CN117778315A - 一种t细胞的制备方法 - Google Patents

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CN117778315A CN202311309570.4A CN202311309570A CN117778315A CN 117778315 A CN117778315 A CN 117778315A CN 202311309570 A CN202311309570 A CN 202311309570A CN 117778315 A CN117778315 A CN 117778315A
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刘晓东
贺智勇
马小雪
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Abstract

本发明涉及一种T细胞的制备方法，该方法包括形成HSPC，使得所述HSPC分化得到T细胞。本发明还涉及通过该方法制备得到的T细胞、包含该T细胞的组合物以及该T细胞或组合物的用途。

Description

一种T细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是涉及一种T细胞的制备方法，具体涉及一种从诱导的多能干细胞（iPSC）分化为T细胞的方法。
背景技术
T细胞是人体免疫系统的关键效应细胞，可用作再生医学和癌症免疫疗法的治疗剂。在人类中，T细胞由骨髓来源的造血祖细胞发育并在胸腺中成熟，成熟的典型特征是T细胞受体-CD3复合物、辅助受体CD4或CD8和协同刺激受体如CD80的表面表达。
传统的CD4+和CD8+ T细胞与适应性免疫有关，并且通常根据它们的辅助性、细胞毒性或调节功能分为不同亚群。这些T细胞也可以根据它们的活化阶段和标志物表达谱分为包括初始T细胞、效应T细胞和记忆性T细胞在内的亚群。在抗原刺激下，CD4+ T细胞进一步分化为各种辅助细胞亚群（如Th1、Th2、Th17等），而CD8+ T细胞释放前炎症细胞因子（如干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α）和溶细胞颗粒（穿孔素和颗粒酶）。除了传统的T细胞外，还有各种具有独特抗肿瘤活性的先天样T细胞群，包括γδ T细胞和自然杀伤T细胞。这些不同的T细胞亚群共同协调介导针对感染和癌症的免疫反应。
现已开发的免疫治疗策略，以参与宿主T细胞介导的对癌症的免疫反应。这种疗法包括使用各种类型的体外扩增T细胞，如肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）和用嵌合抗原受体（CAR）改造的肿瘤重定向T细胞。目前生产CAR-T细胞疗法的方法需要患者T细胞的个体化分离和体外工程，这与广泛临床应用的许多限制有关，例如高成本、低效和不安全生产、免疫缺陷患者的有限剂量以及T细胞适合度的内在变化。此外，原代人类T细胞体外扩增的潜力有限，在细胞培养过程中会逐渐耗尽。相比之下，诱导的多能干细胞（iPSC）可以在体外几乎无限增殖，同时保持其多能性和多谱系分化潜能，使其成为一种有吸引力的细胞来源，从中产生无限量的CAR-T细胞产品。因此，从iPSC中产生“现成的”CAR-T细胞产品可以克服这些临床限制，这似乎是合理的。iPSC的进一步基因工程化也已被证明是一种可行的策略，以获得iPSC衍生的T细胞（iT）产物，其具有增强的治疗特征，如扩大的免疫相容性、改善抗肿瘤活性以及体内持久性。综上所述，iT细胞代表了过继性T细胞免疫疗法的一种有前途的方法。
发明内容
发明要解决的问题
如何提供一种适于大规模生产的T细胞的制备方法，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
用于解决问题的方案
本发明提供了一种制备T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了CHIR 99021的培养基中，诱导多能干细胞（iPSC）分化成胚状体（EB）；
b. 诱导步骤a中形成的EB分化成造血干细胞和祖细胞（HSPC）；
c. 诱导步骤b中形成的HSPC分化为T细胞；
其中，所述步骤a包括：
（a1）在CHIR 99021和Rki的存在下，在第0天进行诱导；
（a2）在CHIR 99021的存在下，在第1天再次进行诱导。
优选地，所述步骤b包括：
（b1）在补充了BMP4、FGF2、VEGF的造血分化培养基中悬浮培养EB；
（b2）在补充了BMP4、SCF、FGF2、VEGF和SB431542的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；
（b3）在补充了SCF、FGF2和VEGF的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成HSPC。
优选地，所述步骤（a）是在第0-1天进行，所述步骤（b1）是在第2-3天进行，所述步骤（b2）是在第4-5天进行，所述步骤（b3）是在第6-7天进行。
优选地，所述HSPC具有CD34+表型。
优选地，所述步骤c包括：
将步骤b中形成的HSPC加入T细胞分化培养基中，并在预先包被有人Delta样配体4-Fc（hDLL4-Fc）的组织培养板中进行细胞培养，得到T细胞。
优选地，所述T细胞分化培养基含有αMEM、胎牛血清（FBS）、SCF、FLT3L、IL-3、IL-7、ITS-G、P/S、GlutaMaX、β-巯基乙醇、TPO和抗坏血酸中的一种或多种。
优选地，所述T细胞分化培养基含有83wt% αMEM、15wt%胎牛血清（FBS）、1wt% ITS-G、1wt% P/S、2 mM GlutaMaX、1-100 μM β-巯基乙醇、1-100 ng/mL SCF、50-200 ng/mLTPO、1-100 mg/mL抗坏血酸、1-50 ng/mL IL-3、1-100 ng/mL IL-7和1-100 ng/mL FLT3L。
优选地，步骤c中所述细胞培养是培养25-35天。
本发明还提供了一种根据所述方法制备得到的T细胞。
本发明还提供了一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含所述T细胞和药学上可接受的赋形剂。
本发明还提供了一种根据所述T细胞或所述药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
优选地，所述肿瘤选自维尔姆斯瘤、尤文肉瘤、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、皮肤癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和膀胱癌中的一种或多种。
发明的效果
本发明通过在合适的条件下进行分步体外培养iPSC，成功地实现了向HSPC的高效分化，所获得的培养产品不含异源物质，同时还具有分化时间更短、效率更高的优势。
