ES2685969T3 - Células formadoras de colonias hemangioblásticas y células hemangioblásticas no injertables - Google Patents

Células formadoras de colonias hemangioblásticas y células hemangioblásticas no injertables Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas in vitro, dicho procedimiento que comprende las etapas de: a) cultivar un cultivo celular que comprende células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) en medios sin suero en presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas iPSC en cuerpos embrioides; y b) añadir al menos dos factores de crecimiento a dicho cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando dicho cultivo en medios sin suero, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en dicho cultivo de cuerpos embrioides, en donde dichas iPSC se mantienen con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) o se mantienen sin alimentador; se añade un inhibidor de Rho-quinasa (ROCK) a los medios del cuerpo embrioide y/o al medio de diferenciación sin suero; dichos iPSC, cuerpos embrioides y células formadoras de colonias hemangioblásticas se cultivan en medios sin suero a lo largo de todas las etapas (a) y (b) de dicho procedimiento; y dichos al menos dos factores de crecimiento en la etapa (b) comprenden BMP4 y VEGF.

Description

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DESCRIPCION
Células formadoras de colonias hemangioblásticas y células hemangioblásticas no injertables Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a procedimientos para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas.
Particularmente, la invención se refiere a un procedimiento para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas in vitro usando un proceso de dos etapas, primero cultivando células madre pluripotentes inducidas en medios sin suero en presencia de al menos un factor de crecimiento en cantidad suficiente para inducir la diferenciación de células madre embrionarias en cuerpos embrioides, y segundo, cultivar los cuerpos embrioides en medios sin suero en presencia de al menos dos factores de crecimiento en una cantidad suficiente para expandir las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en el medio que comprende cuerpos embrioides.
También se describe un procedimiento para generar y expandir células hemangioblásticas humanas no injertables in vitro.
También se describen preparaciones de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas y células hemangioblásticas no injertables. Se describen adicionalmente procedimientos para diferenciar unidades formadoras de colonias hemangioblásticas humanas y células hemangioblásticas no injertables en un linaje hematopoyético o endotelial, así como procedimientos para preparar tipos celulares parcial o totalmente diferenciados de células formadoras de colonias hemangioblásticas y células hemangioblásticas no injertables. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas, las células hemangioblásticas no injertables y las células diferenciadas a partir de las mismas tienen una variedad de usos in vitro e in vivo. La capacidad de generar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas expandidas y células hemangioblásticas no injertables en cantidades tan grandes in vitro proporciona, por primera vez, el potencial para derivar un gran número de tipos de células derivadas de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas y células hemangioblásticas no injertables, tales como células madre hematopoyéticas humanas, o células endoteliales, células hematopoyéticas diferenciadas, tales como glóbulos rojos y plaquetas, que serán útiles en diversas aplicaciones terapéuticas. Además, los números expandidos de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas y células hemangioblásticas no injertables pueden utilizarse en nuevas estrategias terapéuticas en el tratamiento de trastornos de células hematopoyéticas y endoteliales o en bancos de sangre.
Antecedentes
La siguiente descripción incluye información que puede ser útil para comprender la presente invención. No es una admisión de que nada de la información proporcionada en esta memoria sea técnica anterior o relevante para la presente invención reivindicada, o que cualquier publicación referenciada específica o implícitamente sea técnica anterior.
Las células madre hematopoyéticas (HSC) son capaces de autorrenovarse y pueden dar lugar a todos los linajes de células sanguíneas. Estas células, que residen en la médula ósea, forman la base del sistema hematopoyético adulto. El trasplante de estas células representa la terapia basada en células más común aplicada hoy en clínica.
El trasplante de HSC se utiliza para el tratamiento de pacientes con leucemia aguda o crónica, anemia aplásica y diversos síndromes de inmunodeficiencia, así como diversas enfermedades malignas no hematológicas y trastornos autoinmunes. Para los pacientes con tumores malignos hematológicos, el trasplante de HSC puede rescatar a los pacientes de la aplasia inducida por el tratamiento, que puede ocurrir después de dosis altas de quimioterapia y/o radioterapia.
A pesar de la utilidad clínica generalizada del trasplante de HSC, las tres principales fuentes de HSC (médula ósea humana, sangre periférica movilizada y sangre de cordón umbilical) son limitadas, ya que dos tercios de los pacientes que necesitan un trasplante somático de HSC carecen de donantes compatibles. Por ejemplo, para cualquier paciente dado, solo hay un 25 % de posibilidades de que un hermano tenga el antígeno leucocitario humano (HLA) completamente compatible.
Los HLA son proteínas en la superficie de la célula que ayudan al sistema inmunitario a identificar las células como propias (pertenecientes al cuerpo) o no propias (extrañas o procedentes de fuera del cuerpo). Las proteínas HLA están codificadas por grupos de genes que forman una región ubicada en el cromosoma 6 humano, conocida como Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés), en reconocimiento del importante papel de las proteínas codificadas por los loci del MHC en el rechazo de injertos. En consecuencia, las proteínas HLA también se denominan proteínas del MHC. Si bien la compatibilidad de las moléculas del MHC de un trasplante con las del receptor mejora significativamente la tasa de éxito del trasplante clínico, no previene el rechazo, incluso cuando el trasplante se produce entre hermanos con HLA idéntico. Dicho rechazo puede desencadenarse por diferencias entre los antígenos menores de histocompatibilidad. Estos antígenos polimórficos generalmente son péptidos «no
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propios» unidos a moléculas del MHC en las células del tejido de trasplante, y las diferencias entre los antígenos menores de histocompatibilidad a menudo provocan que el sistema inmunitario de un receptor de trasplantes eventualmente rechace el trasplante, incluso cuando existe una compatibilidad entre los antígenos del MHC, a menos que se usen fármacos inmunosupresores.
Hay tres tipos de HLA de clase I y clase II. Una persona (generalmente un hermano) que tiene un HLA de clase I y clase II se llama donante relacionado. El aumento de la supervivencia se asocia con una compatibilidad entre el receptor y el donante de HLA-A, HLA-B, HLA-C de clase I y HLA-DRB1 y HLA-DQB1 de clase II (Morishima, y col., 2002 Blood (99): 4200-6). Para un paciente que no tiene un donante compatible y relacionado, una búsqueda a través de bancos de donantes puede proporcionarle una persona con tipos de HLA compatibles. Sin embargo, la cantidad de personas que necesitan un trasplante de células o tejidos, tal como un trasplante de HSC, es mucho mayor que el suministro disponible de células y tejidos adecuados para el trasplante. En estas circunstancias, no es sorprendente que obtener una buena compatibilidad entre las proteínas del MHC de un receptor y las del trasplante con frecuencia sea imposible. Por lo tanto, muchos receptores de trasplantes deben esperar a que esté disponible un trasplante compatible con el MHC o aceptar un trasplante que no sea compatible con el MHC y toleren dosis más altas de medicamentos inmunosupresores y aun así se arriesguen a ser rechazados. La capacidad de generar y manipular HSC, y/o inducir tolerancia en los receptores de trasplantes, por tanto, será de gran beneficio para el tratamiento y la gestión de las enfermedades humanas.
Basado en el trabajo en el embrión aviar, y posteriormente en ranas y mamíferos, se ha demostrado que los programas de desarrollo de sangre y endotelio están estrechamente relacionados. Por ejemplo, las células endoteliales y hematopoyéticas emergen concurrentemente y muy cerca en las islas de sangre del saco vitelino. Las islas de sangre del saco vitelino se derivan de agregados de células mesodérmicas que colonizan el saco vitelino. El centro de estos agregados da lugar a las células hematopoyéticas embrionarias, mientras que la población periférica se diferencia en células endoteliales que forman la vasculatura que rodea las células sanguíneas internas. Estas observaciones respaldan la noción de que las células endoteliales y hematopoyéticas tienen un precursor común.
Además, en los embriones de pez cebra y de ratón, ambos linajes endoteliales y hematopoyéticos comparten la expresión de ciertos genes, como Flk1, Flt1, Tie1, Tie2, CD34, Scl y Runx1 (Fina y col., 1990 Blood (75): 2417-2426 Millauer y col., 1993 Cell (72): 835-846; Yamaguchi y col., 1993 Development (118): 489-498; Anagnostou y col., 1994 PNAS USA (91): 3974-3978; Kallianpur y col., 1994 Blood (83): 1200-12081; Young y col., 1995 Blood (85): 96105, Asahara y col., 1997 Science (275): 964-967; Kabrun y col., 1997 Development (124): 2039-2048). Del mismo modo, ciertas mutaciones genéticas afectan tanto al desarrollo de células endoteliales como hematopoyéticas (Shalaby y col., 1995 Nature (376): 62-66; Robb y col., 1995 PNAS USA (92): 7075-7079; Shivdasani y col., 1995 Nature (373): 432-434; Stainier y col., 1995 Development (121): 3141-3150; Bollerot y col., 2005 APMIS (113): 790803). Además, la supresión de Flk1 o Flt1, que son ambos receptores para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), da como resultado una alteración del desarrollo hematopoyético y endotelial en el embrión de ratón.
En la bibliografía se ha informado sobre la generación de hemangioblastos de ratón a partir de células madre embrionarias de ratón in vitro (Choi y col., 1998 Development 125: 727-732). Además, se han derivado células precursoras humanas capaces de originar tanto células hematopoyéticas como endoteliales a partir de células ES humanas (Wang y col., 2004 Immunity (21): 31-41 y Wang y col., J Exp Med (201): 1603-1614), pero solo en pequeñas cantidades, cientos de células en el mejor de los casos. Además, no existen procedimientos o condiciones para la expansión de las células precursoras de hemangioblastos in vitro.
A pesar de la identificación previa de tipos de células capaces de dar lugar a células del linaje hematopoyético, sigue existiendo la necesidad de procedimientos mejorados para generar grandes cantidades de poblaciones de células progenitoras, así como tipos de células diferenciadas. La presente invención aborda esta necesidad. Además, la presente invención proporciona un nuevo tipo de célula progenitora no injertable en la médula ósea cuando se administra in vivo a un animal inmunodeficiente. Sin embargo, a pesar de la incapacidad de estas células para injertarse en la médula ósea, las células son capaces de generar células hematopoyéticas diferenciadas e incluso pueden generar otros tipos de células no hematopoyéticas, como tipos de células endoteliales, músculo esquelético y músculo liso.
Además, existe una necesidad crítica de sangre disponible para transfusión. La Cruz Roja y otros proveedores de sangre informan una escasez casi constante de sangre. Esto es especialmente cierto para pacientes con tipos de sangre únicos, pacientes que son Rh+, o después de accidentes o desastres que resultan en bajas masivas. Además, en tiempos de guerra, los militares tienen una gran necesidad de sangre disponible para su uso en el tratamiento de lesiones traumáticas relacionadas con la guerra. La presente invención proporciona células hematopoyéticas diferenciadas para su uso en bancos de sangre y transfusiones. Las células y los procedimientos de la presente invención proporcionarán un avance seguro y confiable más allá de la dependencia tradicional de las donaciones de sangre, y ayudarán a evitar la escasez crítica de sangre disponible.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de procedimientos para generar y expandir grandes cantidades de hemangioblastos humanos, así como tipos de células derivadas de hemangioblastos, es decir, células hematopoyéticas y endoteliales, y todas las soluciones/mezclas que contienen dichas cantidades de
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hemangioblastos o tipos de células derivadas. Dichos procedimientos aumentarían la disponibilidad de células para trasplante y también tendrían utilidad en una variedad de otras aplicaciones terapéuticas, tales como en la inducción de tolerancia inmunológica.
Compendio de la invención
Varias realizaciones de la presente invención superan los problemas descritos en la sección de antecedentes anterior proporcionando un procedimiento de generación y expansión de hemangioblastos humanos o células formadoras de colonias hemangioblásticas in vitro. La capacidad para expandir hemangioblastos humanos o células formadoras de colonias hemangioblásticas mediante los nuevos procedimientos descritos en la presente memoria permite la producción de células que se pueden usar en diversas aplicaciones terapéuticas. Además, se describen procedimientos para generar células del linaje hemangioblástico humano o formadoras de colonias hemangioblásticas (es decir, células hematopoyéticas y endoteliales) que se pueden usar en aplicaciones terapéuticas. Los procedimientos proporcionan una utilidad adicional, ya que permiten la generación de un gran número de hemangioblastos humanos o células formadoras de colonias hemangioblásticas, así como células hematopoyéticas y endoteliales, y células diferenciadas a partir de las mismas, que se pueden usar a escala comercial. Los procedimientos de la presente invención representan una mejora significativa en la generación de hemangioblastos y, aunque simplificados a partir de procedimientos anteriores, dan como resultado un aumento de 8 veces en el rendimiento con respecto a los procedimientos del documento WO 2007/120811.
La presente invención proporciona un procedimiento para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas in vitro, dicho procedimiento que comprende las etapas de: a) cultivar un cultivo celular que comprende células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) obtenidas sin destrucción de un embrión humano en medios sin suero en presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células madre pluripotentes inducidas en cuerpos embrioides; y (b) añadir al menos dos factores de crecimiento a dicho cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando dicho cultivo en medios sin suero, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas en dicho cultivo de cuerpos embrioides, en donde dichas iPSC se mantienen con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) o se mantienen sin alimentador, en donde se añade un inhibidor de Rho-quinasa (ROCK) a medio de cuerpos embrioides y/o de diferenciación sin suero, en donde dichas iPSC, cuerpos embrioides y las células formadoras de colonias hemangioblásticas se cultivan en medios sin suero a lo largo de todas las etapas (a) y (b) de dicho procedimiento, y en donde dichos al menos dos factores de crecimiento en la etapa (b) comprenden BMP4 y VEGf.
Esta invención también proporciona un procedimiento para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas in vitro, dicho procedimiento que comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) en medios sin suero en presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células madre pluripotentes inducidas en cuerpos embrioides; (b) añadir al menos dos factores de crecimiento a dicho cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando dicho cultivo en medios sin suero, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en dicho cultivo de cuerpos embrioides, (c) dichos cuerpos embrioides se disgregan en células individuales; y (d) añadir al menos un factor de crecimiento a dicho cultivo que comprende dichas células individuales y continuar cultivando dicho cultivo en medios sin suero, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en dicho cultivo que comprende dichas células individuales, en donde dichas células iPSC se mantienen con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) o se mantienen sin alimentador, en donde se añade un inhibidor Rho-quinasa (ROCK) a medio de cuerpos embrioides y/o de diferenciación sin suero, en donde dichas iPSC, cuerpos embrioides y células formadoras de colonias hemangioblásticas se cultivan en medios sin suero a lo largo de todas las etapas (a)-(d) de dicho procedimiento, y en donde dichos al menos dos factores de crecimiento en la etapa (b) comprenden BMP4 y VEGF. En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende además la etapa de añadir eritropoyetina (EPO) a las etapas (b) y (d).
En ciertas realizaciones de los procedimientos para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas de esta invención, el factor de crecimiento es una proteína que comprende una proteína homeobox, o una variante funcional o un fragmento activo de la misma. En ciertas realizaciones, la proteína homeobox es una proteína que comprende HOXB4, o una variante funcional o un fragmento activo de la misma. Se contempla que el HOXB4 pueda ser HOXB4 de mamífero, incluyendo HOXB4 de ratón y humano. La proteína HOXB4 podría ser proteína HOXB4 de longitud completa. En aún otras realizaciones, el HOXB4 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (Figura 9) o SEQ ID NO: 3 (Figura 10).
En ciertas realizaciones de los procedimientos para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas de esta invención, el factor de crecimiento que comprende HOXB4 es una proteína de fusión que comprende HOXB4 y un dominio de transducción de proteínas (PTD). En aún otras realizaciones, el PTD y el HOXB4 están conjugados a través de un enlazador. En aún otras realizaciones, el PTD es la proteína TAT, una variante funcional o un fragmento activo de la misma (que incluye un polipéptido TAT). En ciertas realizaciones, la proteína TAT comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. En realizaciones adicionales, el PTD
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comprende una o más copias de un polipéptido TAT con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. En ciertas realizaciones, el PTD es la SEQ ID nO: 15.
En ciertas realizaciones de los procedimientos para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas de esta invención, el factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), proteínas morfogénicas óseas (BMP), factor de células madre (SCF), Flt-3L (FL), trombopoyetina (TPO) y eritropoyetina (EPO). En realizaciones adicionales, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o la proteína morfogénica ósea (BMP), o ambas, se añaden a la etapa de cultivo (a) dentro de las 0-48 horas de cultivo del cultivo celular que comprende las células hES. En otras realizaciones adicionales, el factor de células madre (SCF), Flt-3L (FL) o la trombopoyetina (TPO), o cualquier combinación de los mismos, se añaden al cultivo celular que comprende células hES dentro de las 48-72 horas desde el inicio de la etapa de cultivo (a).
En ciertas realizaciones de los procedimientos para generar y expandir células formadoras de colonias
hemangioblásticas humanas de esta invención, un factor de crecimiento que comprende una proteína HOXB4, o una variante funcional o fragmento activo (o dominio) del mismo, en la etapa o etapas en donde dicha proteína se añade múltiples veces, como, por ejemplo, una vez al día o una vez cada dos días.
En ciertas realizaciones de los procedimientos para generar y expandir células formadoras de colonias
hemangioblásticas humanas de esta invención, el factor de crecimiento que comprende una proteína homeobox se añade a la etapa (b) dentro de las 48-72 horas desde el inicio de la etapa (a). En ciertas realizaciones de los procedimientos de esta invención, la proteína HOXB4, o variantes funcionales o fragmentos activos de la misma, se añade a la etapa (b) dentro de las 48-72 horas desde el inicio de la etapa (a).
En ciertas realizaciones, los procedimientos para generar y expandir células formadoras de colonias
hemangioblásticas humanas de esta invención comprenden adicionalmente la etapa de añadir eritropoyetina (EPO) a la etapa (b).
En ciertas realizaciones, los procedimientos para generar y expandir células formadoras de colonias
hemangioblásticas humanas de esta invención comprenden adicionalmente la etapa o etapas de purificar y/o aislar las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. Las células formadoras de colonias
hemangioblásticas se pueden purificar usando cromatografía en columna de inmunoafinidad con un anticuerpo anti- CD71. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas se pueden aislar por tamaño y/o morfología.
También se describen procedimientos para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, el cultivo celular que comprende células madre derivadas de embriones humanos que se derivan de una biblioteca de células madre embrionarias humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano, en donde dicha biblioteca de células madre de embriones humanos comprende células madre, cada una de las cuales es hemicigótica u homocigótica para al menos un alelo del MHC presente en una población humana, en donde cada miembro de dicha biblioteca de células madre es hemicigótico u homocigótico para un grupo diferente de alelos del MHC en relación con los miembros restantes de la biblioteca. En realizaciones adicionales, la biblioteca de células madre embrionarias humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano comprende células madre que son hemicigóticas u homocigóticas para todos los alelos del MHC presentes en una población humana. Estos procedimientos generan una biblioteca de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, cada una de las cuales es hemicigótica u homocigótica para al menos un alelo del MHC presente en una población humana, en donde cada miembro de dicha biblioteca de células madre es hemicigótico u homocigótico para un grupo diferente de alelos del MHC con respecto a los miembros restantes de la biblioteca. En realizaciones adicionales, estos procedimientos generan una biblioteca de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas que son hemicigóticas u homocigotas para todos los alelos del MHC presentes en una población humana. Por lo tanto, esta descripción también proporciona una biblioteca de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas preparadas por dichos procedimientos. Esta biblioteca podría usarse de la siguiente manera.
Se describe adicionalmente un procedimiento para tratar a un paciente humano que necesita un tratamiento que implica la administración de células madre hematopoyéticas humanas o células endoteliales humanas a dicho paciente, que comprende las etapas de: (a) seleccionar dicho paciente; (b) identificar proteínas del MHC expresadas en la superficie de las células de dicho paciente; (c) proporcionar una biblioteca de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas descrita en el párrafo anterior; (d) seleccionar las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas de la biblioteca que son compatibles con las proteínas del MHC de dicho paciente en las células de dicho paciente; (e) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas identificadas en la etapa (d) en células madre hematopoyéticas humanas, células endoteliales o ambas, dependiendo de la necesidad; (f) administrar dichas células madre hematopoyéticas humanas, células endoteliales o ambas de la etapa (e) a dicho paciente. Este procedimiento podría realizarse en un centro regional, tal como un hospital o un centro médico, o cualquier otra instalación adecuada.
En ciertas realizaciones, los procedimientos para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas de esta invención comprenden adicionalmente la etapa de cultivar las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de
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dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en células madre hematopoyéticas humanas.
En ciertas realizaciones, los procedimientos para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas de esta invención comprenden adicionalmente la etapa de hacer crecer dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en células endoteliales humanas. En realizaciones adicionales, las condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en células endoteliales humanas comprenden hacer crecer las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas sobre placas de cultivo recubiertas con fibronectina.
En ciertas realizaciones de esta invención, los procedimientos para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas dan como resultado al menos 10.000 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, al menos 50.000 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, al menos 100.000 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, al menos 500.000 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, al menos 1 x 106 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, al menos 2 x 106 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, al menos 3 x 106 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas o al menos 4 x 106 células formadoras de colonias
hemangioblásticas humanas. Estos procedimientos dan como resultado soluciones celulares que pueden comprender entre 10.000 y 4 millones de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas.
Por lo tanto, esta invención también proporciona una solución de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas (que podrían crecer en medios sin suero) que comprende al menos 10.000 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, al menos 50.000 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, al menos 100.000 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, al menos 500.000 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, al menos 1 x 106 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, al menos 2 x 106 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, al menos 3 x 106 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas o al menos 4 x 106 células formadoras de colonias
hemangioblásticas humanas. Estas soluciones podrían ser inyectables para un sujeto. Estas soluciones podrían ser adecuadas para la congelación. Estas soluciones podrían ser sin suero. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en estas soluciones son capaces de diferenciarse en al menos células hematopoyéticas y endoteliales, pero tienen un mayor potencial de desarrollo para diferenciarse en otros tipos de células. También se describe el uso de estas soluciones para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad que podría tratarse mediante la administración de células formadoras de colonias hemangioblásticas, células hematopoyéticas o células endoteliales.
También se describe un procedimiento para producir una solución de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas adecuadas para inyección en un paciente que comprende las etapas de aislar la solución de células descrita en el párrafo anterior y poner las células en una solución adecuada para inyección en un paciente. También se describe un procedimiento para producir una solución de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas adecuadas para la congelación que comprende las etapas de aislar la solución de células descrita en el párrafo anterior y poner las células en una solución adecuada para la congelación.
También se describe un procedimiento para administrar células madre hematopoyéticas humanas a un paciente que
lo necesite, que comprende las etapas de: (a) seleccionar un paciente que lo necesite; (b) suministrar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas generadas y expandidas por un procedimiento de esta invención; (c) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en células madre hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas de todas dichas células madre hematopoyéticas humanas a dicho paciente.
También se describe un procedimiento para administrar células madre hematopoyéticas humanas a un paciente que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) seleccionar al paciente que lo necesite; (b) suministrar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en una cantidad de al menos 10.000 células; (c) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en células madre hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas de dichas células madre hematopoyéticas humanas a dicho paciente.
También se describe un procedimiento para administrar células endoteliales humanas a un paciente que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) seleccionar un paciente que lo necesite; (b) suministrar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas generadas y expandidas por un procedimiento de esta invención; (c) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en células endoteliales humanas; y (d) administrar algunas o todas de dichas células endoteliales humanas a dicho paciente.
También se describe un procedimiento para administrar células endoteliales humanas a un paciente que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) seleccionar un paciente que lo necesite; (b) suministrar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en una cantidad de al menos 10.000 células; (c) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en células endoteliales humanas; y (d) administrar algunas o todas de dichas células endoteliales humanas a dicho paciente. En ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas están en una cantidad entre 10.000 y 4 millones de células.
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También se describe un procedimiento para tratar un trastorno de células endoteliales en un paciente que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) seleccionar un paciente que lo necesite; (b) suministrar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas generadas y expandidas mediante un procedimiento descrito anteriormente; (c) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en células endoteliales humanas; y (d) administrar algunas o todas de dichas células endoteliales humanas a dicho paciente.
También se describe un procedimiento para tratar un trastorno de células endoteliales en un paciente que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) seleccionar un paciente que lo necesite; (b) suministrar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en una cantidad de al menos 10.000 células; (c) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en células endoteliales humanas; y (d) administrar algunas o todas de dichas células endoteliales humanas a dicho paciente. En ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas están en una cantidad entre 10.000 y 4 millones de células.
El trastorno de células endoteliales a tratar con estos procedimientos incluye infarto de miocardio, apoplejía, aterosclerosis e isquemia. La isquemia puede ocurrir en el cerebro, las extremidades, el corazón, los pulmones, la piel y los ojos.
Esta invención proporciona un procedimiento para producir células madre hematopoyéticas humanas in vitro, que comprende las etapas de: (a) suministrar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas generadas y expandidas por un procedimiento de esta invención; y (b) cultivar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en células madre hematopoyéticas humanas.
También se describe un procedimiento para producir células endoteliales humanas in vitro, que comprende las etapas de: (a) suministrar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas generadas y expandidas por un procedimiento de esta invención; y (b) cultivar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de dichas células formadoras de colonias
hemangioblásticas humanas en células endoteliales humanas.
Esta invención también proporciona un procedimiento para expandir células formadoras de colonias
hemangioblásticas que comprende células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en medios sin suero en presencia de una proteína que comprende una proteína homeobox (como HOXB4) o un equivalente funcional o un fragmento activo de la misma en una cantidad suficiente para soportar la proliferación de dichas células hemangioblásticas. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas que se van a expandir podrían enriquecerse, purificarse o aislarse de la sangre del cordón umbilical, la sangre periférica o la médula ósea. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas podrían ser células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. Este procedimiento podría dar como resultado soluciones que comprenden células formadoras de colonias hemangioblásticas de entre 10.000 y 4 x 106 células formadoras de colonias hemangioblásticas, o más. La proteína HOXB4 utilizada para este procedimiento podría ser cualquiera que sea adecuada para su uso en los procedimientos para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas.
También se describen procedimientos para inducir tolerancia inmunológica usando las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas generadas y expandidas o expandidas según los procedimientos de esta invención. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas tolerantes se seleccionan para que compartan marcadores de histocompatibilidad con un aloinjerto, y se pueden administrar a un receptor humano antes o simultáneamente con el aloinjerto o el tratamiento celular que regenera una función celular que necesita el paciente. La tolerancia inmunitaria resultante disminuye posteriormente el riesgo de rechazo agudo o crónico del aloinjerto o tratamiento celular.
Los grandes números de células formadoras de colonias hemangioblásticas generadas por los procedimientos descritos en la presente memoria permiten protocolos de tolerancia en donde pueden eliminarse los tratamientos de preacondicionamiento tóxico. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas donantes pueden administrarse a un receptor humano antes de la implantación de un injerto o la implantación de un órgano, tejido o células que son compatibles con respecto a las células formadoras de colonias hemangioblásticas donantes. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas y el injerto pueden obtenerse del mismo donante. El injerto puede derivarse de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas donantes diferenciadas. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas y el injerto alternativamente se pueden obtener de diferentes donantes en donde los donantes son compatibles. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas pueden administrarse a receptores humanos para inducir tolerancia en receptores que lo necesiten.
También se describe un procedimiento para inducir tolerancia en un receptor humano a un aloinjerto donante, en donde el procedimiento comprende las etapas de (a) administrar al receptor un agente que inhiba la coestimulación de las células T; (b) introducir en las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas receptoras que se generan y expanden, o se expanden, según los procedimientos descritos en esta memoria; y (c) implantar el aloinjerto en el receptor. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas (células del donante) promueven la aceptación del aloinjerto por parte del receptor. En ciertas realizaciones, un agente que inhibe la
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coestimulación de células T es un agente que inhibe o bloquea la interacción coestimulante del ligando de CD40 y CD40. El procedimiento puede comprender además administrar un agente que inhiba la interacción CD28-B7. El procedimiento puede o puede no comprender la irradiación tímica y/o la depleción o inactivación de las células T. El procedimiento mencionado anteriormente también puede producir quimerismo mixto en ausencia de espacio hematopoyético creado por irradiación de todo el cuerpo.
También se describe un procedimiento para promover la tolerancia en un receptor humano a un aloinjerto donante, en donde el procedimiento comprende las etapas de (a) crear espacio tímico en dicho receptor; (b) agotar o inactivar las células T reactivas del donante en dicho receptor; (c) introducir células formadoras de colonias hemangioblásticas donantes humanas de dicho donante o que son compatibles con dicho donante en dicho receptor; y (d) implantar dicho aloinjerto en dicho receptor, en donde las células formadoras de colonias hemangioblásticas donantes inducen tolerancia al aloinjerto. En ciertas realizaciones, el procedimiento no comprende irradiación que crea espacio hematopoyético. El procedimiento puede comprender crear espacio tímico administrando al receptor al menos un tratamiento seleccionado entre irradiación tímica (que puede fraccionarse), esteroides, corticosteroides, brequinar o un inmunosupresor o un fármaco.
También se describen procedimientos para generar células adecuadas para su uso en la transfusión de sangre. Por ejemplo, procedimientos para generar glóbulos rojos que se pueden usar en transfusiones. Como tal, los procedimientos proporcionan una solución para ayudar a aliviar la escasez crónica de sangre disponible para la donación.
También se describe un procedimiento para producir células hematopoyéticas diferenciadas a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas in vitro, dicho procedimiento que comprende las etapas de: (a) proporcionar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas; y (b) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas en células hematopoyéticas diferenciadas.
También se describe un procedimiento para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vitro a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, dicho procedimiento que comprende las etapas de: (a) proporcionar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas; (b) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas en células hematopoyéticas diferenciadas; y (c) realizar transfusiones de sangre con dichas células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas realizaciones, dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas se recuperan de cultivos congelados.
También se describe un procedimiento para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vitro a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, dicho procedimiento que comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células madre pluripotentes humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano en presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células madre pluripotentes en cuerpos embrioides; (b) añadir al menos un factor de crecimiento a dicho cultivo que comprende cuerpos embrioides, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en dicho cultivo de cuerpos embrioides; (c) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas en células hematopoyéticas diferenciadas; y (d) realizar transfusiones de sangre con dichas células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas realizaciones, dichas células madre pluripotentes, cuerpos embrioides y células formadoras de colonias hemangioblásticas se hacen crecer en medios sin suero a lo largo de la etapa (a) de dicho procedimiento.
En ciertas realizaciones, la célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria obtenida sin destrucción de un embrión humano.
También se describe un procedimiento para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vitro a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, dicho procedimiento que comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células madre pluripotentes humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano en presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células madre pluripotentes en cuerpos embrioides; (b) añadir al menos un factor de crecimiento a dicho cultivo que comprende cuerpos embrioides, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en dicho cultivo de cuerpos embrioides; (c) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas en células hematopoyéticas diferenciadas; y (d) realizar transfusiones de sangre con dichas células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas realizaciones, dichas células madre, cuerpos embrioides y células formadoras de colonias hemangioblásticas se cultivan en medios sin suero a lo largo de todas las etapas (a) y (b) de dicho procedimiento.
En ciertas realizaciones, la célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria obtenida sin destrucción de un embrión humano.
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En ciertas realizaciones, dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas se recuperan de cultivos congelados.
También se describe un procedimiento para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vitro a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, dicho procedimiento que comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células madre pluripotentes humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano en presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células madre pluripotentes en cuerpos embrioides; (b) añadir al menos un factor de crecimiento a dicho cultivo que comprende cuerpos embrioides, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en dicho cultivo de cuerpos embrioides; (c) disgregar dichos cuerpos embrioides en células individuales; (d) añadir al menos un factor de crecimiento a dicho cultivo que comprende dichas células individuales, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en dicho cultivo que comprende dichas células individuales; (e) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas en células hematopoyéticas diferenciadas; y (f) realizar transfusiones de sangre con dichas células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas realizaciones, dichas células madre, cuerpos embrioides y células formadoras de colonias hemangioblásticas se cultivan en medios sin suero a lo largo de todas las etapas (a)-(d) de dicho procedimiento.
En ciertas realizaciones, la célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria obtenida sin destrucción de un embrión humano.
En ciertas realizaciones, el factor de crecimiento es una proteína que comprende una proteína homeobox, o una variante funcional o un fragmento activo de la misma. En ciertas realizaciones, la proteína homeobox comprende una proteína HOXB4, o una variante funcional o una variante activa de la misma.
En ciertas realizaciones, las células hematopoyéticas diferenciadas se producen como un tipo de célula individual. En ciertas realizaciones, el tipo de célula individual se selecciona entre: glóbulos rojos, plaquetas o fagocitos. En ciertas realizaciones, el fagocito se selecciona entre: granulocitos: neutrófilos, basófilos, eosinófilos, linfocitos o monocitos. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos expresan hemoglobina F. En ciertas realizaciones, los tipos de células individuales se mezclan para igualar aproximadamente la proporción de tipos de células diferenciadas que se encuentran en la sangre, en donde la proporción de tipos de células diferenciadas que se encuentra en la sangre es del 96 % de glóbulos rojos, del 1 % de plaquetas y del 3 % de fagocitos.
En ciertas realizaciones, se producen múltiples tipos de células hematopoyéticas diferenciadas en la misma etapa. En ciertas realizaciones, los múltiples tipos de células hematopoyéticas diferenciadas se seleccionan entre: glóbulos rojos, plaquetas o fagocitos. En ciertas realizaciones, el fagocito se selecciona entre: granulocitos: neutrófilos, basófilos, eosinófilos, linfocitos o monocitos. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos expresan hemoglobina F. En ciertas realizaciones, los tipos de células hematopoyéticas diferenciadas múltiples se producen en una proporción aproximadamente igual a la proporción de tipos de células hematopoyéticas diferenciadas que se encuentran en la sangre, en donde la proporción de tipos celulares diferenciados que se encuentra en la sangre es del 96 % de glóbulos rojos, del 1 % de plaquetas y del 3 % de fagocitos.
En ciertas realizaciones, se añade plasma a las células hematopoyéticas diferenciadas antes de la transfusión.
En ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas se adaptan a un paciente para asegurar que se producen células hematopoyéticas diferenciadas del propio tipo de sangre del paciente. En ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas son negativas para los factores antigénicos A, B, Rh o cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, las células hematopoyéticas diferenciadas son glóbulos rojos, y en donde una etapa de diferenciación de glóbulos rojos incluye eritropoyetina (EPO).
También se describe una célula formadora de colonias hemangioblásticas humanas, célula que puede diferenciarse para producir al menos tipos de células hematopoyéticas o endoteliales, en donde la célula formadora de colonias hemangioblásticas humanas es poco adherente a otras células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas.
También se describe una célula formadora de colonias hemangioblásticas humanas, célula que puede diferenciarse para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales, en donde la célula formadora de colonias hemangioblásticas humanas es poco adherente a otras células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas.
También se describe una célula formadora de colonias hemangioblásticas humanas, célula que puede diferenciarse para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales, en donde la célula formadora de colonias hemangioblásticas humanas es poco adherente a otras células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, y en donde la célula formadora de colonias hemangioblásticas humanas no expresa la proteína CD34.
También se describe una célula formadora de colonias hemangioblásticas humanas, célula que se puede diferenciar para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales, en donde la célula formadora de colonias hemangioblásticas humanas no expresa ninguna de las siguientes proteínas: CD34, CD31, KDR y CD133.
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También se describe un cultivo celular que comprende células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, células que se pueden diferenciar para producir al menos tipos de células hematopoyéticas o endoteliales, en donde las células formadoras de colonias hemangioblásticas son poco adherentes entre sí.
También se describe un cultivo celular que comprende células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, células que se pueden diferenciar para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales, en donde las células formadoras de colonias hemangioblásticas son poco adherentes entre sí.
También se describe un cultivo celular que comprende una población sustancialmente purificada de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, células que se pueden diferenciar para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales, en donde las células formadoras de colonias hemangioblásticas son poco adherentes entre sí, y en donde las células formadoras de colonias hemangioblásticas no expresan la proteína CD34.
También se describe un cultivo celular que comprende células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas diferenciadas a partir de células madre pluripotentes, en donde las células formadoras de colonias hemangioblásticas son poco adherentes entre sí.
En ciertas realizaciones, el cultivo celular comprende al menos 1 x 106 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. En ciertas realizaciones, el cultivo celular comprende al menos 5 x 106 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas.
En ciertas realizaciones, la célula madre pluripotente es una línea de células madre embrionarias obtenida sin destrucción de un embrión humano. En ciertas realizaciones, la célula madre pluripotente se selecciona entre un embrión, un blastómero, un blastocisto o una masa celular interna obtenida sin destrucción de un embrión humano.
También se describe una preparación farmacéutica que comprende células formadoras de colonias
hemangioblásticas humanas, células que se pueden diferenciar para producir al menos tipos de células
hematopoyéticas o endoteliales, en donde las células formadoras de colonias hemangioblásticas son poco adherentes entre sí.
También se describe una preparación farmacéutica que comprende células formadoras de colonias
hemangioblásticas humanas, células que se pueden diferenciar para producir al menos tipos de células
hematopoyéticas y endoteliales, en donde las células formadoras de colonias hemangioblásticas son poco adherentes entre sí.
