CN1170926C - 干细胞因子和可溶性白介素-6受体在血细胞生成多能性细胞体外扩增中的应用 - Google Patents

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Abstract

干细胞因子和可溶性白介素-6受体，白介素-6组合起来，通过gp130信号传导，支持来自正常人血细胞生成多能性细胞的血细胞的增殖，分化和终端成熟。

Description

干细胞因子和可溶性白介素-6受体 在血细胞生成多能性细胞体外扩增中的应用
本申请是1994年11月16日提交的美国专利申请，序列号08/340559的部分继续。
发明背景
本发明涉及白介素-6，可溶性白介素-6受体和干细胞因子在细胞扩增中的组合应用。具体地说，本发明涉及血细胞生成祖细胞/干细胞体外扩增中这些因子的组合应用。
发明领域
白介素-6(IL-6)的受体系统包括两个功能上不同的链：一个配体结合链(IL-6R)和一个非配体结合但传导信号的链(gp130)。gp130链与IL-6R/IL-6复合物相连，导致高亲和性IL-6结合位点和信号传导(1-4)的形成。已证明一种细胞外的，可溶性形式的白介素-6受体(sIL-6R)可通过膜锚定的gp130介导IL-6信号传导。sIL-6R和IL-6的复合物(sIL-6R/IL-6)可与在IL-6R阴性和IL-6R阳性细胞上都表达的gp130相连。该连接引起gp130的同源二聚体化和JAK-STAT通路的活化从而导致细胞应答(4-8)。
已表明IL-6可与IL-3和干细胞因子(SCF)一起协同作用增强人血细胞生成祖细胞的扩增并支持休眠小鼠血细胞生成祖细胞的集落形成(9-11)。但是对gp130信号通路在人血细胞生成中的作用却知之甚少。
最近由于各种临床应用的需要而对血细胞生成祖细胞的体外扩增极感兴趣，这些临床应用包括基因治疗，骨髓移植(BMT)的增强作用以及BMT的替换等。尽管还有以前应用各种细胞因子或基底细胞的组合扩增细胞数目的报道，祖细胞，特别是多能祖细胞所达到的扩增程度仍是相当低的。这表明原始细胞的分化和耗尽发生在扩增培养中(12-15)。最近的研究证明IL-6和sIL-6R的组合通过gp130信号过程的活化而支持多能胚胎干(ES)细胞的自我更新(16)。
IL-6的纯化，克隆和应用是已知的(EP 220574，1987年5月6日公开；Revel等；WO 88/00206，1988年1月14日公开，Clark等)。对sIL-6R纯化和克隆，以及它与IL-6在例如细菌感染，烧伤和创伤等疾病中的组合应用也已有报道(EP 413908，1991年2月27日公开，Novick等；JP 89271865；Yamasaki等，科学，241：825-828，1988)。SCF是一种早期作用血细胞生成因子。对SCF的纯化，克隆和应用已有报道(参见PCT WO 91/05795，题目为“干细胞因子”)。SCF的应用已被描述为可增强骨髓的移植作用和骨髓恢复以及对白细胞减少症和血小板减少症的治疗。还描述了IL-6与SCF的组合应用，但以前未有SCF，IL-6和sIL-6R在血细胞生成祖细胞的扩增中的组合应用的报道。
                            发明概述
本发明证明了可溶性IL-6受体(sIL-6R)和IL-6与干细胞因子(SCF)一起的组合可支持人血细胞生成多能性细胞的体外扩增。当单独与SCF组合时，sIL-6R或IL-6二者都不能有这种作用。
多能性细胞可从脐带血，外周血或骨髓获得。多能造血细胞包括通过CD 34筛选得到的祖细胞和/或干细胞或通过去除可增殖的细胞而功能性选择的干细胞。
细胞因子可以以试剂盒的形式提供，其中试剂盒包括不同细胞因子的独立的容器，或一种或多种细胞因子可以以装在单一的容器中的混合物的形式提供。
另外，该细胞因子的组合可在缺乏促红细胞生成素(EPO)时可支持来自纯化的人血细胞生成干细胞的红细胞样细胞的增殖，分化和终端成熟。当与SCF单独组合时，sIL-6R和IL-6二者在缺乏促红细胞生成素时都没有这种作用。
研究证明sIL-6R，IL-6和SCF组合的方法可从血细胞生成干细胞(如CD 34+细胞)产生红细胞样细胞。细胞因子的效应在无血清培养中也已得到了确证。sIL-6R，IL-6和SCF的组合在甲基纤维素培养中从CD 34+细胞形成了含大量成熟红细胞样细胞的一定数目的红细胞样细胞簇和红细胞样集落。向培养物中加入抗gp130单克隆抗体完全阻止了红细胞样细胞的产生，其中加入抗促红细胞生成素抗体不能影响从CD 34+细胞产生红细胞样细胞。
该结果证明在缺乏促红细胞生成素时，可从血细胞生成祖细胞产生成熟的红细胞样细胞。综合前述的人血清含可检测水平的sIL-6R，IL-6和SCF的报道(26-28)，很可能正常红细胞生成在生理上是由两个不同的通路调控的：一种为促红细胞生成素介导的信号通路和一种新的SCF信号通路结合gp130的机制。
                            附图简述
图1示在指定的因子组合下培养的多能性细胞集落形成的结果。
图2示IL-6存在(○)或不存在(●)下不同sIL-6R浓度下祖细胞的扩增，以及在sIL-6R的存在(○)或不存在时(●)不同IL-6浓度下祖细胞的扩增。
