DE69928678T2

DE69928678T2 - Verwendung von wachstumsfaktoren und hormonen zur vermehrung menschlicher chondrozyten und knorpelgewebeherstellung

Info

Publication number: DE69928678T2
Application number: DE69928678T
Authority: DE
Inventors: E. Lisa FREED; Ivan Martin; Robert Langer; Gordana Vunjak-Novakovic
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1998-09-18
Filing date: 1999-09-17
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2019-09-18
Also published as: CA2344399A1; ATE311437T1; WO2000017321A2; WO2000017321A3; WO2000017321A9; EP1112348B1; JP2004502401A; DE69928678D1; EP1112348A2; US6582960B1; ES2251842T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Nahezu 8 Millionen chirurgische Eingriffe werden jährlich allein in den Vereinigten Staaten durchgeführt, um Gewebe- und Organdisfunktionen zu behandeln. Tissue Engineering (Herstellung von künstlichen Geweben) ist die Entwicklung von biologischen Substituten, um die Gewebefunktion wiederherzustellen, zu erhalten oder zu verbessern. Spezifisch ist Tissue Engineering ein Verfahren durch welches neue lebende Gewebe im Labor erzeugt werden, um erkrankte oder traumatisierte Gewebe zu ersetzen (Langer et al., Science, 260:920–926, 1993).
Eine spezielle Strategie, die entwickelt wurde, um neue Gewebe zu regenerieren ist (i) spezifische Zellen aus dem Gewebe zu isolieren; (ii) die isolierten Zellen in vitro zu expandieren; und (iii) die expandierten Zellen in die erkrankten oder traumatisierten Gewebe zu implantieren, so dass die implantierten Zellen in vivo proliferieren und eventuell den Gewebedefekt ersetzen oder reparieren (Langer et al., oben). Diese Technik wurde für eine Vielzahl von Zelltypen und Gewebedefekten angewendet (siehe z.B. Brittberg et al., N. Engl. J. Med., 331:889–895, 1994; Rheinwald et al., Cell, 6:331-344, 1975; Langer et al., oben). Isolierte Zellen können entweder differenzierte Zellen von spezifischen Geweben oder undifferenzierte Vorläuferzellen (Stammzellen) sein. In beiden Fällen ist die Etablierung von geeigneten Kulturbedingungen für die Zellexpansion äußerst wichtig, um ihr Potential für Regenerierung struktureller und funktioneller Gewebeäquivalente zu erhalten oder zu verbessern (Rheinwald et al., oben).
Ein besonderer Schwerpunkt für die Entwicklung von Geweberegenerationstechniken war die Behebung von Defekten in Knorpelgeweben. Ungleich anderen Geweben hat, Knorpel nur eine geringe Fähigkeit nach einer Verletzung, einer Krankheit oder als ein Ergebnis des hohen Alters, sich selbst zu regenerieren. Dies beruht auf der avaskulären Natur des normalen Gelenkknorpels. Obwohl die Verletzung der oberflächlichen Knorpelplatte im Allgemeinen nicht heilt, ist der subchondrale Knochen vaskularisiert, daher heilt eine Verletzung dieser Stelle in einem bestimmten Umfang. Der neue Knorpel, der anstelle des beschädigten Gelenkknorpels wächst, wird als Faserknorpel bezeichnet. Faserknorpel weist nicht die Beständigkeit und weitere gewünschte mechanische Eigenschaften des ursprünglichen hyalinen Knorpels auf. Menschen, die an Gelenksverletzungen leiden, sind danach für arthritische Degeneration prädisponiert (Freed et al., Biomed. Mat. Res., 28:891–99, 1994; Minas et al., Orthopedics, June, 20(6):525–538, 1997).
Verschiedene unterschiedliche Ansätze wurden unternommen, um Knorpelgewebe zu reparieren. Bei einem Verfahren unter Verwendung von Knorpelexplantaten, wird Knorpel aus einem Körper entnommen und in vitro für die Implantation in Gelenksknorpeldefekten kultiviert (Sah et al., J. Orthop. Res., Januar, 14(1):44–52, 1996). Andere näher zurückliegende Ansätze für die Gelenkknorpelreparatur bestehen typischer Weise aus dem Ernten von Chondrocyten aus knorpeligen Gewebe und Aussäen der Chondrocyten direkt auf eine dreidimensionales Transplantationsmatrixmaterial vor Implantation des Ersatzgewebes in den beschädigten Bereich (Freed et al., oben). Diese Technik resultiert in einem Knorpel mit hoher Qualität, wenn die Regeneration einmal vollständig ist, jedoch erfordert diese Technik eine große Menge an Ausgangsmaterial, die vom Patienten zu ernten ist, was in einem verstärkten Patiententrauma resultiert.
Chondrocyten werden aus einer Biopsie isoliert, in Monolayer(Einschicht)-Kulturen expandiert bis eine ausreichende Menge von Zellen erhalten werden und in die geschädigte Gewebefläche implantiert. Die Implantation erfordert zunächst, dass die Zellen entweder in ein Gel eingebettet oder mit einem biologisch abbaubaren Polymergerüst assoziiert werden (Brittberg et al., Clin. Orthop., Mai 326:270–283, 1996; Minas et al., oben; Freed et al., oben). Die dreidimensionale Natur dieser Matrices beeinträchtigen die strukturelle Integrität des Implantats und stellen eine feste Stütze für das Wachstum der Chondrocytenzellen in knorpeliges Gewebe zur Verfügung. Obwohl dieses System den Vorteil hat, weniger Zellen als Ausgangsmaterial zu erfordern, ist der durch dieses Verfahren erhaltene Knorpel oftmals von geringer Qualität, wenn die Zellen von Spendern mit reifen Skeletten (Erwachsenen) geerntet oder erhalten werden. Alternativ werden Vorläuferzellen aus dem Knochenmark expandiert und verwendet, um Defekte von voller Stärke unter Einschluss sowohl der Knorpeloberfläche und des darunter liegenden subchondralen Knochens zu reparieren (Wakitani et al., J. Bone Joint Surg, 76-A:579–592, 1994: Butnariu-Ephrat et al., Clin. Orthop, 330:234–243, 1996).
