KR100980849B1 - 인터루킨(ｉｌ)-10을 포함하는 조혈모세포의 자가 재생산을촉진하는 조성물 - Google Patents

인터루킨(ｉｌ)-10을 포함하는 조혈모세포의 자가 재생산을촉진하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IL-10을 포함하는 조혈모세포의 자가재생산을 촉진하는 조성물 및 조혈모세포 배양 배지에 IL-10을 첨가 배양하는 것을 특징으로 하는 조혈모세포의 자가재생산을 촉진하는 방법에 관한 것으로, IL-10이 미분화단계의 조혈모세포의 자가재생산을 직접 촉진하는 리간드로서 작용함을 확인하였다.
조혈모세포(hematopoietic stem cell), IL-10(interleukin-10), 자가재생산(self-renewal)

Description

인터루킨(ＩＬ)-10을 포함하는 조혈모세포의 자가 재생산을 촉진하는 조성물{Composition Comprising Interleukin-10 for Promoting Self-renewal of Hematopoietic Stem Cells}
본 발명은 IL-10을 포함하는 조혈모세포의 자가재생산을 촉진하는 조성물 및 조혈모세포 배양 배지에 IL-10을 첨가 배양하는 것을 특징으로 하는 조혈모세포의 자가재생산 촉진 방법에 관한 것이다.
조혈모세포(hematopoietic stem cell; HSCs)는 조혈모 조직에서 혈액세포의 모든 계열세포로 분화될 수 있는 아주 희귀한 소집단이다. 이러한 조혈모세포는 골수가 파괴된 숙주에 조혈모세포를 이식하였을 때 재생하는 동안 자가재생능 (self-renewing capacity)을 가지고 장기간 재구성능력(repopulation)을 보여준다. 조혈모세포의 자가재생산은 각기 다른 이식세포 농도에 따른 in-vivo repopulation cells의 양적증가로 정의하며 competitive repopulating units (CRU)로 표시한다.
조혈모세포는 비대칭적으로 분열하는 동안 조혈모세포의 운명을 지배하는 세 포 외내부의 신호를 받게 된다. 내부적 전사조절연구와 조혈모세포의 자가재생산의 영향을 미칠 수 있는 미세환경과 같은 외부적 요소연구는 많은 연구가 진행 되오고 있는 반면, 조혈모세포의 자가생산성의 생리적 조절은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다.
다면발현적인 면역 조절 사이토카인인 인터루킨(Interleukin, IL-10)은 대식세포, 단핵세포, T림프구 세포의 작동체이며 사이토카인 분비를 억제한다. IL-10의 결핍(IL-10 K.O)은 면역반응을 조절하지 못하는 데에서 야기되는 만성의 탈장과 자가면역질환을 발생시킨다. IL-10이 정상골수세포 또는 재생불량성 빈혈세포에서 얻은 조혈모세포에 미치는 다양한 영향에 대한 몇몇 연구는, 조혈작용에 있어서 IL-10의 역할에 대한 가능성을 주장하고 있다. 하지만 조혈모세포에 대한 IL-10의 간접적 영향이 더 많이 주장되고 있으며, 미분화 단계의 생착능이 있는 조혈모세포에 대한 직접적인 조절자로서의 기능은 명확하게 밝혀지지 않았다.
이런 배경 하에, 본 발명자는 IL-10 K.O 마우스에서의 조혈과정의 여러 단계를 분석하기 위한 실험을 통해, IL-10은 면역기능을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 스트레스를 받은 골수의 미세환경 하에서 IL-10의 분비가 유도되며 IL-10이 조혈모세포의 자가재생산을 직접 조절하는데 탁월한 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 IL-10을 포함하는 조혈모세포의 자가재생산을 촉진하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 조혈모세포 배지에 IL-10을 첨가 배양하는 것을 특징으로 하는 조혈모세포의 자가재생산 촉진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 IL-10을 포함하는 조혈모세포의 자가재생산을 촉진하는 조성물 및 조혈모세포 배양 배지에 IL-10을 첨가 배양하는 것을 특징으로 하는 조혈모세포의 자가재생산 촉진 방법에 관한 것이다.
따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 IL-10을 포함하는 조혈모세포의 자가재생산을 촉진하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "조혈모세포(hematopoietic stem cells: HSCs)"라 함은 적혈구, 백혈구, 혈소판 등의 혈액세포를 만드는 미분화된 골수조혈세포의 조상세포로서, 조혈줄기세포라고도 한다. 조혈모세포는 골수가 파괴된 숙주에 조혈모세포를 이식하였을 때 재생하는 동안 자가재생능(self-renewing capacity)을 가지고 장기간 재구성능력(repopulation)을 보여준다. 본 발명의 조혈모세포는 인간(human), 원숭이(monkeys), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheeps), 개(dogs), 고양 이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rats) 등의 모든 동물 유래의 조혈모세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 세포이다. 또한, 본 발명에서 조혈모세포는 당업계에 널리 알려진 일반적인 방법에 의하여 골수, 말초혈액, 제대혈 등으로부터 획득할 수 있다.
본 발명에서 용어 "자가재생산(self-renewal)"은 동일한 성상 및 특징을 갖는 세포를 생산해내는 능력으로 자가복제, 자기복제, 자가재생이라고도 하며, 조혈모세포가 가지는 중요한 특징의 하나이다. 특히, 조혈모세포에 있어서 자가재생산이란 분화되지 않은 상태를 유지하면서 증식을 계속하는 능력을 의미한다.
