JP2024518632A - 体液免疫系の再生方法およびその使用 - Google Patents
体液免疫系の再生方法およびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024518632A JP2024518632A JP2023572007A JP2023572007A JP2024518632A JP 2024518632 A JP2024518632 A JP 2024518632A JP 2023572007 A JP2023572007 A JP 2023572007A JP 2023572007 A JP2023572007 A JP 2023572007A JP 2024518632 A JP2024518632 A JP 2024518632A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- pluripotent stem
- gene
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 title claims abstract description 17
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 title abstract description 8
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 89
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 82
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 45
- 108010043471 Core Binding Factor Alpha 2 Subunit Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 112
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 27
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 claims description 24
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 15
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 14
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 claims description 11
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 claims description 11
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 10
- 101150008172 HOXA9 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 claims description 9
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 9
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 claims description 8
- 101150040658 LHX2 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 7
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 7
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 7
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 claims description 7
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 claims description 7
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 7
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 claims description 7
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 7
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 6
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 6
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 6
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 101001052849 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Fer Proteins 0.000 claims description 5
- 102100024537 Tyrosine-protein kinase Fer Human genes 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000003325 follicular Effects 0.000 claims description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 5
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 4
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 4
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims description 4
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 4
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims description 4
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 4
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims description 4
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 3
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 3
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 claims description 3
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 3
- 108010049951 Bone Morphogenetic Protein 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 claims description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 2
- 102100033601 Collagen alpha-1(I) chain Human genes 0.000 claims description 2
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims description 2
- 101001000998 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Proteins 0.000 claims description 2
- 206010049933 Hypophosphatasia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 201000011252 Phenylketonuria Diseases 0.000 claims description 2
- 102100035620 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Human genes 0.000 claims description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 2
- 108010029483 alpha 1 Chain Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 2
- 210000003826 marginal zone b cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 10
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 2
- 102000008138 Bone Morphogenetic Protein 3 Human genes 0.000 claims 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims 1
- 210000003566 hemangioblast Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 34
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 34
- 101001020544 Homo sapiens LIM/homeobox protein Lhx2 Proteins 0.000 abstract description 22
- 102100021090 Homeobox protein Hox-A9 Human genes 0.000 abstract description 20
- 108010027263 homeobox protein HOXA9 Proteins 0.000 abstract description 20
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 19
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 7
