JPWO2003014336A1 - 造血幹細胞の製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は、造血幹細胞の製造法および造血幹細胞の培養に用いられる培地に関する。
背景技術
生体中の成熟血液細胞の寿命は短期間であり、絶えず造血前駆細胞の分化により成熟血液細胞が供給されることにより、血液の恒常性が保たれている。造血前駆細胞は、さらに未分化な造血幹細胞の分化により生成する。造血幹細胞は、各種の分化系列に分化できる能力(分化多能性)を有しているとともに、分化多能性を保持したまま自己複製することで生涯にわたり、造血細胞を供給する。つまり、自己複製をすることで分化多能性を持つ幹細胞を生じるとともに、一部は造血前駆細胞を経て各種の成熟血液細胞に分化することが知られている。
このような血液細胞の分化は種々のサイトカインにより調節されている。エリスロポエチン(EPO)は赤血球系の細胞の分化を、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)は好中球系の分化を、トロンボポエチン(TPO)は巨核球および血小板産生細胞の分化を、それぞれ促進することが知られている。しかしながら、造血幹細胞が分化多能性を保持したまま自己複製するに際し、どのような因子が必要とされるかは分かっていない。造血幹細胞の増殖因子として、SCF/MGF(Williams,D.E.,Cell,63:167−174,1990;Zsebo,K.M.,Cell,63:213−224,1990)や、SCGF(WO98/08869号)などいくつかの報告があるが、いずれも造血幹細胞の分化多能性を十分に維持する作用を有していない。また、既知のサイトカインを複数組み合わせて添加することにより造血幹細胞を培養する試みがなされている(Miller CL,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:13648−13653,1997;Yagi M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:8126−8131,1999;Shih C.C.Blood,94:5 1623−1636 1999)。
一方、造血細胞の維持および増殖に適した環境を提供するストローマ細胞を利用して造血幹細胞を分化させずに維持および増殖させる試みがなされている(Moore K.A.,Blood,89:12 4337−4347 1997、Expansion in vitro of adult murine hematopoietic stem cells with transplantable lympho−myeloid reconstituting ability,Cindy L.Miller and Connie J.Eaves,PNAS 94:13648−13653)。また、WO99/03980号には、マウス胎児のAGM(Aorta−Gonad−Mesonephros)領域から株化された、造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得るストローマ細胞株が開示されている。更に、Rappold I,Watt SM,Kusadasi N,Rose−John S,Hatzfeld J,Ploemacher RE.Gp130−signaling synergizes with FL and TPO for the long−term expansion of cord blood progenitors.Leukemia.1999 Dec;13(12):2036−48にはSCF、FL、TPO、sIL−6R−IL−6融合タンパク質(Hyper−IL−6)およびストローマ細胞を用いて培養を行っている。
しかし、Rappoldらの培養系は造血前駆細胞の培養系であり、造血幹細胞の培養系とは全く異なる。また、Kusadasi N et al.,Leukemia.2000;11:1944−1953には、IL−6、Flt−3リガンド(FL)、およびTPOの培養系ではストローマ細胞の機能はFL+TPOで代償され、ストローマ細胞は幹細胞維持機能を増強する作用をほとんど有していないことが報告されている。
発明の概要
発明者らは今般、gp130刺激因子と、サイトカインカクテルと、ストローマ細胞との存在下で造血幹細胞を培養することにより、造血幹細胞を効率的に増殖させ、その生存を支持できることを見出した。
本発明は、造血幹細胞の効果的な製造法、造血幹細胞の効果的な培養法、並びに造血幹細胞の培養に用いられる培地の提供をその目的とする。
本発明による造血幹細胞の製造法は、gp130刺激因子と、一種以上のサイトカイン類と、ストローマ細胞との存在下において造血幹細胞を培養する工程を含んでなるもの、である。
本発明による造血幹細胞の培養法は、gp130刺激因子と、一種以上のサイトカイン類と、ストローマ細胞との存在下において造血幹細胞を培養する工程を含んでなるもの、である。
本発明による造血幹細胞の培養に用いられる培地は、gp130刺激因子と、一種以上のサイトカイン類と、ストローマ細胞とを含んでなるもの、である。
末梢血幹細胞移植や臍帯血幹細胞移植などの造血幹細胞移植療法では、移植する造血幹細胞数が十分量取得できず移植が実施できないことがある。本発明によれば、造血幹細胞を試験管内で効率的に増幅し、また安定に維持することが可能である。従って、十分な量の造血幹細胞が患者から取得できない場合でも、必要量の造血幹細胞を培養し、患者に移植することができる。すなわち本発明は、血液細胞の移植療法および移植療法を必要とする治療の実用化に途を開くものである。
本発明の培養系により増幅した造血幹細胞はまた、血液以外の組織に分化する細胞として利用することも可能である。従って本発明により得られた造血幹細胞は、肝不全、筋ジストロフィー、心筋梗塞などによる心筋の壊死、糖尿病による血管壊死、あるいは腸管膜細胞の壊死から正常な細胞を再生させる治療や、神経細胞を再生させる治療に用いることができる。
発明の具体的説明
造血幹細胞
本発明において「造血幹細胞」とは、血球のすべての分化系列に分化し得る能力(多分化能)を有し、かつその多分化能を維持したまま自己複製することが可能な細胞をいう。
造血幹細胞は、ヒトおよびマウス等の哺乳動物の胎児肝臓、骨髄、胎児骨髄、末梢血、サイトカインおよび/または抗癌剤の投与によって幹細胞を動員した末梢血、および臍帯血等から採取することができる。
マウスでは、移植実験により造血幹細胞と造血前駆細胞とを区別することができる。すなわち、試験細胞を放射線照射マウスに移植し移植後3ヶ月以上にわたりドナー由来の骨髄球、リンパ球の双方の分化系列の造血細胞が移植先個体(レシピエント)に見いだされれば多分化能を有しレシピエント個体で自己複製可能な造血幹細胞が移植細胞集団に存在していたことを示す。
赤血球前駆細胞は、試験管内の培養環境で維持増幅させることは困難であり急速に消失してしまう。赤血球前駆細胞の維持、増殖が確認される場合は、より未分化な造血幹細胞あるいは造血前駆細胞が維持、増殖されることで、赤血球前駆細胞が継続的に産生されていることと考えられる。従って、ヒト造血幹細胞の評価系では、赤血球前駆細胞(BFU−E)あるいは顆粒球、マクロファージの二つの細胞系列に分化可能な前駆細胞(CFU−GM)が維持、増殖されているかを指標とすることで造血幹細胞あるいは未分化な造血前駆細胞が増殖していることを確認することができる。また、免疫不全マウスであるNOD/SCIDマウスへヒト造血細胞を移植し、移植後のヒト造血細胞の存在頻度から造血幹細胞あるいは造血前駆細胞が移植細胞集団に存在していたか確認することができる。
gp130刺激因子