本发明提供了一种从iPSC诱导分化T细胞的方法，所述方法包括几种试剂和细胞因子的组合，适于大规模生产。
附图说明
图1为iT细胞分化示意图，由人诱导多能干细胞分化出中胚层胚状体（EB）、造血胚状体的生成以及随后分化成iT细胞。
图2为使用iPSC生产HSPC的分化方案示意图，利用细胞因子和添加时间的变化从iPSC产生HSPC。
图3为HSPC分化过程中的代表性明场图像，箭头表示悬浮液中CD34+造血干细胞的出现。
图4为HSPC标志物的流式细胞术分析，A）用于流式细胞术分析的HSPC细胞门控的代表，HSPC细胞在条件6的第8天被鉴定为CD235a-CD14-CD43+CD34+；B）用于流式细胞术分析的HSPC细胞门控的代表，HSPC细胞在条件6的第10天被鉴定为CD235a-CD14-CD43+CD34+。
图5为从iPSC生产的CD34+CD43+HSPC，两个独立的iPSC系（IBX和CNTB）在各种条件下分化，在第8天收获EB外源性的非粘附细胞，并通过流式细胞术测定CD34+CD43+HSPC的比例。A）第8天的IBX iPSC；B）第8天的CNTB iPSC。
图6显示了iPSC培养阶段代表性明场图像。
图7为CHIR99021的添加时间1天vs 2天的比较结果。
图8显示了细胞稳定性实验结果。
图9为iT细胞分化过程中的代表性图像。A）体外扩增前后iPSC、造血型胚状体、iT细胞祖细胞（pro-T细胞阶段）和成熟iT细胞的代表性图像；B）从2个独立的iPSC系分化和扩增的iT细胞的代表性图像。所有比例尺代表100µm。
图10显示了从iPSC产生造血干细胞（HPC）。A）来自iPSC系#1和#2的iHPCs的代表性图像，所有的比例尺代表100 µm；B）流式细胞仪分析对从2个独立的iPSC系产生的造血祖细胞（HPC）上的造血标志物CD34和CD43的分析。来自两种细胞系的HPC均显示CD34（>92%）和CD43（>99%）的高表达。
图11显示了iT细胞可以在体外扩增，用抗CD3抗体刺激从iPSC细胞系#1和#2分化的iT细胞3天，体外扩增评估达11天。iT细胞的扩增能力与在相同条件下刺激和培养的原代CD4+和CD8+ T细胞相当。
图12显示了在分化的iT细胞培养物中没有残留的iPSC。多能性标志物OCT4、NANOG、SOX2、TRA-1-60和T细胞谱系标志物GATA3、BCL11B和RUNX1在iPSC细胞系、原代T细胞和iT细胞中的表达的qRT-PCR分析图。与iPSC和原代T细胞相比，iT细胞不表达在iPSC中高表达的多能性标志物，并显示T谱系标志物的高表达。
图13显示了iT细胞在体外受到刺激时产生细胞因子。用PMA/离子霉素刺激原代T细胞和iT细胞16小时，并通过细胞内染色和流式细胞仪分析评估特征效应细胞因子IFNγ和TNFα的产生。与原代CD8+ T细胞相比，从两种iPSC细胞系分化的iT细胞产生的IFNγ和TNFα水平相似。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。其中，附图不一定是按比例绘制的，局部特征可以被放大或缩小，以更加清楚的显示局部特征的细节；除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。
如本文所用，术语“一个/一种（a）”或“一个/一种（an）”是指一个/一种或多个/一种，例如，“一个/一种分子”应当理解为代表一个/一种或多个/多种 分子。因此，术语“一个/一种（a）”或“一个/一种（an）”、“一个/一种或多个/多种”和“至少一个/至少一种”在本文中可以互换使用。
在本发明的权利要求书和说明书中，除非上下文由于表达语言或必要的暗示而另有要求，否则“包含/包括（comprise）”一词或诸如“包含/包括（comprises）”或“包含/包括（comprising）”等变体以包含的意义使用，即规定存在所述特征，但不排除在本发明的各种实施方案中存在或添加其他特征。
如本文所用，术语“约”涵盖给定数值的±25％幅度的范围值。在其他实施方案中，术语“约”涵盖给定数值的±20％、±15％、±10％或±5％幅度的范围值。例如，在一个实施方案中，“约3克”表示2.7-3.3克（即3克±10％）等的值。
类似地，虽然产生T细胞的方法包括有序的、连续的事件，但事件的时机可以改变例如至少25％。例如，虽然在一个实施方案中可以将具 体步骤公开为持续一天，但该事件可以持续多于或少于一天。例如，“一天”可包括约18至约30小时的时间段。在其他实施方案中，时间段可以按该时间段的±20％、±15％、±10％或±5％变化。指示为多天的时间段可以是“一天”的倍数，例如两天可以跨越约36小时到约60小时的时间段等。在另一个实施方案中，可以减少时间变化，例如，第2天是从第0天开始的48±3小时；第4天是从第0天开始的96±3小时，第5天是从第0天开始的120小时±3小时。
如本文所用，术语“多能干细胞”或“PSC”是指这样的细胞，其能够无限复制自身并分化成形成组织或器官的一部分或三个胚层（内胚层、中胚层或外胚层）中的任何一个的所有细胞。多能干细胞有两种主要类型：胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”或“ESC”是指从已完成体外受精治疗并具 有剩余胚胎的患者经同意捐赠的5-7天胚胎中分离的细胞。从人类胚胎中提取细胞的伦理问题在一定程度上阻碍了ESC的使用。
合适的人类PSC包括H1和H9人类胚胎干细胞。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指衍生自成体细胞的ESC样细胞。iPSC具有与ESC非常相似的特征，但避免了与ESC相关的伦理问题，因为iPSC不是衍生自胚胎。相反，iPSC通常衍生自已经“重编程”回多能状态的完全分化的成体细胞。该重编程步骤通常涉及以特定时间间隔和以某些浓度使用重编程因子。将成体细胞重编程回多能状态的一些示例性方法涉及使用施用于成体细胞培养物的RNA、蛋白质或其他小分子。或者，人类iPSC系也可商业获得。
合适的人类iPSC包括但不限于衍生自成纤维细胞的iPSC 19-9-7T、 MIRJT6i-mND1-4和MIRJT7i-mND2-0以及衍生自骨髓单核细胞的iPSC BM119-9。其他合适的iPSC可以从美国威斯康星州麦迪逊的Cellular Dynamics International获得。
如本文所用，由iPSC定向分化获得的EB称为“iEB”或诱导EB细胞。
如本文所用，由iPSC定向分化获得的HSPC称为“iHSPC”或诱导HSPC细胞。
如本文所用，由iPSC定向分化获得的T细胞称为“iT”或诱导T细胞。
如本文所用，术语“分化”是指细胞从一种细胞类型转变为另一种细胞类型的过程，特别是较少特化类型的细胞变成更特化类型的细胞。
如本文所用，术语“培养基（medium）”或其复数“培养基（media）”是指设计成支持细胞生长的液体或凝胶。
