KR20220113290A - 다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포로부터 림프구계세포의 분화 방법 - Google Patents

다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포로부터 림프구계세포의 분화 방법 Download PDF

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Abstract

다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포로부터 림프구계세포의 분화 방법에 관한 것으로, 조혈 내피세포를 장기 배양가능하여 림프구계세포로 유도가 가능한 바, T세포, B세포 NK 세포와 같은 면역세포의 생성을 유도하는데 용이하다.

Description

다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포로부터 림프구계세포의 분화 방법{Method for differentiation of lymphoid lineage blood cells from pluripotent stem cell-derived hemogenic endothelium}
다능성 줄기세포 유래 조혈 내피세포로부터 림프구계세포의 분화 방법에 관한 것이다.
모든 혈액의 발생과 유지는 성인의 골수에 존재하는 극소수의 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)에 의지하고 있다. 골수(bone marrow) 유래, 혈액(mobilized peripheral blood) 유래 또는 제대혈(umbilical cord blood, UCB)에서 유래된 조혈줄기세포의 이식은 여러 유전적 질병 또는 악성 질환 치료의 기준으로 사용되고 있다. 그러나, 조직 적합성 항원(Human Leukocyte Antigen, HLA) 일치 제공자에 따른 제한적인 가능성은 여전히 커다란 당면과제로 남아있으며, 제대혈의 특성상 항원 비적합성에도 불구하고 상대적으로 적은 수의 조혈줄기세포의 양이 생착 지연 또는 이식 후 생착에 여러가지 문제를 야기할 수 있다.
한편, 일본 등록특허 제5995237호에서는 동물의 Aorta Gonad Meconephor(AGM) 유래 혈관모세포를 이용하여 인간혈액세포로 분화하는 방법을 개시하고, 미국 공개특허 제2004-0235160호에서는 동물의 조혈모세포를 효과적으로 분화시키는 방법이 개시하는 등 혈관모세포의 생성 및 이를 활용한 혈액세포의 분화법 개발의 중요성이 대두되고 있다. 그러나, 실제로 인간 혈관모세포를 직접적으로 혈액세포로 분화시키는 혈관세포분화 배양기술법에 대한 보고는 거의 없으며, 림프구계 세포로까지 유도하는 방법은 전무하다. 따라서, 혈액세포의 생성을 가능하게 하는 혈관모세포의 최적화된 장기 배양법을 확립할 필요가 있다.
일 양상은 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)를 bFGF, VEGF 및 SCF를 포함하는 제1 배지에서 배양하여 중배엽성 세포(mesodermal cell)로 분화시키는 단계; 상기 중배엽성 세포를 TPO, EPO 및 IGF-1을 포함하는 제2 배지에서 배양하여 초기 조혈 내피세포(early hemogenic endothelial cell, EHE)로 분화시키는 단계; 및 상기 EHE를 IL-5, IL-7 및 DLL을 포함하는 제3 배지에서 배양하여 후기 조혈 내피세포(late hemogenic endothelial cell, LHE)로 분화시키는 단계를 포함하는 다능성 줄기세포로부터 림프구 계통세포(lymphoid lineage blood cell)를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)를 bFGF, VEGF 및 SCF를 포함하는 제1 배지 조성물을 함유하는 제1 배지에서 배양하여 중배엽성 세포(mesodermal cell)로 분화시키는 단계; 상기 중배엽성 세포를 TPO, EPO 및 IGF-1을 포함하는 제2 배지 조성물을 함유하는 제2 배지에서 배양하여 초기 조혈 내피세포(early hemogenic endothelial cell, EHE)로 분화시키는 단계; 및 상기 EHE를 IL-5, IL-7및 DLL을 포함하는 제3 배지 조성물을 함유하는 제3 배지에서 배양하여 후기 조혈 내피세포(late hemogenic endothelial cell, LHE)로 분화시키는 단계를 포함하는 다능성 줄기세포로부터 림프구 계통세포(lymphoid lineage blood cell)를 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 줄기세포를 의미한다. 상기 다능성 줄기세포는 예를 들어, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포(iPSC), 체세포 핵치환술에 의한 배아줄기세포(Somatic cell nuclear transfer derived stem cell) 등이 있다.
본 명세서에서, 용어 "조혈 내피세포(hemogenic endothelial cell)"는 분화된 희귀 혈관 내피세포로서, 배 발생 동안에 조혈 세포(hematoblast)로 분화될 수 있다. 배아에서 조혈 세포의 발달은 중배엽에서 혈관 모세포를 통해 혈관 내피 및 조혈세포의 전구체(hemopoietic precursor cell)로 순차적으로 진행된다.
본 명세서에서, 용어 "혈관모세포(angioblast, 또는 vasoformative cell)"는 골수에서 파생된 일종의 내피 전구체 세포로, 혈관의 내피로 발달할 수 있는 중간엽 세포 중 하나이다.
본 명세서에서, 용어 "림프구 계통세포(lymphoid lineage blood cell)"는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)로부터 분화된 계통 세포로서 주로 적응 면역계(adaptive immunity)와 선천 면역계(innate immunity)에 관여한다. 림프구 계통세포는 예를 들어, 자연살해세포(natural killer cell, NK cell), T 림프구, B 림프구가 있다. 따라서, 일 양상에 따른 방법은 체외에서 다능성 줄기세포를 NK 세포, T 림프구 또는 B 림프구와 같은 림프구 계통 세포로 효율적으로 분화시킬 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)를 bFGF, VEGFA 및 SCF를 포함하는 제1 배지 조성물을 함유하는 제1 배지에서 배양하여 중배엽성 세포(mesodermal cell)로 분화시키는 단계를 포함한다. 상기 배지 조성물은 통상의 세포 배양용 배지 중에 포함되는 것일 수 있다. 상기 세포 배양용 배지는 예를 들어, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, USA), MEM (Minimal Essential Medium, GIBCO, USA), BME (Basal Medium Eagle, GIBCO, USA), RPMI 1640 (GIBCO, USA), DMEM/F10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10; GIBCO, USA), DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12; GIBCO, USA), α-MEM(α-Minimal essential Medium; GIBCO, USA), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium, GIBCO, USA), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium, GIBCO, USA), Apel Ⅱ(STEMdiff APEL 2 Medium), EGM-2(EGM　Endothelial Cell Growth Medium) 등일 수 있다.
상기 bFGF는 1 내지 25 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 bFGF는 예를 들어, 1 내지 25 ng/㎖, 1 내지 20 ng/㎖, 1 내지 15 ng/㎖, 5 내지 25 ng/㎖, 5 내지 20 ng/㎖, 5 내지 15 ng/㎖ 또는 7 내지 12 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 이때, bFGF의 함량이 상기 범위를 초과하는 경우, 다능성 줄기세포의 중배엽성 세포로의 분화 속도가 느리거나 배아줄기세포의 성향을 띠는 문제점이 있다.