本発明において「gp130刺激因子」とは、ヒトgp130を介してシグナルを伝達する分子を意味し、IL−6およびIL−6受容体のα鎖(以下「IL−6R」と言うことがある)の複合体のように、gp130と会合することによりgp130を活性化し、次いでJAKキナーゼの活性化、STAT3のリン酸化、STAT3によるJunB、JAB、SAA3、C−reactive proteinなどの遺伝子の転写促進を引き起こし、結果として、細胞増殖、細胞分化調節等を生じさせる分子をいう。ヒトgp130を本来発現しないマウスIL−3依存性細胞株であるBa/F3細胞にヒトgp130をコードする遺伝子を発現させた形質転換細胞はgp130シグナルにより増殖するので、この形質転換細胞の増殖を検出することにより、gp130刺激因子か否かを評価できる。形質転換細胞の増殖はアイソトープ標識した核酸を細胞に取り込ませること、ミトコンドリアの活性を評価すること、細胞数を直接計測すること等により確認でき、例えば、特開2001−8690号公報の実施例5の記載に従って実施できる。また、上述のようにgp130刺激は細胞内シグナル伝達分子であるSTAT3の活性化も行うことから、gp130刺激因子かどうかは上記Ba/F3細胞のSTAT3の活性化を検出することにより評価することも可能である。STAT3の活性化は、細胞内のSTAT3がリン酸化されることを検出することにより、また、STAT3により転写が促進される遺伝子群についてはその転写促進をノーザン解析、定量的RT−PCR法により検出することでも可能である。
gp130刺激因子としては、IL−6またはその変異体とIL−6Rまたはその変異体との融合タンパク質、IL−6R(好ましくは、可溶性IL−6R(sIL−6R))またはその変異体とIL−6またはその変異体との組み合わせ(特表平10−509040号)、gp130に対してアゴニストとして作用するgp130に対する抗体(Gu ZJ,Vos JD,Rebouissou C,Jourdan M,Zhang XG,Rossi JF,Wijdenes J,Klein B.,Agonist anti−gp130 transducer monoclonal antibodies are human myeloma cell survival and growth factors.Leukemia.2000 Jan;14(1):188−97)、インターロイキン−11(IL−11)、白血球遊走阻止因子(LIF)、オンコスタチンM、およびカルジオトロピンが挙げられる。
本発明において「IL−6」とは、4つのヘリックスから構成される全長212アミノ酸残基のタンパク質(Hirano et al.,Nature,324,731(1986))を意味する。また本発明において「IL−6の変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される1以上の改変を有し、かつgp130刺激活性を有するIL−6の変異体を意味する。IL−6については、シグナルペプチドであるN末端から28番目のアラニン残基までが欠失してもgp130刺激活性を維持することが知られている(WO00/01731)。またIL−6の37番目のリジン残基のC末端側がプロテアーゼの消化作用を受けること、および28番目のアラニン残基から37番目のリジン残基までの10アミノ酸残基が欠失してもIL−6活性に支障はないことが知られている(WO00/01731)。従って、本発明においてはN末端が欠失し、かつgp130刺激活性を有する改変IL−6をIL−6変異体として用いてもよい。このようなIL−6変異体としては、28番目までのN末端配列が欠失したIL−6、37番までのN末端配列が欠失したIL−6が挙げられる。
本発明において「IL−6R」とは、シグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域から構成される全長468アミノ酸残基のタンパク質(Yamasaki et al,Science,241,p825(1988))を意味する。また本発明において「IL−6Rの変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される1以上の改変を有し、かつgp130刺激活性を有するIL−6Rの変異体を意味する。IL−6Rについては、細胞外領域中に存在するサイトカインレセプター領域(112番目のバリン残基付近から323番目のアラニン残基付近までの領域)がIL−6との結合に必要十分であることが知られている(Yawata et al.,EMBO J.12,p1705(1993))。従って、本発明においてはIL−6Rの112番目のバリン残基付近から333番目のアラニン残基付近までの領域を含んでなる改変IL−6RをIL−6R変異体として用いてもよい。
融合タンパク質はIL−6またはその変異体とIL−6Rまたはその変異体とを直接あるいはリンカーを介して連結してなるタンパク質である。融合タンパク質は、例えば、WO00/01731、WO99/02552、特表2000−506014号、またはFisher et al.,Nature,Biotech.,15,p142(1997)に記載の方法に従って製造できる。
融合タンパク質は、IL−6Rの112番のバリン残基から333番目のアラニン残基までの断片のC末端と、IL−6の38番のアスパラギン酸残基から212番のメチオニン残基までの断片のN末端とを直接連結してなるタンパク質(FP6)であることができる。この場合、融合タンパク質をコードするDNA配列を宿主において発現可能なように連結したベクターを適当な宿主に導入し、形質転換された宿主を培養し、培養物からFP6を採取することにより融合タンパク質FP6を製造できる(WO00/01731参照)。
サイトカイン類
本発明において使用される「サイトカイン類」は、造血幹細胞を増殖させ、造血幹細胞を維持することができる。
このようなサイトカイン類としては、トロンボポエチン(TPO)およびその変異体およびそれらの誘導体、c−mplリガンド(TPOを除く)およびその誘導体、幹細胞因子(SCF)、Flt−3リガンド(FL)、IL−3(インターロイキン−3)、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子(GM−CSF)、インターロイキン−6(IL−6)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)、およびMIP−1α(Davatelis,G.,J.Exp.Med.167:1939,1988)のような増殖因子;エリスロポエチン(EPO)のような造血ホルモン;ケモカイン、Wnt遺伝子産物、およびノッチリガンドのような分化増殖調節因子;発生調節因子;およびこれらの組み合わせが挙げられる。
本発明において「トロンボポエチン(TPO)」とは全長332アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる、血小板産生を特異的に刺激または増大させる活性を有するタンパク質である(WO95/21919)。また本発明において「TPOの変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される1以上の改変を有し、かつ血小板産生を特異的に刺激または増大させるTPOの変異体を意味する。TPOの変異体としては、例えば、WO95/18858、特許第2991640号、特許第2991630号、および特許第2996729号等に記載されているものが挙げられ、好ましくは、アミノ酸残基1番から163番までのアミノ酸配列からなるTPOの変異体が挙げられる。
本発明において「TPOおよびその変異体の誘導体」とは、水溶性ポリマーを連結してなるTPOおよびその変異体を意味する。水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、好ましくは平均分子量が約5kDa〜約50kDaであるポリエチレングリコール、が挙げられる。TPOおよびその変異体のポリエチレングリコール化(PEG化)は周知の方法に従って実施できる(例えば、Focus on Growth Factors 3(2):4−10(1992)参照)。水溶性ポリマー対c−mplリガンドタンパク質のモル比は1:1〜100:1であることができ、ポリPEG化の場合には1:1〜20:1、モノPEG化の場合には1:1〜5:1であることができる。