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 abstract description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 2
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 abstract description 2
- 102000002664 Core Binding Factor Alpha 2 Subunit Human genes 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 45
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 44
- 102100025373 Runt-related transcription factor 1 Human genes 0.000 description 21
- 102100036132 LIM/homeobox protein Lhx2 Human genes 0.000 description 20
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 14
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 14
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 13
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 10
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 9
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 8
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 6
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 6
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 6
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 6
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 102100039341 Atrial natriuretic peptide receptor 2 Human genes 0.000 description 3
- 101710102159 Atrial natriuretic peptide receptor 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 3
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 3
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 210000001102 germinal center b cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 210000002809 long lived plasma cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 101100168714 Homo sapiens CSF1R gene Proteins 0.000 description 2
- 101001078143 Homo sapiens Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 description 2
- 101001033276 Mus musculus Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 101000716728 Mus musculus Kit ligand Proteins 0.000 description 2
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000010091 embryonic hemopoiesis Effects 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 101150084229 ATXN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000719121 Arabidopsis thaliana Protein MEI2-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010049976 Bone Morphogenetic Protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100024504 Bone morphogenetic protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100022526 Bone morphogenetic protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100036462 Delta-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100033553 Delta-like protein 4 Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- 101150033506 HOX gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000928537 Homo sapiens Delta-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000872077 Homo sapiens Delta-like protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001111742 Homo sapiens Rhombotin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000857677 Homo sapiens Runt-related transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150029107 MEIS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101001076414 Mus musculus Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108700041619 Myeloid Ecotropic Viral Integration Site 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000047831 Myeloid Ecotropic Viral Integration Site 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 1
- 102100023876 Rhombotin-2 Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- TXUZVZSFRXZGTL-QPLCGJKRSA-N afimoxifene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=C(O)C=C1 TXUZVZSFRXZGTL-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000000649 b-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000005742 definitive hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- -1 mainly Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003999 primitive hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000003624 spinocerebellar ataxia type 1 Diseases 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
体液免疫系の再生方法であって、当該方法は、抗原特異性抗体免疫応答を実現し、抗原に対して特異性の、親和力が高い抗体を生じるとともに、免疫記憶を発生することができる。それと同時に、再構成される免疫系は、安全であり、腫瘍形成のリスクが見られていない。体液免疫系の再生方法は、多能性幹細胞を用いてＲＵＮＸ１遺伝子、ＨＯＸＡ９遺伝子およびＬＨＸ２遺伝子を発現し、インビトロで誘導分化した後、Ｂ細胞種子を効率的に得、移植後に体液免疫系不全の動物体内で完備の体液免疫系を再生することができる。
Description
本願は、医薬生物工程の技術分野に属し、多能性幹細胞の指向性分化に関し、特に体液免疫系の再生、即ち多能性幹細胞をＢ細胞へ指向性分化する方法およびその使用に関する。
Ｂ細胞は、体液免疫系の中核的な細胞成分であり、Ｂ細胞の機能不全は病人の体液免疫の低下につながり、さらに、重度の細菌、病毒、または他の病原微生物の感染が現れてきた。そのため、再生手段によって体液免疫系を回復させ、ひいては強化させることは、多くの体液免疫系が異常の患者に恵みをもたらす希望がある。
多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＰＳＣｓ）は、無限増殖能力や、分化して異なる系列の細胞を形成する能力を有し、遺伝子編集・修飾に便利な細胞であり、細胞療法再生医学研究のホットスポットである。患者自体に由来する体細胞をリプログラミングした多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣ）を分化させて異なる系列の細胞を形成するように誘導することは、胚幹細胞を使用する論理的論議を回避することができるだけでなく、更に同種異系免疫拒絶のリスクを低減することができるため、再生医学分野の理想的な細胞開発材料となっている。