또한, 상기 VEGFA는 5 내지 40 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 VEGFA는 예를 들어, 5 내지 40 ng/㎖, 5 내지 35 ng/㎖, 5 내지 30 ng/㎖, 5 내지 25 ng/㎖, 5 내지 20 ng/㎖, 10 내지 40 ng/㎖, 10 내지 35 ng/㎖, 10 내지 30 ng/㎖ 또는 15 내지 25 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 이때, VEGFA의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 세포 증식이 원활하지 못하다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 다능성 줄기세포가 혈관 내피세포로 분화될 수 있다는 문제점이 있다.
또한, 상기 SCF는 20 내지 70 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 SGF는 예를 들어, 20 내지 70 ng/㎖, 20 내지 65 ng/㎖, 20 내지 60 ng/㎖, 20 내지 55 ng/㎖, 25 내지 70 ng/㎖, 25 내지 65 ng/㎖, 25 내지 60 ng/㎖, 25 내지 55 ng/㎖, 30 내지 70 ng/㎖, 30 내지 65 ng/㎖ 또는 40 내지 60 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 조성물은 아스코르브산, BMP4, CHIR 또는 이의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 아스코르브산은 50 내지 250 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 아스코르브산은 예를 들어, 50 내지 250 ng/㎖, 50 내지 200 ng/㎖, 50 내지 150 ng/㎖, 70 내지 250 ng/㎖, 70 내지 230 ng/㎖, 70 내지 150 ng/㎖ 또는 80 내지 150 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 BMP4는 10 내지 50 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 BMP4는 예를 들어, 10 내지 50 ng/㎖, 10 내지 45 ng/㎖, 10 내지 40 ng/㎖, 10 내지 35 ng/㎖, 10 내지 30 ng/㎖, 15 내지 50 ng/㎖, 15 내지 45 ng/㎖ 15 내지 40 ng/㎖ 또는 20 내지 35 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 CHIR은 0.5 내지 10 nM의 농도로 포함될 수 있다. 상기 CHIR은 예를 들어, 0.5 내지 10 nM, 1 내지 10 nM, 1 내지 8 nM, 1 내지 6 nM, 1 내지 4 nM, 2 내지 9 nM, 2 내지 7 nM, 2 내지 5 nM, 또는 3 내지 6 nM의 농도로 포함될 수 있다. 이때, CHIR의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 다능성 줄기세포의 중배엽으로의 분화가 원활하지 못하다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 다능성 줄기세포가 간세포 등으로 분화될 수 있다는 문제점이 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 단계는 1 내지 3일 동안 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 단계는 1 내지 3일, 1 내지 2일 또는 2 내지 3일 동안 수행되는 것일 수 있다. 이때, 배양 기간이 상기 범위 미만인 경우, 다능성 줄기세포가 중배엽성 세포로 충분히 분화되지 못하는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 다능성 줄기세포가 중배엽에서 조혈 내피세포로 분화되지 못하고 다른 계통의 세포로 분화되는 문제점이 있다.
일 구체예에 따른 방법은 상기 중배엽성 세포를 기본 배지에 TPO, EPO 및 IGF-1을 포함하는 제2 배지 조성물을 함유하는 제2 배지에서 배양하여 초기 조혈내피세포(early hemogenic endothelial cell, EHE)로 분화시키는 단계를 포함한다.
상기 TPO는 50 내지 250 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 TPO는 예를 들어, 50 내지 250 ng/㎖, 50 내지 200 ng/㎖, 50 내지 150 ng/㎖, 70 내지 250 ng/㎖, 70 내지 230 ng/㎖, 70 내지 150 ng/㎖ 또는 80 내지 150 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 이때, TPO의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 확정적 조혈(definitive hematopoiesis) 과정이 원활하지 못하다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 거핵구(megakaryocyte)로 집중 분화될 수 있다는 문제점이 있다.
또한, 상기 EPO는 5 내지 40 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 EPO는 예를 들어, 5 내지 40 ng/㎖, 5 내지 35 ng/㎖, 5 내지 30 ng/㎖, 5 내지 25 ng/㎖, 5 내지 20 ng/㎖, 10 내지 40 ng/㎖, 10 내지 35 ng/㎖, 10 내지 30 ng/㎖ 또는 15 내지 25 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 이때, EPO의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 적혈구 생성에 오랜 시간이 소요되는 문제점이 있다.
또한, 상기 IGF-1은 20 내지 70 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 IGF-1은 예를 들어, 20 내지 70 ng/㎖, 20 내지 65 ng/㎖, 20 내지 60 ng/㎖, 20 내지 55 ng/㎖, 25 내지 70 ng/㎖, 25 내지 65 ng/㎖, 25 내지 60 ng/㎖, 25 내지 55 ng/㎖, 30 내지 70 ng/㎖, 30 내지 65 ng/㎖ 또는 40 내지 60 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 이때, 상기 IGF-1의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 혈액 분화 결정(commitment) 단계가 원활하지 못다하는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 혈액 분화 결정(commitment) 단계가 골수구계에 한정될 수 있다는 문제점이 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 조성물은 bFGF, VEGFA, SCF, FLT3L, GCSF, 및 IL-6, 또는 이의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.
상기 bFGF는 1 내지 25 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 bFGF는 예를 들어, 1 내지 25 ng/㎖, 1 내지 20 ng/㎖, 1 내지 15 ng/㎖, 5 내지 25 ng/㎖, 5 내지 20 ng/㎖, 5 내지 15 ng/㎖ 또는 7 내지 12 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 VEGFA는 50 내지 250 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 VEGFA는 예를 들어, 50 내지 250 ng/㎖, 50 내지 200 ng/㎖, 50 내지 150 ng/㎖, 70 내지 250 ng/㎖, 70 내지 230 ng/㎖, 70 내지 150 ng/㎖ 또는 80 내지 150 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 SCF는 100 내지 500 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 SCF는 예를 들어, 100 내지 500 ng/㎖, 100 내지 450 ng/㎖, 100 내지 400 ng/㎖, 100 내지 350 ng/㎖, 150 내지 500 ng/㎖, 150 내지 450 ng/㎖, 150 내지 350 ng/㎖, 200 내지 500 ng/㎖, 250 내지 400 ng/㎖, 170내지 330 ng/㎖ 또는 220 내지 300 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 FLT3L은 100 내지 400 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 FLT3L은 예를 들어, 100 내지 400 ng/㎖, 100 내지 350 ng/㎖, 100 내지 320 ng/㎖, 100 내지 300 ng/㎖, 100 내지 280 ng/㎖, 100 내지 260 ng/㎖, 100 내지 240 ng/㎖, 100 내지 220 ng/㎖, 150 내지 400 ng/㎖, 150 내지 300 ng/㎖, 또는 150 내지 250 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 이때, FLT3L의 농도가 상기 범위 미만인 경우, 초기 조혈내피세포의 혈액세포로의 분화 집중도가 떨어질 수 있다는 문제점이 있다.