本発明において「c−mplリガンド」とは、mplレセプターに結合可能なペプチド性リガンド、タンパク質性リガンド、および非ペプチド性リガンドを意味する。タンパク質性c−mplリガンド(TPOを除く)としては、巨核球の刺激剤としてのアゴニスト抗体(WO99/03495、WO99/10494)や造血レセプターアゴニストなどの他のタンパク質(WO96/23888、WO97/12978、WO97/12985、WO98/17810、WO96/34016、WO00/24770)が挙げられる。ペプチド性c−mplリガンドとしては、WO96/40189、WO96/40750、WO98/25965、特開平10−72492号、WO99/42127、WO00/24770に記載されているものが挙げられる。非ペプチド性c−mplリガンドとしては、ベンゾジアゼピン誘導体(特開平11−1477号、特開平11−152276号)や他の低分子リガンド(WO99/11262、WO99/22733、WO99/22734、WO00/35446、WO00/28987)が挙げられる。
本発明において、好ましいサイトカイン類としては、幹細胞因子(SCF);トロンボポエチン(TPO)およびその変異体およびそれらの誘導体;Flt−3リガンド(FL);またはこれらの組み合わせが挙げられる。
本発明において、好ましいサイトカイン類としては、トロンボポエチン(TPO)もしくはその変異体またはそれらの誘導体を少なくとも含むものが挙げられる。
ストローマ細胞
本発明において「ストローマ細胞」とは、生体内の造血環境と同等の、あるいは類似した造血環境をインビトロにて提供できる細胞をいい、試験管内で造血細胞と共培養できる細胞であればその由来は問わない。
ストローマ細胞の例としては、AGM(Aorta−Gonad−Mesonephros)領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell)、線維芽細胞、血管内皮細胞、胎児肝臓由来細胞、および前脂肪細胞が挙げられ、好ましくはAGM領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、および間葉系幹細胞であり、特に好ましくはAGM領域由来の細胞および間葉系幹細胞である。
人為的に発現を調節できるプロモーターの下流に自殺遺伝子などが挿入された組換えベクターをストローマ細胞に導入し、造血幹細胞と培養後にストローマ細胞だけを死滅させ、移植時にストローマ細胞を除去することも可能である。自殺遺伝子の導入および発現は下記のようにして実施できる。すなわち、自殺遺伝子の発現による手法、より具体的には、ジフテリア毒素の利用(Lidor YJ,Lee WE,Nilson JH,Maxwell IH,Su LJ,Brand E,Glode LM.,In vitro expression of the diphtheria toxin A−chain gene under the control of humanchorionic gonadotropin gene promoters as a means of directing toxicity to ovarian cancer cell lines.Am J Obstet Gynecol.1997 Sep;177(3):579−85.)、ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HStk)の利用(Link CJ,Seregina T,Traynor A,Burt RK.,Cellular suicide therapy of malignant disease.,Oncologist.2000;5(1):68−74.)、アポプトーシス関連の遺伝子の発現により、自殺遺伝子を発現させることができる。アポプトーシス関連遺伝子としては、デス領域を持つ受容体遺伝子、例えば、Fas(Ioth N,Cell,66:233−243,1991),TNFreceptor type II(Loetscher H.,Cell 61(2):351−359,1990),Death receptor 3(Kitoson J.,Nature,384:372−375,1996),Death receptor 4(Pan G.,Science,276:111−113,1997)や、上記受容体の信号伝達分子であるFliceや、信号伝達系に属する蛋白質分解酵素であるICE(IL−1 b converting enzyme)(Cerretti D.P.,Science 256:97−100,1992)、さらには、Caspase Family(Patel T,FASEB.J.,10:587−597,1996)、例えばCPP32(Fernandes−Alnemri T,J.Biol.Chem.,269:30761−30764,1994)などが利用できる。また、これらの遺伝子の発現を人為的に制御するには、テトラサイクリンを用いた発現誘導系(Manfred G.,Proc.Natl.Acad.,Sci.USA,89:5547−5551,1992)が利用できる。これらの遺伝子をストローマ細胞株に導入するには、宿主にストローマ細胞株を用いる以外は、通常動物細胞への遺伝子導入に用いられる方法、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター(Kotin,R.M.Hum Gene Ther 5,793(1994))、単純ヘルペスウイルスベクター等のウイルス由来の動物細胞用ベクターを用いる方法、リン酸カルシウム共沈法、DEAE−デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等を用いることができる。ストローマ細胞の自殺関連遺伝子を導入する際に、該遺伝子に加えて薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を用いると、目的遺伝子が導入されたストローマ細胞株の選択が容易となる。
培養
本発明によれば、造血幹細胞を増幅する培養系が提供される。培養系の利用により、造血幹細胞の増殖、生存を効率的に維持することが可能となる。
本発明による培養系は、造血幹細胞を含み、さらに他の造血細胞を含むものであってもよい。さらには、造血幹細胞を含む分画であってもよい。すなわち、造血幹細胞を特異的に認識する抗体で臍帯血、末梢血、骨髄などの造血幹細胞を含む組織から造血幹細胞を分離したものを培養することが可能である。赤血球などの各種細胞を特異的に除去する方法はこれまでの血液細胞分画法により実施することが可能である。また、分画せずに培養を行ってもよい。
造血幹細胞を培養するにあたっては、いわゆる培養用のシャーレ、フラスコ、培養バッグを用いた培養が可能であるが、培地組成、pHなどを機械的に制御し、高密度での培養が可能なバイオリアクターによって、その培養系を改善することもできる(Schwartz,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:6760,1991;Koller,M.R.,Bio/Technology,11:358,1993;Koller,M.R.,Blood,82:378,1993;Palsson,B.O.,Bio/Technology,11:368,1993)。
ストローマ細胞と造血細胞の共培養は、骨髄を採取したのち、そのまま培養を行うことで可能である。また、骨髄を採取した上でストローマ細胞、造血細胞、その他の細胞群などを分離し、骨髄を採取した個人以外のストローマ細胞、造血細胞の組み合わせで共培養を実施することも可能である。また、ストローマ細胞のみを培養し増殖させた後にサイトカインカクテルと造血細胞を添加し共培養を実施することも可能である。ストローマ細胞を培養する際に、より有効に増殖、生存を支持するために、細胞刺激因子を培養系に添加することができる。このような細胞刺激因子としては、トロンボポエチン(TPO)およびその変異体およびそれらの誘導体、c−mplリガンド(TPOを除く)およびその誘導体、幹細胞因子(SCF)、Flt−3リガンド(FL)、インターロイキン−3(IL−3)、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子(GM−CSF)、インターロイキン−6(IL−6)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)、MIP−1α(Davatelis,G.,J.Exp.Med.167:1939,1988)、などのサイトカインに代表される増殖因子、エリスロポエチン(EPO)のような造血ホルモン、ケモカイン、Wnt遺伝子産物、ノッチリガンドのような分化増殖調節因子、発生調節因子などが挙げられる。これらサイトカインはストローマ細胞に産生させてもよい。またサイトカインと同様なシグナルをサイトカイン受容体を介して伝達する物質であれば、これらサイトカインと同様に使用することもできる。