También se describe una preparación farmacéutica que comprende células formadoras de colonias
hemangioblásticas humanas, células que se pueden diferenciar para producir al menos tipos de células
hematopoyéticas y endoteliales, en donde las células formadoras de colonias hemangioblásticas no expresan
ninguna de las siguientes proteínas: CD34, CD31, KDR, y CD133.
En ciertas realizaciones, la preparación farmacéutica comprende al menos 1 x 106 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. En ciertas realizaciones, la preparación comprende al menos 5 x 106 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas.
En ciertas realizaciones, la preparación farmacéutica que comprende células formadoras de colonias hemangioblásticas se diferencia de las células madre pluripotentes obtenidas sin destrucción de un embrión humano. En ciertas realizaciones, la célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria obtenida sin destrucción de un embrión humano. En ciertas realizaciones, la célula madre pluripotente se selecciona entre un embrión, un blastómero, un blastocisto o una masa celular interna obtenida sin destrucción de un embrión humano.
También se describe una preparación crioconservada de las células formadoras de colonias hemangioblásticas descritas en cualquiera de los párrafos anteriores.
También se describe una preparación crioconservada de al menos 1 x 106 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, en donde las células formadoras de colonias hemangioblásticas no expresan ninguna de las siguientes proteínas: CD34, CD31, KDR y CD133.
En ciertas realizaciones, la preparación crioconservada comprende al menos 5 x 106 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas.
En ciertas realizaciones, la preparación crioconservada que comprende células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas no expresa proteína CD34. En ciertas realizaciones, la preparación crioconservada que comprende células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas no expresa las proteínas CD34, CD31, CD133 y KDR. En ciertas realizaciones, la preparación crioconservada que comprende células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas expresa proteínas LMO2 y GATA2.
También se describe un cultivo que comprende una célula hematopoyética diferenciada a partir de las células formadoras de colonias hemangioblásticas como se ha descrito anteriormente. En ciertas realizaciones, también se
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describe un cultivo que comprende una célula endotelial diferenciada a partir de las células formadoras de colonias hemangioblásticas como se ha descrito anteriormente.
También se describe un cultivo que comprende una célula de músculo liso diferenciada a partir de las células formadoras de colonias hemangioblásticas como se ha descrito anteriormente.
También se describe un cultivo que comprende un cardiomiocito diferenciado a partir de las células formadoras de colonias hemangioblásticas como se ha descrito anteriormente.
También se describe el uso de las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas como se ha descrito anteriormente en la fabricación de un medicamento para tratar una afección en un paciente que lo necesite.
También se describe el uso del cultivo celular como se ha descrito anteriormente en la fabricación de un medicamento para tratar una afección en un paciente que lo necesite.
También se describe el uso de la preparación farmacéutica como se ha descrito anteriormente en la fabricación de un medicamento para tratar una afección en un paciente que lo necesite.
También se describen células formadoras de colonias hemangioblásticas producidas por procedimientos como se ha descrito anteriormente.
También se describen células madre hematopoyéticas humanas producidas por procedimientos como se ha descrito anteriormente.
También se describen células endoteliales humanas producidas por los procedimientos descritos anteriormente.
Otras realizaciones descritas en esta memoria proporcionan procedimientos para preparar y usar un nuevo tipo de célula relacionado con, pero distinto de, las células formadoras de colonias hemangioblásticas. También se describen composiciones, soluciones y preparaciones, que incluyen preparaciones crioconservadas, que comprenden este nuevo tipo de célula. También se describen usos terapéuticos in vitro e in vivo de estas células, así como procedimientos para producir uno o más tipos de células diferenciadas que se pueden usar ellas mismas in vitro o in vivo.
También se describe una célula hemangioblástica humana no injertable, que puede diferenciarse para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas, en donde la célula hemangioblástica no tiene la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un huésped.
En ciertas realizaciones, el huésped es un mamífero. En ciertas realizaciones, el mamífero es un ser humano.
En ciertas realizaciones, la célula hemangioblástica no injertable expresa algunas, pero no todas, las proteínas que caracterizan a las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un huésped. En ciertas realizaciones, la célula hemangioblástica no injertable tiene una o más características de las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un huésped. En ciertas realizaciones, la célula hemangioblástica no injertable es poco adherente a otras células hemangioblásticas.
En ciertas realizaciones, la célula hemangioblástica no injertable no expresa una o más proteínas seleccionadas entre CD34, CD31, KDR y CD133. En ciertas realizaciones, la célula hemangioblástica no injertable expresa las proteínas LMO2 y GATA2.
También se describe un cultivo celular que comprende una población sustancialmente purificada de células hemangioblásticas humanas no injertables, células que se pueden diferenciar para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas, en donde las células hemangioblásticas no tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un huésped.
También se describe un cultivo celular que comprende células hemangioblásticas humanas no injertables diferenciadas a partir de células derivadas de embriones obtenidas sin destrucción de un embrión humano, en donde las células hemangioblásticas no injertables pueden diferenciarse para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas, y en donde las células hemangioblásticas no tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un huésped.
En ciertas realizaciones, el cultivo celular comprende células hemangioblásticas no injertables que expresan algunas, pero no todas, las proteínas que caracterizan a las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un huésped. En ciertas realizaciones, el cultivo celular comprende células hemangioblásticas no injertables que tienen una o más características de las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un huésped. En ciertas realizaciones, el cultivo celular comprende células hemangioblásticas no injertables que son poco adherentes a otras células hemangioblásticas.
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En ciertas realizaciones, el cultivo celular comprende células hemangioblásticas no injertables que no expresan una o más proteínas seleccionadas entre CD34, CD31, KDR y CD133. En ciertas realizaciones, el cultivo celular comprende células hemangioblásticas no injertables que expresan proteínas LMO2 y GATA2.
También se describe un cultivo celular que comprende una célula hematopoyética diferenciada a partir de las células hemangioblásticas no injertables.
También se describe una solución de células hemangioblásticas humanas no injertables, que comprende al menos 1
x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables. En ciertas realizaciones, la solución comprende al menos 2
x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables. En ciertas realizaciones, la solución comprende al menos 3
x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables. En ciertas realizaciones, la solución comprende al menos 4
x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables.
En ciertas realizaciones, la solución comprende células hemangioblásticas humanas no injertables que pueden diferenciarse para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas, y en donde las células hemangioblásticas no injertables no tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un huésped. En ciertas realizaciones, la solución comprende células hemangioblásticas humanas no injertables que expresan algunas, pero no todas, las proteínas que caracterizan a las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un huésped. En ciertas realizaciones, la solución comprende células hemangioblásticas humanas no injertables que tienen una o más características de las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un huésped. En ciertas realizaciones, la solución comprende células hemangioblásticas humanas no injertables que son poco adherentes a otras células hemangioblásticas.
En ciertas realizaciones, la solución comprende células hemangioblásticas no injertables que no expresan una o más proteínas seleccionadas entre CD34, CD31, KDR y CD133. En ciertas realizaciones, la solución comprende células hemangioblásticas no injertables que expresan proteínas LMO2 y GATA2.
En ciertas realizaciones, la solución es inyectable para un sujeto. En ciertas realizaciones, la solución es adecuada para la congelación. En ciertas realizaciones, la solución se usa para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad que podría tratarse mediante la administración de células hemangioblásticas no injertables o células hematopoyéticas.
También se describe una preparación farmacéutica que comprende una población sustancialmente purificada de células hemangioblásticas humanas no injertables, células que se pueden diferenciar para producir al menos uno o más tipos de células hematopoyéticas, en donde la célula hemangioblástica no tiene la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un huésped. En ciertas realizaciones, la célula hemangioblástica no injertable expresa algunas, pero no todas, las proteínas que caracterizan a las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un huésped. En ciertas realizaciones, la célula hemangioblástica no injertable tiene una o más de las características de las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas que tienen la capacidad de injertar y repoblar la médula ósea en un huésped. En ciertas realizaciones, la célula hemangioblástica es poco adherente a otras células hemangioblásticas. En ciertas realizaciones, la célula hemangioblástica humana no expresa una o más proteínas seleccionadas entre CD34, CD31, KDR y CD133. En ciertas realizaciones, la célula hemangioblástica humana expresa proteínas LMO2 y GATA2. En ciertas realizaciones, la preparación comprende al menos 1 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables. En ciertas realizaciones, la preparación comprende al menos 5 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables.
También se describe una preparación crioconservada de las células hemangioblásticas humanas no injertables según la invención. En ciertas realizaciones, la preparación comprende al menos 1 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables. En ciertas realizaciones, la preparación comprende al menos 2 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables. En ciertas realizaciones, la preparación comprende al menos 3 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables. En ciertas realizaciones, la preparación comprende al menos 4 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables. En ciertas realizaciones, la preparación comprende al menos 5 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables.
También se describe un procedimiento para generar y expandir células hemangioblásticas humanas no injertables in vitro, dicho procedimiento que comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células derivadas de embriones humanos obtenidas sin destrucción de un embrión humano en medios sin suero en presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células derivadas de embriones en cuerpos embrioides; y (b) añadir al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando el cultivo en medios sin suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células hemangioblásticas humanas no injertables en el cultivo de cuerpos embrioides, en donde los cuerpos embrioides se cultivan durante 10-13 días, y en donde las células derivadas de embriones, cuerpos embrioides y células hemangioblásticas no injertables se cultivan en medios sin suero a lo largo de todas las etapas (a) y (b) de dicho procedimiento.
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También se describe un procedimiento para generar y expandir células hemangioblásticas humanas no injertables in vitro, el procedimiento que comprende las etapas de: (a) cultivar un cultivo celular que comprende células derivadas de embriones humanos obtenidas sin destrucción de un embrión humano en medios sin suero en presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células derivadas de embriones en cuerpos embrioides; (b) añadir al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando el cultivo en medios sin suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células hemangioblásticas humanas no injertables en el cultivo de cuerpos embrioides; (c) disgregar los cuerpos embrioides en células individuales; y (d) añadir al menos un factor de crecimiento al cultivo que comprende las células individuales y continuar cultivando el cultivo en medios sin suero, en donde el factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células hemangioblásticas humanas no injertables en el cultivo que comprende las células individuales, en donde el cultivo de células individuales se cultivan durante 10-13 días, y en donde las células derivadas de embriones, los cuerpos embrioides y las células hemangioblásticas no injertables se cultivan en medios sin suero durante las etapas (a)-(d) de dicho procedimiento.
En ciertas realizaciones, la célula derivada de embrión es una célula madre embrionaria obtenida sin destrucción de un embrión humano.
En ciertas realizaciones, el factor de crecimiento es una proteína que comprende una proteína homeobox o una variante funcional o una variante activa de la misma. En ciertas realizaciones, la proteína homeobox comprende una proteína HOXB4, o una variante funcional o una variante activa de la misma. En ciertas realizaciones, el factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), proteínas morfogénicas óseas (BMP), factor de células madre (SCF), Flt-3L (FL), trombopoyetina (TPO) y eritropoyetina (EPO).
En ciertas realizaciones, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o la proteína morfogénica ósea (BMP), o ambas, se añaden a la etapa (a) dentro de las 0-48 horas de cultivo celular. En ciertas realizaciones, el factor de células madre (SCF), Flt-3L (FL) o trombopoyetina (TPO), o cualquier combinación de los mismos, se añade a dicho cultivo dentro de las 48-72 horas desde el inicio de la etapa (a). En ciertas realizaciones, el factor de crecimiento se añade a la etapa (b) dentro de las 48-72 horas desde el inicio de la etapa (a).
En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende además la adición de eritropoyetina (EPO) a la etapa (b). En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende además la adición de eritropoyetina (EPO) a las etapas (b) y (d).
En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de purificar las células
hemangioblásticas humanas no injertables del cultivo. En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende además la etapa de aislar las células hemangioblásticas humanas no injertables del cultivo.
En ciertas realizaciones, el factor de crecimiento es una proteína de fusión que comprende HOXB4 y un dominio de transducción de proteínas (PTD). En ciertas realizaciones, el PTD y HOXB4 están conjugados a través de un enlazador. En ciertas realizaciones, el dominio de transducción de proteínas (PTD) es la proteína TAT, una variante funcional o un fragmento activo de la misma. En ciertas realizaciones, el HOXB4 es HOXB4 de mamífero. En ciertas realizaciones, HOXB4 de mamífero es HOXB4 de ratón o humano. En ciertas realizaciones, el HOXB4 comprende una proteína de longitud completa.
En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de cultivar las células
hemangioblásticas no injertables en condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de dichas células hemangioblásticas no injertables en células madre hematopoyéticas humanas.
En ciertas realizaciones, el cultivo comprende al menos 1 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables.
En ciertas realizaciones, el cultivo comprende al menos 2 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables.
En ciertas realizaciones, el cultivo comprende al menos 3 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables.
En ciertas realizaciones, el cultivo comprende al menos 4 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables.
También se describe un procedimiento para producir células madre hematopoyéticas humanas in vitro, que comprende las etapas de: (a) suministrar células hemangioblásticas humanas no injertables preparadas por los procedimientos de esta invención; y (b) cultivar las células hemangioblásticas humanas no injertables en condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de las células hemangioblásticas humanas no injertables en células madre hematopoyéticas humanas.
También se describe un procedimiento para administrar células hemangioblásticas humanas no injertables a un paciente que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) seleccionar al paciente que lo necesite; (b) suministrar células hemangioblásticas humanas no injertables preparadas por los procedimientos de esta invención; (c) administrar algunas o todas las células hemangioblásticas humanas no injertables al paciente.
También se describe un procedimiento para administrar células hemangioblásticas humanas no injertables a un paciente que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) seleccionar al paciente que lo necesite; (b) suministrar células hemangioblásticas humanas no injertables en una cantidad de al menos 10.000 células; (c) administrar algunas o todas las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas a dicho paciente. En ciertas
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realizaciones, las células hemangioblásticas humanas no injertables están en una cantidad entre 10.000 y 4 millones de células.
También se describe un procedimiento para administrar células madre hematopoyéticas humanas a un paciente que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) seleccionar al paciente que lo necesite; (b) suministrar células hemangioblásticas humanas no injertables preparadas por los procedimientos de esta invención; (c) diferenciar las células hemangioblásticas humanas no injertables en células madre hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas las células madre hematopoyéticas humanas a dicho paciente.
También se describe un procedimiento para administrar células madre hematopoyéticas humanas a un paciente que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) seleccionar al paciente que lo necesite; (b) suministrar células hemangioblásticas humanas no injertables en una cantidad de al menos 10.000 células; (c) diferenciar las células hemangioblásticas humanas no injertables en células madre hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas las células madre hematopoyéticas humanas a dicho paciente. En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas humanas no injertables están en una cantidad entre 10.000 y 4 millones de células.
También se describe un procedimiento para tratar un trastorno de células madre hematopoyéticas en un paciente que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) seleccionar al paciente que lo necesite; (b) suministrar células hemangioblásticas humanas no injertables preparadas por los procedimientos de esta invención; (c) diferenciar las células hemangioblásticas humanas no injertables en células madre hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas las células madre hematopoyéticas humanas al paciente.
También se describe un procedimiento para tratar un trastorno de células madre hematopoyéticas en un paciente que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) seleccionar al paciente que lo necesite; (b) suministrar células hemangioblásticas humanas no injertables en una cantidad de al menos 10.000 células; (c) diferenciar las células hemangioblásticas humanas no injertables en células madre hematopoyéticas humanas; y (d) administrar algunas o todas las células madre hematopoyéticas humanas a dicho paciente. En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas humanas no injertables están en una cantidad entre 10.000 y 4 millones de células.
También se describe un procedimiento para producir células hematopoyéticas diferenciadas a partir de células hemangioblásticas no injertables in vitro, el procedimiento que comprende las etapas de: (a) proporcionar células hemangioblásticas humanas no injertables; y (b) diferenciar las células hemangioblásticas no injertables en células hematopoyéticas diferenciadas.
También se describe un procedimiento para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vitro a partir de células hemangioblásticas humanas no injertables, el procedimiento que comprende las etapas de: (a) proporcionar células hemangioblásticas humanas no injertables; (b) diferenciar las células hemangioblásticas no injertables en células hematopoyéticas diferenciadas; y (c) realizar transfusiones de sangre con las células hematopoyéticas diferenciadas.
También se describe un procedimiento para producir células hematopoyéticas diferenciadas a partir de células hemangioblásticas no injertables in vitro, dicho procedimiento que comprende las etapas de: (a) proporcionar células hemangioblásticas humanas no injertables preparadas mediante los procedimientos de esta invención; y (b) diferenciar las células hemangioblásticas no injertables en células hematopoyéticas diferenciadas.
También se describe un procedimiento para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas diferenciadas in vitro a partir de células hemangioblásticas humanas no injertables, dicho procedimiento que comprende las etapas de: (a) proporcionar células hemangioblásticas humanas no injertables preparadas mediante los procedimientos de esta invención; (b) diferenciar las células hemangioblásticas no injertables en células hematopoyéticas diferenciadas; y (c) realizar transfusiones de sangre con dichas células hematopoyéticas diferenciadas.
También se describen células hemangioblásticas no injertables producidas por procedimientos como se ha descrito anteriormente.
También se describen células madre hematopoyéticas humanas producidas por procedimientos como se ha descrito anteriormente.
También se describen células madre hematopoyéticas humanas diferenciadas producidas por procedimientos como se ha descrito anteriormente.
También se describen células endoteliales humanas producidas mediante los procedimientos descritos anteriormente.
Otros procedimientos, composiciones, preparaciones y características ilustrativos de la invención se describen en la Solicitud de Estados Unidos con el n.° de serie 11/787.262, presentada el 13 de abril de 2007, y titulada «células formadoras de colonias hemangioblásticas». Debe señalarse que los solicitantes consideran que todas las operaciones son combinaciones operativas de las realizaciones ilustrativas descritas para que sean materias
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patentables que incluyen combinaciones de la materia objeto descrita en la Solicitud de Estados Unidos con el n.° de Serie 11/787.262.
En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, las células hemangioblásticas no injertables proporcionadas en la presente memoria tienen una o más de las propiedades de las células descritas en la Solicitud de Estados Unidos con el n.° de Serie 11/787.262. En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, las células hemangioblásticas no injertables proporcionadas en la presente memoria se formulan como composiciones, preparaciones, preparaciones crioconservadas o soluciones purificadas o mezcladas como se describe en la Solicitud de Estados Unidos con el n.° de Serie 11/787.262. En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, las células hemangioblásticas no injertables proporcionadas en esta memoria se usan terapéuticamente o en bancos de sangre como se describe en la Solicitud de Estados Unidos con el n.° de Serie 11/787.262. En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, las células hemangioblásticas no injertables proporcionadas en la presente memoria se usan para generar tipos celulares diferenciados de forma parcial y/o terminal para su uso in vitro o in vivo como se describe en la Solicitud de Estados Unidos con el n.° de Serie 11/787.262. En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, las células hemangioblásticas no injertables proporcionadas en la presente memoria se derivan de células ES, células ED, etc. obtenidas sin destrucción de un embrión humano usando cualquiera de las metodologías descritas en la presente memoria y en la Solicitud de Estados Unidos con el n.° de serie 11/787.262.
En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, las células hemangioblásticas no injertables se usan para producir células hematopoyéticas diferenciadas, por ejemplo, glóbulos rojos diferenciados.
En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, las células formadoras de colonias hemangioblásticas y/o células hemangioblásticas no injertables se generan a partir de material embrionario, tales como células madre embrionarias o células derivadas de embriones obtenidas sin destrucción de un embrión humano. En ciertas realizaciones, las células se generan a partir de células pluripotentes obtenidas sin destrucción de un embrión humano. Aunque las células madre embrionarias son ejemplos de células pluripotentes, la descripción también contempla que se puedan usar otros tipos de células pluripotentes, que incluyen tipos de células pluripotentes no embrionarias, para generar células formadoras de colonias hemangioblásticas y/o células hemangioblásticas no injertables. Los ejemplos de otras células pluripotentes incluyen, pero no se limitan a, células madre pluripotentes inducidas (iPS).
En ciertas realizaciones inventivas en donde se usan células iPS, dichas células iPS se someten a tripsina, dichas células iPS se mantienen con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) o se mantienen sin alimentador, y/o se añade Y-27632 a un medio de cuerpos embrioides sin suero y/o medios de diferenciación.
En ciertas realizaciones, también se describen hemangioblastos, células formadoras de colonias hemangioblásticas, células hemangioblásticas no injertables, células hematopoyéticas y células endoteliales producidas a partir de células iPS como se describe en esta memoria.
La invención contempla combinaciones de cualquiera de los aspectos y realizaciones anteriores de la invención.
Otras características y ventajas de la invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, tomada junto con los dibujos adjuntos, que ilustran, a modo de ejemplo, diversas características de las realizaciones de la invención.
Breve descripción de las figuras
Las realizaciones a modo de ejemplo se ilustran en las figuras a las que se hace referencia. Se pretende que las realizaciones y figuras descritas en esta memoria se consideren ilustrativas más que restrictivas.
La Figura 1 representa los efectos de BMP y VEGF165 en el desarrollo de colonias de blastos según una realización de la presente invención. A. Se añadieron diferentes dosis de BMP-4 en medio EB que contenía 50 ng/ml de VEGF165, y se observó un desarrollo dependiente de la dosis de las colonias de blastos para BMP-4. B. El medio EB que contiene 50 ng/ml de BMP-4 y VEGF165 se complementó con diferentes dosis (0, 10 y 20 ng/ml) de BMP-2 y BMP-7. BMP-2 y BMP-7 no consiguieron promover el desarrollo de la colonia de blastos. Se añadieron diferentes dosis de VEGF165 en medio EB que contenía 50 ng/ml de BMP-4. El desarrollo de colonias de blastos es dependiente de la dosis de VEGF165. ** P <0,01, n = 3. 1 x 105 células del día 3. Se cultivaron en placa 5 EB por pocillo.
La Figura 2 representa el efecto de bFGF sobre el desarrollo de colonias de blastos añadidas durante diferentes etapas según una realización de la presente invención, (a) Se añadieron diferentes dosis de bFGF en medio EB; (b) Se complementaron diferentes dosis de bFGF en medio de crecimiento de colonias de blastos (BGM); (c) Se añadieron diferentes dosis de bFGF tanto en medio EB como en BGM. ** P <0,01, n = 3. B y C. Se desarrolló la formación una estructura de tipo reticular de células endoteliales derivadas de BC en BGM con (B) y sin (C) bFGF. Las células endoteliales de ambas fuentes formaron estructuras tipo reticular sin diferencias obvias.
La Figura 3 representa el efecto de bFGF sobre el desarrollo de colonias de blastos a partir de tres líneas de hESC
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según una realización de la presente invención. Tiras diagonales: se añadieron diferentes dosis de bFGF en BGM. Horizontal: se añadieron varias dosis de bFGF en medio EB. * P <0,05; ** P <0,01, n = 3.
La Figura 4 representa hESC cultivadas en condiciones sin alimentador que retienen marcadores de pluripotencia y son capaces de una diferenciación de hemangioblastos robusta según una realización de la presente invención. Después de 4-5 pases en condiciones sin alimentador, las células WA01 se tiñeron para la expresión de los marcadores hESC Oct-4 (AC: DAPI, Oct-4 y se fusionaron, respectivamente) y Tra-1-60 (D-F DAPI, TrA-1-60, y se fusionaron, respectivamente). Los paneles G y H demuestran diferencias en la morfología de la colonia cuando las hESC se cultivan en Matrigel (G) frente a MEF (H). Ampliación: originalmente X100. En el panel I, las hESC se cultivaron en MEF o Matrigel y a continuación se diferenciaron en las condiciones optimizadas descritas en esta memoria. Se observó una expansión de hemangioblastos considerablemente mayor en células cultivadas en Matrigel en comparación con las hESC cultivadas con MEF. * P <0,03, n = 3.
La Figura 5 representa el análisis de qRT-PCR de la expresión génica en EB cultivados en diferentes condiciones según una realización de la presente invención. Los niveles de expresión de varios genes asociados con el desarrollo de hemangioblastos se analizaron en EB derivados en presencia o ausencia de una combinación de ambos, BMP-4 y VEGF165. Se usó p-actina como control interno para normalizar la expresión génica. La expresión génica relativa se presenta como una diferencia en múltiplos en comparación con los niveles de expresión promedio observados en las hESC no diferenciadas. ** P <0,002; *** P <0,0004, n = 3.
La Figura 6 representa la identificación de marcadores de superficie para progenitores de hemangioblastos según una realización de la presente invención. Las células EB se enriquecieron con diferentes anticuerpos utilizando el Kit EasySep, y a continuación se cultivaron en placa para el desarrollo de colonias de blastos. ** P <0,01, n = 3.
La Figura 7 representa una secuencia de ácidos nucleicos de tipo silvestre de la proteína HOXB4 según una realización de la presente invención.
La Figura 8 representa una secuencia de ácidos nucleicos de tipo silvestre de la proteína HOXB4 según una realización de la presente invención.
La Figura 9 representa una secuencia de aminoácidos de HOXB4 según una realización de la presente invención.
La Figura 10 representa una secuencia de aminoácidos de HOXB4 según una realización de la presente invención.
La Figura 11 representa las iPSC (IMR90-1) cultivadas en condiciones sin alimentador que retienen los marcadores de pluripotencia según una realización de la presente invención. Después de 4-5 pases en condiciones sin alimentador, las células iPS (IMR90-1) se tiñeron para la expresión de marcadores de pluripotencia. a, campo claro; b, Nanog; c, Oct-4; d, SSEA-4; y e, TRA-1-60. Ampliación: originalmente X200.
La Figura 12 representa el efecto del inhibidor de ROCK sobre la diferenciación hemangioblástica de iPSC según una realización de la presente invención. EB generados a partir de células iPS (IMR90-1) 24 h después del cultivo en placa sin (a, originalmente 100x) y con (b, originalmente 100x) inhibidor de ROCK; colonias de blastos derivadas de células iPS (IMR90-1) sin inhibidor de ROCK (c, originalmente 200x), con inhibidor de ROCK (d, originalmente 200x), y con inhibidor de ROCK más inhibidor de la vía Art (e, originalmente 200x) durante la formación de EB; f-j: diferenciación de células hematopoyéticas y endoteliales de hemangioblastos derivados de iPSC: f (originalmente 200x); CFU-E; g (originalmente 100x), CFU-M; h (originalmente 40x), CFU-G; i (originalmente 400x), la absorción de Ac-LDL (rojo) por las células endoteliales teñidas con VE-Cadherin (verde); j (originalmente 40x), una red similar a un tubo después de poner placas de células endoteliales en Matrigel.
Descripción de la invención
A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Singleton y col., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3a ed., J. Wiley&Sons (Nueva York, NY 2001); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 5th ed., J. Wiley&Sons (Nueva York, NY 2001); y Sambrook y Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2001), proporcionan a un experto en la materia una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud.
Un experto en la materia reconocerá muchos procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria, que podrían usarse en la práctica de la presente invención. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.
Tal como se usa en la descripción de este documento y a lo largo de las reivindicaciones que siguen, el significado de «un», «una» y «el/la» incluye una referencia al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, como se usa en la descripción en esta memoria, el significado de «en» incluye «en» y «sobre» a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
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A lo largo de esta memoria descriptiva, se entenderá que la palabra «comprender» o variaciones tales como «comprende» o «que comprende» implica la inclusión de un número entero o grupos enteros pero no la exclusión de ningún otro entero o grupo de números enteros.
El término «células madre embrionarias» (células ES) se refiere a células derivadas de embriones obtenidas sin destrucción de un embrión humano y se usa en la presente memoria como se usa en la técnica. Este término incluye células derivadas de la masa celular interna de blastocistos o mórulas humanos, incluidos los que han sido pasados en serie como líneas celulares. Cuando se usa para referirse a células procedentes de seres humanos, se usa la expresión célula madre embrionaria humana (hES), este término se refiere a hES obtenidas sin destrucción de un embrión humano. Las células ES pueden derivarse de la fertilización de un óvulo con esperma, así como también del uso de ADN, transferencia nuclear, partenogénesis, o por medios para generar células ES con homocigosis en la región HLA, y se obtienen sin destrucción de un embrión humano. Las células ES también son células derivadas de un cigoto, blastómeros o embrión de mamífero en fase de blastocisto producido por la fusión de un espermatozoide y un óvulo, transferencia nuclear, partenogénesis, androgénesis, o la reprogramación de la cromatina y la posterior incorporación de la cromatina reprogramada en un membrana plasmática para producir una célula, y se obtienen sin destrucción de un embrión humano. Las células madre embrionarias, independientemente de su fuente o el procedimiento particular utilizado para producirlas, se pueden identificar en base a (i) la capacidad de diferenciarse en células de las tres capas germinales, (ii) la expresión de al menos Oct-4 y fosfatasa alcalina y (iii) la capacidad para producir teratomas cuando se trasplantan a animales inmunodeficientes.
Como se usa en la presente memoria, el término «células madre pluripotentes» incluye células madre embrionarias, células madre derivadas de embriones obtenidas sin destrucción de un embrión humano, y células madre pluripotentes inducidas. Las células madre pluripotentes se definen funcionalmente como células madre que son: (a) capaces de inducir teratomas cuando se trasplantan en ratones inmunodeficientes (SCID); (b) capaces de diferenciarse a tipos celulares de las tres capas germinales (por ejemplo, se pueden diferenciar a tipos de células ectodérmicas, mesodérmicas y endodérmicas); y (c) expresan uno o más marcadores de células madre embrionarias (por ejemplo, expresan Oct 4, fosfatasa alcalina, antígeno de superficie SSEA-3, antígeno de superficie SSEA-4, nanog, TRA-1-60, TrA-1-81, SOX2, REX1, etc.). Las células madre pluripotentes ejemplares pueden generarse usando, por ejemplo, procedimientos conocidos en la técnica sin destrucción de un embrión humano. Las células madre pluripotentes ejemplares incluyen células madre embrionarias derivadas del ICM de embriones en estadio de blastocito, así como células madre embrionarias derivadas de uno o más blastómeros de un estadio de escisión o embrión en estadio de mórula sin destruir el resto del embrión. Dichas células madre embrionarias pueden generarse a partir de material embrionario producido por fertilización o por medios asexuales, incluida la transferencia nuclear de células somáticas (SCNt), partenogénesis y androgénesis y se obtienen sin destrucción de un embrión humano. Otras células madre pluripotentes ejemplares incluyen células madre pluripotentes inducidas (células iPS) generadas reprogramando una célula somática mediante la expresión de una combinación de factores (en lo sucesivo, factores de reprogramación). Las células iPS se pueden generar usando células somáticas fetales, postnatales, recién nacidas, juveniles o adultas. En ciertas realizaciones, los factores que se pueden usar para reprogramar células somáticas a células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, una combinación de Oct4 (a veces denominado Oct 3/4), Sox2, c-Myc y Klf4. En otras realizaciones, los factores que se pueden usar para reprogramar células somáticas a células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, una combinación de Oct 4, Sox2, Nanog y Lin28. En otras realizaciones, las células somáticas se reprograman expresando al menos 2 factores de reprogramación, al menos tres factores de reprogramación o cuatro factores de reprogramación. En otras realizaciones, se identifican factores de reprogramación adicionales y se usan solos o en combinación con uno o más factores de reprogramación conocidos para reprogramar una célula somática a una célula madre pluripotente. Las células madre pluripotentes inducidas se definen funcionalmente e incluyen células que se reprograman usando cualquiera de una variedad de procedimientos (vectores integrativos, vectores no integrativos, medios químicos, etc.).
Las células madre pluripotentes pueden ser de cualquier especie. Las células madre embrionarias se han obtenido con éxito en, por ejemplo, ratones, múltiples especies de primates no humanos y humanos, y se han generado células de tipo células madre embrionarias a partir de numerosas especies adicionales. Por lo tanto, un experto en la materia puede generar células madre embrionarias y células madre derivadas de embriones de cualquier especie, incluidos, entre otros, primates humanos, no humanos, roedores (ratones, ratas), ungulados (vacas, ovejas, etc.), perros (domésticos y salvajes), felinos (felinos domésticos y salvajes como leones, tigres, guepardos), conejos, hámsteres, jerbos, ardillas, conejillos de indias, cabras, elefantes, pandas (incluyendo pandas gigantes), cerdos, mapaches, caballo, cebra, mamíferos marinos (delfines, ballenas, etc.) y similares. En ciertas realizaciones, la especie es una especie en peligro de extinción. En ciertas realizaciones, la especie es una especie actualmente extinta.
Del mismo modo, las células iPS pueden ser de cualquier especie. Las células iPS se han generado con éxito utilizando células humanas y de ratón. Las células iPS se han generado con éxito utilizando tejido embrionario, fetal, de recién nacido y adulto. En consecuencia, uno puede generar fácilmente células iPS utilizando una célula donante de cualquier especie. Por lo tanto, se pueden generar células iPS de cualquier especie, incluidos, entre otros, primates humanos, no humanos, roedores (ratones, ratas), ungulados (vacas, ovejas, etc.), perros (domésticos y salvajes), felinos (felinos domésticos y salvajes como leones, tigres, guepardos), conejos, hámsteres, cabras, elefantes, pandas (incluyendo pandas gigantes), cerdos, mapaches, caballos, cebras, mamíferos marinos (delfines,
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ballenas, etc.) y similares. En ciertas realizaciones, la especie es una especie en peligro de extinción. En ciertas realizaciones, la especie es una especie actualmente extinta.
Las células madre pluripotentes inducidas pueden generarse utilizando, como punto de partida, prácticamente cualquier célula somática en cualquier etapa del desarrollo. Por ejemplo, la célula puede ser de un embrión, feto, neonato, juvenil o donante adulto. Las células somáticas ilustrativas que se pueden usar incluyen fibroblastos, tales como fibroblastos dérmicos obtenidos mediante una muestra de piel o biopsia, sinoviocitos de tejido sinovial, células de prepucio, células de la mejilla o fibroblastos de pulmón. Aunque la piel y las mejillas proporcionan una fuente fácilmente disponible y fácilmente alcanzable de células apropiadas, se puede usar prácticamente cualquier célula. En ciertas realizaciones, la célula somática no es un fibroblasto.
Téngase en cuenta que las células madre pluripotentes pueden ser, por ejemplo, células ES obtenidas sin destrucción de un embrión humano o células madre pluripotentes inducidas. Las células madre pluripotentes inducidas pueden producirse expresando una combinación de factores de reprogramación en una célula somática. En ciertas realizaciones, al menos dos factores de reprogramación se expresan en una célula somática para reprogramar con éxito la célula somática. En otras realizaciones, al menos tres factores de reprogramación se expresan en una célula somática para reprogramar con éxito la célula somática. En otras realizaciones, al menos cuatro factores de reprogramación se expresan en una célula somática para reprogramar con éxito la célula somática.
El término «dominio de transducción de proteínas» («PTD») se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos que se transloca a través de una membrana celular en células o confiere o aumenta la velocidad de, por ejemplo, otra molécula (como, por ejemplo, un dominio de proteína) a la cual está unido el PTD, para translocarse a través de una membrana celular hacia las células. El dominio de transducción de proteínas puede ser un dominio o secuencia que se produce naturalmente como parte de una proteína más grande (por ejemplo, un PTD de una proteína viral tal como TAT de VIH) o puede ser una secuencia de aminoácidos sintética o artificial.
Los términos «hemangioblasto» y «células formadoras de colonias hemangioblásticas» se usarán indistintamente a lo largo de esta solicitud. Las células tienen numerosas características estructurales y funcionales. Entre las características de estas células está la capacidad de injertarse en la médula ósea cuando se administran a un huésped. Estas células se pueden describir en base a numerosas propiedades estructurales y funcionales que incluyen, pero no se limitan a, expresión (ARN o proteína) o falta de expresión (ARN o proteína) de uno o más marcadores. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas son capaces de diferenciarse para dar lugar al menos a tipos de células hematopoyéticas o tipos de células endoteliales. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas son preferiblemente bipotenciales y capaces de diferenciarse para dar lugar al menos a tipos de células hematopoyéticas y tipos de células endoteliales. Como tales, las células formadoras de colonias hemangioblásticas de la presente invención son al menos unipotenciales, y preferiblemente bipotenciales. Además, sin embargo, las células formadoras de colonias hemangioblásticas pueden tener un mayor grado de potencial de desarrollo y, en ciertas realizaciones, pueden diferenciarse para dar lugar a tipos celulares de otros linajes. En ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas son capaces de diferenciarse para dar lugar a otros derivados mesodérmicos tales como células cardíacas (por ejemplo, cardiomiocitos) y/o células de músculo liso.
El término «células hemangioblásticas no injertables» se usa a lo largo de esta solicitud para referirse a una nueva población de células que comparten algunas de las características de las células formadoras de colonias hemangioblásticas. Sin embargo, las células hemangioblásticas no injertables se distinguen por que no se injertan en la médula ósea cuando se administran a un huésped inmunodeficiente. A pesar de esta diferencia, las células hemangioblásticas no injertables pueden compartir una o más de una (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) de las características/propiedades funcionales o estructurales de las células formadoras de colonias hemangioblásticas. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas no injertables son poco adherentes entre sí. En otras realizaciones, las células hemangioblásticas no injertables no expresan una o más de una (2, 3, 4) de las siguientes proteínas: CD34, KDR, CD133, CD31. Sin estar limitados por la teoría, las células hemangioblásticas no injertables pueden proporcionar una población de células madre distinta que está algo más comprometida que las células formadoras de colonias hemangioblásticas, y aun así es capaz de producir una gama de tipos de células hematopoyéticas.