조혈작용은 여러 가지 계통의 세포로 증식, 분화할 수 있는 조혈모세포(Hematopoietic Stem Cells)에 의하여 유지되는데, 조혈모세포는 자가재생산 및 성숙세포로의 분화라는 두가지 중요한 특징을 가지고 있다. 즉, 동일세포를 생산해내는 자가재생산 능력과 성숙된 임파조혈세포의 모든 계통으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 조혈모세포의 자가생산성은 조혈기능을 조절하는 중요 요소이므로, 조혈모세포의 자가생산성 조절을 통해 조혈세포로부터 생성되는 면역세포들을 포함하는 면역체계를 조절할 수 있다.
본 발명의 인터루킨(Interleukin, IL)-10은 미분화 단계의 생착능이 있는 조혈모세포에 대한 직접적인 조절자로서, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, IL-10은 면역기능을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 스트레스를 받은 골수의 미세환경 하에서 IL-10의 분비가 유도되며 IL-10은 조혈모세포의 자가재생산을 직접 촉진함을 알 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함된 IL-10은 최종적으로 IL-10이 발현될 수 있는 형태라면 어떤 형태로 포함되어 있든지 제한되지 않는다. 예컨대, IL-10 단백질 그 자체가 포함되어 있을 수도 있고, IL-10을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터가 포함되어 있을 수도 있고, IL-10을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터로 형질감염된 기질세포가 포함되어 있을 수도 있고, IL-10을 코딩하는 유전자가 도입되어 IL-10을 발현하는 바이러스가 포함되어 있을 수도 있다.
따라서, 하나의 바람직한 양태에서, 본 발명에서 조혈모세포의 자가재생산 촉진을 위한 조성물은 IL-10을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터를 포함한다. 본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murine leukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 바람직한 양태로서, 본 발명에서 조혈모세포의 자가재생산을 촉진을 위한 조성물은 IL-10 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 IL-10 단백질을 발현하는 바이러스를 포함한다. 본 발명에서 용어 "바이러스"는 IL-10 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 패키징 세포로 형질전환 및 감염시켜 제작한, IL-10을 발현하는 바이러스를 의미한다. 본 발명의 IL-10 단백질을 발현하는 바이러스 제조에 사용될 수 있는 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등을 포함하며 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 레트로바이러스이다.
또 다른 바람직한 양태로서, 본 발명에서 조혈모세포의 자가재생산 촉진을 위한 조성물은 IL-10을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터로 형질감염된 기질세포를 포함한다. 본 발명에서 용어 "기질세포"란 세망세포, 섬유아세포, 지방세포, 내피세포 등을 포함하는, 비조혈 기관의 비조혈 조직 세포를 말하며, 특정한 타입의 세포를 의미하는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 중간엽 기질세포를 사용하였다. 본 발명에서 용어 "중간엽기질세포(mesenchymal stromal cells; MSCs)"라 함은 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 지방조직, 태반조직 및 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 중간엽기질세포는 인간(human), 원숭이(monkeys), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheeps), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rats) 등의 모든 동물 유래의 세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 세포이다. 또한, 본 발명에서 중간엽기질세포는 당업계에 널리 알려진 일반적인 방법에 의하여 지방조직, 골수, 인대조직, 힘줄, 골격근, 평활근, 뼈, 연골, 결합조직, 말초혈, 피부, 제대혈 또는 태반으로부터 획득할 수 있다.
본 발명의 조성물은 IL-10 외에도 조혈모세포의 자가재생산 촉진에 도움을 주는 성장인자, 사이토카인 및 케모카인을 추가로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 성장인자, 사이토카인 및 케모카인은 백혈병 억제인자, IL-1 내지 IL-9, IL-11 내지 IL-13, IL-15 내지 IL-17, IL-19 내지 IL-22, 과립구 대식구 콜로니 자극인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF), 대식구 콜로니 자극인자 (M-CSF), 적혈구생성인자(Epo), 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3-리간드, B 세포 활성화인 자, 아르테민, 뼈 형태발생 단백질 인자, 표피 성장인자(EGF), 아교세포 유래 향신경성 인자, 림포탁틴, 대식구 염증성 단백질, 미오스타틴, 뉴르튜린, 신경 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 태반 성장인자, 플레이오트로핀, 줄기 세포인자, 줄기 세포 성장인자, 형질전환 성장인자, 종양 괴사 인자, 혈관 내피 세포 성장인자, 및 섬유아세포 성장인자, FGF-산성 및 염기성 섬유아세포 성장인자로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 조혈모세포 배양 배지에 IL-10을 첨가 배양하는 것을 특징으로 하는 조혈모세포의 자가재생산 촉진 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "배지(culture media)"는 인 비트로(in vitro)에서 조혈모세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 조혈모세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.
배지의 종류와 배양 방식에 특별히 제한 없이 조혈모세포 배지에 IL-10을 포함시켜 사용할 수 있으며, IL-10을 단독으로 사용하거나 기존에 알려진 하나 이상의 조혈모세포 자가재생산 촉진 물질을 함께 사용하는 등 다양한 응용이 가능하다. 예컨대, 본 발명의 배지에는 IL-10 외에도 조혈모세포의 배양 및 유지에 도움을 주는 성장인자, 사이토카인 및 케모카인을 추가로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 성장인자, 사이토카인 및 케모카인은 백혈병 억제인자, IL-1 내지 IL-9, IL-11 내지 IL-13, IL-15 내지 IL-17, IL-19 내지 IL-22, 과립구 대식구 콜로니 자극인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF), 대식구 콜로니 자극인자 (M-CSF), 적혈구생성인자(Epo), 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3-리간드, B 세포 활성화인자, 아르테민, 뼈 형태발생 단백질 인자, 표피 성장인자(EGF), 아교세포 유래 향신경성 인자, 림포탁틴, 대식구 염증성 단백질, 미오스타틴, 뉴르튜린, 신경 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 태반 성장인자, 플레이오트로핀, 줄기 세포인자, 줄기 세포 성장인자, 형질전환 성장인자, 종양 괴사 인자, 혈관 내피 세포 성장인자, 및 섬유아세포 성장인자, FGF-산성 및 염기성 섬유아세포 성장인자로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 배지에 포함된 IL-10은 최종적으로 IL-10이 발현될 수 있는 형태라면 어떤 형태로 포함되어 있든지 제한되지 않는다. 예컨대, IL-10 단백질 그 자체가 포함되어 있을 수도 있고, IL-10을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터가 포함되어 있을 수도 있고, IL-10을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터로 형질감염된 기질세 포가 포함되어 있을 수도 있고, IL-10을 코딩하는 유전자가 도입되어 IL-10을 발현하는 바이러스가 포함되어 있을 수도 있다.