如何に多能性幹細胞を分化させてＢ系列種子に形成するように誘導し、移植後に体液免疫系を再構成するかは、世界中の研究ホットスポットおよび難点となり、今まで実質的な突破がなく、ましてや臨床転化のケースがない。
検討によれば、ヒト胚胎多能性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＥＳＣｓ）と基質細胞とをインビトロで共培養した後、Ｂ細胞ではなく、ＮＫ細胞を形成するようにさらに容易に誘導することができることが分かっている（Ｍａｒｔｉｎ、 Ｃｏｌｉｎ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ ｖｏｌ． １１２、７ （２００８）： ２７３０－７参照）。
マウス誘導多能性幹細胞と基質細胞とをインビトロで共培養することにより、Ｔ細胞が誘導されることができるが、Ｂ細胞に誘導することが困難である（Ｗａｄａ、Ｈａｒｕｋａ ｅｔ ａｌ． Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ Ｔ ｃｅｌｌｓ、 ｂｕｔ ｕｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ Ｂ－ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、 ｆｒｏｍ Ｂ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． ２３、１ （２０１１）： ６５－７４参照）。
それと同時に、インビボでＢ細胞を再構成する検討方法も少ない。そのうち、検討によれば、インビトロでＥＳＣを誘導したｐｒｏ／ｐｒｅ－Ｂプロジェニターを免疫不全のマウスに移植した後、Ｂ１およびＢ２細胞を生成可能となるが、上記検討によるＢ細胞が体内で存在する時間が非常に短く、且つ移植してから６～８周間後に分泌された抗体を検出できなくなっている（Ｐｏｔｏｃｎｉｋ、 Ａ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ Ｒａｇ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｂｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ｖｏｌ． ５７、１－３ （１９９７）： １３１－７参照）。更に、検討によれば、ＥＳＣをインビトロで誘導してＢ１細胞のプロジェニターを生成することができ、免疫不全のマウスの体内に移植した後、長期にわたってＢ１細胞を再構成できることが報道されている（Ｌｉｎ、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ＥＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｂ－１ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ ＨＳＣ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｓｉｓ． Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌ． １２、３ （２０１９）： ５７２－５８３参照）。しかしながら、この方法により、適応体液免疫応答に対してより重要なＢ２細胞を取得することができない。
また、多能性幹細胞において特定の転写因子を発現することにより、多系列の造血再構成能力を有する造血幹細胞・プロジェニター（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ：ＨＳＰＣｓ）を取得し、移植後にＢ細胞を含む複数の造血系列細胞を生成することができるという検討がある（Ｌｕ、Ｙｉ－Ｆｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｕｒｉｎｅ ＨＳＣｓ Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌ． １７、１２ （２０１６）： ３１７８－３１９２、およびＳｕｇｉｍｕｒａ、 Ｒｙｏｈｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ． ５４５、７６５５ （２０１７）： ４３２－４３８参照）。しかしながら、上記検討には、安定性が悪く、効率が低いという問題が存在する。
そのため、当該分野では、効率的な多能性幹細胞を誘導して単一のＢ系列種子細胞を取得する方法を切望している。
本願は、多能性幹細胞をＢ細胞へ指向性分化する方法およびその使用を提供し、遺伝子修飾の多能性幹細胞を用いてインビトロで誘導分化し、Ｂ細胞種子を効率的に得、移植後に体液免疫系不全の動物体内で完備の体液免疫系を再生することができ、効率的な体液免疫系の再生方法であり、抗原特異性抗体免疫応答を実現し、抗原に対して特異性の、親和力が高い抗体を生じるとともに、免疫記憶を発生することができる。当該方法により再構成される免疫系は、安全であり、腫瘍形成のリスクが見られていない。
第１の態様として、本願は、ＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、ＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２の３つの遺伝子のタンデム共発現を実現するための発現ベクターを提供する。
本願では、ＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２のｃＤＮＡ配列を同一のベクターにタンデム発現させ、哺乳動物の多能性幹細胞ゲノムに組み込んで、ＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２を安定して発現する宿主細胞を取得することができ、操作が簡単で効率が高く、得られた宿主細胞は、Ｂ細胞へ分化する能力を有する。
そのうち、ＲＵＮＸ１遺伝子は、ＡＭＬ１とも呼ばれ、ＲＵＮＸ転写因子タンパク質ファミリーにおけるメンバーの１つであり、白血病の染色体転座には最もよく見られるターゲット部位である。ＲＵＮＸ１は、極めて重要な造血調節転写因子であり、内皮生血の転化、原始的造血、決定的造血およびリンパ細胞の生成では重要な役割を果たす。
前記ＲＵＮＸ１遺伝子は、複数種の由来であってもよく、例えば、ヒト由来またはマウス由来などであってもよい。そのうち、マウス由来のＲＵＮＸ１遺伝子は、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２２９５２であってもよく、ヒト由来のＲＵＮＸ１遺伝子は、ＥＮＳＧ０００００１５９２１６であってもよい。
ＨＯＸＡ９遺伝子は、ＨＯＸ遺伝子ファミリーの１つであり、配列をコードする特異性転写調節因子であり、胚胎発達および造血調節の点で重要な役割を果たす。ＨＯＸＡ９は、ＨＳＣの補強および維持、内皮生血の転化およびリンパ系生成の促進の点で重要な役割を果たすことができる。
前記ＨＯＸＡ９遺伝子は、複数種の由来であってもよく、例えばヒト由来またはマウス由来であってもよい。そのうち、マウス由来のＨＯＸＡ９遺伝子は、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３８２２７であってもよく、ヒト由来のＨＯＸＡ９遺伝子は、ＥＮＳＧ００００００７８３９９であってもよい。
ＬＨＸ２遺伝子（Ｌｉｍ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）は、ＬＨ－２とも呼ばれ、転写因子ファミリーのメンバーの１つとして、複数種の器官の発達過程において比較的に重要な役割を果たし、特に、神経系において高レベルで発現する。それとともに、ＬＨＸ２は、胚胎造血、赤血球生成の点で重要な役割を果たし、また、造血幹細胞プロジェニターの不死を促進でき、且つＬＨＸ２はｐｒｅ－Ｂ細胞系で発現されることを発見される。
前記ＬＨＸ２遺伝子は、複数種の由来であってもよく、例えばヒト由来またはマウス由来であってもよい。そのうち、マウス由来のＬＨＸ２遺伝子は、ＥＮＳＭＵＳＧ００００００００２４７であってもよく、ヒト由来のＬＨＸ２遺伝子は、ＥＮＳＧ０００００１０６６８９であってもよい。
３つの遺伝子の併用について、主として、ＲＵＮＸ１は多能性幹細胞を分化させて生血内皮細胞を形成するように促進することができるとともに、ＲＵＮＸ１およびＨＯＸＡ９はリンパ系の生成を促進することができ、ＬＨＸ２はさらにＢ系列への分化を促進することができる。他の分化に関連する遺伝子、例えばＲＵＮＸ１、ＬＭＯ２およびＭＥＩＳ１の併用について、この組合せは、後期の生血内皮とＯＰ９－ＤＬ１との共培養を誘導する過程で正常に造血クローンを生成することができない。
第２の態様として、本願は、遺伝子編集した多能性幹細胞である宿主細胞であって、前記宿主細胞は第１の態様に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
好ましくは、前記宿主細胞は、多能性幹細胞であり、誘導性多能性幹細胞および／または胚胎多能性幹細胞系を含む。
好ましくは、前記多能性幹細胞は、遺伝子編集後の誘導性多能性幹細胞および／または胚胎多能性幹細胞系を含む。
第３の態様として、本願は、体液免疫系の再生、即ち多能性幹細胞をＢ細胞へ指向性分化する方法であって、
第１の態様に記載の発現ベクター、即ちＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２の３つの遺伝子を直列連結した発現ベクターを多能性幹細胞に組み込み、耐性クローン化スクリーニングを行うステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた多能性幹細胞を誘導性生血内皮（ｉＨＥＣ）へ指向性分化させるステップ（２）と、
ステップ（２）に記載の誘導性生血内皮と骨髄間質細胞とを共培養し、Ｂ系列分化能力を有する造血プロジェニター、つまりＢ系列種子細胞を得るステップ（３）と、
ステップ（３）に記載のＢ系列種子細胞を移植し、インビボで分化してＢ細胞を生成するステップ（４）と、を含む方法を提供する。
第１の態様に記載の発現ベクター、即ちＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２の３つの遺伝子を直列連結した発現ベクターを多能性幹細胞に組み込み、耐性クローン化スクリーニングを行うステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた多能性幹細胞を誘導性生血内皮（ｉＨＥＣ）へ指向性分化させるステップ（２）と、
ステップ（２）に記載の誘導性生血内皮と骨髄間質細胞とを共培養し、Ｂ系列分化能力を有する造血プロジェニター、つまりＢ系列種子細胞を得るステップ（３）と、
ステップ（３）に記載のＢ系列種子細胞を移植し、インビボで分化してＢ細胞を生成するステップ（４）と、を含む方法を提供する。
