen, die das Markerprotein exprimieren (d.h. Zellen, in denen
der CMDP-1-Promotor
aktiv ist) werden dann isoliert, um eine Population an Zellen zu
erzeugen, die im Hinblick auf chondrogene skelettale Vorläuferzellen
angereichert ist. Durch Entfernung der CDMP-1-exprimierenden Zellen
aus der Zellpopulation kann dieses Verfahren natürlich verwendet werden, um
eine Population von Zellen zu erzeugen, denen die chondrogenen skelettale
Vorläuferzellen
fehlen. Verfahren zur Herstellung des Reporter-Konstrukts und zur
Einführung
desselben in die Referenzpopulation sind auf dem Gebiet bekannt.
Es können
z.B. Zellen; die aus dem Periost, der Synovialmembran oder dem Knochenmark
erhalten wurden, mit einem Plasmid transduziert werden, worin die
Expression der konventionellen dominanten, selektierbaren Marker,
wie z.B. denjenigen, die eine Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen,
z.B. Neomycinphosphotransferase, von lumineszenten oder fluoreszenten
oder Proteinen, wie Luciferase oder grün fluoreszierendem Protein
(z.B. Aequorin), andere nachweisbare Enzyme, wie z.B. β-Glucuronidase
oder von Zelloberflächen-Proteinen wie CD8
unter die Kontrolle des menschlichen CDMP-1-Promotors gebracht wird. Ein putativer
Promotor von CDMP-1 ist in Sugiura T. et al, Biochem Biophys Res
Comm 1999,263:707-13 offenbart. Zusätzlich wurden BAC-Klone, isoliert
aus dem Maus-CDMP-1 (GDF-5) -Lokus durch homologe Rekombination
in Bakterien modifiziert. Die resultierenden Konstrukte trieben
die Expression der exogenen Reportergene bei der Entwicklung von
transgenen Mäusen
an, Rountree R. et al. International Conference on Bone Morphogenetic
Proteins, 7. bis 11. Juni 2000. Die Menge an G418, die die nichttransformierten
Zellen töten
würde,
variiert abhängig
von den spezifischen Eigenschaften der verwendeten Zellen. Im allgemeinen
liegt die Konzentration zwischen 100 und 1.000 μg/ml aktivem G418.
-
Geeignete
Selektionsverfahren sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Solche Selektions-
oder Anreicherungsprotokolle werden die unangenehme Eventualität anderer
kontaminierender Gewebe, die sich aus einem Pool von skelettalen
Vorläuferzellen
ergeben, vermeiden. Sobald sie angereichert sind, können diese
Zellen in jede Richtung irgendeines Differenzierungsweges, wie z.B.
dem chondrogenen Weg, gerichtet werden, indem sie unter konsistenten
und geeigneten Bedingungen mit oder ohne morphogene/Wachstumsfaktoren
kultiviert werden, um in einer homogenen Zellpopulation zu münden, wie
z.B. Chondrozyten mit einer phänotypischen
Stabilität.
Insbesondere zeigt die vorliegende Erfindung, dass das Periost,
Knochenmark und die Synovialmembran CDMP-1-exprimierende skelettale Vorläuferzellen
enthalten, die unter Verwendung geeigneter Kulturbedingungen in
Richtung einer Chondrogenese gerichtet werden können. Im Gegensatz zu den vorherigen
Studien von Nakahara et al. (1991), J. Orthop.
-
Res.
9:465-76 zeigt die vorliegende Erfindung, das unabhängig vom
Alter des Donors die menschlichen skelettalen Vorläuferzellen
einfach zugänglich
und expandierbar sind und konsistent zur Differenzierung zu Chondrozyten
induziert werden können.
-
Eine
dritte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der positiv markierten, z.B.
CDMP-1-markierten skelettalen Vorläuferzellen zur Erzeugung oder
Reparatur von Bindegewebe im allgemeinen, einschließlich Trachea,
Herzventile, Stimmbändern
und ähnlichem.
Diese weitere Verwendung basiert auf der Fähigkeit solcher skelettaler
Vorläuferzellen,
das intrinsische Potenzial einer Multi-Zellinien-Differenzierung beizubehalten,
was sie zu guten Kandidaten für
tissue-engineering-Protokolle macht. Die Isolierung, Expansion und
Sortierung von Zellpopulationen unter Verwendung der spezifischen
Marker der Erfindung führt
zu einem geeigneten Zellpool, der für solche Reparaturverfahren
geeignet ist. Insbesondere wurden unter Verwendung von positiv markierten,
z.B. CDMP-1-markierten, skelettalen Vorläuferzellen geeignete Kulturbedingungen
entwickelt, die zu der Induktion und Bildung von Knorpel in vitro
führten.
Bei der vorliegenden Erfindung wird unter anderem die Bildung von "stabilem Knorpel" angedacht. Stabiler
Knorpel in vivo ist z.B. aus jungem Periost abgeleiteten Zellen
(PDCs) erhältlich.
Unter jungen PDCs wird verstanden, dass die Zellen von Individuen
abstammen, die jünger
sind als 20 Jahre, insbesondere jünger als 16 und besonders jünger als 10.