Células formadoras de colonias hemangioblásticas
Esta invención proporciona un procedimiento para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas inducidas (iPSC) obtenidas sin destrucción de un embrión humano. También se describen preparaciones y composiciones que comprenden células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, procedimientos para producir diversos tipos celulares parcial o terminalmente diferenciados de células formadoras de colonias hemangioblásticas, procedimientos de uso terapéutico de células formadoras de colonias hemangioblásticas y procedimientos de uso terapéutico de diversos tipos celulares parcial o terminalmente diferenciados a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas.
En la presente invención, los inventores informan de un procedimiento más simple y más eficiente para la
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generación robusta de progenitores hemangioblásticos. Además de eliminar varios factores costosos que son innecesarios, se demuestra que la proteína morfogenética ósea-4 (BMP-4) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) son necesarios y suficientes para inducir el compromiso hemangioblástico y el desarrollo de células madre pluripotentes durante etapas tempranas de diferenciación. BMP-4 y VEGF aumentan significativamente la expresión del gen T-brachyury, KDR, CD31 y LMO2, mientras que regulan negativamente de forma drástica la expresión de Oct-4. Se descubrió que la adición del factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) durante el crecimiento y la expansión mejora adicionalmente el desarrollo de BC, generando consistentemente aproximadamente 1 x 108 BC en una placa de seis pocillos de hESC.
También se describe un procedimiento para expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas de mamífero obtenidas de cualquier fuente, incluidas células ES, blastocistos o blastómeros obtenidos sin destrucción de un embrión humano, sangre de cordón umbilical o de placenta, sangre periférica, médula ósea u otro tejido o por cualquier otro medio conocido en la técnica. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas también se pueden generar a partir de células madre pluripotentes humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano. Las células madre pluripotentes humanas pueden ser una población de células sustancialmente homogénea, una población heterogénea de células, o la totalidad o una parte de un tejido embrionario obtenido sin destrucción de un embrión humano. Como ejemplo de células madre pluripotentes que se pueden usar en los procedimientos de la presente invención, se pueden generar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas a partir de células madre embrionarias humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano. Dichas células madre embrionarias incluyen células madre embrionarias obtenidas sin destrucción de un embrión humano que se derivan de o usan, por ejemplo, blastocistos, ICM cultivadas en placa, uno o más blastómeros, u otras porciones de un embrión en fase de preimplantación o similar a una estructura de tipo embrionaria, independientemente de si se produce por fertilización, transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), partenogénesis, androgénesis u otros medios sexuales o asexuales.
En ciertas realizaciones, los hemangioblastos se pueden diferenciar adicionalmente a células hematopoyéticas que incluyen, pero no se limitan a, plaquetas y glóbulos rojos. Dichas células se pueden usar en transfusiones. La capacidad de generar grandes cantidades de células para transfusiones aliviará la escasez crónica de sangre en bancos de sangre y hospitales de todo el país. En ciertas realizaciones, los procedimientos de la invención permiten la producción de células universales para transfusión. Específicamente, pueden generarse fácilmente glóbulos rojos que son de tipo O y Rh- y servirán como fuente de sangre universal para la transfusión.
Los procedimientos de esta invención permiten la expansión in vitro de hemangioblastos a grandes cantidades útiles para una variedad de aplicaciones comerciales y clínicas. La expansión de hemangioblastos in vitro se refiere a la proliferación de hemangioblastos. Aunque los procedimientos de la invención permiten la expansión de células hemangioblásticas humanas hasta alcanzar cantidades comercialmente útiles, también se describen un gran número de células hemangioblásticas y preparaciones celulares que comprenden grandes cantidades de células hemangioblásticas humanas (por ejemplo, al menos 10.000, 100.000 o 500.000 células). En ciertas realizaciones, las preparaciones celulares comprenden al menos 1 x 106 células. En otras realizaciones, las preparaciones celulares comprenden al menos 2 x 106 células hemangioblásticas humanas y en realizaciones adicionales al menos 3 x 106 células hemangioblásticas humanas. En otras formas de realización más, las preparaciones celulares comprenden al menos 4 x 106 células hemangioblásticas humanas.
También se describe una solución, una preparación y una composición que comprende entre 10.000 y 4 millones o más células hemangioblásticas de mamífero (tal como de ser humano). El número de células hemangioblásticas en dicha solución, preparación y composición puede ser cualquier número entre el intervalo de 10.000 a 4 millones o más. Este número podría ser, por ejemplo, de 20.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1 millón, etc.
De forma similar, también se describen preparaciones de células de progenie de hemangioblasto humano (por ejemplo, células hematopoyéticas humanas que incluyen células madre hematopoyéticas humanas y células endoteliales). También se describen procedimientos para producir, almacenar y distribuir células hemangioblásticas y/o células del linaje de hemangioblastos.
También se describen procedimientos y soluciones adecuadas para la transfusión en pacientes humanos o animales. En realizaciones particulares, se describen procedimientos para fabricar glóbulos rojos y/o plaquetas, y/u otros tipos de células hematopoyéticas para transfusión. En ciertas realizaciones, estos son adecuados para su uso en bancos de sangre y hospitales para proporcionar sangre para transfusión después de un traumatismo, o en el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con la sangre. En ciertas realizaciones, estos proporcionan glóbulos rojos que son células donantes universales. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos son funcionales y expresan hemoglobina F antes de la transfusión.
También se describen células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, cultivos celulares que comprenden una población sustancialmente purificada de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, preparaciones farmacéuticas que comprenden células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas y preparaciones crioconservadas de las células formadoras de colonias hemangioblásticas. En ciertas realizaciones, también se describe el uso de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en la fabricación de un medicamento para tratar una afección en un paciente que lo necesite. Alternativamente, también
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se describe el uso de los cultivos celulares en la fabricación de un medicamento para tratar una afección en un paciente que lo necesite. También se describe el uso de preparaciones farmacéuticas en la fabricación de un medicamento para tratar una afección en un paciente que lo necesite.
Las células formadoras de colonias hemangioblásticas se pueden identificar y caracterizar en función de sus propiedades estructurales. Específicamente, y en ciertas realizaciones, estas células son únicas, ya que solo se adhieren poco entre sí (se adhieren poco a otras células formadoras de colonias hemangioblásticas). Debido a que estas células son solo poco adherentes entre sí, los cultivos o colonias de células formadoras de colonias hemangioblásticas se pueden disociar a células individuales usando únicamente técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática. Las células son lo suficientemente poco adherentes entre sí para que la disociación mecánica sola, en lugar de la disociación enzimática o una combinación de disociación mecánica y enzimática, sea suficiente para disgregar los cultivos o colonias sin perjudicar sustancialmente la viabilidad de las células. En otras palabras, la disociación mecánica no requiere tanta fuerza como para causar una lesión celular sustancial o la muerte cuando se compara con lo observado después de la disociación enzimática de agregados celulares.
Además, las células formadoras de colonias hemangioblásticas se pueden identificar o caracterizar basándose en la expresión o falta de expresión (según se evalúa a nivel del gen o a nivel de proteína) de uno o más marcadores. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas pueden identificarse o caracterizarse basándose en la falta de expresión de uno o más (por ejemplo, las células pueden caracterizarse basándose en la falta de expresión de al menos uno, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro) de los siguientes marcadores de superficie celular: CD34, KDR, CD133 o CD31. Además o como alternativa, las células formadoras de colonias hemangioblásticas se pueden identificar o caracterizar basándose en la expresión de GATA2 y/o LMO2. Además o como alternativa, las células formadoras de colonias hemangioblásticas se pueden identificar o caracterizar basándose en la expresión o la falta de expresión de marcadores.
Las células formadoras de colonias hemangioblásticas se pueden identificar o caracterizar basándose en una o cualquier combinación de estas características estructurales o funcionales. Téngase en cuenta que aunque estas células se pueden derivar de cualquiera de varias fuentes, por ejemplo, tejido embrionario, tejido prenatal o tejido perinatal, el término «células formadoras de colonias hemangioblásticas» se aplica a las células, independientemente de la fuente, que sean capaces de diferenciarse para dar lugar a al menos tipos de células hematopoyéticas y/o tipos de células endoteliales y que tienen una o más de las propiedades estructurales o funcionales anteriores.
En ciertas realizaciones, el marcador o marcadores para el progenitor de BC se pueden usar para seleccionar BC después del cultivo inicial.
En ciertas realizaciones, las colonias hemangioblásticas se producen a partir de células pluripotentes obtenidas sin destrucción de un embrión humano sin formar cuerpos embrioides.
Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes para obtener cuerpos embrioides y hemangioblastos
La presente invención proporciona un procedimiento para generar y expandir hemangioblastos humanos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC). Los hemangioblastos así producidos pueden purificarse y/o aislarse.
Las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas también se pueden generar a partir de células madre pluripotentes humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano. Las células madre pluripotentes humanas pueden ser una población de células sustancialmente homogénea, una población heterogénea de células, o la totalidad o una parte de un tejido embrionario obtenido sin destrucción de un embrión humano. Como ejemplo de células madre pluripotentes que se pueden usar en los procedimientos de la presente invención, se pueden generar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas a partir de células madre embrionarias humanas. Dichas células madre embrionarias se obtienen sin destruir un embrión humano e incluyen células madre embrionarias derivadas de, o usando, por ejemplo, blastocistos, ICM cultivadas en placa, uno o más blastómeros, u otras porciones de un embrión en fase de preimplantación o estructura de tipo embrionaria, independientemente de si se produce por fertilización, transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), partenogénesis, androgénesis u otros medios sexuales o asexuales.
Además o como alternativa, las células formadoras de colonias hemangioblásticas pueden generarse a partir de otras células madre pluripotentes obtenidas sin destrucción de un embrión humano. Por ejemplo, se pueden generar células formadoras de colonias hemangioblásticas (sin pasar necesariamente por un proceso de derivación de células madre embrionarias) obtenidas sin destrucción de un embrión humano a partir de embriones en placa, ICM, blastocistos, células de trofoblasto/trofectodermo, uno o más blastómeros, células madre de trofoblasto, células germinales embrionarias, u otras porciones de un embrión en fase de pre-implantación o una estructura de tipo embrionaria, independientemente de si se produce por fertilización, transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), partenogénesis, androgénesis, u otras relaciones sexuales o asexuales medio. De manera similar, se pueden generar células formadoras de colonias hemangioblásticas obtenidas sin destrucción de un embrión humano
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usando células o líneas celulares parcialmente diferenciadas a partir de células madre pluripotentes. Por ejemplo, si se usa una línea de células madre embrionarias humanas obtenida sin destrucción de un embrión humano para producir células que son más primitivas en su desarrollo que las células formadoras de colonias hemangioblásticas, en términos de potencial de desarrollo y plasticidad, dichas células madre pluripotentes podrían usarse entonces para generar células formadoras de colonias hemangioblásticas.
Además, o como alternativa, las células formadoras de colonias hemangioblásticas se pueden generar a partir de otras fuentes prenatales o perinatales que incluyen, sin limitación, el cordón umbilical, la sangre del cordón umbilical, el líquido amniótico, las células madre amnióticas y la placenta.
Se observa que cuando se generan células formadoras de colonias hemangioblásticas a partir de tejido embrionario humano obtenido sin destrucción de un embrión humano, puede ser necesaria una etapa de formación de cuerpos embrioides. Sin embargo, dado que la formación del cuerpo embrioide sirve, al menos en parte, para ayudar a recapitular la interacción tridimensional de las capas germinales que ocurre durante el desarrollo temprano, dicha etapa no necesariamente es imprescindible cuando las células madre pluripotentes ya tienen una estructura u organización que sirve sustancialmente al mismo propósito que la formación de cuerpos embrioides. A modo de ejemplo, cuando las células formadoras de colonias hemangioblásticas se generan a partir de blastocistos en placa obtenidos sin destrucción de un embrión humano, ya existe un nivel de organización tridimensional entre las células del blastocisto. Como tal, no se requiere necesariamente una etapa de formación de cuerpos embrioides para proporcionar señales intercelulares, señales inductivas o arquitectura tridimensional.
Los procedimientos y usos descritos en esta memoria se pueden utilizar para generar células formadoras de colonias hemangioblásticas a partir de células madre pluripotentes o células derivadas de embriones obtenidas sin destrucción de un embrión humano. En ciertas realizaciones, las células derivadas de embriones son células madre embrionarias obtenidas sin destrucción de un embrión humano. En algunas otras realizaciones, las células derivadas de embriones obtenidas sin destrucción de un embrión humano son embriones obtenidos en placa, ICM, blastocistos, células de trofoblasto/trofectodermo, uno o más blastómeros, células madre de trofoblasto u otras partes de un embrión de preimplantación temprana. Para cualquiera de los anteriores, las células derivadas de embriones pueden proceder de embriones producidos por fertilización, transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), partenogénesis, androgénesis u otros medios sexuales o asexuales.
A lo largo de esta solicitud, cuando se describe un procedimiento al referirse específicamente a la generación de células formadoras de colonias hemangioblásticas a partir de células madre embrionarias obtenidas sin destrucción de un embrión humano, se contempla de manera similar la generación de células formadoras de colonias hemangioblásticas a partir o con el uso de otras células madre pluripotentes o células embrionarias derivadas obtenidas sin destrucción de un embrión humano, y usando las células generadas para cualquiera de las mismas aplicaciones terapéuticas.
En ciertos aspectos descritos en la presente memoria, las células madre embrionarias humanas pueden ser el material de partida de este procedimiento y se obtienen sin destrucción de un embrión humano. Las células madre embrionarias se pueden cultivar de cualquier manera conocida en la técnica, tal como en presencia o ausencia de células alimentadoras.
Las células madre embrionarias pueden formar cuerpos embrioides («EB») en suspensión en un medio que contiene suero (Wang y col., 2005 J Exp Med (201): 1603-1614; Wang y col., 2004 Immunity (21): 31-41; Chadwick y col. 2003 Blood (102): 906-915). La adición de suero, sin embargo, presenta ciertos desafíos, incluida la variabilidad en los experimentos, el coste, el potencial de agentes infecciosos y el suministro limitado. Además, para aplicaciones clínicas y ciertas aplicaciones comerciales, el uso de suero requiere cuestiones adicionales de cumplimiento normativo internacional y de Estados Unidos que rijan los productos biológicos.
La presente invención proporciona procedimientos para generar y expandir hemangioblastos humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en donde no se usa suero. Las condiciones sin suero son más propicias para la producción a mayor escala bajo buenas pautas de proceso de fabricación (GMP) que las condiciones que requieren suero. Además, las condiciones sin suero extienden la semivida de ciertos factores agregados al medio (por ejemplo, la semivida de proteínas que incluyen factores de crecimiento, citoquinas y HOXB4 en los medios aumenta cuando no hay suero). Los medios se complementan con BMP4 y VEGF. Se usa medio sin suero a través de los procedimientos de esta invención para generar y expandir hemangioblastos humanos.
En la primera etapa de este procedimiento para generar y expandir células hemangioblásticas humanas, las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) se cultivan en medios sin suero y se inducen para diferenciarse en cuerpos embrioides. Para inducir la formación de cuerpos embrioides, las células madre embrionarias obtenidas sin destrucción de un embrión humano pueden sedimentarse y resuspenderse en un medio sin suero (por ejemplo, en los medios Stemline I o II (Sigma™)) complementado con uno o más factores morfogénicos y citoquinas y a continuación se siembra en placas de cultivo de baja fijación (por ejemplo, fijación ultrabaja). Los factores morfogénicos y las citoquinas pueden incluir, pero sin limitación a, proteínas morfogénicas óseas (por ejemplo, BMP2, BMP-4, BMP-7, pero no BMP-3) y VEGF, SCF y FL. Las proteínas morfogénicas óseas y el VeGf se pueden
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usar solos o en combinación con otros factores. Los factores morfogénicos y las citoquinas se pueden añadir a los medios en 0-48 horas de cultivo celular. Después de la incubación bajo estas condiciones, la incubación en presencia de citoquinas de expansión hematopoyéticas tempranas, que incluyen, pero no se limitan a, trombopoyetina (TPO), ligando de Flt-3 y factor de células madre (SCF), permite que las células ES en placa formen EB. Además de TPO, el ligando de Flt-3 y el SCF, también se pueden añadir a los medios VEGF, BMP-4 y HoxB4. En una realización, las células ES humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano se hacen crecer primero en presencia de BMP-4 y VEGF165 (por ejemplo, 25-100 ng/ml), seguido de crecimiento en presencia de BMP-4, VeGf 165, SCF, TPO y ligando de FLt3 (por ejemplo, 10-50 ng/ml) y HoxB4 (por ejemplo, 1,5-5 pg/ml de una proteína de fusión triple de dominio de transducción de proteínas-HoxB4 como se describe en esta memoria). Los factores adicionales se pueden añadir 48-72 horas después del cultivo en placa.
En este procedimiento de la presente invención, las células hemangioblásticas humanas pueden aislarse de cuerpos embrioides tempranos («EB»). El aislamiento de las células hemangioblásticas de los EB tempranos ayuda a la expansión de las células in vitro. Para las células humanas, las células hemangioblásticas se pueden obtener a partir de EB crecidos durante menos de 10 días. En ciertas realizaciones de la presente invención, las células hemangioblásticas surgen en EB humanos que crecen durante 2-6 días. Según una realización, las células hemangioblásticas se identifican y se pueden aislar a partir de EB humanos cultivados durante 4-6 días. En otras realizaciones, los EB humanos se cultivan durante 2-5 días antes de que se aíslen las células hemangioblásticas. En ciertas realizaciones, los EB humanos se cultivan durante 3-4,5 días antes de que se aíslen las células hemangioblásticas.
En ciertas realizaciones, los EB tempranos se lavan y se disocian (por ejemplo, mediante tripsina/EDTA o colagenasa B). A continuación, se mezcla un número seleccionado de células (por ejemplo, 2-5 x 105 células) con medio de metilcelulosa sin suero optimizado para el crecimiento de células hemangioblásticas (por ejemplo, medio BL-CFU, por ejemplo, Stem Cell Technologies Catalog H4436 o medio de expansión de células hemangioblásticas (HGM), o cualquier medio que contenga el 1,0 % de metilcelulosa en MDM, el 1-2 % de albúmina de suero bovino, 2- mercaptoetanol 0,1 mM, 10 pg/ml de rh-lnsulina, 200 pg/ml de transferrina humana saturada con hierro, 20 ng/ml de rh-GM-CSF, 20 ng/ml de rh-IL-3, 20 ng/ml de rh-IL-6, 20 ng/ml de rh-G-CSF) («rh» significa «humano recombinante»). Este medio puede complementarse con citoquinas en la fase inicial (que incluyen, entre otras, EPO, TPO, SCF, FL, FLt-3, VEGF, BMP tal como BMP2, BMP4 y BMP7, pero no BMP3) y HOXB4 (u otra proteína homeobox). En ciertas realizaciones, se añade eritropoyetina (EPO) a los medios. En realizaciones adicionales, se añaden EPO, SCF, VEGF, BMP-4 y HoxB4 a los medios. En realizaciones adicionales, las células crecen en presencia de EPO, TPO y FL. Cuando H9 es la línea celular de ES humana de partida, se añaden EPO, TPO y FL a los medios. Además de EPO, TPO y FL, los medios para células derivadas de H9 u otras células ES obtenidas sin destrucción de un embrión humano pueden comprender VEGF, BMP-4 y HoxB4.
Las células así obtenidas por este procedimiento (las células pueden estar en medio BL-CFU), que incluyen células hemangioblásticas, se ponen en placas de cultivo de fijación ultrabaja y se incuban en una incubadora de CO2 para cultivar colonias hemangioblásticas. Algunas células pueden formar EB secundarios. Después de aproximadamente 3-6 días, y en algunos casos 3-4,5 días, se observan colonias hemangioblásticas. Las colonias hemangioblásticas se pueden distinguir de otras células tales como EB secundarios por su morfología distintiva de tipo uva y/o por su pequeño tamaño. Además, los hemangioblastos pueden identificarse mediante la expresión de ciertos marcadores (por ejemplo, la expresión de marcadores de células hematopoyéticas y endoteliales tempranas) así como por su capacidad de diferenciarse en al menos células hematopoyéticas y endoteliales (véase más adelante, Derivación de células del linaje de hemangioblastos). Por ejemplo, aunque los hemangioblastos carecen de ciertas características distintivas de las células endoteliales maduras o hematopoyéticas, estas células pueden identificarse por la presencia de ciertos marcadores (tales como, por ejemplo, CD71+) y la ausencia de otros marcadores (por ejemplo, CD34-). Los hemangioblastos también pueden expresar proteínas GATA-1 y GATA-2, CXCR-4 y receptores de TPO y EPO. Además, los hemangioblastos pueden caracterizarse por la ausencia o baja expresión de otros marcadores (por ejemplo, CD31, CD34, KDR u otras moléculas de adhesión). Además, los hemangioblastos se pueden caracterizar por la expresión de ciertos genes (por ejemplo, genes asociados con hemangioblastos y el desarrollo primitivo de eritroblastos primitivos, como, por ejemplo, SCL, LMO2, FLT-1, genes embrionarios de la globina fetal, NF-E2, GATA-1, EKLF, ICAM-4, glicoforinas y receptor de EPO).
En consecuencia, los hemangioblastos pueden aislarse por tamaño (siendo más pequeños que las otras células) o purificarse con un anticuerpo anti-CD71+, tal como mediante cromatografía en columna de inmunoafinidad.
Las células hemangioblásticas pueden aislarse por tamaño y/o morfología mediante el siguiente procedimiento. Después de 6 a 7 días de crecimiento, la mezcla de células contiene EB, que son redondos y representan un grupo de múltiples células, y hemangioblastos, que son similares a una uva, más pequeñas que los EB, y son células individuales. En consecuencia, los hemangioblastos se pueden aislar en función de su morfología y tamaño. Las células hemangioblásticas se pueden recoger manualmente, por ejemplo, cuando se observa la mezcla de células bajo un microscopio. Las células pueden crecer posteriormente en colonias, cada colonia tiene entre 100-150 células.
Las colonias hemangioblásticas humanas derivadas como se ha descrito anteriormente se pueden recoger y volver a sembrar sobre medio CFU de metilcelulosa para formar CFU hematopoyéticas. En ciertas realizaciones, el medio
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CFU comprende StemCell Technologies H4436. En realizaciones adicionales, los hemangioblastos se cultivan en placa en medio Stemline II suplementado con citoquinas y otros factores. Por ejemplo, las colonias BL-CFC individuales pueden seleccionarse a mano y transferirse a una placa revestida con fibronectina que contiene Stemline II con SCF humano recombinante (por ejemplo, 20 ng/ml), TPO (por ejemplo, 20 ng/ml), FL (por ejemplo, 20 ng/ml), IL-3 (por ejemplo, 20 ng/ml), VEgF (por ejemplo, 20 ng/ml), G-CsF (por ejemplo, 20 ng/ml), BMP-4 (por ejemplo, 15 ng/ml), IL-6 (por ejemplo, 10 ng/ml), iGF-1 (por ejemplo, 10 ng/ml), suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS, por ejemplo, 100|jg/ml), Epo (por ejemplo, 3 U/ml). Después de una semana de crecimiento in vitro, las células hematopoyéticas no adherentes se pueden eliminar mediante pipeteo suave y se pueden usar directamente para el ensayo de CFU hematopoyéticas. Después de la eliminación de las células no adherentes, las poblaciones adherentes pueden cultivarse durante una semana más en medio de células endoteliales EGM-2 (Cambrex™), y a continuación examinarse para la expresión de vWF.
Expansión de hemangioblastos in vitro
Ciertos aspectos de la invención se refieren a la expansión in vitro de hemangioblastos. En ciertas realizaciones, los hemangioblastos expandidos mediante los procedimientos descritos en esta memoria se obtienen a partir de cuerpos embrioides tempranos derivados de células madre embrionarias humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano, como se ha descrito anteriormente.
Además de derivar hemangioblastos a partir de células madre embrionarias humanas (células hES obtenidas sin destrucción de un embrión humano), los hemangioblastos que se van a expandir también pueden aislarse de otras fuentes de mamíferos, tales como embriones de mamíferos (Ogawa y col., 2001 Int Rev Immunol (20): 21-44, publicación de patente de Estados Unidos con el n.° 2004/0052771), sangre de cordón de los tejidos de la placenta y umbilical (Pelosi, y col., 2002 Blood (100): 3203-3208; Cogle y col., 2004 Blood (103): 133-5), sangre periférica y médula ósea (Pelosi y col., 2002 Hematopoiesis (100): 3203-3208). En ciertas realizaciones, los hemangioblastos no humanos a expandir pueden generarse a partir de células madre embrionarias no humanas (tales como ratón y primates no humanos). En ciertas realizaciones, los hemangioblastos se obtienen a partir de sangre de cordón umbilical (UCB) o médula ósea mediante procedimientos tales como, por ejemplo, selección positiva de cuentas magnéticas o técnicas de purificación (por ejemplo, columna MACS). Las células se pueden seleccionar en función de su estado CD71+ y se pueden confirmar como CD34-. Además, los hemangioblastos aislados pueden analizarse para determinar su potencial para dar lugar a linajes de células tanto hematopoyéticas como endoteliales. En ciertas realizaciones, los hemangioblastos aislados o purificados y opcionalmente enriquecidos en embriones, sangre de cordón umbilical, sangre periférica, médula ósea u otro tejido tienen una pureza superior al 95 %.
Las células derivadas de médula ósea pueden obtenerse en cualquier fase del desarrollo del individuo donante, incluyendo prenatal (por ejemplo, embrionario o fetal), infante (por ejemplo, desde el nacimiento hasta aproximadamente tres años de edad en seres humanos), niño (por ejemplo, desde aproximadamente tres años de edad hasta aproximadamente 13 años de edad en seres humanos), adolescentes (por ejemplo, desde aproximadamente 13 años de edad hasta aproximadamente 18 años de edad en seres humanos), adultos jóvenes (por ejemplo, desde aproximadamente 18 años hasta aproximadamente 35 años de edad en seres humanos), adultos (desde aproximadamente 35 años de edad hasta aproximadamente 55 años de edad en seres humanos) o ancianos (por ejemplo, desde aproximadamente 55 años y más allá en seres humanos).
La médula ósea humana se puede recoger raspando del esternón partido de un paciente sometido a cirugía, por ejemplo. La médula ósea puede conservarse entonces en grupos de tejido de 0,1 a 1 mm3 en volumen y a continuación crecerse en una capa de alimentación embrionaria de ratón (por ejemplo, una capa de alimentación irradiada o tratada con mitomicina C). Las células de médula ósea se unirán a las placas y durante un período de 1 a 2 semanas de cultivo, las células hemangioblásticas pueden identificarse basándose en características morfológicas y/o marcadores celulares y aislarse (véase la publicación de patente de Estados Unidos con el n.° 2004/0052771). Las células pueden crecer y expandirse posteriormente en condiciones sin suero según los procedimientos descritos en esta memoria.
Además, las células de la médula ósea y las células de la sangre u otros tejidos pueden fraccionarse para obtener células hemangioblásticas. Los procedimientos de fraccionamiento son bien conocidos en la técnica, y generalmente implican tanto selección positiva (es decir, retención de células basándose en una propiedad particular) como selección negativa (es decir, eliminación de células basándose en una propiedad particular). Los procedimientos para el fraccionamiento y enriquecimiento de células derivadas de médula ósea se caracterizan mejor para células humanas y de ratón.
Existe una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica para fraccionar y enriquecer células derivadas de médula ósea u otras. Se pueden usar procedimientos de selección positivos tales como enriquecimiento para células que expresan CD71. Y los procedimientos de selección negativa que eliminan o reducen las células que expresan CD3, CD10, CD11b, CD14, CD16, CD15, CD16, CD19, CD20, CD32, CD45, CD45R/B220 o Ly6G también se pueden usar solos o en combinación con técnicas de selección positiva. En el caso de las células de la médula ósea, cuando las células derivadas de la médula ósea del donante no son autólogas, puede realizarse una selección negativa en la preparación celular para reducir o eliminar las células T diferenciadas.
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Generalmente, los procedimientos usados para la selección/enriquecimiento de células derivadas de médula ósea u otras células utilizarán tecnología de inmunoafinidad, aunque los procedimientos de centrifugación de densidad también son útiles. La tecnología de inmunoafinidad puede adoptar diversas formas, como es bien conocido en la técnica, pero generalmente utiliza un anticuerpo o derivado de anticuerpo en combinación con algún tipo de tecnología de segregación. La tecnología de segregación generalmente da como resultado la segregación física de las células unidas por el anticuerpo y las células no unidas por el anticuerpo, aunque en algunos casos la tecnología de segregación que destruye las células unidas por el anticuerpo se puede usar para la selección negativa.
Se puede utilizar cualquier tecnología de inmunoafinidad adecuada para la selección/enriquecimiento de hemangioblastos de sangre derivada de médula ósea u otras células, incluida la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), cribado, separación inmunomagnética, cromatografía de inmunoafinidad, fijación del complemento mediada por anticuerpos, inmunotoxina, segregación en gradiente de densidad y similares. Después del procesamiento en el proceso de inmunoafinidad, se recogen las células deseadas (las células unidas por el reactivo de inmunoafinidad en el caso de la selección positiva y las células no unidas por el reactivo de inmunoafinidad en el caso de la selección negativa) y pueden someterse a nuevas rondas de selección/enriquecimiento de inmunoafinidad.
La selección/enriquecimiento de inmunoafinidad normalmente se lleva a cabo incubando una preparación de células que comprenden células derivadas de médula ósea con un anticuerpo o reactivo de afinidad derivado de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo específico para un marcador de superficie dado), utilizando entonces el reactivo de afinidad unido para seleccionar a favor o contra las células a las que se une el anticuerpo. El proceso de selección generalmente implica una separación física, tal como se puede conseguir al dirigir gotitas que contienen células individuales en diferentes contenedores dependiendo de la presencia o ausencia de reactivo de afinidad unido (FACS), utilizando un anticuerpo unido (directa o indirectamente) a un sustrato en fase sólida (cribado, cromatografía de inmunoafinidad), o mediante la utilización de un campo magnético para recoger las células que están unidas a partículas magnéticas a través del reactivo de afinidad (separación inmunomagnética). Alternativamente, las células indeseables se pueden eliminar de la preparación de células derivadas de médula ósea usando un reactivo de afinidad que dirige un ataque citotóxico a las células unidas por el reactivo de afinidad. El ataque citotóxico puede ser activado por el reactivo de afinidad (por ejemplo, fijación del complemento), o puede estar localizado en las células diana mediante el reactivo de afinidad (por ejemplo, inmunotoxina, tal como la cadena de ricina B).
Aunque los procedimientos descritos anteriormente se refieren al enriquecimiento de células a partir de una preparación de células sanguíneas o células derivadas de médula ósea, un experto en la materia reconocerá que pueden aplicarse técnicas de selección positivas y negativas similares a preparaciones celulares de otros tejidos.
Ciertos aspectos de la invención se refieren a la expansión in vitro de hemangioblastos. En ciertas realizaciones, los hemangioblastos expandidos mediante los procedimientos descritos en esta memoria se obtienen a partir de cuerpos embrioides tempranos derivados de células madre embrionarias humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano como se ha descrito anteriormente. En otras realizaciones, los hemangioblastos se aíslan o se enriquecen a partir de tejido humano (por ejemplo, placenta o sangre de cordón umbilical, sangre periférica, médula ósea, etc.).
En ciertas realizaciones, los hemangioblastos se expanden en presencia de una proteína de homeodominio (también denominada en la presente memoria proteína homeobox). En realizaciones adicionales, los hemangioblastos se expanden en presencia de HOXB4. En ciertas realizaciones, HOXB4 se añade a las células hemangioblásticas a lo largo del procedimiento para expandir las células hemangioblásticas.
HOXB4 es un factor de transcripción de homeodominio (también denominado HOX2F, HOX2, HOX-2,6 y en rata HOXA5) que se expresa in vivo en la fracción de células madre de la médula ósea y que posteriormente se regula negativamente durante la diferenciación.
La expresión del gen HOXB4 está asociada con el mantenimiento de fenotipos primitivos de células madre (Sauvageau y col., 1995 Genes Dev 9: 1753-1765; Buske y col., 2002 Blood 100: 862-868; Thorsteinsdottir y col., 1999 Blood 94: 2605-2612; Antonchuk y col., 2001 Exp Hematol 29: 1125-1134).
La HOXB4 usada en los procedimientos de la presente invención para generar y expandir hemangioblastos, incluye, pero no se limita a, HOXB4 de longitud completa (por ejemplo, polipéptidos HOXB4 especificados por los números de acceso público GI: 13273315 (Figura 9), GI: 29351568 (Figura 10), así como cualquier variante funcional y fragmento activo de la misma. La proteína HOXB4 de tipo silvestre puede estar codificada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (Figura 9), SEQ ID NO: 3 (Figura 10) o cualquier otra forma alélica alternativa de dicha proteína. Se puede acceder a dichas secuencias a través de bases de datos disponibles públicamente, tales como Genbank. Además, HOXB4 puede expresarse ectópicamente dentro de la célula o puede proporcionarse en el medio. HOXB4 expresada ectópicamente puede estar ligada operativamente a un promotor inducible. HOXB4 proporcionada en los medios se puede excretar por otro tipo celular (por ejemplo, una capa de alimentación) o añadir directamente a los medios.
También se describen proteínas de fusión que comprenden HOXB4 (que incluyen proteínas de fusión que
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comprenden HOXB4 de longitud completa o variantes funcionales de HOXB4 o fragmentos activos de HOXB4). Además de HOXB4, esta proteína de fusión también puede comprender proteínas adicionales, dominios proteicos o péptidos. En ciertas realizaciones, HOXB4 se puede unir a un dominio de transducción de proteínas (PTD) para permitir la translocación de la proteína del medio a las células y posteriormente a los compartimentos nucleares. Las proteínas de fusión pueden comprender o pueden no comprender una o más secuencias de enlace situadas entre los dominios proteicos.
Las variantes funcionales de HOXB4 incluyen mutantes de HOXB4 y variantes alélicas, y fragmentos activos de las mismas. Las variantes funcionales de HOXB4 incluyen cualquier polipéptido HOXB4 y fragmentos activos de los mismos que sean capaces de expandir los hemangioblastos según los procedimientos de la presente invención. Las variantes funcionales de HOXB4 también incluyen polipéptidos HOXB4 que exhiben una mayor actividad de transcripción en comparación con la proteína HOXB4 nativa. Las variantes de HOXB4 incluyen proteínas con una o más sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos en relación con una HOXB4 natural. Las variantes de HOXB4 también incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos que son al menos un 75 % similares a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. Por consiguiente, las variantes de HOXB4 incluyen polipéptidos que son en un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % y 99 % similares a la secuencia de aminoácidos proporcionada en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.
Las variantes de HOXB4 también incluyen polipéptidos codificados por secuencias de ácidos nucleicos que son idénticas al menos en un 80 % a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica su complemento (por ejemplo, la proteína HOXB4 de tipo silvestre puede estar codificada por secuencias de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 2 (GI: 85376187; Figura 7) o la SEQ iD NO: 4 (GI: 29351567; Figura 8). Por lo tanto, las variantes de HOXB4 incluyen polipéptidos HOXB4 que están codificados por secuencias de ácidos nucleicos que son en un 85 %, 90 %, 95 % y 99 % similares a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o complementarias a la misma.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican HOXB4 también incluyen, pero no se limitan a, cualquier secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 2 o 4, complementaria a la misma, o un fragmento de la misma. De forma similar, los ácidos nucleicos que difieren de los ácidos nucleicos como se exponen en la SEQ ID NO: 2 o 4, debido a la degeneración en el código genético, también están dentro del alcance de la invención. Los polipéptidos variantes de HOXB4 también incluyen variantes de empalme u otras proteínas o secuencias de ácido nucleico HOXB4 de origen natural.
Los fragmentos activos de HOXB4 incluyen, pero sin limitación a, cualquier fragmento de polipéptido HOXB4 de longitud completa que sea capaz de mantener los hemangioblastos según los procedimientos de la presente invención. Por consiguiente, en una realización, una proteína HOXB4 de la presente invención es una proteína HOXB4 que carece de parte del extremo N, tal como, por ejemplo, los aminoácidos N-terminales 31, 32 o 33 de HOXB4 de longitud completa.
Cualquiera de las proteínas HOXB4 puede fusionarse con proteínas adicionales o dominios proteicos. Por ejemplo, HOXB4 se puede unir a un dominio de transducción de proteínas (PTD).
Los dominios de transducción de proteínas, unidos o no unidos covalentemente a HOXB4, permiten la translocación de HOXB4 a través de las membranas celulares de modo que la proteína puede llegar finalmente a los compartimentos nucleares de las células.