PSC向T细胞的分化通常在受控条件下进行，特别是当生成的T细胞旨在按照良好操作规范（GMP）施用于人类个体时。该过程的初始步骤涉及在例如组织培养板或培养皿上或生物反应器内培养培养中的PSC。鉴于能够在临床级别扩大T细胞生产以进行过继转移，生物反应器的使用特别有吸引力。然而，利用组织培养板或培养皿的方案也可以被适当扩大，用于过继T细胞转移。
将PSC培养在特定培养基中。合适的基础培养基包括但不限于Iscove改良的Dulbecco培养基（Iscove’s Modified Dulbecco's Medium）/F12（IMDM/F12）、不含FGF2和TGF-β的TeSR1基础培养基（mTeSR1TM基础培养基，Stem Cell Technologies）；DF4S基础培养基，即Essential 8TM培养基（Life Technologies；也称为“E8”培养基）。细胞培养基可以补充其他生长因子，以提高PSC的克隆效率和单细胞存活。可以使用的示例性补充剂是CloneR（Stem Cell Technologies）。一旦PSC达到所需的汇合度，就可以收集细胞并接种和平板接种以形成胚状体。
尽管本发明公开的培养基可包括特定成分（例如形态发生素、小分子和造血细胞因子），但预期除了或替代所公开的那些成分之外，还可以使用具有相同、等同或相似特性的其他成分，这在本领域中是已知的。
如本文所用，“胚状体”（EB）是指由PSC组成的漂浮的三维聚集体。EB包括造血型EB，它是能够形成内皮祖细胞和血液祖细胞的EB。本领域已知生成EB的各种方法。例如，传统方法通常涉及生成PSC的单细胞悬浮液。然后可以将PSC培养在未包被的非组织培养处理的培养皿或微孔中，以防止PSC附着，从而在保持悬浮的同时促进细胞聚集。或者，可以将PSC培养在低附着培养皿或微孔中。较新的形成EB的方法涉及使用自旋聚集或生物反应器，从而提高效率和过程控制。ROCK抑制剂，例如Y-27632，也已被证明可以促进PSC聚集，从而导致EB的形成。EB具有类似于发育中胚胎的畸胎瘤样结构，并且EB的形成是建立从三个胚层中的任何一层分化为细胞的常用平台。
如本文所用，术语“造血干细胞和祖细胞”或“HSPC”是指定型为造血谱系，但能够进一步造血分化的细胞，且包含多潜能造血干细胞（血胚细胞）、骨髓祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴祖细胞。造血干细胞和祖细胞是多潜能干细胞，其产生所有血细胞类型，包含骨髓（单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞）和淋巴谱系（T细胞、B细胞、NK细胞）。
在一些实施方案中，以约10,000个细胞/cm2至约40,000个细胞/cm2 的初始密度，例如10,000个细胞/cm2、15,000个细胞/cm2、20,000个细胞 /cm2、25,000个细胞/cm2、30,000个细胞/cm2、35,000个细胞/cm2或 40,000个细胞/cm2，对PSC平板接种，以生成EB。
一旦EB形成，就将EB培养在包含T分化因子的分化培养基中，以促进分化为T细胞。使用的EB数量取决于所用的组织培养板、组织培养皿或生物反应器的类型。例如，如果使用6孔板，则可以对约10-30个EB平板接种。然而，本领域技术人员将理解，根据所使用的组织培养板、组织培养皿或生物反应器的表面积，确定待平板接种的EB的最佳数量的方法是本领域已知的。
在某些实施方式中，分化培养基或扩增培养基可以是不含异种物质的，并且掺入从天然来源，例如从胎盘或其他人组织中分离的人蛋白质， 或者可以使用重组技术产生的人蛋白质。在某些实施方式中，本文所述的所有蛋白质都是人类的。在某些实施方式中，分化培养基或扩增培养 基中使用的所有蛋白质都是人蛋白质。在某些实施方式中，分化培养基或扩增培养基中使用的所有蛋白质都是人蛋白质。在某些实施方式中，本文所述的所有蛋白质都是人重组蛋白质。在某些实施方式中，分化培养基或扩增培养基中使用的所有蛋白质都是重组人蛋白质。
本文所述的所有蛋白质是本领域技术人员已知的，并且本文所述的大部分蛋白质都可商业获得。
本领域技术人员将理解，根据具体情况，可以以固定或变化的间隔更换细胞培养基。当细胞保持在培养中时，可能会生成有毒代谢物，培养的细胞会不断利用养分，其数量在扩增阶段稳步增加。因此，可以用新鲜的细胞培养基代替旧的细胞培养基。
在某些实施方式中，可以约每2天、约3天、约4天、约5天、约6 天、约7天、约8天、约9天或约10天更换分化培养基或扩增培养基。
一旦T细胞群变得更加成熟，和/或足够数量的PSC已经分化为T细胞，就需要更多的培养基更换，以补充不断增长和成熟的T细胞群。在一些实施方案中，该时间段为约10-20天。在这个阶段之后，可以约每1天、约2天或约3天更换分化培养基或扩增培养基。
培养物中T细胞的数量可以通过本领域已知的多种方法确定。例如，可以使用流式细胞术或显微术。如果使用流式细胞术。
在某些实施方式中，细胞培养基中特定细胞因子、趋化因子、蛋白质、信号因子和生长因子的补充在限定的时间间隔内发生，之后停止这些因子的补充。
在某些实施方式中，在约5-20天后停止补充细胞培养基中特定细胞因子、趋化因子、蛋白质、信号因子和生长因子。例如，可以在约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13 天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天或约20后天停止补充特定因子。
在某些实施方式中，在定义的间隔后停止补充一种或多种以下因子：IL-3、SCF、IL-7、IL-15、FLT3L和IL-2。
如本文所用，术语“T细胞的制备”或“制备T细胞的方法”或者相当的术语指产生T细胞的治疗性组合物的方法，所述制备方法可以包括以下步骤中的一个或多个或者全部：收获、刺激、活化和扩增。
如本文所用，术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公知的，并且旨在包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、未成熟的T淋巴细胞、成熟的T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或者活化的T淋巴细胞。T细胞可以是辅助性T（Th）细胞，例如辅助性T1（Th1）或辅助性T2（Th2）细胞。T细胞可以是辅助性T细胞（HTL；CD4+T细胞）CD4+T细胞、细胞毒性T细胞（CTL；CD8+T细胞）、肿瘤浸润细胞毒性T细胞（TIL；CD8+T细胞）、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞或者T细胞的任何其它亚群。适合于具体实施方案中的其它示例性T细胞群包括初始T细胞和记忆T细胞。
如本文所用，术语“药物组合物”是指已配制成用于施用于个体的包含本文所述T细胞或T细胞群的组合物。优选地，所述药物组合物是无菌的。在某些实施方式中，所述药物组合物是无热原的。
如本文所用，术语“有效量”是指T细胞或T细胞群有效治疗个体的疾病状况、疾病或病症的量。
