TWI481716B - 發展成豬的重組胚囊、豬胎兒及仔豬之培育方法 - Google Patents

Description

發展成豬的重組胚囊、豬胎兒及仔豬之培育方法

本發明相關於一種發展成豬的重組胚囊之培育方法、豬胎兒之培育方法以及仔豬之培育方法。

生物的複製技術係以人工無性繁殖個體，此技術可創造出遺傳物質完全相同之生物群組。最早的複製動物技術為核移置技術，係取自早期胚胚葉細胞為供核細胞，然而核移置技術發育受限於早期胚胚葉細胞數目有限。而後發展利用體細胞為供核細胞的體細胞核轉置技術，最具代表的成功例子為以分化的乳腺上皮細胞作為供核細胞的桃莉羊。體細胞核轉置技術已被用於複製生產經過篩選較佳的家禽家畜、可分泌製造醫藥用蛋白之轉殖動物、用於器官移植之基因轉殖動物等用途。除了靈長類以外，豬的解剖構造及各組織器官的生理功能在哺乳動物中較接近人類，且所產製之同胞及非同胞豬隻細胞核中所帶的遺傳物質完全相同，因此複製豬無論在應用及基礎科學研究上均有極大之發展價值，尤其在以基因轉殖豬作為醫藥工廠及 豬器官應用於人體之異種器官移植研究上具有潛力。

體細胞核轉置技術的步驟為：取得供核細胞和卵母細胞後，去除卵母細胞核質的部分，核質的部分包含染色體和第一極體。將供核細胞注入去核卵母細胞的卵黃膜腔或直接注入卵質中以形成重組胚，再將重組胚激活和體外培養後，將重組胚移置至孕母，經過分娩後，進行DNA分析確認所得幼仔為複製動物。其中，去除卵母細胞核質的成功與否，將決定重組胚後續發育能力。去除豬卵母細胞核質的部分目前普遍的做法是經由顯微操作以壓擠和吸除兩種方法，但顯微操作法的顯微操作微管設備昂貴、顯微操作人員需高度熟練且具有極佳的操作技巧，所耗費時間及人力成本十分可觀。此外，顯微操作法必須使用高品質的卵母細胞，才能得到可接受的成功率。因此以化學方式實施大量去除卵母細胞核質的方法便被廣泛研究，但因為化學方式需配合減數分裂的時機，去除卵母細胞核質、卵母細胞與供核細胞融合和重組胚激活等步驟的順序及時間必需精密地控制，在實務操作上也需耗費大量的時間和繁複的步驟。

利用體細胞核轉置技術進行複製豬之產製雖已被成功建立，但因重組囊胚的品質不良而產製效率迄今仍然甚低。重組囊胚品質不良主要原因為重組胚的在程式化不完全而導致囊胚率低，以及發育為重組囊胚後整體細胞數目太少影響後續發育能力。整體細胞包含內細胞團和滋養層細胞，其中內細胞團為早期幹細胞的來源之一，可以形 成除了滋養母細胞以外的任何類型組織。此外，如果重組胚處於不良的環境條件下，計畫性細胞死亡會被啟動以保護重組胚，而導致整體細胞數凋亡而降低。因此生產高品質的重組囊胚為提高現今複製豬低產製效率的重要策略。

綜合上述，本發明提供一種發展豬的重組胚囊之培育方法、豬胎兒之培育方法以及仔豬之產製培育方法，使用更簡便的方法去除卵母細胞核質以產製重組胚，再以胚聚合的方式生產高品質的重組囊胚。

依據本發明之一實施方式，本發明是一種具有發展豬的重組囊胚之培育方法。包括下列步驟：提供至少二個豬卵母細胞。利用分切刀具將卵母細胞分切為至少二個卵母細胞核質和至少二個卵母細胞質。再提供豬一供核細胞。將供核細胞與其中一個卵母細胞質進行第一次融合成一重組胚。再將重組胚與另一個卵母細胞質進行第二次融合成為二次重組胚，再將此二次重組胚進行激活處理。二次重組胚培養至四細胞期後，將複數個四細胞重組胚聚合成一高品質重組囊胚。

