JP2003533976A

JP2003533976A - 胚分割による霊長類子孫のクローン性増殖

Info

Publication number: JP2003533976A
Application number: JP2001551285A
Authority: JP
Inventors: ジェラルドシャッテン; アンソニーダブリュ．エス．チャン
Original assignee: オレゴンヘルスアンドサイエンスユニバーシティ
Priority date: 2000-01-07
Filing date: 2001-01-05
Publication date: 2003-11-18
Also published as: WO2001050848A3; AU2927501A; EP1248517A2; WO2001050848A2; US20030106082A1; US20020035735A1; CA2396247A1

Abstract

(57)【要約】本発明は胚分割による霊長類子孫のクローン性増殖に関する。この場合、遺伝学的に同一の非ヒト胚は、卵割期胚の卵割球の分割および再集合により、双胎およびそれ以上の組として作製されうる。さらに本発明は、分離した卵割球から単離される胚性幹細胞およびトランスジェニック胚性幹細胞を作製する方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

関連出願の相互参照本発明は、米国特許法第119条(e)項の下で、明確に参照として完全に本明細書
に組み入れられる、2000年1月7日に出願された米国仮特許出願第60/174,812号に
関連し、かつその恩典を主張する。

【０００１】発明の分野本発明は、動物、具体的には霊長類のクローン性増殖の方法に関する。本発明
はまた、胚性幹細胞およびトランスジェニック胚性幹細胞の作製法にも関する。

【０００２】発明の背景成体の体細胞から動物のクローンを作製することにより、ヒツジ（Wilmutら、
385 NATURE 810〜13 （1997））、ウシ（Katoら、282 SCIENCE 2095〜98 （1998
））、マウス（Wakayamaら、394 NATURE 369〜74 （1998））、およびヤギ（Bag
uisiら、17 NATURE BIOTECH. 456〜61 （1999））が作製されている。クローン
を作製する最も説得力のある科学的な根拠に、疾患モデルの作製がある。疾患モ
デルとしてのクローン動物は、個々のクローンの遺伝学的性質が不変であること
から非常に有望である。このような科学的な理由には未だ説得力があるものの、
クローンが胎児および新生児の段階で死ぬこと（Katoら（1998）；Cibelliら、
280 SCIENCE 1256〜58 （1998）；Hillら、51 THERIOGENOLOGY：1451〜65 （199
9）；Renardら、353 LANCET 1489〜91 （1999）；Wellsら、10 REPROD. FERT. D
EV. 369〜78 （1998）；およびWellsら、60 BIOL. REPROD. 996〜1005 （1999）
）、ならびに核移植法によって、加齢が逆戻りされないことを示唆するテロメア
短縮に関する報告（Shieldsら、399 NATURE 316〜17 （1999））は、このクロー
ン作製技術に対する限界を意味する。さらに、さまざまな除核卵母細胞の使用に
起因する、クローンにおけるミトコンドリアの不均質性により、核移植法の結果
、遺伝的キメラが生じることも示される（Evansら、23 NATURE GENETICS 90〜93
（1999））。家畜種およびげっ歯類で成功している事実があるにもかかわらず
、非ヒト霊長類における同様の飛躍的な進歩は成されていない（Wolfら、60 BIO
L. REPROD. 199〜204 （1999））。

【０００３】同一の霊長類は、分子医学にとって計り知れない重要性を持ち、ならびに絶滅
の危機に瀕した種の保存および不妊症にとって意味を持つ。クローン動物間に遺
伝学的な変動がないことにより、実験の精度が比例的に上昇し、その結果薬剤、
遺伝子治療、およびワクチン試験、ならびに老化、環境、または他の影響による
疾患および障害に関する完全な対照によって、統計学的に有意なデータを得るた
めに必要とされる動物の数を減らすことができる。母体環境または健康および行
動に対する後成的な影響を含む、遺伝か環境かに関する、「氏か育ちか」という
問題に対する解答も得られるかもしれない。したがって、出生日が異なっていて
も、遺伝学的に同一の子を研究し（例えば動物を作製する前の表現型解析のよう
な研究；生殖系列細胞（例えば雄の生殖細胞）の連続的な移入、（Brinsterら、
9 SEMIN. CELL DEV. BIOL. 401〜09 （1998））、最初の子の平均寿命を越えて
細胞の老化を扱うことができ、さらに後向きの治療プロトコール（高齢の双胎に
おける）、および将来の治療プロトコールを同時に試験することができる。後成
的な研究は、同一の代理に連続的に移植された、本発明の一卵性の胚を用いて試
験することにより、例えば、低出生体重もしくは胎児発生の他の局面が生涯の長
期にわたる重要性をもちうること（Leeseら、13 HUM. REPROD. 184〜202 （1998
））、子孫のIQの低下が妊娠中における母体の甲状腺機能低下に関連すること（
Haddowら、341 N. ENGL. J. MED. 549〜55 （1999））、または免疫遺伝学が子
宮における拒絶反応をもたらすこと（Gerardら、23 NAT. GENET. 199〜202 （19
99）；、Clarkら、41 AM. J. REPROD. IMMUNOL. 5〜22 （1999）；およびHibyら
、53 TISSUE ANTIGENS 1〜13 （1999））を実証することができる。

【０００４】胚分割法によるクローン作製は核移植法に比べて有利である見込みがある。残
念ながら実用的ではないものの、理論上は核移植法により同一の子を無限に作製
できるはずであった。しかし、遺伝的なキメラ現象（Evansら、（1999））、胎
児および新生児の死亡率（Katoら（1998）；Cibelliら（1998）；Hillら（19
99）；Renardら（1999）；Wellsら（1998）；およびWellsら（1999））、短
縮されたテロメア（Shieldsら（1999））、ならびに一貫性のない成功率（Kato
ら（1998）；Cibelliら（1998）；Hillら（1999）；Renardら（1999）；Wel
lsら（1998）；およびWellsら（1999））により、同技術は直ちに実用化はさ
れない。このような問題があるにせよ、核移植法により提起される矛盾点および
逆説は、哺乳類の生殖の分子調節に関する新たな研究を刺激してきた。

【０００５】遺伝的キメラを生じる核移植法とは対照的に、胚分割法から得られる子孫は完
全に同一であることが期待される（すなわち核ならびに細胞質）。細胞質の治療
後にミトコンドリアの異形成（heteroplasmy）が高頻度で生じることについての
、不妊診療所からの報告は、憂慮される。このような正統でない研究方法は、若
いドナーの卵母細胞の細胞質を微量注入することにより、年配の女性から回収さ
れた老化した卵母細胞を救おうと試みる。分割により2組の三胎を作製し、核移
植により3番目の三胎を作製する、分割および核移植の組み合わせにより、細胞
質遺伝の重要性に対処しうる。

【０００６】幹細胞系はヒトとサルの胚から作製されている（Shamblottら、95 PROC. NATL
. ACAD. SCI. USA 13726〜31 （1999）およびThomsonら、282 SCIENCE 1145〜47
（1999））。ヒトまたは霊長類の完全な非近交系集団に由来する幹細胞が、不
変の遺伝的性質を有する、選択された近交系マウス由来の完全な全能性を有する
か否かはまだ知られていない。

【０００７】これは現在、例えば治療用の幹細胞を同一の同胞において後に試験される多胎
（multiple）から作製し、かつそうすることで幹細胞が奇形癌などの癌を生じる
か否かを知ることにより、本発明の文脈内で評価することができる。

【０００８】発明の概要本発明は、胚分割による動物のクローン増殖法に向けられる。好ましい態様で
は卵割球は胚から分離される。次に卵割球を空の透明帯に移植して胚期まで培養
する。次に培養した胚を代理の雌に移植し、分娩によりクローン動物を作製する
。

【０００９】本発明の別の態様では、動物は哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、または魚類で
ある。本方法の別の局面では、動物は非ヒト霊長類、好ましくはサルである。

【００１０】本発明の別の態様では、雌の代理に移す前に胚を4〜8細胞期まで培養する。本
発明の別の局面では、胚はトランスジェニックである。本発明のさらなる局面で
は、雌の代理に移す前に胚は凍結保存される。本発明のさらなる局面では、卵割
球は凍結され、さらに胚性幹細胞の貯蔵所として役立つこともある。

【００１１】本発明の好ましい態様では、雌の代理の輸卵管へ移す前に、胚から単離した卵
割球に対して着床前遺伝子診断を行う。このような着床前遺伝子診断に用いられ
る方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、蛍光インサイチューハイブリダイ
ゼーション（FISH）、1本鎖高次構造多型（SSCP）、制限酵素断片長多型（RFLP
）、プライムド（primed）インサイチュー標識（PRINS）、比較ゲノムハイブリ
ダイゼーション（CGH）、単一細胞ゲル電気泳動（COMET）解析、ヘテロ二本鎖解
析、サザン解析、および変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）解析などが含まれる。