培養に用いる培地としては、造血幹細胞の増殖および生存が害されない限り特に制限されないが、例えばMEM−α培地(GIBCO BRL)、SF−02培地(三光純薬)、Opti−MEM培地(GIBCO BRL)、IMDM培地(GIBCO BRL)、PRMI1640培地(GIBCO BRL)、が好ましいものとして挙げられる。培養温度は、通常25〜39℃、好ましくは33〜39℃である。また、培地に添加する物質としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、2−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸が挙げられる。CO2は、通常4〜6%であり、5%が好ましい。
造血幹細胞は、すべての造血系の分化系列へ分化が可能なので、試験管内で造血幹細胞を増幅後種々の細胞種に分化させ移植することが可能である。例えば、赤血球が必要であれば、患者の幹細胞を培養し増幅した後、EPOなどの赤血球分化誘導を促進する因子を利用して赤血球を主成分とする造血細胞を人為的に産生することが可能である。
本発明による方法においては造血幹細胞を培養した後、培養物から造血幹細胞を採取する工程を含んでいてもよい。
本発明による方法によって培養した造血幹細胞は、EDTA単独、EDTAを含むトリプシン液など細胞分散溶液として使われる物質を利用して培養器から剥離し、人体に投与できる細胞懸濁液とすることができる。
本発明による方法によって培養した造血幹細胞は、造血幹細胞とストローマ細胞を分離して患者に移入することも可能である。更にストローマ細胞と造血幹細胞を同時に移植することも可能である。
本発明による製造法のうち好ましいものとしては、インターロイキン−6(IL−6)とIL−6受容体のα鎖(IL−6R)との融合タンパク質と、トロンボポエチン(TPO)と、AGM領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、および間葉系幹細胞から選択されるストローマ細胞と、場合によっては幹細胞因子(SCF)およびFlt−3リガンド(FL)との存在下において造血幹細胞を培養する工程を含んでなる製造法が挙げられる。
本発明による培地のうち好ましいものとしては、インターロイキン−6(IL−6)とIL−6受容体のα鎖(IL−6R)との融合タンパク質と、トロンボポエチン(TPO)と、AGM領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、および間葉系幹細胞から選択されるストローマ細胞と、場合によっては幹細胞因子(SCF)およびFlt−3リガンド(FL)とを含んでなる培地が挙げられる。
造血幹細胞の用途
本発明による培養系を用いて培養された造血幹細胞は、従来の骨髄移植や臍帯血移植に代わる血液細胞移植用の移植片として用いることができる。造血幹細胞の移植は、移植片を半永久的に生着させられることから、従来の血液細胞移植治療を改善することができる。
造血幹細胞の移植は、白血病に対する全身X線放射療法や高度化学療法を行う際に実施できる。例えば、固形癌患者の化学療法、放射線療法等の骨髄抑制が副作用として生じる治療を実施する際に、施術前に骨髄を採取しておき、造血幹細胞を試験管内で増幅し、施術後に患者に戻すことで、副作用による造血系の障害から早期に回復させることができ、より強力な化学療法を行えるようになり、化学療法の治療効果を改善する事ができる。また、本発明により得られる造血幹細胞を各種血液細胞に分化させ、それらを患者の体内に移入することにより、各種血液細胞の低形成により不全な状況を呈している患者の改善を図ることができる。また、再生不良性貧血などの貧血を呈する骨髄低形成に起因する造血不全症を改善することができる。その他、本発明の方法による造血幹細胞の移植が有効な疾患としては、慢性肉芽腫症、重複免疫不全症候群、無ガンマグロブリン血症、Wiskott−Aldrich症候群、後天性免疫不全症候群(AIDS)等の免疫不全症候群、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、鎌状赤血球症等の先天性貧血、Gaucher病、ムコ多糖症等のリソゾーム蓄積症、副腎白質変性症、各種の癌または腫瘍等が挙げられる。
造血幹細胞の移植は、用いる細胞以外は、従来行われている骨髄移植や臍帯血移植と同様に行えばよい。
上記のような造血幹細胞移植に用いられる可能性のある造血幹細胞の由来は、骨髄に限られず、前述したような胎児肝臓、胎児骨髄、末梢血、サイトカインおよび/または抗癌剤の投与によって幹細胞を動員した末梢血、および臍帯血等を用いることができる。
移植片は、本発明の方法によって産生した造血幹細胞の他に、緩衝液等を含む組成物としてもよい。
また、本発明により産生される造血幹細胞は、ex vivoの遺伝子治療に用いることができる。造血幹細胞に対する遺伝子治療は、幹細胞が静止期にあり染色体との組換え率が低いこと、また培養中に幹細胞が分化してしまうこと等から困難であった。本発明を利用することによって、幹細胞を分化させずに増幅でき、遺伝子導入効率を大幅に改善できる。この遺伝子治療は、造血幹細胞に外来遺伝子(治療用遺伝子)を導入し、得られる遺伝子導入細胞を用いて行われる。導入される外来遺伝子は、疾患によって適宜選択される。血液細胞を標的細胞とする遺伝子治療の対象となる疾患としては、慢性肉芽腫症、重複免疫不全症候群、無ガンマグロブリン血症、Wiskott−Aldrich症候群、後天性免疫不全症候群(AIDS)等の免疫不全症候群、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、鎌状赤血球症等の先天性貧血、Gaucher病、ムコ多糖症等のリソゾーム蓄積症、副腎白質変性症、各種の癌または腫瘍等が挙げられる。
造血幹細胞に治療用遺伝子を導入するには、通常動物細胞の遺伝子導入に用いられる方法、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、HIVベクターやネコ内在性ウィルスベクターRD114(Kelly PF,Vandergriff J,Nathwani A,Nienhuis AW,Vanin EF.,Highly efficient gene transfer into cord blood nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency repopulating cells by oncoretroviral vector particles pseudotyped with the feline endogenous retrovirus(RD114)envelope protein.Blood.2000 Aug 15;96(4):1206−14)等のウイルス由来の遺伝子治療に用いられる動物細胞用ベクター(遺伝子治療用ベクターについては、Verma,I.M.,Nature,389:239,1997参照)を用いる方法、リン酸カルシウム共沈法、DEAE−デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等を用いることができる。これらの中では、標的細胞の染色体DNAに組み込まれて恒久的に遺伝子の発現が期待できるという点から、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはHIVベクターが好ましい。