Los PTD que pueden fusionarse con una proteína HOXB4 incluyen el PTD de la proteína transactivadora del VIH (TAT) (TaT 47-57) (Schwarze y Dowdy 2000 Trends Pharmacol. Sci. 21: 45-48; Krosl y col., 2003 Nature Medicine (9): 1428-1432). Para la proteína TAT del VIH, la secuencia de aminoácidos que confiere actividad de translocación a la membrana corresponde a los restos 47-57 (YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO: 5) (Ho y col., 2001, Cancer Research 61: 473-477; Vives y col., 1997, J. Biol. Chem. 272: 16010-16017). Esta secuencia sola puede conferir actividad de translocación de proteínas. El TAT PTD también puede ser la secuencia peptídica de nueve aminoácidos RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 6) (Park y col., Mol Cells 2002 (30): 202-8). Las secuencias TAT PTD pueden ser cualquiera de las secuencias peptídicas descritas en Ho y col., 2001, Cancer Research 61: 473-477 (cuya descripción se incorpora en la presente memoria como referencia), que incluye YARKARRQARR (SEQ ID NO: 7), YARAAARQARA (SEQ ID NO: 8), YARAARRAARR (SEQ ID NO: 9) y RARAARRAARA (SEQ ID NO: 10).
Otras proteínas que contienen PTD que pueden fusionarse con las proteínas HOXB4 de la presente invención incluyen la proteína de unión al ADN del virus del herpes simple 1 (HSV-1) VP22 y el factor de transcripción homeótico de Drosophila Antennapedia (Antp) (Schwarze y col., 2000 Trends Cell Biol. (10): 290-295). Para Antp, los aminoácidos 43-58 (RQIKIWFQnRrMKWkK, SeQ ID NO: 11) representan el dominio de transducción de proteínas, y para HSV VP22 el PTD está representado por los restos DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE (SEQ ID NO: 12). Alternativamente, se pueden usar HeptaARG (RRRRRRR, SEQ ID NO: 13) o péptidos artificiales que confieren actividad de transducción como PTD de la presente invención.
En realizaciones adicionales, el PTD puede ser un péptido PTD que está duplicado o multimerizado. En ciertas realizaciones, el PTD es uno o más del péptido TaT PTD YARAAARQARA (SEQ ID NO: 14). En ciertas
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realizaciones, el PTD es un multímero que consiste en tres del péptido TAT PTD YARAAARQARA (SEQ ID NO: 15). Una proteína HOXB4 que está fusionada o unida a un PTD multimérico, tal como, por ejemplo, un dominio de transducción de proteína sintética triplicado (tPTD), puede exhibir una menor labilidad y una mayor estabilidad en las células. Dicha construcción HOXB4 también puede ser estable en medio sin suero y en presencia de células hES.
Las técnicas para elaborar genes de fusión que codifican proteínas de fusión son bien conocidas en la materia. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias polipeptídicas se realiza según técnicas convencionales. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automáticos. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos de genes puede llevarse a cabo utilizando cebadores de anclaje que dan lugar a proyecciones complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden reasociarse posteriormente para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y col., John Wiley&Sons: 1992).
En ciertas realizaciones, un gen de fusión que codifica una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia poli-(His), se puede unir al extremo N de la porción deseada del polipéptido HOXB4 o la proteína de fusión HOXB4, permitiendo que la proteína de fusión se purifique por cromatografía de afinidad usando una resina de metal Ni2+. La secuencia líder de purificación puede eliminarse entonces mediante tratamiento con enteroquinasa para proporcionar el polipéptido HOXB4 purificado (por ejemplo, véase Hochuli y col., (1987) J. Chromatography 411: 177, y Janknecht y col., PNAS USA 88: 8972).
En ciertas realizaciones, una proteína HOXB4 o variante funcional o dominio activo de la misma, está unida al extremo C o al extremo N de una segunda proteína o dominio de proteína (por ejemplo, un PTD) con o sin una secuencia de enlace interpuesta. La longitud exacta y la secuencia del enlazador y su orientación relativa a las secuencias unidas pueden variar. El enlazador puede comprender, por ejemplo, 2, 10, 20, 30 o más aminoácidos y se puede seleccionar basándose en las propiedades deseadas tales como su solubilidad, longitud, separación estérica, etc. En realizaciones particulares, el enlazador puede comprender una secuencia funcional útil para la purificación, detección o modificación, por ejemplo, de la proteína de fusión. En ciertas realizaciones, el enlazador comprende un polipéptido de dos o más glicinas.
Los dominios proteicos y/o el enlazador mediante el cual se fusionan los dominios pueden modificarse para alterar la eficacia, la estabilidad y/o las características funcionales de HOXB4.
En ciertas realizaciones, HOXB4 se expresa ectópicamente dentro de la célula hemangioblástica o se proporciona en el medio. HOXB4 expresada ectópicamente puede estar unida operativamente a una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras son reconocidas en la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión del polipéptido HOXB4.
HOXB4 proporcionada en los medios se puede excretar por otro tipo celular. El otro tipo celular puede ser una capa de alimentación, tal como una capa de célula estromal de ratón transducida para expresar HOXB4 excretable. Por ejemplo, HOXB4 puede fusionarse o modificarse para que comprenda un péptido señal, o una secuencia hidrofóbica que facilite la exportación y secreción de la proteína. Alternativamente, HOXB4, tal como una proteína de fusión unida o no unida covalentemente a un PTD, se puede añadir directamente a los medios. Además, HOXB4 puede estar incluida en un vector viral, tal como un vector retroviral o un vector adenovírico. Dicho vector podría transducir los hemangioblastos u otras células en su cultivo.
Dependiendo de la proteína HOXB4 usada, en realizaciones particulares, HOXB4 se añade a los medios en momentos seleccionados durante la expansión de los hemangioblastos. Debido a que los hemangioblastos se expanden en medio sin suero, HOXB4 es relativamente estable. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, se añade una proteína HOXB4 o proteína de fusión todos los días a los hemangioblastos humanos. En otras realizaciones, se añade una proteína HOXB4 o proteína de fusión cada dos días, y en otras realizaciones más, se añade una proteína HOXB4 o proteína de fusión cada 2 días. En una realización, se añade una proteína de fusión HOXB4, HOXB4-PTD, cada 2 días a los medios.
En ciertas realizaciones, los hemangioblastos pueden expandirse en presencia de cualquier otro factor de crecimiento o proteínas que estén presentes en una cantidad suficiente para expandir dichas células.
Los hemangioblastos obtenidos de cualquier fuente, incluidas células ES humanas o no humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano, médula ósea, placenta o sangre de cordón umbilical, sangre periférica u otro tejido, pueden expandirse según los procedimientos descritos anteriormente. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, se mezcla un número seleccionado de hemangioblastos purificados o células enriquecidas con medio de metilcelulosa sin suero optimizado para el crecimiento de hemangioblasto (por ejemplo, medio BL-CFU, véase el Ejemplo 1 y 2). Este medio se puede complementar con citoquinas en una fase inicial (que incluyen, pero no se limitan a, EPO, TPO, FL, VGF, BMP como BMP2, BMP4 y BMP7, pero no BMP3) y HOXb4. En ciertas realizaciones, se añade eritropoyetina (EPO) a los medios. En ciertas realizaciones, se añaden EPO, TPO y FL a los medios. Las células se cultivan en placas de cultivo de fijación ultrabaja y se cultivan en una incubadora de CO2. Como se ha mencionado anteriormente, las colonias hemangioblásticas exhiben una morfología distintiva de tipo uva y son
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comparativamente más pequeñas que otras células y, en consecuencia, pueden distinguirse de otros tipos de células. Los hemangioblastos también pueden analizarse para detectar marcadores así como también para su capacidad de diferenciarse adicionalmente en linajes de células hematopoyéticas o endoteliales. Los hemangioblastos posteriormente se aíslan y se expanden in vitro. Los medios que se pueden usar para la expansión incluyen medio de metilcelulosa sin suero optimizado para el crecimiento de hemangioblastos (por ejemplo, BL-CFU) complementado con citoquinas en una fase inicial y HOXB4. Las citoquinas en una fase inicial incluyen, pero no se limitan a, EPO, TPO, FL, VEGF, BMP como BMP2, BMP4 y BMP7, pero no BMP3. En ciertas realizaciones, se añade eritropoyetina (EPO) al medio. En realizaciones adicionales, se añaden EPO, TPO y FL al medio.
En consecuencia, un medio para expandir hemangioblastos puede comprender VEGF, SCF, EPO, BMP-4 y HoxB4; en ciertas realizaciones, el medio puede comprender además TPO y FL. Por ejemplo, las células individuales preparadas a partir de EB cultivados durante aproximadamente 3,5 días, se recogieron y disociaron con tripsina al 0,05 %-EDTA 0,53 mM (Invitrogen) durante 2-5 min, y se preparó una suspensión celular única pasando 3-5 veces a través de una aguja 22G. Las células se recogieron por centrifugación a 1000 rpm durante 5 min. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 50-200 pl de medio Stemline I. Para expandir los hemangioblastos, la suspensión de células individuales derivadas de la diferenciación de 2 a 5 x 105 células hES se mezcló con 2 ml de medios de expansión de hemangioblastos (HGM) que contenían metilcelulosa al 1,0% en MDM de Iscove, albúmina de suero bovino al 1-2 % y 2-mercaptoetanol 0,1 mM, 10 pg/ml de rh-lnsulina, 200 pg/ml de transferrina humana saturada con hierro, 20 ng/ml de rh-GM-CSF, 20 ng/ml de rh-IL-3, 20 ng/ml de rh-IL-6, 20 ng/ml de rh-G-CSF, 3 a 6 unidades/ml de rh-Epo, 50 ng/ml de rh-SCF, 50 ng/ml de rh-VEGF y 50 ng/ml de rh-BMP-4 y 1,5 pg/ml de tPTD-HoxB4, con/sin 50 ng/ml de Tpo y FL. Las mezclas de células se sembraron en placas Ultra-Low y se incubaron a 37 °C en el 5 % de CO2 durante 4-6 días.
En ciertas situaciones, puede ser deseable obtener hemangioblastos de un paciente o familiar de un paciente y expandir dichos hemangioblastos in vitro. Dichas situaciones incluyen, por ejemplo, un paciente programado para comenzar la quimioterapia o radioterapia, u otras situaciones en donde se puede usar un trasplante autólogo de HSC (usando las propias células madre del paciente). Por lo tanto, también se describen procedimientos para tratar a pacientes que necesitan terapia basada en células (por ejemplo, pacientes que necesitan reconstitución o tratamiento hematopoyético, o crecimiento de vasos sanguíneos o tratamiento de lesiones vasculares incluyendo isquemia, ver más abajo) usando hemangioblastos expandidos o células del linaje hemangioblástico de la invención, en donde los hemangioblastos se obtienen de la médula ósea, sangre u otro tejido del paciente o un familiar del paciente. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los procedimientos para tratar a un paciente que necesita hemangioblastos (o células del linaje de hemangioblastos) pueden comprender una etapa de aislamiento de hemangioblastos del paciente o un familiar del paciente. Los hemangioblastos aislados del paciente o del familiar del paciente pueden expandirse in vitro según los procedimientos de la presente invención y posteriormente administrarse al paciente. Alternativamente, los hemangioblastos expandidos se pueden crecer aún más para dar lugar a células hematopoyéticas o células endoteliales antes del tratamiento del paciente.
También es posible obtener células ES humanas de dicho paciente mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica sin destrucción de un embrión humano, tal como transferencia nuclear de células somáticas. Los hemangioblastos de ese paciente a continuación pueden generarse y expandirse a partir de sus propias células ES usando un procedimiento descrito en la presente memoria. Esos hemangioblastos o derivados del linaje de los mismos se pueden administrar a ese paciente o a sus familiares.
Usando los procedimientos de la presente invención, los hemangioblastos humanos se expanden para alcanzar cantidades comercialmente grandes que se pueden usar posteriormente en diversas aplicaciones terapéuticas y clínicas. Además, los hemangioblastos obtenidos por los procedimientos descritos en la presente memoria se pueden diferenciar adicionalmente para dar lugar a linajes de células endoteliales o hematopoyéticas para su uso en aplicaciones clínicas.
Los hemangioblastos obtenidos a partir del procedimiento de esta invención para generar y expandir hemangioblastos humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas tienen el potencial de diferenciarse en al menos células endoteliales o células hematopoyéticas (es decir, son al menos bipotenciales). Otros hemangioblastos también pueden ser bipotenciales. Otros hemangioblastos más pueden ser capaces de diferenciarse en células distintas de las células hematopoyéticas y endoteliales, es decir, son multi o pluripotenciales).
Ingeniería de genes del MHC en células madre embrionarias humanas para obtener hemangioblastos de complejidad reducida
Las células madre embrionarias humanas usadas como punto de partida para el procedimiento de generación y expansión de células hemangioblásticas humanas también pueden derivarse de una biblioteca de células madre embrionarias humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano, cada una de las cuales es hemicigótica u homocigótica para al menos un alelo del MHC presente en una población humana. En ciertas realizaciones, cada miembro de dicha biblioteca de células madre es hemicigótico u homocigótico para un grupo diferente de alelos del MHC con relación a los miembros restantes de la biblioteca. En ciertas realizaciones, la biblioteca de células madre es hemicigótica u homocigótica para todos los alelos del MHC que están presentes en una población humana. En el
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contexto de esta invención, las células madre que son homocigóticas para uno o más genes de antígenos de histocompatibilidad incluyen células que son nulicigóticas para uno o más (y en algunas realizaciones, todos) de dichos genes. Nulicigótico para un locus genético significa que el gen es nulo en ese locus, es decir, ambos alelos de ese gen se eliminan o están inactivos. Pueden producirse células madre que son nulicigóticas para todos los genes del MHC por procedimientos convencionales conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, direccionamiento a genes y/o pérdida de heterocigocidad (LOH). Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patentes de los Estados Unidos US 20040091936, US 20030217374 y US 20030232430, y la solicitud provisional de Estados Unidos número 60/729.173.
Por consiguiente, también se describen procedimientos para obtener hemangioblastos, que incluyen una biblioteca de hemangioblastos, con complejidad reducida del MHC.
Los hemangioblastos y las células del linaje hemangioblástico con una complejidad del MHC reducida aumentarán el suministro de células disponibles para aplicaciones terapéuticas, ya que eliminarán las dificultades asociadas con la compatibilidad para los pacientes. Dichas células pueden derivarse de células madre que están diseñadas para ser hemicigóticas u homocigóticas para genes del complejo MHC.
Una célula ES humana obtenida sin destrucción de un embrión humano puede comprender modificaciones en uno de los alelos de cromosomas hermanos en el complejo MHC de la célula. Se pueden usar una variedad de procedimientos para generar modificaciones génicas, tales como la selección de genes, para modificar los genes en el complejo MHC. Además, los alelos modificados del complejo MHC en las células pueden modificarse posteriormente para que sean homocigóticos de modo que estén presentes alelos idénticos en los cromosomas hermanos. Se pueden utilizar procedimientos tales como la pérdida de heterocigosidad (LOH) para diseñar células que tengan alelos homocigóticos en el complejo MHC. Por ejemplo, se pueden dirigir uno o más genes en un grupo de genes del MHC procedentes de un alelo parental para generar células hemicigóticas. El otro grupo de genes del MHC se puede eliminar por direccionamiento génico o LOH para hacer una línea nula. Esta línea nula se puede utilizar posteriormente como línea celular embrionaria en donde se eliminan las matrices de los genes HLA, o genes individuales, para formar un banco hemicigótico u homocigótico con un fondo genético uniforme.
En un aspecto, una biblioteca de líneas celulares ES obtenidas sin destrucción de un embrión humano, en donde cada miembro de la biblioteca es homocigótico para al menos un gen HLA, se usa para derivar hemangioblastos. En otro aspecto, también se describe una biblioteca de hemangioblastos (y/o células del linaje de hemangioblastos), en donde se seleccionan y diferencian varias líneas de células ES obtenidas sin destrucción de un embrión humano en hemangioblastos. Estos hemangioblastos y/o células del linaje hemangioblástico se pueden usar para un paciente que necesita una terapia basada en células.
Por consiguiente, ciertas realizaciones de esta descripción se refieren a un procedimiento de administración de hemangioblastos humanos, células madre hematopoyéticas o células endoteliales humanas que se han derivado de células madre embrionarias de complejidad reducida obtenidas sin destrucción de un embrión humano a un paciente que lo necesite. En ciertas realizaciones, este procedimiento comprende las etapas de: (a) identificar a un paciente que necesita tratamiento que implica la administración de hemangioblastos humanos, células madre hematopoyéticas o células endoteliales humanas a él o ella; (b) identificar las proteínas del MHC expresadas en la superficie de las células del paciente; (c) proporcionar una biblioteca de hemangioblastos humanos de complejidad reducida del MHC preparada mediante el procedimiento para generar y expandir células hemangioblásticas humanas in vitro de la presente invención; (d) seleccionar las células hemangioblásticas humanas de la biblioteca que son compatibles con las proteínas del MHC de este paciente en sus células; (e) diferenciar opcionalmente las células humanas de hemangioblastos identificadas en la etapa (d) en células madre hematopoyéticas humanas, células endoteliales o ambas, o células que se diferencian adicionalmente en uno o ambos de estos dos linajes, dependiendo de la necesidad; (f) administrar cualquiera de las células de la etapa (d) y/o (e) a dicho paciente. Este procedimiento se puede realizar en un centro regional, como, por ejemplo, un hospital, una clínica, un consultorio médico y otras instalaciones de atención médica. Además, los hemangioblastos seleccionados como compatibles para el paciente, si se almacenan en un número pequeño de células, pueden expandirse antes del tratamiento del paciente.
Células formadoras de colonias hemangioblásticas/hemangioblastos humanos
En ciertos aspectos, también se describen células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. Estas células son un tipo de célula individual y primitiva con una variedad de usos terapéuticos y de otro tipo. Además, este tipo de célula proporciona una herramienta importante para estudiar el desarrollo de al menos los linajes hematopoyético y/o endotelial. Como tal, la presente descripción contempla diversas preparaciones (que incluyen preparaciones farmacéuticas) y composiciones que comprenden células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, así como preparaciones (que incluyen preparaciones farmacéuticas) y composiciones que comprenden uno o más tipos celulares parcial o terminalmente diferenciados a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas.
Las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas tienen al menos una de las siguientes características estructurales: (a) pueden diferenciarse para dar lugar a al menos tipos de células hematopoyéticas o
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tipos de células endoteliales; (b) pueden diferenciarse para dar lugar a al menos tipos de células hematopoyéticas y tipos de células endoteliales; (c) son poco adherentes entre sí (a otras células que forman colonias hemangioblásticas humanas); (d) no expresan la proteína CD34; (e) no expresan la proteína CD31; (f) no expresan la proteína KDR; (g) no expresan la proteína CD133; (h) expresan la proteína GATA2; (i) expresan la proteína LMO2. En ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas tienen al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho o al menos nueve de las características estructurales o funcionales detalladas en esta memoria.
También se describen células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. Dichas células pueden diferenciarse para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y/o endoteliales. En ciertas realizaciones, las células se caracterizan por ser poco adherentes a otras células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. Alternativa o adicionalmente, estas células también se pueden describir basándose en la expresión o la falta de expresión de ciertos marcadores. Por ejemplo, estas células también se pueden describir basándose en la falta de expresión de al menos una de las siguientes proteínas: CD34, KDR, CD133 y CD31.
Como se ha detallado anteriormente, una de las propiedades interesantes de las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas es que son poco adherentes entre sí. Debido a que estas células son solo poco adherentes entre sí, los cultivos o colonias de células formadoras de colonias hemangioblásticas se pueden disociar en células individuales usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática. Las células son lo suficientemente adherentes entre sí para que la disociación mecánica sola, en lugar de la disociación enzimática o una combinación de las mismas, sea suficiente para disgregar los cultivos o colonias sin perjudicar sustancialmente la viabilidad de las células. En otras palabras, la disociación mecánica no requiere tanta fuerza como para causar una lesión celular importante o la muerte.
Esta propiedad no solo es útil para describir las células y distinguirlas fenotípicamente de otros tipos de células, sino que también tiene importantes implicaciones terapéuticas. Por ejemplo, números relativamente grandes (más de 1 x 106 o incluso más de 1 x 107 o incluso más de 1 x 108) de las células formadoras de colonias hemangioblásticas pueden inyectarse en seres humanos u otros animales con un riesgo sustancialmente menor de causar coágulos o embolias, u obstrucciones pulmonares de otro tipo. Este es un avance significativo en la terapia celular. La capacidad de administrar con seguridad un número relativamente grande de células hace que la terapia celular sea práctica y posible para el tratamiento eficaz de un número cada vez mayor de enfermedades y afecciones.
El término «poco adherente» se describe cualitativamente más arriba y se refiere al comportamiento de las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas entre sí. Los cultivos o colonias de células formadoras de colonias hemangioblásticas se pueden disociar a células individuales usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática. Las células son lo suficientemente adherentes entre sí para que la disociación mecánica sola, en lugar de la disociación enzimática o una combinación de las mismas, sea suficiente para disgregar los cultivos o colonias sin perjudicar sustancialmente la viabilidad de las células. En otras palabras, la disociación mecánica no requiere tanta fuerza como para causar una lesión celular importante o la muerte.
El término también se puede describir más cuantitativamente. Por ejemplo, y en ciertas realizaciones, el término «poco adherente» se usa para referirse a cultivos o colonias de células formadoras de colonias hemangioblásticas en donde al menos el 50 % de las células en el cultivo pueden disociarse a células individuales usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática. En otras realizaciones, el término se refiere a cultivos en donde al menos el 60 %, 65 %, 70 % o 75 % de las células en el cultivo pueden disociarse a células individuales usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática. En otras formas de realización más, el término se refiere a cultivos en donde al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso el 100 % de las células en el cultivo se pueden disociar a células individuales usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática.
La capacidad para disociar las células formadoras de colonias hemangioblásticas usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática puede cuantificarse adicionalmente basándose en la salud y la viabilidad de las células después de la disociación mecánica. En otras palabras, si la disociación sin técnicas enzimáticas requiere tanta fuerza mecánica que se daña o se mata un número significativo de las células, las células no son poco adherentes, como se define en la presente memoria. Por ejemplo y en ciertas realizaciones, el término «poco adherente» se refiere a cultivos de células que pueden disociarse a células individuales usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática, sin perjudicar sustancialmente la salud o la viabilidad o las células en comparación con la observada cuando las mismas células se disocian utilizando técnicas de disociación enzimática. Por ejemplo, la salud o viabilidad de las células disminuye en menos del 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o incluso menos del 1 % en comparación con lo observado cuando un cultivo de las mismas células se disocia utilizando técnicas de disociación enzimática.
Las técnicas de disociación enzimática ejemplares incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con tripsina, colagenasa u otras enzimas que interrumpen las interacciones célula-célula o célula-matriz. Las técnicas de disociación mecánica ejemplares incluyen, pero no se limitan a, una o más pasadas a través de una pipeta.
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Las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas se definen estructural y funcionalmente. Dichas células se pueden generar a partir de cualquiera de varias fuentes, incluyendo tejido embrionario obtenido sin destrucción de un embrión humano, tejido prenatal, tejido perinatal e incluso tejido adulto. A modo de ejemplo, las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas pueden generarse a partir de células madre embrionarias humanas, otras células derivadas de embriones (blastocistos, blastómeros, ICM, embriones, trofoblastos/células de trofectodermo, células madre de trofoblasto, células germinales primordiales, células germinales embrionarias, etc.) obtenidos sin destrucción de un embrión humano, líquido amniótico, células madre amnióticas, placenta, células madre placentarias y cordón umbilical.
También se describen células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, composiciones que comprenden células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, y preparaciones (que incluyen preparaciones farmacéuticas) que comprenden células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. Ciertas características de estos aspectos se describen en detalle a continuación. La presente descripción contempla combinaciones de cualquiera de los siguientes aspectos y realizaciones.
También se describe una célula formadora de colonias hemangioblásticas humanas. La célula puede diferenciarse para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y/o endoteliales. En ciertas realizaciones, la célula es poco adherente a otras células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. En ciertas realizaciones, la célula no expresa la proteína CD34. En algunas otras realizaciones, la célula no expresa una o más (por ejemplo, la célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro) de las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En algunas otras realizaciones, la célula expresa la proteína GATA2 y/o LMO2.
También se describe una célula formadora de colonias hemangioblásticas humanas. La célula puede diferenciarse para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y/o endoteliales, y la célula no expresa ninguna de las siguientes proteínas: CD34, CD31, KDR y CD133. En ciertas realizaciones, la célula es poco adherente a otras células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. En otras realizaciones, la célula expresa la proteína GATA2 y/o LMO2.
También se describe un cultivo celular que comprende una población sustancialmente purificada de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. Las células pueden diferenciarse para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y endoteliales, y las células son poco adherentes entre sí. En ciertas realizaciones, la célula no expresa la proteína CD34. En algunas otras realizaciones, la célula no expresa una o más (por ejemplo, la célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro) de las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En algunas otras realizaciones, la célula expresa la proteína GATA2 y/o LMO2.
También se describe un cultivo celular que comprende células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas diferenciadas de tejido embrionario. En ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas son poco adherentes entre sí. En ciertas realizaciones, las células pueden diferenciarse para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y/o endoteliales, y las células son poco adherentes entre sí. En ciertas realizaciones, la célula no expresa la proteína CD34. En algunas otras realizaciones, la célula no expresa una o más (por ejemplo, la célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro) de las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En algunas otras realizaciones, la célula expresa la proteína GATA2 y/o LMO2.
También se describe un cultivo celular que comprende células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, células que se pueden diferenciar para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y/o endoteliales. En ciertas realizaciones, las células son poco adherentes entre sí. En ciertas realizaciones, la célula no expresa la proteína CD34. En algunas otras realizaciones, la célula no expresa una o más (por ejemplo, la célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro) de las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En algunas otras realizaciones, la célula expresa la proteína GATA2 y/o LMO2.
También se describe una preparación farmacéutica que comprende células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, células que se pueden diferenciar para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y/o endoteliales. En ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas son poco adherentes entre sí. En ciertas realizaciones, la célula no expresa la proteína CD34. En algunas otras realizaciones, la célula no expresa una o más (por ejemplo, la célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro) de las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En algunas otras realizaciones, la célula expresa la proteína GATA2 y/o LMO2. La preparación farmacéutica se puede preparar usando cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
También se describe una preparación farmacéutica que comprende células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, en donde las células formadoras de colonias hemangioblásticas no expresan ninguna de las siguientes proteínas: CD34, CD31, KDR y CD133. En ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas pueden diferenciarse para producir al menos tipos de células hematopoyéticas y/o endoteliales. En ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas son poco adherentes entre sí. En algunas otras realizaciones, la célula expresa la proteína GATA2 y/o LMO2. La preparación farmacéutica se puede preparar usando cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
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En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, la composición o preparación farmacéutica comprende al menos 1 x 105 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. En alguna otra realización de cualquiera de los anteriores, la composición o preparación farmacéutica comprende al menos 1 x 106, al menos 5 x 106, al menos 1 x 107, o más de 1 x 107 células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas.
Las células, composiciones y preparaciones adicionales incluyen células parcial o terminalmente diferenciadas a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. Por ejemplo, composiciones y preparaciones que comprenden uno o más tipos de células hematopoyéticas y/o endoteliales diferenciadas a partir de una célula formadora de colonias hemangioblásticas. Los tipos de células hematopoyéticas ejemplares incluyen células madre hematopoyéticas, plaquetas, glóbulos rojos, linfocitos, megacariocitos y similares. A modo de ejemplos adicionales, las composiciones y preparaciones que comprenden uno o más tipos de células diferentes, tales como uno o más tipos de células mesodérmicas parcial o terminalmente diferenciadas, se diferencian de las células formadoras de colonias hemangioblásticas.
En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, también se describe una preparación crioconservada de células de colonias hemangioblásticas humanas o células parcial o terminalmente diferenciadas de las mismas.
En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, también se describe el uso terapéutico de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, o composiciones o preparaciones de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. Dichas células y preparaciones se pueden usar en el tratamiento de cualquiera de las afecciones o enfermedades detalladas a lo largo de la memoria descriptiva, así como en la industria de los bancos de sangre. Además, las células diferenciadas a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, o composiciones o preparaciones de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, se pueden usar terapéuticamente en el tratamiento de cualquiera de las afecciones o enfermedades detalladas en toda la memoria descriptiva, así como en la industria de los bancos de sangre.
Las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas se pueden usar terapéuticamente. Además o como alternativa, las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas se pueden usar para estudiar el desarrollo de linajes endoteliales y hematopoyéticos o en ensayos de cribado para identificar factores que se pueden usar, por ejemplo, para (i) mantener células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas o (ii) para promover la diferenciación de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas a uno o más tipos celulares parcial o terminalmente diferenciados. Además, las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas se pueden usar para generar uno o más tipos celulares parcial o terminalmente diferenciados para su uso in vitro o in vivo.
Las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas se pueden usar en cualquiera de los procedimientos o aplicaciones descritos en la presente solicitud, que incluyen, pero no se limitan a, en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades o afecciones descritas en esta memoria.
Preparaciones celulares que comprenden hemangioblastos expandidos in vitro
En la presente invención, los hemangioblastos humanos se expanden para alcanzar cantidades comerciales y se usan en diversas aplicaciones terapéuticas y clínicas.
En realizaciones particulares, los hemangioblastos se expanden para alcanzar números de células del orden de 10.000 a 4 millones (o más). Estos números de células se pueden alcanzar a los 3 a 4 días de comenzar las preparaciones iniciales. Por consiguiente, la presente invención se refiere a preparaciones que comprenden grandes cantidades de hemangioblastos, dichas preparaciones que comprenden al menos 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, un millón, 2 millones, 3 millones o 4 millones de células.
También se describe una solución, una composición y una preparación que comprende grandes cantidades de hemangioblastos, dicha solución, dicha composición y dicha preparación que comprende al menos 10.000, 50.000,
100.000, 500.000, un millón, 2 millones, 3 millones o 4 millones de células. Los hemangioblastos podrían ser humanos.
La presente descripción también se refiere a la diferenciación de los hemangioblastos obtenidos por los procedimientos descritos en la presente invención en linajes de células hematopoyéticas o endoteliales, o en ambos, que se usan posteriormente en aplicaciones clínicas. Por lo tanto, la presente descripción también se refiere a preparaciones celulares que comprenden grandes cantidades de células hematopoyéticas o endoteliales. La presente descripción también se refiere a la diferenciación de los hemangioblastos obtenidos mediante los procedimientos descritos en esta memoria en otros linajes celulares, distintos de las células hematopoyéticas y endoteliales. Por lo tanto, la presente descripción también se refiere a preparaciones celulares que comprenden un gran número de otras células derivadas de hemangioblastos.
Las composiciones y preparaciones que comprenden grandes cantidades (por ejemplo, miles o millones) de hemangioblastos pueden obtenerse expandiendo hemangioblastos que se obtienen como se ha descrito anteriormente. Por consiguiente, también se describen composiciones y preparaciones que comprenden grandes cantidades de hemangioblastos conseguidas mediante la expansión de células ES (tales como células ES humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano) o hemangioblastos obtenidos de sangre de cordón, sangre
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periférica o médula ósea. Además, dado que los procedimientos de expansión pueden aplicarse a hemangioblastos de origen de ratón, rata, bovino o primate no humano, por ejemplo, la presente invención también se refiere a composiciones y preparaciones que comprenden un gran número de hemangioblastos de otras especies además del ser humano. Los hemangioblastos a expandir mediante los procedimientos de esta invención pueden ser bipotenciales, es decir, pueden diferenciarse en células endoteliales o células madre hematopoyéticas. En ciertas realizaciones, los hemangioblastos humanos generados y expandidos a partir de células ES humanas son bipotenciales y se obtienen sin destrucción de un embrión humano. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas son capaces de diferenciarse para dar lugar al menos a tipos de células hematopoyéticas o tipos de células endoteliales. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas son preferiblemente bipotenciales y capaces de diferenciarse para dar lugar a al menos tipos de células hematopoyéticas y tipos de células endoteliales. Como tal, las células formadoras de colonias hemangioblásticas son al menos unipotenciales, y preferiblemente bipotenciales. Además, sin embargo, las células formadoras de colonias hemangioblásticas pueden tener un mayor grado de potencial de desarrollo y, en ciertas realizaciones, pueden diferenciarse para dar lugar a tipos celulares de otros linajes. En ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas son capaces de diferenciarse para dar lugar a otros derivados mesodérmicos tales como células cardíacas (por ejemplo, cardiomiocitos) y/o células de músculo liso.
Marcadores de células de hemangioblastos de mamíferos
Como se ha descrito anteriormente, las células formadoras de colonias hemangioblásticas carecen de ciertas características distintivas de las células endoteliales o hematopoyéticas maduras. Sin embargo, estas células formadoras de colonias hemangioblásticas o hemangioblastos pueden identificarse por diversos marcadores tales como, por ejemplo, las proteínas CD71+, GATA-1 y GATA-2, CXCR-4, y los receptores TPO y EPO. En realizaciones adicionales, los hemangioblastos expresan LMO-2. Los hemangioblastos pueden caracterizarse adicionalmente por la ausencia o baja expresión de otros marcadores. En consecuencia, los hemangioblastos pueden ser CD34-CD31- y KDR-. En realizaciones adicionales, los hemangioblastos pueden ser CD34-, CD31-, KDR-y CD133-.
Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los hemangioblastos generados y expandidos por los procedimientos de la presente invención se caracterizan por la presencia o ausencia de uno o más de los marcadores enumerados en la Tabla 2 del documento WO2007/120811. Por ejemplo, los hemangioblastos pueden dar negativo para la expresión de uno cualquiera o más de los marcadores enumerados en la Tabla 2 que se representa como «-» bajo «BL-CFC». Por consiguiente, en algunas realizaciones, los hemangioblastos pueden ser negativos para la expresión de CD34. Las células, además o como alternativa, pueden ser negativas para la expresión de CD31, CD133 y/o KDR. En realizaciones adicionales, los hemangioblastos pueden expresar cualquiera de los marcadores indicados en la Tabla 2 con «+». Por ejemplo, las células pueden expresar uno o más de los marcadores LMO-2 y GATA-2. La expresión de un marcador puede evaluarse mediante cualquier procedimiento, tal como, por ejemplo, inmunohistoquímica o inmunotransferencia para analizar la expresión de proteínas, o análisis de ARNm para analizar la expresión a nivel del ARN.
Derivación de células del linaje de hemangioblastos
Los procedimientos y preparaciones celulares descritos en esta memoria también se refieren a células derivadas de hemangioblastos. Los hemangioblastos humanos generados y expandidos por esta invención y los hemangioblastos de mamífero expandidos por los procedimientos de la presente descripción pueden diferenciarse in vitro para obtener células hematopoyéticas (incluyendo células madre hematopoyéticas (HSC)) o células endoteliales, así como también células que se diferencian más en estos dos linajes. Estas células se pueden usar posteriormente en las aplicaciones terapéuticas y comerciales que se describen a continuación.
En ciertas realizaciones, las células hematopoyéticas se obtienen cultivando los hemangioblastos en BL-CFU sin suero durante 3-10 días. En otras realizaciones, las suspensiones de células individuales de células BL-CFC derivadas de hES se cultivan durante 10-14 días. Mantener las condiciones sin suero es óptimo en la medida en que las condiciones sin suero facilitan la producción a mayor escala y el cumplimiento de las pautas regulatorias, así como también reducen los costes. Los hemangioblastos de la presente invención también se pueden cultivar en cultivo Hem sin suero (Bhatia y col., 1997 J Exp Med (186): 619-624), que mantiene células madre hematopoyéticas humanas y comprende BSA (por ejemplo, BSA al 1 %), insulina (por ejemplo, insulina humana 5 pg/ml), transferrina o medio de transferrina (por ejemplo, transferrina humana 100 pg/ml), L-glutamina, beta-mercaptoetanol (por ejemplo, 10'4 M) y factores de crecimiento. Los factores de crecimiento pueden comprender SCF (por ejemplo, 300 ng/ml), factor estimulante de colonias granulocíticas (G-CSF) (por ejemplo, 50 ng/ml), Flt-3 (por ejemplo, 300 ng/ml), IL-3 (por ejemplo, 10 ng/ml) e IL-6 (por ejemplo, 10 ng/ml). Otros factores útiles para obtener células hematopoyéticas a partir de hemangioblastos incluyen trombopoyetina (TPO) y VEGF (ver, por ejemplo, Wang y col., 2005 Ann NY Acad Sci (1044): 29-40) y BMP-4. Los hemangioblastos también se pueden cultivar en medio de metilcelulosa sin suero complementado con un cóctel de factores de crecimiento hematopoyético de multilinaje. Por lo tanto, los hemangioblastos se pueden cultivar en metilcelulosa en medio de Dulbecco modificado con Iscove (IMDM) que comprende BSA, transferrina humana saturada, LDL humana, complementada con factores de crecimiento de acción temprana (por ejemplo, ligando c-kit, ligando flt3), factores de crecimiento multilinaje (por ejemplo, IL-3, CSF de macrófagos granulocitos (GM-CSF)) y factores de crecimiento de un solo linaje (por ejemplo,
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G-CSF, M-CSF, EPO, TPO)), VEGF y bFGF. Alternativamente, los hemangioblastos pueden hacerse crecer en un medio que comprende factores de crecimiento de un solo linaje para mantener el crecimiento de un tipo de célula hematopoyética (por ejemplo, glóbulos rojos, macrófagos o granulocitos).