【００１２】本発明はまた、本明細書に記載された方法で作製される動物にも向けられる。
好ましい態様では、動物は霊長類である。本発明の別の局面では、動物はトラン
スジェニック動物、好ましくはトランスジェニック霊長類である。

【００１３】本発明の範囲にはまた、胚分割法で作製した、単離された卵割球に由来する胚
性幹細胞およびトランスジェニック胚性幹細胞の作製も含まれる。好ましい態様
では、分割胚を用いてクローン性の子孫を作製し、かつ単離された卵割球を用い
て胚性細胞系を作製する。さらなる態様において、分割胚はトランスジェニック
であり、このような分割されたトランスジェニック胚を用いてクローン性のトラ
ンスジェニック子孫を作製し、かつ単離されたトランスジェニックの卵割球を用
いてトランスジェニックの胚性幹細胞系を作製する。

【００１４】本発明は、胚から卵割球を分離させ、さらにこれらの細胞を培養して幹細胞系
を作製する、胚性幹細胞の作製方法にも関する。好ましい態様では、本明細書に
記載された方法で霊長類の胚性幹細胞を作製する。本発明の別の局面では、本明
細書に記載された方法を用いて、トランスジェニックの胚性幹細胞、好ましくは
トランスジェニック霊長類の胚性幹細胞を作製する。

【００１５】本発明は、本明細書に記載された方法により作製する胚性幹細胞にも向けられ
る。好ましい態様では、胚性幹細胞は霊長類の胚性幹細胞である。さらなる態様
では、このような胚性幹細胞はトランスジェニック、好ましくはトランスジェニ
ック霊長類の胚性幹細胞である。

【００１６】本発明は、胚の着床前遺伝子診断の方法にも関する。好ましい態様では、卵割
球は胚から分離され、かつ単一の卵割球について遺伝子解析が行われる。本発明
のさらなる態様では、残りの卵割球を胚期まで培養し、続いて雌の代理に移す。
卵割球の遺伝子解析に用いられる方法には、PCR、FISH、SSCP、RFLP、PRINS、CG
H、COMET解析、ヘテロ二本鎖解析、サザン解析、およびDGGE解析などが含まれる
。

【００１７】発明の詳細な説明本発明の方法を記載する前に、本発明が、当然変化しうるように記載された特
定の方法論、プロトコール、細胞系、動物の種または属、構築物、および試薬に
制限されないことは理解されるべきである。また本明細書で用いる用語は、特定
の態様を説明することのみを目的としており、かつ添付した特許請求の範囲によ
ってのみ制限される、本発明の範囲を制限することを意図しないことは理解され
るべきである。

【００１８】本明細書で、また添付した特許請求の範囲に記載されているように、単数形の
「1つの」、および「その」は、文脈で特に断らない限り複数の表示を含むこと
を留意しなければならない。したがって例えば「1個の細胞（a cell）」という
表示は1個または複数の細胞を意味し、当業者に公知な同等物を含む。

【００１９】文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語
は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。
本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法、装置、および材料は
、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、装
置、および材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物および特
許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている
、構築物および方法論を記載および開示する目的で、参照として本明細書に組み
入れられる。上述した刊行物および主文中に記載する刊行物は、本出願の出願日
に先だって開示するだけのために提供される。本発明者らが先行発明により、そ
のような開示に先行する権利がないことを容認すると解釈されるべき事項は、本
明細書には全くない。

【００２０】定義便宜のため、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定
の用語および語句の意味を以下に提供する。

【００２１】「動物」という用語には、哺乳類（例えば、げっ歯類（例えばマウスおよびラ
ット）、霊長類（例えばサル、類人猿、ヒト）、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ウシ、
ブタ）、両生類、爬虫類、魚類、および鳥類などの、すべての脊椎動物が含まれ
る。また、胚期および胎児期を含む、あらゆる発生期にある個々の動物も含まれ
る。

【００２２】本明細書で用いる「霊長類」という用語は、サル、類人猿、およびヒトが含ま
れるがこれらに限定されない、哺乳類の群に属する、任意の動物を意味する。

【００２３】本明細書で用いる「全能性を有する」という語句は、胚、胎児、および動物な
どの発生中の細胞塊中のすべての細胞を生じる細胞を意味する。好ましい態様で
は、「全能性を有する」という語句は、動物のあらゆる細胞を生じる細胞を意味
する。全能性を有する細胞は、1個または複数の核移植段階から胚を作製する手
順で使用されると、発生中の細胞塊のあらゆる細胞を生じることができる。動物
体は子宮外で（ex utero）機能する動物でありうる。動物は例えば、生産の動物
の場合がある。全能性を有する細胞を使用して、臓器の採取に役立つような動物
、例えば遺伝子を改変して頭部の成長が除去されたり、またはホメオティック（
homeotic）遺伝子の操作により他の臓器を除去される、不完全な動物を産出する
こともできる。

【００２４】本明細書で用いる「全能性を有する」という語句は、「多能性を有する」とい
う語句と区別される。後者の語句は、発生中の細胞塊内における細胞の分集団に
分化するが、そのような発生中の細胞塊におけるすべての細胞を生じることはで
きない細胞を意味する。したがって、「多能性を有する」という語句は、生産の
動物におけるすべての細胞を生じることはできない細胞を意味しうる。

【００２５】本明細書で用いる「全能性を有する」という語句はまた、「キメラの（chimer
）」、または「キメラ（chimera）」という語句とは区別される。後者の語句は
、細胞塊内の他の細胞の核DNAとは著しく異なるヌクレオチド塩基配列を有する
、核DNAをもつ細胞の亜群を含む、発生中の細胞塊を意味する。発生中の細胞塊
は例えば、胚、胎児、および/または動物として存在しうる。

【００２６】本明細書で用いる「胚性幹細胞」という語句は、好ましくはインビトロ細胞培
養で維持された胚から単離された、多能性を有する細胞を含む。胚性幹細胞は、
支持細胞の有無にかかわらず培養することができる。胚性幹細胞は、胚盤胞期の
胚および前胚盤胞期の胚を含む、任意の発生時期に胚から単離された胚性細胞か
ら樹立することができる。胚性幹細胞とその使用法は当業者に公知である。これ
については例えば「有蹄類胚に由来する、培養内部細胞塊細胞系（Cultured Inn
er Cell Mass Cell-Lines Derived from Ungulate Embryos）」という表題で、
いずれも参照としてその全体が本明細書に含まれ図、表、および図面を含む、米
国特許第6,011,197号および国際公開公報第97/37009号（SticeおよびGolueke、1
997年10月9日発行）、ならびにヤン（Yang）およびアンダーソン（Anderson）、
38 THERIOGENOLOGY 315〜335 （1992）を参照されたい。

【００２７】本発明の目的上、本明細書で用いる「胚」または「胚性の」という語句は、母
性宿主（maternal host）の子宮膜に着床していない、発生中の細胞塊を含む。
したがって本明細書で用いる「胚」という用語は、受精した卵母細胞、細胞質雑
種、前胚盤胞期の発生中の細胞塊、および/または、母性宿主の子宮膜への着床
前の発生期にある、他の任意の発生中の細胞塊を意味する場合がある。本発明の
胚は生殖隆起を示さない場合がある。したがって「胚性細胞」は、胚から単離さ
れたり、および/または胚から生じる。

【００２８】胚は細胞発生の複数の段階を提示する場合がある。例えば1個の細胞胚は接合
体（zygote）と呼ぶことができ、接合体は分割胚から生じる中実で球状の細胞塊
であり桑実胚と呼ぶことができ、さらに割腔を有する胚は胚盤胞と呼ぶことがで
きる。

【００２９】本明細書で用いる「胎児」という用語は、母性宿主の子宮膜に着床した発生中
の細胞塊を意味する。胎児は例えば生殖隆起のような明確な特徴を含む場合があ
る。生殖隆起は当業者により容易に同定される特徴であり、多くの動物種の胎児
で認識可能な特徴である。本明細書で用いる「胎児細胞」という用語は、胎児か
ら単離された、および/または胎児から生じた任意の細胞、または胎児に由来す
る細胞を意味する場合がある。「非胎児細胞」という用語は、胎児に由来しない
、または胎児から単離されたものではない細胞を意味する。