例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、次のようにして作製することができる。まず、野生型アデノ随伴ウイルスDNAの両端のITR(inverted terminal repeat)の間に治療用遺伝子を挿入したベクタープラスミドと、ウイルスタンパク質を補うためのヘルパープラスミドを293細胞にトランスフェクションする。続いてヘルパーウイルスのアデノウイルスを感染させると、AAVベクターを含むウイルス粒子が産生される。あるいは、アデノウイルスの代わりに、ヘルパー機能を担うアデノウイルス遺伝子を発現するプラスミドをトランスフェクションしてもよい。次に、得られるウイルス粒子を造血幹細胞に感染させる。ベクターDNA中において、目的遺伝子の上流には、適当なプロモーターを挿入し、下流に適当なターミネーターを挿入し、また、エンハンサーを適宜上流あるいは下流に挿入し、これらによって遺伝子の発現を調節することが好ましい。また、サイレンシングを防止するために、インシュレーターを目的遺伝子の上流および下流に連結してもよい。更に、治療用遺伝子が導入された細胞の選択が容易になるように、治療用遺伝子に加えて薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を連結してもよい。治療用遺伝子は、センス遺伝子であってもアンチセンス遺伝子であってもよい。
遺伝子治療用組成物は、本発明による方法によって産生された造血幹細胞の他に、緩衝液や新規の活性物質等を更に含む組成物としてもよい。
更に、本発明による培養系により増幅した造血幹細胞を血液以外の組織に分化する細胞として利用することも可能である。従来、生体に存在する各種組織の幹細胞はその組織の幹細胞としか機能し得ないと考えられてきたが、近年になり、他臓器の幹細胞として機能することが示されてきた。造血幹細胞あるいは造血幹細胞を含む細胞集団が肝臓細胞(Lagasse E,Connors H,Al−Dhalimy M,Reitsma M,Dohse M,Osborne L,Wang X,Finegold M,Weissman IL,Grompe M.,Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo.,Nat Med.2000 Nov;6(11):1229−34.、[2127]PRODUCTION OF HUMAN HEPATOCYTES BY HUMAN LIN−,CD34+/−CELLS IN VIVO.,Esmail D.Zanjani,Christopher D.Porada,Kirsten B.Crapnell,Neil D.Theise,Dianne S.Krause,F.R.MacKintosh,Joao L.Ascensao,Graca Almeida−Porada.Department of Veterans Affairs Medical Center,Reno,NV,USA;University of Nevada School of Medicine,Reno,NV,USA;New York University School of Medicine,New York,NY,USA;Yale University,New Haven,CT,USA.Blood 2000 96(11);494a)、骨格筋細胞(Gussoni E,Soneoka Y,Strickland CD,Buzney EA,Khan MK,Flint AF,Kunkel LM,Mulligan RC.,Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation.Nature.1999 Sep 23;401(6751):390−4)、心筋細胞(Orlic D,Kajstura J,Chimenti S,Jakoniuk I,Anderson SM,Li B,Pickel J,McKay R,Nadal−Ginard B,Bodine DM,Leri A,Anversa P.,Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium.Nature.2001 Apr 5;410:701−5)、血管内皮細胞、腸管粘膜細胞(Krause DS,Theise ND,Collector MI,Henegariu O,Hwang S,Gardner R,Neutzel S,Sharkis SJ.,Multi−organ,multi−lineage engraftment by a single bone marrow−derived stem cell.Cell.2001 May 4;105(3):369−77)などに分化する能力を有することが示されている。従って本発明による培養法により製造された造血幹細胞を、肝不全、筋ジストロフィー、心筋梗塞などによる心筋の壊死、糖尿病による血管壊死、あるいは腸管膜細胞の壊死から正常な細胞を再生する治療に用いることができる。本発明による培養法により製造された造血幹細胞はまた、神経細胞の再生治療に用いることができる。
実 施 例
実施例1:マウス骨髄からの造血幹細胞の調製
C57BL/6−Ly5.1 pep(8〜10週齢、雄)(筑波大学 中内啓光教授より供与)の大腿骨内の骨髄を採取し、PBSに懸濁した。定法に従い(高津聖志、免疫研究の基礎技術、羊土社、1995年)、マウス骨髄単核球細胞画分を比重遠心法により濃縮した後、染色バッファー(5% FCS,0.05% NaN3を含むPBS)に懸濁し、Osawa,M.et al.,Science 273:242−245,1996に従って以下の方法で造血幹細胞分画を取得した。
FITC結合CD34抗体、フィコエリスリン結合Sca−1抗体、アロフィコシアニンc−Kit(すべてPharmingen社製)、および分化マーカー(Lin)として以下の6種類のビオチン化した分化抗原特異的な抗体、CD45R,CD4,CD8,Gr−1,Ter119,CD11c(すべてPharmingen社製)を、骨髄単核球細胞懸濁液に添加し、氷中で20分間放置し反応させた。染色バッファーで2回洗浄した後に、セルソーター(FACS Vantage,Becton Dickinson社)により、CD34陰性、かつSca−1陽性、かつc−Kit陽性、かつLin陰性の細胞を分取した。
実施例2:サイトカインカクテルとマウス造血幹細胞の液体培養
実施例1に従って調製したマウス造血幹細胞をU底96穴プレートに50個/wellで蒔き、培養を行った。培養に用いた培地はエスクロンSF03(三光純薬社)に0.1%BSAを添加したものを用いた。サイトカインカクテルとして、マウスSCF(キリンビール社)、ヒトIL−6(キリンビール社)、マウスIL−11(R&D Systems),Flt−3リガンド(R&D Systems)それぞれ50ng/ml、あるいは、マウスSCF(キリンビール社)、FP6(東ソー社)、Flt−3リガンド(R&D Systems)それぞれ50ng/mlを添加し、37℃、5%CO2で7日間培養を行った。7日間の培養後、造血幹細胞/前駆細胞増幅の割合を調べるために、実施例3に示す競合的長期造血再構築アッセイを行った。
実施例3:放射線照射したマウスへの造血細胞移植
実施例2および実施例3にて培養を行った細胞を、20万個の全骨髄細胞(C57BL/6−Ly5.2マウス由来、チャールスリバー社)と共に、8.5GyのX線を照射したC57BL/6−Ly5.2マウス(チャールスリバー社、8週齢、雄)各5匹ずつに尾静脈注より移植した。移植後、経時的に眼窩より末梢血を回収し、FACSによりC57BL/6−Ly5.1 pepマウス由来の細胞数の割合を算定した。定法に従い(高津聖志、免疫研究の基礎技術、羊土社、1995年)、末梢血の解析を行った。末梢血50μlに蒸留水を350μl加え、30秒間放置し、赤血球を溶血させた後に、2倍濃度のPBSを加えて遠心し、白血球を回収した。細胞を染色バッファー(5% FCS、0.05% NaN3を含むPBS)で1回洗浄した後に、抗CD16抗体、FITC結合抗Ly5.1(CD45.1)抗体、フィコエリスリン結合抗Gr−1およびCD11c抗体、およびアロフィコシアニン結合CD90(Thy1)およびCD45R(B220)抗体(すべて、Pharmingen社より購入)を添加し、氷中で30分放置して反応させた。次いで、染色バッファーで洗浄後、FACS解析を行った。移植後経時的に、末梢血中の、Gr−1またはCD11c陽性細胞中(骨髄球系)のLy5.1陽性の割合と、CD90またはCD45R陽性細胞中(リンパ球系)のLy5.1陽性の割合を、それぞれ算定することにより、造血幹細胞培養期間中の再構築を行うことが可能な細胞数の増減を推定した。