Es ist wichtig festzuhalten, dass die Behandlung von skelettalen
Vorläuferzellen
in einer Monolayerkultur mit verschiedenen Wachstumsfaktoren nicht
zu irgendeiner Reaktion im Hinblick auf die Osteogenese und/oder
Chondrogenese führte,
wie bewertet durch RT-PCR-Analyse im Hinblick auf Knochen und Knorpelmarker,
durch Elsass Blau und von Kossa-Färbung und durch die alkalische
Phosphatase-Aktivität. Für eine erfolgreiche
Induktion von Knorpel scheint es notwendig, CDMP-1-markierte skelettale Vorläuferzellen
mit sehr hoher Zelldichte zu kultivieren, z. B, eine Zelldichte
von mindestens 105 Zellen/ml und vorzugsweise
in der sogenannten Mikromasse-Kultur mit einer Zelldichte von ungefähr 2 × 107 Zellen/ml. Für eine erfolgreiche Induktion
von Bindegewebe ist es weiterhin ratsam, einen Faktor, der die Differenzierung
der skelettalen Vorläuferzellen
in die Art des Bindegewebes, die erzeugt oder repariert werden soll,
zuzufügen
(in vitro) oder zu verabreichen (in vivo), z.B. einen transformierenden
Wachstumsfaktor-β,
wie z.B. TGF-β 1,
TGF-β 2
oder TGF-β 3, vorzugsweise
in einer Rate von ungefähr
10 ng/ml in einem chemisch definierten serumfreien Medium, zu oder zusammen
mit den kulturexpandierten CDMP-1-markierten skelettalen Vorläuferzellen.
Menschliche PDCs von jungen Donoren zeigen z.B. eine spontane chondrogene
Aktivität,
jedoch war die Induktion einer chondrogenen Reaktion bei älteren Zellen
durch Kombination von Mikromasse-Kulturen mit z.B. TFG-β 1-Behandlung, unabhängig von
der Anzahl der Zellpassagen oder dem Alter der überprüften Donoren möglich.
-
Eine
vierte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von positiv, z.B. CDMP-1-markierten
skelettalen Vorläuferzellen
als Quelle für
Wachstumsfaktoren, insbesondere Transformations-Wachstumsfaktoren-β ("TGF-β") und Knochen-morphogenen
Proteinen (BMP"),
von denen bekannt ist, dass sie für die Stimulierung und den
Erhalt des Knorpel-Phänotyps
wichtig sind. Dies kann z.B. der Chondrozyten-in-vitro-Expansion
helfen, indem es die Chondrozyten an einer Dedifferenzierung über serielle
Passagen hindert. Dies kann für
die in-vitro-Expansionsverfahren
menschlicher Chondrozyten für
die Transplantation unter Verwendung eines Mediums, abgeleitet von
autologen skelettalen Vorläuferzellen,
nützlich
sein.
-
Eine
fünfte
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von positiv markierten, z.B.
CDMP-1-markierten skelettalen Vorläuferzellen als Matrix erzeugende
Zellen.
-
Gemäß dieser
Ausführungsform
sind menschliche skelettale Vorläuferzellen,
behandelt mit geeigneten Wachstumsfaktoren (wie in der oben beschriebenen
dritten Ausführungsform)
in der Lage, eine extrazelluläre
Matrix zu erzeugen, die an hyalinen Knorpel erinnert. Die behandelten
Zellen können
daher als Matrixzufuhr für
die Anhaftung und das Wachstum von Chondrozyten in Gelenkoberflächendefekten
("JSD") -Reparaturen verwendet
werden und für
tissue-engineering Verfahren des Knorpelskeletts im allgemeinen,
z.B. für
die Behandlung einer subglottischen Stenose, Tracheopathia, Chondropathia
patellae, Osteoarthritis und traumatischen Läsionen, z.B. unter Verwendung
bioresorbierbarer Polymere (wie z.B. Polymilchsäure oder Polyglykolsäure), die
lokal angewendet werden, um die Läsion aufzufüllen. Bei einer solchen Verwendung
stellen die behandelten Zellen einen geeigneten Träger für die Anhaftung
und das Zellwachstum bereit, unter Umständen beschichtet oder vermischt
mit Wachstumsfaktoren. Solche Kombinationen von Zellen, Polymermatrizes
und Wachstumsfaktoren werden auch bei der orthopädischen rekonstruktiven Chirurgie
geeignet sein. Eine Alternative für diese Ausführungsform
ist ein Verfahren zur Verbesserung der Implantation einer prosthetischen Vorrichtung
in einem Bindegewebe, umfassend den Schritt der Implantation einer
Prothesevorrichtung mit skelettalen Vorläuferzellen, die daran angehaftet
sind, unter geeigneten Bedingungen für eine Differenzierung der Zellen
in das gewünschte
Bindegewebe.
-
Eine
sechste Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Co-Implantation positiv markierter, z.B.
CDMP-1-markierter
skelettaler Vorläuferzellen
und Chondrozyten für
die JSD-Reparatur und tissue engineering Verfahren des Knorpelskeletts
im allgemeinen. Diese Ausführungsform
basiert auf der überraschenden
Beobachtung, dass die Zugabe von expandierten skelettalen Vorlauferzellen
zu einer Chondrozyten-Suspension für die Knorpelreparatur eine
dramatische Wirkung auf die Fähigkeit
der Knorpelbildung durch Chondrozyten sowohl in vitro als auch in
vivo aufweist. Diese Co-Implantation ist in der Lage, die Anzahl
von benötigten
Chondrozyten für
eine erfolgreiche JSD-Reparatur substanziell zu reduzieren und führt auch
zu einer deutlichen Erhöhung
der erzeugten Knorpelmenge. Diese Beobachtungen können es
uns erlauben, frisch isolierte Chondrozyten oder nur minimal expandierte
Chondrozyten zu verwenden anstelle der beeinträchtigten in-vitro-expandierten
chondrozytischen Zellen und dadurch das Problem zu umgehen, das
mit dem Verlust einer Knorpel bildenden Fähigkeit von Chondrozyten, die
sich aus einer in-vitro-Expansion ergibt, zu umgehen. Wie auf dem
Gebiet wohlbekannt, ist die in-vitro-Zellexpansion tatsächlich ein
kritischer Step bei der autologen Chondrozyten-Transplantation und
kann die Wirksamkeit der injizierten Zellen für die Erzeugung von Knorpel behindern.