Eine besondere Herausforderung, die dieses System darstellt ist die Proliferationsrate der Zellen während der Expansionsphasen einer derartigen Art und Weise zu erhöhen, die in einer erfolgreichen Regeneration resultiert. WO-A-93/0468 offenbart ein spezifisches serumfreies Kulturmedium für die Kultivierung von Fibroblasten oder Chondrocyten. Es wird offenbart, dass die Differenzierung von Fibroblasten durch die Verwendung von Seren mit dem Wachstumsfaktor TGF-β (transforming growth factor beta; TGF-β) verbessert werden kann.
Es besteht ein Bedarf für verbesserte Expansionstechniken für Zellen, die beim Tissue Engineering verwendet werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren für das Expandieren von Chondrocyten für die Verwendung im Tissue Engineering wie in Anspruch 1 definiert. Es ist ein Gesichtspunkt der Erfindung, dass das Expandieren von Zellen in der Anwesenheit von spezifischen Wachstumsfaktoren und Hormonen die Poliferation der Zellpopulation stimuliert, während die Eigenschaften der Zellen, die zur Regeneration von hochqualitativen Gewebe notwendig sind, beibehalten werden. Es ist ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung, Verfahren zur Regeneration von Geweben mit besseren strukturellen und funktionellen Eigenschaften durch Rekapitulieren bzw. Wiederholen von Vorgängen zur Verfügung zu stellen, die während der Embryonalentwicklung auftreten. Es ist noch ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung, Verfahren für den Erhalt oder Verbesserung der Fähigkeit der expandierten Zellen auf Differenzierungsreize zu reagieren zur Verfügung zu stellen, wenn sie neues Gewebe in vitro oder in vivo regenerieren.
Jede Art von biochemischen Faktoren, die die Proliferation der Zellen ohne Verlust der Qualität der Zellen erhöhen, kann in dem Verfahren der Zellexpansion verwendet werden. Nicht-beschränkende Beispiele von biochemischen Faktoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Chondromoduline, Wachstumsfaktoren aus Blutplättchen, epidermale Wachstumsfaktoren, der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2, Wachstumsfaktor TGF-β, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren, knochenmorphogenetische Proteine, epidermale Wachstumsfaktoren, und aus Blutplättchen stammende Wachstumsfaktoren, wenn auch die Erfindung die Expansion von Chondrocyten in einem Zellkulturmedium erfordert, das wenigstens den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 und den Wachstumsfaktor TGF-β enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Knorpelgewebe für das Tissue Engineering unter Verwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung regeneriert. Es wird nachgewiesen, dass aus reifem Knorpelgewebe isolierte Chondrocyten in der Anwesenheit des Fibroblasten-Wachstumsfaktors-2 (FGF-2) expandiert werden können und dann zur Regenerierung von Knorpelgewebe verwendet werden können. Spezifisch hilft FGF-2 zugegeben zu einem Kulturmedium während der Zellexpansion in Zellen ihr Potential zur Regeneration von knorpeligen Gewebe beizubehalten. Spezifisch senkt FGF-2 die Verdopplungszeit der Zellpopulation, während es eine Zellpopulation mit einem homogenen Differenzierungszustand erzeugt und ihre Fähigkeit zur Antwort auf Umweltänderungen erhält, wie etwa Reaktionen auf Wachstumsfaktoren wie Insulin.
Erfindungsgemäß werden Chondrocyten, bevorzugt von Säugetieren, und bevorzugter von Menschen, aus reifem knorpeligen Gewebe isoliert und in vitro in der Anwesenheit des Fibroblasten-Wachstumsfaktors 2 (FGF-2) und des Wachstumsfaktor TGF-β 1 expandiert. Diese Expansion erlaubt die Entdifferenzierung bzw. Dedifferenzierung der Zellen bei Beibehaltung ihres vollen Potentials für die Redifferenzierung bzw. Rückdifferenzierung in Reaktion auf Umweltänderungen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform resultiert die Expansion und Entdifferenzierung von menschlichen Chondrocyten in Zellen, die in primäre Chondrocyten für die Verwendung im Tissue Engineering redifferenziert werden können. Die Redifferenzierung wird bevorzugt in einem serumfreien Medium durchgeführt. Bevorzugter wird die Redifferenzierung in einem serumfreien Medium durchgeführt, das Insulin, Wachstumsfaktor TGF-β und Dexamethason enthält. Am meisten bevorzugt wird die Redifferenzierung in einem serumfreien Medium durchgeführt, das Insulin, Transferrin, selenige Säure, Linoleinsäure, Albumin, Ascorbinsäure, den Wachstumsfaktor TGF-β und Dexamethason enthält.
Es wurde gefunden, dass die Expansion von Zellen in der Anwesenheit von biochemischen Wachstumsfaktoren für die Verwendung im Tissue Engineering ebenfalls die Effizienz der Transfektion von Nukleinsäuren in die Zellen verbessert. Typischer Weise wird der Gentransfer während der Monolayer-Expansion durchgeführt. Daher können Anwendungen, in den Tissue Engineering-Techniken mit Gentherapie kombiniert werden, in Übereinstimmung mit den Lehren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Definitionen
"Entdifferenzierung": "Entdifferenzierung" wird hierin verwendet, um Zellen zu beschreiben, die keine differenzierten Funktionen haben, und um die Regression in einen früheren, bipotenten oder multipotenten embryonalen Zustand zu implizieren. Zum Beispiel, wenn Chondrocyten aus Knorpelgewebe aus der Knorpelmatrix freigesetzt und in einer Monolayer-Kultur gegeben werden, hören sie auf charakteristische Merkmale zu produzieren, die sie als differenziert definieren. Zwei derartige Marker für differenzierte Chondrocytenzellen sind zwei gut charakterisierte strukturelle Makromoleküle, Knorpel-Proteoglycan und Kollagen Typ II.
"Bioaktives Molekül" oder "biochemischer Faktor": "Bioaktives Molekül" oder "biochemischer Faktor" wird hierin verwendet, um eine chemische Substanz oder Protein zu bezeichnen, die eine metabolische Reaktion einer Zelle auslösen können. Ein biochemischer Faktor kann ein Protein sein, zum Beispiel ein Hormon oder ein Wachstumsfaktor, der einen spezifischen biochemischen Weg in der Zelle stimulieren wird. Ein biochemischer Faktor kann auch einfach eine chemische Substanz sein, wie etwa ein chemotherapeutisches Mittel. Ein "bioaktives Molekül" umfasst ebenfalls jeden hydrodynamischen Faktor oder Signal.
"Expandieren": "Expandieren" oder „expandiert" wird hierin verwendet, um ein Verfahren oder das Wachstum von Zellen in vitro zu bezeichnen.
Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A ist eine Grafik, die das Gewicht der gezüchteten Konstrukte darstellt, die entweder aus primären Chondrocyten oder aus Chondrocyten expandiert mit oder ohne FGF-2 in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Insulin. gewachsen sind.
Die 1B ist eine Grafik, die den Prozentsatz von Glycosaminoglycan auf das Feuchtgewicht von Konstrukten darstellt, die aus primären Chondrocytenexpandiert mit oder ohne FGF-2 in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Insulin gewachsen sind.
2. Kollagen Typ II-Färbung von Chondrocyten-Monolayern. Ohne (A, C) oder mit (B, D) FGF-2 nach der ersten (A, B) und zweiten (C, D) Passage expandierte Chondrocyten. Mit FGF-2-expandierte Chondrocyten zeigten einen geringeren Grad an Kollagen Typ II, was eine schnellere und homogenere Entdifferenzierung anzeigt. Maßstabsbalken = 100 μm.
3. F-Actin-Färbung von Chondrocyten Monolayern. Für zwei Passagen in Medium ohne FGF-2 (A), mit (B) FGF-2 und in Medium mit FGF-2 nur während der ersten Passage (C) oder nur während der zweiten Passage (D) expandierte Chondrocyten. Ohne FGF-2 expandierte Chondrocyten zeigten starke F-Actin-Fasern. Maßstabsbalken = 10 μm.
4. Glycosaminoglycan (GAG) und Kollagen Typ II-Färbung von Chondrozyten-Polymerkonstrukten. Konstrukte auf der Grundlage von primären Chondrocyten (I) und Chondrocyten, die für zwei Passagen ohne FGF-2 (II) und mit FGF-2 (III) expandiert wurden, nach einer Woche (A, B, C) und sechs Wochen (D, E, F) Kultivierung. Histologische Schnitte wurden mit Safranin 0 für GAG (A, B, D, E) oder mit einem monoklonalen Antikörper für Kollagen Typ II (C, F) gefärbt. Primäre und FGF-2-expandierte Chondrocyten wiesen ein kontinuierliches ECM auf, das hohe Konzentrationen an GAG und Kollagen Typ II enthält, während ohne FGF-2-expandierte Chondrocyten eine Kontraktion des Polymergerüst und in Konstrukten mit einer geringen Menge an GAG mit nicht nachweisbaren Menge an Kollagen Typ II resultierten. Die Pfeile zeigen Polymerfasern. Maßstabsbalken = 2 mm (A, D) oder 100 μm (B, C, E, F).
5. F-Actin-Färbung von Chondrozyten-Polymerkonstrukten. Konstrukte auf der Grundlage von primären Chondrocyten (A) und für zwei Passagen expandierten Chondrocyten ohne FGF-2 (B) und mit FGF-2 (C), kultiviert für eine Woche. Primäre und FGF-2 expandierte Zellen haben eine kugelförmige Morphologie, die typisch für differenzierte Chondrocyten ist, während ohne FGF-2-expandierte Zellen ein längliches Fibroblasten-ähnliches Erscheinungsbild hatten, mit reichlich F-Actin-Strukturen im Zytoplasma. Pfeile zeigen eine restliche Polymerfaser. Maßstabsbalken = 20 μm.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Zu implantierende Zellen
Die vorliegende Erfindung stellt verbesserte Verfahren für das Tissue Engineering zur Verfügung. Insbesondere stellt die Erfindung verbesserte Ansätze zum Expandieren von Zellen für die Verwendung in Tissue Engineering-Anwendungen zur Verfügung. Die grundlegende Theorie, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, ist das zur Regeneration von Geweben mit besseren strukturellen und funktionellen Eigenschaften es wünschenswert ist, Vorgänge zu rekapitulieren, die während der Embryonalentwicklung auftreten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden aus einem reifen Gewebe isolierte Zellen expandiert und in der Anwesenheit von spezifischen biochemischen Faktoren entdifferenziert, um ihr Differenzierungspotenzial zu bewahren. Auf diese Art und Weise können die Zellen besser in der Lage sein auf Differenzierungsreize zu reagieren, wenn sie ein neues Gewebe in vitro oder in vivo regenerieren.
Spezifisch stellt die neue Erfindung Verfahren für die verbesserte Expansion von Chondrocyten zur Verfügung, die beim Tissue Engineering verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung spezifische Wachstumsfaktoren für das Zellkulturmedium zur Verfügung, um die Proliferation der Chondrocyten zu fördern, während das Differenzierungspotenzial der Zellen erhalten bleibt. Um einige Beispiele zu geben, enthalten Wachstumsfaktoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, Chondromoduline, Wachstumsfaktoren aus Blutplättchen, epidermale Wachstumsfaktoren, der Heparinbindungsfaktor, die Wachstumsfaktor α und β (transforming growth factor alpha und beta), der Fibroblasten-Wachstumsfaktor alpha, der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2, insulinähnliche Wachstumsfaktoren, knochenmorphogenetische Proteine und vasculäre Endothel-Wachstumsfaktoren, wenn auch die Erfindung eine Expansion von Chondrocyten in einem Zellkulturmedium erfordert, das wenigstens den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 und den Wachstumsfaktor TGF-β enthält. In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Zugabe von Hormonen (z.B. Insulin, Glucagon oder Östrogen) zu dem Zellkulturmedium zur Verfügung, um die Proliferation der Zellen zu fördern, während das Differenzierungspotenzial der Zellen erhalten bleibt. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen können angiogene Faktoren für die in vitro-Expansion verwendet werden.
Tissue Engineering-Techniken wurden verwendet, um Defekte in einer Vielzahl von unterschiedlichen Zelltypen zu beheben. Tissue Engineering kann für die Beseitigung von Defekten von hartem Gewebe angewendet werden, wie etwa bei Defekten in Knorpel oder Knochen, die bei einer Krankheit oder einem Trauma auftreten. Tissue Engineering wurde ebenfalls für die Berichtigung von Weichgewebestrukturen verwendet. Zum Beispiel können Zellen verwendet werden, um metabolische Organe (z.B. die Leber oder die Bauchspeicheldrüse), epidermales Gewebe (z.B. bei Brandopfern) oder zum Wiederaufbau oder zur Vermehrung von Brustgewebe verwendet werden (z.B. können Muskelzellen verwendet werden, um die Brust von Frauen mit Brustkrebs, angeborenen Defekten oder Verletzungen in der Folge eines Traumas wieder aufzubauen; siehe US Patent Nr. 5,512,600 und WO/96/18424). Weiterhin können angeborene Schäden, wie etwa vesicoureteraler Reflux oder Inkontinenz durch Implantation eines Gels oder einer Gerüstmatrix mit eingesäten Muskelzellen in einer Menge, die wirksam ist, um einen Muskelbereich zu erhalten, der die erforderliche Kontrolle über den Urindurchfluß zur Verfügung stellt, oder den Schaden auf andere Weise behebt (US Patent Nr. 5,667,778.