藉此，本發明可利用來自屠宰場品質良莠不齊的豬卵巢，以手工操作分切刀具去除卵母細胞核質的部分，和以往以顯微操作微管設備去除卵母細胞核質相比，不但少了兩次顯微操作步驟(未受精卵去核和引入供核細胞)，基本儀器設備成本僅需六分之一，人力也可減為三分之一。和 化學方式去除卵母細胞核質相比，也少了繁複的步驟而更簡便和高效率。另外，本發明供核細胞卵母細胞質進行兩次融合，所形成的二次重組胚比以傳統複製技術所產生的重組胚具有更多卵母細胞質，能提高二次重組胚的存活率和後續的發育完整。此外，本發明聚合複數個遺傳物質完全相同的四細胞重組胚，使整體細胞數目增加以改善豬重組胚的囊胚發育。並確定重組囊胚後續的發展能力，以產生高品質的重組囊胚。

依據本發明之又另一實施方式，本發明是一種豬胎兒之培育方法，包括下列步驟：提供豬之至少二個卵母細胞。利用分切刀具將卵母細胞分切為至少二個卵母細胞核質和至少二卵母個細胞質。再提供豬之一供核細胞。將供核細胞與其中一個卵母細胞質進行第一次融合成一重組胚。再將重組胚與另一個卵母細胞質進行第二次融合成一二次重組胚。將二次重組胚進行激活處理。二次重組胚培養至四細胞期後，將複數個四細胞重組胚聚合成一重組囊胚，最後將重組囊胚移置入母豬生殖道中而形成豬胎兒。

依據本發明之再一實施方式，本發明是一種仔豬之培育方法，包括下列步驟：提供豬之至少二個卵母細胞。利用分切刀具將卵母細胞分切為至少二個卵母細胞核質和至少二卵母個細胞質。再提供豬之一供核細胞。將供核細胞與其中一個卵母細胞質進行第一次融合成一重組胚。再將重組胚與另一個卵母細胞質進行第二次融合成一二次重組胚。將二次重組胚進行激活處理。二次重組胚培養至四 細胞期後，將複數個四細胞重組胚聚合成一重組囊胚，最後將重組囊胚移置入母豬生殖道中而形成豬胎兒，並經過所有胎兒成長及分化期間而生育出正常的後代仔豬。

此外，前述之再一實施方式的供核細胞，可為遺傳物質未經改變或遺傳物質經改變的細胞。

藉此，本發明因具有更簡便的步驟和不需昂貴的儀器，本發明能普遍推廣做為育種之用，且能藉由供核細胞的替換，做為改進優良畜種和產製轉基因豬等用途。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

110‧‧‧步驟

120‧‧‧步驟

130‧‧‧步驟

140‧‧‧步驟

150‧‧‧步驟

160‧‧‧步驟

170‧‧‧步驟

210‧‧‧步驟

220‧‧‧步驟

230‧‧‧步驟

240‧‧‧步驟

250‧‧‧步驟

260‧‧‧步驟

270‧‧‧步驟

280‧‧‧步驟

310‧‧‧步驟

320‧‧‧步驟

330‧‧‧步驟

340‧‧‧步驟

350‧‧‧步驟

360‧‧‧步驟

370‧‧‧步驟

380‧‧‧步驟

410‧‧‧卵母細胞

411‧‧‧卵母細胞核質

412‧‧‧卵母細胞質

420‧‧‧供核細胞

430‧‧‧分切刀具

440‧‧‧重組胚

450‧‧‧二次重組胚

460‧‧‧四細胞重組胚

470‧‧‧重組囊胚

471‧‧‧1×胚聚合重組囊胚

472‧‧‧2×胚聚合重組囊胚

473‧‧‧3×胚聚合重組囊胚

480‧‧‧母豬

490‧‧‧仔豬

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施範例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖繪示本發明一實施方式之發展成豬之重組囊胚之培育方法之流程圖。

第2圖繪示本發明另一實施方式之豬胎兒之培育方法之流程圖。

第3圖繪示本發明再一實施方式之仔豬之培育方法之流程圖。

第4圖繪示第3圖之示意圖。

第5圖(a)(b)(c)部分為四細胞重組胚進行胚聚合之顯微照片圖；(d)部分為發育至重組囊胚之顯微照片圖。

第6圖繪示重組囊胚之細胞分佈圖。

第7圖(a)(b)(c)部分為重組囊胚之顯微照片圖；(d)(e)(f)部分為重組囊胚經細胞免疫螢光染色後之螢光顯微照片圖。

第8圖繪示表現多能性分化和計畫性細胞死亡之基因表現量圖。

第9圖繪示以3×胚聚合重組囊胚所產製豬之照片圖。

附件1為第7圖之彩色照片圖。

請一併參閱第1圖至第4圖。第1圖繪示發展成豬的重組胚囊之培育方法之流程圖。第2圖繪示豬胎兒之培育方法之流程圖。第3圖繪示仔豬之培育方法之流程圖。第4圖繪示豬之培育方法之示意圖。