-
Zusätzlich zu
den vielzähligen
vorher zitierten Verwendungen haben die positiv markierten, z.B. CDMP-1-markierten
skelettierten Vorläuferzellen
der vorliegenden Erfindung den Vorteil, dass sie für bis zu mindestens
18 Monate in Zellbanken unter Lagerbedingungen, einschließlich einer
Lagertemperatur unterhalb von –100°C, z.B. in
flüssigem
Stickstoff und im Fall der Notwendigkeit aufgetaut, in geeigneter
Weise behandelt und in dasselbe Individuum an einer Stelle implantiert
werden können,
an der neues Bindegewebe gewünscht
wird. Trypsin-freigesetzte PDC-Kulturen wurden z.B. in flüssigem Stickstoff
in DMEM mit 20 % FBS und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO; Sigma) kryokonserviert.
Diese Lagerstabilität
von Vorläuferzellen
ist überraschend,
da andere Zellen, einschließlich
Chondrozyten, ihren Phänotyp
verlieren, wenn sie selbst für
eine kurze Zeitspanne unter denselben Bedingungen gelagert werden.
-
Die
positiv markierten, z.B. CDMP-1-markierten skelettalen Vorläuferzellen
können
auch für
die heterologe Transplantation in Fällen von HLA (menschlichen
Leukozyten-Antigen)
-Kompatibilität
oder für
Gewebe, bei denen das Risiko einer Abstoßung minimal ist, und einfach
pharmazeutisch verhindert werden kann, verwendet werden.
-
Positiv
markierte gellen gemäß der vorliegenden
Erfindung können
auch die Abwesenheit eines negativen Markers zeigen. Die oben beschriebenen
Zellsortierungsverfahren können
zur Produktion von im wesentlichen reinen Vorläuferzellen verwendet werden.
-
Ein
vollständigeres
Verständnis
der vorliegenden Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden illustrativen
Beispiele erhalten werden.
-
Beispiel 1 – Isolierung
von skelettalen Vorläuferzellen
aus dem Periost, der Synovialmembran und dem Knochenmark
-
Periost
von menschlichen Donoren mit verschiedenem Alter wurde aseptisch
aus der proximalen medialen Tibia geerntet, entweder innerhalb von
12 bis 24 Stunden nach dem Tod oder von Patienten, die einer chirurgischen
Knie-Ersatz-Operation unterzogen wurden. Das Periost wurde zweimal
mit Hank's balancierter Salzlösung ("HBSS") gespült, erhältlich von
Life Technologies, supplementiert mit antibiotischerantimykotischer
Lösung
(100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin
B, ebenfalls erhältlich
von Life Technologies), fein zerkleinert und mit 0,2 % Collagenase
(Life Technologies) in hochglulcosehaltigem Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium
("DMEM") (Life Technologies),
enthaltend 10%iges fötales
Rinderserum (FBS) (erhältlich
von BioWhittaker) und Antibiotika verdaut. Nach einer Inkubation
bei 37°C über Nacht
wurden die Periostzellen durch Zentrifugation gesammelt, zweimal
gewaschen, in hoch-glukosehaltigem DMEM, supplementiert mit 10 %
FBS und Antibiotika resuspendiert, in einem T25-Kulturkolben plattiert
und man ließ sie
für 4 Tage
anhaften. Nach dieser Zeitspanne wurden nicht anhaftende Zellen
durch Änderung
des Mediums entfernt.
-
Synovial-Membranen
von menschlichen Donoren mit verschiedenem Alter wurden aseptisch
aus den Kniegelenken innerhalb von 24 Stunden nach dem Tod geerntet
und folgend demselben Protokoll wie oben für das Periost, verarbeitet.
-
Heparin-behandelte
Knochenmarkproben von menschlichen Donoren mit verschiedenem Alter
wurden mit HBSS verdünnt,
auf Lymphoprep (1,077 g/ml, erhältlich
von Nycomed, Oslo) geschichtet und bei 300 × g für 20 Minuten zentrifugiert.
Zellen aus der Gradienten-Grenzfläche wurden gesammelt, dreimal
in HBSS gewaschen und im Medium für die Kultur resuspendiert.