本願では、ＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２が共発現する多能性幹細胞系を指向性分化することにより得られた誘導性生血内皮と骨髄間質細胞とを共培養してＢ系列種子細胞を得、分化後に機能が正常であるＢ細胞を取得し、すべての成熟細胞のタイプを含み、腫瘍形成のリスクがない。
好ましくは、ステップ（１）に記載のＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２を直列連結した発現ベクターを任意の安全部位に組み込むことができる。組み込み部位は、組み込まれた遺伝子を安定して発現できればよい。本願では、タンデム発現する遺伝子を多能性幹細胞のＲＯＳＡ２６部位、ＡＡＶＳ１部位、ＣＣＲ５部位、Ｈ１１部位、ＣＯＬ１Ａ１部位またはＴＩＧＲＥ部位に組み込むことが好ましい。
好ましくは、ステップ（１）に記載の多能性幹細胞は、遺伝子編集後の誘導性多能性幹細胞および／または胚胎多能性幹細胞系である。
好ましくは、ステップ（１）に記載の組み込みの方法は、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、トランスフェクションまたはウィルス感染のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含み、相同組換えであることが好ましい。
好ましくは、ステップ（１）に記載の耐性スクリーニングは、ハイグロマイシンＢを用い、プライマリクローン幹細胞系を取得する。他の耐性スクリーニング策略、例えばクロラムフェニコール、ジェネティシン（Ｇ－４１８）、ブラストサイジン、ミコフェノール酸などを用い、プライマリクローン幹細胞系を取得することもできる。
好ましくは、ステップ（２）に記載の指向性分化方法は、Ｄ０培地、Ｄ２．５培地、およびＤ６培地を順に用いて多能性幹細胞を培養して前記誘導性生血内皮を取得することである。
好ましくは、前記Ｄ０培地は、３～８ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含む基礎分化培地である。前記骨形態形成タンパク質４の濃度は、例えば、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬまたは８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。
好ましくは、前記Ｄ２．５培地は、３～８ｎｇ／ｍＬの（例えば３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬまたは８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましい）ＢＭＰ４および３～８ｎｇ／ｍＬの（例えば３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬまたは８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましい）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む基礎分化培地である。
好ましくは、前記Ｄ６培地は、１０～３０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン３（ＩＬ３）、１０～３０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン６（ＩＬ６）、１０～３０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）、１０～３０ｎｇ／ｍＬのＦＭＳチロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）および１～２μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を含む基礎分化培地である。
そのうち、前記ＩＬ３の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬまたは３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。前記ＩＬ６の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬまたは３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。前記ＳＣＦの濃度は、例えば１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬまたは３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。前記Ｆｌｔ３Ｌの濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬまたは３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。前記ドキシサイクリンの濃度は、例えば１μｇ／ｍＬ、１．２μｇ／ｍＬ、１．４μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、１．６μｇ／ｍＬ、１．８μｇ／ｍＬまたは２μｇ／ｍＬであってもよく、１μｇ／ｍＬであることが好ましい。
前記Ｄ０培地、前記Ｄ２．５培地および前記Ｄ６培地の成分を表１に示す。
好ましくは、前記基礎分化培地は、１０～２０％のウシ胎仔血清（％は体積分率を示す）、１８０～２２０μｇ／ｍＬの鉄飽和トランスフェリン（ｉｒｏｎ－ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、４×１０－４～５×１０－４Ｍのチオグリセロール、１～３ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ－Ｉ添加剤および３０～７０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸を含むＩＭＤＭ培地である。
そのうち、前記ウシ胎仔血清の濃度は、例えば１０％、１２％、１４％、１６％、１８％または２０％であってもよく、１５％であることが好ましい。前記鉄飽和トランスフェリンの濃度は、例えば１８０μｇ／ｍＬ、１９０μｇ／ｍＬ、２１０μｇ／ｍＬまたは２２０μｇ／ｍＬであってもよく、２００μｇ／ｍＬであることが好ましい。前記チオグリセロールの濃度は、例えば４×１０－４Ｍ、４．２×１０－４Ｍ、４．４×１０－４Ｍ、４．８×１０－４Ｍまたは５×１０－４Ｍであってもよく、４．５×１０－４Ｍであることが好ましい。前記ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ－Ｉ添加剤の濃度は、例えば１ｍＭ、１．４ｍＭ、１．８ｍＭ、２．２ｍＭ、２．４ｍＭ、２．６ｍＭ、２．８ｍＭまたは３ｍＭであってもよく、２ｍＭであることが好ましい。前記アスコルビン酸の濃度は、例えば３０μｇ／ｍＬ、３５μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、４５μｇ／ｍＬ、５５μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、６５μｇ／ｍＬまたは７０μｇ／ｍＬであってもよく、５０μｇ／ｍＬであることが好ましい。
本願では、発明者は、培地における添加物を変更することにより、指向性造血分化系を設計して最適化させ、多能性幹細胞を造血させて誘導性生血内皮へ分化するように誘導し、前記誘導性生血内皮はさらにマウス骨髄間質細胞と共培養することにより、Ｂ系列種子細胞を取得する。
好ましくは、ステップ（３）に記載の骨髄間質細胞は、ＯＰ９－ＤＬ１細胞、ＯＰ９－ＤＬ４細胞、ＯＰ９細胞、ＭＳ５細胞、ＭＳ５－ＤＬ１細胞、ＭＳ５－ＤＬ４細胞、ＨＳ－５細胞、ＨＳ－５－ＤＬ１細胞、ＨＳ－５－ＤＬ４細胞、ＭＳＣ細胞、ＭＳＣ－ＤＬ１細胞またはＭＳＣ－ＤＬ４細胞のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含み、骨髄、胸腺、リンパ節、肝臓、脾臓組織などに由来の基質細胞およびＤＬ１またはＤＬ４が修飾発現した骨髄間質細胞のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを選択してもよい。
上記細胞系は、ＤＬ１がある場合には、ＤＬＬ１とも別称され、ＤＬ４がある場合には、ＤＬＬ４とも別称され、いずれも同様な該当する細胞系である。
好ましくは、ステップ（３）に記載の共培養の過程では、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を用いて誘導し、他の誘導原理で設計された発現エレメントを用いて対応する医薬誘導を行ってもよく、例えば、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ、４－ＯＨＴ）であってもよい。
好ましくは、ステップ（３）に記載の共培養の方法は、誘導性生血内皮とＯＰ９－ＤＬ１細胞とをＤ１１培地で共培養して、前記Ｂ系列種子細胞を取得することである。
好ましくは、前記Ｄ１１培地の成分を表２に示す。
そのうち、前記ＩＬ３の濃度は、例えば１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬまたは３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。前記ＳＣＦの濃度は、例えば１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬまたは３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。前記Ｆｌｔ３Ｌの濃度は、例えば１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬまたは３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。前記ドキシサイクリンの濃度は、例えば１μｇ／ｍＬ、１．２μｇ／ｍＬ、１．４μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、１．６μｇ／ｍＬ、１．８μｇ／ｍＬまたは２μｇ／ｍＬであってもよく、１μｇ／ｍＬであることが好ましい。前記ウシ胎仔血清の濃度は、例えば１０％、１２％、１４％、１６％、１８％または２０％であってもよく、１５％であることが好ましい。前記鉄飽和トランスフェリンの濃度は、例えば１８０μｇ／ｍＬ、１９０μｇ／ｍＬ、２１０μｇ／ｍＬまたは２２０μｇ／ｍＬであってもよく、２００μｇ／ｍＬであることが好ましい。前記チオグリセロールの濃度は、例えば４×１０－４Ｍ、４．２×１０－４Ｍ、４．４×１０－４Ｍ、４．８×１０－４Ｍまたは５×１０－４Ｍであってもよく、４．５×１０－４Ｍであることが好ましい。前記ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ－Ｉ添加剤の濃度は、例えば１ｍＭ、１．４ｍＭ、１．８ｍＭ、２．２ｍＭ、２．４ｍＭ、２．６ｍＭ、２．８ｍＭまたは３ｍＭであってもよく、２ｍＭであることが好ましい。前記アスコルビン酸の濃度は、例えば３０μｇ／ｍＬ、３５μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、４５μｇ／ｍＬ、５５μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、６５μｇ／ｍＬまたは７０μｇ／ｍＬであってもよく、５０μｇ／ｍＬであることが好ましい。