En una realización, las colonias hemangioblásticas se resuspenden en medio Stemline I. Después, las células se mezclan con 1 ml de medio CFU hematopoyético sin suero (H4436, Stem Cell Technologies™) más 1,5 pg/ml de tPTD-HoxB4 y el 0,5% de EX-CYTE (Serologicals Proteins Inc.™). Las mezclas de células se cultivaron en placas sin tratar de cultivo celular y se incubaron a 37 °C durante 10-14 días. Las CFU hematopoyéticas que surgen después de 10-14 días después del cultivo inicial en placa se pueden caracterizar morfológicamente, tal como mediante tinción con colorante Wright-Giemsa.
Las células hematopoyéticas también pueden derivarse del hemangioblasto usando otras condiciones conocidas en la técnica (por ejemplo, en medios que comprenden IMDM, 30 % de suero de ternera fetal (FCS), 1 % de albúmina de suero bovino (BSA), beta-mercaptoetanol 10'4 M, y L-glutamina 2 mM). Además, en otras realizaciones, el factor de crecimiento de fibroblastos básico se puede usar para promover la frecuencia de BL-CFC dentro de los EB y promover la diferenciación hematopoyética (Faloon y col., 2000 Development (127): 1931-1941). En otras realizaciones más, el factor de crecimiento de hemangiopoyetina (HAPO) se usa para promover el crecimiento y la diferenciación hematopoyética de los hemangioblastos (Liu y col., 2004 Blood (103): 4449-4456). La diferenciación en células hematopoyéticas se puede evaluar mediante el estado de CD45 (CD45+) y el ensayo de CFU, por ejemplo.
Para formar células hematopoyéticas, los hemangioblastos humanos se pueden cultivar durante 3-10 días, u opcionalmente durante períodos de tiempo más largos (por ejemplo, 10-14 días) en medio CFU. Los hemangioblastos humanos pueden formar CFU que comprenden granulocitos, eritrocitos, macrófagos y megacariocitos (CFU-GEMM/mix) así como unidades formadoras de colonias que contienen solo uno de estos últimos tipos de células (por ejemplo, CFU-G, CFU-E, CFU-M, y CFU-GM). En ciertas realizaciones, las suspensiones unicelulares de células BL-CFC derivadas de hES se cultivan durante 10-14 días para derivar células hematopoyéticas tales como, por ejemplo, células hematopoyéticas eritroides, mieloides, macrófagos y multilinaje.
También se describen células endoteliales derivadas de los hemangioblastos humanos obtenidos y expandidos o hemangioblastos de mamíferos expandidos mediante los procedimientos descritos en esta memoria. Los hemangioblastos pueden cultivarse en condiciones favorables para la maduración endotelial.
En ciertas realizaciones descritas en esta memoria, para obtener células endoteliales, los hemangioblastos se siembran primero en una superficie recubierta de fibronectina y después de 3-5 días (o en otras realizaciones 3-7 días), se vuelven a poner en una capa gruesa de Matrigel para apoyar la diferenciación en células endoteliales. Estas condiciones mantienen las condiciones sin suero establecidas durante el desarrollo del hemangioblasto. Alternativamente, los hemangioblastos se pueden cultivar en medios que se sabe que favorecen la diferenciación en células endoteliales. Dichas condiciones incluyen, por ejemplo, endocultivo que comprende el 20 % de suero bovino fetal (FBS), 50 ng/ml de suplemento de crecimiento de células endoteliales (es decir, extractos de hipófisis), 10 Ul/ml de heparina y 5 ng/ml de VEGF-A165 humano (Terramani y col., 2000 In vitro Cell Dev Biol Anim (36): 125-132). Otras condiciones conocidas en la técnica incluyen medio suplementado con el 25 % de FCS/suero de caballo, y en algunas realizaciones, heparina (por ejemplo, 10U/ml), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF1) (por ejemplo, 2 ng) y suplemento de crecimiento EC (ECGS, por ejemplo, 100 pg). Los factores de crecimiento VEGF y EGF también se pueden usar en combinación con HAPO para apoyar la diferenciación endotelial (Liu y col., 2004). Los hemangioblastos también pueden sembrarse en placas recubiertas con colágeno y fibronectina, por ejemplo, para promover la diferenciación en células endoteliales. Las células pueden analizarse para determinar el factor de von Willebrand (vWF) y la óxido nítrico sintetasa endotelial (eNOS) y la capacidad para formar una red endotelial in vitro.
Por consiguiente, para formar células endoteliales, las colonias hemangioblásticas derivadas por los procedimientos descritos anteriormente se recogen y se vuelven a poner en placas sobre placas de cultivo recubiertas de fibronectina optimizadas para la primera etapa hacia la diferenciación endotelial. Las células pueden ponerse en placas en medio completo EGM-2 o EGM-2MV (Cambrex™). Después de 3 a 5 días, y en realizaciones alternativas de 3 a 7 días, las células se recolocan en una superficie que soporta la diferenciación endotelial, tal como en una capa de Matrigel. Después de 16-24 horas de incubación, la formación de cordones tubulares ramificados sugiere un comportamiento típico de células endoteliales. También se pueden usar ensayos específicos de endotelio, tales como la captación de LDL para confirmar que estas células son de naturaleza endotelial.
En otros aspectos, los hemangioblastos humanos generados y expandidos por esta invención y los hemangioblastos de mamífero expandidos mediante los procedimientos de esta descripción se pueden diferenciar in vitro para obtener otras células, así como también células que se diferencian adicionalmente de estos linajes celulares. Dichos linajes celulares adicionales se pueden derivar de los hemangioblastos generados y expandidos por esta invención y los hemangioblastos de mamífero expandidos por los procedimientos descritos en la presente memoria porque las células hemangioblásticas pueden tener un grado incluso mayor de potencial de desarrollo más allá de la diferenciación en células hematopoyéticas y endoteliales.
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Células de hemangioblastos no injertables
La presente descripción proporciona una nueva población de células que comparte algunas características con los hemangioblastos identificados previamente y células formadoras de colonias hemangioblásticas. Sin embargo, la nueva población de células descrita en la presente memoria es distinta en el sentido de que es no injertable en la médula ósea cuando se administra a animales inmunodeficientes. Esta nueva población de células progenitoras es útil para el estudio del desarrollo básico y la biología de células madre, es útil para generar tipos de células diferenciadas de forma parcial y terminal in vitro e in vivo, y es útil para el desarrollo de productos terapéuticos. Además, estas células se pueden usar en ensayos de cribado para identificar, por ejemplo, (i) factores o condiciones que promueven la expansión de células hemangioblásticas no injertables y (ii) factores o condiciones que promueven la generación de uno o más tipos de células diferenciadas a partir de células hemangioblásticas no injertables. Los factores y condiciones identificados se pueden usar en la producción de terapias basadas en células y libres de células, en la producción de medios y formulaciones, y en el estudio de la biología del desarrollo y de células madre.
Visión general
También se describen células hemangioblásticas no injertables, composiciones y preparaciones que comprenden células hemangioblásticas no injertables, procedimientos de producción y expansión de células hemangioblásticas no injertables, procedimientos para producir tipos de células diferenciadas a partir de células hemangioblásticas no injertables y procedimientos de uso de células hemangioblásticas no injertables o células derivadas terapéuticamente de las mismas.
Los procedimientos descritos en la presente memoria se pueden usar para generar células hemangioblásticas humanas no injertables. Sin embargo, las células se pueden obtener a partir de otras especies que incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejos, vacas, perros, gatos, ovejas, cerdos y primates no humanos.
La presente descripción proporciona un procedimiento para expandir células hemangioblásticas no injertables de mamífero obtenidas de cualquier fuente, incluidas células ES, blastocistos o blastómeros obtenidos sin destrucción de un embrión humano, sangre de cordón procedente de la placenta o tejido umbilical, sangre periférica, médula ósea u otro tejido o por cualquier otro medio conocido en la técnica. En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas humanas no injertables se generan a partir de células madre embrionarias u otras células madre pluripotentes obtenidas sin destrucción de un embrión humano. A modo de ejemplo, pueden generarse células hemangioblásticas humanas no injertables a partir de células madre embrionarias obtenidas sin destrucción de un embrión humano, así como de células iPS. En otras realizaciones, las células hemangioblásticas no injertables se generan a partir de células derivadas de embriones humanos obtenidas sin destrucción de un embrión humano. Las células derivadas de embriones humanos pueden ser una población de células sustancialmente homogénea, una población heterogénea de células, o todo o una parte de un tejido embrionario obtenido sin destrucción de un embrión humano. Como ejemplo de células derivadas de embriones obtenidas sin destrucción de un embrión humano que se puede usar en los procedimientos de la presente invención, se pueden generar células hemangioblásticas humanas no injertables a partir de células madre embrionarias humanas. Dichas células madre embrionarias obtenidas sin destrucción de un embrión humano incluyen células madre embrionarias derivadas de, o usando, por ejemplo, blastocistos, ICM cultivadas en placa, uno o más blastómeros, u otras porciones de un embrión en fase de preimplantación o una estructura de tipo embrionaria, independientemente de si se produce por fertilización, transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), partenogénesis, androgénesis u otros medios sexuales o asexuales. En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas no injertables se generan a partir de células madre pluripotentes obtenidas sin destrucción de un embrión humano. Las células madre pluripotentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias obtenidas sin destrucción de un embrión humano y células iPS. En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas humanas no injertables se generan a partir de células no pluripotentes. Las células no pluripotentes pueden incluir células somáticas, tales como células derivadas de la piel, hueso, sangre, tejido conectivo, corazón, riñón, pulmón, hígado o cualquier otro órgano interno. En ciertas realizaciones, las células no pluripotentes pueden ser células derivadas de tejido conjuntivo, tales como fibroblastos. En ciertas realizaciones, las células no pluripotentes son células derivadas de un tejido adulto.
En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas no injertables se pueden diferenciar adicionalmente a células madre hematopoyéticas y/o tipos de células hematopoyéticas que incluyen, pero no se limitan a, plaquetas y glóbulos rojos. Dichas células se pueden usar en transfusiones o en otras terapias. Aunque dichas células tienen numerosos usos, un uso particularmente importante sería mejorar la disponibilidad de sangre para transfusiones. En ciertas realizaciones, también se describen glóbulos rojos diferenciados de células hemangioblásticas no injertables. Dichos glóbulos rojos diferenciados podrían usarse para transfusiones.
También se describen procedimientos para generar células hematopoyéticas diferenciadas a partir de células hemangioblásticas no injertables para su uso en transfusiones de sangre para aquellos que lo necesiten. En ciertas realizaciones, las células hematopoyéticas diferenciadas se transfunden para tratar un traumatismo, pérdida de sangre durante cirugía, enfermedades de la sangre tales como anemia, anemia de células falciformes o enfermedades hemolíticas o una enfermedad maligna. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos se transfunden para tratar un traumatismo, una pérdida de sangre durante cirugía o enfermedades de la sangre tales como anemia,
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anemia de células falciformes o enfermedad hemolítica. En ciertas realizaciones, se transfunde una población mixta de glóbulos rojos. Debe observarse que muchos tipos de células hematopoyéticas diferenciadas, particularmente glóbulos rojos, normalmente existen in vivo como una población mixta. Específicamente, in vivo se encuentran glóbulos rojos circulantes de diferentes edades y niveles de diferenciación. Además, los glóbulos rojos maduran con el tiempo para expresar menos hemoglobina fetal y más hemoglobina adulta. La presente descripción contempla la transfusión de poblaciones purificadas de glóbulos rojos o de una población mixta de glóbulos rojos que tienen niveles variables de edad y de diferenciación. En realizaciones particulares, la invención contempla la transfusión de glóbulos rojos que expresan hemoglobina fetal (hemoglobina F). La transfusión de glóbulos rojos que expresan hemoglobina fetal puede ser especialmente útil en el tratamiento de la anemia de células falciformes. La capacidad de generar grandes cantidades de células para transfusiones aliviará la escasez crónica de sangre en bancos de sangre y hospitales de todo el país.
En ciertas realizaciones, los procedimientos de la presente descripción permiten la producción de células universales para transfusión. Específicamente, los glóbulos rojos que son de tipo O y Rh- pueden generarse fácilmente y servirán como fuente de sangre universal para transfusión. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos producidos a partir de los procedimientos de la solicitud son funcionales. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos expresan hemoglobina F antes de la transfusión. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos transportan oxígeno. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos tienen una esperanza de vida igual a los glóbulos rojos derivados naturalmente. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos tienen una vida útil que es el 75 % de la de glóbulos rojos derivados naturalmente. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos tienen una vida útil que es el 50 % de la de glóbulos rojos derivados naturalmente. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos tienen una vida útil que es el 25 % de la de glóbulos rojos derivados naturalmente.
En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas no injertables pueden tener un mayor potencial de desarrollo, y pueden diferenciarse para producir tipos de células endoteliales, tipos de células de músculo liso o tipos de células cardíacas.
Los procedimientos de la presente descripción permiten la expansión in vitro de células hemangioblásticas no injertables en grandes cantidades útiles para una variedad de aplicaciones comerciales y clínicas. La expansión de células hemangioblásticas no injertables in vitro se refiere a la proliferación de células hemangioblásticas no injertables. Aunque los procedimientos de la presente descripción permiten la expansión de células hemangioblásticas humanas no injertables hasta alcanzar cantidades comercialmente útiles, la presente descripción también se refiere a un gran número de células hemangioblásticas no injertables y a preparaciones celulares que comprenden grandes cantidades de células hemangioblásticas no injertables humanos (por ejemplo, al menos
10.000, 100.000 o 500.000 células). En ciertas realizaciones, las preparaciones celulares comprenden al menos 1 x 106 células. En otras realizaciones, las preparaciones de células comprenden al menos 2 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables y en realizaciones adicionales al menos 3 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables. En otras realizaciones más, las preparaciones celulares comprenden al menos 4 x 106 células hemangioblásticas humanas no injertables. Téngase en cuenta que estas preparaciones celulares pueden estar purificadas o sustancialmente purificadas. Sin embargo, en ciertas realizaciones, las preparaciones celulares adecuadas comprenden una mezcla de células hemangioblásticas no injertables y células formadoras de colonias hemangioblásticas. La mezcla puede tener cualquier relación, incluidas mezclas que comprenden una mayor proporción de células hemangioblásticas no injertables y mezclas que comprenden una mayor proporción de células formadoras de colonias hemangioblásticas.
También se describen una solución, una preparación o una composición que comprende entre 10.000 y 4 millones o más células hemangioblásticas no injertables de mamífero (tal como ser humano). El número de células hemangioblásticas no injertables en una solución, una preparación y una composición de este tipo puede ser cualquier número entre el intervalo de 10.000 a 4 millones o más. Este número podría ser, por ejemplo, 20.000,
50.000, 100.000, 500.000, 1 millón, etc.
De manera similar, también se describen preparaciones de células de progenie hemangioblástica humana no injertable (por ejemplo, células hematopoyéticas humanas que incluyen células madre hematopoyéticas humanas). La presente descripción se refiere además a procedimientos para producir, almacenar y distribuir células hemangioblásticas no injertables y/o progenie de células hemangioblásticas no injertables.
La presente descripción también proporciona procedimientos y soluciones adecuadas para la transfusión en pacientes humanos o animales. En realizaciones particulares, la descripción proporciona procedimientos para producir glóbulos rojos y/o plaquetas, y/u otros tipos de células hematopoyéticas para transfusión. En ciertas realizaciones, la descripción es adecuada para su uso en bancos de sangre y hospitales para proporcionar sangre para transfusión después de un traumatismo o en el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con la sangre. En ciertas realizaciones, la descripción proporciona glóbulos rojos que son células donantes universales. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos son funcionales y expresan hemoglobina F antes de la transfusión.
También se describen células hemangioblásticas humanas no injertables, cultivos celulares que comprenden una población sustancialmente purificada de células hemangioblásticas humanas no injertables, preparaciones farmacéuticas que comprenden células hemangioblásticas humanas no injertables y preparaciones crioconservadas
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de las células hemangioblásticas no injertables. En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona el uso de las células hemangioblásticas humanas no injertables en la fabricación de un medicamento para tratar una afección en un paciente que lo necesite. Alternativamente, la descripción proporciona el uso de los cultivos celulares en la fabricación de un medicamento para tratar una afección en un paciente que lo necesite. La descripción también proporciona el uso de las preparaciones farmacéuticas en la fabricación de un medicamento para tratar una afección en un paciente que lo necesite.
Las células hemangioblásticas no injertables se pueden identificar y caracterizar en función de sus propiedades estructurales y/o propiedades funcionales. Estas células progenitoras no se injertan cuando se administran a un huésped inmunodeficiente. En ciertas realizaciones, estas células son únicas ya que solo se adhieren poco entre sí (se adhieren poco a otras células hemangioblásticas no injertables). En realizaciones en donde las células son poco adherentes, los cultivos o colonias de células hemangioblásticas no injertables se pueden disociar a células individuales usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática. En ciertas realizaciones, las células son suficientemente adherentes entre sí para que la disociación mecánica sola, en lugar de la disociación enzimática o una combinación de disociación mecánica y enzimática, sea suficiente para disgregar los cultivos o colonias sin deteriorar sustancialmente la viabilidad de las células. En otras palabras, la disociación mecánica no requiere tanta fuerza como para causar una lesión celular sustancial o la muerte cuando se compara con lo observado después de la disociación enzimática de los agregados celulares.
En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas no injertables pueden identificarse o caracterizarse adicionalmente basándose en la expresión o falta de expresión (según se evalúa a nivel del gen o a nivel de la proteína) de uno o más marcadores. En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas no injertables tienen una o más de las características de las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas no injertables pueden identificarse o caracterizarse basándose en la falta de expresión de una o más (por ejemplo, las células pueden caracterizarse basándose en la falta de expresión de al menos uno, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro) de los siguientes marcadores de superficie celular: CD34, KDR, CD133 o CD31. Además o como alternativa, las células hemangioblásticas no injertables se pueden identificar o caracterizar basándose en la expresión de GATA2 y/o LMO2.
Células hemangioblásticas humanas no injertables
En ciertos aspectos, también se describen células hemangioblásticas humanas no injertables. Estas células son un tipo de célula única y primitiva con una variedad de usos terapéuticos y de otro tipo. Además, este tipo de célula proporciona una herramienta importante para estudiar el desarrollo de al menos los linajes hematopoyéticos. Como tal, la invención contempla diversas preparaciones (que incluyen preparaciones farmacéuticas) y composiciones que comprenden células hemangioblásticas humanas no injertables, así como preparaciones (que incluyen preparaciones farmacéuticas) y composiciones que comprenden uno o más tipos celulares parcial o terminalmente diferenciados a partir de células hemangioblásticas no injertables. Sin estar sujetos a ninguna teoría en particular, estas células representan una población de células madre distintas, algo más comprometidas (que las células formadoras de colonias hemangioblásticas) que retienen la capacidad de generar numerosos tipos de células hematopoyéticas.
Las células hemangioblásticas no injertables de la presente descripción se pueden identificar o caracterizar basándose en una o cualquier combinación de las características estructurales o funcionales descritas para las células formadoras de colonias hemangioblásticas. Téngase en cuenta que aunque estas células pueden derivarse de cualquiera de una serie de fuentes, por ejemplo, tejido embrionario obtenido sin destrucción de un embrión humano, tejido prenatal o tejido perinatal, el término «células hemangioblásticas no injertables» se aplica a las células, independientemente de la fuente, que no son injertables y que son capaces de diferenciarse para dar lugar a al menos un tipo de célula hematopoyética, y opcionalmente tienen una o más de las propiedades estructurales o funcionales anteriores.
Para ilustrar, las células hemangioblásticas humanas no injertables no se injertan cuando se administran a un huésped inmunodeficiente y tienen al menos una de las siguientes características estructurales: (a) pueden diferenciarse para dar lugar a al menos un tipo de célula hematopoyética; (b) pueden diferenciarse para dar lugar a al menos tipos de células hematopoyéticas y tipos de células endoteliales; (c) son poco adherentes entre sí (a otras células hemangioblásticas no injertables); (d) no expresan la proteína CD34; (e) no expresan la proteína CD31; (f) no expresan la proteína KDR; (g) no expresan la proteína CD133; (h) expresan la proteína GATA2; (i) expresan la proteína LMO2. En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas humanas no injertables tienen al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho o al menos nueve de las características estructurales o funcionales detalladas en la presente invención.
Como se ha detallado anteriormente, una de las propiedades interesantes de las células hemangioblásticas humanas no injertables es que son poco adherentes entre sí. Debido a que estas células son solo poco adherentes entre sí, los cultivos o colonias de células hemangioblásticas no injertables se pueden disociar a células individuales usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática. Las células son lo suficientemente adherentes entre sí para que la disociación mecánica sola, en lugar de la disociación enzimática o una combinación de las mismas, sea suficiente para disgregar los cultivos o colonias sin perjudicar
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sustancialmente la viabilidad de las células. En otras palabras, la disociación mecánica no requiere tanta fuerza como para causar una lesión celular importante o la muerte.
Esta propiedad no solo es útil para describir las células y distinguirlas fenotípicamente de otros tipos de células, sino que también tiene importantes implicaciones terapéuticas. Por ejemplo, números relativamente grandes (más de 1 x 106 o incluso más de 1 x 107 o incluso más de 1 x 108) de las células hemangioblásticas no injertables pueden inyectarse en seres humanos u otros animales con un riesgo sustancialmente menor de causar coágulos o embolias, u obstrucciones pulmonares de otro tipo. Este es un avance significativo en la terapia celular. La capacidad de administrar con seguridad un número relativamente grande de células hace que la terapia celular sea práctica y posible para el tratamiento eficaz de un número cada vez mayor de enfermedades y afecciones.
El término «poco adherente» se describe cualitativamente más arriba y se refiere al comportamiento de las células hemangioblásticas humanas no injertables entre sí. Los cultivos o colonias de células hemangioblásticas no injertables se pueden disociar a células individuales usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática. Las células son lo suficientemente adherentes entre sí para que la disociación mecánica sola, en lugar de la disociación enzimática o una combinación de las mismas, sea suficiente para disgregar los cultivos o colonias sin perjudicar sustancialmente la viabilidad de las células. En otras palabras, la disociación mecánica no requiere tanta fuerza como para causar una lesión celular importante o la muerte.
El término también se puede describir más cuantitativamente. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el término «poco adherente» se usa para referirse a cultivos o colonias de células hemangioblásticas no injertables en donde al menos el 50 % de las células en el cultivo pueden disociarse a células individuales usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática. En otras realizaciones, el término se refiere a cultivos en donde al menos el 60 %, 65 %, 70 % o 75 % de las células en el cultivo pueden disociarse a células individuales usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática.
En otras formas de realización más, el término se refiere a cultivos en donde al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso el 100 % de las células en el cultivo se pueden disociar a células individuales usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática.
La capacidad para disociar las células hemangioblásticas no injertables usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática se puede cuantificar adicionalmente basándose en la salud y la viabilidad de las células después de la disociación mecánica. En otras palabras, si la disociación sin técnicas enzimáticas requiere tanta fuerza mecánica que se daña o se mata un número significativo de las células, las células no son poco adherentes, como se define en la presente memoria. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el término «poco adherente» se refiere a cultivos de células que pueden disociarse a células individuales usando solo técnicas de disociación mecánica y sin necesidad de técnicas de disociación enzimática, sin perjudicar sustancialmente la salud o la viabilidad o las células en comparación con la observada cuando las mismas células se disocian utilizando técnicas de disociación enzimática. Por ejemplo, la salud o viabilidad de las células disminuye en menos del 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o incluso menos del 1 % en comparación con lo observado cuando un cultivo de las mismas células se disocia utilizando técnicas de disociación enzimática.
Las técnicas de disociación enzimática ejemplares incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con tripsina, colagenasa u otras enzimas que interrumpen las interacciones célula-célula o célula-matriz. Las técnicas de disociación mecánica ejemplares incluyen, pero no se limitan a, una o más pasadas a través de una pipeta.
Las células hemangioblásticas humanas no injertables se definen estructural y funcionalmente. Dichas células se pueden generar a partir de cualquiera de varias fuentes, incluyendo tejido embrionario obtenido sin destrucción de un embrión humano, tejido prenatal, tejido perinatal e incluso tejido adulto. A modo de ejemplo, las células hemangioblásticas humanas no injertables pueden generarse a partir de células madre embrionarias humanas, otras células derivadas de embriones (blastocistos, blastómeros, ICM, embriones, trofoblastos/células trofectodermo, células madre de trofoblasto, células germinales primordiales, células germinales embrionarias, etc.) obtenidos sin destrucción de un embrión humano, líquido amniótico, células madre amnióticas, placenta, células madre placentarias y cordón umbilical. De manera más general, las células hemangioblásticas no injertables pueden generarse a partir de células pluripotentes, tales como células madre embrionarias obtenidas sin destrucción de un embrión humano o células madre pluripotentes. Las células madre pluripotentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias obtenidas sin destrucción de un embrión humano y células madre pluripotentes inducidas (células iPS). Las células hemangioblásticas humanas no injertables también pueden generarse a partir de células no pluripotentes, como células somáticas, que incluyen, pero no se limitan a, células derivadas de la piel, hueso, sangre, tejido conjuntivo, corazón, riñón, pulmón, hígado o cualquier otro órgano interno. En ciertas realizaciones, las células no pluripotentes pueden ser células derivadas de tejido conjuntivo, tales como fibroblastos. En ciertas realizaciones, las células no pluripotentes son células derivadas de un tejido adulto.
También se describen células hemangioblásticas no injertables (tales como células humanas), composiciones que comprenden células hemangioblásticas humanas no injertables, y preparaciones (que incluyen preparaciones farmacéuticas) que comprenden células hemangioblásticas humanas no injertables. Ciertas características de estos
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aspectos de la presente descripción se describen en detalle a continuación. La descripción contempla combinaciones de cualquiera de los siguientes aspectos y realizaciones, así como combinaciones con la descripción proporcionada en la Solicitud de Estados Unidos con el n.° de Serie 11/787.262.
Como se detalla anteriormente, las células formadoras de colonias hemangioblásticas y/o células hemangioblásticas no injertables pueden producirse a partir de una variedad de células que incluyen, pero no se limitan a, células pluripotentes (células madre embrionarias, células derivadas de embriones obtenidas sin destrucción de un embrión humano y células madre pluripotentes inducidas).
La presente descripción proporciona células hemangioblásticas no injertables (tales como células humanas). La célula puede diferenciarse para producir al menos un tipo de célula hematopoyética. En ciertas realizaciones, la célula es poco adherente a otras células hemangioblásticas humanas no injertables. En ciertas realizaciones, la célula no expresa la proteína CD34. En algunas otras realizaciones, la célula no expresa una o más (por ejemplo, la célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro) de las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En algunas otras realizaciones, la célula expresa la proteína GATA2 y/o LMO2. En algunas otras realizaciones, la célula comparte una o más de una (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) de las características funcionales o estructurales de las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas.
También se describe un cultivo celular que comprende una población sustancialmente purificada de células hemangioblásticas no injertables (tales como células humanas). Las células pueden diferenciarse para producir al menos tipos de células hematopoyéticas. En ciertas realizaciones, las células son poco adherentes entre sí. En ciertas realizaciones, la célula no expresa la proteína CD34. En algunas otras realizaciones, la célula no expresa una o más (por ejemplo, la célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro) de las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En algunas otras realizaciones, la célula expresa la proteína GATA2 y/o LMO2. En algunas otras realizaciones, la célula comparte una o más de una (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) de las características funcionales o estructurales de las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas.
También se describe un cultivo celular que comprende células hemangioblásticas no injertables diferenciadas de tejido embrionario obtenido sin destrucción de un embrión humano. En ciertas realizaciones, la descripción proporciona un cultivo celular que comprende células hemangioblásticas no injertables diferenciadas a partir de células pluripotentes (células madre pluripotentes) obtenidas sin destrucción de un embrión humano. En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas no injertables son poco adherentes entre sí. En ciertas realizaciones, las células pueden diferenciarse para producir al menos tipos de células hematopoyéticas, y las células son poco adherentes entre sí. En ciertas realizaciones, la célula no expresa la proteína CD34. En algunas otras realizaciones, la célula no expresa una o más (por ejemplo, la célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro) de las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En algunas otras realizaciones, la célula expresa la proteína GATA2 y/o LMO2. En algunas otras realizaciones, la célula comparte una o más de una (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) de las características funcionales o estructurales de las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas.
También se describe un cultivo celular que comprende células hemangioblásticas humanas no injertables, células que se pueden diferenciar para producir al menos tipos de células hematopoyéticas. En ciertas realizaciones, las células son poco adherentes entre sí. En ciertas realizaciones, la célula no expresa la proteína CD34. En algunas otras realizaciones, la célula no expresa una o más (por ejemplo, la célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro) de las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En algunas otras realizaciones, la célula expresa la proteína GATA2 y/o LMO2. En algunas otras realizaciones, la célula comparte una o más de una (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) de las características funcionales o estructurales de las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas.
También se describe una preparación farmacéutica que comprende células hemangioblásticas humanas no injertables, células que se pueden diferenciar para producir al menos tipos de células hematopoyéticas. En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas no injertables son poco adherentes entre sí. En ciertas realizaciones, la célula no expresa la proteína CD34. En algunas otras realizaciones, la célula no expresa una o más (por ejemplo, la célula no expresa al menos una, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro) de las siguientes proteínas: CD34, CD31, CD133, KDR. En algunas otras realizaciones, la célula expresa la proteína GATA2 y/o LMO2. En algunas otras realizaciones, la célula comparte una o más de una (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) de las características funcionales o estructurales de las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. La preparación farmacéutica se puede preparar usando cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
También se describe una preparación farmacéutica que comprende células hemangioblásticas humanas no injertables. La preparación farmacéutica se puede preparar usando cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, la composición o preparación farmacéutica comprende al menos 1 x 105 células hemangioblásticas humanas no injertables. En alguna otra realización de cualquiera de las anteriores, la composición o preparación farmacéutica comprende al menos 1 x 106, al menos 5 x 106, al menos 1 x 107, o más de 1 x 107 células hemangioblásticas humanas no injertables. En ciertas realizaciones, la preparación es
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una preparación purificada o sustancialmente purificada. En otras realizaciones, la preparación comprende una mezcla de células hemangioblásticas no injertables y otros tipos de células. Por ejemplo, una mezcla de células hemangioblásticas no injertables y células formadoras de colonias hemangioblásticas.
Las células, composiciones y preparaciones adicionales incluyen células parcial o terminalmente diferenciadas a partir de células hemangioblásticas humanas no injertables. Por ejemplo, la invención contempla composiciones y preparaciones que comprenden uno o más tipos de células hematopoyéticas y/o endoteliales diferenciadas a partir de células hemangioblásticas no injertables. Los tipos de células hematopoyéticas ejemplares incluyen células madre hematopoyéticas, plaquetas, glóbulos rojos, linfocitos, megacariocitos y similares. A modo de ejemplos adicionales, la invención contempla composiciones y preparaciones que comprenden uno o más tipos de células diferentes, tales como uno o más tipos de células mesodérmicas parcial o terminalmente diferenciadas, diferenciadas a partir de células hemangioblásticas no injertables.
En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, la presente descripción proporciona una preparación crioconservada de células hemangioblásticas humanas no injertables o células parcial o terminalmente diferenciadas de las mismas.
En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, la presente descripción proporciona el uso terapéutico de células hemangioblásticas humanas no injertables, o composiciones o preparaciones de células hemangioblásticas humanas no injertables. Dichas células y preparaciones se pueden usar en el tratamiento de cualquiera de las afecciones o enfermedades detalladas a lo largo de la memoria descriptiva, así como en la industria de los bancos de sangre. Además, las células diferenciadas a partir de células hemangioblásticas humanas no injertables, o composiciones o preparaciones de células hemangioblásticas humanas no injertables, se pueden usar terapéuticamente en el tratamiento de cualquiera de las afecciones o enfermedades detalladas a lo largo de la memoria descriptiva.
Las células hemangioblásticas humanas no injertables descritas en esta memoria se pueden usar terapéuticamente. Además o como alternativa, las células hemangioblásticas humanas no injertables se pueden usar para estudiar el desarrollo de linajes endoteliales y hematopoyéticos o en ensayos de cribado para identificar factores que se pueden usar, por ejemplo, para (i) mantener células hemangioblásticas humanas no injertables o (ii) para promover la diferenciación de células hemangioblásticas humanas no injertables a uno o más tipos de células parcial o terminalmente diferenciadas. Además, las células hemangioblásticas humanas no injertables se pueden usar para generar uno o más tipos celulares parcial o terminalmente diferenciados para su uso in vitro o in vivo.
Las células hemangioblásticas humanas no injertables descritas en esta memoria se pueden usar en cualquiera de los procedimientos o aplicaciones descritos en la presente solicitud, que incluyen, pero no se limitan a, en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades o afecciones descritas en esta memoria. Las enfermedades y afecciones ejemplares se describen adicionalmente en la solicitud de Estados Unidos con el número de serie 11/787.262. Además, las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas y las células hemangioblásticas no injertables se pueden usar para producir tipos de células hematopoyéticas diferenciadas, que incluyen glóbulos rojos funcionales.
Preparaciones celulares que comprenden hemangioblastos expandidos in vitro
En ciertas realizaciones de la presente descripción, las células hemangioblásticas de mamífero (incluidas las humanas) no injertables se expanden para alcanzar cantidades comerciales y se usan en diversas aplicaciones terapéuticas y clínicas. En realizaciones particulares, las células hemangioblásticas no injertables se expanden para alcanzar números de células del orden de 10.000 a 4 millones (o más). Estos números de células se pueden alcanzar dentro de los 3-4 días de comenzar las preparaciones iniciales. Por consiguiente, la presente descripción se refiere a preparaciones que comprenden grandes cantidades de células hemangioblásticas no injertables, dichas preparaciones que comprenden al menos 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, un millón, 2 millones, 3 millones o 4 millones de células.
También se describen una solución, una composición y una preparación que comprenden grandes cantidades de células hemangioblásticas no injertables, dicha solución, dicha composición y dicha preparación que comprende al menos 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, un millón, 2 millones, 3 millones o 4 millones de células Las células hemangioblásticas no injertables podrían ser humanas. Las soluciones pueden estar purificadas, purificarse sustancialmente, o mezclarse con otros tipos de células progenitoras que incluyen, pero no se limitan a, células formadoras de colonias hemangioblásticas.
Otros aspectos de la presente descripción se refieren a diferenciar las células hemangioblásticas no injertables obtenidas mediante los procedimientos descritos en esta memoria en linajes de células hematopoyéticas o endoteliales, o ambos, que se usan posteriormente en aplicaciones clínicas. Por lo tanto, la presente descripción también se refiere a preparaciones celulares que comprenden grandes cantidades de tipos de células parcial o terminalmente diferenciadas.
Las composiciones y preparaciones que comprenden números grandes (por ejemplo, miles o millones) de células hemangioblásticas no injertables pueden obtenerse expandiendo células hemangioblásticas no injertables que se
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obtienen como se ha descrito anteriormente. Por consiguiente, la presente descripción también se refiere a composiciones y preparaciones que comprenden grandes cantidades de células hemangioblásticas no injertables conseguidas expandiendo células ES (tales como células ES humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano) o células hemangioblásticas no injertables obtenidas de sangre de cordón umbilical, sangre periférica o médula ósea. Además, como los procedimientos de expansión pueden aplicarse a células hemangioblásticas no injertables de origen de ratón, rata, bovino o primate no humano, por ejemplo, la presente descripción también se refiere a composiciones y preparaciones que comprenden grandes cantidades de células hemangioblásticas no injertables de otras especies además del ser humano. Las células hemangioblásticas no injertables a expandir por los procedimientos de esta descripción pueden ser bipotenciales, es decir, pueden diferenciarse en células endoteliales o células madre hematopoyéticas. En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas humanas no injertables generadas y expandidas a partir de células ES humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano son bipotenciales. Las células hemangioblásticas no injertables son capaces de diferenciarse para dar lugar al menos a tipos de células hematopoyéticas. Las células hemangioblásticas no injertables son, en ciertas realizaciones, bipotenciales y capaces de diferenciarse para dar lugar al menos a tipos de células hematopoyéticas y tipos de células endoteliales. Como tal, las células hemangioblásticas no injertables son al menos unipotenciales, y pueden ser bipotenciales. Además, sin embargo, las células hemangioblásticas no injertables pueden tener un mayor grado de potencial de desarrollo y pueden, en ciertas realizaciones, diferenciarse para dar lugar a tipos de células de otros linajes. En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas no injertables son capaces de diferenciarse para dar lugar a otros derivados mesodérmicos tales como células cardíacas (por ejemplo, cardiomiocitos) y/o células de músculo liso.
Además, las células hemangioblásticas no injertables se pueden usar en ensayos de cribado para identificar agentes que, por ejemplo, (i) promueven la diferenciación de las células a uno o más tipos de células hematopoyéticas o (ii) promueven la proliferación y/o supervivencia del células para facilitar el almacenamiento y almacenamiento de células. Las células hemangioblásticas no injertables también se pueden usar para estudiar la biología básica del desarrollo o se pueden comparar con las células formadoras de colonias hemangioblásticas para determinar las diferencias de desarrollo entre las dos poblaciones de células madre relacionadas.