본 발명의 IL-10을 포함하는 조성물을 이용하여 별도의 세포조절물질 처리 없이 간편하게 미분화단계의 조혈모세포의 자가재생산을 촉진시켜 면역반응을 조절할 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험동물의 준비 및 IL -10 K.O 마우스에서 미분화 조혈모세포의 감소
동종이식 마우스 모델을 위해 8~10주의 C57BL/6J-Ly5.2 또는 C57BL/6J-pep3b-Ly5.1 (Pep3b)를 공여마우스와 숙주마우스로 사용하였다. 각각의 마우스 세포는 세포표면의 표현형으로 구별할 수 있다. Ly5.1 또는 Ly5.2 IL-10 넉 아웃마우스 (Il10tm1Cgn) (C57BL6;Ly5.2)는 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)로부터 공급받았다. 모든 마우스는 가톨릭 실험동물실의 청정구역에서 micro-isolator cage 안에서 번식, 유지하였다. 그리고 동물실험은 가톨릭실험 동물위원회의 승인 을 받았다.
조혈모세포계에 미치는 IL-10의 영향을 조사하기 위해, 게놈 DNA에 EcoRI 제한효소를 처리한 후 Southern blot 분석과 PCR 분석법으로 동형 IL-10 넉 아웃(K.O; Knock-Out) 마우스를 검정하여 (도 1A), IL-10 K.O 마우스와 정상마우스(WT, C57BL6)의 골수세포를 비교분석하였다. IL-10 K.O 마우스에서 WT마우스 보다 약간 골수세포의 수가 감소하는 것을 관찰하였으며(14.8±3 대 21.2±2 × 107개의 세포, 각 그룹당 개체수 n=4~5) 분화된 골수세포 각 계열의 비율은 IL-10 K.O 마우스군과 WT 마우스군에서 비슷하였고, 다만 IL-10 K.O 마우스군에서 적혈구계(Ter119) 세포가 감소된 것을 관찰하였다 (도 1B). 유사하게도 동일한 골수세포를 semi-solid medium에 배양하였을 때 집락군의 유형과 수도 두 그룹에서 차이가 없었다 (도 1C).
이와 반대로 장기배양세포 (LTC-IC)을 통한 미분화 단계의 조혈모세포에서는 유의한 차이점을 보여주었다. 4주의 장기배양 후 동일한 골수세포 수로부터 IL-10 K.O 골수는 24±4 개의 집락군을 형성한 반면 WT 마우스 골수는 67±17 개의 집락군을 형성하였다 (도 1D) (3번의 반복실험; p<0.05; WT의 개체수n=4, IL-10 K.O의 개체수 n=5). 이러한 결과들은 IL-10 K.O 마우스에서 분화된 조혈모세포보다 미분화된 조혈모세포에 선택적으로 영향을 미칠 수 있다는 가능성을 보여준다. 위의 가능성을 실험하기 위해 치사 방사선 조사된 숙주 마우스들에게 각각의 골수세포를 이식하여 장기간 체내 생착 재구성능을 살펴보았다. 도 2A와 2B에서 보는 바와 같이 이식 3주 후 WT 마우스의 골수세포보다 IL-10 K.O 마우스의 골수세포의 생착력이 낮게 나타났다 (70% 대 45%). 그리고 12주 동안 생착력 차이는 유지되었다 (이식 12주 후 88% 대 46%, p=0.02)(도 2B). 반면에 공여 세포로부터 기원된 림프계와 골수계의 분포비율의 생착력 차이가 없으므로 (도 2C), 분화된 전구세포의 단계보다는 좀더 조혈모세포의 단계에서 차이가 있음을 주장할 수 있다. 이와 같은 가능성을 알아보기 위해 각각의 골수세포내의 조혈모세포의 정량적인 차이를 이식 생착율을 통하여 분석하였다. 그 분석 결과 WT 마우스의 골수보다 II-10 K.O 마우스 골수의 CRUs 가 낮게 측정되었다 (4340 CRUs 대 1580 CRUs)(표1). 또한 흥미롭게도 20주 이상된 탈장 현상을 보인 IL-10 K.O 마우스에서는 CRUs (<376 CURs)가 좀더 감소된 것을 알 수 있었다. 위와 같은 결과들은 IL-10 K.O 마우스에서는 미분화 조혈모세포가 양적으로 감소함을 보여준다.
실시예 2. IL -10를 분비하는 기질세포가 조혈모세포의 자가재생산에 미치는 영향 마우스의 조혈모 전구세포를 얻기 위해 마우스의 체중에 따라 150mg/kg로 5-fluorouracil(5-FU, Sigma, St. Louis, MO) 처리한 후, 4일 후에 마우스에서 골수세포를 추출하였다. 또한 미분화 조혈모세포를 얻기 위해 전체 골수세포를 면역자기정제법(StemsepTM, Stemcell Technologies, Vancouver, Ca)를 이용하여 계열(lineage) 양성세포(CD5, CD45R, CD11b, TER119, Gr-1, 7-4)를 제거하였다. 양성세포를 제거한 세포를 Lin-Sca-1+c-kit+ (LSK) 세포로 추출하였다. Side population(SP) 세포는 다음에 기술된 바와 같이 순수하게 분리하였다. 골수세포를 5㎍/ml Hoechst 33342 (SigmaChemical Co., St. Louis, MO), 2% FBS, 1mM Hepes 가 함유된 완충액 50μM verapamil(Sigma Chemical Co.)를 첨가한 대조군과 첨가하지 않은 실험군을 37℃ 에서 90분간 배양하였다. 그리고 난후 FACS vantage에서 350nm, 450nm, 675nm 파장을 이용하여 세포를 추출하였다.