图3示在第7天(空心棒)，第14天(斜线棒)和第21天(实心棒)补加鉴定的因子或因子组合的祖先细胞的扩增。
图4示在第7天(空心棒)，第14天(斜线棒)和第21天(实心棒)时在SCF的存在下补加有各种因子组合时含血清和无血清培养物中祖细胞的扩增。
图5示不同浓度的抗人gp130单克隆抗体(A)和抗人IL-6R单克隆抗体(B)对总的祖细胞(○)和CFU-Mix(●)扩增的影响。
图6示在IL-6和SCF存在下不同量的sIL-6R的作用。
图7示在sIL-6R和SCF存在时不同量的IL-6的作用。
图8示SCF，IL-6/SCF和sIL-6R/IL-6/SCF在无血清和有血清培养中的作用。
图9示产生的红细胞样细胞的特征。
图10示在第7，14和21天培养时由不同的因子组合产生的总细胞数，成红细胞和红细胞数。IL-3是白介素-3，G-CSF是粒细胞集落刺激因子，和GM-CSF是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
图11示抗gp130MAbs(μg/ml)对加入了sIL-6R/IL-6/SCF或EPO/SCF组合的悬浮培养物的作用。
图13示抗EPO抗体(μg/ml)对加入EPO，EPO/SCF或sIL-6R/IL-6/SCF组合的悬浮培养物的作用。
                            发明详述
本发明来自对gp130信号通路的潜在作用的观察结果，该通路可在人血细胞生成干/祖细胞中启动sIL-6R和IL-6的复合物的活性。本文的结果表明包含sIL-6R和IL-6的gp130信号通路，可在SCF的存在下，极大的刺激人原始血细胞生成祖细胞的体外扩增。
gp130，IL-6信号转导受体组分，与IL-6配体和IL-6受体(IL-6R)和复合物组合并转导信号。为了检测gp130信号通路在血细胞生成祖细胞扩增中的作用，而测定了重组可溶性人IL-6受体(sIL-6R)和/或IL-6与各种细胞因子的组合对CD 34+细胞的作用。
发现在干细胞因子(SCF)的存在下，sIL-6R和IL-6的组合(sIL-6R/IL-6)极大地刺激了血细胞生成祖细胞/干细胞以及CD 34+细胞的扩增。sIL-6R和SCF的组合或IL-6和SCF的组合二者都没有这种结果。在加入sIL-6R/IL-6/SCF之后悬浮培养发生了明显的多能血细胞生成祖细胞的产生达三周之久。在添加了组合的细胞因子的含血清和无血清培养中都观察到了有效的集落的形成，特别是多系(multilineage)和未成熟(blast)细胞的形成。最初的血细胞生成祖/干细胞可从任何适应的细胞来源获得，其中包括胎儿，胎盘，脐带血，外周血或骨髓。这些多能血细胞生成细胞包括通过CD 34+筛选得到的祖和/或干细胞。可任选地，多能血细胞生成细胞可以是通过去除可增殖的细胞而功能性选择或分离的细胞(Berardi等.，科学，267：104-108，1995)。
本发明证明两种信号通路，分别由sIL-6R/IL-6和SCF启始的gp130信号通路和c-Kit信号通路协同增强人血细胞生成祖细胞的体外扩增。已有报道sIL-6R在IL-6的存在下在一些例如BAF-m130细胞，gp130 cDNA-转染细胞和小鼠破骨细胞中加强激动剂效果(6-8，25)。但是本发现证明在SCF的存在下sIL-6R/IL-6对人原始血细胞生成祖细胞是有效的刺激剂。以前的对体外扩增的报道没能证明sIL-6R/IL-6/SCF组合对人原始血细胞生成祖细胞的刺激的激动人心的协同效应。
血细胞生成祖细胞的体外扩增对于制备适于包括基因治疗和细胞替换的潜在的临床应用的血细胞生成细胞来说是一个有吸引力的方法。已有报道各种细胞因子的组合可用于祖细胞的扩增(12-15)。一般是将SCF，IL-3和IL-6做为对原始血细胞生成细胞具有最大作用的细胞因子的，并且已将这些因子的组合广泛地用做血细胞生成祖细胞扩增的基本的和有效地细胞因子序列。但是本发明证明，对原始祖细胞包括CFU-Mix或CFU-Blast的扩增速率来说，sIL-6R，IL-6和SCF的组合(sIL-6R/IL-6/SCF)是优良的(Superior)。
已前的研究是在IL-3，IL-6和SCF与其它一些细胞因子如G-CSF，GM-CSF，IL-1或EPO组合的存在为基础，培养来自外周血的CD 34+细胞。这类研究表明该组合可用于在含血清的悬浮培养物中产生祖细胞(12，13)。尽管以前的与IL-3的组合使CFU-GM大约增加了60倍，但是CFU-Mix没有扩增且在培养的第14天时，CFU-Mix或BFU-E都未检测到。这样的发现表明在这些培养中相对晚期的祖细胞优先扩增。相反地，应用本发明，可在悬浮培养中对多能血细胞生成祖细胞进行有效扩增以及在甲基纤维素培养中大量形成Mix和Blast集落，这表明sIL-6R/IL-6刺激了较早期的原始血细胞生成细胞或甚至是多能干细胞。
向上面的培养物中加入抗gp130单克隆抗体(mAb)或抗IL-6R mAb发现可剂量依赖性抑制悬浮培养中祖细胞的扩增。抗体还完全阻断了甲基纤维素培养中多系集落的形成。该发现清楚地证明了所观察到的sIL-6R/IL-6的效应是通过IL-6结合的sIL-6R分子与靶细胞上膜锚定的gp130的相互作用而实现的。