如本文所用，术语“治疗（treat）”、“治疗（treating）”或“治疗（treatment）”是指治疗性治疗和防预性（prophylactic）或预防性（preventative）措施，其中目的是预防或改善个体的疾病状况、疾病或病症，或减缓（减轻）个体的疾病状况、疾病或病症的进展。需要治疗的个体包括已经患有疾病状况、疾病或病症的个体以及待预防疾病状况、疾病或病症的个体。
如本文所用，术语“预防（prevent）”、“预防（preventation）”、“预防性（preventative）”或“防预性”是指防止疾病状况、疾病或病症的发生，或阻止、防御或抵挡住其发生，包括异常或症状。需要预防的对象可能易于发展所述疾病状况、疾病或病症。
如本文所用，术语“改善（ameliorate）”或“改善（amelioration）”是指包括异常或症状在内的疾病状况、疾病或病症的减少、减轻或消除。需要治疗的个体可能已经患有所述疾病状况、疾病或病症，或者可能易于患有所述疾病状况、疾病或病症，或者可能是待预防所述疾病状况、疾病或病症。
如本文所用，术语“个体”是指哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类动物，特别是人类，或者可以是家畜、动物园动物或伴侣动物。尽管特别考虑本文公开的方法及其所得T细胞或T细胞群适合人类的医学治疗，但它们也适用于兽医治疗，包括治疗诸如马、牛和羊等家畜，诸如狗和猫等伴侣动物，或诸如猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄类动物等动物园动物。
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的范围限制；实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。表1为本申请所使用的全部或部分试剂。
表1
试剂 供应商 目录号
StemScale PSC悬浮培养基 ThermoFisher A4965001
Y27632 Tocris 1254
CHIR99021 Sigma SML1046
Stemline II造血干细胞扩增培养基 Sigma S0192
青霉素-链霉素双抗溶液(P/S) ThermoFisher 15140122
GlutaMAX补充剂 ThermoFisher 35050061
L-抗坏血酸 Sigma-Aldrich A4544
ITS-G ThermoFisher 41400045
BMP4 Miltenyi Biotec 130-111-167
FGF2 Miltenyi Biotec 130-093-564
VEGF Miltenyi Biotec 130-109-396
SB431542 Tocris 1614 / TB1614-GMP
SCF Miltenyi Biotec 130-096-695
β-巯基乙醇 ThermoFisher 21985023
IL-7 Miltenyi Biotec 130-095-362
IL-15 Miltenyi Biotec 130-095-764
IL-12 Miltenyi Biotec 130-096-705
IL-21 Peprotech 200-21-250UG
IL-18 MBL B001-5
TL-1A Peprotech 310-23
Z-VAD R&D FMK001
FLT3L Miltenyi Biotec, 130-096-477
hDLL4-Fc Sino Biological 10171-H02H
Accutase Stem Cell Technologies 07922
CryoStor® CS10 Stem Cell Technologies 07930
重组人纤连蛋白（Retronectin） Takara Bio T100A
DPBS ThermoFisher 14190-144
本发明提供了一种制备T细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了CHIR 99021的培养基中，诱导多能干细胞（iPSC）分化成胚状体（EB）；
b. 诱导步骤a中形成的EB分化成造血干细胞和祖细胞（HSPC）；
c. 诱导步骤b中形成的HSPC分化为T细胞；
其中，所述步骤a包括：
（a1）在CHIR 99021和Rki的存在下，在第0天进行诱导；
（a2）在CHIR 99021的存在下，在第1天再次进行诱导。
在某些实施方式中，所述步骤b包括：
（b1）在补充了BMP4、FGF2、VEGF的造血分化培养基中悬浮培养EB；
（b2）在补充了BMP4、SCF、FGF2、VEGF和SB431542的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；
（b3）在补充了SCF、FGF2和VEGF的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成HSPC。
在某些实施方式中，所述EB为iEB。
在某些实施方式中，所述HSPC为iHSPC。
在某些实施方式中，所述T细胞为iT细胞。
在某些实施方式中，所述方法在制备的过程中无需滋养层。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述培养基选自StemScale PSC、Essential 8、KSR/FGF2、mTeSR、AKIT或B8中的一种或多种。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述培养基为StemScale PSC。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为0.1-100µM。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为0.2-50µM。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为0.5-25µM。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为1-20µM。