Erfindungsgemäß können die Zellen, die zum Wiederaufbau oder zur Vergrößerung der spezifischen physikalischen Stelle verwendet werden, unterschiedlich sein zu den Zellen, die normalerweise das Gewebe im Körper bilden. Zum Beispiel können Chondrocyten verwendet werden, um Weichgewebedefekte zu beheben, dadurch dass sie als ein Auffüllmittel dienen (US Patent Nr. 6,060,053). In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen werden verschiedene Zelltypen verwendet, um ein einzelnes regeneriertes Gewebe zu erzeugen. In jedem Fall ist es wichtig, dass die erfindungsgemäßen Zellen in Anwesenheit von spezifischem biochemischen Faktoren expandiert und entdifferenziert werden, ohne die für die erfolgreiche Geweberegeneration erforderlichen zellulären Eigenschaften zu verlieren.
Viele verschiedene biochemische Faktoren können in der Erfindung verwendet werden. Spezifische biochemische Faktoren sind bevorzugt in der Lage die Proliferation von relevanten Zellen in vitro zu stimulieren und können die Entdifferenzierung von aus einem reifen Gewebe isolierten differenzierten Zellen unterstützen. Erfindungsgemäß wird ein Faktor bevorzugt, der, wenn er zu dem Gewebekulturmedium während der Expansion der isolierten Zellen zugegeben wird, die Verdopplungszeit der Zellpopulaton vermindert. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Faktoren zur Verfügung, die, wenn sie zu einem Gewebekulturmedium gegeben werden, die Wirkung der Umkehr des Differenzierungsprozesses eines spezifischen, reifen Zelltyps haben oder das Differenzierungspotenzial eines unreifen Zelltyps erhalten. Besonders bevorzugt sind biochemische Faktoren, die sowohl die Verdopplungszeit der speziellen Zellpopulation vermindern als auch das Differenzierungspotenzial erhalten. Derartige Eigenschaften reproduzieren eine embryonale Umgebung für die Zellen und fördern die Regeneration von Gewebe mit hoher Qualität, für die vorher beschriebenen Anwendungen. Ohne zu wünschen, die Erfindung zu begrenzen sind einige Beispiele von biochemischen Faktoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, Chondromoduline, Wachstumsfaktoren aus Blutplättchen, ein epidermaler Wachstumsfaktor, der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2, der Wachstumsfaktor TGF-β, insulinähnliche Wachstumsfaktoren und knochenmorphogenetische Proteine, wenn auch die Erfindung die Expansion in einem Zellkulturmedium erfordert, das wenigstens den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 und den Wachstumsfaktor TGF-β enthält.
Der Zustand der expandierenden Zellen beeinflusst signifikant die erfolgreiche Regenerierung von Gewebe mit hoher Qualität. Daher fördert bevorzugt die Wachstumsumgebung der Zellen während der in vitro-Expansionen der Zellen die Optimierung des Expansionsprozesses. In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die expandierten Zellen in Bezug auf ihr Differenzierungsstadium homogen sind. Erfindungsgemäß kann die Wachstumsumgebung durch die Zugabe von Wachstumsfaktoren und/oder Hormonen manipuliert werden, um eine homogene Population von entdifferenzierten Zellen zu erhalten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Chondrocyten durch das erfindungsgemäße Verfahren für die Regeneration von Knorpelgewebe expandiert. Spezifisch werden aus einer Person isolierte Chondrocyten in der Anwesenheit von Wachstumsfaktoren expandiert, die die Proliferationsrate der Chondrocyten erhöhen, während sie die geeigneten Differenzierungseigenschaften der Zellen erhalten, um eine erfolgreiche Regeneration von Knorpelgewebe von hoher Qualität für die Implantation sicherzustellen.
Vor der vorliegenden Erfindung wurde Knorpelgewebe in Gewebekultur über einen von zwei Wegen erhalten: (i) Knorpelgewebe wurde aus dem Körper isoliert und in einer in vitro-Gewebekultur (Gewebeexplantat) vermehrt, oder (ii) primäre Chondrocytenzellen, isoliert aus Knorpelgewebe, wurden auf ein dreidimensionales polymeres Gerüst ausgesät und proliferierten und differenzierten auf dem Gerüst, um Knorpelgewebe (Gewebeimplantate) zu bilden. Bemühungen zunächst Chondrocytenzellen in in vitro-Monolayer-Kulturen vor dem Aussäen von dreidimensionalen polymeren Gerüsten zu expandieren waren im Allgemeinen in der Hinsicht erfolglos, dass das erhaltene Knorpelgewebe bei derartigen Bemühungen von schlechter Qualität verglichen zu dem Knorpelgewebe erhalten durch Einsäen des polymeren Gerüsts mit frisch isolierten primären Chondrocyten war.
Es ist bekannt, dass Säugetierzellen (z.B. Chondrocyten und Knochen) in einer dreidimensionalen Umgebung sehr unterschiedlich auf Reize reagieren (z.B. biochemische Faktoren und hydrodynamische Faktoren oder Signale) als es Zellen in Monolayer-Kulturen tun. Es wurde gezeigt, dass der differenzierte Phänotyp von Chondrocytenzellen durch Übertragung von ihnen aus einer Monolayer-Kultur in eine dreidimensionale Umgebung stabilisiert werden kann (Benya et al., Cell, 30:215–224, 1982). Chondrocytenzellen in Monolayer-Kultur bilden typischerweise differenzierte Fibroblastenzellen (Kato et al. J. Cell Biol., Februar, 100(2):477-485, 1985). Der Verlust des chondrocytischen Phänotyps in der Monolayer-Kultur trägt zu der Unfähigkeit der expandierten Zellen bei, erfolgreich Knorpelgewebe einzusäen und zu regenerieren, das äquivalent zu durch frisch isolierte primäre Chondrocyten direkt eingesät auf die polymere Matrix gebildetem Knorpelgewebe ist. Eine besondere Herausforderung ist die Zellmasse zu erhöhen ohne ebenfalls in einen Verlust der Qualität der Zelle in einem regenerierten Knorpelgewebe zu resultieren.
Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) wurde in vitro an Chondrocytenzellen sowohl in der Monolayer-Kultur als auch in einer dreidimensionalen Umgebung angewendet. Es wurde festgestellt, dass der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) (ebenfalls basic fibroblast growth factor genannt) ein potentes Mitogen für Chondrocyten in Monolayer-Kultur und in vivo ist (Wroblewski et al., J. Bone Miner. Res., Mai, 10(5):735-742, 1995; Kato et al., J. Biol. Chem., 265:5903–5909, 1990).
Jedoch waren Berichte über die Verwendung von FGF-2 zur Kultivierung von Knorpelgewebe in vitro in einer dreidimensionalen Umgebung widersprüchlich. Zum Beispiel wurde über FGF-2 sowohl berichtet, dass es (i) eine Abnahme der reifen phänotypischen Eigenschaften typisch für Knorpelexplantate verursacht (Sah et al., oben) und (ii) die Proliferationsrate erhöht, ohne die reifen phänotypischen Eigenschaften von mit Chondrocyten eingesäten Implantaten in der Anwesenheit von FGF-2 beeinträchtigt (Toolan et al., J. Biomed Mater Res., Juni 31(2):273–280, 1996).
Obwohl Chondrocyten in der Anwesenheit von FGF-2 kultiviert wurden, und FGF-2 verwendet wurde, um mit Chondrocyten eingesäte Implantate zu kultivieren, wurden FGF-2-expandierte Chondrocyten nicht für das Tissue Engineering oder die Geweberegeneration verwendet. Unter der Voraussetzung der unterschiedlichen Wirkungen von FGF-2 auf Chondrocyten in Monolayer-Kulturen gegenüber einem polymeren Gerüst, gab es keinen Grund für die Erwartung, dass die Verwendung von in FGF-2 expandierten Zellen zum Einsäen von dreidimensionalen Matrizes erfolgreich sein würde.
Die vorliegende Erfindung beweist, dass wenn FGF-2 zu dem Kulturmedium während der Expansionsphase gegeben wird, nicht nur die Chondrocyten schneller proliferieren sondern ebenfalls ein höheres Potenzial beibehalten um knorpelige Gewebeäquivalente zu regenerieren (siehe Beispiel 1). Eine schnellere Proliferation mindert ebenfalls die anfängliche Menge an notwendigem Gewebe und/oder die erforderliche Zeit, um eine ausreichende Menge von Zellen zum Einsäen auf ein Gerüst oder eine Gelstruktur zu erhalten. Ohne das es erwünscht ist an eine besondere Theorie gebunden zu sein, schlagen wir vor, dass FGF-2 nicht bei der Induzierung der chondrogenen Differenzierung von regenerierendem Gewebe wirksam ist, sondern bei der Beibehaltung des chondrogenen Differenzierungspotenzials von Chondrocyten während ihrer in vitro-Expansion von Chondrocytenzellen.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Expansion von Chondrocyten in FGF-2-haltigem Medium dabei hilft, ihr Potenzial zur Regeneration von knorpeligem Gewebe beizubehalten. Daher stellen mit FGF-2-expandierte Chondrocyten eine Zellpopulation mit einem höheren Potenzial für die Reparatur von Knorpeldefekten dar als Chondrocyten, die in einem Kulturmedium ohne FGF-2 expandiert wurden. Es ist besonders bevorzugt, dass Chondrocyten in der Anwesenheit von FGF-2 expandiert werden, bevor sie in eine Implantationsmatrix eingesät werden, wobei zu diesem Zeitpunkt eine weitere Proliferation auf der Matrix in der Anwesenheit oder Abwesenheit von FGF-2 durchgeführt werden kann.
Erfindungsgemäß werden Säuger-Chondrocyten, bevorzugt menschliche, in einem Medium expandiert, dass den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) und ebenfalls den Wachstumsfaktor TGF-β enthält. Wie vorher diskutiert, erlaubt die Expansion von Chondrocyten im Zellkulturmedium die Entdifferenzierung von Zellen während ihr volles Potenzial zur Redifferenzierung in Antwort auf Umweltänderungen beibehalten wird, und erzeugt Zellen, die nützlich für die Regeneration von Knorpel durch Tissue Engineering sind.
Über dies werden menschliche Chondrocyten expandiert in einem Zellkulturmedium, das FGF-2 und TGFβ enthält, bevorzugt in primäre Chondrocyten in einem Zellkulturmedium redifferenziert, das im Wesentlichen frei von Serum ist. Bevorzugt enthält das serumfreie Zellkulturmedium ebenfalls Insulin, TGFβ und Dexamethason. Noch mehr bevorzugt enthält das serumfreie Kulturmedium Insulin, Transferrin, selenige Säure, Linoleinsäure, Albumin, Ascorbinsäure, den Wachstumsfaktor TGF-β (TGF-β) und Dexamethason. In Beispiel 2 beschriebene Experimente beweisen, das humane Chondrocyten, die im Zellkulturmedium in Monolayern expandiert werden, um die höchste Proliferationsrate zu induzieren, nachfolgend die höchsten Spiegel an Redifferenzierungsmarkern zu erzeugen, wenn sie in der Anwesenheit von TGF-β und FGF-2 expandiert werden. Überdies erzeugt die Redifferenzierung von expandierten humanen Chondrocyten die höchsten Spiegel an Differenzierungsmarkern, wenn sie in einem serumfreien Kulturmedium kultiviert werden, das Insulin, TGF-β und Dexamethason enthält.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung ist es wünschenswert, das die zum Einsäen von Implantationsmatrizes präparierten Zellen auf andere biochemische Faktoren und Signale reagieren können. Frisch aus knorpeligen Gewebe isolierte Chondrocyten reagieren normalerweise auf Insulin, welches eine erhöhte Proliferation der Chondrocyten verursacht. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass Chondrocyten, die zunächst in der Anwesenheit von FGF-2 expandiert wurde, auf Insulin in einer Art und Weise reagieren, die ähnlich zu Chondrocyten ist, die ohne zwischengeschalteten Expansionsschritt direkt aus Knorpelgewebe geerntet und direkt auf die Implatationsmatrix eingesät wurden (siehe Beispiel 1). Da FGF-2-expandierte Chondrocyten stark auf Insulin in einer ähnlichen Art und Weise wie frisch geerntete Chondrocyten reagieren, können sie eine geeignete Zellpopulation für die Knorpelregeneration in denjenigen Therapien darstellen, die die Verwendung von zusätzlichen Hormonen und Wachstumsfaktoren umfassen, um die Geweberegeneration weiter zu stimulieren.