なお、前記Ｄ１１培地の主体培地は、α－ＭＥＭ培地またはＩＭＤＭ培地であってもよい。本願は、試験過程で使用する骨髄間質細胞がＯＰ９－ＤＬ１であるため、培地は、α－ＭＥＭ培地であることが好ましい。
好ましくは、ステップ（４）に記載の分化して生成するＢ細胞は、Ｂ２２０＋ Ｂ細胞および／またはＣＤ１９＋ Ｂ細胞を含む。
好ましくは、前記分化して生成するＢ細胞は、ｐｒｏ－Ｂ細胞、ｐｒｅ－Ｂ細胞、Ｂ１細胞、Ｂ２細胞または形質細胞（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ）のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む。
好ましくは、前記Ｂ１細胞は、Ｂ１ａ細胞および／またはＢ１ｂ細胞を含む。
好ましくは、前記Ｂ２細胞は、濾胞性Ｂ細胞（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｂ、ＦＯ Ｂ）および／または辺縁帯Ｂ細胞（Ｍａｒｇｉｎａｌ ｚｏｎｅ、ＭＺ Ｂ）である。
本願の好ましい技術方案として、本願は、多能性幹細胞をＢ細胞へ指向性分化する方法であって、
ＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２を直列連結した発現ベクターを遺伝子組換えにより多能性幹細胞のＲＯＳＡ２６部位に組み込み、ハイグロマイシンＢを用いて耐性スクリーニングを行うステップ（１）と、
ステップ（１）に記載の多能性幹細胞を、Ｄ０培地、Ｄ２．５培地、Ｄ６培地を順に用いて培養し、８～１２日目に誘導性生血内皮へ指向性分化するステップ（２）と、
ステップ（２）に記載の誘導性生血内皮とＯＰ９－ＤＬ１細胞とを、Ｄ１１培地で８～２１日間共培養し、ドキシサイクリンを用いて誘導し、Ｂ系列種子細胞を取得するステップ（３）と、
ステップ（３）に記載のＢ系列種子細胞を動物モデルに移し、分化してＢ細胞を生成し、前記Ｂ細胞は、ｐｒｏ－Ｂ細胞、ｐｒｅ－Ｂ細胞、Ｂ１細胞、Ｂ２細胞または形質細胞のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含むステップ（４）と、を含む方法を提供する。
ＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２を直列連結した発現ベクターを遺伝子組換えにより多能性幹細胞のＲＯＳＡ２６部位に組み込み、ハイグロマイシンＢを用いて耐性スクリーニングを行うステップ（１）と、
ステップ（１）に記載の多能性幹細胞を、Ｄ０培地、Ｄ２．５培地、Ｄ６培地を順に用いて培養し、８～１２日目に誘導性生血内皮へ指向性分化するステップ（２）と、
ステップ（２）に記載の誘導性生血内皮とＯＰ９－ＤＬ１細胞とを、Ｄ１１培地で８～２１日間共培養し、ドキシサイクリンを用いて誘導し、Ｂ系列種子細胞を取得するステップ（３）と、
ステップ（３）に記載のＢ系列種子細胞を動物モデルに移し、分化してＢ細胞を生成し、前記Ｂ細胞は、ｐｒｏ－Ｂ細胞、ｐｒｅ－Ｂ細胞、Ｂ１細胞、Ｂ２細胞または形質細胞のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含むステップ（４）と、を含む方法を提供する。
好ましくは、ステップ（２）では、１１日目に誘導性生血内皮へ指向性分化する。
好ましくは、ステップ（３）に記載の共培養の時間は、１０日間である。
第４の態様として、本願は、第３の態様に記載の方法で製造されたＢ系列種子細胞またはＢ細胞を提供する。
第５の態様として、本願は、第１の態様に記載の発現ベクター、第２の態様に記載の宿主細胞、第４の態様に記載のＢ系列種子細胞またはＢ細胞のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む医薬組成物を提供する。
好ましくは、前記医薬組成物は、医薬的に許容される補助材料をさらに含む。前記医薬的に許容される補助材料は、ベクター、賦形剤または希釈剤のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む。
第６の態様として、本願は、第５の態様に記載の医薬組成物の、免疫応答を強化する医薬、疾患を予防および／または治療する医薬、Ｂ細胞免疫療法で腫瘍を治療する医薬、Ｂ細胞ワクチンまたはＢ細胞分泌治療用タンパク質の細胞療法の医薬の製造における使用をさらに提供する。
好ましくは、前記免疫応答を強化する医薬は、Ｂ細胞免疫応答および／またはＴ細胞免疫応答を強化する医薬を含む。
好ましくは、前記疾患を予防および／または治療する医薬は、Ｂ細胞免疫不全、感染性疾患、腫瘍を予防および／または治療する医薬を含む。
好ましくは、前記Ｂ細胞分泌治療用タンパク質の細胞療法の医薬は、自己免疫疾患、遺伝子遺伝性疾患を予防および／または治療する医薬を含む。
好ましくは、前記Ｂ細胞分泌治療用タンパク質は、抗体を含む。
好ましくは、前記遺伝子遺伝性疾患は、血友病、リソソーム蓄積症、低ホスファターゼ症またはフェニルケトン尿症のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む。
本願では、前記医薬組成物は、（１）免疫応答の強化、特にＢ細胞免疫応答および／またはＴ細胞免疫応答の強化、（２）疾患の予防および／または治療、好ましくはＢ細胞免疫不全、感染性疾患、腫瘍などの予防および／または治療、（３）Ｂ細胞ワクチンの開発及び製造、および（４）Ｂ細胞分泌治療用タンパク質の細胞療法、好ましくは、自己免疫疾患、遺伝子遺伝性疾患などの予防および／または治療に使用できる。
本願では、前記医薬組成物は、（１）免疫応答の強化、特にＢ細胞免疫応答および／またはＴ細胞免疫応答の強化、（２）疾患の予防および／または治療、好ましくはＢ細胞免疫不全、感染性疾患、腫瘍などの予防および／または治療、（３）Ｂ細胞ワクチンの開発及び製造、および（４）Ｂ細胞分泌治療用タンパク質の細胞療法、好ましくは、自己免疫疾患、遺伝子遺伝性疾患などの予防および／または治療に使用できる。
従来技術と比べ、本願は、以下の有益な効果を有する。
（１）本願は、外因性ＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２の共発現ベクターを多能性幹細胞に導入し、誘導性共発現外因性ＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２の多能性幹細胞の構築が成功し、前記多能性幹細胞は、Ｂ細胞へ分化する能力を有するとともに、免疫効果を強化し、免疫不全を予防および／または治療し、感染性疾患を予防および／または治療し、腫瘍を予防および／または治療する医薬、Ｂ細胞ワクチン、およびＢ細胞分泌治療用タンパク質の細胞療法の医薬の製造に使用できる。
（２）本願は、指向性分化系および共培養方法を採用し、前記多能性幹細胞をＢ系列種子細胞へ指向性分化し、前記Ｂ系列種子細胞は移植した後、インビボで分化してＢ細胞を生成することができるとともに、免疫効果を強化し、免疫不全を予防および／または治療し、感染性疾患を予防および／または治療し、腫瘍を予防および／または治療する医薬、Ｂ細胞ワクチン、およびＢ細胞分泌治療用タンパク質の細胞療法の医薬の製造に使用できる。
（３）本願の方法を採用して得られた多能性幹細胞に由来のＢ細胞は、機能が正常であり、腫瘍形成のリスクがなく、複数種の医薬の製造に使用でき、広い適用見込みを有する。
以下、具体的な実施形態によって図面と結び付けて本願の技術方案をさらに説明するが、以下の実施例は、本願の簡単な例に過ぎず、本願の権利保護範囲を代表または限定するためのもではない。本願の保護範囲は、特許請求の範囲に準じる。
以下の実施例において、特に説明しない限り、使用される試薬および消耗品は、いずれも当該分野の一般的な試薬メーカから購入可能である。特に説明しない限り、使用される試験方法および技術手段は、いずれも当該分野の通常の方法および手段である。
実施例１ ＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２遺伝子を発現するベクターおよび多能性幹細胞の製造
本実施例は、電気的形質転換法（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）と遺伝子組換えとの組み合わせにより、誘導可能な発現配列を多能性幹細胞のＲＯＳＡ２６部位に部位特異的ノックインし、前記発現システムは、ｐ２ａおよびｔ２ａ配列を用いてＲＵＮＸ１（ＣＣＤＳ２８３３９．１）、ＨＯＸＡ９（ＣＣＤＳ２０１４６．１）およびＬＨＸ２（ＣＣＤＳ１６００８．１）のｃＤＮＡ配列を直列連結し、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）で遺伝子発現を誘導するものである。
本実施例は、電気的形質転換法（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）と遺伝子組換えとの組み合わせにより、誘導可能な発現配列を多能性幹細胞のＲＯＳＡ２６部位に部位特異的ノックインし、前記発現システムは、ｐ２ａおよびｔ２ａ配列を用いてＲＵＮＸ１（ＣＣＤＳ２８３３９．１）、ＨＯＸＡ９（ＣＣＤＳ２０１４６．１）およびＬＨＸ２（ＣＣＤＳ１６００８．１）のｃＤＮＡ配列を直列連結し、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）で遺伝子発現を誘導するものである。
図１（Ａ）に示すように、ノックインされた配列は、ｉＲＵＮＸ１－ｐ２ａ－ＨＯＸＡ９－ｔ２ａ－ＬＨＸ２タンデム配列、および耐性スクリーニングのためのハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ＨｙｇｒｏＲ）配列を含む。
相同組換えの多能性幹細胞の取得に成功するために、電気的形質転換してから２０時間後、ハイグロマイシンＢ（１５０μｇ／ｍＬ）を含む多能性幹細胞培地を添加し、毎日液体を置き換えた。ハイグロマイシンＢを用いて１０日間スクリーニングした後、顕微鏡で、個別のクローンを、マウス胎児線維芽細胞（Ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＭＥＦ）が予め播種された１２ウェルプレートに採取し、ウェルごとに１つの多能性幹細胞クローンを入れ、ハイグロマイシン無しの培地で培養した。
クローン集団がＭＥＦ細胞層に付着すると、毎日液体を置き換え、３日間後に０．２５％のトリプシンでクローン集団を消化し、１２ウェルプレートに継代した。細胞形態は、図１（Ｂ）に示すように、クローン集団が対数増殖期にあり、縁部が整然で明らかであり、ＭＥＦ細胞層と明らかな境界があり、分化しなかった。細胞状態および成長密度に基づいて継代、増幅および凍結保存を行った。