具有發展成豬的重組囊胚470之培育方法，步驟如下所述。步驟110，提供豬之至少二個卵母細胞410。步驟120，利用分切刀具430將卵母細胞410分切為至少二個卵母細胞核質411和至少二個卵母細胞質412。步驟130，再提供豬之一供核細胞420。步驟140，將供核細胞420與其中一個卵母細胞質412進行第一次融合成一重組胚440。步驟150，再將重組胚440與另一個卵母細胞質412進行第二次融合成一二次重組胚450。步驟160，將二次重組胚450進行激活處理。步驟170，二次重組胚450培養至四細胞期 後，將複數個四細胞重組胚460聚合成一重組囊胚470。

豬胎兒之培育方法，步驟如下所述。步驟210，提供豬之至少二個卵母細胞410。步驟220，利用分切刀具430將卵母細胞410分切為至少二個卵母細胞核質411和至少二個卵母細胞質412。步驟230，再提供豬之一供核細胞420。步驟240，將供核細胞420與其中一個卵母細胞質412進行第一次融合成一重組胚440。步驟250，再將重組胚440與另一個卵母細胞質412進行第二次融合成一二次重組胚450。步驟260，將二次重組胚450進行激活處理。步驟270，二次重組胚450培養至四細胞期後，將複數個四細胞重組胚460聚合成一重組囊胚470。步驟280，將重組囊胚470移置入母豬480生殖道中而形成豬胎兒。

豬之培育方法，步驟如下所述。步驟310，提供豬之至少二個卵母細胞410。步驟320，利用分切刀具430將卵母細胞410分切為至少二個卵母細胞核質411和至少二個卵母細胞質412。步驟330，再提供豬之一供核細胞420。步驟340，將供核細胞420與其中一個卵母細胞質412進行第一次融合成一重組胚440。步驟350，再將重組胚440與另一個卵母細胞質412進行第二次融合成一二次重組胚450。步驟360，將二次重組胚450進行激活處理。步驟370，二次重組胚450培養至四細胞期後，將複數個四細胞重組胚460聚合成一重組囊胚470。步驟380，將重組囊胚470移置入母豬480生殖道中而形成豬胎兒，並經過所有胎兒成長及分化期間而生育出仔豬490。

下列實驗例用於示範說明本發明，係用以有利於本發明所屬技術領域中具有通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制，但用於如何實施本發明的材料及方法。

實驗例1：卵母細胞410之取得與體外成熟培養。

本實驗例所使用之卵巢，係採自屠宰場所屠宰之三品種雜交〔藍瑞斯(Landrace)公豬與杜洛克(Duroc)×約克夏(Yorkshire)雜交母豬，LYD〕女豬。豬隻於屠宰後即儘速取出其卵巢，將卵巢暫存於30~35℃含1%抗生素(penicillin)之生理食鹽水中，在2小時內攜回實驗室。於室溫下以注射針筒直接吸取直徑2~6mm之濾泡，將濾泡液及卵丘卵母細胞複合體懸浮於培養皿所盛之磷酸緩衝溶液(Dulbecco's phosphate buffered saline,DPBS)中。此懸浮液進一步被匯集於玻璃試管中靜置沈澱，其下層沈澱物經再度稀釋後，移置於立體顯微鏡下鏡檢，收集形態完整結實之卵丘卵母細胞複合體。經收集之卵丘卵母細胞複合體，重複經DPBS清洗後，浸置於100μl含10%豬卵巢濾泡液、10%胎牛血清及含10IU/mL人類絨毛膜激性腺素和10IU/mL孕馬血清激性腺素的激性腺素之基礎成熟培養液(TCM-199)中。再培養於39℃、5% CO₂ 飽和相對溼度之培養箱中。在41~42小時體外成熟培養後，將卵丘卵母細胞複合體移置500μl含1mg/mL玻尿酸酶之DPBS中，以玻璃針重複吸放含1mg/mL玻尿酸酶之DPBS以去除卵丘細 胞。再於解剖顯微鏡下找尋具有明顯第一極體之卵母細胞410做為後續實驗所需之材料。