중간엽기질세포(Mesenchymal stromal cells)는 마우스의 골수세포를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에 10% FBS와 1% PenStrep (Gibco-BRL, Rockville, Maryland) 함유된 배지에서 배양하였다. 중간엽기질세포를 확립시키기 위해 조혈모세포 인자인 CD45가 음성이 될 때까지 계대 배양하였다.
IL-10를 분비하는 중간엽기질세포를 만들기 위해 murine IL-10 cDNA를 MIG(MSCV-IRES-GFP)인 레트로바이러스 벡터에 클로닝하였다. 293T 세포주에 각각의 레트로바이러스 벡터와 gag-pol, vesicular stomatitis virusglycoprotein(VSV-G), gibbon ape leukemia virus(GALV)와 같은 envelope DNA와 함께 감염시킨 후, 상층액을 모아서 초원심 분리시키고 중간엽기질세포에 감염시켰다. 전이된 중간엽기질세포에서 GFP를 발현하는 양성세포만을 얻어내었다. IL-10 이 전이된 중간엽기질세포를 96시간 동안 배양한 후 상층액을 걸어내어 ELISA로 IL-10의 농도를 측정하였다. 위와 같은 방법으로 분리된 IL-10를 분비하는 기질세포의 상층액에서의　IL-10 농도는 60~70ng/ml 인 반면, 대조군 기질세포에서는 IL-10 농도는 20~30pg/ml 으로 측정되었다. 또한 위와 같이 확립된 기질세포는 조혈모세포의 표면 표현형을 가지 지 않고 전형적인 중간엽기질세포의 표면 표현형을 가짐을 확인하였다 (도 3B). 기질세포만을 마우스 내에 이식하였을 경우 어떠한 조혈모세포의 생착도 관찰할 수 없었다 (결과는 나타내지 않음). 위에서 서술한 각각의 중간엽기질세포를 feeder로 사용하여 그 위에 5-FU 처리한 골수세포를 long-term culture medium(MyelocultTM, StemCell Technology) 배지에 같은 사이토카인을 첨가하여 5일 동안 배양하였다.
집락군세포(colony forming cell;CFC) 분석을 위해 methylcellulose medium (MethoCultTM M3231, StemCell Technologies)에 3U/mL erythropoietin (StemCell Technologies), 50ng/mL mSF (R&D systems), 10ng/mL hIL-6 (R&D systems) 및 10ng/mL mIL-3 (R&D systems)첨가하고 골수세포를 함께 배양하여 14일 후 세포집락군의 수와 유형을 측정하였다. 장기배양세포 분석을 위해 처음으로 기질세포(feeder cell)를 확립 시키고자 골수세포를 long-term culture medium (MyelocultTM, StemCell Technology)에 10-6M hydrocortisone sodium hemisuccinate (Sigma)를 첨가하여 배양한 후, 확립된 기질세포를 1500cGy로 방사선조사 하였다. 골수세포를 함께 배양하면서 4주 동안 매주 반씩 배지를 교체한 후, semi-solid methylcellulose medium에 옮긴 후 형성된 집락군의 수를 측정하였다.
900rad로 방사선 조사된 숙주마우스에 공여자세포와 1X105개의 helper cells를 함께 이식하였다. 이식 생착된 세포들을 골수나 혈액의 백혈구 세포에서 발현되는 항원(Ly5.1 또는 Ly5.2)을 FACS 분석법을 통해 공여 세포를 측정하였다. 재구성된 조혈모세포의 계열분석은 골수계는 anti- Mac-1 (BD Pharmigen, San Diego,CA) 와 anti-Gr-1 antibody (BD Pharmigen)으로 염색하였고, 림프계는 anti-TB104 (BD Pharmigen)또는 anit-B220(BD Pharmigen) 항체로 염색하여 생착능을 측정하였다.
체내에서 재구성되는 조혈모세포를 정량하기 위해, 한계희석 이식법 (Limiting dilution transplantation)을 실시하였다. 900cGy로 치사 방사선 조사된 숙주마우스에 1X105개의 helper cells과 함께 공여세포를 연속적으로 희석하여 이식하였다. 이식한 지 16주 후부터 숙주마우스의 혈액세포에서 생착된 공여자의 세포구성 비율이 림프계와 골수계 모두 1% 이상 되는 것을 생착 양성으로 간주하였다. 각 세포 용량당 어떤 특정한 세포용량에서 37%의 대상마우스가 음성으로 생착되는 세포용량을 1개의 CRU(competitive repopulation unit)로 계산하였다. CRU 빈도와 95% confidence intervals(CI)는 Poission statistics를 적용하여 음성 생착된 마우스 비율을 L-Calc software (StemCell Technologies)를 사용하여 계산하였다.