Realizaciones clínicas y comerciales de hemangioblastos humanos, células hemangioblásticas no injertables, células del linaje hemangioblástico y células del linaje hemangioblástico no injertables
Terapias basadas en células
Mientras que las células hemangioblásticas humanas y las células hemangioblásticas no injertables tienen el potencial de diferenciarse in vivo en células hematopoyéticas o endoteliales, se pueden usar en tratamientos basados en células en donde son necesarios cualquiera de estos dos tipos de células o mejorarían el tratamiento. Además, un paciente puede tratarse con cualquier terapia o tratamiento que comprenda células del linaje hemangioblástico y células del linaje hemangioblástico no injertables (es decir, células hematopoyéticas y/o células endoteliales). La siguiente sección describe procedimientos para usar los hemangioblastos humanos y las células hemangioblásticas no injertables generadas y expandidas por los procedimientos descritos en la presente memoria, o expandidos mediante los procedimientos descritos en esta memoria.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, se contemplan tratamientos para aumentar o tratar células hematopoyéticas y tratamientos para aumentar el crecimiento de vasos sanguíneos y/o facilitar la reparación de vasos sanguíneos. Por consiguiente, en ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a procedimientos y composiciones para tratar a un paciente que necesita células hematopoyéticas o el crecimiento o la reparación de los vasos sanguíneos. Los hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables pueden inyectarse en el vaso sanguíneo de un sujeto o administrarse al vaso sanguíneo de un sujeto a través de una operación. El paciente o el sujeto puede ser un ser humano.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, se usan células hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables en el trasplante, en donde de otro modo se usaría el trasplante de HSC. Dicho trasplante se puede usar, por ejemplo, en la reconstitución hematopoyética para el tratamiento de pacientes con leucemia aguda o crónica, anemia aplásica y diversos síndromes de inmunodeficiencia, así como diversas neoplasias malignas no hematológicas y trastornos autoinmunes, y para rescatar pacientes de la aplasia inducida por el tratamiento después de altas dosis de quimioterapia y/o radioterapia. Dicho trasplante puede conseguirse in vivo o ex vivo (tal como en un trasplante de médula ósea).
En otras realizaciones de la presente descripción, se usan células hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables para tratar pacientes que necesitan reconstitución hematopoyética o tratamiento hematopoyético. Dichos pacientes incluyen, por ejemplo, pacientes con talasemias, anemia de células falciformes, anemia aplásica (también denominada anemia hipoplásica), citopenia, hipoplasia medular, deficiencia de plaquetas, neoplasias hematopoyéticas tales como leucemias, hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) y ADA (por ejemplo, inmunodeficiencia combinada severa deficiente en desaminasa (ADA) (SCID)).
Las realizaciones particulares de la presente descripción se refieren por tanto a procedimientos para tratar a un paciente que necesita reconstitución hematopoyética o tratamiento hematopoyético usando los hemangioblastos de
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la presente descripción. Por consiguiente, también se describen procedimientos para tratar a un paciente que necesita reconstitución hematopoyética o un tratamiento que comprende seleccionar un paciente que lo necesite, generar y expandir o expandir hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables según los procedimientos de la presente invención, y administrar los hemangioblastos humanos o las células hemangioblásticas no injertables en el paciente. Alternativamente, el procedimiento puede comprender diferenciar los hemangioblastos humanos células hemangioblásticas no injertables generados y expandidos o expandidos o en células hematopoyéticas humanas y posteriormente administrar las células hematopoyéticas al paciente.
Las realizaciones alternativas incluyen procedimientos en donde los hemangioblastos humanos o las células hemangioblásticas no injertables se producen a gran escala y se almacenan antes de la selección de un paciente que lo necesite. Por lo tanto, otras realizaciones de la presente descripción se refieren a procedimientos para tratar a un paciente que necesita reconstitución hematopoyética o un tratamiento que comprende seleccionar un paciente que lo necesite, realizando un pedido de hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables ya aisladas y expandidas según los procedimientos descritos anteriormente, y administrar dichos hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables al paciente. Asimismo, el procedimiento puede comprender diferenciar dichos hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables en células hematopoyéticas humanas y administrar dichas células hematopoyéticas al paciente. En realizaciones adicionales, se cultivan hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables hemicigóticos u homocigóticos para al menos un alelo del MHC, opcionalmente cultivadas hasta cantidades comerciales, y opcionalmente almacenadas por una entidad comercial. Cuando un paciente presenta la necesidad de tales células, células del linaje hemangioblástico o células del linaje hemangioblástico no injertable, un médico u hospital realizarán un pedido al negocio para dichas células.
Debido a que las células hemangioblásticas humanas y las células hemangioblásticas no injertables proliferarán y se diferenciarán en células endoteliales bajo un microambiente angiogénico, las células hemangioblásticas humanas se pueden usar de manera terapéutica para proporcionar nuevos vasos sanguíneos o para inducir la reparación de vasos sanguíneos dañados en un sitio de lesión en un paciente. Por lo tanto, en ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a procedimientos para promover el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos o reparar la vasculatura lesionada. Los hemangioblastos humanos o las células hemangioblásticas no injertables se pueden usar para tratar lesiones endoteliales, como infarto de miocardio, accidente cerebrovascular y cerebro isquémico, extremidades isquémicas y heridas cutáneas, incluidas las extremidades y heridas isquémicas que se producen en animales o pacientes diabéticos, y la lesión por reperfusión isquémica en la retina. Otras afecciones isquémicas que pueden tratarse con hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables incluyen isquemia renal, isquemia pulmonar y miocardiopatía isquémica. Los hemangioblastos también se pueden usar para ayudar a reparar los vasos sanguíneos lesionados después de la angioplastia con balón o el despliegue de una endoprótesis vascular. Los hemangioblastos o las células hemangioblásticas no injertables se pueden usar adicionalmente en injertos de tejidos, cirugía y después de lesiones por radiación. Además, los hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables se pueden usar para tratar y/o prevenir la progresión de la aterosclerosis así como para reparar el daño de las células endoteliales que se produce en la esclerosis sistémica y el fenómeno de Raynaud (RP) (Blann y col., 1993 J. Rheumatol. (20) 1325-30).
En consecuencia, la presente descripción proporciona diversos procedimientos implicados en proporcionar crecimiento o reparación de los vasos sanguíneos a un paciente que lo necesite. En una realización, la descripción proporciona un procedimiento para inducir la formación de nuevos vasos sanguíneos en un tejido isquémico en un paciente que lo necesite, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de la preparación purificada de células hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables descrita anteriormente para inducir la formación de nuevos vasos sanguíneos en dicho tejido isquémico. Por lo tanto, ciertos aspectos de la presente descripción proporcionan un procedimiento para mejorar la formación de vasos sanguíneos en un paciente que lo necesite, que comprende seleccionar al paciente que lo necesite, aislar células hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables como se ha descrito anteriormente, y administrar las células hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables al paciente. En otro aspecto más, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar un vaso sanguíneo lesionado en un paciente que lo necesite, que comprende seleccionar al paciente que lo necesite, expandir o generar y expandir células hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables como se ha descrito anteriormente, y administrar las células hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables al paciente. Además de las realizaciones mencionadas anteriormente, los hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables pueden producirse a gran escala y almacenarse antes de la selección del paciente que necesita hemangioblastos. En realizaciones adicionales, se cultivan hemangioblastos hemicigóticos u homocigóticos para al menos un alelo del MHC, se cultivan opcionalmente hasta cantidades comerciales, y opcionalmente se almacenan antes de que se seleccione un paciente para el tratamiento con hemangioblastos o con células hemangioblásticas no injertables. Cualquiera de los hemangioblastos, las células hemangioblásticas no injertables o las preparaciones celulares de estas células anteriormente mencionados se pueden administrar directamente en la circulación (por vía intravenosa). En ciertas realizaciones (por ejemplo, cuando la reparación vascular es necesaria en el ojo, como en el tratamiento de la lesión por isquemia/reperfusión de la retina), las células hemangioblásticas, las células hemangioblásticas no injertables o las preparaciones celulares de estas células pueden administrarse por inyección intravítrea.
La administración de las soluciones o preparaciones de hemangioblastos, células hemangioblásticas no injertables y sus células derivadas se puede realizar por cualquier vía y se puede determinar caso por caso. Además, una
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cantidad efectiva a administrar de estas soluciones o preparaciones de hemangioblastos o células derivadas de las mismas es una cantidad que es terapéuticamente eficaz y puede determinarse caso por caso.
En aspectos adicionales, las células del linaje hemangioblástico o células del linaje hemangioblástico no injertables se usan en aplicaciones terapéuticas, que incluyen en el tratamiento de las indicaciones descritas anteriormente, por ejemplo. Por consiguiente, los hemangioblastos o las células hemangioblásticas no injertables generadas y expandidas o expandidas por los procedimientos descritos en esta memoria primero se diferencian in vitro para obtener células hematopoyéticas y/o endoteliales, y a continuación para obtener células que se diferencian adicionalmente en estos dos linajes. Estas células pueden administrarse posteriormente a un sujeto o paciente para tratar afecciones hematopoyéticas o para reconstitución hematopoyética, o para el tratamiento de isquemia o lesión vascular, por ejemplo.
Las HSC derivadas de hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables obtenidas mediante los procedimientos descritos en la presente memoria se cultivan adicionalmente para expandir las HSC y/o para derivar otros tipos de células del linaje hematopoyético. Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren al uso de HSC derivadas de los hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables en trasplante. En realizaciones adicionales, se usan células hematopoyéticas diferenciadas (tales como, por ejemplo, granulocitos, eritrocitos, células mieloides, megacariocitos, plaquetas, macrófagos, mastocitos y neutrófilos (Wiles y Keller 1991 Development (111): 259) en diversos tratamientos tales como terapia de transfusión o para el tratamiento de infecciones. Por consiguiente, otras realizaciones de la presente descripción se refieren a procedimientos de tratamiento de un paciente que necesita reconstitución hematopoyética o tratamiento usando las HSC o células del linaje hematopoyético derivadas de hemangioblastos.
En ciertos aspectos, por lo tanto, también se describen procedimientos para tratar a un paciente que necesita células hematopoyéticas o un tratamiento que comprende seleccionar a un paciente que lo necesite, expandir o aislar y expandir hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables según los procedimientos descritos en la presente memoria, diferenciando dichas células hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables en células madre hematopoyéticas y/o células hematopoyéticas maduras, y administrando las células hematopoyéticas al paciente.
En otros aspectos de la descripción, los hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables se cultivan para dar lugar a células endoteliales según los procedimientos descritos en esta memoria. El endotelio se puede usar posteriormente para proporcionar nuevos vasos sanguíneos o para inducir la reparación de vasos sanguíneos dañados en un sitio de lesión en un paciente. Por lo tanto, en ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a procedimientos para promover el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos o reparar la vasculatura lesionada en donde se usan células endoteliales derivadas de hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables como terapia. Las células endoteliales se pueden usar para tratar lesiones endoteliales, como infarto de miocardio e isquemia pulmonar, accidente cerebrovascular y cerebro isquémico, extremidades isquémicas y heridas de la piel, incluidas las extremidades y heridas isquémicas que se producen en animales o pacientes diabéticos, lesión por reperfusión isquémica en la retina, isquemia. Las células endoteliales también se pueden usar para ayudar a reparar vasos sanguíneos dañados después de la angioplastia con balón o el despliegue de una endoprótesis vascular, así como en injertos, cirugía y después de una lesión por radiación. Además, las células endoteliales se pueden usar para tratar y/o prevenir la progresión de la aterosclerosis, así como para reparar el daño de las células endoteliales que se produce en la esclerosis sistémica y el fenómeno de Raynaud.
La célula endotelial se puede diferenciar adicionalmente y esas células, según sea apropiado, se pueden usar en el tratamiento de una o más de las enfermedades o afecciones de las «células endoteliales», tales como las enumeradas en el párrafo anterior.
Por consiguiente, también se describen procedimientos para tratar a un paciente con lesión endotelial o vascular o que necesite el crecimiento o la reparación de los vasos sanguíneos que comprenden seleccionar a un paciente que lo necesite, expandir o aislar y expandir hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables según los procedimientos descritos en la presente memoria, diferenciar dichas células hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables en células endoteliales, y administrar las células endoteliales al paciente.
Banco de sangre
También se describen procedimientos para producir células hematopoyéticas adecuadas para transfusión. Aunque dichas células y procedimientos tienen numerosos usos, un uso particularmente importante sería mejorar la disponibilidad de sangre para transfusiones. En ciertas realizaciones preferidas, la descripción proporciona glóbulos rojos diferenciados de hemangioblastos/unidades formadoras de colonias hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables. Dichos glóbulos rojos diferenciados podrían usarse para transfusiones.
También se describen procedimientos para generar células hematopoyéticas diferenciadas a partir de hemangioblastos/unidades formadoras de colonias hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables para su uso en transfusiones de sangre para aquellos que lo necesiten. En ciertas realizaciones, las células hematopoyéticas diferenciadas se transfunden para tratar un traumatismo, la pérdida de sangre durante la cirugía,
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enfermedades de la sangre tales como anemia, anemia de células falciformes o enfermedades hemolíticas o una enfermedad maligna. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos se transfunden para tratar un traumatismo, la pérdida de sangre durante la cirugía o enfermedades de la sangre tales como anemia, anemia de células falciformes o enfermedad hemolítica. En ciertas realizaciones, las plaquetas se transfunden para tratar trastornos congénitos de las plaquetas o enfermedades malignas. En ciertas realizaciones, se transfunde una población mixta de glóbulos rojos y plaquetas.
Debe observarse que muchos tipos de células hematopoyéticas diferenciadas, particularmente los glóbulos rojos, normalmente existen in vivo como una población mixta. Específicamente, in vivo se encuentran glóbulos rojos circulantes de diferentes niveles de edad y diferenciación. Además, los glóbulos rojos maduran con el tiempo para expresar menos hemoglobulina fetal y más hemoglobina adulta. La presente descripción contempla la transfusión de poblaciones purificadas de glóbulos rojos o de una población mixta de glóbulos rojos que tienen niveles variables de edad y de diferenciación. En realizaciones particulares, la descripción contempla la transfusión de glóbulos rojos que expresan hemoglobina fetal (hemoglobina F).
También se describe un procedimiento para producir células hematopoyéticas diferenciadas a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas y células hemangioblásticas no injertables in vitro, dicho procedimiento que comprende las etapas de:
(a) proporcionar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables; y
b) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables en células hematopoyéticas diferenciadas.
También se describe un procedimiento para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas que se diferencian in vitro a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables, dicho procedimiento que comprende las etapas de:
(a) proporcionar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables;
(b) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables en células hematopoyéticas diferenciadas; y
(c) realizar transfusiones de sangre con dichas células hematopoyéticas diferenciadas.
También se describe un procedimiento para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas que se han diferenciado in vitro a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, dicho procedimiento que comprende las etapas de:
(a) cultivar un cultivo celular que comprende células madre embrionarias humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano en medio sin suero en presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células madre embrionarias en cuerpos embrioides;
(b) añadir al menos un factor de crecimiento a dicho cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando dicho cultivo en medios sin suero, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables en dicho cultivo de cuerpos embrioides;
(c) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables en células hematopoyéticas diferenciadas; y
(d) realizar transfusiones de sangre con dichas células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas realizaciones, dichas células madre, cuerpos embrioides y células formadoras de colonias hemangioblásticas se hacen crecer en medios sin suero a lo largo de todas las etapas (a) y (b) de dicho procedimiento.
También se describe un procedimiento para realizar transfusiones de sangre usando células hematopoyéticas que se han diferenciado in vitro a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas, dicho procedimiento que comprende las etapas de:
(a) cultivar un cultivo celular que comprende células madre pluripotentes humanas obtenidas sin destrucción de un embrión humano en medios sin suero en presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas células madre pluripotentes en cuerpos embrioides;
(b) añadir al menos un factor de crecimiento a dicho cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando dicho cultivo en medios sin suero, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente
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para expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables en dicho cultivo de cuerpos embrioides;
(c) disgregar dichos cuerpos embrioides en células individuales;
(d) añadir al menos un factor de crecimiento a dicho cultivo que comprende dichas células individuales y continuar cultivando dicho cultivo en medios sin suero, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables en dicho cultivo que comprende dichas células individuales;
(e) diferenciar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables en células hematopoyéticas diferenciadas; y
(f) realizar transfusiones de sangre con dichas células hematopoyéticas diferenciadas.
En ciertas realizaciones, dichas células madre pluripotentes, cuerpos embrioides, células formadoras de colonias hemangioblásticas, células hemangioblásticas no injertables y células individuales se cultivan en medios sin suero a lo largo de todas las etapas (a)-(d) de dicho procedimiento.
En ciertas realizaciones, la célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria obtenida sin destrucción de un embrión humano.
En ciertas realizaciones, el factor de crecimiento es una proteína que comprende una proteína homeobox, o una variante funcional o un fragmento activo de la misma. En ciertas realizaciones, la proteína homeobox comprende una proteína HOXB4, o una variante funcional o un fragmento activo de la misma.
En ciertas realizaciones, las células hematopoyéticas diferenciadas se producen como un único tipo de célula tal como glóbulos rojos, plaquetas y fagocitos. Obsérvese, sin embargo, que cuando se produce un único tipo de célula, el tipo de célula puede ser heterogéneo en términos de nivel de madurez o diferenciación del tipo de célula particular. A modo de ejemplo, los glóbulos rojos diferenciados pueden ser heterogéneos en términos de nivel de madurez y edad celular. Sin estar limitados por la teoría, dicha heterogeneidad de las células eritrocíticas puede ser beneficiosa porque imita la forma en que se encuentran los glóbulos rojos in vivo.
En ciertas realizaciones, los tipos de células individuales se mezclan para igualar la proporción de tipos de células diferenciadas que se encuentran en la sangre. En ciertas realizaciones, se producen múltiples tipos de células hematopoyéticas diferenciadas en la misma etapa. En ciertas realizaciones, el fagocito se selecciona entre: granulocitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, linfocitos o monocitos. En ciertas realizaciones, los tipos de células hematopoyéticas se producen en una proporción aproximadamente igual a la proporción de los tipos de células hematopoyéticas diferenciadas encontradas en sangre, el 96 % de glóbulos rojos, el 1 % de plaquetas y el 3 % de fagocitos. En ciertas realizaciones, se añade plasma a las células hematopoyéticas diferenciadas antes de la transfusión. En ciertas realizaciones, se transfunden células empaquetadas, por ejemplo glóbulos rojos empaquetados, en ausencia o ausencia sustancial de plasma.
En ciertas realizaciones, las células hematopoyéticas diferenciadas producidas a partir de los procedimientos de la solicitud son funcionales. En ciertas realizaciones, las plaquetas producidas a partir de los procedimientos de la solicitud son funcionales. En ciertas realizaciones, los fagocitos producidos a partir de los procedimientos de la solicitud son funcionales. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos producidos a partir de los procedimientos de la solicitud son funcionales. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos expresan hemoglobina F antes de la transfusión. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos transportan oxígeno. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos tienen una esperanza de vida igual a glóbulos rojos derivados naturalmente. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos tienen una vida útil que es el 75 % de la de glóbulos rojos derivados naturalmente. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos tienen una vida útil que es el 50 % de la de glóbulos rojos derivados naturalmente. En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos tienen una vida útil que es el 25 % de la de glóbulos rojos derivados naturalmente.
En ciertas realizaciones, los procedimientos de la solicitud producen 1 x 106 células por placa de 100 mM. En ciertas realizaciones, se producen 2 x 106 células por placa de 100 mM. En ciertas realizaciones, se producen 3 x 106 células por placa de 100 mM. En ciertas realizaciones, se producen 4 x 106 células por placa de 100 mM. En ciertas realizaciones, se producen 5 x 106 células por placa de 100 mM. En ciertas realizaciones, se producen 6 x 106 células por placa de 100 mM. En ciertas realizaciones, se producen 7 x 106 células por placa de 100 mM. En ciertas realizaciones, se producen 8 x 106 células por placa de 100 mM. En ciertas realizaciones, se producen 9 x 106 células por placa de 100 mM. En ciertas realizaciones, se producen 1 x 107 células por placa de 100 mM. En ciertas realizaciones, se producen 5 x 107 células por placa de 100 mM. En ciertas realizaciones, se producen 1 x 108 células por placa de 100 mM.
En ciertas realizaciones, la etapa de diferenciación se realiza usando condiciones conocidas por un experto en la materia como se ha descrito anteriormente. En ciertas realizaciones, la etapa de diferenciación se realiza usando procedimientos específicos para diferenciar células en glóbulos rojos (véase documento WO2005/118780). En
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ciertas realizaciones, la etapa de diferenciación se realiza usando procedimientos específicos para diferenciar células en plaquetas. En ciertas realizaciones, la etapa de diferenciación se realiza usando procedimientos específicos para diferenciar células en leucocitos.
Los agentes de diferenciación que se pueden usar incluyen citoquinas tales como interferón alfa A, interferón alfa A/D, interferón beta, interferón gamma, proteína inducible por interferón gamma 10, interleuquina 1, interleuquina 2, interleuquina 3, interleuquina 4, interleuquina 5, interleuquina 6, interleuquina 7, interleuquina 8, interleuquina 9, interleuquina 10, interleuquina 1, interleuquina 12, interleuquina 13, interleuquina 15, interleuquina 17, factor de crecimiento de queratinocitos, leptina, factor inhibidor de leucemia, factor estimulante de colonias de macrófagos y proteína-1 alfa inflamatoria de macrófagos.
Los agentes de diferenciación también incluyen factores de crecimiento tales como 6Cquina (recombinante), activina A, interferón alfa A, interferón alfa, anfiregulina, angiogenina, factor de crecimiento de células B-endoteliales, beta celulina, interferón B, factor neurotrófico derivado del cerebro, CIO (recombinante), cardiotrofina-1, factor neurotrófico ciliar, quimioatrayente-1 de neutrófilos inducido por citoquinas, suplemento de crecimiento de células endoteliales, eotaxina, factor de crecimiento epidérmico, péptido activador de neutrófilos-78, eritropoyetina, receptor de estrógeno-alfa, receptor de estrógeno-B, factor de crecimiento de fibroblastos (ácido/básico, estabilizado con heparina, recombinante), ligando FLT-3/FLK-2 (ligando FLT-3), interferón gamma, factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, Gly-His-Lys, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos, GRO-alfa/MGSA, GRO-B, GRO-gamma, HCC-1, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, alfa heregulina (dominio EGF), proteína-1 de unión al factor de crecimiento de insulina, factor de crecimiento similar a la insulina de unión al complejo de proteína-1/IGF-1, factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento similar a la insulina II, factor de crecimiento nervioso 2,5S (NGF), 7S-NGF, proteína inflamatoria de macrófagos-1B, proteína inflamatoria de macrófagos-2, proteína inflamatoria de macrófagos-3 alfa, proteína inflamatoria de macrófagos-3B, proteína quimiotáctica de monocitos-1, proteína quimiotáctica de monocitos-2, proteína quimiotáctica de monocitos-3, neurotrofina-3, neurotrofina 4, ngF-B (recombinante humana o de rata), oncostatina M (recombinante humana o de ratón), extracto pituitario, factor de crecimiento placentario, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, pleiotrofina, rantes, factor de células madre, factor estimulante del crecimiento del factor 1B/pre-B derivado de células estromales, trombopoyetina, factor de crecimiento transformante alfa, factor de crecimiento transformante B1, factor de crecimiento transformante B2, factor de crecimiento transformante B3, factor de crecimiento transformante B5, factor de necrosis tumoral (alfa y B) y factor de crecimiento endotelial vascular.
Los agentes de diferenciación también incluyen hormonas y antagonistas de hormonas, como 17B-estradiol, hormona adrenocorticotrópica, adrenomedulina, hormona estimulante de melanocitos alfa, gonadotropina coriónica, globulina de unión a corticosteroides, corticosterona, dexametasona, estriol, hormona foliculoestimulante, gastrina 1, glucagón, gonadotropina, hidrocortisona, insulina, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, L- 3,3',5'-triyodotironina, L-3,3',5-triyodotironina, leptina, hormona luteinizante, L-tiroxina, melatonina, MZ-4, oxitocina, hormona paratiroidea, PEC-60, hormona del crecimiento hipofisario, progesterona, prolactina, secretina, globulina transportadora de hormonas sexuales, hormona estimulante del tiroides, factor liberador de tirotropina, globulina fijadora de tiroxina y vasopresina.
Además, los agentes de diferenciación incluyen componentes de la matriz extracelular, tales como fibronectina, fragmentos proteolíticos de fibronectina, laminina, trombospondina, agrecano y sindezan.
Los agentes de diferenciación también incluyen anticuerpos contra diversos factores, como el anticuerpo contra el receptor de lipoproteína de baja densidad, el anticuerpo interno contra el receptor de la progesterona, el anticuerpo contra la cadena 2 del receptor del interferón alfa, el anticuerpo contra el receptor de quimiocina CC 1, el anticuerpo contra CD 118, el anticuerpo contra CD 119, el anticuerpo contra el factor 1 estimulante de colonias, el anticuerpo contra el receptor CSF-1/c-fins, el anticuerpo contra el factor de crecimiento epidérmico (AB-3), el anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico, el anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico fosfo-específico, el anticuerpo contra el factor de crecimiento epidérmico (AB-1), el anticuerpo contra el receptor de eritropoyetina, el anticuerpo contra el receptor de estrógeno, el anticuerpo contra el receptor de estrógeno C- terminal, el anticuerpo contra el receptor de estrógeno B, el anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos, el anticuerpo básico contra el factor de crecimiento de fibroblastos, el anticuerpo contra la cadena del receptor del interferón gamma, el anticuerpo recombinante humano contra el interferón gamma, anticuerpo C- terminal contra GFR alfa-1, anticuerpo C-terminal contra GFR alfa-2, el anticuerpo contra el factor estimulante de colonias de granulocitos (AB-1), el anticuerpo contra el receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos, el anticuerpo contra el receptor de insulina, el anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento-1 similar a la insulina, el anticuerpo recombinante humano contra la interleuquina-6, el anticuerpo recombinante humano contra la interleuquina-1, el anticuerpo recombinante humano contra la interleuquina-2, el anticuerpo recombinante contra la leptina de ratón, el anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento nervioso, el anticuerpo de pollo contra p60, el anticuerpo contra la proteína similar a la hormona paratiroidea, el anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, el anticuerpo contra el receptor B del factor de crecimiento derivado de plaquetas, el anticuerpo contra el factor de crecimiento alfa derivado de plaquetas, el anticuerpo contra el receptor de progesterona, el anticuerpo contra el receptor del ácido retinoico-alfa, el anticuerpo contra el receptor nuclear de la hormona tiroidea, el anticuerpo contra el receptor nuclear alfa 1/Bi de la hormona antitiroidea, el anticuerpo contra
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el receptor de la transferrina/CD71, el anticuerpo contra el factor de crecimiento transformante alfa, el anticuerpo contra el factor de crecimiento transformante b3, el anticuerpo contra el factor de necrosis tumoral alfa y anticuerpo contra el factor de crecimiento endotelial vascular.
También se describe una biblioteca de células hematopoyéticas diferenciadas que pueden proporcionar células compatibles a posibles pacientes receptores tal como se ha descrito anteriormente. En ciertas realizaciones, las células se almacenan congeladas. Por consiguiente, en una realización, la descripción proporciona un procedimiento para llevar a cabo un negocio farmacéutico, que comprende la etapa de proporcionar preparaciones de células hematopoyéticas diferenciadas que son homocigóticas para al menos un antígeno de histocompatibilidad, las células que se seleccionan de un banco de dichas células que comprende una biblioteca de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables que pueden expandirse mediante los procedimientos descritos en la presente memoria, en donde cada célula formadora de colonias hemangioblásticas o la preparación de células hemangioblásticas no injertables es hemicigótica u homocigótica para al menos un alelo del MHC presente en la población humana, y en donde dicho banco de células formadoras de colonias hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables comprende células que son hemicigóticas u homocigóticas para un grupo diferente de alelos del MHC con relación a los otros miembros en el banco de células. Como se ha mencionado anteriormente, el direccionamiento de genes o la pérdida de heterocigosidad se pueden usar para generar las células madre del alelo del MHC hemicigóticas u homocigóticas usadas para derivar las células formadoras de colonias hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables. En ciertas realizaciones, en el banco se incluyen células formadoras de colonias hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables de todos los tipos de sangre. En ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas o las células hemangioblásticas no injertables son compatibles con un paciente para asegurar que se produzcan células hematopoyéticas diferenciadas del propio tipo de sangre del paciente. En ciertas realizaciones, las células formadoras de colonias hemangioblásticas o las células hemangioblásticas no injertables son negativas para los factores antigénicos A, B, Rh o cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, las células hematopoyéticas diferenciadas son células donantes universales. A modo de ejemplo, las células hematopoyéticas que son de tipo O y Rh negativo se pueden usar universalmente para la transfusión de sangre. En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona procedimientos para producir eritrocitos de tipo O y Rh negativo para la transfusión universal.
En ciertas realizaciones, los glóbulos rojos diferenciados a partir de las células formadoras de colonias hemangioblásticas o las células hemangioblásticas no injertables expresan hemoglobina fetal. La transfusión de glóbulos rojos que expresan hemoglobina fetal puede ser especialmente útil en el tratamiento de la anemia de células falciformes. Como tal, también se describen procedimientos mejorados para tratar la anemia de células falciformes.
En una realización, después de seleccionar una preparación de células formadoras de colonias hemangioblásticas particular o una preparación de células hemangioblásticas no injertable para que sea adecuada para un paciente, se expande después para alcanzar cantidades apropiadas para el tratamiento del paciente y se diferencia para obtener células hematopoyéticas diferenciadas antes de administrar las células al receptor. Los procedimientos para llevar a cabo un negocio farmacéutico también pueden comprender establecer un sistema de distribución para distribuir la preparación para la venta o pueden incluir el establecimiento de un grupo de ventas para comercializar la preparación farmacéutica.
En cualquiera de los anteriores, las células formadoras de colonias hemangioblásticas o las células hemangioblásticas no injertables se pueden diferenciar directamente o las células formadoras de colonias hemangioblásticas o las células hemangioblásticas no injertables se pueden congelar para un uso posterior. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un cultivo congelado de células formadoras de colonias hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables adecuadas para la posterior descongelación y expansión, y también adecuado para la diferenciación a linajes hematopoyéticos o endoteliales.
Se pueden usar células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables para generar un número sustancial de tipos de células hematopoyéticas que se pueden usar en transfusiones de sangre. Por ejemplo, pueden generarse números sustanciales de poblaciones homogéneas o heterogéneas de glóbulos rojos y/o plaquetas a partir de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas. Las células formadoras de colonias hemangioblásticas, las células hemangioblásticas no injertables y los tipos de células hematopoyéticas diferenciadas de las mismas se pueden almacenar en un banco, como se hace actualmente con los productos sanguíneos donados, y usarse en transfusiones y otros tratamientos. Los bancos de estos productos ayudarán a aliviar la escasez crítica de productos sanguíneos donados. Además, las células formadoras de colonias hemangioblásticas, las células hemangioblásticas no injertables y los productos derivados pueden manipularse genéticamente in vitro para proporcionar productos sanguíneos de donantes universales.
También se describe un procedimiento para llevar a cabo un negocio de banco de sangre. El negocio de banco de sangre objeto implica la derivación y el almacenamiento (a corto o largo plazo) de células formadoras de colonias hemangioblásticas, células hemangioblásticas no injertables y/o tipos de células hematopoyéticas (por ejemplo, glóbulos rojos, plaquetas, linfocitos, etc.) generados a partir de las mismas. Las células se pueden crioconservar para su almacenamiento a largo plazo, o se pueden mantener en cultivo para un almacenamiento a relativamente
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corto plazo. Las células se pueden clasificar y comprobar su compatibilidad de forma parecida a como se clasifican los productos sanguíneos actualmente disponibles, y las células se pueden almacenar según el tipo. Además, en ciertas realizaciones, las células pueden modificarse para generar específicamente células que son A negativas y/o B negativas y/o Rh negativas para producir células que son universal o casi universalmente adecuadas para la transfusión en cualquier paciente.
Obsérvese que las células formadoras de colonias hemangioblásticas, las células hemangioblásticas no injertables y/o los tipos de células hematopoyéticas diferenciadas pueden generarse usando cualquiera de los procedimientos detallados a lo largo de la memoria descriptiva.
En ciertas realizaciones de un procedimiento para llevar a cabo un negocio de banco de sangre, las células (células formadoras de colonias hemangioblásticas, células hemangioblásticas no injertables y/o tipos de células hematopoyéticas diferenciadas) se generan y almacenan en una o más instalaciones centrales. Las células se pueden transferir, por ejemplo, a hospitales o instalaciones de tratamiento para su uso en la atención del paciente. En algunas otras realizaciones, las células se mantienen en un estado crioconservado y específicamente descongeladas y preparadas para su transfusión en base a órdenes de hospitales u otras instalaciones de tratamiento. Dichas órdenes pueden ser una orden permanente (por ejemplo, generar y proporcionar una cierta cantidad de células de un cierto número de unidades).
En ciertas realizaciones, el procedimiento incluye un sistema para facturar a hospitales o compañías de seguros los costes asociados con los productos almacenados en el banco.
En ciertas realizaciones de cualquiera de las anteriores, las células pueden asignarse basándose en el número de células, el volumen o cualquier unidad que permita al usuario cuantificar la dosis que se administra a los pacientes y/o comparar estas dosis con las administradas durante una transfusión de sangre convencional.
En ciertas realizaciones, las células se generan, almacenan y administran como una población mixta de células. Por ejemplo, la preparación puede incluir células de diferentes etapas de desarrollo, así como distintos tipos de células. En otras realizaciones, las células se generan, almacenan y/o administran como una preparación sustancialmente purificada de un tipo de célula individual.
En ciertas realizaciones, las preparaciones de células se criban para detectar una o más enfermedades infecciosas. La detección puede ocurrir antes o después de la generación o el almacenamiento. Por ejemplo, las preparaciones de células se pueden cribar para identificar hepatitis, VIH u otras enfermedades infecciosas transmitidas por la sangre que podrían transmitirse a los receptores de estos productos.
Inducción de tolerancia en receptores del injerto
Las células hemangioblásticas humanas generadas y expandidas por los procedimientos de esta invención, o expandidas por los procedimientos de esta invención, se pueden usar para inducir tolerancia inmunológica. La tolerancia inmunológica se refiere a la inhibición de la respuesta inmune del receptor del injerto que, de lo contrario, se produciría, por ejemplo, en respuesta a la introducción de un antígeno MHC no propio (por ejemplo, un antígeno compartido con el injerto y los hemangioblastos tolerantes) en el receptor. Por lo tanto, la tolerancia se refiere a la inhibición de la respuesta inmune inducida por un antígeno específico del donante en oposición a la inhibición inmune de amplio espectro que se puede provocar usando inmunosupresores. La tolerancia puede implicar respuestas humorales, celulares o tanto humorales como celulares. La tolerancia puede incluir la eliminación y/o inactivación de células T reactivas del donante maduras preexistentes así como la eliminación y/o inactivación a largo plazo (por ejemplo, de por vida) de células T reactivas con el donante recién desarrolladas.
Los procedimientos descritos en la presente invención para generar y expandir hemangioblastos humanos ofrecen varias ventajas para inducir tolerancia. Los procedimientos de la presente invención dan como resultado la generación de números grandes, previamente inalcanzables, de hemangioblastos humanos. Un gran número de hemangioblastos humanos permite la inducción de tolerancia en los receptores de injertos con protocolos de preacondicionamiento menos tóxicos. Además, los procedimientos de la presente invención proporcionan la generación de una biblioteca de hemangioblastos humanos, cada uno de los cuales es hemicigótico u homocigótico para al menos un alelo del MHC presente en la población humana, en donde cada miembro de dicha biblioteca de células hemangioblásticas es hemicigótico o homocigótico para un grupo diferente de alelos del MHC en relación con los otros miembros de la biblioteca. Dicha biblioteca de hemangioblastos humanos se puede usar en la selección de células hemangioblásticas humanas tolerantes, de modo que las células se pueden seleccionar para que sea compatible con cualquier injerto de donante disponible.
Recientemente se ha demostrado que el trasplante de médula ósea y el posterior establecimiento de quimerismo hematopoyético o mixto inducen tolerancia específica a nuevos tipos de tejidos derivados de células madre hematopoyéticas tanto en modelos murinos como humanos. El quimerismo hematopoyético o mixto se refiere a la producción en un receptor de células hematopoyéticas derivadas de células madre donantes y receptoras. Por lo tanto, si un receptor logra el quimerismo hematopoyético, el receptor será tolerante a los antígenos específicos del donante. En muchos protocolos para inducir tolerancia, las células tolerantes del donante que se administran al receptor se injertan en la médula ósea del receptor. Para crear espacio hematopoyético en la médula ósea receptora
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para las células donantes, algunos protocolos requieren una etapa de creación de espacio hematopoyético (por ejemplo, por irradiación de todo el cuerpo), y dicha etapa normalmente es tóxica o perjudicial para el receptor. Sin embargo, si se dispone de un gran número de células tolerantes del donante, existe evidencia por modelos de roedores de que la irradiación puede eliminarse por completo, logrando así el quimerismo hematopoyético o mixto con la ventaja de regímenes de preacondicionamiento menos tóxicos. Por lo tanto, se puede conseguir el quimerismo mixto, por ejemplo, con el acondicionamiento específico no mieloablativo del receptor.