또한, 상기 GCSF는 5 내지 50 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 GCSF는 예를 들어, 5 내지 50 ng/㎖, 5 내지 45 ng/㎖, 5 내지 40 ng/㎖, 5 내지 35 ng/㎖, 5 내지 30 ng/㎖, 5 내지 25 ng/㎖, 10 내지 50 ng/㎖, 10 내지 45 ng/㎖, 10 내지 40 ng/㎖, 10 내지 35 ng/㎖, 15 내지 30 ng/㎖ 또는 15 내지 25 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 이때, GCSF의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 초기 조혈내피세포의 골수구계 세포로의 분화 독려가 잘 이루어지지 않을 수 있다.
또한, 상기 IL-6는 10 내지 70 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 IL-6는 예를 들어, 10 내지 70 ng/㎖, 10 내지 65 ng/㎖, 10 내지 60 ng/㎖, 10 내지 55 ng/㎖, 20 내지 70 ng/㎖, 20 내지 65 ng/㎖, 20 내지 60 ng/㎖, 30 내지 60 ng/㎖ 또는 45 내지 55 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 이때, IL-6의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 확정적 림프구 생성(lymphopoiesis)이 잘 이루어지지 않을 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 단계는 6 내지 8일 동안 수행되는 것일 수 있다. 이때, 배양 기간이 상기 범위 미만인 경우, 조혈 내피세포의 성장과 팽창이 위축될 수 있다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 중배엽에서 조혈 내피세포의 분화가 충분히 일어나지 않아 조혈 내피세포의 빈도가 줄어드는 문제점이 있다.
상기 초기 조혈 내피세포는 하기 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다:
(a) 막대기형(rod type)의 형태학적 특성을 갖는 것;
(b) 밝은 노란색 빛을 갖는 것,;
(c) 분열 시간(doubling time)이 15 내지 35시간인 것; 및
(d) CD31+, Tie-2+, CD44+, CD34+ 또는 이들 조합의 표면 항원 특성을 갖는 것.
상기 방법은 상기 EHE를 IL-5, IL-7및 DLL을 포함하는 제3 배지 조성물을 함유하는 제3 배지에서 배양하여 후기 조혈 내피세포(late hemogenic endothelial cell, LHE)로 분화시키는 단계를 포함한다.
상기 IL-5는 20 내지 70 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 IL-5는 예를 들어, 20 내지 70 ng/㎖, 20 내지 65 ng/㎖, 20 내지 60 ng/㎖, 20 내지 55 ng/㎖, 25 내지 70 ng/㎖, 25 내지 65 ng/㎖, 25 내지 60 ng/㎖, 30 내지 60 ng/㎖, 또는 45 내지 55 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 이때, IL-5의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 림프구계 세포의 수가 적어질 수 있는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 적혈구 세포가 다량으로 생성되는 문제점이 있다.
또한, 상기 IL-7은 5 내지 40 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 IL-7은 예를 들어, 5 내지 40 ng/㎖, 5 내지 35 ng/㎖, 5 내지 30 ng/㎖, 5 내지 25 ng/㎖, 10 내지 40 ng/㎖, 10 내지 35 ng/㎖, 10 내지 30 ng/㎖, 또는 15 내지 35 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 이때, IL-7의 함량이 상기 범위 미만인 경우, NK 세포로의 분화가 원활하지 않을 수 있다.
또한, 상기 DDL1은 5 내지 50 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 DDL1은 예를 들어, 5 내지 50 ng/㎖, 5 내지 45 ng/㎖, 5 내지 40 ng/㎖, 5 내지 35 ng/㎖, 5 내지 30 ng/㎖, 10 내지 50 ng/㎖, 10 내지 45 ng/㎖, 10 내지 40 ng/㎖, 10 내지 30 ng/㎖, 15 내지 30 ng/㎖ 또는 20 내지 30 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 이때, DDL1의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 혈액 세포 중 림프구계 세포의 증식 속도가 떨어지거나 혈관모세포에서 림프구계 세포가 잘 분리되지 않는다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, NK 세포보다는 T 세포로의 분화가 용이할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제3 배지는 bFGF, VEGFA, SCF, FLT3L, GCSF, 및 IL-6, IGF-1, IL-15 또는 이의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.
상기 bFGF는 1 내지 25 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 bFGF는 예를 들어, 1 내지 25 ng/㎖, 1 내지 20 ng/㎖, 1 내지 15 ng/㎖, 5 내지 25 ng/㎖, 5 내지 20 ng/㎖, 5 내지 15 ng/㎖ 또는 7 내지 12 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 VEGFA는 5 내지 250 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 VEGFA는 예를 들어, 50 내지 250 ng/㎖, 50 내지 200 ng/㎖, 50 내지 150 ng/㎖, 70 내지 250 ng/㎖, 70 내지 230 ng/㎖, 70 내지 150 ng/㎖ 또는 80 내지 150 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 SCF는 100 내지 500 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 SCF는 예를 들어, 100 내지 500 ng/㎖, 100 내지 450 ng/㎖, 100 내지 350 ng/㎖, 100 내지 250 ng/㎖, 100 내지 150 ng/㎖, 150 내지 500 ng/㎖, 150 내지 400 ng/㎖, 150 내지 300 ng/㎖, 170 내지 250 ng/㎖, 200 내지 250 ng/㎖ 또는 300 내지 350 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 FLT3L은 100 내지 400 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 FLT3L은 예를 들어, 100 내지 400 ng/㎖, 100 내지 350 ng/㎖, 100 내지 320 ng/㎖, 100 내지 300 ng/㎖, 100 내지 280 ng/㎖, 100 내지 260 ng/㎖, 100 내지 240 ng/㎖, 100 내지 220 ng/㎖, 150 내지 400 ng/㎖, 150 내지 300 ng/㎖, 또는 150 내지 250 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 GCSF는 5 내지 50 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 GCSF는 예를 들어, 5 내지 50 ng/㎖, 5 내지 45 ng/㎖, 5 내지 40 ng/㎖, 5 내지 35 ng/㎖, 5 내지 30 ng/㎖, 5 내지 25 ng/㎖, 10 내지 50 ng/㎖, 10 내지 45 ng/㎖, 10 내지 40 ng/㎖, 10 내지 35 ng/㎖, 15 내지 30 ng/㎖ 또는 15 내지 25 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 IL-6는 10 내지 70 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 IL-6는 예를 들어, 10 내지 70 ng/㎖, 10 내지 65 ng/㎖, 10 내지 60 ng/㎖, 10 내지 55 ng/㎖, 20 내지 70 ng/㎖, 20 내지 65 ng/㎖, 20 내지 60 ng/㎖, 30 내지 60 ng/㎖ 또는 45 내지 55 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 IGF-1은 20 내지 70 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 IGF-1은 예를 들어, 20 내지 70 ng/㎖, 20 내지 65 ng/㎖, 20 내지 60 ng/㎖, 20 내지 55 ng/㎖, 25 내지 70 ng/㎖, 25 내지 65 ng/㎖, 25 내지 60 ng/㎖, 25 내지 55 ng/㎖, 30 내지 70 ng/㎖, 30 내지 65 ng/㎖ 또는 40 내지 60 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 IL-15는 5 내지 40 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 IL-15는 예를 들어, 5 내지 40 ng/㎖, 5 내지 35 ng/㎖, 5 내지 30 ng/㎖, 5 내지 25 ng/㎖, 5 내지 20 ng/㎖, 10 내지 40 ng/㎖, 10 내지 35 ng/㎖, 10 내지 30 ng/㎖ 또는 15 내지 25 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 이때, IL-15의 함량이 상기 범위 미만인 경우, NK 세포로의 분화 및 유지가 어렵다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, T 세포 등 다른 세포로의 분화 격려(encouragement)도 함께 일어나 NK 세포만을 타겟으로 하거나 림프구 계통 세포 중 어느 하나로만의 선택적 분화가 어렵다는 문제점이 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 단계는 12 내지 13일 동안 수행되는 것일 수 있다. 이때, 분화 기간이 상기 범위 미만인 경우, 초기 조혈(primary hematopoiesis) 과정이 충분히 일어나지 않아 확정적 조혈(definitive hematopoeisi) 과정의 세포 생성과 빈도가 줄어드는데 영향을 준다는 문제점이 있다.