-
Beispiel 2 – In-vitro-Zellexpansion
-
Zellen,
die gemäß Beispiel
1 isoliert wurden, wurden in Monolayer in hoch-glukosehaltigem DMEM, enthaltend
10 % FBS und Antibiotika, bei 37°C
in 95 % angefeuchteter Luft und 5 CO2 kultiviert
und das Medium wurde alle 3 Tage ersetzt. Nach 10 bis 20 Tagen einer
Primärkultur,
wenn die kaum angehafteten Zellen eine Konfluenz erreichten, wurden
sie zweimal mit Calcium- und Magnesium-freier phosphatgepufferter
Salzlösung
(PBS) gewaschen und durch Behandlung mit Trypsin-EDTA (0,25 % Trypsin, 1 mM EDTA; Life
Technologies) geerntet und durch eine 1:4-Verdünnung für die erste Subkultur wiederum
ausplattiert. Die Zellpassagen wurde auf dieselbe Weise mit einer
1:4-Verünnung
alle 6 bis 12 Tage und noch bevorzugter alle 7 bis 8 Tage, wenn
die Zellen eine Konfluenz erreichten, fortgesetzt.
-
Beispiel 3 – CDMP-1
als Marker für
skelettale Vorläuferzellen
-
Zellen,
die wie in Beispiel 1 aus Periost, Synovialmembran und Knochenmark
isoliert wurden und wie in Beispiel 2 beschrieben, expandiert wurden,
wurden nach unterschiedlichen Passagen durch RT-PCR-Analyse, wie
hiernach beschrieben, zusammen mit anderen Zellen charakterisiert,
wie z.B. menschlichen Haut-Fibroblasten. Es wurde festgestellt,
dass CDMP-1 nur von Skelett-Vorläufer-Zellpopulationen
in allen Passagen bis zu 18 Passagen, die untersucht wurden, exprimiert
wurde, jedoch nicht durch andere Zellpopulationen. Wir demonstrierten
tatsächlich,
dass nur die CDMP-1-markierten
Kultur expandierten Zellen unter spezifischen Bedingungen, z.B.
in Richtung einer Chondrogenese differenzieren können, während die CDMP-1-negativen
Zellen unter denselben Bedingungen nicht in der Lage sind, irgendeinen
Skelett-Differenzierungsweg zu beschreiten. Weiterhin geht dem Auftreten
von Knorpelmarkern immer die Herabregulation der Expression von CDMP-1
voran.
-
2A zeigt
die RT-PCR-Analyse für
die Expression von CDMP-1, normalisiert auf die Expression von β-Actin in
unterschiedlichen Zellpopulationen, nummeriert von 1 bis 4.
- – Spur
1: Menschliche Periost-abgeleitete skelettale Vorläuferzellen;
- – Spur
2: Menschliche, von einer Synovialmembran abgeleitete skelettale
Vorläuferzellen;
- – Spur
3: Menschliche, vom Knochenmark abgeleitete skelettale Vorläuferzellen;
- – Spur
4: Menschliche Haut-Fibroblasten.
-
2B zeigt
die RT-PCR-Analyse für
CDMP-1 und Typ-II-Collagen,
normalisiert auf die Expression von β-Actin bei menschlichen Haut-Fibroblasten
(Spuren 1 und 2) und menschlichen, vom Periost abgeleiteten skelettalen
Vorläuferzellen
(Spuren 3 und 4) in Mikromassekultur, entweder unbehandelt (Spuren
1 und 3) oder 6 Tage mit 10 ng/ml TFG-β 1 behandelt (Spuren 2 und 4).
- – Spur
1: Menschliche unbehandelte Haut-Fibroblasten;
- – Spur
2: Menschliche Haut-Fibroblasten, behandelt mit 10 ng/ml TGF-β 1;
- – Spur
3: Menschliche unbehandelte skelettale Vorläuferzellen;
- – Spur
4: Menschliche skelettale Vorläuferzellen,
behandelt mit 10 ng/ml TGF-β 1.
-
RNA-Extraktion und semi-quantitative
RT-PCR-Analyse
-
Gesamt-RNA
aus menschlichen Zellen wurde unter Verwendung des S.N.A.P.TM-Kits (erhältlich von Invitrogen) extrahiert
und DNAse-behandelt. 1 μg
der Gesamt-RNA wurde revers transkribiert, um cDNA mit Oligo(dT)-Primern
unter Verwendung von Thermoscript (Life Technologies) herzustellen.
Die Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") wurde in einem
Volumen von 10 μl
durchgeführt,
unter Zugabe von 1 μl
aus 60 μl
der cDNA als Matrize unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase (erhältlich von
Eurogentech). Wenn die Sequenz des Gens bekannt war, wurden Primer
auf unterschiedlichen Exons entworfen, um die cDNA von einer genomischen
DNA-Kontamination
zu unterscheiden. Vor der PCR-Analyse wurden die cDNAs auf die Expression
des Haushälter
(housekeeping) gens-β-Actin
abgeglichen. PCR für
menschliches β-Actin
wurde durchgeführt
unter Beendigung der Reaktion bei jedem Zyklus, beginnend vom 17.
Zyklus, um sicherzustellen, dass die PCR-Amplifikation sich noch immer in der
linearen Phase befand. Die PCR-Produkte wurden in 1%igem Agarosegel
in TBE (Tris-Borat/EDTA)
Elektrophoresepuffer elektrophoretisch behandelt, mit Ethidiumbromid
gefärbt,
durch die UV-Transilluminierung sichtbar gemacht und durch Dichtemessung
unter Verwendung der Image-Master-Software (erhältlich von Pharmacia-Biotech)
analysiert. cDNAs wurden gemäß der relativen
Intensitäten der
Banden verdünnt.
Um auszuschließen,
dass β-Actin
in den unterschiedlichen zu vergleichenden Proben differenziell
reguliert wurde, wurde dieselbe Analyse ebenfalls im Hinblick auf
die Expression eines anderen Haushaltergens, Glucose-3-Phosphatdehydrogenase
(GAPDH) durchgeführt.