最近的研究表明gp130在细胞上广泛表达，并且ES细胞通过sIL-6R/IL-6复合物不需要LIF即可维持自我更新(6，16，18)。但形成是不完整的，因为细胞因子受体通常在人CD 34+血细胞生成干/祖细胞上表达。当然，SCF地c-Kit受体是存在的，在我们的研究之中，通过免疫染色发现gp130出现在所有的CD 34+细胞上，而IL-6R只存在于一小部分CD 34+细胞群体上。在IL-6R阳性细胞中sIL-6R/IL-6复合物可增强IL-6信号并且，更重要的是，可通过gp130在通常对IL-6不应答的IL-6R阴性细胞中介导信号。如本研究所揭示的，由于sIL-6R/IL-6只有在SCF的存在下才起作用，gp130和c-Kit在祖细胞上的共表达和对这些信号的共活化导致有潜在临床应用的血细胞生成祖细胞的大量增殖。
                        实施例
实施例1
sIL-6R，IL-6和SCF对甲基纤维素培养中CD 34+细胞的集落形成的影响。
材料方法
细胞制备
人脐带血是在正常的，成熟分娩(full-term)中获得的并根据常规程序收集。在用Silica((IBL，Fujioka，Japan)去除巨噬细胞通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离单核细胞(MNC)。用携带抗CD 34抗体的磁性珠(Dynabeads M-450 CD 34；Dynal，Oslo，Norway)与CD 34+细胞结合从MNC中纯化CD 34+细胞，用Dynal Magnetic Particle Concentrator从MNC中分离细胞，以及用DETACHa Bead CD 34(Dynal)从珠子中分离所选择的细胞。根据生产商的说明进行筛选和分离操作。FACS分析确认所分离细胞的85～95％是CD 34阳性的(Ortho Diagnostics Systems，Westwood，MA)。
受体和细胞因子。
如前所述，重组人IL-6和sIL-6R的克隆，表达和纯化已被很好的特征描述(17，18)。人SCF(Amgen；Thousand Oaks，CA)，人IL-3，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和促红细胞生成素(EPO)(Kirin Brewery Co.Ltd.；Tokyo，Japan)，和人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(Chugai Pharmaceutical Co.；Tokyo，Japan)被用于评价各种细胞因子组合对细胞的作用。所有的细胞因子都是纯的重组分子并使用其可在人血细胞生成细胞的甲基纤维素培养中的最优应答的浓度。其浓度是SCF 100ng/ml，IL-3200U/ml，EPO 2U/ml，和G-CSF和GM-CSF 10ng/ml。
悬浮培养
应用已知技术将纯化的CD 34+细胞培养在悬浮培养物中(21，22)。培养混合物包含2000 CD 34+细胞，α-培养基(ICN Flowi ICN BIOMEDICALS，Inc.，Costa Mesa，CA)，20％胎牛血清(FBS；Hy Clone，UT)，1％结晶的和去离子化的级分V牛血清白蛋白(BSA，Sigma)和不同的细胞因子的组合。在37℃在充满5％CO2，5％O2和90％N2的饱和湿度的空气中将1ml培养混合物培养在24孔组织培养板的每个孔中(Nunc，Kamstrup，Denmark)。无血清悬浮培养物由2％纯化BSA(Sigma)，10μg/ml胰岛素，200μg/ml转铁蛋白(Sigma)，10-5M巯基乙醇(Eastman)和40μg/ml低密度脂蛋白(Sigma)代替了FBS和BSA(22)。
每隔一周，去掉一半培养体积减少培养物，然后用重新配制的含同样的细胞因子组合的培养基替代。洗涤并计数所收集的培养基中的细胞(12-15)。通过在克隆甲基纤维素测试中进一步培养一部分扩增细胞而对在每个时间点上培养物中产生的血细胞生成祖细胞总数进行了评测。对实施例3的阻断研究，在培养的最开始时加入了抗gp130 mAb或抗IL-6R mAb。
克隆培养
将在悬浮培养中的接种的CD 34+细胞和其后代以对CD 34+细胞500细胞/ml和对培养的细胞2×103～10×103细胞/ml的浓度在甲基纤维素培养中平行培养三份(23)。培养混合物含细胞，α-培养基，0.9％甲基纤维素(Shinetsu.Chemical.CO.，Tokyo，Japan)，30％FBS，1％BSA，5×10-5M硫基乙醇和各含或不含sIL-6R的细胞因子组合。将1ml含细胞的培养混合物接种在每个35mm Lux标准的非组织培养皿中并在充有5％CO2的饱和湿度的空气中在37℃下培养。除了用1％纯BSA，300μg/ml人转铁蛋白，160μg/ml刀豆卵磷脂(Sigma)和96μg/ml胆固醇(NacalaiTesque Inc.，Kyoto，Japan)代替BSA和FBS之外，无血清甲基纤维素培养物含与管血清的培养相同样的成份(11)。
SCF，IL-3，IL-6，EPO和G-CSF的组合被用于确定在悬浮培养的各个时间点上产生的各种祖细胞。根据已知的标准，所有培养部平行进行三份并在第14天时收获(10，11，23)。
结果