Por consiguiente, como los nuevos procedimientos descritos en la presente memoria permiten la producción de grandes cantidades de células hemangioblásticas humanas, la presente invención ofrece la ventaja de inducir tolerancia inmunitaria con protocolos de acondicionamiento menos rigurosos o menos tóxicos. Por ejemplo, la etapa de creación de espacio hematopoyético se puede eliminar si se usa un número suficiente de células tolerantes del donante.
Por consiguiente, en ciertas realizaciones de la presente invención, las células hemangioblásticas humanas generadas y expandidas o expandidas mediante los procedimientos descritos en esta memoria se pueden usar para inducir tolerancia inmunológica. Si bien no se desea estar sujeto a ninguna teoría sobre el mecanismo, las células hemangioblásticas humanas pueden inducir tolerancia inmunológica dirigiéndolas a la médula ósea del receptor e injertándolas en la médula ósea del receptor con el fin de producir un quimerismo mixto.
En ciertas realizaciones, las células hemangioblásticas humanas donantes se administran a un paciente receptor (por ejemplo, mediante inyección intravenosa) antes de implantar un injerto o trasplantar un órgano, tejido o células del donante al paciente receptor. En ciertas realizaciones, los hemangioblastos humanos se administran para inducir tolerancia en pacientes que lo necesiten (por ejemplo, receptores de injerto o trasplante). Por consiguiente, en ciertas realizaciones, el procedimiento para inducir tolerancia en un paciente receptor humano comprende las etapas de: (a) seleccionar un paciente que necesita un trasplante o terapia celular; (b) administrar a dicho paciente células hemangioblásticas humanas derivadas de un donante o que son compatibles con el donante, en donde dichas células hemangioblásticas se generan y expanden o se expanden según los procedimientos de esta invención, y (c) implantar un injerto de órgano, tejido, o células del donante en el paciente receptor, en donde dichas células hemangioblásticas inducen tolerancia a antígenos del donante. En ciertas realizaciones, el paciente recibirá una terapia de órgano, tejido o células, en donde el órgano, tejido o células se obtienen del donante o de una fuente de células del donante. Por ejemplo, las células hemangioblásticas de un donante pueden (1) expandirse según los procedimientos descritos en la presente memoria para generar un gran número de células tolerantes del donante, y (2) expandirse y diferenciarse in vitro para obtener células o tejidos hematopoyéticos o endoteliales, que posteriormente se pueden implantar en el paciente receptor. En otras realizaciones, la terapia de órgano, tejido o células no se deriva de células hemangioblásticas del donante sino que se adapta a los hemangioblastos del donante.
Como se usa en la presente memoria, el término «compatible» se refiere a cuán similar es la tipificación del HLA entre el donante y el receptor (por ejemplo, injerto). En una realización, el término «compatible» con respecto a las células hemangioblásticas y al injerto del donante se refiere a un grado de compatibilidad con los alelos del MHC de clase I y/o MHC de clase II, de modo que no se produce el rechazo. En otra realización, el término «compatible» con respecto a los hemangioblastos y el injerto del donante se refiere a un grado de compatibilidad con los alelos del MHC de clase I y/o del MHC de clase II, de manera que el injerto del donante es tolerado por sus células hemangioblásticas compatibles del donante. En otra realización, el término «compatible» con respecto a hemangioblastos e injerto del donante se refiere a un grado de compatibilidad con los alelos del MHC de clase y/o del MHC de clase II, de manera que no se requiere inmunosupresión.
Los procedimientos descritos en esta memoria para inducir tolerancia a un antígeno alogénico o injerto alogénico se pueden usar cuando, como entre el donante y el receptor, hay un grado de incompatibilidad en los loci del MHC u otros loci, de manera que se produce el rechazo del injerto. Por consiguiente, por ejemplo, en ciertas realizaciones, puede haber una incompatibilidad de al menos un locus de MHC o al menos otro locus que media el reconocimiento y el rechazo, por ejemplo, un locus de antígeno menor. En algunas realizaciones, por ejemplo, los alelos del HLA del receptor y el donante no son compatibles y dan como resultado uno o más antígenos incompatibles. Con respecto a los loci del MHC de clase I y clase II, el donante y el receptor, por ejemplo, pueden ser compatibles con la clase I y no ser compatibles con la clase II; no ser compatibles con la clase I y ser compatibles con la clase II; no ser compatibles con la clase I y no ser compatibles con la clase II; ser compatibles con la clase I, y ser compatibles con la clase II. En cualquiera de estas combinaciones, otros loci que controlan el reconocimiento y el rechazo, por ejemplo, loci antigénicos menores, pueden ser compatibles o incompatibles. Incompatibilidad con el MHC de clase I significa incompatibilidad para uno o más loci del MHC de clase I, por ejemplo, no son compatibles en uno o más de HLA-A, HLA-B o HLA-C. Incompatibilidad con el MHC clase II significa incompatibilidad en uno o más loci del MHC de clase II, por ejemplo, no son compatibles en uno o más de un DPA, un DPB, un DQA, un DQB, un DRA o un DRB. Por ejemplo, los hemangioblastos y el injerto pueden ser compatibles con los alelos del HLA-DRB1 y DQB1 de clase II. Los hemangioblastos y el injerto pueden ser compatibles con dos o más alelos del HLA-A, B, o C de clase I (además de tener alelos DRB1 y DQB1 compatibles).
En otras realizaciones, las células tolerantes del donante son células derivadas de los hemangioblastos generados y expandidos o expandidos mediante los procedimientos descritos en esta memoria. Según esta realización, los
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hemangioblastos humanos del donante se diferencian in vitro para dar lugar a células madre hematopoyéticas del donante, y las células madre hematopoyéticas del donante se administran a continuación al paciente receptor para inducir tolerancia. En cualquiera de los procedimientos anteriores, los hemangioblastos del donante o células madre hematopoyéticas derivadas de los mismos y administrados a dicho receptor preparan al paciente receptor para el trasplante o injerto compatible (con respecto a las células tolerantes del donante) induciendo tolerancia en dicho receptor.
En otras realizaciones, el procedimiento para inducir tolerancia comprende además la etapa o etapas de crear espacio hematopoyético (para promover el injerto de hemangioblastos o células madre hematopoyéticas derivadas de los mismos). En otra realización, el procedimiento para inducir tolerancia comprende además la etapa o etapas de inhibir temporalmente el rechazo de células hemangioblásticas del donante o células madre hematopoyéticas derivadas del mismo, por ejemplo, eliminando y/o inactivando células T precursoras reactivas con el donante. Para crear espacio hematopoyético, el procedimiento puede incluir irradiación (por ejemplo, irradiación tímica selectiva, de cuerpo entero, o linfoide). Para evitar el rechazo de las células del donante, el procedimiento puede comprender además la administración de fármacos o anticuerpos (por ejemplo, inhibidores de la proliferación celular, antimetabolitos o anticuerpos anti-células T o anti-CD8 o anti-CD4), y/u otros tratamientos que promueven la supervivencia y el injerto de las células del donante y la formación de quimerismo mixto (por ejemplo, la administración de células del estroma o factores de crecimiento, citoquinas, etc. a dicho receptor u otros agentes que agotan o inactivan los anticuerpos naturales del receptor). En ciertas realizaciones, la irradiación, los anticuerpos, los fármacos y/u otros agentes administrados para crear espacio hematopoyético y/o promover la supervivencia de las células del donante en el receptor, son suficientes para inactivar los timocitos y/o las células T en el receptor. Dicha etapa de crear espacio hematopoyético y/o inhibir temporalmente el rechazo de las células del donante puede realizarse, por ejemplo, antes de la introducción de las células hemangioblásticas del donante en dicho receptor. Alternativamente, el paciente puede recibir un agente o procedimiento para bloquear, eliminar o inactivar células T simultáneamente con la administración de las células tolerantes del donante.
En ciertas realizaciones, se usa una combinación de procedimientos de creación de espacio hematopoyético e inmunosupresores. Por ejemplo, un receptor puede recibir un anticuerpo contra células T en combinación con irradiación tímica y/o irradiación de todo el cuerpo a dosis bajas. En una realización, el receptor puede recibir anticuerpos contra CD4 y contra CD8, seguido de una dosis no mieloablativa suave de irradiación corporal total (por ejemplo, una dosis que elimina una fracción de la médula ósea del receptor sin hacer que la médula ósea sea irrecuperable) e irradiación tímica selectiva o, alternativamente, una dosis adicional de anticuerpos inactivadores de células T o reactivos bloqueantes coestimuladores (por ejemplo, CTLA4-Ig y/o anticuerpo contra CD40L). Después de la irradiación, las células hemangioblásticas del donante, o las células madre hematopoyéticas derivadas de las mismas, se pueden administrar al receptor (por ejemplo, mediante inyección intravenosa). En esta realización, la irradiación de todo el cuerpo para promover el injerto de las células del donante puede reemplazarse por la administración de un gran número de hemangioblastos humanos del donante o células madre hematopoyéticas derivadas de los mismos. La obtención de dichas grandes cantidades de células humanas donantes se puede conseguir según los procedimientos descritos en esta memoria.
En otra realización, los tratamientos para reducir o inactivar las células T del receptor pueden ayudar a prevenir la inhibición del injerto o promover la supervivencia del donante administrado que tolera las células hemangioblásticas humanas. En otra realización, el procedimiento puede incluir la supresión clonal de células reactivas del donante en el paciente receptor. Por ejemplo, un paciente puede recibir una dosis moderada de irradiación de todo el cuerpo, seguido de la administración de hemangioblastos humanos del donante y bloqueo coestimulante de células T. Alternativamente, un paciente puede recibir bloqueo coestimulatorio de células T y administración de grandes cantidades de células hemangioblásticas humanas del donante sin recibir irradiación.
En otra realización, la tolerancia puede conseguirse sin acondicionamiento mieloablativo del receptor. En una realización, un receptor puede recibir hemangioblastos humanos del donante en combinación con anti-CD40L para facilitar el injerto de hemangioblastos del donante. Por ejemplo, un receptor puede recibir grandes cantidades de hemangioblastos del donante, junto con anticuerpos monoclonales contra CD40L, seguidos en unos pocos días por una dosis de CTLA4-Ig. Dicho protocolo puede eliminar las células T reactivas del donante y bloquear la interacción CD40-CD40L. Los nuevos procedimientos descritos en la presente memoria para generar y expandir hemangioblastos humanos in vitro hacen posible un protocolo de tolerancia tan suave.
Después del acondicionamiento del receptor y/o el agotamiento o bloqueo de las células T reactivas del donante, los hemangioblastos humanos generados tolerantes del donante se administran al receptor por los procedimientos de la presente invención. Los hemangioblastos humanos del donante pueden derivarse de hemangioblastos obtenidos de una fuente de tejido o célula del donante. Alternativamente, los hemangioblastos humanos del donante pueden obtenerse de una fuente diferente al donante que sea compatible con el donante.
En ciertas realizaciones, la tolerancia se induce en un paciente receptor mediante la administración de hemangioblastos humanos del donante en administraciones múltiples (por ejemplo, mediante dos, tres, cuatro o más administraciones de las células del donante). Por consiguiente, la tolerancia se puede inducir por un procedimiento que comprende múltiples administraciones de células tolerantes del donante, en donde las múltiples administraciones se dan al receptor dentro de un marco temporal de una semana o menos.
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En ciertas realizaciones, la capacidad de las células hemangioblásticas humanas para inducir tolerancia inmunológica puede evaluarse usando diferentes sistemas modelo experimentales. Por ejemplo, se ha utilizado la capacidad de establecer un sistema inmunitario humano en un ratón SCID para estudiar la respuesta inmune humana en un modelo experimental. Se ha demostrado previamente que el hígado fetal humano y el tejido del timo se pueden usar para reconstituir un sistema inmunitario humano funcional en un receptor de ratón inmunocompetente. De forma similar, la capacidad funcional de las células hemangioblásticas humanas puede evaluarse usando un sistema de modelo experimental similar. Por ejemplo, la capacidad de los hemangioblastos humanos para reemplazar el hígado fetal humano en el establecimiento de un sistema inmunitario humano funcional en el ratón puede evaluarse usando el modelo experimental descrito anteriormente. Además, en un ratón con un sistema inmunitario humano funcional (por ejemplo, donde se usa un hígado humano y tejido de timo para establecer un sistema inmunitario humano en un ratón SCID para producir un ratón hu-SCID), hemangioblastos humanos «donantes» (no compatibles con respecto al hígado fetal y al tejido tímico usado para establecer el ratón hu-SCID) se pueden administrar al ratón hu-SCID, según cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, con el fin de conseguir un quimerismo mixto. La tolerancia al antígeno del donante se puede analizar posteriormente tras la implantación de un aloinjerto compatible con los hemangioblastos del donante en estos animales.
En ciertas realizaciones, la presente descripción se refiere a combinaciones de células. Las combinaciones efectivas de células comprenden dos componentes: un primer tipo de célula para inducir tolerancia inmunológica y un segundo tipo de célula que regenera la función necesaria. Ambos tipos de células se pueden producir mediante los procedimientos de la presente invención y se pueden obtener del mismo donante. Por ejemplo, las células hemangioblásticas humanas de un donante se pueden usar como células tolerantes del donante. Las células del donante (por ejemplo, células madre embrionarias, células madre pluripotentes o células progenitoras tempranas, o hemangioblastos) obtenidas sin destrucción de un embrión humano también se pueden usar para generar, por ejemplo, células hematopoyéticas o células endoteliales (como se describe en la presente memoria), células neurales tales como oligodendrocitos, hepatocitos, cardiomiocitos o precursores de cardiomiocitos, u osteoblastos y sus progenitores. Por consiguiente, los hemangioblastos humanos del donante se pueden usar para inducir tolerancia en un receptor de manera que el receptor sea tolerante a células o tejidos derivados de dichas células hemangioblásticas del donante o a partir de dichas células madre embrionarias o pluripotentes del donante obtenidas sin destrucción de un embrión humano.
En otra realización, los dos componentes celulares de las combinaciones de células de la presente invención se pueden obtener a partir de diferentes fuentes o donantes, en donde las dos fuentes o donantes son compatibles. Por ejemplo, los hemangioblastos pueden generarse a partir de una fuente de células madre embrionarias obtenidas sin destrucción de un embrión humano, mientras que las células o tejidos de injerto pueden obtenerse de una fuente diferente de la fuente de células madre embrionarias utilizada para generar los hemangioblastos humanos. En dichas realizaciones, las dos fuentes son compatibles.
Para cualquiera de los fines terapéuticos descritos en esta memoria, se pueden suministrar hemangioblastos humanos o células hematopoyéticas derivadas del mismo para inmunotolerancia en forma de composición farmacéutica, que comprende un excipiente isotónico preparado en condiciones suficientemente estériles para la administración humana.
Hemangioblastos en terapia génica
También se describe el uso de células hemangioblásticas, células hemangioblásticas no injertables, o células hematopoyéticas o endoteliales diferenciadas a partir de las mismas, o a su vez células más diferenciadas de estas células, en terapia génica. La preparación de células hemangioblásticas de mamífero o células hemangioblásticas no injertables de la presente descripción se puede usar para administrar un gen terapéutico a un paciente que tiene una afección que es susceptible de tratamiento por el producto génico del gen terapéutico. Los hemangioblastos y las células hemangioblásticas no injertables son particularmente útiles para administrar genes terapéuticos que participan en la angiogénesis o influyen en ella (por ejemplo, VEGF para inducir la formación de colaterales en tejido isquémico), hematopoyesis (por ejemplo, eritropoyetina para inducir la producción de glóbulos rojos), función de vasos sanguíneos (por ejemplo, factores de crecimiento para inducir la proliferación de los músculos lisos vasculares para reparar el aneurisma) o la función de las células sanguíneas (por ejemplo, factores de coagulación para reducir el sangrado) o codificar las proteínas secretadas, por ejemplo, hormona de crecimiento. Los procedimientos para terapia génica son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos con el n.° 5.399.346 por Anderson y col. Una cápsula biocompatible para suministrar material genético se describe en la Publicación PCT WO 95/05452 de Baetge y col. Los procedimientos de transferencia génica en células derivadas de médula ósea también se han reportado anteriormente (véase la patente de Estados Unidos con el n.° 6.410.015 de Gordon y col.). El gen terapéutico puede ser cualquier gen que tenga utilidad clínica, tal como un gen que codifica un producto génico o proteína que está implicado en la prevención o tratamiento de enfermedades, o un gen que tiene un efecto regulatorio celular que está implicado en la prevención o el tratamiento de enfermedades. Los productos génicos pueden sustituir un producto génico, una proteína o un efecto regulador de células faltante o defectuoso en el paciente, permitiendo así la prevención o el tratamiento de una enfermedad o afección en el paciente.
Por consiguiente, la presente descripción proporciona además un procedimiento para administrar un gen terapéutico a un paciente que tiene una afección susceptible de terapia génica que comprende, seleccionar al paciente que lo
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necesite, modificar la preparación de hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables para que las células porten un gen terapéutico, y administrar la preparación modificada al paciente. La preparación puede modificarse mediante técnicas que son conocidas en general en la técnica. La modificación puede implicar la inserción de un segmento de aDn o ARN que codifica un producto génico en las células hemangioblásticas de mamífero, en donde el gen potencia los efectos terapéuticos de las células hemangioblásticas o las células hemangioblásticas no injertables. Los genes se insertan de tal manera que la célula hemangioblástica modificada producirá el producto génico terapéutico o tendrá el efecto terapéutico deseado en el cuerpo del paciente. En una realización, los hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables se preparan a partir de una fuente celular originalmente adquirida del paciente, tal como médula ósea. El gen puede insertarse en las células hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables usando cualquier procedimiento de transferencia génica, por ejemplo, incorporación de ADN desnudo, inyección directa de ADN, captación de ADN mediada por receptor, transfección mediada por retrovirus, transfección mediada por virus, transfección no viral, transfección mediada por lípidos, electrotransferencia, electroporación, transfección mediada por fosfato de calcio, microinyección o proteoliposomas, todos ellos que pueden implicar el uso de vectores de terapia génica. Se pueden usar otros vectores además de vectores retrovirales, incluidos los derivados de virus de ADN y otros virus de ARN. Como debería ser evidente cuando se usa un virus de ARN, dicho virus incluye ARN que codifica el agente deseado de modo que las células hemangioblásticas que se transfectan con dicho virus de ARN se proporcionan, por lo tanto, con ADN que codifica un producto génico terapéutico. Los procedimientos para llevar a cabo la introducción de genes en las células son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, id.).
También se describe una preparación purificada de células hemangioblásticas humanas o células hemangioblásticas no injertables, en donde las células se han modificado para portar un gen terapéutico, que se pueden proporcionar en envases o paquetes comerciales que comprenden además instrucciones para el uso de la preparación en terapia génica para prevenir y/o tratar una enfermedad mediante la administración del gen terapéutico. Por consiguiente, la presente descripción proporciona además un paquete comercial (es decir, un kit) que comprende una preparación de células hemangioblásticas de mamífero o células hemangioblásticas no injertables de la invención, en donde la preparación se ha modificado para que las células de la preparación porten un gen terapéutico, e instrucciones para tratar a un paciente que tiene una afección susceptible de tratamiento con terapia génica.
Otras aplicaciones y procedimientos comerciales
Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren a la expansión de hemangioblastos humanos y células hemangioblásticas no injertables hasta alcanzar cantidades comerciales. En realizaciones particulares, los hemangioblastos humanos y las células hemangioblásticas no injertables se producen a gran escala, se almacenan si es necesario y se suministran a hospitales, médicos u otras instalaciones sanitarias. Una vez que un paciente presenta una indicación tal como, por ejemplo, isquemia o lesión vascular, o necesita reconstitución hematopoyética, pueden pedirse y proporcionarse oportunamente hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables. Por consiguiente, la presente descripción se refiere a procedimientos para generar y expandir hemangioblastos humanos y células hemangioblásticas no injertables para obtener células a escala comercial, preparaciones celulares que comprenden hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables derivadas de dichos procedimientos, así como procedimientos para proporcionar (es decir, producir, opcionalmente almacenar y vender) hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables a hospitales y médicos. Además, las células del linaje hemangioblástico o células del linaje hemangioblástico no injertables pueden producirse in vitro y opcionalmente almacenarse y venderse a hospitales y médicos.
Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente descripción se refieren a procedimientos de producción, almacenamiento y distribución de hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables expandidas por los procedimientos descritos en esta memoria. Después de la generación y expansión in vitro de hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables, los hemangioblastos humanos o las células hemangioblásticas no injertables pueden recogerse, purificarse y almacenarse opcionalmente antes del tratamiento de un paciente. Alternativamente, en situaciones en donde se desean células del linaje hemangioblástico o hemangioblástico no injertable, los hemangioblastos humanos o las células hemangioblásticas no injertables pueden diferenciarse adicionalmente in vitro antes del tratamiento de un paciente. Por tanto, en realizaciones particulares, la presente descripción proporciona procedimientos para suministrar hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables a hospitales, centros de salud y médicos, por lo que los hemangioblastos, células hemangioblásticas no injertables, células del linaje hemangioblástico o células del linaje hemangioblástico no injertables producidos mediante los procedimientos descritos en la presente memoria se almacenan, se solicitan a demanda por un hospital, centro de salud o médico y se administran a un paciente que necesita hemangioblastos, células hemangioblásticas no injertables, linaje hemangioblástico o terapia de linaje hemangioblástico no injertable. En realizaciones alternativas, un hospital, centro sanitario o médico ordena hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables basadas en datos específicos del paciente, hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables que se producen según las especificaciones del paciente y posteriormente se suministran al hospital o al médico que realiza el pedido.
También se describe una biblioteca de hemangioblastos, células hemangioblásticas no injertables, células del linaje hemangioblástico y/o células del linaje hemangioblástico no injertables que pueden proporcionar células compatibles a posibles pacientes receptores. Por consiguiente, en una realización, la descripción proporciona un procedimiento
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para llevar a cabo un negocio farmacéutico, que comprende la etapa de proporcionar preparaciones de hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables que son homocigóticas para al menos un antígeno de histocompatibilidad, en donde las células se seleccionan de un banco de dichas células que comprende una biblioteca de hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables que pueden expandirse mediante los procedimientos descritos en la presente memoria, en donde cada hemangioblasto o preparación de células hemangioblásticas no injertables es hemicigótica u homocigótica para al menos un alelo del MHC presente en la población humana, y en donde dicho banco de células hemangioblásticas o células hemangioblásticas no injertables comprende células que son hemicigóticas u homocigóticas para un grupo diferente de alelos del MHC con relación a los otros miembros en el banco de células. Como se ha mencionado anteriormente, el direccionamiento de genes o la pérdida de heterocigosidad se pueden usar para generar las células madre del alelo del MHC hemicigóticas u homocigotas utilizadas para derivar los hemangioblastos. En una realización, después de seleccionar una preparación de hemangioblastos o de células hemangioblásticas no injertables para que sea adecuada para un paciente, a continuación se expande para alcanzar cantidades apropiadas para el tratamiento del paciente. Dichos procedimientos pueden comprender además la etapa de diferenciar los hemangioblastos o las células hemangioblásticas no injertables para obtener células hematopoyéticas y/o endoteliales antes de administrar las células al receptor. Los procedimientos para llevar a cabo un negocio farmacéutico también pueden comprender establecer un sistema de distribución para distribuir la preparación para la venta o pueden incluir el establecimiento de un grupo de ventas para comercializar la preparación farmacéutica.
También se describe el uso de hemangioblastos humanos y células hemangioblásticas no injertables de la presente invención como herramienta de investigación en entornos como una compañía farmacéutica, química o de biotecnología, un hospital o una institución académica o de investigación. Por ejemplo, los hemangioblastos humanos, las células hemangioblásticas no injertables y las células derivadas de los mismos (por ejemplo, células endoteliales) se pueden usar para seleccionar y evaluar factores angiogénicos y antiangiogénicos o se pueden usar en ingeniería de tejidos. Además, debido a que los hemangioblastos y las células hemangioblásticas no injertables obtenidos y expandidos por los procedimientos descritos en la presente memoria tienen el doble potencial para diferenciarse en células hematopoyéticas y endoteliales, se pueden usar en biología celular y molecular de la hematopoyesis y la vasculogénesis. Además, los hemangioblastos humanos y las células hemangioblásticas no injertables se pueden usar para el descubrimiento de nuevos marcadores de estas células, genes, factores de crecimiento y factores de diferenciación que desempeñan un papel en la hematopoyesis y la vasculogénesis, o para el descubrimiento de fármacos y el desarrollo de ensayos de cribado de agentes potencialmente tóxicos o protectores.
En otras realizaciones de la presente descripción, las células hemangioblásticas y de linaje hemangioblástico no injertable (tales como células sanguíneas) también se usan comercialmente. Las células hematopoyéticas se pueden utilizar para generar productos sanguíneos, tales como hemoglobina y factores de crecimiento, que se pueden utilizar para aplicaciones clínicas y de investigación.
La presente descripción también incluye procedimientos para obtener células ES humanas de un paciente sin destrucción de un embrión humano y a continuación generar y expandir hemangioblastos humanos o células hemangioblásticas no injertables derivadas de las células ES. Estos hemangioblastos y células hemangioblásticas no injertables pueden almacenarse. Además, estos hemangioblastos y células hemangioblásticas no injertables se pueden usar para tratar al paciente del que se obtuvieron las células ES o un familiar de ese paciente.
Como los procedimientos y aplicaciones descritos anteriormente se refieren a tratamientos, preparaciones farmacéuticas y al almacenamiento de hemangioblastos o células hemangioblásticas no injertables, la presente descripción también se refiere a soluciones de hemangioblastos y células hemangioblásticas no injertables que son adecuadas para dichas aplicaciones. La presente descripción se refiere por tanto a soluciones de hemangioblastos y células hemangioblásticas no injertables que son adecuadas para su inyección en un paciente. Dichas soluciones pueden comprender células formuladas en un líquido fisiológicamente aceptable (por ejemplo, solución salina normal, solución salina tamponada, o una solución salina equilibrada). Una solución puede opcionalmente comprender factores que facilitan la diferenciación celular in vivo. Se puede administrar una solución a un paciente mediante administración vascular (por ejemplo, infusión intravenosa), según los procedimientos aceptados en la técnica utilizados para el trasplante de médula ósea. En algunas realizaciones, la solución celular se administra en una vena periférica, una vena periférica superficial, o alternativamente, mediante administración venosa central (por ejemplo, a través de un catéter venoso central). El número de células en la solución puede ser de al menos aproximadamente 102 y menor que aproximadamente 109 células. En otras realizaciones, el número de células en solución puede variar de aproximadamente 101, 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 105, 106, 107 o 108 a aproximadamente 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 105, 106, 107, 108 o 109, en donde los límites superior e inferior se seleccionan independientemente, excepto por que el límite inferior es siempre menor que el límite superior. Además, las células pueden administrarse en una única o en múltiples administraciones.
Generación de hemangioblastos de iPSC humanas
Basado en el procedimiento para generar de forma eficiente y reproducible grandes cantidades de hemangioblastos a partir de múltiples líneas hESC obtenidas sin destrucción de un embrión humano descrito en la presente memoria (ver también Lu y col. Nat Methods 2007; 4: 501-509; Lu y col. Regen Med 2008); 3: 693-704), los inventores
utilizaron además la plataforma de hemangioblastos para diferenciar las hESC obtenidas sin destrucción de un embrión humano a través de progenitores hemangioblásticos en células eritroides a gran escala (aproximadamente 1010 a 1011 células/hESC en placa de seis pocillos), que es más de mil veces más eficiente de lo reportado anteriormente.
5 Poco se ha informado sobre la capacidad de las iPSC para someterse a la diferenciación dirigida, especialmente, hacia hemangioblastos. Un informe reciente de Choi y col. (STEM CELLS 2009; 27 (3): 559-567) describe estudios con iPSC humanas que utilizan un sistema de cultivo basado en el alimentador OP9 que produjo diferenciación hematopoyética y endotelial, demostrando el potencial de las iPSC humanas. Del mismo modo, Zhang y col. (Circ Res 2009; 104: e30-e41) informa la derivación de cardiomiocitos funcionales de iPSC humanas, aunque con baja 10 eficiencia en comparación con las hESC, utilizando el procedimiento de EB. La generación eficiente de hemangioblastos de iPSC humanas se describe en esta memoria. Los inventores describen las condiciones para la generación eficiente de hemangioblastos a partir de iPSC humanas, usando sus experiencias con el sistema hESC.
Ejemplos de referencia
Los siguientes ejemplos de referencia se proporcionan para ilustrar mejor la solicitud.
15 Ejemplo de referencia 1
Materiales y procedimientos Cultivo de hESC
Se usaron las líneas hESC WA01 (H1), HUES3 y MA01 y se mantuvieron tal como se ha descrito anteriormente (6). Brevemente, se cultivaron las hESC en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) tratados con mitomicina C en 20 medio completo de hESC. Las hESC se pasaron cada 3-5 días antes de alcanzar la confluencia usando el 0,05 % de tripsina-EDTA 0,53 mM. Para un cultivo sin alimentador, las células se cultivaron entonces en matriz de Matrigel cualificada para hESC (BD Biosciences) en medio TeSR™ 1 modificado completo (m TeSR™ 1) (Stem Cell Technologies, Inc), que se basa en la formulación de Ludwig y col. (7,8). Las células se mantuvieron según las instrucciones sugeridas por el fabricante. Brevemente, las células se pasaron cuando alcanzaron aproximadamente 25 el 90 % de confluencia, normalmente cada 5-7 días con relaciones de división que varían de 1:3 a 1:6. Las células se trataron con dispasa (1 mg/ml BD, Biosciences) y se incubaron durante 3-5 minutos a 37 °C para comenzar a desalojar las colonias. Las colonias se lavaron con DMEM/F12 (Mediatech) para eliminar la solución de dispasa. Para extraer las colonias del plástico de cultivo tisular, los pocillos se recubrieron con DMEM/F12 y se rasparon suavemente hasta que todas las colonias se habían desplazado. Las colonias se transfirieron a tubos cónicos, los 30 pocillos se lavaron con DMEM/F12 y las células se combinaron para recoger lo que quedaba en los pocillos. Se centrifugaron durante 5 minutos a 1000 rpm. Los sedimentos celulares se resuspendieron en medio mTeSR™ 1 y se transfirieron a placas de 6 pocillos recubiertos con Matrigel, en 2 ml de medio mTeSR™ 1 por pocillo. Las células se mantuvieron a 37 °C bajo el 5 % de CO2 y el medio mTeSR™ 1 se repuso a diario.
Análisis citoquímico por inmunofluorescencia
35 Las colonias de hESC sin alimentador se sometieron a ensayo para la expresión de Oct-4 y Tra-1-60 usando inmunofluorescencia. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % (PFA), se lavaron con PBS y se bloquearon con suero de cabra normal al 5% (Vector Labs), BSA al 1 % (Sigma) y Triton-X-100 al 0,2% (Sigma) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron con anticuerpos primarios contra Oct-4 (Santa Cruz Biotechnology) o Tra-1-60 (Millipore/Chemicon), en solución de bloqueo, durante la noche a 4 °C, se lavaron 40 con PBS y se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado a biotina (Jackson Immuno Research Labs), en solución de bloqueo, durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de un lavado adicional, las células se incubaron con estreptavidina conjugada Alexa 954 (Invitrogen/Sondas moleculares), durante 15 minutos a temperatura ambiente seguido de un lavado final prolongado en PBS. Las células se montaron en Prolong Gold con DAPI (Invitrogen/Molecular Probes).
45 Diferenciación de los hemangioblastos de las hESC
Para inducir las hESC cultivadas en MEF en hemangioblastos, se disociaron el 80-90 % de las placas confluentes mediante digestión con tripsina al 0,05 %. Para diferenciar las hESC sin alimentador en hemangioblastos, el 85-90 % de células confluentes se desalojaron de la matriz de Matrigel usando el protocolo descrito anteriormente. Las células en las dos condiciones se sembraron en placas Ultra-Low (Corning, NY) en medio Stemline II (Sigma) con 50 diferentes dosis de BMP-4, VEGF y bFGF como se ha descrito previamente (2). La mitad del medio se reemplazó después de 48 horas con medio nuevo que contiene las mismas citoquinas o el mismo medio más SCF, ligando FLT3 (FL) y Tpo (20 ng/ml, sistema R&D) que dependen de diferentes condiciones de experimentación. Después de
3,5 días, se recogieron los EB y se disociaron con tripsina al 0,05 %. Las suspensiones monocelulares se obtuvieron haciendo pasar las células a través de una aguja de calibre 22 y a través de un filtro de células de 40 pm, se 55 recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 50-100 pl de medio Stemline II. Las células (0,75 x 105 a 1 x 105) se mezclaron con 2,5 ml de medio de crecimiento de colonias de blastos (BGM) como se ha descrito previamente (2), se sembraron en placas Ultra-Low y se incubaron a 37 °C. Las colonias de blastos derivadas tanto
de MEF como de las hESC sin alimentador se observaron 3-4 días después de la siembra en placa, seguido poco después por una expansión rápida. Las células blásticas (BC) se definen en este estudio como células obtenidas a partir de colonias de blastos del día 6.
Enriquecimiento de precursores de hemangioblastos
5 Los marcadores de superficie del precursor de BC potenciales CD31, CD34, KDR, CXCR-4, CD133, ACE, PCLP1, PDGFRa, Tie-2, Nrp-2, Tpo-R y bFGFR-1 se seleccionaron para el enriquecimiento celular. Todos los anticuerpos son del isotipo de IgG monoclonal de ratón y son: CD31 y CD34 (Dako Cytomation), KDR y Tpo-R (R&D Systems, Inc.), CXCR-4 (Abeam Inc.), Nrp-2, ACE, PCLP1 y PDGFRa (Santa Cruz Biotechnology), Tie-2 (Cell Signaling Technology, Inc.), bFGFR-1 (Zymed Laboratories), y CD133 (Miltenyi Biotech). El conjunto de cóctel de anticuerpos 10 fue preparado por el kit de selección de EasySep «do-It-Yourself» (Stem Cell Technologies). Las suspensiones celulares derivadas de EB se centrifugaron a 1200 rpm durante 4 minutos y se resuspendieron en PBS con el 2 % de tampón de FBS/EDTA 1 mM a una concentración de 1-2 x 106 células/100 pl. Las células se mezclaron con diferentes cócteles de anticuerpos durante 15 minutos a temperatura ambiente y a continuación se incubaron con EasySep Nanoparticle a temperatura ambiente durante 10 minutos adicionales. Las células seleccionadas positivas 15 se separaron después de verter el sobrenadante momento en donde se pusieron tubos con células en un soporte magnético. Las células positivas seleccionadas con anticuerpo (1 x 105) se mezclaron con 2,5 ml de BGM y se cultivaron en placa para el desarrollo de la colonia de blastos.
RT-PCR en tiempo real y análisis de datos
El ARN total se extrajo de EB o de hESC no diferenciadas usando RNeasy Micro Kits (Qiagen) según el protocolo 20 del fabricante. Los ADNc se sintetizaron utilizando el kit de síntesis de aDnc BD SmArT PCR (BD Biosciences) según las instrucciones del manual. La RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR) se realizó usando FullVelocity SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene). Las reacciones se realizaron por triplicado con los siguientes componentes por reacción: 50 ng de molde, 0,2 micromoles de cada cebador y mezcla maestra 1X. Las secuencias específicas de genes de los cebadores usados se enumeran en la Tabla 1, y la temperatura de hibridación para todos los 25 cebadores es de 55 °C. La amplificación y la obtención de datos en tiempo real se realizaron en un Stratagene Mx3005P con el software MxPro versión 3.0. Se usaron las siguientes condiciones de ciclos: un ciclo de 95 °C durante diez minutos seguido de cuarenta ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto, 72 °C durante 30 segundos, seguido de un ciclo final de 95 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 30 segundos y 95 °C durante 30 segundos. La cuantificación relativa de cada gen diana se realizó en base a la normalización del umbral 30 del ciclo (Ct) a p-actina (ACt) usando el procedimiento AACt (9). Análisis de datos relativos de expresión génica usando PCR cuantitativa en tiempo real y el procedimiento 2('AACT) (9), en donde el ACt de cada gen examinado en las muestras experimentales se comparó con el ACt promedio de cada gen en una muestra de control de hESC no diferenciada (AACt). A continuación, el cambio en la expresión se calculó como 2'AAct Los datos de diferencia negativa se convirtieron a un valor lineal de «cambio en la expresión» con la siguiente fórmula:
35 Cambio lineal en la expresión = - (1/cambio en la expresión).
Análisis estadístico
Todos los datos se presentaron como media ± SEM. Las comparaciones intergrupales se realizaron mediante la prueba f de Student no pareado utilizando el software GraphPad Prism, versión 4 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). p <0,05 fue interpretado como estadísticamente significativo.