Allgemein ist es bevorzugt, dass in der Praxis die vorliegenden Chondrocyten in der Lage sind, Umweltreize zu empfangen und auf sie zu reagieren, wie die in vitro oder in vivo während des Vorgangs der Geweberegeneration vorhanden sind. Bevorzugt sind die Zellen heterologe Zellen. Alternativ werden die Zellen von einem engen Verwandten oder von einem Individuum der gleichen Art isoliert. Es wird vom durchschnittlichen Fachmann anerkannt werden, dass eine Zellpopulation, die auf Proliferations- oder Differenzierungszellreize reagieren kann für die Verwendung im Tissue Engineering vorteilhaft sein wird. Eine Zellpopulation, die besser auf derartige Reize reagieren kann, wird schneller, zuverlässiger regenerieren und als ein Ergebnis ein Gewebe von höherer Qualität für die Implantation ergeben. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist es erwünscht, während des Regenerationsvorgangs bioaktive Moleküle zu den Zellen zu geben. Eine Vielzahl von bioaktiven Molekülen kann unter Verwendung von zum Beispiel Matrizes beschrieben im US Patent Nr. 5,716,404 (siehe unten) vorgesehen werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird FGF-2 verwendet, um die Expansion von Chondrocyten zu verbessern.
In Übereinstimmung der vorliegenden Erfindung wird FGF-2 und TGFβ verwendet, um die Chondrocyten-Expansion zu verbessern.
In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform verbessert die Expansion von Zellen in der Anwesenheit von biochemischen Wachstumsfaktoren die Verwendung im Tissue Engineering ebenfalls die Effizienz der Transfektion von Nukleinsäuren in die Zellen. Typischerweise wird der Gentransfer während der Monolayer-Expansion durchgeführt. Daher können Anwendungen, in denen Tissue Engineering-Techniken mit Gentherapie kombiniert werden in Übereinstimmung mit den Lehren der vorliegenden Erfindung benutzt werden. Zum Beispiel können ohne Begrenzung, Zellen mit einem Vektor transferiert werden, welche eine Resistenz gegenüber einer Vielzahl von biologischen und chemischen Verbindungen verleiht. Diese Verbindungen enthalten, aber sind nicht begrenzt auf, Antibiotika, Cytokine und inflammatorische Mittel.
Implantation
Dissoziierte Zellen werden in Kombination mit einer geeigneten biologisch abbaubaren, polymeren Matrix implantiert, um ein neues Gewebe zu bilden. Es gibt zwei Formen von Matrizes, welche verwendet werden könne: ein polymeres Hydrogel gebildet aus einem Material, wie etwa Alginat mit darin suspendierten Zellen, und eine fasrige Matrix mit Zwischenräumen zwischen 100 und 300 Mikron. Bevorzugte polymere Matrizes sind diejenigen, die sich über ein bis zwei Monate abbauen, wie etwa Polymilchsäure-Glycolsäure-Copolymere. Die Matrizes können vor der Implantation eingesät werden, oder implantiert, vaskularisiert und dann mit Zellen eingesät werden. Für eine ausführliche Beschreibung von Hydrogel-Polymer-Lösungen und Polymer-Matrizes und anderen Verfahren für die Implantation siehe US Patent Nr. 5,716,404. Für andere Verfahren oder Verwendungen von biologisch abbaubaren Polymeren, um metabolische Organe und andere Gewebe zu regenerieren, z.B. Knorpel, siehe Cima et al., Biotechn. Bioeng., 38:145–158, 1991; Langer et al., Biomaterials, 11:738–745, 1990; Vacanti et al., J. Pediatr. Surg., 23:3–9, 1988; und Vacanti et al., Arch.Surg., 123:545–549, 1988.
In einigen Ausführungsformen werden die Zellmatrixstrukturen in Kombination mit Gewebeexpandervorrichtungen implantiert. Wenn die Zellmatrix implantiert ist oder Zellen proliferieren und neues Gewebe bilden, wird die Expandiergröße verringert, bis es entfernt werden kann und der erwünschte Wiederaufbau oder Zuwachs erhalten wird.
Wie vorher erwähnt, können andere Materialen wie etwa bioaktive Moleküle, die die Vaskularisierung des implantierten Gewebes erhöhen und/oder das Einwachsen von fibrotischen Gewebe hemmen, mit der Matrix implantiert werden, um die Entwicklung von mehr normalem Gewebe zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche nicht den Umfang der Erfindung zu beschränken beabsichtigen. Andere Gesichtspunkte, Vorteile und Modifikationen innerhalb des Umfangs der Erfindung werden für die Fachleute offensichtlich sein, an welche sich die Erfindung richtet. Die folgenden Beispiele sind dafür gedacht diese Fachleute mit einer vollständigen Offenbarung und Beschreibung zu versehen, wie die neuartigen Verfahren der Erfindung durchgeführt und verwendet werden können und beabsichtigen in keiner Weise den Umfang dessen zu begrenzen, was die Erfinder als ihre Erfindung ansehen.
Beispiele
Beispiel 1 – Verwendung von FGF-2 in der Optimierung der in vitro-Expansion von Säuger-Chondrocyten
Die Ergebnisse zeigen, dass wenn FGF-2 zu dem Kulturmedium während der Expansionsphase zugegeben wird, nicht nur die Chondrocyten schneller proliferieren, was die anfängliche benötigte Menge an Gewebe und/oder die erforderlicher Zeit senkt, sondern ebenfalls ein höheres Potenzial behalten Knorpelgewebeäquivalente zu regenerieren.