Nach Abgleichung auf β-Actin und
GADPH wurden alle Proben simultan im Hinblick auf etliche Gene überprüft, einschließlich denjenigen, von denen
bekannt war, dass sie an der Chondrogenese und dem Erhalt des Knorpels
beteiligt sind. Für
jedes Gen wurde die Zyklisierung optimiert, um sicherzustellen,
dass die Amplifikation sich immer noch in der linearen Phase befand,
wenn die PCR für
alle Proben beendet wurde.
-
Beispiel 4 – Bestimmung
der phänotypischen
skelettalen Vorläuferzell-Stabilität über die
seriellen Passagen
-
Bei
jeder Passage des Expansionsverfahrens gemäß Beispiel 2 wurden skelettale
Vorläuferzellen
von Donoren mit unterschiedlichem Alter für eine Gesamt-RNA-Extraktion
geerntet und eine RT-PCR-Analyse für die Expression von 40 Genen,
wie oben beschrieben, durchgeführt.
Ihr molekulares Profil blieb über
eine serielle Passage von bis zu mindestens 15 Passagen stabil,
was anzeigte, dass sie im großen
und ganzen ohne Beeinträchtigung
ihrer Fähigkeit
als Skelett-Vorläufer expandiert
werden können.
-
3 zeigt,
dass der Phänotyp
von skelettalen Vorläuferzellen
nicht von der Zahl der Zellpassagen oder dem Donoralter abhängt. Periost
abgeleitete Zellen bei P5 und P15 von vier Donoren mit unterschiedlichem
Alter weisen ein vergleichbares molekulares Profil auf, wie bewertet
durch semi-quantitative RT-PCR. Die Figur zeigt nur ein repräsentatives
Panel der überprüften Gene.
In der letzten Spur war Milli-Q-Wasser die Negativkontrolle. Die
Matrizen wurden auf die β-Actin-Expression
abgeglichen.
-
Beispiel 5 – Anchor-unabhängiges Wachstum
von skelettalen Vorläuferzellen
-
Das
anchor-unabhängige
Wachstum von skelettalen Vorläuferzellen
aus Beispiel 2 wurde in vitro durch Agarose-Kultur und in vivo durch intramuskuläre Injektion
in immundeffiziente Nacktmäuse,
wie unten erklärt, überprüft. Die
Injektion von erwachsenen skelettalen Vorläuferzellen in Nacktmäuse führte zu
einer Bildung von schlecht differenzierten unreifen faserknorpeligem
Gewebe von menschlichem Ursprung, wie durch in-situ-Hybridisierung
auf eine human-spezifische alu-Sequenz demonstriert.
-
Agarosekultur
-
Die
Agarosekultur wurde gemäß dem Verfahren
von Benya et al., Cell (1982) 30:215-24 durchgeführt. Kurz gefasst wurden Petrischalen
mit einem Durchmesser von 35 mm2 mit 1%iger
steriler Hoch-Tm-Agarose (erhältlich von
Life Technologies) beschichtet und auf einer ebenen Oberfläche bei
Raumtemperatur platziert, um sich zu verfestigen. Die Zellen wurden
durch Trypsinbehandlung freigesetzt, durch den Trypan-Blau-Ausschlußtest gezählt und
in 0,5%iger Niedrig-Tm-Agarose (Life Technologies)
in DMEM mit einer Dichte von 2 × 104
Zellen/ml resuspendiert. 0,5 ml dieser Zellsuspension wurden zu
jeder der Petri-Schalen zugefügt.
Nach einem Abkühlen
bei 4°C
für 15
Minuten wurde DMEM, enthaltend 10 FBS, Antibiotika und 50 μg/ml Ascorbinsäure (Sigma)
zugefügt
und die Petri-Schalen wurden bei 37°C in 95%ige angefeuchtete Luft
und 5 % CO2 übertragen. Das Medium wurde
an jedem zweiten Tag ersetzt.
-
In-vivo-Assay
-
Skelettale
Vorläuferzellen
nach einer unterschiedlichen Passagenzahl aus Beispiel 2 wurden
durch eine Trypsin-Behandlung
freigesetzt, zweimal in steriler PBS gewaschen und durch den Trypan-Blau-Ausschlußtest gezählt. 5 × 106 lebensfähige
Zellen wurden in einem Volumen von 50 bis 100 μl PBS resuspendiert und intramuskulär in den
Oberschenkel von weiblichen, 4 bis 5 Wochen alten immunodefizienten
Mäusen
injiziert. Die Tiere wurden nach 3 Wochen durch Cervix-Dislokation geopfert
und der Oberschenkel zum Erhalt des Implantats seziert. Die Implantate
wurden gewogen und entweder sofort eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert
oder in frisch angesetztem 4%igem Formaldehyd für 4 Stunden fixiert, Nach der
Fixierung wurden die Proben in Paraffin eingebettet, bei 5 μm sektioniert
und gemäß den Standardvorschriften
gefärbt (Elsass-Blau,
pH 2,5, Toluidin-Blau,
Masson-Trichrom, Safranin 0) (Manual of Histological Techniques). 4 zeigt
Implantate, gewonnen aus Nacktmäusen,
3 Wochen nach einer intramuskulären
Injektion von 5 × 106 erwachsenen
menschlichen, Periost-abgeleiteten skelettalen Vorläuferzellen.