図1に示した通り、サイトカインを添加し培養を行うことで移植後2週間に高いキメリズムを示す短期骨髄再構築能を有する造血前駆細胞を有意に増加させることが可能である。しかし、サイトカイン存在下に培養した細胞のキメリズムは1ヶ月以降急速に低下し、培養をせずに移植した幹細胞のキメリズムよりも低下して来ており、培養期間に造血幹細胞が分化し造血幹細胞の性質である長期再構築能を消失したことがわかる。一方、SCF+FP6+FLのサイトカインコンビネーションとSCF+IL−6+IL−11+FLのサイトカインコンビネーションを比較すると、前者の方が長期に亘りキメリズムを高値に保っている。この結果は、FP6を用いた培養系では、同様にgp130受容体シグナルを伝達するIL−6、IL−11を添加した場合と異なる造血細胞の増幅が行われていることがわかる。前者においては移植後3ヶ月においても後者より高いキメリズムが観察され、FP6を入れたサイトカインコンビネーションはより未分化な造血細胞を増幅することが可能であることを示す。
実施例4:マウスストローマ細胞AGM−S3−A9と造血幹細胞の共培養
WO99/03980または特開2001−37471に従ってストローマ細胞AGM−S3を調製し、得られたAGM−S3をサブクローニングすることにより、ヒト臍帯血由来造血幹細胞に対する支持活性が高いサブクローン、すなわちBFU−Eを増幅あるいは維持する活性が高いサブクローンとしてAGM−S3−A9細胞を得た。AGM−S3−A9細胞(10%FCSを含むMEMα培地にて培養)を、1×105個ずつ24ウエルの培養皿に蒔き、1日培養し、細胞が培養皿の底一面を覆うまで増殖させた。その後、SCF(キリンビール社)、TPO(キリンビール社)(各20ng/ml)、FP6(東ソー社)(各20ng/mlあるいは50ng/ml)を含む1mlの新鮮な培地(10% FCSを含むMEMα培地)に交換し、実施例1で得たマウス造血幹細胞(C57BL/6−Ly5.1由来)100個をこれらの細胞上に重層し、培養を開始した。培養7日目に、細胞をトリプシン処理(0.05% トリプシン、0.5mM EDTAを含むPBSで37℃、2〜5分間放置)し、培養皿のストローマ細胞を含むすべての細胞を回収し、培養系の2分の1相当を1匹のマウスに移植した。対照としてサイトカインカクテルのみ(各サイトカイン濃度は20ng/ml)の培養系(10% FCSを含むMEMα培地)を実施例2にしたがい同時に準備し回収した。回収した細胞を用いて、実施例3に示す方法により造血幹細胞あるいは造血前駆細胞の増殖の状況を解析した(図2)。
SCF+TPO+FP6のみの液体培養では、実施例3と同様に移植後2週で高いキメリズムは認められるが、移植後2ヶ月にかけてキメリズムは減少する。一方、ストローマ細胞AGM−S3−A9とSCF+TPO+FP6の共培養では、移植後2週においてサイトカインのみの培養条件と同様に高いキメリズムが認められるとともに、移植後2ヶ月を経過してもinputを越える高いキメリズムが維持されている。inputのキメリズムを遙かに越えるこのキメリズムの上昇は、ストローマ細胞AGM−S3−A9とSCF+TPO+FP6の共培養終了時に培養開始時の造血幹細胞よりも多くの造血幹細胞が存在していることを示し、造血幹細胞がこの培養系で自己複製し増殖していたことを示す。この結果はAGM−S3−A9ストローマ細胞とSCF+TPO+FP6の存在下造血幹細胞を培養すると造血前駆細胞だけでなく、造血幹細胞も増幅できることを示す。
実施例5:ヒト間葉系幹細胞(hMSC)と造血幹細胞との共培養
ヒト間葉系幹細胞(hMSC)(CAMBREX社、cat.#PT−2501:Lot#:0F0558、専用培地;hMSC BulletKitにて培養)を、1×105個ずつ24ウエルの培養皿に蒔き、1日培養し、細胞が培養皿の底一面を覆うまで増殖させた。その後、SCF(キリンビール社)、TPO(キリンビール社)、FP6(東ソー社)(各20ng/ml)を含む1mlの新鮮な培地(10% FCSを含むMEMα培地)に交換し、実施例1で得たマウス造血幹細胞(C57BL/6−Ly5.1由来)50個をこれらの細胞上に重層し、培養を開始した。培養7日目に、細胞をトリプシン処理(0.05% トリプシン、0.5mM EDTAを含むPBSで37℃、2〜5分間放置)し、培養皿のストローマ細胞を含むすべての細胞を回収した。対照としてサイトカインカクテルを添加しないhMSCとの共培養系を準備し、同時に回収した。回収した細胞を用いて、実施例3に示す方法により造血幹細胞の増殖の状況を解析した(図3)。
hMSCのみとの共培養を行った場合キメリズムの上昇は観察されず、造血前駆細胞、造血幹細胞ともに培養期間中に失われていった。一方、SCF+TPO+FP6のサイトカインカクテル存在下にhMSC細胞と造血幹細胞を共培養すると、移植後2週において高いキメリズムが認められると同時に移植後2ヶ月を経過してもinputを越える高いキメリズムが維持されている。inputのキメリズムを遙かに越えるこのキメリズムの上昇は、hMSC細胞とSCF+TPO+FP6の共培養終了時に培養開始時の造血幹細胞よりも多くの造血幹細胞が存在していることを示し、造血幹細胞がこの培養系で自己複製し増殖していたことを示す。この結果はhMSC細胞とSCF+TPO+FP6の存在下造血幹細胞を培養すると造血前駆細胞だけでなく、造血幹細胞も増幅できることを示す。
実施例6:ヒト造血幹細胞および造血前駆細胞の支持活性の評価
(1)ヒト臍帯血CD34陽性幹細胞の分離
ヒト臍帯血は、キリンビール医薬探索研究所研究倫理委員会の基準に準拠し、正常分娩時に採取した。臍帯血は凝固しないようにヘパリン(ノボノルディスク社)を添加したシリンジを用いて採取した。ヘパリン処理臍帯血をFicoll−paque(Phramacia社)に重層し、比重遠心(400×G、室温、30分間)により単核細胞を分離した。単核細胞に混入した赤血球は、赤血球溶血剤(PharmLyseTM、Pharmingen社)で室温5分間処理して溶血させた。1mM EDTAを含むPBSで単核細胞を洗浄後、CD34抗体結合磁性体ビーズ(Direct CD34 isolation kit、Miltenyi Biotec社)を添加し氷冷下、30分間放置した。細胞を洗浄後、CD34を発現する細胞を磁気カラム(MidiMACS,Hiltenyi Biotec社)を用いて分離した。この細胞集団をヒト臍帯血由来造血幹細胞集団とした。
(2)ヒト造血幹細胞とAGM−S3サブクローン(AGM−S3−A9)との共培養
前日にA9を2×105個/well(6ウェル培養皿)(Falcon社)に播種し、10% FCSを含むMEMα培地1mlで培養し、細胞がウェルの底一面を覆うまで増殖させた。上記ストローマ細胞上にCD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞を10,000個/ウェルで重層し、4mlの10% FCSを含むMEMα培地にFP6 20ng/ml、ヒトSCF 20ng/ml、ヒトTPO(キリンビール社)20ng/ml、およびヒトFL 100ng/ml(R&D systems社、カタログ番号308−FK)を含むサイトカインカクテル(STF+FP6)を添加し共培養した。増殖活性比較のために、対照群はサイトカインを添加せずA9のみの共培養、あるいはA9非存在下、12穴プレートにて2mlの上述のサイトカインカクテルを含む培地にて培養した。共培養開始1週間後に半分の培地を除去し、新たに培地1mlを添加した。共培養開始2週間目にトリプシン処理(0.05% トリプシン、0.5mM EDTAを含むPBS(GIBCO BRL社)で37℃、5〜10分間放置)によりストローマ細胞とヒト血液細胞を同時に培養皿より剥がし、コロニーアッセイに付し造血幹細胞あるいは造血前駆細胞の増殖を解析した。