Bovine, artikuläre Chondrocyten wurden in Monolayern expandiert. Durch die Zugabe von 5 ng/ml FGF-2 zu dem Kulturmedium wurde die Proliferationsrate signifikant erhöht (Verdopplungszeiten waren 13,9 ± 0,6 und 18,9 ± 1,0 Stunden für Zellen, die mit bzw. ohne FGF-2 expandiert wurden). Bovine Chondrocyten, expandiert durch etwa 10 Verdopplung mit und ohne FGF-2 (5 ng/ml) als auch frisch geerntete primäre Chondrocyten wurden auf biologisch abbaubare Polymergerüste gesät (nicht-gewebte Netze hergestellt aus Polyglykolsäure, PGA) wie vorher beschrieben (Freed et al., oben). Die resultierenden Zell-Polymerkonstrukte wurden in Medium mit 10% fetalem bovinen Serum kultiviert, ohne (Kontrolle) oder mit der Zugabe von 5 ng/ml Insulin. Zu diesem Zeitpunkt wurde kein FGF-2 zu dem Kulturmedium einer Gruppe gegeben. Nach 6 Wochen Kultur wurden die Konstrukte trocken getupft, gewogen und biochemisch auf den Gehalt an Glykosaminoglykan (GAG; 1) untersucht, einer der Hauptbestandteile der extrazellulären Matrix von Knorpel. Zweifach genommene Proben wurden histologisch verarbeitet und auf Kollagen Typ II gefärbt (2 und 4).
Mit FGF-2 expandierte Chondrocyten waren in der Lage knorpelige Konstrukte zu regenerieren, die ihrer Größe signifikant größer als diejenigen auf der Grundlage von Chondrocyten waren, die dem Kontrollmedium expandiert wurden, und erreichten die Größe von Konstrukten, die auf frisch geernteten Chondorzyten basierten (1A). Die Zugabe von Insulin zum Kulturmedium induzierten einen signifikanten Anstieg im Endgewicht der Konstrukte auf der Grundlage von frisch geernteten Chondrocyten und von mit FGF-2 expandierten Chondrocyten, während in Kontrollmedium expandiert Chondrocyten nicht signifikant auf Insulin reagierten.
Die GAG-Fraktion (Prozentsatz des Feuchtgewichts des Konstrukts) bei Konstrukten auf der Grundlage von frisch geernteten Chondrocyten war vergleichbar zu der in Konstrukten auf der Grundlage von FGF-2 expandierten Chondrocyten und signifikant höher als den Konstrukten auf der Grundlage von Chondrocyten, die im Kontrollmedium expandiert wurden. Derselbe Trend wurde beobachtet, wenn Insulin zu dem Kulturmedium gegeben wurde (1B). Kollagen Typ II war in Konstrukten auf der Grundlage von primären und FGF-2 expandierten Chondrocyten reichlich vorhanden und nicht nachweisbar, wenn die Zellen ohne FGF-2 expandiert wurden.
Die Anwesenheit von FGF-2 während der Chondrocytenexpansion erhöhte die Proliferationsrate während der ersten Passage (Tabelle 1) beschleunigte den Entdifferenzierungsvorgang, wie durch die reduzierte Expression AP (Tabelle 1) und Kollagen Typ II (2) nachgewiesen wurde. Die AP-Aktivität nahm mit der fortlaufenden Passage ab und in einer Geschwindigkeit, die in Anwesenheit von FGF-2 höher war (Tabelle 1). Kollagen Typ II wurde allgemein in P1-Chondrocyten nachgewiesen, aber die Fraktion der Zellen, die positiv war und die Intensität der Färbung war jeweils höher für die Zellen, die ohne FGF-2 expandiert wurden (2A und 2B). Kollagen Typ II wurde nur in wenigen P2-Zellen exprimiert, die ohne FGF-2 expandiert wurden (2C) und wurde in keiner mit expandierten FGF-2 P2-Zelle nachgewiesen (2D). Kollagen Typ I wurde in ähnlichen Zellen expandiert mit oder ohne FGF-2 nachgewiesen (Daten nicht gezeigt).
Ohne FGF-2 expandierte Chondrocyten wiesen lange, starke F-Actin-Fasern auf, welche insbesondere nach der zweiten Passage auffällig waren (3A), während die in Anwesenheit von FGF-2 expandierten Chondrocyten eine diffuse Färbung für F-Actin aufwiesen (3B). Zusätzlich entwickelten die Chondrocyten, die mit FGF-2 nur während der ersten Passage und nicht in der zweiten Passage expandiert waren, starke F-Actin Fasern (3C), während Chondrocyten, die ohne FGF-2 während der ersten Passage und dann mit FGF-2 während der zweiten Passage expandiert wurden, eine diffuse cytoplasmatische Färbung für F-Actin zeigten (3D). Eine große, ausgebreitete zelluläre Morphologie schien mit der Anwesenheit von starken F-Actin Fasern zu korrelieren (3).
Beispiel 2
Expansion von humanen Chondrocyten
Humane Chondrocyten wurden auf Knorpeloberflächen aus der Hüfte und dem Sprunggelenk von 25 bis 66 Jahre alten Patienten isoliert, die einen Gelenkersatz infolge von Oberschenkelhalsbruch oder einer Weichgewebetumorresektion unterzogen wurden. Die Zellen wurden in Monolayern für 16 Tage expandiert (2 Passagen, etwa 5–9 Verdoppelungen) in DMEM mit 10% FBS und ergänzt mit FGF-2, Wachstumsfaktor TGF-β 1 (TGF-β), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), aus Blutplättchen gewonnenem Wachstumsfaktor-bb (BDGF) oder einer Kombination von TGF-β und FGF-2 (T + F). Die Verdoppelungszeit der Chondrocyten wurden wie vorher bestimmt. Nach jeder Passage wurde die Expression spezifischer Gene (Kollagen-Typ I und II, Aggrecan und Versican) auf der Transkriptionsebene unter Verwendung von quantitativen Echtzeit-PCR Assays auf der Grundlage der TaqMan Fluoreszenz. Der Grad der Differenzierung wurde als das Verhältnis von Kollagen Typ II zu Typ I (CII/CI) oder Aggrecan zu Versican (AGG/VER) auf der mRNA-Ebene bestimmt. Primäre und mit und ohne FGF-2 expandierte PS-Chondrocyten wurden auf PGA-Netze gesät, kultiviert und, wie vorher für bovine Chondrocyten beschrieben, untersucht. Primäre und P2-Chondrocyten, expandiert in der Anwesenheit der verschiedenen untersuchten Faktoren, wird ebenfalls in konischen Polyproylenröhrchen zentrifugiert, um kugelförmige Pellets zu bilden (5 × 10⁵ Zellen/Pellet). Die Pellets wurden für zwei Wochen entweder in DMEM-Serum und Insulin oder in einem definierten (serumfreien) Medium bestehend aus DMEM mit Insulin, TGF-β und Dexamethason kultiviert. Die Pellets wurden histologisch, biochemisch und unter Verwendung quantitativer PCR untersucht. Zweifach genommene Proben von drei unabhängigen Experimenten wurden analysiert.