图I示在所示因子组合存在下，来自培养的多能性细胞的结果。在第14天获取集落。集落数是三次平行培养的平均值±标准误。(用于克隆类型的缩写如下：GM，粒细胞-巨噬细胞集落；Meg，巨核细胞集落；B，红细胞样细胞簇；Blast，未成熟细胞集落；Mix，混合血细胞生成集落；和GEMM，粒细胞-红细胞-巨噬细胞-巨核细胞集落)。将每种细胞因子与1280ng/ml SIL-6R，50ng/mlIL-6和/或100ng/mlSCF组合使用。
在含血清的培养中，sIL-6R，IL-6，sIL-6R/IL-6或SCF单用仅诱导小数目的集落。与IL-6或SCF单独添加相比，IL-6和SCF的组合增强GM和Blast集落的形成。在所观察到的添加sIL-6R，IL-6和SCF的培养中最大的集落的产生达到接种率的50％。向IL-6和SCF组合中添加sIL-6R使总集落形成数目增加了4.2倍。sIL-6R/IL-6/SCF诱导的集落数目比用IL-3大11.3倍，比用GM-CSF大5.2倍，比用G-CSF大5.4倍。在添加sIL-6R/IL-6/SCF的培养中除了一定数目的Meg集落和红细胞样细胞簇之外，还形成了相当数目的大尺寸的Blast集落和Mix集落，其中主要是GEMM。多于60％的sIL-6R/IL-6/SCF诱导的集落是GEMM和Blast集落，其中IL-3，GM-CSF和G-CSF诱导的集落是GM集落。
为了排除FBS中一些未知因子的可能影响，还进行了无血清培养。在添加sIL-6R/IL-6/SCF的培养中再次看到很明显的集落形成。向IL-6和SCF的组合中加入sIL-6R使总集落数增加了17.5倍。除了Meg集落和红细胞样细胞簇(erythroid burst)之外，该组合还刺激了大量的Mix和Blast集落的形成。在其它因子组合时，没有集落或仅有很少GM集落形成。
如图I所示当sIL-6R/IL-6与其它因子一起被组合测试时，在有血清培养中观察到了sIL-6R/IL-6和IL-3，GM-CSF或G-CSF之间轻微的协同作用。但在无血清培养时，未发现sIL-6R/IL-6和这些因子之间的协同作用。该结果提示sIL-6R/IL-6与SCF特异地协同刺激CD 34+祖细胞的增殖。
                    实施例2
sIL-6R，IL-6和SCF对悬浮培养中血细胞生成多能性细胞的作用。
在各种浓度的sIL-6R与SCF单用或IL-6/SCF组合进行组合之下，对CD 34+细胞在含血清的悬浮培养中进行了研究。在培养14天之后对来源于培养物的祖细胞进行了评测。图2示应用sIL-6R/IL-6/SCF组合时2000含840个祖细胞(SCF 10ng/ml)CD 34+细胞在含血清的悬浮培养中培养14天后，祖细胞扩增结果。图2A示在IL-6(50ng/ml)存在(○)或不存在(●)时不同浓度下的sIL-6R下祖细胞的增加。图2B示在sIL-6R(1280ng/ml)的存在(○)或不存在(●)下不同浓度的IL-6时祖细胞的增加。如图1A所表明的，对应于sIL-6R的浓度总的祖细胞急剧增加。当应用低至80ng/ml的浓度的sIL-6R时，仍可检测得到这种增加。当应用1280ng/ml浓度的sIL-6R时，这种增加达到大约70倍的平台。
但当缺乏IL-6时，sIL-6R不能扩增全部祖细胞。看来祖细胞的最佳扩增依赖于IL-6的浓度。当在sIL-6R的存在下使用大于50ng/ml的IL-6浓度时，得到了祖细胞的最大扩增(增加63倍)(图2B)。相反地，在缺乏sIL-6R时，使用甚至当IL-6的浓度大于50ng/ml时的IL-6与SCF的组合；也仅有大约10倍的祖细胞的增加。这些结果证明sIL-6R只有在与IL-6组合时，才是功能性的并能在CD 34+细胞中转导增殖信号。这些结果还表明1280μg/ml sIL-6R和50ng/ml IL-6在含有SCF的悬浮培养中是祖细胞扩增的最佳浓度。
为了更详细地检测sIL-6R/IL-6对血细胞生成祖细胞扩增的作用，而进行了三个星期的含血清和无血清的悬浮培养(与其它因子组合添加有sIL-6R和IL-6)，其中每周分析一次祖细胞的扩增。在添加了单因子或因子组合的悬浮培养在第7天(空白棒)，第14天(斜线棒)和第21天(实心棒)时从含684祖细胞的2000 CD 34+细胞的总的祖细胞的产生的结果。数据来自单一的一次实验。在另外4个实验中也得到了类似的结果。
在只添加了IL-6或sIL-6R的培养中，祖细胞的数目慢慢减少，且在第14天或21天时已基本检测不到祖细胞。sIL-6R/IL-6或SCF单用对祖细胞的扩增都没有显著的效果。在添加了SCF和IL-6的细胞中在第7天，14天，21天时祖细胞总数分别增加了8.5倍，14倍，和12倍。相反地，sIL-6R，IL-6和SCF的组合极大地增加了祖细胞的扩增。动力学研究表明祖细胞总数的增加直到第14天，接着减少直到第21天。当与预扩增(Pre-expansion)值相比较时，在第7，14，和21天时祖细胞的总的增加分别是44倍，61倍和33倍。FACS分析观察到第14天总的CD 34+细胞大约增加了80倍。