(3)コロニーアッセイによる造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状況の評価
上記共培養系にて増殖した細胞は、適宜稀釈して1mlメチルセルロース培養系に付し、4連で解析を行なった。また増幅効果を比較するために対照として共培養前のCD34陽性細胞についても同様のコロニーアッセイを実施した。メチルセルロース培養系は、0.89%メチルセルロース(信越化学)を含むIMDM培地(GIBCO BRL社)に10%ウシ胎児血清(Hyclone社)、2mM L−グルタミン(GIBCO BRL社)、1mMピルビン酸ナトリウム(和光化学)、0.5μM 2−メルカプトエタノールおよび抗生物質(最終濃度はペニシリン100U/ml、ストレプトマイシン100μg/ml、アンフォテリシンB 250ng/ml;Antibiotic−Antimycotic(×100),liquid,GIBCO BRL社)を添加したものにサイトカインとして100ng/mlヒトSCF、ヒトIL−6、10ng/mlヒトIL−3、ヒトG−CSF、ヒトTPO、4IU/mlEPO(すべてキリンビール社)を添加し、35mm培養皿(Nunc社)にて実施した。上記で用いた各種造血因子は、いずれもリコンビナント体であり、純粋なものである。2週間の培養の後、出現してきたコロニーを顕微鏡下で観察し、CFU−GM(granulocyte−macrophage colony−forming unit)、BFU−E(erythroid burst forming unit)、CFU−E mix(erythrocyte mixed colony−forming unit)の数を計測した。
図4にCD34陽性造血幹細胞とAGM−S3−A9ストローマ細胞存在下、あるいはストローマ細胞非存在下2週間培養後の造血幹細胞あるいは造血前駆細胞の増幅状況を検討した結果を示す。AGM−S3−A9ストローマ細胞とサイトカインカクテル培地により共培養前に比べCFU−GM、BFU−E、CFU−E mixすべての分化系列細胞の増殖が支持された。また、サイトカイン単独の培養系と比べて、ストローマ細胞が存在することでサイトカインカクテルのみ存在した場合と比較してすべてのコロニーの増幅が確認できた。特に赤血球糸の前駆細胞であるBFU−E、CFU−E mixを維持することは通常困難であるが、サイトカインカクテル存在下でのストローマ細胞との共培養系ではサイトカイン単独よりもその増殖が認められた。従って、ヒト造血細胞に対してもストローマ細胞存在下にsIL−6R−IL−6融合タンパクを含むサイトカインカクテルを添加することで造血幹細胞あるいは造血前駆細胞の増幅を促進することが可能となった。
(4)A9とサイトカインカクテルによる造血幹細胞支持活性におけるFP6の効果
本造血幹細胞増殖培養系におけるFP6の活性について評価した。FP6を含むサイトカインカクテル(SCF+TPO+FL+FP6)あるいはFP6を含まないサイトカインカクテル(SCF+TPO+FL)を添加した場合のAGM−S3−A9共培養系、または非共培養系について、CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞に対する幹細胞支持能の比較をCFU−GM、BFU−E、CFU−E mixを指標に、上記(2)および(3)の評価系を用いて実施した。図5に2週間共培養の結果を示す。何れのサイトカインカクテルを用いた場合でもストローマ細胞の存在により、すべてのコロニー形成細胞を増幅させることができた。SCF+TPO+FL+FP6とSCF+TPO+FLのサイトカインの組み合わせでは、FP6が存在する方がより多くのコロニー形成細胞の増加が確認された。
これまでにストローマ細胞非存在下にSCF+TPO+FLにsIL−6R−IL−6融合タンパク、あるいはSCF+TPO+FLにsIL−6R、IL−6を添加し培養することでSCID再構築細胞を効率的に増幅させることができる報告がなされている(Kollet O,Aviram R,Chebath J,ben−Hur H,Nagler A,Shultz L,Revel M,Lapidot T.,sIL−6R−IL−6:The soluble interleukin−6(IL−6)receptor/IL−6 fusion protein enhances in vitro maintenance and proliferation of human CD34(+)CD38(−/low)cells capable of repopulating severe combined immunodeficiency mice.,Blood 1999 Aug 1 94:3923−31、Ueda T,Tsuji K,Yoshino H,Ebihara Y,Yagasaki H,Hisakawa H,Mitsui T,Manabe A,TAnaka R,Kobayashi K,Ito M,Yasukawa K,Nakahata T.,Expansion of human NOD/SCID−repopulating cells by stem cell facter,Flk2/Flt3 ligand,thrombopoietin,IL−6,and soluble IL−6 receptor.J Clin Invest.2000 Apr;105(7):1013−21.)が、本実施例ではストローマ細胞を上記サイトカインの組み合わせに加えることでサイトカインカクテル単独をしのぐコロニー形成細胞の増幅が確認された。本実施例の結果はサイトカインカクテル単独に比べてストローマ細胞を培養系に存在させることでよりコロニー形成細胞を増加させることが可能であることを示しておりヒト造血幹細胞が増幅していることを示すものである。
本造血幹細胞培養系におけるTPOの活性について検討した。TPOを含むサイトカインカクテル(SCF+TPO+FL+FP6)あるいはTPOを含まないサイトカインカクテル(SCF+FL+FP6)を添加した場合のAGM−S3−A9共培養系について、CD34陽性ヒト臍帯血由来造血幹細胞に対する幹細胞支持能の比較をCFU−GM、BFU−E、CFU−E mixを指標に、上記(2)および(3)の評価系を用いて実施した。図6に結果を示す。TPOが存在する場合(SCF+TPO+FL+FP6)とTPOが存在しない(SCF+FL+FP6)場合とで比較するとBFU−Eで3.8倍、CFU−E mixで33倍の増幅効果の差が認められた。この結果は、本造血幹細胞培養系に添加すべきサイトカインとしてTPOが選択されることを示す。また、このような検討を行うことで、本培養系に適したサイトカインの選択を行えることを示す。
【図面の簡単な説明】
図1は、サイトカインカクテルの造血幹細胞の増殖に与える影響を、マウス造血幹細胞を移植した個体の末梢血におけるドナー由来血球細胞のキメリズムの経時的な変化により示した図である。「input」(□)は、マウス造血幹細胞を採取後直ちに放射線照射マウスに移植した場合を示す。「S+IL6+IL11+FL」(黒四角)は、マウス造血幹細胞を採取後、SCF+IL−6+IL−11+FLのサイトカイン存在下で培養した後に放射線照射マウスに移植した場合を示す。「S+FP6+FL」(○)は、マウス造血幹細胞を採取後、SCF+FP6+FLのサイトカイン存在下で培養した後に放射線照射マウスに移植した場合を示す。
図2は、サイトカインカクテルの造血幹細胞の増殖に与える影響を、マウス造血幹細胞を移植した個体の末梢血におけるドナー由来血球細胞のキメリズムの経時的な変化により示した図である。「input」(×)は、マウス造血幹細胞を採取後直ちに放射線照射マウスに移植した場合を示す。「Liquid STF」(□)は、マウス造血幹細胞を採取後、SCF+FP6+TPOのサイトカインで培養した後に放射線照射マウスに移植した場合を示す。「A9+STF」(黒四角および◆)は、マウス造血幹細胞を採取後、SCF+FP6+TPOのサイトカインの存在下、ストローマ細胞AGM−S3−A9と共培養した後に放射線照射マウスに移植した場合を示す。「A9+STF(20)」(黒四角)はFP6の濃度が20ng/mlの時の結果を示す。「A9+STF(50)」(◆)はFP6の濃度が50ng/mlの時の結果を示す。