在某些实施方式中，步骤（a）中所述CHIR 99021的浓度为约约1 μM、约2 μM、约3 μM、约4 μM、约5 μM、约6 μM、约7 μM、约8 μM、约9 μM、约10 μM、约11 μM、约12 μM、约13 μM、约14 μM、约15 μM、约16 μM、约17 μM、约18 μM、约19 μM或约20 μM。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基还含有P/S、GlutaMaX、抗坏血酸或ITS-G中的一种或多种。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基含有1wt% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1wt% ITS-G、1-100 ng/mL BMP4、1-100 ng/mL FGF2和1-100 ng/mL VEGF。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基中BMP4的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基中FGF2的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b1）中所述培养基中VEGF的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基还含有P/S、GlutaMaX、抗坏血酸和ITS-G中的一种或多种。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基含有1wt% P/S、2mM GlutaMaX、50 μg/ml抗坏血酸、1wt% ITS-G、1-100 ng/mL BMP4、1-100 ng/mL SCF、1-100 ng/mL FGF2、1-100ng/mL VEGF和1-20 μM SB431542。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中BMP4的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中SCF的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中FGF2的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中VEGF的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b2）中所述培养基中SB431542的浓度为约1 μM、约2 μM、约3 μM、约4 μM、约5 μM、约6 μM、约7 μM、约8 μM、约9 μM、约10 μM、约11 μM、约12 μM、约13μM、约14 μM、约15 μM、约16 μM、约17 μM、约18 μM、约19 μM或约20 μM。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基还含有P/S、GlutaMaX、抗坏血酸或ITS-G中的一种或多种。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基含有1wt% P/S、2mM GlutaMaX、50 μg/ml抗坏血酸、1wt% ITS-G、1-100 ng/mL SCF、1-100 ng/mL FGF2和1-100 ng/mL VEGF。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基中SCF的浓度为约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基中FGF2的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，步骤（b3）中所述培养基中VEGF的浓度为约10 ng/mL、约20ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述步骤（a）是在第0-1天进行。
在某些实施方式中，所述步骤（a）是在第0天或第1天进行。
在某些实施方式中，所述步骤（b1）是在第2-3天进行。
在某些实施方式中，所述步骤（b1）是在第2天或第3天进行。
在某些实施方式中，所述步骤（b2）是在第4-5天进行。
在某些实施方式中，所述步骤（b2）是在第4天或第5天进行。
在某些实施方式中，所述步骤（b3）是在第6-7天进行。
在某些实施方式中，所述步骤（b3）是在第6天或第7天进行。
在某些实施方式中，所述HSPC具有CD34+表型。
在某些实施方案中，所述HSPC具有CD34+CD43+表型。
在某些实施方案中，所述HSPC具有CD235a-CD14-CD43+CD34+表型。
在某些实施方式中，所述步骤c包括：
将步骤b中形成的HSPC加入T细胞分化培养基中，并在预先包被有人Delta样配体4-Fc（hDLL4-Fc）的组织培养板中进行细胞培养，得到T细胞。
在某些实施方式中，所述T细胞分化培养基含有αMEM、胎牛血清（FBS）、SCF、FLT3L、IL-3、IL-7、ITS-G、P/S、GlutaMaX、β-巯基乙醇、TPO和抗坏血酸中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述T细胞分化培养基中β-巯基乙醇的浓度为约1 μM、约5 μM、约10 μM、约15 μM、约20 μM、约25 μM、约30 μM、约35 μM、约40 μM、约45 μM、约50 μM、约55 μM、约60 μM、约65 μM、约70 μM、约75 μM、约80 μM、约85 μM、约90 μM、约95 μM或约100μM。
在某些实施方式中，所述T细胞分化培养基中SCF的浓度为约1 ng/mL、约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述T细胞分化培养基中TPO的浓度为约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL、约100 ng/mL、约110 ng/mL、约120 ng/mL、约130ng/mL、约140 ng/mL、约150 ng/mL、约160 ng/mL、约170 ng/mL、约180 ng/mL、约190 ng/mL或约200 ng/mL。
在某些实施方式中，所述T细胞分化培养基中抗坏血酸的浓度为约1 mg/mL、约10mg/mL、约20 mg/mL、约30 mg/mL、约40 mg/mL、约50 mg/mL、约60 mg/mL、约70 mg/mL、约80mg/mL、约90 mg/mL或约100 mg/mL。
在某些实施方式中，所述T细胞分化培养基中IL-3的浓度为约1 ng/mL、约2 ng/mL、约3 ng/mL、约4 ng/mL、约5 ng/mL、约6 ng/mL、约7 ng/mL、约8 ng/mL、约9 ng/mL、约10ng/mL、约11 ng/mL、约12 ng/mL、约13 ng/mL、约14 ng/mL、约15 ng/mL、约16 ng/mL、约17ng/mL、约18 ng/mL、约19 ng/mL、约20 ng/mL、约21 ng/mL、约22 ng/mL、约23 ng/mL、约24ng/mL、约25 ng/mL、约26 ng/mL、约27 ng/mL、约28 ng/mL、约29 ng/mL、约30 ng/mL、约31ng/mL、约32 ng/mL、约33 ng/mL、约34 ng/mL、约35 ng/mL、约36 ng/mL、约37 ng/mL、约38ng/mL、约39 ng/mL、约40 ng/mL、约41 ng/mL、约42 ng/mL、约43 ng/mL、约44 ng/mL、约45ng/mL、约46 ng/mL、约47 ng/mL、约48 ng/mL、约49 ng/mL或约50 ng/ mL。