Die Masson-Trichrom (4A) und schwache Elsass-Blau-Färbung bei
pH 2,5 (48) zeigte ein schlecht. differenziertes fibröses Gewebe,
das stark an Periost erinnerte. Dies zeigt an, dass die skelettalen
Vorläuferzellen
in vivo anchor-unabhängig
wachsen können
und ihre phänotypische
Stabilität
beibehalten.
-
Die
in-situ-Hybridisierung im Hinblick auf die humanspezifische alu-Sequenz
wurde auf den gewonnenen Implantaten für eine Identifizierung menschlicher
Zellen wie folgt durchgeführt.
-
In-situ-Hybridisierung
auf human-spezifische alu-Repeats
-
Die
in-situ-Hybridisierung wurde, wie von Kuznetsov et al. (1997), J.
Bone Min. Res. 12:1335-47 beschrieben, durchgeführt. 4 zeigt,
dass das aus dem in-vivo-Assay erhaltene fibröse Gewebe von menschlichem
Ursprung ist und nicht von dem Maus-Wirt abstammt.
-
Beispiel 6 – In-vitro-Bildung
von Knorpel mit skelettalen Vorläuferzellen
-
Die
in-vitro-Induktion und Bildung von Knorpel, demonstriert durch Elsass-Blau-Färbung und
Molekularanalyse im Hinblick auf Knorpel-Marker durch RT-PCR wurde
durch Kombination von Mikromassekulturen von skelettalen Vorläuferzellen
aus Beispiel 2 bei hoher Zelldichte und Behandlung der Zellen mit
TGF-β 1
oder TGF-β 2
oder TGF-β 3
(R&D-Systems),
gelöst
in 4 mM HCl, enthaltend 1 mg/ml bovines Serumalbumin (BSA, Serva)
durchgeführt
und zu dem Kulturmedium in einer Endkonzentration von 10 ng/ml zugegeben.
Die chondrogene Differenzierung von skelettalen Vorläuferzellen
wurde in allen Donoren erhalten, unabhängig von der Anzahl der Zellpassagen
oder dem Alter des Donors, siehe 6A und 6B.
Die Anwendung von TGF-β 1
auf skelettale Vorläuferzellen
von Donoren mit einem Alter von 24, 30, 62 und 78 erzeugte Chondrozyten, die
Collagen-Typ-2 zeigten. Unter denselben Bedingungen erwiesen sich
rekombinantes menschliches Knochenmorphogenes Protein (BMP)-2, BMP-4
(Genetics Institute), BMP-7 oder GDF-5 (CDMP-1; Creative Biomolecules),
gelöst
in 45%igem Acetonitril, 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) und dem Kulturmedium
in Endkonzentrationen von 100 bis 300 ng/ml zugefügt als sehr
viel weniger effektiv als die TGFβs.
-
Mikromassakultur
-
Expandierte
skelettale Vorläuferzellen
von menschlichen Donoren mit unterschiedlichem Alter nach unterschiedlicher
Passagenzahl aus Beispiel 2 wurden durch Trypsin-Behandlung freigesetzt,
durch den Trypan-Blau-Ausschlußtest
gezählt
und in DMEM resuspendiert, supplementiert mit 10%igem FBS und Antibiotika
mit einer Zelldichte von 2 × 107
lebensfähigen
Zellen pro ml. Mikromassekulturen wurden durch Pipettieren von 20 μl-Tröpfchen der
Zellsuspension in individuelle Vertiefungen von Platten mit 24 Vertiefungen
erhalten. Nachdem die Zellen sich ohne Medium 3 Stunden lang anbinden
durften, wurde chemisch definiertes serumfreies Medium ohne Wachstumsfaktoren
zugefügt.
Der Tag der Einführung
in die Mikromassekultur wurde als Tag 0 bezeichnet. Rekombinantes
menschliches TGF-β 1
oder TGF-β 2
oder TGF-β 3
(erhältlich
von R & D Systems)
wurde in 4 mM HCl, enthaltend 1 mg/ml bovines Serumalbumin (BSA)
gelöst
und dem Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml jeden
Tag, beginnend am Tag 1 zugefügt,
wenn das Kulturmedium geändert
wurde. Dieselben Mengen an 4 mM HCl, enthaltend 1 mg/ml BSA, wurden zu
Parallelkulturen als Kontrolle zugefügt.
-
Mikromassekulturen
wurden nach unterschiedlichen Zeitspannen für die RT-FCR-Analyse und die
Elsass-Blau-Färbung,
wie unten erklärt,
geerntet. Zum Vergleich wurden menschliche Haut-Fibroblasten unter identischen Bedingungen
kultiviert.
-
Für die histochemische
und immun-histochemische Analyse wurden Mikromassekulturen, wie
unten beschrieben, durchgeführt.
-
In vitro Elsass-Blau-Färbung
-
Die
Zellen wurden zweimal mit PBS gespült, in Methanol eine Stunde
bei –20°C fixiert,
mit destilliertem Wasser gewaschen und über Nacht mit Elsass-Blau bei
pH 0,2 bedeckt (0,5 % Elsass-Blau 8 GS, erhältlich von Carl Roth, in 1
N HCl). Die quantitative Analyse wurde durch Extraktion von Elsass-B1au-gefärbten Kulturen
mit 200 μl
6 M Guanidin HCl in Milli-Q-Wasser
für 6 Stunden
bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die optische Dichte des extrahierten Farbstoffs wurde dann bei 630
nm unter Verwendung von Spectronic 2000 (Bausch & Lomb) gemessen. Parallel wurden
menschliche Haut-Fibroblasten als negative Kontrolle verwendet und
menschliche artikuläre
Chondrozyten als Positivkontrolle.