对甲基纤维素测试中不同亚型的扩增的祖细胞的每周的分析表明，在sIL-6R，IL-6和SCF的存在下，所有类型的祖细胞包括GM集落形成单位(CFU-GM)、红细胞样细胞簇形成单位(BFU-E)，CFU-Blast和CFU-Mix在三周的培养中持续不断的产生，尽管在其它因子的组合时很难检测得到Mix集落。CFU-Mix在第7天和14天分别大约增加了60倍和80倍。有趣的是，在sIL-6R，IL-6和SCF的存在下在无血清悬浮培养的第2 1天仍获得了相当数目的CFU-Mix，增加了40倍。
这些结果揭示sIL-6R/IL-6与SCF在血细胞生成祖细胞的扩增中协同作用。在后面的实验中，测试了在SCF的存在下，sIL-6R/IL-6与其它包括IL-3和G-CSF的早期作用细胞因子的组合。
本研究还将sIL-6R，IL-6和SCF的组合与以前用做扩增标准的研究的IL-3，IL-6和SCF组合进行了对比。应用sIL-6R/IL-6/SCF的总的祖细胞的扩增是应用IL-3，IL-6，SCF组合的扩增的1.5倍。
图4描述了在含血清和无血清两种培养中不同细胞因子组合的CFUMix的产生。最初的培养混合物中包括包含786祖细胞和188 CFU-Mix的2000 CD 34+细胞。在第7天(空心棒)，第14天(斜线棒)，第21天(实心棒)在SCF的存在下向培养物中添加不同的因子组合。数据示一次实验的结果。在另两个实验中得到了类似的数据。
sIL-6R，IL-6和SCF组合使CFU-Mix在含血清的培养中，在第7天，14天分别大约增加了60倍和80倍，而在无血清培养中分别使其在第7，14天增加了大约49倍和68倍。由IL-3，IL-6和SCF组合产生的祖细胞主要是粒细胞和/或巨噬细胞系，而CFU-Mix在有血清培养中的第14天只扩增了约30倍，而在无血清培养的第14天只扩增了约10倍。向sIL-6R，IL-6和SCF的组合中加入IL-3不增加CFU-Mix的扩增。奇怪地是，向组合中加入G-CSF看来对扩增有负影响。这些结果证明sIL-6R，IL-6和SCF的组合是一个有新的扩增组合，特别是对原始祖细胞的扩增。
                    实施例3
抗gp130 mAb和抗IL-6R mAb对多能性细胞扩增的影响。
为了证明了gp130参与了sIL-6R/IL-6复合物介导的血细胞生成祖细胞扩增，而测评了小鼠抗人gp130 mAb和抗人sIL-6R mAb对祖细胞扩增的作用。
抗体的制备
抗人gp130单克隆抗体(例如GPX7，GPX22和GPZ35)的制备是已知的(2，19)。这三个抗体识别gp130受体上不同的表位并且是已知可通过抑制IL-6诱导的gp130与IL-6受体的连接而抑制IL-6介导的生物反应。还制备了抗人IL-6R mAb(PM1)(20)。已知PM1可通过抑制IL-6R与IL-6的结合而抑制IL-6介导的生物反应。
已发现在含血清的悬浮培养中加入抗gp130 mAbs可剂量依赖性地抑制总的祖细胞的扩增。图5示当向培养物中加入不同浓度的抗人gp130mAb(A)和抗人IL-6R mAb(B)时，在含sIL-6R，IL-6和SCF的培养中所得到的总祖细胞(○)和CFU-Mix(●)的扩增，以及在含IL-3和SCF的组合(△)时总祖细胞数。将不含mAb的培养做为对照实验。数据示在每个用mAb处理的培养中产生的祖细胞数时对照中产生的祖细胞数的比例，并以对照的百分数(％)表示。
在1μg/ml的抗gp130 mAb浓度时，CFU-MTX的扩增被完全阻断了，其中看来mAb对IL-3和SCF组合洗导的扩增有很少或无影响。向培养物中加入抗IL-6R mAb引起同样的抑制表现，除了较低的效率之外，在所观察的10μg/ml(图5B)的浓度完全取消了CFU-Mix的扩增。抗IL-6R抗体还对IL-3和SCF组合的刺激的扩增无影响。相反地，抗EPO抗体抑制了SCF和EPO诱导的扩增，但对IL-6R，IL-6和SCF诱导的扩增无影响(数据未示出)。在无血清的悬浮培养和甲基纤维素培养中获得了同样的结果。
                    红细胞样细胞的生产
研究还进一步对gp130信号通路对人造血生祖细胞红细胞样细胞的产生的影响进行检测。正常人血细胞生成祖/干细胞是从脐带血单核细胞分离的并在IL-6和SCF以及各种浓度的sIL-6R的一起存在下培养。发现总细胞数以剂量依赖的方式增加。这种增加在sIL-6R的浓度低至80ng/ml时即可检测得到并在1280ng/ml时出现平台。图6示在IL-6和SCF的存在下应用各种量的sIL-6R的一次实验的结果。
总细胞数的分析表明，在sIL-6R的浓度超过1 280ng/ml时，在培养的第7，14，和21天总细胞数分别增加了30倍，650倍和900倍。但在缺乏IL-6时，sIL-6R不能使总细胞数增加。这些结果清楚地表明只有在与IL-6组合时，sIL-6R才是有功能的并能在CD 34+细胞中转导增殖信号。
IL-6的剂量反应研究也表明总细胞数剂量依赖性地增加。在1280ng/ml sIL-6R的存在下应用50-100ng/ml浓度的IL-6得到了最大的细胞数(图7)。但在缺少sIL-6R时，IL-6只产生小的细胞数目的增加，甚至其用量大于50ng/ml时也是如此。这些结果提示在带有SCF的含血清的培养中，1280ng/ml的sIL-6R和50ng/ml的IL-6对来自纯化干细胞的总细胞的扩增来说可能是一个有效的组合。当使用纯化自人骨髓的CD 34+细胞时，也观察了sIL-6R，IL-6和SCF组合时总细胞数的扩增(未示出数据)。