【００３０】本明細書で用いる「内部細胞塊（inner cell mass）」という用語は、胚本体
を生じる細胞を意味する。胚盤胞の外側に並ぶ細胞は、胚の栄養芽層と呼ばれる
。胚から内部細胞塊を単離する方法は当業者に公知である。シムズ（Sims）およ
びファースト（First）、91 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 6143〜47 （1994）；
およびキーファー（Keefer）ら、38 MOL. REPROD. DEV. 264〜268 （1994）を参
照されたい。「前胚盤胞」という用語は当技術分野で公知であり、既に言及した
。

【００３１】「トランスジェニック胚」とは、1個または複数の細胞が人の介入により導入
された異種核酸を含む胚を意味する。導入遺伝子は、細胞の前駆体へ導入するこ
とにより、意図的な遺伝子操作により、または組換えウイルスの感染により、細
胞に直接または間接的に導入される場合がある。本明細書に記載されるトランス
ジェニック胚では、導入遺伝子により細胞が関心対象の構造遺伝子を発現する。
しかしながら、導入遺伝子が沈黙している（silent）状態にあるトランスジェニ
ック胚も含まれる。

【００３２】「トランスジェニック細胞」という用語は、導入遺伝子を含む細胞を意味する
。

【００３３】「生殖細胞系のトランスジェニック動物」という語句は、遺伝的変化または遺
伝情報が生殖細胞系に導入されることによって、遺伝情報を子孫に伝達する能力
が付与されるトランスジェニック動物を意味する。このような子孫が実際にその
ような遺伝的変化の一部またはすべてをもつ場合、それらもトランスジェニック
動物である。

【００３４】「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体の産生に必要な、調節配
列およびコード配列を含むDNA配列を意味する。ポリペプチドは完全長のコード
配列にコードされうるか、または所望の酵素活性が保持されているかぎりはコー
ド配列の任意の部分にコードされうる場合がある。

【００３５】「導入遺伝子」という用語は、動物のゲノムへ導入される任意の核酸を広く意
味し、おそらく通常はゲノム上に存在しない配列を有する遺伝子もしくはDNA、
存在するが所与のゲノムでは通常は転写および翻訳（発現）されない遺伝子、ま
たはゲノムへの導入が望まれる、他の任意の遺伝子もしくはDNAを含むが、これ
らに限定されない。導入遺伝子には、非トランスジェニックゲノム上に通常存在
するが、発現の変更が望まれる遺伝子、または変更型または異型としての導入が
望まれる遺伝子が含まれる場合がある。導入遺伝子は、特異的に、限定された遺
伝子座に向けられる場合があり、染色体内に無作為に組み込まれる場合があり、
または染色体外で複製するDNAとなる場合がある。導入遺伝子は、1つまたは複数
の転写調節配列、および選択された核酸が適切に発現するために必要でありうる
、イントロンなど他の任意の核酸を含む場合がある。導入遺伝子は、コード配列
または非コード配列、またはそれらの組み合わせの場合がある。導入遺伝子は、
適切な条件下で1つまたは複数の導入遺伝子の発現を駆動する能力をもつ、調節
エレメント（element）を含む場合がある。

【００３６】「関心対象の構造遺伝子」という語句は、例えば生物学的に活性のある関心対
象のタンパク質またはアンチセンスRNAを発現する、構造遺伝子を意味する。構
造遺伝子は、植物、真菌、動物、細菌のゲノムもしくはエピソーム、真核生物の
核DNAもしくはプラスミドDNA、cDNA、ウイルスDNA、または化学合成されたDNAを
含む、当技術分野で公知の任意の供給源に、全体としてまたは部分的に由来する
場合がある。構造遺伝子配列は例えば、受容体、酵素、サイトカイン、ホルモン
、増殖因子、免疫グロブリン、細胞周期タンパク質、細胞内情報伝達タンパク質
、膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、またはレポータータンパク質（例えば緑
色蛍光タンパク質（GFP）、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）などのポリ
ペプチドをコードする場合がある。さらに構造遺伝子は心血管疾患、神経疾患、
生殖障害、癌、眼疾患、内分泌障害、肺疾患、代謝障害、自己免疫異常、老化な
どの特定の疾患または障害に関連する遺伝子の場合がある。

【００３７】構造遺伝子は、発現産物の生物学的活性もしくは化学構造、発現速度、または
発現制御様式に影響を及ぼしうる1個または複数の改変をコード領域または非翻
訳領域に含む場合がある。このような改変には、1個または複数のヌクレオチド
の変異、挿入、欠失、および置換が含まれるがこれらに限定されない。構造遺伝
子は連続したコード配列を構成しうるか、または適切なスプライス接合に結合し
た、1個もしくは複数のイントロンを含みうる。構造遺伝子は融合タンパク質を
コードする場合もある。

【００３８】核の組成物と細胞質の組成物が同一である霊長類は、現在のクローン作製方針
では作製することができないが、このような同一物（identical）が得られれば
、例えば疾患の遺伝的基礎および後成的な基礎について調べる前臨床調査のため
の、理想的な科学モデルを提示する。この場合、本発明は卵割期の胚の卵割球の
分離および再構築により、妊娠および出産は双胎およびより高次の多胎として遺
伝学的に同一の霊長類を産出する段階に関し、胚移植後にもたらされる。107個
のアカゲザル胚を分割することにより、計368の多胎が作製された。13個の分割
胚を移植した後に、4例の妊娠が成立した（対照の53％に対して31％）。胚の4分
の1から1匹の健康な雌が生まれたことから、この方法で生きた子孫が得られるこ
とがわかる。DNAフィンガープリント法により同一である、この子孫の同胞は枯
死妊娠（blighted pregnancy）、すなわち胎盤は正常であったが胎児組織を欠い
ていたとして、流産した。胚盤胞の細胞数は、多胎では対照と比べて少なく、胚
細胞緊密化および胚盤胞形成は速やかに起こった。分割胚に由来する内部細胞塊
（ICM）ではアポトーシスが高い比率で生じたので、結果的にICM細胞が不足する
ことが枯死妊娠の原因と言えるかもしれない。胚の大多数は出産用に移植しつつ
、可能性がある幹細胞療法または遺伝子解析（例えば着床前遺伝子解析）用に1
個または2個の細胞を保存しておくことで卵割球の生検を行うことができる。個
々の分割胚は個別に凍結保存し、後に胚のすべてを解凍して首尾よく移植するこ
とができる。したがって、同一の子孫を、例えば同じ妊娠母を連続的に妊娠させ
ることで作製することが可能であり、このために胎児-母体環境の影響を胎児お
よび母体の両方の遺伝的性質と区別することができる。さらに霊長類幹細胞のも
つ最大限の能力を、遺伝学的に同一の児に導入された分割胚から確立された系を
用いて調べることができる。核移植法の代わりに、分割によるクローン作製は、
遺伝学的に同一かつ生物学的に正常な霊長類研究モデルの切迫した必要性に対処
する。したがって分割胚を保存でき、またはその後の妊娠のために、ここで生き
ている子孫と同一の幹細胞系を細胞治療の可能性について調べることができる。

【００３９】このクローン作製法は、遺伝学的に同一の霊長類を作製する方法だけでなく、
遺伝学的に同一のトランスジェニック霊長類を作製する可能性も提供する。この
ようなトランスジェニック霊長類は、重篤なヒト疾患の研究モデル、ならびに遺
伝子および細胞の治療方針の効力を評価するためのモデルとしても用いることが
可能であり、これにより、ノックアウトマウスおよびヒトの患者との間に存在す
る科学的な空白を埋める。トランスジェニック動物の最も有望な作製方法では、
改変したドナー細胞を核移植または幹細胞技術のいずれかに用いる。前者の方法
は、克服できない障壁に遭遇しているようにみえるので、後者の方法は実施可能
性が立証される可能性があるが、これは霊長類の子孫が、遺伝子工学的に作製さ
れた胚性幹細胞を用いてキメラ胚から作製されうる場合に限られる。重要な点と
して本発明は、霊長類の胚の分離、操作、ドナー透明体への移入、再構築胚の成
長、胚移植、妊娠の確立、および胚の一部に由来する子孫の出生における成功を
説明する。いずれの段階も、霊長類において幹細胞および他のキメラの全能性を
確立する研究プロトコールを完全なものとするためである。

【００４０】枯死妊娠の失敗は、これらの細胞が着床後に胎盤の機能に寄与するため、胎盤
の治療の可能性を提示する。胎盤が十分機能しないと子宮内の胎児の発育遅延が
起こり、さらに治療のために胎盤細胞を補給しうる。研究の可能性には、雄核発
生胚（androgenote）のように、ゲノム刷り込み（Gerardら（1999）； Clarkら
（1999）；Hibyら（1999）およびWilliamsonら、 72 GENET. RES. 255〜65 （
1998））によって失われた胚の増殖、ならびに初期病因が実際に胎盤不全にある
場合には（Cibelliら（1998）；Hillら（1999）；Renardら（1999）；Wells
ら（1998）；およびWellsら（1999））、核移植で作製されたクローンさえが
含まれる。このように提供された細胞にタグを付けることで、これらがICMまた
は胎児に寄与しないことを確実にできる可能性がある。