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7 zeigt
eine Elsass-Blau-Färbung
bei pH 0,2 von menschlichen skelettalen Vorläuferzellen in Mikromassekultur,
entweder unbehandelt (7A) oder 6 Tage mit 10 ng/ml TGF-β 1 behandelt
(7B). Die unbehandelten Proben zeigen keine blaue Farbe, während die
behandelten Proben eine starke blaue Färbung zeigen.
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Histologie und Immunhistochemie
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Für histologische
und immunhistochemische Analysen wurden 100 μl einer Skelett-Vorläuferzellsuspension
in Mikromasse in indivuelle Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen plattiert.
Die Mikromassen wurden entweder mit 10 ng/ml TGF-β 1 oder mit
derselben Menge einer TGF-β 1-Trägerlösung in
dem chemisch definierten serumfreien Medium behandelt. Nach 15 bis
20 Tagen wurden die Mikromassen von den Vertiefungen abgelöst, mit
10 % Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und bei 5 μm sektioniert.
Für die
histologische Überprüfung wurden
die Sektionen von Paraffin befreit und mit Toluidin-Blau, Safranin
0 oder Elsass-Blau bei pH 2,5 gemäß den Standardprotokollen gefärbt (Manual
of Histological Techniques). Im letzteren Fall wurde Neutral-Rot
für die
Gegenfärbung
der Kerne verwendet. Für
die immunhistochemische Analyse wurden die Sektionen von Paraffin
befreit und mit Chondroitinase ABC (Sigma) mit 50 mU/ml bei Raumtemperatur
für eine Stunde
vorverdaut, um den Zugang für
die Antikörper
zu erleichtern. Nicht-spezifische Antikörperbindung wurde durch Inkubation
der Objektträger
in 5 % BSA in PBS für
eine Stunde blockiert. Die Sektionen wurden dann eine Stunde mit
einem Maus-Anti-humanen-Typ-2-Collagen monoklonalen Antikörper (erhältlich von
Chemicon International), verdünnt
1:5 in 0,5%iger BSA in PBS inkubiert. Die Reaktivität wurde
mit einem Fluoreszenzmikroskop nach Inkubation für eine Stunde mit einem Cy3-konjugierten
sekundären
Antikörper
(Ziegen-Anti-Maus-IgG; Jackson ImmunoResearch Laboratorien) nachgewiesen,
der in 0,5%iger BSA in PBS 1:500 verdünnt worden war. Die Kerne wurden
mit DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol;
ICN) gegengefärbt.
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8 zeigt
die histochemische und immunhistochemische Analyse von Mikromassen,
entweder unbehandelt (A, B, H) oder mit 10 ng/ml TGF-β 1 für 15 Tage
behandelt. CDMP-1-markierte Zellen in Mikromasse mit TGF-β 1 durchlaufen
eine Chondrogenese. Die extrazelluläre Knorpelmatrix ist mit Toluidin-Blau
(C) und Elsass-Blau (D nach 7 Tagen, F nach 15 Tagen) gefärbt. Die
extrazelluläre
Knorpelmatrix ist auch Typ-II-Collagen immunogefärbt (G, H nach 15 Tagen).
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Beispiel 7 – Verstärkung der
Knorpelbildungsfähigkeit
von Chondrozyten mit skalettalen Vorläuferzellen
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Die
Wechselwirkungen von skelettalen Vorläuferzellen und artikulären Chondrozyten
wurden sowohl in vitro als auch in vivo bewertet. Für diese
Experimente verwendeten wir menschliche skelettale Vorläuferzellen
aus Beispiel 2 und artikuläre
Schweine-Chondrozyten, erhalten wie unten angegeben, um den relativen Beitrag
von zwei unterschiedlichen Zelltypen zu dem Knorpelbildungsprozess
zu bestimmen. Wie in Beispiel 5 erklärt, kann der Beitrag von menschlichen
Zellen durch Durchführen
einer in-situ-Hybridisierung
auf human-spezifische alu-Gene sichergestellt werden. Die Zugabe
von menschlichen skelettalen Vorläuferzellen aus Beispiel 3 zu
artikulären
Schweine-Chondrozyten
ergab eine dramatische Auswirkung auf das Knorpelbildungspotenzial
der Chondrozytenzellen. Insbesondere wurde ein Anstieg der Menge
des hergestellten Knorpels und gleichzeitig eine Abnahme des Grenzwerts
des in-vivo-Assays (d.h. es waren weniger als eine Million Zellen
für die
Knorpelbildung und Organisation nötig) beobachtet.
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Erhalt von
artikulären
Schweine-Chondrozyten
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Knorpel
wurde zu voller Dicke aus dem metatarsalen und metatarso-phalangealen
Gelenken eines erwachsenen Schweins geschnitten und in HBSS, supplementiert
mit Antibiotika, platziert. Nach zwei Waschschritten in HBSS, enthaltend
Antibiotika, für
5 Minuten bei 37°C
wurde der Knorpel fein zerkleinert und in eine sterile 0,2%ige rohe
Collagenaselösung
in hoch glukosehaltigem DMEM, enthaltend 10 % FBS und Antibiotika, platziert.