有可能在含血清的培养中所观察的到的sIL-6R/IL-6组合的作用是由于其与污染胎中血清(FBS)的未知因子结合作用的结果，而只仅仅是sIL-6R/IL-6/SCF单独组分的结果。为了排除这种可能性，对无血清悬浮培养的CD 34+脐带血细胞进行了研究。令人奇怪地是当与有血清培养相比较时，观察到了sIL-6R，IL-6和SCF之间比含血清时更大的协同作用(图8)。用sIL-6R，IL-6和SCF的组合的无血清培养使总细胞数在第7，14和21天时分别增加了38倍，530倍和2200倍。已证明SCF采用，或其与IL-6组合应用培养细胞甚至到第21天时也只扩增2.2或7.5倍。这些结果清楚地排除了未知因子的可能影响并证明了在SCF的存在下，sIL-6R确实诱导了血细胞生成干细胞的扩增。
对扩增细胞的细胞离心制品进行了各种细胞化学和免疫化学染色。这些细胞的分化细胞计数表明主要存在的是未成熟细胞，例如CD 34+脐带血细胞培养7天时结果(图9a)。有意思的是，当应用sIL-6R，IL-6和SCF组合时，在培养的第14天，在含血清和无血清的悬浮培养中都观察到了一定数目的红血母细胞。通过联苯胺染色和应用抗血型糖蛋白A(图9b)和血红蛋白a(图9c)的免疫染色对红细胞样细胞的特征进行了确定。一些红细胞样细胞分化到了幼红细胞和有核红(ennucleated)细胞阶段。在培养的第21天，大多数红细胞样细胞分化到了幼红细胞阶段，并且观察到了许多有核红细胞。
通过对细胞离心甩片上血型糖蛋白A阳性细胞出现率和总细胞数的计算而得到了红细胞样细胞的绝对数目。在图10中出示了对加入了不同的细胞因子组合的无血清培养中红细胞样细胞的绝对数目的每周的分析结果。
sIL-6R，IL-6和SCF组合不仅与其它组合相比显著地刺激了总细胞数的产生，而且刺激了红细胞样细胞的产生。在培养2周之后，该组合产生的大约79％的细胞是红细胞样细胞(即E-未成熟细胞和红细胞)。在培养3周之后，该组合产生的大约69％的细胞是红细胞样细胞。在含sIL-6R和IL-6与IL-3或GM-CSF的组合的培养中观察到了小数目的红细胞样细胞，这提示gp130信号传导在红细胞样细胞体外产生中起了作用。
除了这些包含促红细胞生成素的组合之外，在加入了其它组合的培养物中检测不到红细胞样细胞。与促红细胞生成素单用相比，sIL-6R，IL-6和SCF所产生的红细胞样细胞在培养的第14天大约是它的5倍，在培养的第21天时大约是它的115倍(图10)。与促红细胞生成素，sIL-6R和IL-6的组合相比，sIL-6R/IL-6/SCF组合所生产的红细胞样细胞总数是在培养的第14天时它的大约4.1倍，而在培养的第21天时是大约38.3倍。在CD 34+骨髓细胞的含血清和无血清培养中部观察到了sIL-6R/IL-6/SCF组合对红细胞样细胞产生的作用(数据未出示)。
在接受了sIL-6R/IL-6/SCF的组合的悬浮培养中，大量红细胞样细胞的产生可能来自于CD 34+骨髓细胞的含血清和无血清培养中都观察到了sIL-6R/IL-6/SCF组合对红细胞样细胞产生的作用(数据未出示)。
在接受了sIL-6R/IL-6/SCF的组合的悬浮培养中，大量红细胞样细胞的产生可能来自于CD 34+细胞群体中未成熟红细胞样祖细胞的增殖，分化和成熟。为了确证这种可能性，而对CD 34+细胞的甲基纤维素克隆培养进行了研究。向培养物中加入了单独的促红细胞生成素，组合的促红细胞生成素/IL-6或促红细胞生成素/sIL-6R/IL-6组合。表1示将500个CD 34+脐带血细胞培养14天得到的结果。
                         表1
                 红细胞样细胞簇      混合红细胞样集落
EPO                57.7±14.8               0
EPO/IL-6           63.0±3.5                0
EPO/sIL-6R/IL-6    65.0±7.6                9±6.1
sIL-6R，IL-6和SCF的组合，在缺乏促红细胞生成素时，不仅刺激了红细胞样细胞簇，而且还刺激产生了大量的大的混合红细胞样集落。在所有的混合红细胞样集落中都含有许多包含红细胞的成熟红细胞样细胞(图9f和和图9g)。sIL-6R/IL-6/SCF组合从500个CD 34+脐带血细胞中产生了27.2±5.8红细胞样细胞簇和122.3±21.8混合红细胞样集落。相反，在只加入SCF或SCF与IL-6的组合的培养中既没有观察到红细胞样细胞簇，也没有观察到混合红细胞样集落。还在无血清培养中对应用sIL-6R/IL-6/SCF组合时脐带血和骨髓干细胞中红细胞样细胞簇和混合红细胞样集落的产生进行了确证(数据未出示)。当用sIL-6R/IL-6/SCF组合培养含成熟红细胞样祖细胞的骨髓单核细胞(即集落形成单位一红细胞样的)时，观察到了一定数目的红细胞样集落。这些结果强有力的提示sIL-6R/IL-6/SCF不仅可支持CD 34+细胞群体中未成熟红细胞样祖细胞而且可支持骨髓单核细胞中成熟红细胞样祖细胞的增殖，分化，和终端成熟。