實驗例2：供核細胞420之製備。

供核細胞420為取自迷你豬之豬耳皮膚成纖維母細胞。供核細胞420以含10%胎牛血清之基本培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)培養於39℃、5% CO₂ 飽和相對溼度之培養箱中。經過3次細胞繼代培養後，將細胞以含30%胎牛血清和10%DMSO(dimethylsulf-oxide)之DMEM長期冷凍保存於液態氮(-196℃)中。供核細胞420在與卵母細胞質412進行融合前一周，將前述凍存於液態氮之供核細胞420取出解凍，以含10%胎牛血清之DMEM培養於39℃、5% CO₂ 飽和相對溼度之培養箱中。在與卵母細胞質412進行融合前2天，將供核細胞420之培養基更換為含0.25%胎牛血清之DMEM進行飢餓培養。在與卵母細胞質412融合前，將供核細胞420以胰蛋白酶作用5分鐘使細胞團塊懸浮。將懸浮的細胞移至T10〔含10%胎牛血清之HEPES-TCM-199(以HEPES緩衝之TCM-199)〕中於室溫靜置1小時。

實驗例3：孤雌激活胚與二次重組胚450之產製。

孤雌激活胚之產製步驟如下：將第一極體明顯之卵母細胞410以電激活液〔含0.3M mannitol,0.1mM MgSO₄ ,0.1mM CaCl₂ and 0.01% polyvinyl alcohol(PVA)〕清洗兩次後，移入含有電激活液兩極為1mm寬之電激活槽內，應用電激活激活操作器施予一次電場強度2.2kv/cm之直流電 激，電激時間為30微秒，隨後將已激活後之卵母細胞410置回培養液中，5-10分鐘後移入激活培養液〔含2.5mM激酶抑制劑(6-dimethylamino purine,6-DMAP)〕中培養4小時。最後以體外培養液(porcine zygote medium-3,PZM-3)清洗3次後，置於39℃、5% CO₂ 飽和溼度之培養箱中培養7天。

重組胚440之產製步驟如下：將第一極體明顯且仍具有透明帶之卵母細胞410培養於含3.3mg/mL鍊黴蛋白酶和33%胎牛血清之HEPES-TCM-199中20秒以去除卵母細胞410之透明帶，再以T10清洗2次，卵母細胞410清洗後，以10個卵母細胞410在一個40μ l液滴的比例，一字排開在40μ l含有2.5mg/mL細胞鬆弛素B(cytochalasin B)之T10中。於立體顯微鏡下以微刀片將卵母細胞410分切為包含第一極體和染色質的卵母細胞核質411和卵母細胞質412兩部分。將分切後的卵母細胞質412以T10清洗2次。後續進行兩次卵母細胞質412與供核細胞420的融合。在第一次融合步驟，將卵母細胞質412移至含1mg/mL植物血球凝集素(phytohaemagglutinin,PHA)之HEPES-TCM-199中5秒後，使卵母細胞質412與供核細胞420以一比一成對並培養於含0.3M mannitol and 0.01% PVA之融合培養基中20秒，再移至兩極為1mm寬之電激活槽內。應用電激活激活操作器施予一次電場強度2.0kv/cm之直流電激，電激時間為9微秒，使卵母細胞質412與供核細胞420融合為重組胚440，隨後將重組胚440置回 T10中培養1小時後，同時進行第二次融合和電激活步驟。將重組胚440與另一個卵母細胞質412以一比一成對置於電激活液(含0.3M mannitol,0.1mM MgSO4,0.1mM CaCl2 and 0.01% PVA)中，再移至電激活槽內，施予一次電場強度0.85kv/cm之直流電激，電激時間為80微秒，使重組胚440與卵母細胞質412融和為二次重組胚450。隨後將二次重組胚450置於激活培養液中培養4小時。最後以PZM-3清洗3次後，每個二次重組胚450隨機個別培養於WOW(well-of-the-well)系統中。

再配合參照下列表一。

表一為孤雌激活胚與二次重組胚450包含卵裂率、囊胚率和整體細胞數之發育能力比較，其中重覆次數n=8。雖然二次重組胚450之囊胚率36.5%低於孤雌激活胚之囊胚率48.8%，但兩組在卵裂率和整體細胞數部分不具有顯著差異。