図3は、ヒト間葉系幹細胞およびサイトカインカクテルの造血幹細胞の増殖に与える影響を示した図である。具体的には、マウス造血幹細胞を移植した個体の末梢血におけるドナー由来血球細胞のキメリズムの経時的な変化を示した。「input」(×)は、マウス造血幹細胞を採取後直ちに放射線照射マウスに移植した場合を示す。「MSC」(○)は、マウス造血幹細胞を採取後、ヒト間葉系幹細肪と共培養した後に放射線照射マウスに移植した場合を示す。「MSC+STF」(△)は、マウス造血幹細胞を採取後、SCF+FP6+TPOのサイトカインの存在下、ヒト間葉系幹細胞と共培養した後に放射線照射マウスに移植した場合を示す。
図4は、ストローマ細胞およびサイトカインカクテルの造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖に与える影響を示した図である。「input」は、ヒト造血幹細胞を採取後直ちにコロニーアッセイに供した場合を示す。「A」は、ヒト造血幹細胞を採取後、SCF+FP6+TPO+FLのサイトカインの存在下、ストローマ細胞AGM−S3−A9と共培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「B」は、ヒト造血幹細胞を採取後、SCF+FP6+TPO+FLのサイトカインの存在下培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「BFU−E」:BFU−E(erythroid burst−forming unit)、「CFU−GM」:CFU−GM(granulocyte−macrophage colony−forming unit)、「CFU−Emix」:CFU−Emix(erythrocyte mixed colony−forming unit)。
図5は、ストローマ細胞およびサイトカインカクテルの造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖に与える影響を示した図である。「input」は、ヒト造血幹細胞を採取後直ちにコロニーアッセイに供した場合を示す。「A」は、ヒト造血幹細胞を採取後、SCF+FP6+TPO+FLのサイトカインの存在下、ストローマ細胞AGM−S3−A9と共培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「B」は、ヒト造血幹細胞を採取後、SCF+TPO+FLのサイトカインの存在下、ストローマ細胞AGM−S3−A9と共培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「C」は、ヒト造血幹細胞を採取後、SCF+FP6+TPO+FLのサイトカインの存在下に培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「D」は、ヒト造血幹細胞を採取後、SCF+TPO+FLサイトカインの存在下に培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「BFU−E」:BFU−E(erythroid burst−forming unit)、「CFU−GM」:CFU−GM(granulocyte−macrophage colony−forming unit)、「CFU−Emix」:CFU−E mix(erythrocyte mixed colony−forming unit)。
図6は、ストローマ細胞およびサイトカインカクテルの造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖に与える影響を示した図である。「input」は、ヒト造血幹細胞を採取後直ちにコロニーアッセイに供した場合を示す。「A」は、ヒト造血幹細胞を採取後、SCF+FP6+TPO+FLのサイトカインの存在下、ストローマ細胞AGM−S3−A9と共培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「B」は、ヒト造血幹細胞を採取後、SCF+FP6+FLのサイトカインの存在下、ストローマ細胞AGM−S3−A9と共培養した後にコロニーアッセイに供した場合を示す。「BFU−E」:BFU−E(erythroid burst−forming unit)、「CFU−GM」:CFU−GM(granulocyte−macrophage colony−forming unit)、「CFU−Emix」:CFU−Emix(erythrocyte mixed colony−forming unit)。
Claims (13)
- gp130刺激因子と、一種以上のサイトカイン類と、ストローマ細胞との存在下において造血幹細胞を培養する工程を含んでなる、造血幹細胞の製造法。
- gp130刺激因子が、インターロイキン−6(IL−6)またはその変異体とIL−6受容体のα鎖(IL−6R)またはその変異体との融合タンパク質、IL−6Rまたはその変異体とIL−6またはその変異体との組み合わせ、gp130に対してアゴニストとして作用するgp130に対する抗体、IL−11、白血球遊走阻止因子(LIF)、オンコスタチンM、またはカルジオトロピンである、請求項1に記載の方法。
- gp130刺激因子がIL−6またはその変異体とIL−6Rまたはその変異体との融合タンパク質である、請求項1の方法。
- 融合タンパク質が、IL−6Rの112番から333番までの断片のC末端と、IL−6の38番から212番までの断片のN末端とを直接連結してなるタンパク質(FP6)である、請求項3に記載の方法。
- サイトカイン類が、造血幹細胞を増殖させるおよび/または維持する因子である、請求項1に記載の方法。
- サイトカイン類が、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)もしくはその変異体またはそれらの誘導体、Flt−3リガンド(FL)、またはこれらの組み合わせである、請求項1に記載の方法。
- サイトカイン類が、少なくともトロンボポエチン(TPO)もしくはその変異体またはそれらの誘導体を含むものである、請求項1に記載の方法。
- ストローマ細胞が、AGM領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、間葉系幹細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、胎児肝臓由来細胞、または前脂肪細胞である、請求項1に記載の方法。
- 造血幹細胞の培養工程の前に、ストローマ細胞を培養する工程を更に含んでなる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- gp130刺激因子と、一種以上のサイトカイン類と、ストローマ細胞との存在下において造血幹細胞を培養する工程を含んでなる、造血幹細胞の培養法。
- インターロイキン−6(IL−6)とIL−6受容体のα鎖(IL−6R)との融合タンパク質と、トロンボポエチン(TPO)と、AGM領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、および間葉系幹細胞から選択されるストローマ細胞と、場合によっては幹細胞因子(SCF)およびFlt−3リガンド(FL)との存在下において造血幹細胞を培養する工程を含んでなる、造血幹細胞の製造法。
- gp130刺激因子と、一種以上のサイトカイン類と、ストローマ細胞とを含んでなる、造血幹細胞の培養に用いられる培地。
- インターロイキン−6(IL−6)とIL−6受容体のα鎖(IL−6R)との融合タンパク質と、トロンボポエチン(TPO)と、AGM領域由来の細胞、骨髄由来ストローマ細胞、および間葉系幹細胞から選択されるストローマ細胞と、場合によっては幹細胞因子(SCF)およびFlt−3リガンド(FL)とを含んでなる、造血幹細胞の培養に用いられる培地。
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