在某些实施方式中，所述T细胞分化培养基中IL-7的浓度为约1 ng/mL、约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述T细胞分化培养基中FLT3L的浓度为约1 ng/mL、约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述T细胞分化培养基含有83wt% αMEM、15wt%胎牛血清(FBS)、1wt% ITS-G、1wt% P/S、2 mM GlutaMaX、1-100 μM β-巯基乙醇、1-100 ng/mL SCF、50-200 ng/mL TPO、1-100 mg/mL抗坏血酸、1-50 ng/mL IL-3、1-100 ng/mL IL-7和1-100ng/mL FLT3L。
在某些实施方式中，步骤c中所述细胞培养是培养25-35天。
在某些实施方式中，步骤c中所述细胞培养是培养约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、约30天、约31天、约32天、约33天、约34天或约35天。
在某些实施方式中，所述T细胞的制备方法还包括以下步骤：
d. 扩增所述步骤c制备得到的T细胞。
在某些实施方式中，所述步骤d包括：
（d1）将c步骤制备得到的T细胞加入T细胞成熟培养基中，并在预先包被有抗CD3单克隆抗体和Retronectin的平板中进行细胞培养；
（d2）将步骤（d1）制备得到的细胞加入T细胞增殖培养基中，并在没有预先包被有抗CD3单克隆抗体和Retronectin的平板中进行细胞培养。
在某些实施方式中，所述T细胞成熟培养基含有FBS、ITS-G、P/S、抗坏血酸、IL-7和IL-15中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述T细胞分化培养基中IL-7的浓度为约1 ng/mL、约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述T细胞分化培养基中IL-15的浓度为约1 ng/mL、约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述T细胞成熟培养基含有15wt% FBS、1wt% ITS-G、1wt% P/S、50 mg/mL抗坏血酸、10 ng/mL IL-7和10 ng/mL IL-15。
在某些实施方式中，所述T细胞增殖培养基含有FBS、P/S、抗坏血酸、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12、IL-18、TL-1A和Z-VAD中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述T细胞增殖培养基中IL-7的浓度为约1 ng/mL、约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述T细胞增殖培养基中IL-15的浓度为约1 ng/mL、约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述T细胞增殖培养基中IL-21的浓度为约1 ng/mL、约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述T细胞增殖培养基中IL-12的浓度为约1 ng/mL、约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述T细胞增殖培养基中IL-18的浓度为约1 ng/mL、约10 ng/mL、约20 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL、约60 ng/mL、约70 ng/mL、约80 ng/mL、约90 ng/mL或约100 ng/mL。
在某些实施方式中，所述T细胞增殖培养基含有15wt% FBS、1wt% P/S、50 mg/mL抗坏血酸、10 ng/mL IL-7、10 ng/mL IL-15、20 ng/mL IL-21、50 ng/mL IL-12、50 ng/mLIL-18、50 ng/mL TL-1A和10 μm Z-VAD。
在某些实施方式中，步骤d1中所述细胞培养是培养2-4天。
在某些实施方式中，步骤d1中所述细胞培养是培养约2天、约3天或约4天。
在某些实施方式中，步骤d2中所述细胞培养是培养8-10天。
在某些实施方式中，步骤d2中所述细胞培养是培养约8天、约9天或约10天。
本发明还提供了一种根据所述方法制备得到的T细胞。
本发明还提供了一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含所述T细胞和药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方式中，所述药物组合物还包含额外的治疗剂。
本发明还提供了一种所述T细胞或所述药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
在某些实施方式中，所述肿瘤选自维尔姆斯瘤、尤文肉瘤、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、皮肤癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和膀胱癌中的一种或多种。
实施例1：HSPC的制备（条件 #8）
人类iPSC通常在市售的Essential 8培养基中维持培养。当iPSC到达70%细胞汇合度时，检查细胞具有健康的形态，没有自发分化。利用Accutase将iPSC细胞解离成单个细胞。对收集的单细胞进行计数并接种在补充有5-50 uM Y27632的StemScale PSC悬浮完全培养基中。
将细胞在37℃、5% CO2培养箱中在耐CO2的轨道振荡器上以30-100 rpm的速度连续旋转孵育。在24小时内（第0天），使用StemScale PSC悬浮完全培养基进行半换液培养，并添加ROCK抑制剂Rki和GSK-3抑制剂CHIR 99021。
在24小时后（第1天），添加CHIR 99021。
24小时后（第2天），收获形成的胚状体(EB)，并用添加了1wt% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1wt% ITS-G、1-100 ng/ml BMP4、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/mlVEGF的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基1重新悬浮。