40 Ejemplo de referencia 2
Se requiere BMP-4 y VEGF para el desarrollo de hemangioblastos
Un sistema sin suero para inducir la diferenciación de hESC hacia los linajes hemangioblástico y hematopoyético se ha descrito previamente (2,10). Aunque se usaron BMP-4, VEGF y un cóctel de citoquinas hematopoyéticas tempranas, no se examinaron los requerimientos absolutos y las concentraciones óptimas de los factores 45 individuales. Con el fin de reducir el gasto y el esfuerzo necesarios para generar hemangioblastos para futuras investigaciones y aplicaciones clínicas, los inventores examinaron específicamente los requisitos mínimos y los efectos de VEGF, BMP y tres citoquinas hematopoyéticas tempranas (TPO, FL y SCF) en el desarrollo eficiente de las colonias de blastos a partir de las hESC. Se comprobó que BMP-4 es absolutamente necesario para el desarrollo de colonias de blastos en condiciones sin suero. No se obtuvieron colonias de blastos sin el suplemento de BPM-4 50 en el medio durante la formación de EB y se observó un claro efecto dosis-respuesta de BMP-4 para la formación de colonias de blastos a partir de las hESC (Figura 1A). Además, BMP-4 no podía sustituirse por otros miembros de la familia BMP. BMP-2 y BMP-7 solos, o una combinación de los dos, no pudieron promover el desarrollo de BC. Además, la suplementación de BMP-2 y BMP-7 en medio EB que contiene BMP-4 no mostró ningún efecto (10 ng/ml) o inhibió (20 ng/ml) el desarrollo de la colonia de blastos (Figura 1B). Sin embargo, la adición de BMP-4 y 55 BMP-2 y/o BMP-7 en medio de crecimiento de colonias de blastos (BGM) no tuvo ningún efecto sobre el desarrollo de colonias de blastos, lo que sugiere que BMP-4 solo promueve la fase de especificación mesodérmica/hemangioblástica, pero no el crecimiento y la expansión de BC. De forma similar, no se desarrollaron colonias de blastos cuando se eliminó VEGF165 del medio de formación de EB. Se descubrió que VEGF165 promueve
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el desarrollo de colonias de blastos de una manera dependiente de la dosis (Figura 1C). VEGF121, una isoforma de miembros del VEGF que solo se puede unir a los receptores KDR y FLT1 (11), se puede usar como sustituto de VEGF165 para promover el desarrollo de colonias de blastos a partir de hESC; se desarrollaron cantidades casi idénticas de colonias de blastos (68 ± 5 frente a 67 ± 12) cuando se añadieron 50 ng/ml de VEGF165 o VEGF121, que es la dosis óptima en condiciones sin suero, en medio EB. No obstante, en contraste con BMP-4, no se obtuvieron colonias de blastos si VEGF estaba ausente en BGM, lo que demuestra que VEGF juega un papel crítico tanto en la fase temprana de especificación mesodérmica/hemangioblástica y en el crecimiento y expansión de BC.
En el trabajo original de los inventores*2*, se añadieron TPO, FL y SCF 48 horas después de sembrar las hESC en medio EB en un esfuerzo por promover adicionalmente el crecimiento y la expansión del progenitor hematopoyético temprano. A continuación se examinó si TPO, FL y SCF desempeñaban algún papel en la especificación de las hESC hacia el linaje mesodérmico/hemangioblástico. Se formaron EB cultivando en placa las hESC en medio Stemline II con 50 ng/ml de BMP-4 y VEGF, y se dividieron en dos pocillos después de 48 horas: a un pocillo se le añadieron 20 ng/ml de TPO, FL y sCf, al otro pocillo no se le añadió ningún factor adicional, y los EB se incubaron durante otras 36 horas. Entonces se recogieron los EB y se obtuvo una suspensión de células individuales y se sembró en placas para la formación de colonias de blastos. Nuestros resultados muestran que el suplemento de TPO, FL y SCF durante la formación de EB no tiene ningún efecto en el desarrollo de colonias de blastos, 242 ± 16 frente a 287 ± 33 colonias de blastos desarrolladas por 1 x 105 células derivadas de EB tratados con y sin TPO, FL y SCF, respectivamente.
Ejemplo de referencia 3
bFGF promueve el crecimiento, pero no el compromiso, de hemangioblastos a partir de hESC
Estudios previos han demostrado que la suplementación de bFGF durante la diferenciación temprana promueve el desarrollo hematopoyético de ESC murinas y humanas (1213145). Por lo tanto, investigamos si la adición de bFGF durante la etapa de diferenciación de EB mejoraría la formación de colonia de blastos a partir de las hESC. La adición de bFGF durante la formación de EB no tuvo ningún efecto sobre el desarrollo de colonias de blastos y, de hecho, a una dosis más alta (40 ng/ml) inhibió la formación de colonias de blastos a partir de múltiples líneas de hESC (Figura 2A y Figura 3). Por el contrario, la adición de bFGF en BGM mejoró significativamente el desarrollo de las colonias de blastos (Figura 2A, Figura 3). Tanto el número de colonias de blastos (p <0,001) como el número total de BC aumentaron significativamente en comparación con BGM sin la suplementación de bFGF. Con bFGF a la dosis óptima (20 ng/ml) en BGM, las colonias de blastos son más grandes y más sanas, y de forma consistente cosechamos aproximadamente 1 x 108 BC de una placa de seis pocillos de hESC WA01 de alta calidad (aproximadamente 1,2 x 107 células) después 6 días de crecimiento, que es 8 ± 1 veces más alto que lo obtenido de BGM sin la suplementación de bFGF.
Para investigar los potenciales de diferenciación de linaje de BC generadas con y sin suplementación de bFGF, se cultivaron en placa números iguales de BC agrupadas para la diferenciación de linaje hematopoyético y endotelial como se ha descrito previamente*2*. Para la formación de CFU hematopoyéticas, se formaron 129 ± 9 y 86 ± 22 CFU/104 BC a partir de BC derivadas de BGM suplementado con y sin bFGF (20 ng/ml), respectivamente. Además, no se observaron diferencias para el desarrollo de diferentes CFU (CFU-mix, CFU-G, CFU-M y CFU-E) entre los dos grupos (datos no mostrados). Para la diferenciación del linaje endotelial, más BC (62 ± 3 %) de BGM con bFGF (20 ng/ml) se diferenciaron en células endoteliales que las Bc (55 ± 3 %) derivadas de BGM sin suplemento de bFGF. Las células endoteliales de ambas fuentes formaron estructuras parecidas a vasos capilares de manera eficiente después del recubrimiento en Matrigel (Figuras 2B y 2C). Estos resultados sugieren que bFGF promueve el crecimiento de BC, pero no causa una diferenciación preferencial del linaje.
Ejemplo de referencia 4
Generación robusta de hemangioblastos a partir de hESC mantenidas sin células alimentadoras
Se ha informado sobre que las hESC mantenidas en alimentadores MEF contienen el ácido siálico y ácido N- glucolilneuramínico no humano (Neu5Gc) (15,7,8), y que las fuentes animales de Neu5Gc pueden causar una posible reacción inmunogénica con el complemento humano. El cultivo de hESC en capas alimentadoras MEF previene la eliminación completa de Neu5Gc animal, y plantea inquietudes por las posibles aplicaciones clínicas de los hemangioblastos generados a partir de las líneas de hESC mantenidas en estas condiciones. Por lo tanto, hemos tomado medidas para determinar si se pueden generar hemangioblastos a partir de hESC mantenidas sin alimentadores MEF. Tres líneas de hESC se pasaron con dispasa sobre placas recubiertas con matriz de Matrigel cualificada para hESC, y se mantuvieron en medio mTeSR como se describe en «Materiales y procedimientos». Su estado indiferenciado se confirmó con tinción de inmunofluorescencia para la expresión de los antígenos Oct-4 y Tra-1-60 y la morfología de las colonias (Figura 4A-4H). Estas células se recogieron y se utilizaron para el desarrollo de BC usando las condiciones optimizadas descritas anteriormente. Curiosamente, se observó un número significativamente mayor de BC con las hESC sin alimentador en comparación con las hESC cultivadas en alimentadores MEF cuando se cultivaron en placa números idénticos de células EB (Figura 4I, p <0,05). Estos resultados se observaron para las tres líneas de hESC probadas WA01, MA01 y HUES-3 (datos no mostrados).
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Ejemplo de referencia 5
Mecanismo que subyace a los efectos de BMP-4 y VEGF sobre el desarrollo de hemangioblastos
Para diseccionar el mecanismo molecular que subyace a los efectos de BMP-4 y VEGF sobre el desarrollo de hemangioblastos a partir de hESC, los inventores compararon la expresión de genes asociados con el desarrollo de hemangioblastos en EB de 3,5 días de edad que se formaron en medio Stemline II, tanto con como sin cada factor, así como con una combinación de BMP-4 y VEGF. La expresión génica se analizó mediante RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR) y se comparó con sus niveles en las hESC no diferenciadas. Los EB formados sin ningún factor expresó niveles más altos de OCT-4, un marcador de las hESC, que las hESC no diferenciadas. La suplementación de VEGF en medio EB dio lugar a una regulación a la baja moderada de la expresión de OCT-4; mientras que la adición de BMP-4 o BMP-4 más VEGF dio como resultado una disminución significativa en la expresión de oCT-4 (p <0,0005, Figura 5). No hubo efecto aditivo de BMP-4 y VEGF en la expresión de OCT-4. La expresión del gen T-brachyury, el marcador más temprano expresado en células de mesodermo, se regularon negativamente en todas las muestras excepto en EB derivados de cultivos que contienen tanto BMP-4 como VEGF (este último muestra un aumento significativo en su expresión (p <0,0005). Se observaron patrones de expresión para CD31 y LMO2, los niveles de expresión significativamente aumentados solo se detectaron en EB expuestos a una combinación de BMP-4 y VEGF (p <0,0005). Se ha demostrado que KDR, uno de los receptores de VEGF más estudiados, se expresa en todas las líneas hESC (4,5); su expresión se redujo drásticamente en EB derivados de medios sin adición de factor exógeno, y con suplementación de BMP-4 o VEGF solo. No obstante, se observó un aumento moderado pero significativo en la expresión de KDR en EB formados en presencia de BMP-4 y VEGF (p <0,002), una condición que promovió el desarrollo eficiente de hemangioblastos a partir de las hESC. Sorprendentemente, en contraste con un informe reciente (14), se detectó disminuciones sustanciales en la expresión de genes MixL y SCL/TAL-1 en EB formados en todas las condiciones. Una posible explicación es que el crecimiento en diferentes medios sin suero provocó un patrón de expresión diferente en estos genes. Sin embargo, estos resultados sugieren que el compromiso y desarrollo de mesodermo/hemangioblasto a partir de las hESC requiere BMP-4 y VEGF, consistentes con los resultados del desarrollo de la colonia de blastos (Figura 1).
Ejemplo de referencia 6
Identificación de marcadores de superficie para progenitores de células blásticas
En nuestro procedimiento original (2), se generaron BC mediante un nuevo cultivo en placa de las células EB a los
3,5 días en el 1 % de metilcelulosa suplementada con factores definidos. Esta estrategia es importante cuando se identifican BC que poseen el potencial de formar células hematopoyéticas y endoteliales, y también es reproducible cuando se generan BC a partir de hESC. Sin embargo, este enfoque utiliza placas en incubadoras de cultivo tisular convencionales y, por lo tanto, no se puede adaptar a biorreactores giratorios a mayor escala. Esta limitación se debe principalmente al hecho de que las células procedentes de EB del día 3,5 son heterogéneas e incluyen hESC no diferenciadas (solo una parte de las células son progenitores de BC). El nuevo cultivo en placa de esta población heterogénea en cultivo líquido por tanto daría lugar al crecimiento de todas las células, incluida la formación de EB secundarias a partir de las hESC no diferenciadas, excluyendo su posible uso en aplicaciones clínicas. No obstante, si se puede identificar el marcador o marcadores para el progenitor de BC, el progenitor purificado puede sembrarse en un cultivo líquido adaptado con un biorreactor giratorio para una producción a mayor escala de BC. Por lo tanto, seleccionamos 12 moléculas de superficie celular que están asociadas al desarrollo de derivados de mesodermo. Los anticuerpos correspondientes se usaron para enriquecer las células procedentes de EB del día 3,5 y las células enriquecidas se analizaron para determinar la capacidad de formación de colonias de blastos. Como se muestra en la Figura 6, las células KDR+ procedentes de EB del día 3,5 generaron tres veces más colonias de blastos que las células control no fraccionadas (p <0,01), lo que es consistente con estudios previos (5). Aunque también encontramos un aumento moderado en las colonias de blastos (“1,5 veces) después de cultivar poblaciones enriquecidas en CD31+ y CD34+, el aumento no alcanzó significación estadística. Todas las demás poblaciones enriquecidas produjeron un número igual o menor de colonias de blastos en comparación con las células control no fraccionadas, lo que indica que el progenitor de BC no expresa estas moléculas. Las células no unidas (que fluyen a través) de todos los anticuerpos analizados también formaron números similares de colonias de blastos a las células no fraccionadas, sugiriendo que incluso las células KDR+, CD34+ y CD31+ representan una porción muy limitada de las células que son capaces de formar colonias de blastos.
Tabla 1. Secuencias de cebadores específicos de gen utilizados en la qRT-PCR
Gen
Cebador directo, 5'-3' SEQ ID NO Cebador inverso, 5'-3' SEQ ID NO Ref.
OCT-4
GAAGGTATTCAGCCAAACGC 16 GTTACAGAACCACACTCGGA 17 ND
BRACH
TGCTTCCCTGAGACCCAGTT 18 GATCACTTCTTTCCTTTGCATCAAG 19 (33)
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MixL1
CCGAGTCCAGGATCCAGGTA 20 CTCTGACGCCGAGACTTGG 21 (33)
KDR/Flk1
CCAGCCAAGCTGTCTCAGT 22 CTGCATGTCAGGTTGCAAAG 23 (4)
CD31
GAGTCCTGCTGACCCTTCTG 24 ATTTTGCACCGTCCAGTCC 25 (4)
Scl/TAL1
ATGAGATGGAGATTACTGATG 26 GCCCCGTTCACATTCTGCT 27 (4)
LMO2
AACTGGGCCGGAAGCTCT 28 CTTGAAACATTCCAGGTGATACA 29 (4)
GAPDH
CGATGCTGGCGCTGAGTAC 30 CCACCACTGACACGTTGGC 31 ND
p-Actina
GCGGGAAATCGTGCGTGACA 32 GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCG 33 ND
Ejemplo de referencia 7
Generación de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas a partir de células ES humanas
Cultivo de células ES humanas. Las líneas celulares hES utilizadas en este estudio se han descrito anteriormente como HI y H9 (registradas en el NIH como WA01 y WA09) y cuatro líneas (MA01, MA03, MA40 y MA09) derivadas de Advanced Cell Technology. Las células ES humanas no diferenciadas se cultivaron en células de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) inactivadas (tratadas con mitomicina C) en medios hES completos hasta que alcanzaron el 80 % de confluencia (Klimanskaya y McMahon; Approaches of derivation and maintenance of human ES cells: Detailed procedures and alternatives, en Handbook of Stem Cells. Volumen 1: Embryonic Stem Cells, ed. Lanza, R. y col. (Elsevier/Academic Press, San Diego, 2004). A continuación, las células hES no diferenciadas se disociaron con el 0,05 % de tripsina-EDTA 0,53 mM (Invitrogen) durante 2-5 minutos y se recogieron por centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos.
Formación de EB. Para inducir la formación del precursor de hemangioblastos (mesodermo), se sembraron células hES (2 a 5 x 105 células/ml) en placas de fijación ultrabajas (Corning) en medio Stemline sin suero (por ejemplo, Stemline I o II, Sigma™) con la adición de BMP-4 y VEGF165 (50 ng/ml, R&D Systems) y se cultivaron en CO2 al 5 %. Aproximadamente 48 horas más tarde, el medio EB se repone y se suplementa con un cóctel de factores de crecimiento hematopoyético/endotelial temprano. Por ejemplo, la mitad de los medios se eliminaron y se añadieron nuevos medios con las mismas concentraciones finales de BMP-4 y VEGF, más SCF, TPO y ligando FLT3 (20 ng/ml, R&D Systems). La proteína de fusión del dominio de proteína de transducción (tPTD)-HoxB4 triple (1,5 |jg/ml) se añadió al medio de cultivo entre 48-72 horas para expandir el hemangioblasto y su precursor.
Expansión de hemangioblastos. Después de 3,5-5 días, se recogieron los EB y se disociaron con tripsina al 0,05 %- EDTA 0,53 mM (Invitrogen) durante 2-5 minutos, y se preparó una suspensión de células individuales pasando 3-5 veces a través de una aguja 22G. Las células se recogieron por centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos y se contaron. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 50-200 jl de medio Stemline sin suero. Para expandir los hemangioblastos, las suspensiones de células individuales de EB derivados de la diferenciación de 2 a 5 x 105 células hES se mezclaron con 2 ml de medio de expansión BL-CFC/hemangioblastos (BGM) que contenía metilcelulosa al 1,0 % en MDM de Iscove, albúmina de suero bovino al 1-2 %, 2-mercaptoetanol 0,1 mM y un cóctel de factores de crecimiento. Por ejemplo, 10 jg/ml de rh-lnsulina, 200 jg/ml de transferrina humana saturada de hierro, 20 ng/ml de rh-GM-CSF, 20 ng/ml de rh-IL-3, 20 ng/ml de rh-IL-6, 20 ng/ml de rh-G-CSF, 3 a 6 unidades/ml de rh-EPO, 50 ng/ml de rh-SCF, 50 ng/ml de ligando rh-FLt3, 50 ng/ml de rh-VEGF y 50 ng/ml de rh-BMP-4) («rh» significa «recombinante humano») y 1,5 pg/ml de proteína de fusión tPTD-HoxB4, con/sin 50 ng/ml de TPO y FL. Las mezclas de células se cultivaron en placa en placas de fijación ultrabaja y se incubaron a 37 °C en el 5 % de CO2 durante 4-7 días. Después de 4-6 días, las colonias de blastos de hemangioblastos de tipo uvas (denominadas BL-CFCs o BC) fueron visibles por microscopía. La preparación se sometió a citocentrifugación y la tinción de Wright-Giemsa de las colonias de blastos derivadas de hES confirmaron las características morfológicas de las células blásticas inmaduras. Para extender estos resultados a otras líneas celulares hES (WA09 [H9], MA01, MA03, MA40 y MA09, se necesitaban suplementos de FL y Tpo para el crecimiento sostenido de las colonias de BC (sin FL y Tpo, (se obtuvieron 10-20 células hES-BC pequeñas que murieron después de 4-8 días). La Epo también fue esencial para la formación de BC y el crecimiento en todas las líneas celulares hES probadas. Estas células podían expandirse fácilmente (una placa de 6 pocillos de hES generaba aproximadamente 6,1 ± 0,66 [media ± SD] millones de hemangioblastos) en las condiciones bien definidas y reproducibles descritas anteriormente.
Para el análisis inmunocitoquímico de BL-CFC, las BL-CFC purificadas se sometieron a citocentrifugación en un portaobjetos de vidrio tratado con polilisina y se fijaron en paraformaldehído al 4 %. Para examinar la expresión de la mayoría de los genes, los anticuerpos primarios se incubaron a 4 °C durante la noche, seguido por anticuerpos secundarios marcados con colorante fluorescente, y finalmente se examinaron con un microscopio de fluorescencia. Se usaron células BM humanas normales, células K562 y HUVEC como controles.
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El análisis inmunocitoquímico reveló que las BL-CFC o BC expresadas en células hES expresaban proteínas GATA- 1 y GATA-2, proteínas LMO2, receptores de CXCR-4, TPO y EPO, y reaccionaban fácilmente con anticuerpo específico para CD71, el receptor de transferrina (Tabla 1 y Fig. 16d-v). Las células expresaron poco o nada de cD31, CD34 y KDR u otras moléculas de adhesión. Como se describe más completamente en 11/787.262, las células son células formadoras de colonias hemangioblásticas.
Ejemplo de referencia 8
Expansión de un tipo de célula diferente: célula hemangioblástica no injertable
Como se detalla anteriormente y en 11/787.262, se generaron células formadoras de colonias hemangioblásticas después de la expansión durante aproximadamente 4-7 días. En ciertas condiciones, el cultivo adicional de EB más allá de 7 días produjo grandes cantidades de un tipo de célula distinta. Como se describe a lo largo de este documento, este tipo de célula progenitora distinta se denomina célula hemangioblástica no injertable.
Los EB se cultivaron como se ha descrito anteriormente. El día 7 del protocolo de expansión, después de la formación de agrupaciones de tipo uva indicativos de células formadoras de colonias hemangioblásticas, se añadieron 5 ml de medio BL sobre estos cultivos de agrupaciones de células de tipo uva. Los cultivos son semisólidos y contienen 10 ml de medio de metilcelulosa. Después de la adición de medio nuevo, las células se cultivan durante 3-6 días adicionales, durante un total de 10-13 días en cultivo después de la formación de EB.
La adición de medio fresco mejoró enormemente la proliferación celular continua y la supervivencia durante estos períodos de cultivo prolongados. Después de 10-13 días en cultivo, las células se purificaron de la agrupación. De forma similar a las células formadoras de colonias hemangioblásticas, estas células hemangioblásticas no injertables formaron agrupaciones de tipo uva y se adhirieron débilmente entre sí. Sin embargo, como se detalla a continuación, estas células no eran idénticas a las células formadoras de colonias hemangioblásticas previamente identificadas.
Cuando las células se separaron de las agrupaciones el día 10, y el rendimiento de las células se comparó con el rendimiento de las células formadoras de colonias hemangioblásticas observadas generalmente cuando se recogieron el día 7, observamos un aumento espectacular en el número de células obtenidas. Específicamente, se purificaron por encima de 5 veces más células el día 10 frente al día 7. Como tal, se pueden producir y utilizar fácilmente mayores cantidades de células hemangioblásticas no injertables, por ejemplo, para producir cantidades mayores de tipos de células diferenciadas.
Las células identificadas después de 10-13 días de cultivo de expansión son similares, en muchos aspectos, a las células formadoras de colonias hemangioblásticas previamente identificadas. Por ejemplo, las células generalmente son poco adherentes entre sí (como las células formadoras de colonias hemangioblásticas). Además, las células identificadas después de 10-13 días de cultivo de expansión se diferenciaron in vitro para producir tipos de células hematopoyéticas. Específicamente, las células hemangioblásticas no injertables conservan la capacidad de formar CFU hematopoyéticas. Las células se separaron de las agrupaciones de tipo uva después de 10-13 días en cultivo y se cultivaron en placa en medio de metilcelulosa semisólido que contenía citoquinas que favorecen el crecimiento de CFU hematopoyéticas. Después de 10-12 días en cultivo, se observaron CFU de eritrocitos, CFU de granulocitos, CFU de macrófagos y CFU hematopoyéticas mixtas, demostrando así el potencial para producir tipos de células hematopoyéticas.
A pesar de las similitudes entre las células formadoras de colonias hemangioblásticas y las células hemangioblásticas no injertables descritas en la presente memoria, estas células no tienen el mismo potencial de diferenciación. Sin desear estar sujetos a ninguna teoría en particular, las células hemangioblásticas no injertables pueden representar un tipo de células distintas del desarrollo que, en contraste con las células formadoras de colonias hemangioblásticas, ya no son capaces de injertarse en la médula ósea después de la administración in vivo a un animal inmunodeficiente. Específicamente, 1-5 millones de células hemangioblásticas humanas no injertables (por ejemplo, células cultivadas durante 10-13 días después de la formación de EB) se administraron a ratones NOD/SciD. El examen de 24 ratones no pudo revelar el injerto de células humanas en la médula ósea o el bazo. Por el contrario, cuando se administraron números similares de células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas (por ejemplo, células cultivadas durante 6-8 días) a ratones NOD/SCID, se examinaron células humanas injertadas en la médula ósea de los 12 animales.
Otros procedimientos ilustrativos, composiciones, preparaciones y características de la invención se describen en los siguientes documentos: Solicitud de Estados Unidos con el n.° de serie 11/787.262, presentada el 13 de abril de 2007, y titulada «células formadoras de colonias hemangioblásticas». Las enseñanzas de esta solicitud se incorporan en la presente memoria en su totalidad por referencia.
Debe observarse que los solicitantes consideran que todas las combinaciones operables de las realizaciones ilustrativas descritas son materia patentable que incluye combinaciones de la materia objeto descrita en la Solicitud de Estados Unidos con el n.° de Serie 11/787.262. Por ejemplo, las células hemangioblásticas no injertables proporcionadas en la presente memoria (i) pueden tener una o más de las propiedades de las células descritas en la solicitud de Estados Unidos con el n.° de serie 11/787.262, (ii) pueden formularse como composiciones, preparaciones, preparaciones crioconservadas, o soluciones purificadas o mezcladas como se describe en la
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Solicitud de Estados Unidos con el n.° de serie 11/787.262, (iii) se pueden usar terapéuticamente y en bancos de sangre como se describe en la Solicitud de Estados Unidos con el n.° de serie 11/787.262, y (iv) se pueden usar para generar tipos de células parcial y terminalmente diferenciadas para su uso in vitro o in vivo como se describe en la Solicitud de Estados Unidos con el n.° de Serie 11/787.262. Además, las células hemangioblásticas no injertables pueden derivarse de células ES, células ED, células madre pluripotentes (incluyendo células iPS), etc., usando cualquiera de las metodologías descritas en la presente memoria y en la Solicitud de Estados Unidos con el n.° de serie 11/787.262.
Ejemplo de referencia 9
Generación eficiente de hemangioblastos a partir de iPSC humanas Generación de iPSC de alta calidad
En varios de los estudios preliminares de los inventores, son capaces de generar colonias hemangioblásticas a partir de IMR90 humano (Figura 12c) y de iPSC Adult4-3 (datos no mostrados), usando las condiciones de diferenciación de hESC optimizadas. Aunque su eficacia fue mucho menor en comparación con las hESC, demuestran claramente el potencial de diferenciación en hemangioblastos de las iPSC humanas. La baja eficiencia observada puede deberse a múltiples factores, siendo uno de ellos la calidad de las iPSC. Los inventores observaron que este es uno de los factores más importantes para la generación de hemangioblastos de alta eficiencia. Los cultivos de hESC de alta calidad se componen de colonias con bordes apretados con signos mínimos de diferenciación como se ve bajo el microscopio, a aproximadamente el 80 % de confluencia, pero sin tocarse entre sí. Crecen a una velocidad moderada: las hESC pasadas a una división de 1:3 alcanzarán la confluencia en 3-5 días con tinción positiva de los marcadores de pluripotencia en casi todas las células. Las hESC de alta calidad normalmente generan un gran número de células EB (por ejemplo, 2 x 106 las hESC de alta calidad generarán “2-3 x 106 células EB después de
3,5 días). Las etapas críticas para obtener iPSC de alta calidad incluyen: (1) pases con tripsina frente a colagenasa: los inventores han demostrado que las hESC puede pasarse rutinariamente por tripsina/EDTA después de que se haya realizado la adaptación inicial de cultivos pasados mecánicamente (Klimanskaya y col. Approaches of derivation and maintenance of human ES cells: Detailed procedures and alternatives. En: Lanza Rea, ed. Handbook of Stem Cells. Volumen 1: Embryonic Stem Cells. Nueva York, Estados Unidos: Elsevier/Academic Press, 2004: 437449). Según la experiencia de los inventores, la tripsina funciona mejor que la colagenasa IV ampliamente utilizada porque produce grupos celulares más pequeños (2-5 células) y células individuales que forman colonias más uniformemente distribuidas y de tamaño similar, lo que eliminará el contacto prematuro entre colonias y limitará la diferenciación espontánea, mientras que los pases de colagenasa dan como resultado colonias más grandes que muestran una diferenciación más extensa y deben pasarse a una relación de división más baja o antes de que se alcance la densidad deseada del cultivo. En general, los pases con tripsina/EDTA permiten la capacidad de ampliar el cultivo 3-4 veces más rápido que la colagenasa y obtener una población celular homogénea. Estas observaciones también pueden ser válidas para iPSC humanas. Los experimentos de los inventores demostraron que las iPSC humanas se pueden adaptar a la digestión con tripsina, y estas células mantienen un estado indiferenciado después de más de 20 pases; (2) Mantenimiento con fibroblastos embrionarios de ratón (alimentador MEF) o sin alimentador: el mantenimiento a largo plazo de las hESC e iPSC requería alimentadores MEF. El cultivo de las hESC e iPSC sobre capas alimentadoras MEF previene la eliminación completa de los componentes animales, y genera preocupación por las posibles aplicaciones clínicas de derivados generados a partir de las hESC y iPSC mantenidas en estas condiciones. Por lo tanto, se ha llevado a cabo la primera etapa para determinar si los hemangioblastos se pueden generar a partir de hESC mantenidas en la matriz de Matrigel en medio mTeSR. Los inventores han demostrado que se generaron un número significativamente mayor (aumento de 3 veces) de hemangioblastos con las hESC sin alimentador en comparación con las hESC cultivadas en alimentadores MEF cuando se sembraron en placas números idénticos de células EB (p <0,05) para las tres líneas de hESC probadas WA01, MA01 y HuES-3 (Lu y col., Regen Med 2008; 3: 693-704). Los inventores iniciaron entonces los experimentos de cultivo de iPSC humanas en el sistema anterior sin alimentador, y las iPSC humanas mantenidas en condiciones sin alimentador expresaron los marcadores de pluripotencia de Nanog, Oct-4, SSEA-4 y Tra-1-60 (Figura 11). Se probará si las iPSC humanas en condiciones sin alimentador se diferenciarán a hemangioblastos con alta eficiencia.
Optimización de la formación y diferenciación del cuerpo embrioide (EB): humano
Las iPSC muestran una mala capacidad de supervivencia después de la disociación celular y durante la formación de EB, un fenómeno también observado para las hESC. Se ha demostrado que la adición de un inhibidor selectivo de la quinasa asociada a Rho (ROCK), Y-27632, al medio de formación de EB sin suero previene la apoptosis de las hESC, mejora la formación de EB y promueve la diferenciación (Watanabe y col., Nat Biotechnol 2007; 25: 681-686). Los experimentos mostraron que la suplementación con Y-27632 en la formación de EB sin suero y en el medio de diferenciación resultó en una mejor formación de EB a partir de células iPS humanas (IMR90)-1 que en el medio de control: los EB en medio StemLine II más citoquinas generalmente son más pequeños con muchas células muertas después de 24 horas; mientras que los EB en medio al que se le ha añadido Y-27632 son lisos y grandes con muchas menos células muertas a su alrededor (Figuras 12a y 12b), lo que indica que se formaron Eb más sanos. Después del cultivo en placa para la formación de colonias de blastos, las células de EB tratadas con Y-27632 desarrollaron de forma sustancial colonias de blastos más sanas que las derivadas de EB sin tratamiento con Y- 27632 (Figuras 12c y 12d), generando >2 veces más hemangioblastos. Estudios previos también sugieren que la
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insulina, un componente en casi todos los medios de cultivo celular, incluido el medio StemLine II utilizado en el sistema de formación de EB descrito en la presente memoria, es un potente inhibidor de la diferenciación del mesodermo de las hESC, posiblemente a través de la vía de señalización PI3K/Akt. La inhibición de la vía de señalización PI3K/Akt potenció la diferenciación de mesodermo de las hESC en condiciones sin suero (Freund y col., Stem Cells 2008; 26: 724-733). Los resultados mostraron que la suplementación con un inhibidor de la vía de señalización PI3K/Akt en la formación de EB y el medio de diferenciación aumentaba sustancialmente la formación de hemangioblastos a partir de las hESC MA09. Se obtuvo un aumento de >2,5 veces de hemangioblastos de placas tratadas con inhibidor de PI3K/Akt en comparación con las placas de control. De manera similar, la suplementación con el inhibidor de la vía de señalización PI3K/Akt solo o más Y-27632 durante la formación de EB también dio como resultado colonias de blastos más sanas a partir de células iPS (IMR90)-1 que los controles (Figura 12e), produciendo 2,1 veces y 2,6 veces más hemangioblastos para EB tratados con inhibidor de PI3K/Art y EB tratados con inhibidor de PI3K/Art más inhibidor de ROCK, respectivamente. Los hemangioblastos se purificaron y se cultivaron en placa en condiciones para la diferenciación de células endoteliales o hematopoyéticas. Como se muestra en la Figura 12f-12j, estas células se diferenciaron en células tanto hematopoyéticas como endoteliales después de volver a cultivar en placa en condiciones apropiadas.
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Anteriormente se describen varias realizaciones de la invención en la Descripción detallada. Aunque estas descripciones describen directamente las realizaciones anteriores, se entiende que los expertos en la materia pueden concebir modificaciones y/o variaciones a las realizaciones específicas mostradas y descritas en esta memoria. A menos que se indique específicamente, la intención de los inventores es que las palabras y frases en la memoria descriptiva y las reivindicaciones tengan los significados ordinarios y habituales para los expertos en la materia o materias aplicables.
La descripción anterior de varias realizaciones de la invención conocida por el solicitante en este momento de la presentación de la solicitud se ha presentado y está destinada a fines de ilustración y descripción. Las realizaciones descritas sirven para explicar los principios de la invención y su aplicación práctica y para permitir que otros expertos en la materia utilicen la invención en diversas realizaciones y con diversas modificaciones que sean adecuadas para el uso particular contemplado.

Claims (14)

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    1. Un procedimiento para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas in vitro, dicho procedimiento que comprende las etapas de:
    a) cultivar un cultivo celular que comprende células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) en medios sin suero en presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas iPSC en cuerpos embrioides; y
    b) añadir al menos dos factores de crecimiento a dicho cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando dicho cultivo en medios sin suero, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en dicho cultivo de cuerpos embrioides,
    en donde
    dichas iPSC se mantienen con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) o se mantienen sin alimentador;
    se añade un inhibidor de Rho-quinasa (ROCK) a los medios del cuerpo embrioide y/o al medio de diferenciación sin suero;
    dichos iPSC, cuerpos embrioides y células formadoras de colonias hemangioblásticas se cultivan en medios sin suero a lo largo de todas las etapas (a) y (b) de dicho procedimiento; y
    dichos al menos dos factores de crecimiento en la etapa (b) comprenden BMP4 y VEGF.
  2. 2. Un procedimiento para generar y expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas in vitro, dicho procedimiento que comprende las etapas de:
    a) cultivar un cultivo celular que comprende células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) en medios sin suero en presencia de al menos un factor de crecimiento en una cantidad suficiente para inducir la diferenciación de dichas iPSC en cuerpos embrioides; y
    b) añadir al menos dos factores de crecimiento a dicho cultivo que comprende cuerpos embrioides y continuar cultivando dicho cultivo en medios sin suero, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en dicho cultivo de cuerpos embrioides,
    c) disgregar dichos cuerpos embrioides en células individuales;
    d) añadir al menos un factor de crecimiento a dicho cultivo que comprende dichas células individuales y continuar cultivando dicho cultivo en medios sin suero, en donde dicho factor de crecimiento está en una cantidad suficiente para expandir las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en dicho cultivo que comprende dichas células individuales,
    en donde:
    dichas iPSC se mantienen con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) o se mantienen sin alimentador;
    se añade un inhibidor de Rho-quinasa (ROCK) a los medios del cuerpo embrioide y/o al medio de diferenciación sin suero;
    dichos iPSC, cuerpos embrioides y células formadoras de colonias hemangioblásticas se cultivan en medios sin suero a lo largo de todas las etapas (a)-(d) de dicho procedimiento; y
    dichos al menos dos factores de crecimiento en la etapa (b) comprenden BMP4 y VEGF.
  3. 3. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de añadir eritropoyetina (EPO) a la etapa (b).
  4. 4. El procedimiento según la reivindicación 2, que comprende además la etapa de añadir eritropoyetina (EPO) a las etapas (b) y (d).
  5. 5. El procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en donde las iPSC se someten a tripsina.
  6. 6. El procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en donde las iPSC se mantienen con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF).
  7. 7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las iPSC se mantienen sin alimentador.
  8. 8. El procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en donde el inhibidor de Rho-quinasa
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    (ROCK) es Y-27632.
  9. 9. El procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en donde dicho factor de crecimiento es una proteína que comprende una proteína homeobox (tal como una proteína HOXB4, que puede ser una proteína HOXB4 de longitud completa y opcionalmente HOXB4 de mamífero, tal como una hOxb4 de ratón o humana), o una variante o un fragmento activo de la misma.
  10. 10. El procedimiento según la reivindicación 9, en donde dicho factor de crecimiento es una proteína de fusión que comprende HOXB4 y un dominio de transducción de proteína (PTD) tal como una proteína TAT, una variante o un fragmento activo de la misma, y en donde dicho PTD y dicha HOXB4 están opcionalmente conjugados a través de un enlazador.
  11. 11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), proteínas morfogénicas óseas (BMP), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de células madre (SCF), Flt- 3L (FL), trombopoyetina (TPO) y eritropoyetina (EPO).
  12. 12. El procedimiento según la reivindicación 11, en donde dicho factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o proteína morfogénica ósea (BMP), o ambos, se añaden a la etapa (a) dentro de las 0-48 horas del cultivo celular.
  13. 13. El procedimiento según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde dicho factor de células madre (SCF), Flt-3L (FL) o trombopoyetina (TPO), o cualquier combinación de los mismos, se añade a dicho cultivo dentro de las 48-72 horas desde la inicio de la etapa (a), tal como en la etapa (b).
  14. 14. El procedimiento según cualquier reivindicación anterior, que comprende además al menos una etapa adicional seleccionada del grupo que consiste en:
    • purificar las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas de dicho cultivo;
    • aislar las células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas de dicho cultivo; y
    • cultivar dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas humanas en condiciones adecuadas para inducir la diferenciación de dichas células formadoras de colonias hemangioblásticas en células madre hematopoyéticas humanas.
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