【００４１】着床前遺伝子診断に関する影響には、アポトーシス率の観点からみた卵割球生
検後の精度についての問題、および卵割球除去後の胎児の生存能力に関する問題
が含まれる。したがって、着床前に胚から単離された卵割球を対象に遺伝子解析
を行うことが賢明である。胎児の生存能力に加えて、このような解析を用いて、
染色体DNAの完全性、導入遺伝子の存在、および遺伝子変異を評価することがで
きる。

【００４２】着床前遺伝子診断には数多くの方法が用いられる。例えばPCR法を用いて遺伝
子変異を解析することができる（Tsai、 19 PRENAT. DIAGN. 1048〜51 （1999）
；Rojasら 64 FERTIL. STERIL. 255〜60 （1995））。複合（multiplex）マーカ
ーPCR法および複合蛍光PCR法を行うことで、1個の細胞内における複数の変異を
検出することができる（Dreesenら、6 MOL. HUM. REPROD. 391〜96 （2000）；
Blakeら、5 MOL. HUM. REPROD. 1166〜75 （1999））。複数の変異を検出する別
の方法にDGGE解析がある（Vrettouら、19 PRENAT. DIAGN. 1209〜16 （1999））
。遺伝子変異の検出に使用できる他の方法には、SSCP、ヘテロ二本鎖解析、およ
びRFLPが含まれる（Tawataら、12 GENET. ANAL. 125〜27 （1996）；Diamondら
、27 BIOTECHNIQUES 1054〜62 （1999）；Van den VeyverおよびRoa、10 CURR.
OPIN. OBSTET. GYNECOL. 97〜103 （1998）；Sutterlinら、19 PRENAT. DIAGN.
1231〜36（1999））。

【００４３】さらに、単一細胞ゲル電気泳動アッセイ法（COMET）を行うことで、DNAの2本
鎖切断および1本鎖切断を調べることができる（Rojasら、722 J. CHROMATOGR. B
. BIOMED. SCI. APPL. 225〜54 （1999）；Takahashiら、54 THERIOGENOLOGY 13
7〜45 （2000）；Takahashiら、54 MOL. REPROD. DEV. 1〜7 （1999））。染色
体異常を検出するためにFISH解析を行うことができる（Sasabeら、16 J. ASSIST
. REPROD. GENET. 92〜96 （1999））；しかしPRINS法は、インサイチューハイ
ブリダイゼーションの別法として使用することができ（Pellestorら、2 MOL. HU
M. REPROD. 135〜38 （1996））、かつ染色体の異数性をCGH法（Voullaireら、1
9 PRENAT. DIAGN. 846〜51 （1999））により検出することができる。

【００４４】本発明はまた、「細胞の保険（cellular insurance）」、すなわち胚性幹細胞
の貯蔵所として凍結卵割球を維持することを目的とした、胚細胞の保存にも関す
る。実際に例えば5〜8胎児期由来の胚盤胞を用いて胚性幹細胞を樹立することが
できる。このような細胞系は細胞治療に極めて重要であると考えられ、4細胞期
を越える単一の卵割球を、極めて重度の疾患もしくは他の疾病または外傷に対す
る保険として、凍結保存するべき否かに関して、臨床的な問題が生じる可能性が
ある。

【００４５】要約すると、胚分割によるクローン作製により、同一の胚が効率よく産出され
、霊長類の子孫が生きて生まれる。分割により同一の子孫が生じうる可能性があ
り、ならびに生まれた子孫と同一の幹細胞を樹立することもできる。実際に、凍
結した胚の保存、その後の着床、および/または細胞療法のために作製される幹
細胞系のために、用いることができる。

【００４６】一方、本発明の特定の態様では、霊長類の四胎が胚分割法で得られ、同一の双
胎、三胎、四胎、五胎（またはそれ以上）の霊長類の組が意図され、かつ可能で
あり、例えば非常に重要な臨床前調査の実施を可能にすると考えられる。

【００４７】霊長類に由来する一般的に同一の細胞および幹細胞は、多くの疾患（例えば老
化、エイズ、癌、アルツハイマー病、自己免疫異常、代謝障害、肥満、器官形成
、精神疾患、および生殖）の研究に極めて重要であると言える。さらに分子医学
および遺伝子治療プロトコールの革新的戦略の開発に関する、これらの細胞の重
要性を過小評価すべきではない。例えば臨床戦略には、クローン作製、補助生殖
技術、トランスジェニック動物の作製、および全能性を有する不死化した胚性生
殖細胞（EG細胞）および幹細胞（ES細胞）の使用などが含まれる。さらに、同一
のトランスジェニックの、および/または不死化された全能性を有するEGまたはE
Sに由来する細胞は、不妊、配偶子形成、避妊、補助生殖、不妊の遺伝学的基礎
、雄雌間の減数分裂細胞周期の調節、生殖の老化、および特発性不妊症の非内分
泌的基礎に関連した分子事象を明らかにする際の、理想的な前臨床モデルになり
うる。

【００４８】これらの方法を用いて、ヒトの発生、特に着床前後の発生、体軸の明確化、体
節形成、器官形成、刷り込み、胚体外膜の配置、および全能性について調べるこ
ともできる。トランスジェニックレポーターの動的な非侵襲的画像化法を用いる
ことで、霊長類胎児の細胞の配置を、妊娠中および生涯を通して同定することが
できる。クローン作製およびトランスジェニック動物を利用して、疾患の発症機
構を発見し、かつ分子医学的な治療法の作製ならびに最適化を行うことができる
。例えば、特定遺伝子に関して遺伝子ノックアウトにより作製した霊長類により
、癌、心臓病および脳卒中を引き起こす動脈硬化、先天性代謝異常、ならびに他
の胎児性疾患および新生児性疾患、パーキンソン病、多嚢胞性腎疾患、失明、難
聴、知覚障害、蓄積症（レッシュ-ナイハン症候群およびゼルウェガー症候群）
、ならびに嚢胞性線維症の治療法の発見が促進されうる。このような動物はまた
、糖尿病、肝障害、腎障害、人工臓器の発達、創傷治癒、心臓発作による損傷、
脳卒中による脳損傷、脊椎損傷、記憶喪失、アルツハイマー病、および他の痴呆
症、筋肉および神経の損傷を含む、疾患の細胞療法の評価および改善に適してい
る。

【００４９】したがって本発明は、胚性幹細胞およびトランスジェニックの胚細胞を用いて
ヒトの疾患を治療する方法にも関する。具体的には、本発明に記載される霊長類
のクローン性増殖法により、胚性幹細胞およびトランスジェニックの胚性幹細胞
を作ることもできる。

【００５０】胚の内部細胞塊に由来する細胞（例えば胚盤胞）を用いて、胚性幹細胞系を誘
導することが可能であり、またこのような細胞を組織培養で維持することができ
る（例えば参照として本明細書に組み入れられる、Schuldinerら、97 PROC. NAT
L. ACAD. SCI. USA 11307〜12 （2000）；Amitら、15 DEV. BIOL. 271〜78 （20
00）；米国特許第5,843,780号；米国特許第5,874,301号を参照）。一般に幹細胞
は比較的未分化であるが、分化した機能的な細胞となる可能性がある。例えば造
血幹細胞は、最終的に分化して赤血球や白血球などの血液細胞を生じる可能性が
ある。

【００５１】本発明で説明された方法を用いて、特定の疾患に関連した遺伝子を発現しうる
、トランスジェニック霊長類の胚性幹細胞を作製することもできる。例えばトラ
ンスジェニック霊長類の胚細胞を、ドーパミンの生合成経路にかかわる酵素であ
る、チロシンヒドロキシラーゼを発現させるように作製することができる。この
神経伝達物質はパーキンソン病患者の脳の基底核領域で枯渇している。したがっ
てチロシンヒドロキシラーゼを発現するトランスジェニック霊長類の胚細胞をパ
ーキンソン病患者の基底核領域に移植することで、神経におけるドーパミン量を
強力に回復させうる（例えばBankiewiczら、144 EXP. NEUROL. 147〜56 （1997
）を参照）。したがって本発明で説明された方法により、ヒトの多くの疾患を治
療することができる（例えばRathjenら、10 REPROD. FERTIL. DEV. 31〜47 （19
98）；Guanら、16 ALTEX 135〜41 （1999）；Roviraら、96 BLOOD 4111〜117 （
2000）；Mullerら、14 FASEB J. 2540〜48 （2000）を参照）。