24-48小时后（第3-4天），收获EB并用含有补充了1wt% P/S，2mM GlutaMaX，50 ug/ml抗坏血酸，1wt% ITS-G，1-100 ng/ml BMP4，1-100 ng/ml FGF2，1-100 ng/ml VEGF，1-100 ng/ml SCF和1-20 uM SB431542的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基2进行重悬。
24-72小时后（第5-7天），收获EB并用含有添加1wt% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1wt% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基3重悬。
24小时后（第8天），在含有50 ug/ml抗坏血酸、1wt% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF、1-100 ng/ml FLT3配体(FLT3L)、1-100 ng/ml TPO、1-100 ng/ml IL-11、1-100 ng/ml IGF1、1-100 ng/ml IL-3、1-100 ng/ml IL-6并补充有1wt% P/S、2mM GlutaMaX的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基4收获EB和悬浮细胞，用于下游分化或进一步扩增。在第8-10天，收获HSPC，并进行细胞表面标志的测定，结果显示在图3中。从图3的结果可以看出，本发明的方法中所生成的HSPC能够表达造血干细胞和祖细胞的细胞标志CD34和CD43，且主要细胞类型为CD34+/CD43+型，可见，该方法获得了造血谱系的HPC。
实施例2：HSPC的制备（条件 #4）
人类iPSC通常在市售的Essential 8培养基中维持培养。当iPSC到达70%细胞汇合度时，检查细胞具有健康的形态，没有自发分化。利用Accutase将iPSC细胞解离成单个细胞。对收集的单细胞进行计数并接种在补充有5-50 uM Y27632的StemScale PSC悬浮完全培养基中。
将细胞在37℃、5% CO2培养箱中在耐CO2的轨道振荡器上以30-100 rpm的速度连续旋转孵育。在24小时内（第0天），使用StemScale PSC悬浮完全培养基进行半换液培养，并添加ROCK抑制剂Rki。
在24小时后（第1天），添加CHIR 99021（2X）。
24小时后（第2天），收获形成的胚状体(EB)，并用添加了1wt% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1wt% ITS-G、1-100 ng/ml BMP4、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/mlVEGF的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基1重新悬浮。
24-48小时后（第3-4天），收获EB并用含有补充了1wt% P/S，2mM GlutaMaX，50 ug/ml抗坏血酸，1wt% ITS-G，1-100 ng/ml BMP4，1-100 ng/ml FGF2，1-100 ng/ml VEGF，1-100 ng/ml SCF和1-20 uM SB431542的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基2进行重悬。
24-72小时后（第5-7天），收获EB并用含有添加1wt% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1wt% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基3重悬。
24小时后（第8天），在含有50 ug/ml抗坏血酸、1wt% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF、1-100 ng/ml FLT3配体(FLT3L)、1-100 ng/ml TPO、1-100 ng/ml IL-11、1-100 ng/ml IGF1、1-100 ng/ml IL-3、1-100 ng/ml IL-6并补充有1wt% P/S、2mM GlutaMaX的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基4收获EB和悬浮细胞，用于下游分化或进一步扩增。在第8-10天，收获HSPC，并进行细胞表面标志的测定。
实施例3：HSPC的制备（条件#6）
人类iPSC通常在市售的Essential 8培养基中维持培养。当iPSC到达70%细胞汇合度时，检查细胞具有健康的形态，没有自发分化。利用Accutase将iPSC细胞解离成单个细胞。对收集的单细胞进行计数并接种在补充有5-50 uM Y27632的StemScale PSC悬浮完全培养基中。
将细胞在37℃、5% CO2培养箱中在耐CO2的轨道振荡器上以30-100 rpm的速度连续旋转孵育。在24小时内（第0天），使用StemScale PSC悬浮完全培养基进行半换液培养，并添加ROCK抑制剂Rki和GSK-3抑制剂CHIR 99021。
在24小时后（第1天），添加CHIR 99021。
24-48小时后（第2-3天），收获形成的胚状体（EB），并用添加了1wt% P/S、2mMGlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1wt% ITS-G、1-100 ng/ml BMP4、1-100 ng/ml FGF2、1-100ng/ml VEGF的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基1重新悬浮。
24-48小时后（第4-5天），收获EB并用含有补充了1wt% P/S，2mM GlutaMaX，50 ug/ml抗坏血酸，1wt% ITS-G，1-100 ng/ml BMP4，1-100 ng/ml FGF2，1-100 ng/ml VEGF，1-100 ng/ml SCF和1-20 uM SB431542的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基2进行重悬。
24-48小时后（第6-7天），收获EB并用含有添加1wt% P/S、2mM GlutaMaX、50 ug/ml抗坏血酸、1wt% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基3重悬。