상기 후기 조혈 내피세포는 하기 (a) 내지 (b)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다:
(a) 조약돌형(cobblestone-like type)의 형태학적 특성을 갖는 것; 및
(b) CD31+, CD34+, CD144+, Flk-1+, CD144+CD31+, CD144+CD34+, CD31+CD34+, Flk-1+CD34+, 또는 이들 조합의 표면 항원 특성을 갖는 것.
상기 방법은 상기 LHE를 13 내지 28일 동안 추가로 배양하여 림프구 계통세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 LHE를 13 내지 28일, 13 내지 27일, 13 내지 26일, 13 내지 25일, 13 내지 24일, 13 내지 22일, 13 내지 20일, 15 내지 28일, 15 내지 25일 또는 20 내지 28일 동안 추가로 배양할 수 있다. 이때, 배양 기간이 상기 범위 미만인 경우, 조혈내피세포가 림프구 계통세포로 충분히 분화되지 못한다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 림프구계 세포의 촉진이 지연되어 림프구계 세포를 충분히 수득할 수 없다는 문제점이 있다.
또한, 상기 림프구 계통세포로 분화시키는 단계는 bFGF, VEGFA, SCF, FLT3L, GCSF, IL-6, IGF-1, IL-7, IL-15, IL-5 및 DLL1으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 배지 조성물을 함유하는 EGM-2 기본 배지에서 LHE를 배양하는 것일 수 있다.
즉, 일 양상에 따른 방법은 림프구 계통세포의 분화 적정성에 맞는 배지 조건을 최적화하고 분화 단계별로 상기 배지를 적용함으로써 조혈 내피세포의 장기 배양을 가능하게 할 수 있다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 림프구 계통세포를 제공한다.
다른 양상은 상기 림프구 계통세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 양상은 상기 림프구 계통세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다. 상기 유효성분의 림프구 계통세포, 그의 세포 집단 또는 그의 배양액을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 림프구 계통세포의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 방법에 의해 제조된 림프구 계통세포는 면역 활성을 가지는 바, 면역항암제로 이용가능하다.
일 양상에 따른 방법은 조혈 내피세포를 장기 배양가능하여 림프구계세포로 유도가 가능한 바, T세포, B세포 NK 세포와 같은 면역세포의 생성을 유도하는데 용이하다.
도 1은 초기 및 후기 조혈내피세포의 성상을 나타낸 사진이다.
도 2a는 후기 조혈내피세포의 배양 시간에 따른 세포 형태를 나타낸 사진 및 단일 세포의 증식을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 후기 조혈내피세포의 마커 단백질 발현을 확인한 사진이다.
도 3a는 Apel Ⅱ 기본 배지에서 HE를 배양하고 1일째, 3일째, 7일째 및 그 후의 세포 형상을 나타낸 사진이다.
도 3b는 EGM-2 기본 배지에서 HE를 배양하고 1일째 및 3일째의 세포 형상을 나타낸 사진이다.
도 3c는 DMEM/F12 기본 배지에서 HE를 배양하고 1일째, 3일째, 7일째 및 그 후의 세포 형상을 나타낸 사진이다.
도 4a는 후기 조혈 내피세포에서의 마커 단백질을 확인한 결과이다.
도 4b는 CD31세포의 Tie-2 enrichment를 확인한 사진이다.
도 5a는 생쥐의 간 내 조혈내피세포에서의 림프구계 세포 생성을 확인한 결과이다.
도 5b는 생쥐 AGM 내 조혈내피세포에서의 림프구계 세포 생성을 확인한 결과이다.
도 5c는 각 기본 배지에서 배양한 조혈내피세포의 성상과 콜로니 형성, 림프구계 세포 및 골수구계 세포의 생성 정도를 도표화하고, 조혈내피세포의 모양의 확인한 결과이다.
도 5d는 AGM 내 분화된 세포들을 이용하여 CD45, CD4, CD8, NK1.1의 발현 정도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 인간 전분화능 줄기세포 유래 조혈 내피세포로부터 림프구계 세포의 생성 단계별 세포의 성상 및 발현 마커를 나타낸 결과이다.
도 6b는 IL-5 및 DDL1을 처리한 스팟에서 림프구계 세포로의 분화가 이루어지는지 여부를 림프루계 전사인자의 발현으로 확인한 그래프이다.
7a는 인간 전분화능 줄기세포 유래 후기 조혈내피세포의 배양 31일 째 T 림프구 전구세포인 γδT 세포의 표면 마커를 FACS로 확인한 결과이다.
7b는 인간 전분화능 줄기세포 유래 후기 조혈내피세포의 배양 31일 째 T 림프구 전구세포인 γδT 세포의 표면 마커를 정량화한 그래프이다.