實驗例4：體外受精胚之產製。

體外受精胚之產製步驟如下：將0.25ml新鮮豬精液以含10%胎牛血清之DPBS清洗後，經300G離心力離心2分鐘，再重覆上述步驟乙次。精液經2次清洗後，使精子沉澱懸浮於mTBM(modified Tris-buffered medium)中，置於於39℃、5% CO₂ 飽和溼度之培養箱中體外成熟培養44 小時，以供後續體外受精用。在產製體外受精胚前，將卵丘卵母細胞複合體以玻璃針重覆吸放含0.1%玻尿酸酶去除卵丘細胞，並以mTBM清洗卵母細胞410 3次，將卵母細胞410置於39℃、5% CO₂ 飽和溼度之培養箱中培養至少12小時。再於解剖顯微鏡下找尋具有明顯第一極體之卵母細胞410做為後續實驗所需之材料。產製體外受精胚時，將20至30個卵母細胞410隨機的移置於45μl mTBM中，並覆蓋上預熱之礦物油，以製成卵母細胞410小滴。將體外成熟培養後之精子做適當的稀釋後，取5μl精子懸浮液加入每個卵母細胞410小滴中，使最終精液濃度為5×10⁵ 精子/mL。將卵母細胞410和精子混合均勻後，移入39℃、5% CO₂ 飽和溼度之培養箱中進行共培養。共培養6小時後，將卵母細胞410吸取至PZM-3中清洗3~4次，以移除包被外圍之精子。再將每20~30個卵母細胞410置於100ml PZM-3，覆蓋上礦物油後於39℃、5% CO₂ 飽和溼度之培養箱中培養7天。

實驗例5：二次重組胚450之培養和聚合。

二次重組胚450培養於WOW系統48小時後，此時為母源性基因表現轉為胚源控制時期，二次重組胚450已發育為四細胞重組胚460，將四細胞重組胚460以不同的細胞數目進行胚聚合。請參照第5圖(a)至(c)部分之顯微照片圖，分別為第5圖(a)部分，沒有進行胚聚合之四細胞重組胚460(1×)；第5圖(b)部分，以兩個四細胞重組胚460進行胚聚合(2×)；第5圖(c)部分，以三個四細胞重組胚460 進行胚聚合(3×)。將胚聚合後的四細胞重組胚460置於含3mg/mL牛血清白蛋白之PZM-3，覆蓋上礦物油後移入WOW系統，於39℃、5% CO₂ 飽和溼度之培養箱中再培養5天後，分別發育為1×胚聚合重組囊胚471、2×胚聚合重組囊胚472和3×胚聚合重組囊胚473。重組囊胚470之顯微照片圖請參照第5圖(d)部分。

再配合參照下列表二和第6圖。

表二為二次重組胚450在胚聚合後的發育狀況，其中2×和3×組別的囊胚率高於1×組別(分別為63.0%、73.6%和35.1%；P <0.05)。3×組別的整體細胞數也是三組中最多的(和2×和1×組別相比分別為126、86和55；P <0.05)。第6圖為重組囊胚470之細胞分佈圖，以整體細胞數為基準，將所有重組囊胚470分為整體細胞數<50、50-100和>100三個群組。如第6圖所示，在>100群組中3×胚聚合重組囊胚473佔了69.0%，比1×胚聚合重組囊胚471(2.5%)和2×胚聚合重組囊胚472(30.6%)加總後的兩倍還多。由表二和第6圖的數據顯示，胚聚合確實能提高二次重組胚450的囊胚率和重組囊胚470的整體細胞數。

實驗例6：重組囊胚470整體和分類細胞計算。

1×胚聚合重組囊胚471、2×胚聚合重組囊胚472和 3×胚聚合重組囊胚473以Hoechst 33342染細胞核作為計算整體細胞數的依據，並以細胞免疫螢光染色分別染內細胞團和滋養層細胞。再以倒立螢光顯微鏡計算整體細胞、內細胞團和滋養層細胞數目。