【００５２】実施例どのような形であれ制限するものと解釈されるべきではない、以下の実施例に
より、本発明をさらに説明する。本出願全体を通して引用されたすべての参照の
内容（参考文献、公表済みの特許、刊行された特許出願、および同時係属中の特
許出願を含む）は参照として本明細書に組み入れられる。

【００５３】実施例1．胚の分割ゴナドトロピンで刺激した雌のアカゲザルから腹腔鏡を用いて回収されたアカ
ゲザルの卵母細胞を、体外受精法（IVF）で受精させた（Wuら、55 BIOL. REPROD
. 260〜70 （1996））。胚を適切な段階まで培養し、プロナーゼで透明体を除去
した（Hewitsonら、13 HUM. REPROD. 3449〜55 （1998））。透明体を含まない
胚は、分割を行う20分前に個別に回収しておく。個々の胚を、カルシウムおよび
マグネシウムを含まないTALP-HEPES培地を含む操作用ドロップに移した。卵割球
を、マイクロシリンジで制御された、先端を丸くした（blunt）マイクロピペッ
ト（直径30 μm）を通して繰り返し吸引して分離した。分離した卵割球を、透明
体を分離した後に、卵母細胞の細胞質を機械的に除去して得られた空の透明体に
移した。作製した個々の多胎胚（multiple embryo）をそれ自体の透明体中に置
いて卵割球の集合を促した。したがって、採取した卵1個あたり1個の透明体しか
ないことから、透明体は制限された。この問題を解決するために、ウシ卵母細胞
から採取した別の透明体を良好に使用した。

【００５４】胚移植用の雌の代理は、血清エストラジオール量とプロゲステロン量を指標と
して選択した。妊娠は、24日〜30日目の間に内分泌学的プロフィールおよび胎児
の超音波検査を行って確認した。

【００５５】血統の確認は、D3S1768、D6S276、D6S291、D6S1691、D7S513、D7S794、D8S110
6、D10S1412、D11S925、D13S765、D16S403、D17S804、およびD18S72の各遺伝子
座に対する非相同ヒトプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で増幅
した13か所のマイクロサテライト遺伝子座に関するDNAタイピング法で行った。

【００５６】卵胞刺激法月経周期が正常な雌のアカゲザルの過刺激を外因性ゴナドトロピンで誘導した
（Mengら、57 BIOL. REPROD. 454〜59 （1997）；Vandervoortら、6 J. IN VITR
O FERTIL. EMBRYO TRANSFER 85〜91 （1989）；Zelinski-Wootenら、51 HUM. RE
PROD. 433〜40 （1995）。月経の開始時点において、雌に、GnRH拮抗薬（Antide
；Ares Serono、スイス・オーボンヌ；体重1 kgあたり0.5 mg）を6日間にわたっ
て毎日皮下注射し、その間に組換え体ヒトFSH（r-hFSH；Organon社、ニュージャ
ージー州ウェストオレンジ；30 IU筋注）を1日2回投与することで刺激に対する
反応を抑制した。続いて1日、2日、または3日間r-hFSH＋r-hLHの注入（r-hLH；A
res Serono；各30 IU、1日2回の筋注）を行った。超音波検査を濾胞刺激の7日目
に行い、濾胞反応が適切に起こっていることを確認した。濾胞の直径が3 mm〜4
mmになった時点で、排卵のため、1000 IUのr-hCG （Serono、マサチューセッツ
州ランドルフ）を筋肉内注射で投与した。

【００５７】腹腔鏡による濾胞の吸引濾胞の吸引をhCGの２７時間後に行った。卵母細胞を、テフロン（登録商標）
（Teflon）チューブで連結した針吸引（needle suction）装置を用いて濾胞から
吸引した（Ｒｅｎｏｕら、３５ＦＥＲＴＩＬ．ＳＴＥＲＩＬ．４０９〜１
２（１９８１）およびＢａｖｉｓｔｅｒら、２８ＢＩＯＬ．ＲＥＰＲＯＤ
．９８３〜９９（１９９３）により改変）。簡単に説明すると、１０ｍｍ
のトロカールを腹壁経由で留置して拡大鏡を導入した。卵巣は、挿入した拡大鏡
に接続されたモニターで画像化した。皮膚を２か所で小さく切開し、５ｍｍの
トロカールの両側を挿入しやすくした。把持鉗子を各トロカールを通して導入し
て卵巣を２か所で固定した。安定化したら、テフロンチューブにつなげた２０ゲ
ージのステンレス鋼製皮下針を、OHMEDA真空調節器に連結した。このチューブに
最初に５ＩＵ／ｍｌのヘパリンを添加した無菌性のTALP-HEPESを流した後に、
腹壁を介して各卵巣に挿入した。複数の各濾胞を、約４０ｍｍＨｇ〜６０ｍ
ｍＨｇの圧の連続真空状態で、５ＩＵ／ｍｌのヘパリンを添加した１ｍｌの
TALP-HEPES培地を含む血液採取管へ吸引して３７℃で維持した。採取管を、ただ
ちに専用の霊長類卵母細胞／接合体実験室に移して卵母細胞を回収し、成熟期の
評価を行った。

【００５８】アカゲザルの卵母細胞の採取および評価各採取管の内容物を、2 mg/mlのヒアルロニダーゼを添加したTALP-HEPESで希
釈した。卵母細胞を洗浄した後に、3 mg/mlのBSA（CMRL-BSA）を含む事前に平衡
化したCMRL培地に移し、、10 mg/mlのブタFSHおよび10 IU/mlのhCGを添加して、
成熟期の評価を行った。膨張した卵丘細胞を示す、分裂中期IIで停止させた卵母
細胞、明瞭な囲卵腔、および第一極体を、CMRL-BSA中で受精するまでの最長8時
間まで維持した。未成熟の卵母細胞を、ホルモンを加えたCMRL-BSA中で最長24時
間まで成熟させた（Bavisterら（1983）；BOATMAN、IN VITRO GROWTH OF NON-H
UMAN PRIMATE PRE- AND PERI-IMPLANTATION EMBRYOS 273〜308 （B.D. Bavister
編、Plenum Press 1987）；Morganら、45 BIOL. REPROD. 89〜93 （1991）。

【００５９】アカゲザルの精液の採取、調製、および処理生殖能が証明されたアカゲザルの雄を対象に、許容可能な精液試料をペニスの
電気刺激を利用した射精法により、日常的に生産するように訓練し（Bavisterら
（1983）； Boatman （1987）。凝固射精物を液状にした後に液状精液を除去し
、400×gで5分間遠心して10 mlのTALP-HEPESで3回洗浄した。ペレットを1 mlのT
ALP-HEPESに再懸濁した後に、微量の試料を分取して構造解析に用いた。残りを
数え、20×10⁶精子/mlの濃度になるように1 mlの平衡化したTALPで希釈した後に
、10 mlのミネラルオイルを重層した35 mmのプラスチック製ペトリ皿に置いた。
精子懸濁液を5％ CO₂の存在下で37℃で6時間インキュベートした。カフェイン（
1 mM）と1 mMのジブチル環状アデノシン一リン酸（dbcAMP）を最後に添加して、
過活性化を刺激した（Bavisterら（1983））。精液を用いてIVFを行い（Wuら、
55 BIOL. REPROD. 260〜70、1996）、かつ細胞質内精子注入（ICSI）（Hewitson
ら、55 BIOL. REPROD. 271〜80 （1996））を行って胚を作製した。卵割期の胚
の卵割球を分離して、核移植および融合の核ドナーとして用いた。

【００６０】胚の分割遺伝学的に同一の双胎を作製するために、胚の分割は、クシミンスカ（Krzymi
nska）ら（5 HUMAN REPROD. 203〜08 （1990））に記載された胚生検の方法に
基づき、卵割球吸引により行った。4個〜8個の細胞のIVF用またはICSI用の胚を
、オイルで覆った100 mlのCa²⁺およびMg²⁺を含まない培地に移して10分間インキ
ュベートした。1個の胚をマイクロピペットを用いて吸引して保持した。生検用
ピペット（内径30 mM〜40 mM）を、透明体を介して導入し、卵割球を吸引して慎
重に除去した。あるいは、先端を丸くした火炎研磨（flame polished）マイクロ
ピペットを透明体上に導入し（酸性タイロード（Tyrode）液の細流を用いて行っ
た；Handysideら、1 LANCET 347〜49（1989））、卵割球を吸引して除去した。
次にマイクロピペットを用いて卵割球を空の透明体に挿入した。2個の双胎胚（1
個は元の透明体中にあり、もう1個は人工透明体中にある）を、TALP-HEPESで2回
、CMRLで1回洗浄した後にBRL細胞上のCMRL培地中で卵割が起きるまで共に培養し
た。次に双胎胚を雌の代理に移植した。