상기와 같이 5-FU 처리한 골수세포를 각각의 기질세포와 함께 배양한 후 치사 방사선 조사된 숙주 마우스들에 이식하였더니, 관찰기간동안 IL-10를 분비하는 기질 세포군이 대조군보다 높게 생착됨을 관찰할 수 있었다 (이식 16주 후 37±9% 대 13±7%, p<0.05)(도 3C). IL-10 기질 세포군에서 높게 생착됨은 숙주 마우스 내에서 공여세포(Ly5.1)로부터 유래하여 재생된 조혈모세포의 수가 많기 때문이라고 사료된다. 그래서 2차 숙주마우스에서 한계이식 생착법을 이용하여 재구성된 1차 골수를 정량하였다 (550 CRUs 대 65 CRUs). 이것은 초기의 input cells(5-FU 골수 세포1×105 당 16 CRUs)(도 3D)로부터 34배(550/15)와 4배(65/15)가 증가된 것으로 볼 수 있다. 이러한 결과들은 IL-10이 조직체 내에서도 자발적으로 조혈모세포의 재생의 증가를 야기함을 보여준다.
실시예 3. IL -10가 조혈모세포의 자가재생산에 미치는 영향
IL-10을 분비하는 기질세포 배양에서 조혈모세포의 재생이 증가하였을지라도, IL-10 은 단핵세포에서부터 분비되는 TNF-α와 IFN-γ와 같은 사이토카인의 분비를 억제시킬 수 있다. 그리고 이러한 사이토카인은 미분화 조혈모세포수를 감소시킬 수 있다. 그러므로 조혈모세포 증식에서 간접적인 사이토카인의 억제성 효과의 가능성을 배제시키기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
IL-10이 5일의 배양기간 동안 기질세포 또는 accessory cells을 제외한 상태에서 조혈모세포의 빈도의 차이를 야기하는 조혈모세포의 자가재생산성을 촉진시키면 이는 분화된 accessory cells 의 재생을 최소할 수 있다. 그리하여 순수하게 분리된 LSK 세포를 IMDM + BITTM가 포함된 serum-free medium (Stemcell Technology, Vancouver, Canada)에 10-4 M 2-mercaptoenthanol + 40 ㎍/mL LDL(Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 100ng/ml murine steel factor (mSF, R&D systems, Minneapolis, MN, USA), 100 ng/ml human flt-3 ligand (hFL, R&D systems) 및 50ng/ml human thrombopoietin (hTPO, CytoLab /PeproTech, Rehovot, Israel)를 첨가하고 100 ng/ml murine IL-10 (mIL-10 CytoLab/PeproTech, Rehovot, Israel)를 첨가하지 않 은 대조군과 첨가한 실험군을 5일 동안 배양한 후, 숙주 마우스들에게 한계 이식하였다 (도 4A).
그 결과, IL-10을 첨가하지 않은 대조군 보다 IL-10을 첨가해준 그룹에서 CRU frequencies 가 3~4배 증가하였다 (4.3배와 2.8배 증가) (표2). IL-10을 첨가하여 배양하고 배양이 끝난 후 전체 LSK 세포도 증가하였다(8.3배와 2.9배)(표2). 이는 배양을 한 후 LSK 세포와 재구성되는 줄기세포과의 연관성을 보여준다. PI 염색을 통한 LSK세포의 세포주기나 생존율의 차이는 없었다. 그리고 IL-10 첨가하여 배양한 배지에서 대조군과 비교하여 TNF-α와 IFN-γ의 농도의 차이가 없었다 (도 4B). 그러므로 IL-10의 첨가로 인한 CRU 빈도의 증가는 사이토카인 분비에서 IL-10의 간접적 억제효과로 야기되지 않았음을 알 수 있다.
실시예 4. 골수세포에서의 면역조직화학염색법을 통한 IL -10 사이토카인과 수용체 발현
IL-10 이 조혈모세포를 촉진하는 ligand 인지를 알아보기 위해 미분화 단계의 조혈모 세포군에서 IL-10 수용체의 발현여부를 측정하였다. 유체세포측정법(flow cytometry) 분석을 위해 Lineage 음성세포(Lin-), LSK 세포, SP 세포(단핵세포 중에 0.25%)들을 정상골수세포에서 순수하게 분리하고, IL-10 수용체의 α subunit 에 대한 항체(BD Biosciences PharMingen, San Diegl, CA)와 함께 반응시켰다. 5'-GAG TCT CCA GGG CTA CAG GC-3'(서열번호 1)와 5‘-CAC AGC TAA CCA CAC CCA GG-3'(서열번호 2)의 프라이머 조합을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. TNF-α 와 IFN-γ의 사이토카인 농도를 측정하기 위해 LSK 세포를 시험관 배양하여 2일 또는 5일 후에 상층액만을 취하여 ELISA를 통해 농도를 측정하였다. 정상골수와 방사선 조사된 골수에서 IL-10의 분비를 측정하기 위하여, 다음과 서술된 바에 따라 면역조직화학염색법으로 분석하였다. 탈파라핀 처리된 대퇴골 조직을 sodium citrate 용액 처리하고(121℃, 3분) IL-10 항체 (Biolegend, San Diego, CA)(10ug/ml)가 함유된 혈청 완충용액 (ChemMate TM Detection Kit, DAKO, Denmark)에 30분간 반응 처리하였다. 15분 후에 슬라이드를 2차 항체인 goat anti-rat antibody (Biolegend)와 염색시키고 endogenous peroxidase를 방지하기 위해 0.3% H2O2를 처리시킨후, streptavidin-HRP(DAKO)와 HE를 염색시켰다. 정상골수에서 IL-10의 분비를 측정하기 위해 5’-CAG TAC AGC CGC CGG GAA GAC AA-3'(서열번호 3) 와 5‘-CAG CTT CTC ACC CAG GGA AT-3'(서열번호 4)의 프라이머 조합을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 4C에서 보여준 바와 같이 미분화 단계의 조혈모세포들을 포함하는 Lin- 세포와 LSK 세포, SP 세포들에서 IL-10 수용체가 발현되었고, 세포막 수용체에 대한 항체를 통한 분석에서도 발현되었다. IL-10 수용체는 장기 생착 조혈모세포로서의 특성을 가진 SP세포(tip-SP cells)에서도 발현됨에 따라 원시적인 조혈모세포는 수용체를 통해 IL-10의 자극을 받을 수 있음을 알 수 있다 (도 4D).