請參照第7圖和附件1，(a)和(d)部分為1×胚聚合重組囊胚471顯微照片和螢光顯微照片；(b)和(e)部分為2×胚聚合重組囊胚472顯微照片和螢光顯微照片；(c)和(f)部分為3×胚聚合重組囊胚473顯微照片和螢光顯微照片。在螢光顯微照片的部分，藍色的細胞代表內細胞團，粉紅-紅色的細胞代表滋養層細胞。

再配合參照下列表三。

表三為於倒立螢光顯微鏡下計算1×胚聚合重組囊胚471、2×胚聚合重組囊胚472和3×胚聚合重組囊胚473之內細胞團、滋養層細胞和整體細胞數後所得細胞配置情況。無論在整體細胞數、內細胞團數和滋養層細胞數方面，3×胚聚合重組囊胚473和2×胚聚合重組囊胚472皆比1×胚聚合重組囊胚471還多(分別為整體細胞數：132和97 vs.55；內細胞團數：35和25 vs.9；滋養層細胞數：98和73 vs.46；P <0.05)。而3×胚聚合重組囊胚473與2×胚聚合重組 囊胚472相比，在整體細胞數和滋養層細胞數上有顯著差異(P <0.05)。3×胚聚合重組囊胚473和2×胚聚合重組囊胚472在內細胞團/整體細胞的比例也高於1×胚聚合重組囊胚471(分別為26.1%和25.1% vs.15.3%；P <0.05)。由表三之數據顯示，胚聚合確實能提高重組囊胚470的細胞數，而且越多四細胞重組胚460進行胚聚合效果越顯著。

實驗例7：DNA損害偵測。

將培養至第7天的重組囊胚利用DNA斷裂端標記試驗(TUNEL assay)偵測重組囊胚470計畫性細胞死亡的程度。計畫性細胞死亡指標的計算方式如下：計畫性細胞死亡指標=(TUNEL染色陽性細胞核數/全部細胞核數)×100。

再配合參照下列表四。

表四為1×胚聚合重組囊胚471、2×胚聚合重組囊胚472和3×胚聚合重組囊胚473內計畫性細胞死亡的程度。在整體細胞數的部分，3×胚聚合重組囊胚473高於2×胚聚合重組囊胚472和1×胚聚合重組囊胚471(分別為126 vs.89和57；P <0.05)。相反的，在計畫性細胞死亡指標的部分，1×胚聚合重組囊胚471高於2×胚聚合重組囊胚472和3×胚聚合重組囊胚473(分別為4.7% vs.2.7%和2.2%；P <0.05)。表四數據顯示，胚聚合能降低重組囊胚470的計畫 性細胞死亡，而且越多四細胞重組胚460進行胚聚合效果越顯著。

實驗例8：表現多能性分化和計畫性細胞死亡之基因表現。

重組囊胚470的品質可以是否具備表現多能性分化之基因，以及計畫性細胞死亡之基因量表現來評估。本發明偵測代表多能性分化基因Oct4、Rex01 和Cdx2 以及計畫性細胞死亡基因Bcl-xL 和Bax 之基因表現量。將三組以不同數目進行胚聚合之四細胞重組胚460培養5天後，以及體外培養7天後之孤雌激活胚和體外受精胚，共五個組別胚胎以TRIzol試劑萃取總RNA，再以RNeasy Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA,USA)純化RNA。純化後的RNA以核酸定量光譜儀測量吸光值評估RNA濃度。每組RNA取19ng以反轉錄聚合酶連鎖反應取得cDNA後，將各組之cDNA以即時定量聚合酶連鎖反應，分別三重覆偵測表現多能性分化基因Oct4、Rex01 和Cdx2 以及計畫性細胞死亡基因Bcl-xL 和Bax 之基因表現。

五個組別在各基因之表現量請參照第8圖，數據先以β-actin表現量標準化後，再以體外受精胚基因表現量為基準，其他組別以倍數呈現。在與多能性分化相關之基因表現方面，各組Rex01 基因表現量無顯著差異；但在Oct4 基因，3×胚聚合重組囊胚473比1×胚聚合重組囊胚471和孤雌激活胚提高了基因表現(分別為1.51倍、0.66倍和0.70倍)，但在3×胚聚合重組囊胚473、2×胚聚合重組囊胚472 和體外受精胚這三組Oct4 基因表現量則無顯著差異；在Cdx2 基因，3×胚聚合重組囊胚473基因表現量(1.32倍)和體外受精胚相近，但與1×胚聚合重組囊胚471、2×胚聚合重組囊胚472和孤雌激活胚組別有顯著差異(分別為0.56倍、0.70倍和0.53倍)。在和計畫性細胞死亡相關之基因方面，各組別在Bcl-xL 基因表現量無顯著差異；相反的在Bax 基因表現量上，1×胚聚合重組囊胚471(1.41倍)和孤雌激活胚(1.24倍)明顯高於(P <0.05)2×胚聚合重組囊胚472(0.82倍)和3×胚聚合重組囊胚473(0.66倍)。由第7圖數據顯示，3×胚聚合重組囊胚473提高了多能性分化之基因表現量，又降低了計畫性細胞死亡之基因表現量，確實為高品質重組囊胚470。