Ｄｏｘで処理してから２４時間後のｉＲＵＮＸ１－ｐ２ａ－ＨＯＸＡ９－ｔ２ａ－ＬＨＸ２多能性幹細胞の総ｍＲＮＡ（Ｄｏｘが加えられていないグループを対照グループとする）を抽出し、Ｑ－ＰＣＲによりＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２のｍＲＮＡの発現レベルを検出した。図１（Ｃ）は、Ｄｏｘを加えることにより、ＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２の発現を誘導することができることを示す。
実施例２ 多能性幹細胞の誘導性生血内皮への分化の誘導
多能性幹細胞の誘導性生血内皮への分化を誘導するために、図２（Ａ）に示すような胚様体指向性誘導分化系を用いた。
多能性幹細胞の誘導性生血内皮への分化を誘導するために、図２（Ａ）に示すような胚様体指向性誘導分化系を用いた。
指向性誘導分化系における各培地の処方は、以下の通りである。
基礎分化培地：１５％のウシ胎仔血清、２００μｇ／ｍＬの鉄飽和トランスフェリン、４．５×１０－４Ｍのチオグリセロール、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ－Ｉ添加剤および５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸を含むＩＭＤＭ培地。
Ｄ０培地：５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４を含む基礎分化培地。
Ｄ２．５培地：５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４および５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子を含む基礎分化培地。
Ｄ６培地：２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬのヒトＦＭＳチロシンキナーゼ３リガンドおよび１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含む基礎分化培地。
Ｄ０培地：５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４を含む基礎分化培地。
Ｄ２．５培地：５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４および５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子を含む基礎分化培地。
Ｄ６培地：２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬのヒトＦＭＳチロシンキナーゼ３リガンドおよび１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含む基礎分化培地。
具体的なステップは、以下の通りである。
（１）４０ｍｉｎ前もって６ウェルプレートに濃度が０．１％である０．１％のゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）を播種し、スタンバイした。０．０５％のトリプシンで多能性幹細胞を単細胞に消化し、遠心後に多能性幹細胞を再懸濁した。余計のゼラチンを吸い取り、多能性幹細胞懸濁液をゼラチンが被覆されたウェルに移し、インキュベーターに４０ｍｉｎ置くことにより、ＭＥＦ細胞を除去した。懸濁細胞を集め、２５０ｇで５ｍｉｎ遠心させ、ＤＰＢＳで１回洗浄した。
（２）Ｄ０培地で細胞を再懸濁させて計数し、細胞濃度を１×１０５個／ｍＬに調整した。５～１０ｍＬの細胞懸濁液を傾斜した１０ｃｍのディッシュに添加し、２０μＬの細胞懸濁液を吸い取り、１５ｃｍのシャーレに入れて胚様体（ＥＢ）を懸濁させ、単一のＥＢは２０μＬ（約２０００個の細胞）である。その後、シャーレを逆さにし、シャーレの底部に１つの１０ｃｍのシャーレの蓋を置き、蓋に５～６ｍＬの細胞培養用水を加えた。３７℃のインキュベーターで２．５日間培養した。
（３）４０ｍｉｎ前もって６ウェルプレートに濃度が０．１％である０．１％のゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）を播種し、スタンバイした。パスツールピペットでＥＢを遠心管に収集し、ＤＰＢＳでシャーレの底部を洗浄し、ＥＢが自然沈降した後、注意深く上清を吸い取り、９０ｇの低速で５ｍｉｎ遠心して上清を除去した。Ｄ２．５培地でＥＢを再懸濁した後、余計のゼラチンを吸い取り、ＥＢをゼラチンが被覆された６ウェルプレートに移し、１２時間培養してＥＢに汚染があるか否かを観察した。
（４）その後、Ｄ４に液体置き換えを行ってから継続して２日間培養し、用いられる培地は、Ｄ２．５培であった。
（５）Ｄ６培地に置き換えて１日間培養した。その後、１日おきに液体を置き換え、用いられる培地は、Ｄ６培地であった。
胚様体は培養過程でだんだん外周へ拡散、遷移して中胚葉細胞を形成した。図２（Ｂ）に示すように、１１日目に、ｉＲＵＮＸ１－ｐ２ａ－ＨＯＸＡ９－ｔ２ａ－ＬＨＸ２胚様体中心の外周に、明らかな分化された細胞の輪（左）が見られるとともに、胚様体の周囲に明らかな造血クラスター（右）が見られた。
胚様体誘導分化培養の１１日目に、図２（Ｃ）のような選別策略（ＣＤ３１＋、ＣＤ４１＋、ＣＤ４５－、ｃ－Ｋｉｔ＋およびＣＤ２０１＋）を用いてフローサイトメーターによる誘導性生血内皮の選別を行った。
実施例３ 誘導性生血内皮とＯＰ９－ＤＬ１基質細胞との共培養
さらに誘導性生血内皮から分化を誘導してＢ系列種子細胞を取得するために、図３（Ａ）に示すように、本実施例において選別された誘導性生血内皮とＯＰ９－ＤＬ１基質細胞とを共培養した。
さらに誘導性生血内皮から分化を誘導してＢ系列種子細胞を取得するために、図３（Ａ）に示すように、本実施例において選別された誘導性生血内皮とＯＰ９－ＤＬ１基質細胞とを共培養した。
具体的なステップは、以下の通りである。
（１）４日前もってＯＰ９－ＤＬ１細胞を蘇生し、細胞成長状態に基づいてタイムリーに継代し、細胞が過剰成長により劣化することを回避した。
（２）使用する前の日に継代し、ウェルごとに２万の細胞（１２ウェルプレート）を再播種し、翌日に使用した。
共培養培地は、Ｄ１１培地であり、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬのヒトＦＭＳチロシンキナーゼ３リガンド、１μｇ／ｍＬのＤｏｘ、１５％のウシ胎仔血清、２００μｇ／ｍＬの鉄飽和トランスフェリン、４．５×１０－４Ｍのチオグリセロール、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ－Ｉ添加剤および５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸を含むα－ＭＥＭ培地であった。
図３（Ｂ）は、ｉＲＵＮＸ１－ｐ２ａ－ＨＯＸＡ９－ｔ２ａ－ＬＨＸ２多能性幹細胞に由来の誘導性生血内皮と基質細胞ＯＰ９－ＤＬ１とを１０日間共培養した後、基質細胞ＯＰ９－ＤＬ１において高度が均一で小さくて丸くて明るい造血細胞を形成することを示す。
図３（Ｃ）は、ｉＲＵＮＸ１－ｐ２ａ－ＨＯＸＡ９－ｔ２ａ－ＬＨＸ２多能性幹細胞に由来の誘導性生血内皮と基質細胞ＯＰ９－ＤＬ１とを１０日間共培養した後、生成した造血細胞が造血プロジェニターの免疫表現型：ＬＳＫ（Ｌｉｎ－ｃ－Ｋｉｔ＋Ｓｃａ１＋）となることを示す。
実施例４ 共培養後に移植してインビボＢ系列再生
インビボ微小環境を用いてＢ細胞を取得するために、本実施例において、さらに共培養後に移植する策略を設計した。
インビボ微小環境を用いてＢ細胞を取得するために、本実施例において、さらに共培養後に移植する策略を設計した。
前記共培養後に移植する策略は、図４（Ａ）に示すように、誘導性生血内皮をＯＰ９－ＤＬ１基質細胞においてＤｏｘを添加して１０日間誘導した後、Ｂ系列種子細胞を取得した。その後、多能性幹細胞に由来のＢ系列種子細胞を目の静脈を介して８～１２週齢のＢ細胞不全のマウス（μＭＴマウス）に移植し、インビボＢ系列再生を行った。
図４（Ｂ）により、ｉＲＵＮＸ１－ｐ２ａ－ＨＯＸＡ９－ｔ２ａ－ＬＨＸ２多能性幹細胞に由来の誘導性生血内皮を共培養した後に得られたＢ系列種子細胞は、レシピエントμＭＴマウスの各種の造血組織および器官に造血キメラを形成できることが明らかになった。
移植してから６週間のレシピエントマウスをフローサイトメトリーにより分析した結果、末梢血、骨髄、脾臓およびリンパ節において、多能性幹細胞に由来の血液細胞は主としてＣＤ１９＋Ｂ細胞であり、Ｂリンパ系を効果的に再構成する効果を実現することを示す。
本実施例において、ゲノムレベルから、レシピエントマウスにおけるＧＦＰ＋造血細胞（主にＢ細胞）がｉＲＵＮＸ１－ｐ２ａ－ＨＯＸＡ９－ｔ２ａ－ＬＨＸ２多能性幹細胞に由来することを確認するために、プライマーを設計してＰＣＲ増幅およびシークエンシング同定を行った。
まず、フローソートにより骨髄、リンパ節および脾臓に由来のＧＦＰ＋細胞を選別し、ゲノムを抽出し、遺伝子配列がノックインされた特異性プライマーを用いてＰＣＲ同定を行った（図４（Ｃ）に示す）。
図４（Ｄ）は、これらの細胞ゲノム内にｉＲＵＮＸ１－ｐ２ａ－ＨＯＸＡ９－ｔ２ａ－ＬＨＸ２プラスミドに由来の配列があることを示し、ＧＦＰ＋血液細胞（主にＢ細胞）がｉＲＵＮＸ１－ｐ２ａ－ＨＯＸＡ９－ｔ２ａ－ＬＨＸ２多能性幹細胞に由来することが証明され、それと同時に、シークエンシング結果（図４（Ｅ）に示す）によりこのことも証明された。
それと同時に、多能性幹細胞に由来のＢ細胞が抗体を分泌する機能を備えるか否かを検証するために、移植してから４～６週後、ＥＬＩＳＡにより未免疫レシピエントマウスの血清における免疫グロブリンの含有量を検出した。
図４（Ｆ）に示すように、陰性対照群であるμＭＴマウスと比べ、Ｂ系列種子細胞が移植されたμＭＴレシピエントマウス（ｉＢマウス）の血清から、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３およびＩｇＡが含まれる各種の免疫グロブリンタイプを検出することができ、機能性Ｂリンパ系を再構成する効果を実現している。
実施例５ Ｂ系列再生の発生過程
ｉＲＵＮＸ１－ｐ２ａ－ＨＯＸＡ９－ｔ２ａ－ＬＨＸ２多能性幹細胞に由来のＢ系列の発生過程をさらに明確するために、フローサイトメトリーにより、図５（Ａ）に示すように、Ｂ系列種子細胞が骨髄においてｐｒｏ／ｐｒｅ－Ｂプロジェニターを再生し、さらに未成熟Ｂ細胞および成熟Ｂ細胞に発達することができることが分かった。
ｉＲＵＮＸ１－ｐ２ａ－ＨＯＸＡ９－ｔ２ａ－ＬＨＸ２多能性幹細胞に由来のＢ系列の発生過程をさらに明確するために、フローサイトメトリーにより、図５（Ａ）に示すように、Ｂ系列種子細胞が骨髄においてｐｒｏ／ｐｒｅ－Ｂプロジェニターを再生し、さらに未成熟Ｂ細胞および成熟Ｂ細胞に発達することができることが分かった。