7c는 인간 전분화능 줄기세포 유래 후기 조혈내피세포의 배양 31일 째 T 림프구 전구세포인 γδT 세포의 세포 모양을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[제조예]
제조예 1. 줄기세포의 조혈 내피세포(Hemogenic endothelial cell)로의 분화 및 유지를 위한 배양 조건 확립
줄기세포의 조혈 내피세포로의 분화 및 배양 조건을 확인하였다. 구체적으로, ㈜차바이오텍으로부터 입수한 줄기세포(이하, 'CHA52 세포') 2.0 x105 개를 6 well 배양 접시 중, 마트리겔이 코팅된 1 well에 분주하고 이틀 동안 배양하였다. 이후, 상기 세포를 기본 배지(Stemline Ⅱ 배지)에 bFGF 7 ng/㎖, CHIR 1 nM, 아스코르브산 60 ng/㎖, VEGFA 15 ng/㎖, SCF 35 ng/㎖ 및 BMP4 18 ng/㎖를 포함한 중배엽 특이 조건배지에서 3일 동안 배양하였다(이하, '단계 Ⅰ'). 이후, 상기 세포를 기본 배지(Apel Ⅱ 배지)에 bFGF 7 ng/㎖, VEGFA 15 ng/㎖, SCF 180 ng/㎖, FLT3L 150 ng/㎖, GCSF 18 ng/ ㎖, TPO 80 ng/㎖, EPO 17 ng/㎖, IL-6 25 ng/㎖ 및 IGF-1 30 ng/㎖을 포함하는 최적화된 배지에서 6일동안 추가로 배양하였다(이하, '단계 Ⅱ'). 6일째까지의 기간을 전 조혈 내피세포(pro hemogenic endothelial cell, pro HE)라고 명명하고, 6일째 되는 날 조혈 내피세포를 계대배양 하여 고순도로 분리하였다. 이때, 0.25% Trypsin/EDTA를 배양기 안에서 3분 동안 처리하여 single layer로 분포된 비 조혈 내피세포들이 먼저 떨어지는 것을 확인하였다. 이후, DPBS로 배지를 세척한 후, 0.25% Trypsin/EDTA를 추가로 처리하여 조혈 내피세포 클러스터(cluster)를 단일 세포로 분리하였다. 분리된 단일 세포를 0.44 ㎛ 필터로 여과한 후, 1 well에서 나온 세포를 2 well에 나누어 기본 배지(Apel Ⅱ 배지)에 bFGF 11 ng/㎖, VEGFA 50 ng/㎖, SCF 170 ng/㎖, FLT3L 150 ng/ ㎖, GCSF 18 ng/㎖, IL-6 35 ng/㎖, IGF-1 25 ng/㎖, IL-7 15 ng/㎖, IL-15 10 ng/㎖, IL-5 25 ng/㎖ 및 DLL1 7 ng/㎖을 포함한 조건배지에서 21일 동안 계대배양 하였다(이하, '단계 Ⅲ'). 21일까지 3~4일에 한번씩 배지의 half change를 유지하였다.
제조예 2~4.
각 단계에서 하기 표 1~3의 구성 및 함량을 포함하였다는 점을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
구성 제조예 2 제조예 3 제조예 4 제조예 5
단계 Ⅰ bFGF 15 ng/㎖ 9 ng/㎖ 12 ng/㎖ 17 ng/㎖
CHIR 5 nM 2 nM 4 nM 7 nM
아스코르브산 70 ng/㎖ 80 ng/㎖ 120 ng/㎖ 150 ng/㎖
VEGFA 18 ng/㎖ 22 ng/㎖ 25 ng/㎖ 30 ng/㎖
SCF 55 ng/㎖ 45 ng/㎖ 58 ng/㎖ 65 ng/㎖
BMP4 20 ng/㎖ 22 ng/㎖ 30 ng/㎖ 35 ng/㎖
구성 제조예 2 제조예 3 제조예 4 제조예 5
단계 Ⅱ bFGF 15 ng/㎖ 9 ng/㎖ 12 ng/㎖ 17 ng/㎖
VEGFA 18 ng/㎖ 22 ng/㎖ 25 ng/㎖ 30 ng/㎖
SCF 225 ng/㎖ 195 ng/㎖ 210 ng/㎖ 270 ng/㎖
FLT3L 170 ng/㎖ 190 ng/㎖ 210 ng/㎖ 230 ng/㎖
GCSF 25 ng/㎖ 23 ng/㎖ 27 ng/㎖ 30 ng/㎖
TPO 150 ng/㎖ 120 ng/㎖ 130 ng/㎖ 180 ng/㎖
EPO 23 ng/㎖ 21 ng/㎖ 25 ng/㎖ 27 ng/㎖
IL-6 35 ng/㎖ 45 ng/㎖ 55 ng/㎖ 65 ng/㎖
IGF-1 40 ng/㎖ 35 ng/㎖ 45 ng/㎖ 55 ng/㎖
구성 제조예 2 제조예 3 제조예 4 제조예 5
단계 Ⅲ bFGF 13 ng/㎖ 15 ng/㎖ 20 ng/㎖ 23 ng/㎖
VEGFA 30 ng/㎖ 70 ng/㎖ 90 ng/㎖ 110 ng/㎖
SCF 230 ng/㎖ 200 ng/㎖ 300 ng/㎖ 330 ng/㎖
FLT3L 180 ng/㎖ 210 ng/㎖ 240 ng/㎖ 270 ng/㎖
GCSF 25 ng/㎖ 22 ng/㎖ 28 ng/㎖ 32 ng/㎖
IL-6 45 ng/㎖ 40 ng/㎖ 55 ng/㎖ 65 ng/㎖
IGF-1 40 ng/㎖ 30 ng/㎖ 50 ng/㎖ 55 ng/㎖
IL-7 25 ng/㎖ 18 ng/㎖ 28 ng/㎖ 35 ng/㎖
IL-15 23 ng/㎖ 17 ng/㎖ 30 ng/㎖ 37 ng/㎖
IL-5 40 ng/㎖ 30 ng/㎖ 50 ng/㎖ 65 ng/㎖
DDL1 35 ng/㎖ 15 ng/㎖ 28 ng/㎖ 30 ng/㎖
[실시예]
실시예 1. 조혈 내피세포의 성상 확인
상기 제조예 1의 단계 Ⅲ에서 배양한 조혈 내피세포를 배양 13일차를 기준으로 하여 초기 조혈 내피세포(early hemogenic endothelial cell, EHE)와 후기 조혈 내피세포(late hemogenic endothelial cell, LHE)로 나눈 후, 각 세포의 성상을 현미경(x 100, x 200 및 x 400)을 이용하여 확인하였다.