为了进一步检测调节红细胞生成的替代通路的可能性，我们测定了不同的抗体对细胞发育的影响。对下面的抗体的作用进行了研究：阻断sIL-6R/IL-6复合物和细胞表面gp130相互作用的抗gp130mAb(GPX7，GPX22和GPX35)(19，29)；阻断IL-6和IL-6R之间相互作用的抗IL-6R mAb，(20)；和阻断CD 34+细胞红细胞样细胞发育的抗促红细胞生成素中和抗体。向含sIL-6R/IL-6/SCF组合的悬浮培养中加入抗gp130 mAb完全阻止了红细胞样细胞的产生(图11)。但是抗gp130抗体对促红细胞生成素依赖的红系细胞的产生无影响。
向含sIL-6R/IL-6/SCF组合的培养中加入10mg/ml浓度的抗IL-6R mAb导致了对红细胞样细胞产生的几乎完全的抑制(图12)。抗IL-6R mAb的低效率可以用可干扰体与IL-6和细胞表面IL-6R之间中和作用的sIL-6R的过量来解释。相反，尽管抗促红细胞生成素抗体几乎全部抑制了促红细胞生成素依赖的红细胞样细胞的产生，它却不影响sIL-6R/IL-6/SCF组合的红细胞样细胞的产生(图13)。
血细胞生成干细胞的甲基纤维素克隆培养还表明抗gp130 mAb，而不是抗促红细胞生成素抗体，全部阻断了由sIL-6R/IL-6/SCF组合诱导的红细胞样细胞簇和混合红细胞样集落形成的发育。这些结果清楚地表明所观察到的白介素-6配体和可溶性受体之间作用来自IL-6和sIL-6R之间的作用，和所得到的IL-6/sIL-6R复合物与靶祖细胞上膜锚定的gp130相连接的结果。该结果还表明通过gp130信号通路与SCF组合来自未成熟红细胞样祖细胞的红细胞样细胞的产生与促红细胞生成素的存在是不相关的。
据信在生理上红细胞样细胞的增殖和终端分化是通过促红细胞生成素受体信号通路而调节的。本发明gp130信号通路与SCF组合可刺激未成熟红细胞样祖细胞，在缺乏促红细胞生成素时增加红血母细胞和红细胞。这就提示促红细胞生成素信号通路对正常人红细胞样细胞的增殖，分化和终端成熟不是专一性的。sIL-6R/IL-6/SCF组合显著地红细胞样细胞的产生，以及未加入sIL-6R的干细胞此类产生的缺乏，可以联想到以前的报道，sIL-6R赋于IL-6对缺少跨膜IL-6R但却表达gp130的细胞的应答。该理论受到免疫细胞化学染色实验的支持，实验证明所有的CD 34+细胞和可增殖细胞都表达gp130，但却有约90％的接受了sIL-6R/IL-6/SCF组合的CD 34+细胞对IL-6R染色是阴性的。
已有报道在人血清中对sIL-6R的检测表明了其生理意义(26)。血清中的sIL-6R就其与IL-6结合并最终刺激gp130的能力来说是有生物活性的(30)。在320ng/ml sIL-6R和25ng/ml IL-6浓度时观察到了sIL-6R和IL-6组合时使外CD 34+细胞红细胞样细胞产生的半最大效应。这看来是在生理范围之内的。IL-6和SCF也可在人血清中检测得到。与IL-6一样，可溶性和膜结合形式的SCF都是由骨髓基质细胞产生的，该细胞可固着血细胞生成干细胞并未成熟祖细胞并支持其在骨髓中的增殖(27，28，31，32)。综合起来，本结果表明，SCF与gp130信号通路相组合，在正常体内促红细胞生成中起到了重要的作用。
                        实施例4
sIL-6R和IL-6对人血细胞生成干细胞的增殖活性。
方法
人脐带血的获得是根据常规的指导，从正常成熟分娩中收集的。在用Silica(IBL，Fujioka，Japan)去除巨噬细胞之后用Ficoll-Hypaque密度梯度离心对单核细胞进行了分离。在洗涤之后，以珠子：细胞为1∶1的比例将单核细胞与携带抗CD 34抗体的磁性颗粒(Dynabeads M-450CD 34；Dynal，Oslo，Norway)混合。将细胞珠子悬浮液悬浮起来并在4℃培养30分钟使细胞与珠子结合。在Dynal Magnetic Particle Concentrator中收集得到的珠子/玫瑰花结细胞。根据生产商的说明，从用DETACHaBead CD 34(Dynal)阳性选择的细胞上解离下珠子；必释放选择的CD 34+细胞。FACS分析分离的CD 34+细胞的纯度为85-95％(Ortho，USA)。
添加有SCF，IL-3，IL-6，促红细胞生成素和G-CSF的甲基纤维素培养中的克隆效率是45-55％。应用前述的技术并经过如下的修饰将纯化的CD 34+细胞进行悬浮培养(21，22)。培养培养基含2000CD 34+细胞，α-培养基，1％结晶的去离子化的牛血清白蛋白(BSA，Sigma)。将1ml培养混合物和不同的重组的人sIL-6R，IL-6和SCF(100ng/ml)的组合在37℃5％CO2，5％O2培养在24孔组织培养板中(Nunc，Kamstrop Denmark)。如前所述产生和应用重组sIL-6R，IL-6和SCF。无血清悬浮培养由2％纯的BSA(Sigma)，10mg/ml胰岛素，200mg/ml转铁蛋白，10-5M巯基乙醇(Eastman)和40mg/ml低密度脂蛋白(Nakarai Tesque Inc.，Tokyo)来代替FBS来组成(10)。每隔一周，用含同样的一系列细胞因子的新鲜培养基替换一半培养基。然后收集一部分细胞，洗涤，在血球计数仪中计数，细胞离心并染色。
结果