図５（Ｂ）は、脾臓、リンパ節および腹膜腔のいずれにおいても多能性幹細胞に由来の成熟Ｂ１細胞（Ｂ１ａおよびＢ１ｂを含む）および成熟Ｂ２細胞（ＦＯ ＢとＭＺ Ｂとを含む）が存在することを示す。
レシピエントマウス（ｉＢマウス）の脾臓における初期濾胞性Ｂ細胞（ｎａｉｖｅ ＦＯ Ｂ）を選別してＢ細胞受容体（ＢＣＲ）のシークエンシングを行った。図５（Ｃ）に示すように、多能性幹細胞に由来の初期濾胞性Ｂ細胞（ｎａｉｖｅ ＦＯ Ｂ）は、重鎖および軽鎖の多様性再配列を備え、多能性幹細胞に由来のｎａｉｖｅ ＦＯ ＢのＢＣＲ多様性は、陽性対照群であるＣ５７ＢＬ／６マウスのｎａｉｖｅ ＦＯ ＢのＢＣＲ多様性に類似する。本実施例によれば、レシピエントマウスの体内の多能性幹細胞に由来するＢ系列の正常発達を証明した。
実施例６ Ｂ細胞免疫機能の検証
本実施例において、ｉＲＵＮＸ１－ｐ２ａ－ＨＯＸＡ９－ｔ２ａ－ＬＨＸ２多能性幹細胞に由来のＢ細胞が抗原特異性の抗体を生じるか否かを検証した。
本実施例において、ｉＲＵＮＸ１－ｐ２ａ－ＨＯＸＡ９－ｔ２ａ－ＬＨＸ２多能性幹細胞に由来のＢ細胞が抗原特異性の抗体を生じるか否かを検証した。
図６（Ａ）は、非Ｔ細胞依存性Ｉ型抗原（ＮＰ－ＬＰＳ）でレシピエントマウス（ｉＢマウス）を免疫させた後、多能性幹細胞に由来のＢ細胞は、抗原特異性（ａｎｔｉ－ＮＰ）ＩｇＭおよびＩｇＧ３を分泌することができることを示す。
図６（Ｂ）は、非Ｔ細胞依存性ＩＩ型抗原（ＮＰ－ＡＥＣＭ－ＦＩＣＯＬＬ）でレシピエントマウス（ｉＢマウス）を免疫させた後、多能性幹細胞に由来のＢ細胞は、抗原特異性（ａｎｔｉ－ＮＰ）ＩｇＭおよびＩｇＧ３を分泌することができることを示す。
図６（Ｃ）は、Ｔ細胞依存性抗原（ＮＰ－ＣＧＧ）でレシピエントマウスを一次免疫させ（図中のＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）、および（図中のＩＶおよびＶ）レシピエントマウス（ｉＢマウス）を二次免疫させた後、多能性幹細胞に由来のＢ細胞は、抗原特異性（ａｎｔｉ－ＮＰ）ＩｇＭおよびＩｇＧ１を分泌することができることを示す。
従って、本実施例によれば、多能性幹細胞に由来のＢ細胞は、特定の抗原に対して特異性抗体を生じることができることを証明した。
実施例７ 適応免疫応答
Ｔ細胞依存性抗原（ＮＰ－ＣＧＧ）でレシピエントマウス（ｉＢマウス）を免疫させた後、図７（Ａ）に示すように、免疫後の１４日目、フローサイトメトリーによる検出結果から、脾臓における多能性幹細胞に由来のＢ細胞は、形質細胞（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ）を形成することができ、抗原特異性の胚中心Ｂ細胞（ＮＰ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＧＣ Ｂ）を生じることができることが明らかになった。
Ｔ細胞依存性抗原（ＮＰ－ＣＧＧ）でレシピエントマウス（ｉＢマウス）を免疫させた後、図７（Ａ）に示すように、免疫後の１４日目、フローサイトメトリーによる検出結果から、脾臓における多能性幹細胞に由来のＢ細胞は、形質細胞（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ）を形成することができ、抗原特異性の胚中心Ｂ細胞（ＮＰ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＧＣ Ｂ）を生じることができることが明らかになった。
図７（Ｂ）は、免疫後の１４日目に、レシピエントマウス脾臓からＩｇＭ＋メモリーＢ細胞を検出することができ、それと同時に、多能性幹細胞に由来のＢ細胞はタイプ切替を行ってＩｇＧ１＋メモリーＢ細胞を生じることができることを示す。
図７（Ｃ）は、レシピエントマウスの骨髄において一次抗原刺激を行ってから２１日目および二次抗原刺激（一次抗原刺激を行ってから１１１日目に再び抗原刺激を行った）を行ってから１７日目に、フローサイトメトリーにより、いずれも長寿命形質細胞（ｌｏｎｇ ｌｉｖｅｄ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ）を検出することができることを示す。
そのため、本実施例によれば、レシピエントマウスの多能性幹細胞に由来のＢ細胞は、抗原刺激された後、胚中心Ｂ細胞（Ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ Ｂ、 ＧＣ Ｂ）、メモリーＢ細胞（ｍｅｍｏｒｙ Ｂ）および長寿命形質細胞を正常に形成することができ、効果的に適応免疫応答に参与することができることを証明した。
上記をまとめると、本願は、外因性ＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９和ＬＨＸ２共発現ベクターを多能性幹細胞に導入し、誘導性共発現外因性ＲＵＮＸ１、ＨＯＸＡ９およびＬＨＸ２の多能性幹細胞の構築が成功し、前記多能性幹細胞はＢ系列種子細胞へ指向性分化し、Ｂ細胞に発達する。本願の方法で得られた多能性幹細胞に由来のＢ細胞は、機能が正常であるだけでなく、腫瘍形成のリスクがなく、免疫効果を強化し、免疫不全を予防および／または治療し、感染性疾患を予防および／または治療し、腫瘍を予防および／または治療する医薬、Ｂ細胞ワクチン、およびＢ細胞分泌治療用タンパク質の細胞療法の医薬の製造に使用できる。
上記内容は、本願の具体的な実施形態のみであるが、本願の保護範囲は、それにより限定されるものではないことを、出願人より声明する。当業者であれば、いかなる当該技術分野に属する当業者が本願で開示される技術的範囲内に容易に想到可能な変更または切替は、全て本願の保護範囲および開示範囲内に含まれることを理解すべきである。
Claims (12)
- ＲＵＮＸ１遺伝子、ＨＯＸＡ９遺伝子およびＬＨＸ２遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、
発現ベクター。 - 前記ＲＵＮＸ１遺伝子、ＨＯＸＡ９遺伝子およびＬＨＸ２遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いて直列連結する、
請求項１に記載の発現ベクター。 - 前記２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む、
請求項２に記載の発現ベクター。 - 前記発現ベクター上において、ＲＵＮＸ１遺伝子をコードするヌクレオチド配列、ＨＯＸＡ９遺伝子をコードするヌクレオチド配列およびＬＨＸ２遺伝子をコードするヌクレオチド配列は順次に連結し、且つ前記ＲＵＮＸ１遺伝子をコードするヌクレオチド配列とＨＯＸＡ９遺伝子をコードするヌクレオチド配列との間はＰ２Ａヌクレオチド配列を用いて連結し、前記ＨＯＸＡ９遺伝子をコードするヌクレオチド配列とＬＨＸ２遺伝子をコードするヌクレオチド配列との間はＴ２Ａヌクレオチド配列を用いて連結する、
請求項１～３のいずれか一項に記載の発現ベクター。 - 請求項１～４のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、
好ましくは、前記宿主細胞は、多能性幹細胞であり、誘導性多能性幹細胞および／または胚胎多能性幹細胞系を含み、
好ましくは、前記多能性幹細胞は、遺伝子編集後の誘導性多能性幹細胞および／または胚胎多能性幹細胞系を含む、
宿主細胞。 - 請求項１～４のいずれか一項に記載の発現ベクターを多能性幹細胞に組み込み、耐性クローン化スクリーニングを行うステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた多能性幹細胞を誘導性生血内皮へ指向性分化するステップ（２）と、
ステップ（２）に記載の誘導性生血内皮と骨髄間質細胞とを共培養し、Ｂ系列種子細胞を得るステップ（３）と、
ステップ（３）に記載のＢ系列種子細胞を動物モデルに移し、分化させてＢ細胞を生成するステップ（４）と、を含む、
体液免疫系の再生方法。 - ステップ（１）では、前記発現ベクターを多能性幹細胞に組み込んだ部位は、ＲＯＳＡ２６部位、ＡＡＶＳ１部位、ＣＣＲ５部位、Ｈ１１部位、ＣＯＬ１Ａ１部位またはＴＩＧＲＥ部位を含み、
好ましくは、ステップ（１）に記載の組み込みの方法は、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、トランスフェクションまたはウィルス感染のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含み、相同組換えであることが好ましく、
好ましくは、ステップ（１）に記載の耐性スクリーニングは、ハイグロマイシンＢを用い、
好ましくは、ステップ（２）に記載の指向性分化方法は、Ｄ０培地、Ｄ２．５培地およびＤ６培地を順に用いて前記多能性幹細胞を培養し、前記誘導性生血内皮を取得することであり、
好ましくは、ステップ（３）に記載の骨髄間質細胞は、ＯＰ９－ＤＬ１細胞、ＯＰ９－ＤＬ４細胞、ＯＰ９細胞、ＭＳ５細胞、ＭＳ５－ＤＬ１細胞、ＭＳ５－ＤＬ４細胞、ＨＳ－５細胞、ＨＳ－５－ＤＬ１細胞、ＨＳ－５－ＤＬ４細胞、ＭＳＣ細胞、ＭＳＣ－ＤＬ１細胞、ＭＳＣ－ＤＬ４細胞のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含み、
好ましくは、ステップ（３）に記載の共培養の過程で、ドキシサイクリンを用いて誘導し、
好ましくは、ステップ（３）に記載の共培養の方法は、前記誘導性生血内皮とＯＰ９－ＤＬ１細胞をＤ１１培地で共培養し、前記Ｂ系列種子細胞を取得することである、
請求項６に記載の方法。 - 前記Ｄ０培地は、３～８ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４を含む基礎分化培地であり、
好ましくは、前記Ｄ２．５培地は、３～８ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４および３～８ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子を含む基礎分化培地であり、
好ましくは、前記Ｄ６培地は、１０～３０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン３、１０～３０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン６、１０～３０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、１０～３０ｎｇ／ｍＬのＦＭＳチロシンキナーゼ３リガンドおよび１～２μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含む基礎分化培地であり、
好ましくは、前記基礎分化培地は、１０～２０％のウシ胎仔血清、１８０～２２０μｇ／ｍＬの鉄飽和トランスフェリン、４×１０－４～５×１０－４Ｍのチオグリセロール、１～３ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ－Ｉ添加剤および３０～７０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸を含むＩＭＤＭ培地であり、