도 1은 초기 및 후기 조혈 내피세포의 성상을 나타낸 사진이다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 초기 조혈 내피세포의 경우, 넓지 않은 분포의 세포 덩어리를 이루며 클러스터를 형성하는 것을 확인할 수 있고, 초기 조혈 내피세포 외에 다른 세포들이 함께 분포하는 것을 확인할 수 있었다. 이때, CD31, VE-Cadherin과 같은 조혈 내피세포의 마커 단백질이 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 배양 13일차 이후의 후기 조혈 내피세포의 경우, 초기 조혈 내피세포에 비해 더 많은 세포가 응집된 것을 확인할 수 있었으며, 여기에서 떠오르는 혈액 세포의 경우 확정적 혈액(definitive blood)의 모양을 나타내었다. 이러한 후기 조혈 내피세포는 배양 후기로 갈수록 세포질이 얇아지고 가늘어지면서 수명을 다하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 후기 조혈내피세포로부터 FLK-1+의 거핵구-적혈구의 선조세포(Progenitors)가 나오는 것을 확인할 수 있었다. 이들 한 개의 후기 조혈 내피세포에서 여러 개의 거핵구-적혈구의 선조세포들을 생성하여 clonal expansion 한 결과, 조혈 내피세포는 주로 막대기 모양(rod like cells)을 나타내어, 전형적인 혈관내피세포의 모양인 조약돌 모양(cobblestone-like cells)이나 중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cells)의 모양과는 차별되는 것을 확인할 수 있었다. 후기 조혈 내피세포에 의해 형성된 혈액 세포는 초기단계의 주로 원시적 혈액 세포(primitive blood cell, 주로 골수구계)이며, 후기 조혈 내피세포 유래 세포에서는 확정적 혈액 세포(definitive blood cell, 골수구계와 림프구계 모두를 포함)를 가지고 있고, 생성된 혈관 내피세포에서의 튜브 형성(tube formation)이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과로 미루어 보아 조혈 내피세포는 혈관내피세포의 특성과 혈액 세포의 특성을 모두 보유하고 있는 것으로 사료된다.
도 2a는 후기 조혈 내피세포의 배양 시간에 따른 세포 형태를 나타낸 사진 및 단일 세포의 증식을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 후기 조혈 내피세포의 배양 1일 차에서는 포르피린(porpyrin)의 전구물질인 5-아미노레불린산 합성효소(5-aminolevulinate synthase)에 의한 것으로 추정되는 밝은 빛에 의해 (하얀색 화살표로 표시) 현미경상에서 밝은 노란색 빛을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 적아구(erythroblast)를 다 생성하고 난 다음의 조혈 내피세포에서는 밝은 빛이 사라지는 것을 확인할 수 있었다(D9, 10일째 이후). 또한, 5일 째 조혈 내피세포에서는 Budding되는 적아구(erythroblast)의 모양을 확인할 수 있으며, 7일 째 이후에 적아구가 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 조혈 내피세포들의 Doubling day는 1.2일 정도이며, doubling time은 평균 29.5시간 정도인 것을 확인하였다.
도 2b는 후기 조혈내피세포의 마커 단백질 발현을 확인한 사진이다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 9일째 이후 클러스터를 이루는 조혈 내피세포에서 마커 단백질인 CD31, Tie-2, CD34, 등이 발현되는 것을 확인하였으며, 일부 세포에서는 RUNX1, brachuary와 같은 중배엽 마커가 핵 안에 남아있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 조혈 내피세포에서 혈액 세포로 떠오를 때 혈액 세포에 FLK-1 단백질이 집중적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 배양 조건에 따른 후기 조혈 내피세포의 증식 및 분화
상기 실시예 1에서 배양한 후기 조혈 내피세포를 1개월 동안 냉동 보관한 후, 37℃ water bath에서 해동하였다. 이후, 후기 조혈 내피세포의 증식 및 분화에 적합한 배지를 확인하기 위하여 3가지 기본 배지(Apel Ⅱ, EGM-2 및 DMEM/F12 배지)를 사용하였고, ApelⅡ 및 DMEM/F12 배지의 경우, bFGF 7 ng/㎖, VEGFA 15 ng/㎖, SCF 180 ng/㎖, FLT3L 150 ng/㎖, GCSF 18 ng/㎖, TPO 80 ng/㎖, EPO 17 ng/㎖, IL-6 25 ng/㎖, IGF-1 30 ng/㎖, IL-3 45 ng/㎖ 및 CHIR 1 nM을 첨가하였다. EGM-2 배지의 경우, 상기 제조예 1의 Ⅲ 단계와 동일한 종류 및 양의 사이토카인을 추가로 첨가하였다. 이후, 냉동 후 해동된 후기 조혈 내피세포를 상기 3개의 배지에 각각 배양하였고, 모든 배지는 3~4일에 한번씩 배지의 half change를 유지하였다. 후기 조혈 내피세포의 경우, 냉동 후 해동된 혈관내피세포이기 때문에 배양 접시에 부착하여 증식할 것으로 기대하였다.
도 3a는 Apel Ⅱ 기본 배지에서 조혈 내피세포를 배양하고 1일째, 3일째, 7일째 및 그 후의 세포 형상을 나타낸 사진이다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, Apel Ⅱ 기본 배지에서는 대부분의 조혈 내피세포가 배양 접시의 부착(attachment)에 실패하고 빠르게 죽는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 7일 이후까지 생존한 조혈 내피세포의 경우, 내피세포로서의 기능이 안정화되면 백혈구 유사 세포(WBC like cell)를 생성하거나 적아구 콜로니를 형성된 것을 확인할 수 있었다. 다만, BGM-2 및 DMEM/F12 기본 배지에서 배양한 조혈 내피세포의 혈액 세포 생산량에 비하여 현저히 낮았다.
도 3b는 EGM-2 기본 배지에서 조혈 내피세포를 배양하고 1일째 및 3일째의 세포 형상을 나타낸 사진이다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, EGM-2 기본 배지에서 배양한 조혈 내피세포는 배양 접시에 부착 후 안정적으로 증식하였으며, 증식 속도도 다른 기본 배지에 비해 빠르고 안정적이었다. 특히, 7일 이상 증식된 조혈 내피세포의 경우, 전형적인 조약돌모양의 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell)와 비정형적인 혈관 내피세포 모양의 세포군으로 나뉘어진 것을 확인할 수 있었다. 한편, ApelⅡ 기본 배지에서 배양한 세포 중, 세포 부착이 이루어지지 않은 세포를 EGM-2 배지에서 3일 동안 배양하여 부착 세포의 증식을 유도한 후, 다시 Apel Ⅱ 배지에서 배양한 결과, 조혈 내피세포가 정상적으로 증식하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, EGM-2 기본 배지는 조혈 내피세포의 증식과 생착에 긍정적이며, 배양 접시 내에서 조혈 내피세포가 안정적인 부착과 증식을 함으로써 혈액 세포의 생산에 영향을 미칠 수 있다.