【００６１】胚移植のためのレシピエントの選択卵ドナーに合わせた月経周期が正常な雌のアカゲザルを対象にスクリーニング
を行って胚レシピエントを決定した。スクリーニングは、月経周期の8日目（月
経初日を1日目とする）から毎日血液試料を採取し、血清中のプロゲステロンお
よびエストロゲンを解析した。血清エストロゲン量が基礎量の2〜4倍に上昇する
と、排卵が通常12〜24時間以内に起こる。排卵の時機は、血清エストロゲン量の
有意な減少、および血清プロゲステロン量の上昇により決定した（例えば1 ng/m
lを上回る量）。排卵から2日目または3日目に、2個の4〜8細胞期の胚をレシピエ
ントの輸卵管に移して外科的に胚移植を行った。

【００６２】開腹による胚移植および妊娠のモニタリング腹部中央を切開して外科的な胚移植を行った（Wolfら、41 BIOL. REPROD. 335
〜46 （1989））。3 mg/mlのBSAを含むHEPES緩衝TALP中に、2個の4〜8細胞期の
胚を含むトムキャット（Tomcat）カテーテルを用いて輸卵管にカニューレを挿入
した。カテーテルを引き抜く時には、0.05 mlの培地中のカテーテルから胚を除
いた。このカテーテルを培地で軽く洗浄した後に、雌の体から除いて、胚が良好
に移されるようにした。着床を確認するために血液試料を毎日採取して、血清中
のエストロゲン量およびプロゲステロン量を調べた（Lanzendorfら、42 BIOL. R
EPROD. 703〜11 （1990））。ホルモン量が妊娠の可能性を示した場合、移植後3
5日目に腹部の超音波検査で確認した。超音波検査時に、胎児の長さ、胎児の心
臓活動、および卵黄嚢のサイズを測定した。これらの測定値を、IVF妊娠および
自然妊娠で得られた同様の測定値と比較した（TarantalおよびHendrickx、15 AM
. J. PRIMAT. 309〜23 （1988））。妊娠が確認されたら血液試料を週に2回採取
し、血清中のプロゲステロン量とエストロゲン量を妊娠中期の間モニターした。
妊娠中期に超音波検査を行って、発生が正常に進んでいることを確認した。エス
トロゲン量およびプロゲステロン量が適切なものの超音波検査で妊娠が認められ
ないレシピエントについては、LHバイオアッセイ法で測定されるサルの血清の絨
毛性ゴナドトロピン（mCG）に関して血液試料を解析した（Ellinwoodら、22 BIO
L. REPROD. 955〜963 （1980））。

【００６３】アポトーシス細胞の検出末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）によるdUTPニック末
端標識（TUNEL）アッセイキット（インサイチュー死亡検出キット、Boehringer
Mannheim、米国）を用いて、アポトーシス細胞の有無を評価した。完全な固定お
よびTUNELアッセイ法をテラサキ（Terasaki）ディッシュ上で行った。透明帯の
ない胚盤胞を2％ホルムアミド（pH 7.4）中で30分間固定し、PBSで洗浄した後に
、0.1％ Triton X-100および0.1％クエン酸ナトリウム溶液を含むPBS中で4℃で
2分間透過させた。胚細胞の切断DNA末端をTdTおよびフルオレセイン-dUTPで60分
間かけて37℃で標識した。胚盤胞を1 μg/mlのヘキスト 33258 （三塩酸ビスベ
ンジミド、Sigma、セントルイス、ミズーリ州）で対比染色してDNA全体を視覚化
した。ベクタシールド（Vectashield）（Vector Labs、カリフォルニア州）を用
いて胚盤胞をスライドガラス上に載せた。胚盤胞上に圧力がかかるのを防いでそ
の3次元構造を保持するために、2枚のカバーガラススペーサー（高さ170 μm、
すなわち130〜150 μmのアカゲザル胚の直径を上回る）を、ベクタシールドの小
滴に並べたカバースリップの下に配置した。直列に3 μmの空間をはさんだ共焦
点画像切片を、UV用のアルゴンレーザーと蛍光励起用の第2のアルゴン-488レー
ザーを装備したライカ（Leica）共焦点TCS SP顕微鏡で得た。0.75 N.A.の25×の
対物鏡を用いた。胚盤胞1個あたり30〜50枚の画像を得た。これらの切片を編集
して胚盤胞の3次元像を作製した。個々の共焦点画像をアドべフォトショップ（A
dobe Photoshop）（Adobe Systems、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を
用いて解析した。切片を交互に積み上げて個々の像の胚盤胞を完全に3次元再構
築した。この3次元再構築は、核を切片毎に数えることで全細胞数を提供した。
胚盤胞の中ほどの切片に焦点を合わせることで、TEの核とICMの核を区別するこ
とができる。これらの切片では、TE細胞は胚盤胞表面の周囲に1細胞の厚みの輪
を形成し、ICM細胞は胚胞腔に細胞のやや厚い蓄積がみられる。またICMの核は相
互に近接している。さらにICM細胞は上下の切片では見えない。アルゴン-クリプ
トンレーザー（TUNEL染色）およびUVレーザー（ヘキスト、全DNA）で得た切片を
積み上げることで、どの核がアポトーシスを起こし、かつこのような核がTE細胞
かICM細胞のものであるのかを区別した。

【００６４】計107個のアカゲザル胚を分割して368個の多胎胚を作製した。図1Aでは8細胞
期胚を分割して、一組の同一の四胎胚を作製した。この胚は各2個の卵割球を含
む。透明体のない8細胞期胚を分離して個々の卵割球とした（図1B）。各卵割球
は顕微操作（図1C）で扱い、2個の卵割球を空の透明帯に挿入して（図1D）、一
組の四胎胚を作製し（図1E）、インビトロで培養した（図1F）。1対の四胎胚を
妊性の種畜と証明された2匹の代理に移植した後に、両代理は妊娠した。1匹の代
理（図1G）は超音波検査で「枯死」妊娠すなわち胎盤嚢に胎児組織がみられない
妊娠であることが判明した。PCR法によるマイクロサテライトを指標とした血統
解析から、それが健康な雌と遺伝学的に同一であることがわかる。

【００６５】健康な四胎胚の雌が、問題のない妊娠器官を経て157日目に生まれた（Hewitso
nら、5 NATURE MED. 431〜33 （1999）；Tarantalら、15 AM. J. PRIMAT. 309
（1988））。胚分割および代理への移入後における妊娠の開始は31％の頻度でみ
られ（対照の53.3％に対して4/13の成功率）、1匹は双胎胚の移入後に生化学的
な妊娠であることがわかり（妊娠30日前に流産した）、1匹は生化学的な四胎胚
の妊娠が明らかとなり（図1G）、かつ1匹は生きた四胎胚の児であった（図1H）
。双胎胚を移植した4匹目の代理では絨毛性ゴナドトロピン量の上昇が認められ
た。多胎胚の13例の移入による4例の妊娠（31％）のうち、胎児嚢を示したのは1
例のみで、生産は1匹であった（8％）。対照でみられた8例の妊娠（53％）とは
対照的に、対照では胎児嚢を示したのは10例（66％；双胎のため）で、生産は6
匹であった（40％）。着床の証拠が得られたにもかかわらず、妊娠失敗が高率で
あった要因には以下が含まれうる：「ドナーとなった」透明体の破損（ただし透
明体の「穿孔」は着床率を上げるために臨床的に行われる）；顕微操作段階（た
だしICSI用の胚は直接的な精子微量注入後に高率で成長する）；卵割球分離中に
生じた損傷；アカゲザルの季節性；およびおそらく最も可能性が高い、より小さ
な多胎胚内には細胞がほとんどないこと。

【００６６】胚盤胞細胞の配分は、対照と分割時では異なっていた（図2）。胚細胞は、栄
養外胚葉（TE；胚体外膜の前駆体）、または内部塊細胞（ICM；胎児および胚体
外膜）の2つの運命のいずれか一方を有する。共焦点画像法および3次元再構築に
より、分割体の芽細胞では6±2.6のICMおよび51.2±30.0のTEであったのに対し
、IVFによる胚盤胞では13.2±4.8のICMおよび122.6±52.1のTEであることが判明
した（図2）。注目すべき点は、霊長類の胚盤胞がマウスと同様に左右対称性を
示したことであり、これは第1減数分裂軸がICMと割腔を隔てる胚板、およびおそ
らくは原腸形成時の板を指定することを示唆している。