實驗例9：重組囊胚470之胚移置。

將3×胚聚合後重組囊胚470和未進行胚聚合之重組囊胚470體外培養第5~6天後，以外科手術法移置母豬480之子宮角。母豬480為二品種雜交〔藍瑞斯(Landrace)×約克夏(Yorkshire)〕母豬480，並於胚移置前連續荷爾蒙給藥4~5天。胚移置後第21天，以腹部超音波判斷母豬480懷孕與否，之後每兩個星期都以腹部超音波確認豬胎兒發育。於懷孕第113天施打前列腺素F2α以刺激母豬480分娩生育仔豬490。請參照第9圖所示，為3×胚聚合重組囊胚473胚移置母豬480所產製之仔豬490，仔豬490品種和供核細胞420相同為迷你豬，而非與母豬480相同之二品種雜交〔藍瑞斯(Landrace)×約克夏(Yorkshire)〕。

再配合參照下列表五。

表五為胚聚合後之重組囊胚470發育為仔豬490之情形。在3×胚聚合重組囊胚473組別中，胚移置的4隻母豬480中共有2隻母豬480懷孕，懷孕率為50%。總共生育7隻仔豬490。而在1×胚聚合重組囊胚471組別中，胚移置的4隻母豬480皆未懷孕，懷孕率為0%。表五數據顯示，胚聚合確實能提高複製豬之產製率。

實驗例10：統計分析。

上述所使用的統計分析如下所述，將各組百分比數據先以正弦反函數轉換後，利用SAS軟體中變異數分析(ANOVA)方法以一般線性模式(General Linear Models,GLM)來檢定多個母體間的參數是否有差異，再以Tukey's test進行兩兩修正比較，當P值小於0.05時代表數據具有顯著意義。

本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定 本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

410‧‧‧卵母細胞

411‧‧‧卵母細胞核質

412‧‧‧卵母細胞質

420‧‧‧供核細胞

430‧‧‧分切刀具

440‧‧‧重組胚

450‧‧‧二次重組胚

460‧‧‧四細胞重組胚

470‧‧‧重組囊胚

480‧‧‧母豬

490‧‧‧仔豬

Claims (36)