도 3c는 DMEM/F12 기본 배지에서 조혈 내피세포를 배양하고 1일째, 3일째, 7일째 및 그 후의 세포 형상을 나타낸 사진이다.
그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, DMEM/F12 기본 배지에서 배양한 조혈 내피세포는 배양 접시에 부착하여, 증식하는 것을 확인할 수 있었다. EGM-2 기본 배지에서 배양한 조혈 내피세포와 비교하여 증식 속도가 4~5일 정도 늦었으나 조혈 내피세포의 콜로니가 다수 형성되어 8일 이후부터는 다량의 혈액세포를 안정적으로 생성하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 조혈 내피세포에서 발현하는 단백질 마커의 확인
상기 실시예 2의 기본 배지에 따라 조혈 내피세포에서 발현하는 마커 단백질의 발현을 비교하였다. 그 결과, 기본 배지에 따른 마커 단백질의 발현이 크게 다르지 않았으며, 조혈 내피세포에서 전형적인 마커 단백질이 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
도 4a는 EGM-2 기본 배지에서 3일 동안 배양한 조혈 내피세포에서의 마커 단백질을 확인한 결과이다.
도 4b는 EGM-2 기본 배지에서 14일 동안 배양한 조혈 내피세포의 Tie-2 enrichment를 확인한 사진이다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, EGM-2 기본 배지에서 배양한 조혈 내피세포 그룹에서는 CD31 27.9%, CD34 8.2%, CD144 29.9%, Flk-1 4.5%의 단백질 마커가 발현되고, CD144+CD31+ 11.3%, CD144+CD34+ 8.5%, CD31+CD34+ 10.2%, Flk-1+CD34+ 4.9%의 단백질 마커가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, CD31을 이용해 MACS sorting 한 그룹에서 Tie-2의 발현이 CD31+ 세포군에서 24.9% enrichment 되어 있음을 알 수 있었고, CD31- 세포군에서는 1.8% enrichment 되어 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, CD31+ 세포의 조혈 내피세포로의 commitment를 시사한다. 또한, Tie2 > CD144 > CD31 > CD34 > FLK1의 순서로 조혈 내피세포 마커가 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 림프구계 세포의 생성 유도를 위한 조혈 내피세포의 배양 조건 확인
상기 실시예 2의 결과를 바탕으로 림프구계 생성을 유도하기 위한 조혈 내피세포의 배양 조건을 추가적으로 확인하였다. 먼저, 10.5~11.5 일의 생쥐 태아(rat fetus)에서 Arota gonad mesonephros (AGM)과 간조직을 분리하였다. 이후, 1.5 ㎖ eppendorf tube 뚜껑 뒤로 mincing한 조직을 DPBS로 세척 후 상기 실시예 2와 동일한 3가지 배지에서 생쥐의 출생일인 20일째까지 배양하였다. 각 배지에서 배양한 조혈 내피세포의 모양을 확인하기 위하여 Hematoxylin & Eosin 염색을 수행하였다.
도 5a는 생쥐의 간 내 조혈 내피세포에서의 림프구계 세포 생성을 확인한 결과이고, 도 5b는 생쥐 AGM 내 조혈 내피세포에서의 림프구계 세포 생성을 확인한 결과이다. 도 5c는 각 기본 배지에서 배양한 조혈 내피세포의 성상과 콜로니 형성, 림프구계 세포 및 골수구계 세포의 생성 정도를 도표화하고, 조혈 내피세포의 모양의 확인한 결과이다.
간 조직 유래 혈액세포에서는 조혈 내피세포의 획득이 거의 이뤄지지 않았으나, 조혈 내피세포에서 만들어진 혈액세포들이 간으로 침윤(infiltration) 하여 성숙하는 과정에서 각 3가지 배지에 따라 다른 경향을 나타내는 것을 확인하였다. 구체적으로, 도 5a에 나타낸 바와 같이, EGM-2 기본 배지의 경우, 조혈 내피세포가 모두 죽는 것을 확인하였다. 반면, Apel Ⅱ 기본 배지 경우, 3일째 안에 거핵구-적혈구세포, 전적혈모구(Pronormoblast)에서 정염성적혈모구(orthochromic normoblast)까지 세포들이 빠르게 유도되어 6일 안에 세포들이 사라지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, DMEM/F12 기본 배지의 경우, 적혈구계보다는 거핵구-적혈구세포유래 거핵모구, 거핵구 (MK-II)까지 분화가 왕성하고 전혈소판 돌기와 silia의 형성을 눈에 띄게 확인할 수 있었다. 특히, Heme 장착 적혈구 계열의 세포보다는 백혈구 계열 세포의 생성이 많은 것을 확인할 수 있었다.
한편, 도 5b에 나타낸 바와 같이, AGM에 존재하는 조혈 내피세포의 경우, 배지에 따라 최대 9일째까지의 배양 정도가 다른 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, EGM-2 기본 배지의 경우, 혈액 세포의 소멸이 눈에 띄게 상승한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 인간의 전분화능 유래 조혈 내피세포와는 다르게 생쥐의 조혈 내피세포는 장기간 생존하지는 않는 것을 알 수 있다. 그러나, Apel Ⅱ 기본 배지의 경우, 적혈구 계열 세포의 enrichment가 빠르게 이뤄지고 백혈구 계열 세포의 증식이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, DMEM/F12 기본 배지의 경우, 적혈구계 세포의 분화보다 거핵구와 백혈구의 분화 정도가 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로, 도 5c에 나타낸 바와 같이, 간 및 AGM 유래 세포는 EGM-2 기본 배지에 비하여 DMEM/F12 및 Apel Ⅱ 기본 배지에서 부착 및 세포 증식이 활발히 이루어져 조혈 내피세포 및 혈구세포로 장기간 분화가 가능함을 알 수 있다.
도 5d는 AGM 내 분화된 세포들을 이용하여 CD45, CD4, CD8, NK1.1의 발현 정도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이, Apel Ⅱ 기본 배지의 경우 10일째에 부유세포 내 자연살해세포의 유도가 가장 높았고, DMEM/F12 기본 배지의 경우, 6일째에 거핵구와 더불어 CD4, CD8 세포의 유도가 빠르게 상승하고 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 2개의 기본 배지 모두에서 AGM 유래 혈액 세포가 유지되는 것을 알 수 있다.