Nach einer Inkubation bei 37°C über Nacht
wurden die Zellen zweimal in Kulturmedium (DMEM, enthaltend 10 %
FBS und Antibiotika) gewaschen und mit dem Trypan-Blau-Ausschlusstest
gezählt,
um die Zahl der lebensfähigen
Zellen einzustellen,
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In-vitro-Co-Kultur
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Durch
serielle Passagen geführte
menschliche skelettale Vorläuferzellen
aus Beispiel 2 und frisch isolierte artikuläre Schweine-Chondrozyten wurden
in Mikromassekulturen plattiert unter Verwendung der in Beispiel
6 beschriebenen Bedingungen, und zwar in dieselbe Vertiefung einer
Platte mit 12 Vertiefungen ohne Zugabe von Wachstumsfaktoren. Als
Kontrollen wurden zwei Mikromassen von menschlichen skelettelen
Vorläuferzellen
in eine Vertiefung und in eine andere Vertiefung zwei Mikromassen
von artilculäre
Schweine-Chondrozyten
pipettiert. In jeder Vertiefung hatten die zwei Mikromassen keinen
physikalischen Kontakt. Die Mikromassen wurden für die histochemische Analyse
und die Färbeprotokolle
geerntet.
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In-vivo-Co-Implantation
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Durch
serielle Passagen geführte
menschliche skelettale Vorläuferzellen
aus Beispiel 2 und frisch isolierte artikuläre Schweine-Chondrozyten wurden
intramuskulär
in Nacktmäuse
in unterschiedlichen Verhältnissen,
wie in Tabelle 2 angegeben, injiziert. Als Kontrollen wurden menschliche
skelettale Vorläuferzellen
und artikuläre
Schweine-Chondrozyten
ebenfalls separat injiziert, wobei dieselben Zelldichten verwendet
wurden. Die Tiere wurden nach 3 Wochen durch Cervix-Dislokation
geopfert. Die Implantate wurden gewogen und entweder sofort eingefroren
und in flüssigem
Stickstoff gelagert oder in frisch angesetztem 4%igem Formaldehyd für 4 Stunden
fixiert. Nach dem Fixieren wurden die Proben in Paraffin eingebettet,
bei 5 μm
selctioniert und gemäß den Standard-Protokollen
gefärbt
(Elsass-Blau, pH 2,5, Toluidin-Blau, Masson-Trichrome, Safranin
O) (Manual of Histological Techniques). Die in-situ-Hybridisierung
für die
human-spezifische alu-Sequenz wurde durchgeführt, Um menschliche skelettale
Vorläuferzellen
von artikulären Schweine-Chrondrozyten
in dem Implantat nachzuweisen und zu unterscheiden. Die Ergebnisse
waren die folgenden:
-
-
Alle
Zahlen sind in Millionen ausgedrückt.
-
8 zeigt
die Genexpressions-Dynamik, bestimmt durch RT-PCR während der
Chondrogenese in CDMP-1-markierten skelettalen Vorläuferzellen.
Spuren
1 und 2: | Menschliche
Dermis-Fibroblasten |
Spur
3: | Menschliche
skelettale Vorläuferzellen
in Monolayer |
Spuren
4 bis 12: | Menschliche
skelettale Vorläuferzellen
in Mikromasse |
-
Es
kann festgestellt werden, dass CDMP1 stark herabreguliert wird,
wenn die skelettalen Vorläuferzellen
in die Chondrogenese eintreten und zu dem Chondrozyten-Phänotyp reifen.
Der reife Chondrozyten-Phänotyp
wird durch das Auftreten von Typ-II-Collagen, Typ-X-Collagen, FGFR3
(Fibroblasten-Wachstumsfaktor 3) und BMP2 angekündigt. Ein positiver Marker
gemäß der vorliegenden
Erfindung, wie der CDMP-1-Marker oder ein Marker oder Faktor, der
mit diesem Marker co-exprimiert wird oder co-nachweisbar ist und
ein negativer Marker, wie z.B. die Chondrozyten-Marker Typ-II Collagen,
Typ-X-Collagen, FGFR3 und BMP2 oder ein Marker, der mit irgendeinem
oder allen diesen Markern co-exprimiert wird oder co-nachweisbar
ist, schließen sich
gegenseitig aus. Die skelettalen Vorläuferzellen der vorliegenden
Erfindung können
durch einen positiven Marker identifiziert werden, wie z.B. CDMP-1
(oder einen Marker oder Faktor, der mit CDMP-1 co-exprimiert wird oder
co-nachweisbar ist), der nicht zur gleichen Zeit wie ein negativer
Marker exprimiert wird, wie z.B. FGFR3 oder ein anderer Faktor oder
Marker, der mit FGFR3 co-exprimiert wird oder co-nachweisbar ist.
-
Obwohl
die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf skelettale Vorläuferzellen
beschrieben wurde, wird der Fachmann anerkennen, dass die vorliegende
Erfindung auf jede Art einer Gewebereparatur angepasst werden kann.
Das zu befolgende Verfahren ist die Identifizierung embryonaler
Marker oder von Markern, die Vorläuferzellen für spezifische
Gewebezellen identifizieren, die repariert werden sollen, um dann
Zellen aus dem Organismus zu selektieren, die den Marker zeigen.
Die selektierten Zellen können
dann ex vivo/in vitro expandiert und darauffolgend zur Reparatur
des Gewebes reimplantiert werden.