실시예 5. Stress 미세환경 하에서 IL -10가 조혈모세포의 자가재생산성에 미치는 영향
다음으로 조혈모세포에 대한 IL-10의 영향이 조직학적으로 유의한 차이가 있는지 알아보기 위하여, IL-10이 재생과 재구성하는 동안 미세환경의 변화에 따른 변화가 있는지를 알아보았다. 방사선 조사로 유도된 "stress" 상태와 "steady-state" 상태 하에서 골수 미세환경 안에서 IL-10 분비량을 측정하였다. 방사선 조사를 하지 않은 steady-state 골수에서는 IL-10의 양이 낮게 측정된 것과는 달리 방사선 조사된 골수에서는 IL-10의 분비량이 현저하게 증가하였다 (도 5A). 방사선 조사된 골수에서 trabecular부분에서 endosteal 세포막의 골아세포에서 IL-10의 분비가 증가하는 것을 관찰하였다. trabecular 세포막에서의 IL-10의 분비증가는 방사선 조사한 후 8일까지 유지되었다 (도 5B). Trabecular bone은 조혈모세포가 초기에 머무르는 곳이며, 골아세포는 조혈모세포의 자가재생산을 위한 줄기세포 niche의 부분이다. 이러한 결과들로부터 IL-10은 stress가 유도된 조혈모세포의 재생동안 조혈모세포의 자가재생산을 위한 중요한 리간드임을 알 수 있다.
실시예 6. 통계적 분석
실험군간의 유의한 차이를 알아보기 위해 Student's t test(p<0.05)를 이용하여 분석하였으며, CRU 빈도와 95% confidence intervals(CI)는 ±2SEM를 반영하는 Poisson statistics를 적용하여 계산하였다.
표 1. WT 와 IL -10 K.O 마우스의 골수에서 CRU 수의 정량적인 비교
각각 마우스의 골수에서 lineage negative(Lin-)세포들의 전체수를 측정하였다. 정제된 lin-세포는 숙주골수세포(1×105 개의 세포)와 함께 한계희석용량으로 방사선 조사된 숙주마우스에 이식하였다. 이식 16주 이후 CRU 빈도를 측정하기 위해 음성 생착된 마우스의 비율로 Possion statistics를 통하여 계산하였다. 재생된 CRUs의 전체수는 2개의 대퇴골과 2개의 경골의 골수의 비율을 전체 골수의 25%로 보정하여 전체 lin-세포수로부터 계산되어졌다. CRU 수의 95% confidence interval(CI)는 ±2SEM으로 보정하여 측정하였다.
Figure 112007054462619-pat00001
표 2. 기질세포가 없는 LSK 세포의 배양에서 IL -10의 효과
골수세포에서 LSK 세포를 분리하여 기질세포가 없고 성장인자들(SF, FL,TPO)가 함유된 배지에서 IL-10를 첨가하지 않은 대조군과 첨가한 실험군을 배양하였다 (각각의 실험군당 1×104 개의 세포). 5일 동안 배양한 후, 전체 LSK 세포수를 측정하였고 flow cytometry를 통해 LSK 세포의 비율 또한 측정하였다. 그리고 CRU 빈도를 측정하기 위해 방사선 조사된 숙주마우스에 한계희석용량으로 배양이 끝난 세포들을 이식하였다. 표2는 양성 생착된 마우스의 비율과 각각의 다른 두 실험에서 측정한 CRU 빈도(±2SEM 으로 표시되어진 95% confidence interval(C.I)의 상하한계치)를 나타낸다.
a: 5일 배양후 증식되어진 전체 LSK세포의 수.
Figure 112007054462619-pat00002
도 1은 조혈모세포에서의 IL-10 결핍 효과의 시험관 내 분석과 관련된 것이다. (A)는 IL-10 유전자에 대한 벡터표적화의 도식적 구조와 야생형(WT) 및 IL-10 넉 아웃(K.O) 마우스의 Southern blot 검정을 나타낸 것이고, (B)는 골수계(Mac-1/Gr-1)와 림프계(B220 와 TB104) 및 적혈구계(Ter119)의 조혈모세포의 비율을 SEM표시되는 오차막대로 나타낸 것이다 (야생형의 개체수=4, IL-10 넉 아웃의 개체수=5 * p<0.05). (C)는 야생형(WT)과 IL-10 넉 아웃(K.O) 마우스의 골수세포로부터 형성되는 집락군 세포 비교 결과로서, 적혈구계(CFU-E, BFU-E), 골수계(CFU-GM) 및 적혈구계와 골수계가 혼합되어 있는(CFU-GEMM)의 집락군 형성을 위해 야생형(WT)과 IL-10 넉 아웃(K.O) 마우스의 동량의 골수세포를 반고형 배지에서 배양하여, 각 유형의 집락군의 평균을 측정하여 나타낸 것이고, 오차막대는 SEM으로 표시하였다 (WT의 개체수 n=4, IL-10 K.O의 개체수 n=5). (D)는 야생형(WT)과 IL-10 넉 아웃(K.O) 마우스 골수세포의 장기배양세포의 능력을 비교한 결과로서, 야생형(WT)과 IL-10 넉 아웃(K.O) 마우스의 동량의 골수세포(1×105개의 세포)를 4주 동안 배지를 반씩 교체하면서 배양한 후, 반고형 배지에 형성된 집락군의 수를 측정하였다. 3번의 실험으로부터 측정된 집락군의 평균값을 나타내었다 (WT의 개체수n=4, IL-10 K.O의 개체수 n=5; p=0.02).