24小时后（第8天），在含有50 ug/ml抗坏血酸、1wt% ITS-G、1-100 ng/ml SCF、1-100 ng/ml FGF2、1-100 ng/ml VEGF、1-100 ng/ml FLT3配体(FLT3L)、1-100 ng/ml TPO、1-100 ng/ml IL-11、1-100 ng/ml IGF1、1-100 ng/ml IL-3、1-100 ng/ml IL-6并补充有1wt% P/S、2mM GlutaMaX的Stemline II造血干细胞扩增培养基作为造血分化培养基4收获EB和悬浮细胞，用于下游分化或进一步扩增。在第8-10天，收获HSPC，并进行细胞表面标志的测定。过程细胞形态及表面标识物检测结果参见图4-5。
实施例4-8：HSPC的制备（条件 #1-3、5、7）
实施例4-8（条件 #1-3、5、7）的培养方式与实施例1基本相同，具体条件参见图2。
实施例9：HSPC的稳定性实验
从形态学角度观察了在iPSC培养阶段（即第0天）添加CHIR（条件 6），结果如图6，可以看到，CHIR的添加使得在iPSC培养阶段及形成了iPSC球体再开始进行分化, 从而达到数量更多及均一性更好的球体进行下游的分化。
进一步尝试在iPSC诱导形成中胚层的阶段（即条件 6的第1-3天），将CHIR99021的诱导时间延长为2d，结果如图7，可以看到CHIR99021只添加1天会相比于添加2天更助于从HE EB上释放出HPC细胞，对于细胞整体活性/成长也更有利。
针对条件 6进行了4批次的稳定性实验，结果如图8所示，造血EB里的CD34细胞多为更早期的前体细胞(CD43-),而已经从EB球释放出来的悬浮细胞可达到>50% CD34阳性，>90% CD43阳性，说明从EB球释放的悬浮细胞多为造血谱系祖细胞。
实施例10：iT细胞的制备
将实施例1-8制备得到的HSPC重悬于T细胞分化培养基中，所述培养基含有83wt%αMEM、15wt%胎牛血清(FBS)、1wt% ITS-G、1wt% P/S、2 mM GlutaMaX、55 μM β-巯基乙醇、50ng/mL SCF、100 ng/mL TPO、50 mg/mL抗坏血酸、5 ng/mL IL-3、50 ng/mL IL-7和50 ng/mLFLT3配体（FLT3L）。将细胞接种到预先用hDLL4-Fc（人Delta样配体4-Fc）包被的组织培养板上，并在常氧环境中培养21天。大部分培养基（80%）每隔一天更新一次，并且每隔7天通过温和的机械解离将细胞重新接种到新鲜的hDLL4-Fc表面上。
实施例11：iT细胞的扩增
在T细胞分化的第22天进行iT细胞扩增。收集iT细胞，重悬于T细胞成熟培养基（补充有15wt% FBS、1wt% ITS-G、1wt% P/S、50 mg/mL抗坏血酸、10 ng/mL IL-7和10 ng/mLIL-15的αMEM培养基）中，并在预先包被有抗CD3单克隆抗体和纤维连接蛋白的平板中培养。细胞在37℃、5% CO2中培养3天。从扩增的第4天开始，将细胞在没有CD3/纤维连接蛋白包被的平板中的T细胞增殖培养基（补充有15wt% FBS、1wt% P/S、50 mg/mL抗坏血酸、10 ng/mLIL-7、10 ng/mL IL-15、20 ng/mL IL-21、50 ng/mL IL-12、50 ng/mL IL-18、50 ng/mL TL-1A和10 μM Z-VAD的αMEM培养基）中培养长达10天。在iT细胞扩增第14天，收获iT细胞。从这个阶段开始，可以使用冻存液CS10冷冻保存培养物。
应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。

Claims (12)

1.一种制备T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了CHIR 99021的培养基中，诱导多能干细胞分化成胚状体；
b. 诱导步骤a中形成的EB分化成造血干细胞和祖细胞；
c. 诱导步骤b中形成的HSPC分化为T细胞；
其中，所述步骤a包括：
（a1）在CHIR 99021和Rki的存在下，在第0天进行诱导；
（a2）在CHIR 99021的存在下，在第1天再次进行诱导。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b包括：
（b1）在补充了BMP4、FGF2、VEGF的造血分化培养基中悬浮培养EB；
（b2）在补充了BMP4、SCF、FGF2、VEGF和SB431542的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；
（b3）在补充了SCF、FGF2和VEGF的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成HSPC。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（a）是在第0-1天进行，所述步骤（b1）是在第2-3天进行，所述步骤（b2）是在第4-5天进行，所述步骤（b3）是在第6-7天进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HSPC具有CD34+表型。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c包括：
将步骤b中形成的HSPC加入T细胞分化培养基中，并在预先包被有人Delta样配体4-Fc的组织培养板中进行细胞培养，得到T细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述T细胞分化培养基含有αMEM、胎牛血清、SCF、FLT3L、IL-3、IL-7、ITS-G、P/S、GlutaMaX、β-巯基乙醇、TPO和抗坏血酸中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述T细胞分化培养基含有83wt% αMEM、15wt %胎牛血清、1wt % ITS-G、1wt % P/S、2 mM GlutaMaX、1-100 μM β-巯基乙醇、1-100ng/mL SCF、50-200 ng/mL TPO、1-100 mg/mL抗坏血酸、1-50 ng/mL IL-3、1-100 ng/mLIL-7和1-100 ng/mL FLT3L。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤c中所述细胞培养是培养25-35天。
9.一种根据权利要求1-8中任一项所述方法制备得到的T细胞。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求9所述的T细胞和药学上可接受的赋形剂。
11.一种根据权利要求9所述的T细胞或根据权利要求10所述的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自维尔姆斯瘤、尤文肉瘤、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、皮肤癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和膀胱癌中的一种或多种。
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