Von allen während der Expansionsphase in Monolayern untersuchten Faktoren war FGF-2 derjenige, der am meisten die Proliferationsrate von humanen Chondrocyten erhöhte, insbesondere, wenn er in Kombination mit TGF-β verwendet wurde (Verdopplungszeiten für Zellen kultiviert in der Kontrolle, in mit FGF-2 bzw. TGF-β + FGF-2 ergänzten Medien waren 76,6 ± 3,9, 47,4 ± 2,0 und 38,2 ± 2,9 Stunden). Die Zellproliferationsrate lag im umgekehrten Verhältnis zum Differenzierungsstadium. Unter Kontrollbedingungen expandierte P2-Chondrocyten hatten CII/CI und AGG/VER-Verhältnisse im Mittel von 2 Prozent von denjenigen gemessen in primären Chondrocytenvorexpansion, und diese Verhältnisse wurden weiterhin auf 0,3 Prozent und 0,002 Prozent reduziert, wenn Zellen in der Anwesenheit von FGF-2 bzw. TGF-β + FGF-2 expandiert wurden. Die Redifferenzierung von expandierten Chondrocyten in Pelletkulturen zeigte an, dass es unabhängig von den Zuständen der Zellexpansion die CII/CI-Verhältnisse etwa 4-fach höher waren, wenn Pellets in definierten Mediumkulturen kultiviert wurde, im Gegensatz zum Medium, das Serum enthält. Das höchste Differenzierungsausmaß wurde in Pellets auf der Grundlage von TGF-β + FGF-2(CTR) nachgewiesen. In TGF-β + FGF-2 Pellets waren CII/CI und AGG/VER-Verhältnisse entsprechend 50 und 3-fach höher als in CTR-Pellets und beide Verhältnisse waren in etwa 50 Prozent derjenigen gemessen auf der Grundlage von primären Chondrocyten.
Die Ergebnisse haben gezeigt, dass Chondrocyten, expandiert unter Bedingungen, die die höchsten Proliferationsraten und die am stärksten erhöhte Entdifferenzierung zeigen, diejenigen waren, die die beste Fähigkeit aufwiesen wieder in das Differenzierungsprogramm einzutreten, wenn sie in eine 3D-Umgebung gebracht wurden. Insbesondere die seriell passagierten bovinen Chondrocyten, kultiviert auf PGA-Netzen, regenerierten knorpelige Gewebe bei Geschwindigkeiten und in Ausmaßen, die vergleichbar zu denjenigen beobachtet für primäre Chondrocyten sind, nur wenn sie in der Anwesenheit von FGF-2 expandiert wurden. Zusätzlich exprimierten seriell passagierte adulte humane Chondrocyten, die in definierten Medium kultiviert wurden, als Pellets die höchsten Spiegel an Differenzierungsmarkern zeigten, etwa 50 Prozent der für primäre Chondrocyten gemessenen Spiegel, wenn sie in der Anwesenheit von TGF-β und FGF-2 expandiert wurden.

Claims

Verfahren zum Expandieren von Chondrocyten für das Tissue Engineering, umfassend: (i) Bereitstellen von Chondrocyten; (ii) Entdifferenzieren und Expandieren der Chondrozyten in einem Zellkulturmedium, das Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 und den Wachstumsfaktor TGF-β (transforming growth factor beta) enthält, wodurch expandierte Zellen entstehen; und (iii) Verwenden der expandierten Zellen für das Tissue Engineering.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Chondrocyten beim Tissue Engineering verwendet werden können.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Chondrocyten Säuger-Chondrocyten sind.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Chondrocyten Rinder-Chondrocyten sind.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Chondrocyten humane Chondrocyten sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Chondrocyten in einem Zellkulturmedium expandiert werden, das wenigstens einen Wachstumsfaktor enthält, der Ereignisse rekapituliert, die während der Embryonalentwicklung stattfinden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Chondrocyten in einem Zellkulturmedium expandiert werden, das wenigstens einen Wachstumsfaktor enthält, der die Fähigkeit dieser Zellen, auf Differenzierungsreize zu reagieren, aufrechterhält.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Chondrocyten in einem Zellkulturmedium expandiert werden, das wenigstens ein Wachstumsfaktor enthält, der die Verdopplungszeit der Chondrocyten reduziert und die Chondrocyten entdifferenziert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Chondrocyten während des Expandierens mit Nucleinsäuren transfiziert werden.
Verfahren zur Regeneration von Gewebe, das die folgenden Schritte umfasst: (i) Bereitstellen von Zellen, wobei es sich bei den Zellen um Chondrocyten handelt; (ii) Entdifferenzieren und Expandieren der Zellen in einem ersten Zellkulturmedium, das Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 und den Wachstumsfaktor TGF-β enthält; (iii) Redifferenzieren der expandierten Zellen in einem zweiten Zellkulturmedium; und (iv) Verwenden der expandierten Zellen für das invitro-Tissue-Engineering.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Zellen Säuger-Chondrocyten sind.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Zellen humane Chondrocyten sind.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das zweite Zellkulturmedium ein serumfreies Zellkulturmedium ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das zweite Zellkulturmedium ein serumfreies Zellkulturmedium ist, das wenigstens einen Wachstumsfaktor enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das zweite Zellkulturmedium ein serumfreies Zellkulturmedium ist, das Insulin, den Wachstumsfaktor TGF-β und Dexamethason enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das zweite Zellkulturmedium ein serumfreies Zellkulturmedium ist, das Insulin, Transferrin, Selenige Säure, Linoleinsäure, Albumin; Ascorbinsäure, den Wachstumsfaktor TGF-β und Dexamethason enthält.
Verwendung von redifferenzierten expandierten Zellen, die durch die Schritte (i) bis (iii) gemäß einem der Ansprüche 10 bis 17 erhältlich sind, bei der Herstellung einer Zellmatrixstruktur für die Gewebereparatur.
Verwendung von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 und dem Wachstumsfaktor TGF-β als Kulturmediumzusatz, um das Potential von Säuger-Chondrocyten, Knorpelpotential zu regenerieren, zu konservieren.