好ましくは、前記Ｄ１１培地は、１０～３０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン３、１０～３０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、１０～３０ｎｇ／ｍＬのＦＭＳチロシンキナーゼ３リガンド、１～２μｇ／ｍＬのドキシサイクリン、１０～２０％のウシ胎仔血清、１８０～２２０μｇ／ｍＬの鉄飽和トランスフェリン、４×１０－４～５×１０－４Ｍのチオグリセロール、１～３ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ－Ｉ添加剤および３０～７０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸を含むα－ＭＥＭ培地である、
請求項７に記載の方法。 - ステップ（４）に記載の分化して生成するＢ細胞は、Ｂ２２０＋ Ｂ細胞および／またはＣＤ１９＋ Ｂ細胞を含み、
好ましくは、前記分化して生成するＢ細胞は、ｐｒｏ－Ｂ細胞、ｐｒｅ－Ｂ細胞、Ｂ１細胞、Ｂ２細胞または形質細胞のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含み、
好ましくは、前記Ｂ１細胞は、Ｂ１ａ細胞および／またはＢ１ｂ細胞を含み、
好ましくは、前記Ｂ２細胞は、濾胞性Ｂ細胞および／または辺縁帯Ｂ細胞である、
請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項６～９のいずれか一項に記載の方法により製造されたＢ系列種子細胞またはＢ細胞。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の発現ベクター、請求項５に記載の宿主細胞、請求項１０に記載のＢ系列種子細胞またはＢ細胞のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む医薬組成物であって、
好ましくは、前記医薬組成物は、医薬的に許容される補助材料をさらに含む、
医薬組成物。 - 請求項１１に記載の医薬組成物の、免疫応答を強化する医薬、疾患を予防および／または治療する医薬、Ｂ細胞免疫療法で腫瘍を治療する医薬、Ｂ細胞ワクチンまたはＢ細胞分泌治療用タンパク質の細胞療法の医薬の製造における使用であって、
好ましくは、前記免疫応答を強化する医薬は、Ｂ細胞免疫応答および／またはＴ細胞免疫応答を強化する医薬を含み、
好ましくは、前記疾患を予防および／または治療する医薬は、Ｂ細胞免疫不全、感染性疾患、腫瘍を予防および／または治療する医薬を含み、
好ましくは、前記Ｂ細胞分泌治療用タンパク質の細胞療法の医薬は、自己免疫疾患、遺伝子遺伝性疾患を予防および／または治療する医薬を含み、
好ましくは、前記Ｂ細胞分泌治療用タンパク質は、抗体を含み、
好ましくは、前記遺伝子遺伝性疾患は、血友病、リソソーム蓄積症、低ホスファターゼ症またはフェニルケトン尿症のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む、使用。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110552087 | 2021-05-20 | ||
| CN202110552087.3 | 2021-05-20 | ||
| CN202210234297.2 | 2022-03-10 | ||
| CN202210234297.2A CN115418373A (zh) | 2021-05-20 | 2022-03-10 | 一种体液免疫系统再生的方法及其应用 |
| PCT/CN2022/085730 WO2022242359A1 (zh) | 2021-05-20 | 2022-04-08 | 一种体液免疫系统再生的方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024518632A true JP2024518632A (ja) | 2024-05-01 |
Family
ID=84141073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023572007A Pending JP2024518632A (ja) | 2021-05-20 | 2022-04-08 | 体液免疫系の再生方法およびその使用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2024518632A (ja) |
| WO (1) | WO2022242359A1 (ja) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6005666B2 (ja) * | 2011-02-08 | 2016-10-12 | セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド | プログラミングによる造血前駆細胞の生産 |
| DK3365435T3 (da) * | 2015-10-20 | 2021-04-06 | Fujifilm Cellular Dynamics Inc | Produktion af hæmatopoietiske prækursorceller med multi-afstamning med genetisk programmering |
| CA3094322A1 (en) * | 2017-03-20 | 2018-09-27 | Washington University | Cells and methods of uses and making the same |
| JP2021516049A (ja) * | 2018-03-01 | 2021-07-01 | ザ ユニバーシティ オブ カンザス | 組換えｔ細胞受容体遺伝子を用いて細胞ベースの治療薬を製造するための技法 |
| CN114181968B (zh) * | 2022-02-11 | 2022-07-19 | 北京干细胞与再生医学研究院 | 一种具备b谱系分化潜能的人造血祖细胞的制备方法及其应用 |
-
2022
- 2022-04-08 JP JP2023572007A patent/JP2024518632A/ja active Pending
- 2022-04-08 WO PCT/CN2022/085730 patent/WO2022242359A1/zh active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022242359A1 (zh) | 2022-11-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107922925B (zh) | 用于自然杀伤细胞扩增的方法 | |
| JP6339998B2 (ja) | 幹細胞よりナチュラルキラー細胞を発生させる方法 | |
| KR102510368B1 (ko) | 혈관 콜로니 형성 세포 | |
| Dwarshuis et al. | Cells as advanced therapeutics: State-of-the-art, challenges, and opportunities in large scale biomanufacturing of high-quality cells for adoptive immunotherapies | |
| ES2685969T3 (es) | Células formadoras de colonias hemangioblásticas y células hemangioblásticas no injertables | |
| KR101445337B1 (ko) | 지방 흡인 후의 지방흡인물로부터 조혈모세포의 분리 및 정제 | |
| KR102292843B1 (ko) | 역분화줄기세포(iPSC) 유래 자연 살해 세포 및 이의 용도 | |
| CN114181968B (zh) | 一种具备b谱系分化潜能的人造血祖细胞的制备方法及其应用 | |
| WO2012133948A1 (ja) | 生体組織から単離できるssea-3陽性の多能性幹細胞を含む他家移植用細胞治療用組成物 | |
| JP6942466B2 (ja) | 抗原特異的ｔ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞の製造方法 | |
| JP7098187B2 (ja) | 多能性幹細胞及びその分化したｔ細胞と使用 | |
| JP5745419B2 (ja) | 細胞、核酸構築物、前記構築物を含む細胞、及び疾患の治療において前記細胞を利用する方法 | |
| JP2024518632A (ja) | 体液免疫系の再生方法およびその使用 | |
| TW200540270A (en) | Medium for feeder-free differentiation and feeder-free differentiation method from primate embryonic stem cell | |
| Zheng et al. | Generating hematopoietic cells from human pluripotent stem cells: approaches, progress and challenges | |
| WO1999003980A1 (fr) | Cellules de stroma derivees d'agm | |
| CN115418373A (zh) | 一种体液免疫系统再生的方法及其应用 | |
| KR20120019898A (ko) | 세포응집을 이용한 인간 혈액 유래 혈구 세포괴의 유도와 이를 이용한 혈중 성체줄기세포 및 전구세포의 증폭방법 및 상기의 방법에 의해 제조된 줄기세포 | |
| Nakamura | In vitro production of transfusable red blood cells | |
| JP2007238473A (ja) | 造血幹細胞の維持増幅を促進する因子及び造血幹細胞の増幅方法 | |
| WO2006085482A1 (ja) | 造血幹細胞の自己複製因子及び増幅方法 | |
| CN116479041A (zh) | 一种基因构建体以及产生多谱系造血干祖细胞的方法 | |
| Chen | Lymphoid Cells | |
| CN117778315A (zh) | 一种t细胞的制备方法 | |
| WO2024073665A1 (en) | Scalable expansion of cd71+ erythroid progenitor cells for cell therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20240119 |