【００６７】 ICM細胞数およびTE細胞数が減少することで娘細胞が少なくなり、そのために
着床率および胎児発生が影響を受ける可能性がある。TUNELアッセイ法により、
多胎胚でアポトーシスが比例的に多く起こること、かつ多胎胚のICM細胞で最高
となることが明らかとなった（対照の13.2±7.7％に対して39.9±35.3％）。こ
れは、TE細胞は着床能力をもつもののICM細胞が極めて少ないことが生存胚の産
生を減じることから、流産の原因となる可能性がある。

【００６８】妊娠は四胎胚で確立し、7胎胚はインビトロで胚盤胞を形成する能力を保持し
ており、ICM細胞は生存していた。総合すると、多胎胚の59％に胚細胞緊密化が
認められたが、胚盤胞形成能力を保持していた多胎胚はわずか12％であった。大
部分の胚は精液注入後の40時間〜48時間で分割され、第2分裂〜第4分裂の範囲、
すなわち4〜16細胞期の胚の状態であった。着床前の発生の結果を表1に示す。

【００６９】

【表１】着床前の発生 CM：胚細胞緊密化；Bl：胚盤胞表1：分割胚のインビトロにおける着床前の発生ドナー胚の細胞期、再構築された同一物の数、ならびに胚細胞緊密化状態の桑
実胚（CM）および胚盤胞形成（BF）の割合。総数：一部が胚細胞緊密化前に凍結
されていたことから、元の胚は107個未満、かつ多胎胚は368個未満。

【００７０】胚細胞緊密化および胚盤胞の成功率は後期に低下した（図3および表1、前掲）
。また個々の再構築胚の発生能力は、高次の多胎胚を任意の1個の胚から作製す
る場合に低下した（図4）。2個の胚を1個の胚から再構築した時には、胚細胞緊
密化率は高く（94％、n=32）、胚盤胞形成率は28％であった（n=18）。興味深い
ことに、再構築胚は対照と比べてやや早く胚細胞が緊密化し、これは胚の細胞数
よりはむしろ、内因性の経時的時計および/または細胞周期時計の存在を示唆し
ている。胚の移行に対する母体側の分子レベルにおける調節は、ヒトおよび他の
霊長類では第2分裂と第3分裂の間（すなわち4細胞期〜8細胞期；Koford ら、4 F
OLIA PRIMATOL. 221〜226 （1966）；Braudeら、322 NATURE 459〜61 （1988）
）に生じると考えられており、今回本明細書においてインビトロで、ならびに天
然にみられる全能性の喪失と一致している。このような卵割はまた、TEまたはIC
Mへ進む細胞運命を指定する可能性がある（Flemingら、4 ANN. REV. CELL BIOL.
459〜485 （1988））。霊長類の一卵性双胎の出現は自然界ではまれであり、例
えばアカゲザルで0.22％であり、ヒトでは0.6％未満であるが（Benirschke、「
生殖の百科事典（ENCYCLOPEDIA OF REPRODUCTION）、E. KnobilおよびJ.D. Neil
l編（Academic出版、ニューヨーク、1999）、第4巻、887〜891ページ）、ただ
し例外的に一部のアルマジロでは多胚形成により常に一卵性の四胎が生まれる。
哺乳類にみられる無性生殖のこのような例外、すなわち1個の受精卵からの多胎
が出まれることは、少なくともこの種においては発生の4細胞期において全能性
が失われる可能性があることを示唆している。

【００７１】実施例2．胚性幹細胞の作製胚性幹細胞（ES細胞）は以下の方法で分割胚から樹立される。胚の分離後に、
2個〜4個の卵割球をマウス胚繊維芽細胞（MFF）に由来する単層の支持細胞を含
むマイクロウェル中で培養する。次に残りの胚を空の透明体に移して、実施例1
で説明したように胚を再構築する。ES細胞系を単離し培養するこの共培養系は、
当技術分野で公知である（例えばThomsonら、92 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 7
844〜48 （1995）；Ouhibiら、40 MOL. REPROD. DEV. 311〜24 （1995）を参照
）。支持細胞が、幹細胞分化を阻害する増殖因子様の白血病阻害因子（LIF）を
提供することが報告されている。このマイクロウェルは5〜10 μlの培養液（基
礎培地として80％ DMEM、20％ FBS、1 mM βメルカプトエタノール、1000 ユニ
ット/mlのLIF、非必須アミノ酸、およびグルタミン）を含む。次に細胞を5％ CO₂ 環境で37℃でインキュベートし、ミネラルオイルで表面を覆う。毎日新鮮な培
地と交換し、卵割球の生存は細胞分裂により判断する。初期培養中に、細胞がME
F単層に接着してコロニー形成が認められるまで、細胞塊を機械的に分離する。
次にコロニーを4ウェルプレートに移し、続いて35 mmのディッシュに移して、安
定な細胞系が樹立するまで徐々に培養を拡張してゆく。分離させた卵割球の培養
に加えて、再構築した胚についても、胚盤胞期に至るまで培養する。ハッチ（ha
tch）胚盤胞すなわち透明体のない胚盤胞をマイクロウェル中のMEF単層上で上述
の通りに培養する。卵割球を分離する代わりに、胚盤胞をMEF単層に接着させる
。胚盤胞がMEFに接着した時点でICM細胞を機械的に分離し、新鮮な培地を満たし
たウェルへ移す。胚細胞を上述の通りに培養し、細胞の増殖を個々のコロニーが
認められるまで続ける。クローン増殖した個々のコロニーを選択する。このクロ
ーン増殖および増殖過程を、クローン細胞が樹立するまで続ける。

【００７２】未受精卵母細胞に偽性レトロウイルスベクターを感染させることで、トランス
ジェニックの非ヒト霊長類の作製が成功している。このような方法は、参照とし
て明確に本明細書に組み入れられる、同時係属中の米国特許出願第09/736,271号
に開示されている。導入遺伝子の存在はトランスジェニックサルのすべての組織
で証明されており、これは、初期の組込みが、おそらく母体の染色体において受
精前に起きたことを示唆している。トランスジェニックの胚性幹細胞系を作る際
には、偽感染により作製されたトランスジェニック胚を、クローン胚作製段階に
ついて上述した手順で分離させる。次にこのような分割胚を用いて、クローンの
子孫を作製するか、またはその胚の相対物（counterpart）を用いて、トランス
ジェニックの胚性幹細胞系を作製する。したがって、トランスジェニックの子孫
およびトランスジェニックの胚性幹細胞系は、卵母細胞期に成された同じ遺伝的
改変を共有する。

【００７３】本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本発明の方法および系につい
てさまざまな改変および変更がなされることは、当業者には明らかであると考え
られる。本発明は、特定の好ましい態様について記載されているが、請求する発
明が、そのような特定の態様に過度に制限されるべきではないと理解されるべき
である。実際に、当業者に公知の本発明の実施に関して記載された様式のさまざ
まな改変は、添付の特許請求の範囲内であることを意図している。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ-Ｈ】インビトロおよび胚移植後の、霊長類の胚分割および発生
。

【図１Ａ-Ｂ】インビトロで受精させた、透明体を含まない8細胞期のアカ
ゲザル胚を、Ca²⁺およびMg²⁺を含まない培地中で機械的に破壊することで8個の
個々の卵割球に分離させた。

【図１Ｃ-Ｅ】分離した2個の卵割球を4個の空の透明体にそれぞれ移すこ
とで、4個の四胎胚を作製し、それぞれが元の8個の細胞のうち2個を有した。こ
れらの胚をバッファローラット（Buffalo Rat）肝臓細胞単層上で培養した。複
数の胚は発生および構造の正常性について毎日記録した。

【図１Ｆ】胚細胞緊密化の徴候を示す胚を、分割の1日〜3日後に移植のた
めに選択した。内分泌プロフィールを毎日追跡し、着床は超音波により移入後31
日目に確認した。

【図１Ｇ】胎盤は正常に見えるものの胎児が存在しない異常な四胎妊娠。

【図１Ｈ】胎児の発生が正常で、正常な雌が誕生した四胎妊娠。A〜Fのバ
ー＝120 μm；GとHのバー＝5 cm。

【図２】栄養外胚葉細胞と内部細胞塊細胞への胚細胞の配分は、対照と比
べて多胎胚では低かった。胚盤胞期における対照の細胞数は多胎胚の細胞数の2
倍であった。アカゲザルの分割胚は、対照と同様の時点において胚細胞緊密化お
よび、胚盤胞の形成がなされた。

【図３】胚細胞緊密化および胚盤胞形成の成功率。再構築胚の発生能力は
、進行期の胚を分割した場合には低くなる。双胎に分割した胚では、三胎胚およ
びそれ以上に分割した胚と比べて、胚細胞緊密化および胚盤胞形成の割合が高い
。