실시예 5. 인간 다능성 줄기세포의 조혈 내피세포 및 혈액세포로의 분화 확인
상기 실시예 4에서 생쥐 태아의 체내 유래 조혈내피세포가 혈액 세포로 분화하는 것을 확인한 것을 바탕으로, 상기 실시예 1에서 배양한 후기 조혈 내피세포를 실시예 2의 배지에서 분화 및 증식하여 혈액세포로 분화시킨 후, 표면 마커를 확인하였다. 구체적으로, 상기 제조예 1에서 단계 Ⅰ 내지 Ⅲ에 따라 21일 동안 배양한 조혈 내피세포를 34일 째가 되는 날까지 추가로 배양하였다. 이때, 배양 28일 이후에는 조혈 내피세포의 탈락이 이루어지거나 세포 사멸의 빈도가 증가하기 때문에 조혈 내피세포의 기능적인 창(functional window)을 21~28일까지로 정하였다. 34일 째가 되는 날까지 배양한 조혈 내피세포에 한해 0.25% Trypsin/EDTA를 추가로 처리하여 세포 클러스터를 단일 세포로 분리하였다. 이후, CFU-assay를 수행하여 골수구계 세포의 콜로니 생성여부를 확인하였다.
도 6a는 인간 전분화능 줄기세포 유래 조혈 내피세포로부터 림프구계 세포의 생성 단계별 세포의 성상 및 발현 마커를 나타낸 결과이다.
도 6b는 IL-5 및 DDL1을 처리한 스팟에서 림프구계 세포로의 분화가 이루어지는지 여부를 림프루계 전사인자의 발현으로 확인한 그래프이다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 13일 이후 34일째까지 배양한 조혈 내피세포는 골수구계 세포의 콜로니가 생성되며 분화가 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 6b에 나타낸 바와 같이, IL-5 및 DLL1 등을 처리한 스팟(spot)에서 림프구계 전사인자(transcription factor)가 다수 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 일 양상에 따른 배지는 인간 다능성 줄기세포의 장기 배양이 가능하여 조혈 내피세포 및 혈관 세포(림프구계 세포)로의 분화가 가능한 것을 알 수 있다.
실시예 6. 인간 다능성 줄기세포의 T 림프구 전구세포로의 분화 확인
상기 실시예 4에서 생쥐 태아의 체내 유래 조혈내피세포가 혈액 세포로 분화하는 것을 확인한 것을 바탕으로, 상기 실시예 1에서 배양한 후기 조혈 내피세포를 실시예 2의 배지에서 분화 및 증식하여 T 림프구 전구세포, 즉 αβT 세포의 전구세포인 γδT 세포로 분화시킨 후, 표면 마커를 확인하였다. 구체적으로, 상기 제조예 1에서 단계 Ⅰ 내지 Ⅲ에 따라 21일 동안 배양한 조혈 내피세포를 31일 째가 되는 날까지 추가로 배양하였다. 이때, 배양 31일 째에 확정적 조혈생성과정을 통해 림프구계 세포의 생성이 이루어지므로, 조혈 내피세포의 기능적인 창(functional window)을 21~31일까지로 정하였다. 배양 후 31일째 되는 날, FACS를 수행하여 세포 표면 마커를 분석하였다.
7a는 인간 전분화능 줄기세포 유래 후기 조혈내피세포의 배양 31일 째 T 림프구 전구세포인 γδT 세포의 표면 마커를 FACS로 확인한 결과이다.
7b는 인간 전분화능 줄기세포 유래 후기 조혈내피세포의 배양 31일 째 T 림프구 전구세포인 γδT 세포의 표면 마커를 정량화한 그래프이다.
7c는 인간 전분화능 줄기세포 유래 후기 조혈내피세포의 배양 31일 째 T 림프구 전구세포인 γδT 세포의 세포 모양을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, 후기 조혈내피세포는 배양 22일 째에 확정적 조혈세포의 단계로 넘어가면서 CD3의 발현이 나타나기 시작하였다. 또한, 배양 31일 째에 부착 세포와 비교하여 부유(suspension) 세포에서 CD3 양성 세포 수가 유의하게 많았으며, 약 40%의 빈도율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, CD3 양성 세포에서 TCR 수용체 아형을 확인할 수 있었으며, 부착 세포와 비교하여 부유 세포에서 TCR Vδ2의 발현이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

  1. 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)를 bFGF, VEGF 및 SCF를 포함하는 배지 조성물을 함유하는 제1 배지에서 배양하여 중배엽성 세포(mesodermal cell)로 분화시키는 단계;
    상기 중배엽성 세포를 TPO, EPO 및 IGF-1을 포함하는 배지 조성물을 함유하는 제2 배지에서 배양하여 초기 조혈 내피세포(early hemogenic endothelial cell, EHE)로 분화시키는 단계; 및
    상기 EHE를 IL-5, IL-7및 DLL을 포함하는 배지 조성물을 함유하는 제3 배지에서 배양하여 후기 조혈 내피세포(late hemogenic endothelial cell, LHE)로 분화시키는 단계를 포함하는 다능성 줄기세포로부터 림프구 계통세포(lymphoid lineage blood cell)를 제조하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 다능성 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능줄기세포(iPSC), 체세포 핵치환술에 의한 배아줄기세포(Somatic cell nuclear transfer derived stem cell) 및 성체 유래 중간엽줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 배지는 아스코르브산, BMP4 또는 이의 혼합물을 추가로 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 배지는 bFGF, VEGFA, SCF, FLT3L, GCSF, 및 IL-6, 또는 이의 혼합물을 추가로 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 EHE는 하기 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것인 방법:
    (a) 막대기형(rod type)의 형태학적 특성을 갖는 것;
    (b) 밝은 노란색 빛을 갖는 것,;
    (c) 분열 시간(doubling time)이 15 내지 35시간인 것; 및
    (d) CD31+, Tie-2+, CD144+, CD34+ 또는 이들 조합의 표면 항원 특성을 갖는 것.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 제3 배지는 bFGF, VEGFA, SCF, FLT3L, GCSF, 및 IL-6, IGF-1, IL15 또는 이의 혼합물을 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 LHE는 하기 (a) 내지 (b)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것인 방법:
    (a) 조약돌형(cobblestone-like type)의 형태학적 특성을 갖는 것; 및
    (b) CD31+, CD34+, CD144+, Flk-1+, CD144+CD31+, CD144+CD34+, CD31+CD34+, Flk-1+CD34+, 또는 이들 조합의 표면 항원 특성을 갖는 것.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 다능성 줄기세포를 중배엽성 세포로 분화시키는 단계는 1 내지 3일 동안 수행하는 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 중배엽성 세포를 EHE로 분화시키는 단계는 6 내지 8일 동안 수행하는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 EHE를 LHE로 분화시키는 단계는 12 내지 13일 동안 수행하는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, LHE를 13 내지 28일 동안 추가로 배양하여 림프구 계통세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 LHE를 bFGF, VEGFA, SCF, FLT3L, GCSF, IL-6, IGF-1, IL-7, IL-15, IL-5 및 DLL1으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 배지 조성물을 함유하는 EGM-2 기본 배지에서 배양하는 것인 방법.

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