도 2는 WT와 IL-10 K.O 마우스 골수세포의 체내 재구성능 비교와 관련된 그래프를 나타낸 것이다. (A),(B)는 치사량 방사선 조사된 숙주마우스(Ly5.1)에 WT 또는 IL-10 K.O 마우스의 동량의 골수세포(2×105 개의 세포)와 helper cells(1×105 개의 세포)를 동시에 이식한 후 숙주마우스의 혈액에서 공여자로부터 기원되어 생착된 세포비율의 평균값과 FACS plot(A)을 나타낸 것이다 (3번의 실험, 각 실험군당 개체수 n=17, *; p<0.05). (C)는 숙주마우스의 혈액에서 골수계(Mac-1/Gr-1)와 림프계(B220)로 분석한 생착된 계열세포의 분포를 나타낸 것으로서, 공여자로부터 기원된 각 계열세포의 비율을 나타내었다.
도 3은 IL-10를 분비하는 기질세포와 함께 배양된 조혈모세포의 재구성 능력 증진과 관련된 그래프를 나타낸 것이다. (A)는 5-FU 처리된 골수세포(pep3b, Ly5.1)를 SF, FL3,TPO가 함유된 배지에 대조군 기질세포(MIG/stroma) 또는 IL-10를 분비하는 기질세포(IL-10/stroma) 위에서 5일 동안 배양한 후, 재구성 능력을 비교하기 위해 치사량 방사선 조사된 숙주 마우스들(BL6, Ly5.2)에게 이식하였고, 공여세포의 CRUs의 빈도는 1차 골수세포를 2차 숙주마우스에 한계희석 이식법으로 정량하는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이며, 한계희석 이식법은 각 1차 숙주마우스의 공여세포(Ly5.1)의 CRUs의 전체수를 측정하기 위함이다. (B)는 기질세포로서 확립된 초기의 간엽 줄기의 형질적 특성을 나타낸 것으로서, FACS plot으로 IL-10을 분비하는 기질세포가 중간엽기질세포의 전형적인 세포막 형질을　분석하였다. 점선은 대조군 isotype이고 두꺼운 선은 제시된 항체를 이용하여 염색하여 분석하였다. (C)는 세포(초기 세포수 1×105 개)를 MIG/stroma(MIG) 또는 IL-10/stroma(IL-10) 와 함께 배양하고 이식한 후 1차 숙주마우스 혈액에서의 생착 수준을 나타낸 것으로서, 숙주마우스 혈액 백혈구세포에서 공여 세포(Ly5.1) 비율의 평균 ±2SEM를 나타내었다 (2번 실행, 대조군 개체수 n=11, IL-10 실험군 개체수 n=8, *; p<0.05). (D)는 1차 숙주마우스 골수에서 재구성되어진 CRU 수로서, 2차 이식을 위해 1차 숙주마우스의 골수세포를 처음 이식 24주 후에　추출하고, 공여 세포의 CRUs 빈도는 2차 이식 16주 후 Possion statistics를 사용하여 측정하였다. 그리고 전체 CRUs의 수는 두 개의 대퇴골과 경골의 골수비율을 전체 골수세포의 25%로 가정하여 계산하였다. 값(Values)은 하나의 마우스당 공여자로부터 기원된 세포(Ly5.1)의 전체 CRUs값이다 (각 그룹당 2차 숙주마우스의 개체수 n=15). 오차막대는 95% confidence interval(C.I)의 상하 한계치이며(보정 ±2SEM), MIG의 CRUs는 65이었고(95% C.I.; 17~250), IL-10은 550 CRUs(95% C.I.; 240~1260)이었다.
도 4는 IL-10이 체외 배양중 조혈모세포의 자가재생산을 직접적으로 자극할 수 있음을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. (A)는 정제된 LSK 세포를 사이토카인이 함유된 기질세포가 없는 배지에 IL-10을 첨가하거나 첨가하지 않고 5일간 배양한 후, CRU 빈도를 측정하기 위해 연속한계 희석법으로 방사선 조사된 숙주마우스에 세포들을 이식하였고, 사이토카인 분비를 억제하는 IL-10의 효과를 알아보기 위해 배양 2일과 5일의 상층액을 취하여 사이토카인의 농도를 측정하는 실험과정을 개략적으로 나타낸 그림이다. (B)는 기질세포가 없는 LSK 세포의 배양중에　IL-10을 첨가하거나 첨가하지 않은 배지에서 TNF-α IFN-γ 농도를 측정한 것으로, 상층 액은 LSK세포배양 2일 또는 5일째에 걸어 내었고, 사이토카인 측정은 ELISA를 통해서 이중 측정방법으로 평균값을 측정하였다. (C)는 미분화된 조혈모세포의 IL-10 수용체 발현을 나타낸 것으로, Lineage 음성세포(Lin-), LSK 세포, SP 세포 (단핵세포중에 0.25%) 들을 정상골수세포에서 순수하게 분리하고, IL-10 수용체의 α subunit에 대한 세포막 수용체와 전사를 분석하였다. 세포막 항체 염색을 통한 flow cytometry 분석그림(upper panel)과 전사를 통한 RT-PCR 결과(lower panel)를 나타내었다. RT-PCR의 β-actin은 cDNA mix를 1/10 희석 분석하였다 (NC; 음성대조군, W; 전제골수 세포). (D)는 SP 세포의 subpopulation에서의 IL-10 수용체 발현을 나타낸 것으로, 비중이 낮은 단핵 세포들을 Hoechst33342로 염색하여 proximal-SP(전체 단핵 세포들에 0.22%), tip-SP(0.02%), 또는 MP(main population, 98.6%) 으로 구역을 나뉘었으며, verapamil를 첨가한 군은(왼쪽)에 첨가하지 않은 군은(오른쪽)에 나타내었다. 양성으로 염색된 세포의 수는 isotype 대조군을 99% 로 표준을 잡아서 IL-10 수용체의 항체를 염색하여 분석하였다.