【図４】各再構築した胚の発生能力。高次の多胎胚は低い発生能力を示し
た。胚細胞緊密化率は、3個またはそれ以上の胚を作製したときにわずかな低下
がみられたものの、高次の分割においても維持された。胚細胞緊密化とは異なり
、胚盤胞形成率は、高次の分割に対する感受性はより強かった。胚盤胞形成率は
、2個の胚を作製した時より3個の胚を作製した時に半分に低下し、六胎を越える
分割を試みたところ発生は停止した。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年７月９日（２００２．７．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 11/00 11/00 15/00 15/00 25/00 25/00 27/02 27/02 35/00 35/00 37/00 37/00 43/00 １０５ 43/00 １０５Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者チャンアンソニーダブリュ．エス．アメリカ合衆国オレゴン州アロハナンバー 329 エスダブリュマスターズループ 4589 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA08 QA19 QQ08 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR55 QR62 QS32 QS34 QX01 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC12 AC20 BA01 BD12 CA44 4C084 AA13 MA67 NA14 ZA011 ZA331 ZA361 ZA811 ZB071 ZB261 ZC031 ZC211 ZC521 4C087 AA01 AA02 BB57 BB63 NA14 ZA01 ZA33 ZA36 ZA81 ZB07 ZB26 ZC03 ZC21 ZC52

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の段階を含む、動物のクローンを作製する（cloning）
方法：胚から卵割球を分離する段階；該卵割球を空の透明体（zonae）に移す段階；該卵割球を胚期（embryonic stage）まで培養する段階；該胚を代理（surrogate）の雌の輸卵管に移す段階；および分娩によりクローン動物を作製する段階。
【請求項２】動物が哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類からなる
群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】動物が霊長類である、請求項2記載の方法。
【請求項４】動物が非ヒト霊長類である、請求項3記載の方法。
【請求項５】非ヒト霊長類がサルである、請求項4記載の方法。
【請求項６】胚が4〜8細胞期である、請求項1記載の方法。
【請求項７】胚がトランスジェニックである、請求項1記載の方法。
【請求項８】代理の雌に移す前に胚が凍結され、かつ保存される、請求項
1記載の方法。
【請求項９】分離させた卵割球から胚性幹細胞を作製する段階をさらに含
む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】分離させた卵割球から胚性幹細胞を作製する段階をさらに
含む、請求項7記載の方法。
【請求項１１】請求項1記載の方法に従って作製される動物。
【請求項１２】動物が霊長類である、請求項11記載の動物。
【請求項１３】動物が非ヒト霊長類である、請求項12記載の動物。
【請求項１４】請求項7記載の方法に従って作製される動物。
【請求項１５】動物が霊長類である、請求項14記載の動物。
【請求項１６】動物が非ヒト霊長類である、請求項15記載の動物。
【請求項１７】以下の段階を含む、胚性幹細胞を作製する方法：胚から卵割球を分離する段階；および該卵割球を培養して幹細胞系を作製する段階。
【請求項１８】胚性幹細胞が霊長類の胚性幹細胞である、請求項17記載の
方法。
【請求項１９】霊長類の胚性幹細胞が非ヒト霊長類の胚性幹細胞である、
請求項18記載の方法。
【請求項２０】胚性幹細胞がトランスジェニックの胚性幹細胞である、請
求項17記載の方法。
【請求項２１】トランスジェニックの胚性幹細胞がトランスジェニック霊
長類の胚性幹細胞である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】トランスジェニック霊長類の胚性幹細胞がトランスジェニ
ック非ヒト霊長類の胚性幹細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】請求項17記載の方法に従って作製される胚性幹細胞。
【請求項２４】胚細胞貯蔵所（repository）に保存される、請求項23記載
の胚性幹細胞。
【請求項２５】遺伝子治療に使用される、請求項23記載の胚性幹細胞。
【請求項２６】ヒトの疾患のための治療として使用される、請求項23記載
の胚性幹細胞。
【請求項２７】ヒトの疾患が、心血管疾患、神経疾患、生殖障害、癌、眼
疾患、内分泌障害、肺疾患、代謝障害、遺伝病、自己免疫異常、および老化から
なる群より選択される、請求項26記載の胚性幹細胞。
【請求項２８】請求項18の方法で作製される胚性幹細胞。
【請求項２９】胚細胞貯蔵所に保存されている、請求項28記載の胚性幹細
胞。
【請求項３０】遺伝子治療に使用される、請求項28記載の胚性幹細胞。
【請求項３１】ヒトの疾患の治療に使用される、請求項28記載の胚性幹細
胞。
【請求項３２】ヒトの疾患が、心血管疾患、神経疾患、生殖障害、癌、眼
疾患、内分泌障害、肺疾患、代謝障害、遺伝病、自己免疫異常、および老化から
なる群より選択される、請求項31記載の胚性幹細胞。
【請求項３３】請求項19記載の方法に従って作製される胚性幹細胞。
【請求項３４】胚細胞貯蔵所に保存される、請求項33記載の胚性幹細胞。
【請求項３５】遺伝子治療に使用される、請求項33記載の胚性幹細胞。
【請求項３６】ヒトの疾患のための治療として使用される、請求項33記載
の胚性幹細胞。
【請求項３７】ヒトの疾患が、心血管疾患、神経疾患、生殖障害、癌、眼
疾患、内分泌障害、肺疾患、代謝障害、遺伝病、自己免疫異常、および老化から
なる群より選択される、請求項36記載の胚性幹細胞。
【請求項３８】請求項20記載の方法に従って作製される胚性幹細胞。
【請求項３９】胚細胞貯蔵所に保存される、請求項38記載の胚性幹細胞。
【請求項４０】遺伝子治療に使用される、請求項38記載の胚性幹細胞。
【請求項４１】ヒトの疾患のための治療として使用される、請求項38記載
の胚性幹細胞。
【請求項４２】ヒトの疾患が、心血管疾患、神経疾患、生殖障害、癌、眼
疾患、内分泌障害、肺疾患、代謝障害、遺伝病、自己免疫異常、および老化から
なる群より選択される、請求項41記載の胚性幹細胞。
【請求項４３】請求項21記載の方法に従って作製される胚性幹細胞。
【請求項４４】胚細胞貯蔵所に保存される、請求項43記載の胚性幹細胞。
【請求項４５】遺伝子治療に使用される、請求項43記載の胚性幹細胞。
【請求項４６】ヒトの疾患の治療に使用される、請求項43記載の胚性幹細
胞。
【請求項４７】ヒトの疾患が、心血管疾患、神経疾患、生殖障害、癌、眼
疾患、内分泌障害、肺疾患、代謝障害、遺伝病、自己免疫異常、および老化から
なる群より選択される、請求項46記載の胚性幹細胞。
【請求項４８】請求項22記載の方法に従って作製される胚性幹細胞。
【請求項４９】胚細胞貯蔵所に保存される、請求項48記載の胚性幹細胞。
【請求項５０】遺伝子治療に使用される、請求項48記載の胚性幹細胞。
【請求項５１】ヒトの疾患のための治療として使用される、請求項48記載
の胚性幹細胞。
【請求項５２】ヒトの疾患が、心血管疾患、神経疾患、生殖障害、癌、眼
疾患、内分泌障害、肺疾患、代謝障害、遺伝病、自己免疫異常、および老化から
なる群より選択される、請求項51記載の胚性幹細胞。
【請求項５３】胚について着床前遺伝子診断を行う段階をさらに含む、請
求項1記載の方法。
【請求項５４】着床前遺伝子診断が、雌の代理の輸卵管へ移す前に行われ
る、請求項53記載の方法。
【請求項５５】着床前遺伝子診断が、PCR、FISH、SSCP、RFLP、PRINS、CG
H、COMET解析、ヘテロ二本鎖解析、サザン解析、およびDGGE解析からなる群より
選択される、請求項54記載の方法。
【請求項５６】以下の段階を含む、胚の着床前遺伝子診断法：胚から卵割球を分離する段階；および胚の着床前に該卵割球について遺伝子解析を行う段階。
【請求項５７】胚を雌の代理に移植する、請求項56記載の方法。
【請求項５８】遺伝子解析が、PCR、FISH、SSCP、RFLP、PRINS、CGH、COM
ET解析、ヘテロ二本鎖解析、サザン解析、およびDGGE解析からなる群より選択さ
れる、請求項56記載の方法。
【請求項５９】卵割球が凍結される、請求項1記載の方法。
【請求項６０】卵割球が貯蔵所に保存される、請求項59記載の方法。