如上所述，研究的结果被出示于图10到图12中。图10示在IL-6(1.50ng/ml)的存在(○)或不存在(●)时应用不同浓度的sIL-6R和SCF在培养的第14天，在含血清的悬浮培养中干细胞的生长。图11示在sIL-6R(1280ng/ml)的存在(○)或不存时(●)应用不同浓度的IL-6和SCF在培养的第14天，在含血清的悬浮培养中干细胞的生长。图12示含单独的SCF，或者SCF和IL-6(50ng/ml)的组合，或者SCF/IL-6和sIL-6R(1280ng/ml)的组合时在含血清和无血清培养中在第7天(空心柱)，第14天(斜线柱)和第21天(实心柱)时干细胞的生长。结果来自三个独立的实验。标准方差以误差棒的方式表达。
                        实施例5
含组合的细胞因子的培养中血细胞生成干细胞红细胞样细胞的发育。
方法
在第7天和14天用常规方法对悬浮培养的细胞离心制品进行May-Grunwald-Giemsa染色。在第14天，还根据前述的方法(23)用抗血型糖蛋白A(Immuotech Co Marseilles，France)和抗血红素α-链(CosmoBio Co，Tokyo，Japan)的mAb使用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)方法进行免疫染色。阳性细胞被微红色颗粒染色。如上所述进行甲基纤维素培养(23，24)。培养培养物含500 CD 34+脐带血细胞，a-培养基，0.9％，30％FBS，1％BSA，5×10-5M巯基乙醇，1280ng/ml sIL-6R，80ng/ml IL-6和100ng/ml SCF。将1ml培养混合物培养在每个35mm Lux标准非组织培养皿中。将细胞在含5％CO2的空气中在37℃进行培养。
结果
研究结果被出示于图9中。在第7天(图9a)和14天(图8d)将悬浮培养的细胞离心制品用May-Grunwald-Giemsa染色。图9b和9c分别是用抗血型糖蛋白A mAb或抗血红素αmAb在第14天的对细胞离心制品的免疫染色。在图9e和9f中分别图示在用sIL-6R，IL-6和SCF在第14天在甲基纤维素培养中从红细胞样细胞中产生的代表性红细胞样细胞簇和混合红细胞样集落。
                        实施例6
对红细胞样细胞产生的抗体效果
方法
下面的试验检测了抗人gp130 mAb，抗人IL-6R mAb和抗人促红细胞生成素抗体对红细胞样细胞的产生的作用。如上所述制备了抗人gp130 mAb抗体制品(GPX7，GPX22和GPX35)(2)。简言之，用重组人可溶性gp130免疫小鼠，并建立了产生抗人gp130 mAb GPX7，GPX22和GPX35的杂交瘤。这三个抗体识别gp130上不同的表位，并通过抑制IL-6诱导的gp130与IL-6受体的结合而抑制了IL-6介导的生物应答(2，19)。制备了抗人IL-6R(PMI)mAb(20)。PMI通过抑制IL-6和IL-6受体的结合而抑制了IL-6介导的生物反应。兔抗人促红细胞生成素抗体(2gGK-5)由Kirin Co.；Japan提供。抗促红细胞生成素抗体(24mg/ml)中和2U/ml的促红细胞生成素(34)。
如图11所示，向人脐带血干细胞(2000 CD 34+细胞)中添加了预先确定的最佳浓度的sIL-6R/IL-6/SCF的组合(○)或促红细胞生成素(2U/ml)和SCF(100ng/ml)的组合(●)。如实施例4所述，观察了加入或未加入了抗人gp130 mAb(图11)，小鼠抗人IL-6R mAb(PMI)(图12)或兔抗人促红细胞生成素抗体(图13)的含血清的悬浮培养。在培养的开始加入梯度浓度的抗体。将未加入抗体的孔作为对照。在培养14天后，收获细胞，计数并离心。以总细胞数和离心甩片确定的红细胞样细胞的比例为基础对总的红细胞样细胞进行了计算(包括红血母细胞，幼红细胞和红细胞)。所得到了数据代表了在每个用抗体处理了的红细胞样细胞时对照孔中的细胞的比例，并以对照的百分比来表示(％)。

Claims (8)

1.一种体外扩增多能血细胞生成细胞的方法，其中所述多能血细胞生成细胞表达gp130，所述方法包括：用含可溶性白介素-6受体、白介素-6和干细胞因子的细胞因子组合培养所述细胞。
2.权利要求1的方法，其中将被扩增的细胞得自脐带血、外周血或骨髓。
3.权利要求1的方法，其中多能血细胞生成细胞是通过CD 34选择得到的祖细胞和/或干细胞。
4.权利要求3的方法，其中多能血细胞生成细胞是去除了增殖中细胞的干细胞。
5.权利要求1的方法，其中所说的可溶性白介素-6受体的使用浓度为至少80ng/ml到1280ng/ml。
6.权利要求5的方法，其中所说的白介素-6的使用浓度为至少50ng/ml到100ng/ml。
7.一种组合物，它包括用于权利要求1的多能血细胞生成细胞扩增的可溶性白介素-6受体、白介素-6和干细胞因子。
8.一种产生分化的血细胞集落的方法，它包括：将多能血细胞生成细胞与包含可溶性白介素-6受体、白介素-6和干细胞因子的组合相结合的体外方法，其中所述可溶性白介素-6受体、白介素-6和干细胞因子的量足以在缺乏促红细胞生成素的情况下产生成熟的红细胞样细胞群。
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