도 5는 스트레스 받은 골수의 미세환경 하에서 IL-10의 유도와 관련된 그래프를 나타낸 것이다 (900cGy로 방사선 조사된 마우스의 골수를 각각의 제시된 날짜별로 추출함). (A)는 RT-PCR를 통한 골수내의 IL-10 전사를 나타내며, (B)는 각각의 마우스의 대퇴골에서 IL-10 항체를 이용하여 면역조직화학염색법을 통해 IL-10 분비를 측정한 결과이다. 아래쪽 panel의 네모상자에서 화살표는 endosteal 골아세포를 가리키며, 별모양은 대퇴골의 trabecule를 가리키고, panel에 삽입된 네모상자는 골아세포에서의 IL-10를 세포질 염색하여 나타낸 결과이다 (×400배).
<110> OH, IL HOAN <120> Composition comprising interleukin-10 for promoting self-renewal of hematopoietic stem cells <150> KR10-2007-0040578 <151> 2007-04-25 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 for RT-PCR of IL-10 receptor <400> 1 gagtctccag ggctacaggc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 for RT-PCR of IL-10 receptor <400> 2 cacagctaac cacacccagg 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 for RT-PCR of IL-10 <400> 3 cagtacagcc gccgggaaga caa 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 for RT-PCR of IL-10 <400> 4 cagcttctca cccagggaat 20

Claims (23)

  1. 인터루킨(IL)-10을 포함하는, 조혈모세포의 미분화능 유지 및 자가재생능 촉진용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조혈모세포는 인간으로부터 유래한 것이며, 원시미분화상태의 표지자로서 Lin-Sca-1+c-kit+(LSK)를 가지며, Side Population(SP) 세포의 특성을 가지는 것인 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 조혈모세포는 인간 골수에서 유래한 것인 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 분리된 조혈모세포를 추가로 포함하는 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 성장인자, 사이토카인 및 케모카인을 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 성장인자, 사이토카인 및 케모카인이 백혈병 억제인자, IL-1 내지 IL-9, IL-11 내지 IL-13, IL-15 내지 IL-17, IL-19 내지 IL-22, 과립구 대식구 콜로니 자극인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF), 대식구 콜로니 자극인자 (M-CSF), 적혈구생성인자(Epo), 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3-리간드, B 세포 활성화인자, 아르테민, 뼈 형태발생 단백질 인자, 표피 성장인자(EGF), 아교세포 유래 향신경성 인자, 림포탁틴, 대식구 염증성 단백질, 미오스타틴, 뉴르튜린, 신경 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 태반 성장인자, 플레이오트로핀, 줄기 세포인자, 줄기 세포 성장인자, 형질전환 성장인자, 종양 괴사 인자, 혈관 내피 세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자, FGF-산성 및 염기성 섬유아세포 성장인자로 구성된 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 인터루킨(IL)-10 을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터를 포함하는 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 인터루킨(IL)-10을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터로 형질감염된 기질세포를 포함하는 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 기질세포는 인간으로부터 유래한 것인 조성물.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 기질세포는 지방조직, 골수, 인대조직, 힘줄, 골격근, 평활근, 뼈, 연골, 결합조직, 말초혈, 피부, 제대혈 또는 태반으로부터 유래한 것인 조성물.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 기질세포는 중간엽기질세포인 조성물.
  12. 제 1항에 있어서, 인터루킨(IL)-10 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 인터루킨(IL)-10 단백질을 발현하는 바이러스를 포함하는 조성물.
  13. 조혈모세포 배양 배지에 인터루킨(IL)-10을 첨가 배양하는 것을 특징으로 하는, 조혈모세포의 미분화능을 유지 및 자가재생능을 촉진하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 조혈모세포는 인간으로부터 유래하는 것이며, 원시미분화상태의 표지자로서 Lin-Sca-1+c-kit+(LSK)를 가지며, Side Population(SP) 세포의 특성을 가지는 것인 방법.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 조혈모세포가 인간 골수에서 유래한 것인 방법.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 배양 배지에 성장인자, 사이토카인 및 케모카인을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 성장인자, 사이토카인 및 케모카인이 백혈병 억제인자, IL-1 내지 IL-9, IL-11 내지 IL-13, IL-15 내지 IL-17, IL-19 내지 IL-22, 과립구 대식구 콜로니 자극인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF), 대식구 콜로니 자극인자 (M-CSF), 적혈구생성인자(Epo), 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3-리간드, B 세포 활성화인자, 아르테민, 뼈 형태발생 단백질 인자, 표피 성장인자(EGF), 아교세포 유래 향신경성 인자, 림포탁틴, 대식구 염증성 단백질, 미오스타틴, 뉴르튜린, 신경 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 태반 성장인자, 플레이오트로핀, 줄기 세포인자, 줄기 세포 성장인자, 형질전환 성장인자, 종양 괴사 인자, 혈관 내피 세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자, FGF-산성 및 염기성 섬유아세포 성장인자로 구성된 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 13항에 있어서, 인터루킨(IL)-10 을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터를 포 함하는 방법.
  19. 제 13항에 있어서, 인터루킨(IL)-10을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터로 형질감염된 기질세포를 포함하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 기질세포는 인간으로부터 유래한 것인 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 상기 기질세포는 지방조직, 골수, 인대조직, 힘줄, 골격근, 평활근, 뼈, 연골, 결합조직, 말초혈, 피부, 제대혈 또는 태반으로부터 유래한 것인 방법.
  22. 제 19항에 있어서, 상기 기질세포는 중간엽기질세포인 방법.
  23. 제 13항에 있어서, 인터루킨(IL)-10 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 인터루킨(IL)-10 단백질을 발현하는 바이러스를 포함하는 방법.
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