1. 一種具有發展成豬的重組囊胚之培育方法，包括下列步驟：提供豬之至少二卵母細胞；利用一分切刀具將該些卵母細胞分切為至少二卵母細胞核質和至少二卵母細胞質；提供豬之一供核細胞；將該供核細胞與一該卵母細胞質進行第一次融合成一重組胚；將該重組胚與另一該卵母細胞質進行第二次融合成一二次重組胚；將該二次重組胚進行激活處理；將該二次重組胚培養至四細胞期；以及將複數個四細胞重組胚聚合成一重組囊胚。
2. 如請求項1所述具有發展成豬的重組囊胚之培育方法，其中，各該卵母細胞係為被一卵丘細胞完整包覆的一卵子，進行體外培養後以一玻尿酸酶去除該卵丘細胞。
3. 如請求項1所述具有發展成豬的重組囊胚之培育方法，其中，在利用該分切刀具將該些卵母細胞分切前，各該卵母細胞先培養於一操作液中去除一透明帶。
4. 如請求項1所述具有發展成豬的重組囊胚之培育 方法，其中，該供核細胞含有外源基因。
5. 如請求項4所述具有發展成豬的重組囊胚之培育方法，其中，該供核細胞進一步進行滿盤培養或血清飢餓培養。
6. 如請求項4所述具有發展成豬的重組囊胚之培育方法，其中，該供核細胞包含細胞株細胞、未株化初代細胞、體細胞、成體幹細胞、胚幹細胞或生殖細胞。
7. 如請求項4所述具有發展成豬的重組囊胚之培育方法，其中，該供核細胞為遺傳物質未經改變或遺傳物質經改變者。
8. 如請求項4所述具有發展成豬的重組囊胚之培育方法，其中，該供核細胞為經純化或未經純化者。
9. 如請求項1所述具有發展成豬的重組囊胚之培育方法，其中，各該卵母細胞核質具有一第一極體和該染色質。
10. 如請求項1所述具有發展成豬的重組囊胚之培育方法，其中，該供核細胞與該些卵母細胞質第一次融合及第二次融合係利用電融合。
11. 如請求項1所述具有發展成豬的重組囊胚之培育方法，其中，激活處理係電激活並將該二次重組胚培養於含激酶抑制劑6-DMAP之一激活培養液中。
12. 如請求項1所述具有發展成豬的重組囊胚之培育方法，其中，該些四細胞重組胚聚合時機為母源性基因表現轉為胚源控制時期之後。
13. 一種豬胎兒之培育方法，包括下列步驟：提供豬之至少二卵母細胞；利用一分切刀具將該些卵母細胞分切為至少二卵母細胞核質和至少二卵母細胞質；提供豬之一供核細胞；將該供核細胞與一該卵母細胞質進行第一次融合成一重組胚；將該重組胚與另一該卵母細胞質進行第二次融合成一二次重組胚；將該二次重組胚進行激活處理；將該二次重組胚培養至四細胞期；將複數個四細胞重組胚聚合成一重組囊胚；以及將該重組囊胚移置入一母豬生殖道中而形成一豬胎兒。
14. 如請求項13所述豬胎兒之培育方法，其中，該卵母細胞係為被一卵丘細胞完整包覆的一卵子，進行體外培養後以一玻尿酸酶去除該卵丘細胞。
15. 如請求項13所述豬胎兒之培育方法，其中，在利用該分切刀具將該些卵母細胞分切前，各該卵母細胞先培養於一操作液中去除一透明帶。
16. 如請求項13所述豬胎兒之培育方法，其中，該供核細胞含有外源基因。
17. 如請求項16所述豬胎兒之培育方法，其中，該供核細胞進一步進行滿盤培養或血清飢餓培養。
18. 如請求項16所述豬胎兒之培育方法，其中，該供核細胞包含細胞株細胞、未株化初代細胞、體細胞、成體幹細胞、胚幹細胞或生殖細胞。
19. 如請求項16所述豬胎兒之培育方法，其中，該供核細胞為遺傳物質未經改變或遺傳物質經改變者。
20. 如請求項16所述豬胎兒之培育方法，其中，該供核細胞為經純化或未經純化者。
21. 如請求項13所述豬胎兒之培育方法，其中，各該卵母細胞核質具有一第一極體和該染色質。
22. 如請求項13所述豬胎兒之培育方法，其中，該供核細胞與該些卵母細胞質第一次融合及第二次融合係利用電融合。
23. 如請求項13所述豬胎兒之培育方法，其中，激活處理係電激活並將該二次重組胚培養於含激酶抑制劑6-DMAP之一激活培養液中。
24. 如請求項13所述豬胎兒之培育方法，其中，該些四細胞重組胚聚合時機為母源性基因表現轉為胚源控制時期之後。
25. 一種仔豬之培育方法，包括下列步驟：提供豬之至少二卵母細胞；利用一分切刀具將該些卵母細胞分切為至少二卵母細胞核質和至少二卵母細胞質；提供豬之一供核細胞；將該供核細胞與一該卵母細胞質進行第一次融合成一重組胚；將該重組胚與另一該卵母細胞質進行第二次融合成一二次重組胚； 將該二次重組胚進行激活處理；將該二次重組胚培養至四細胞期；將複數個四細胞重組胚聚合成一重組囊胚；以及將該重組囊胚移置入一母豬生殖道中而形成一豬胎兒，並經過所有胎兒成長及分化期間而生育出一仔豬。
26. 如請求項25所述仔豬之培育方法，其中，該卵母細胞係為被一卵丘細胞完整包覆的一卵子，進行體外培養後以一玻尿酸酶去除該卵丘細胞。
27. 如請求項25所述仔豬之培育方法，其中，在利用該分切刀具將該些卵母細胞分切前，各該卵母細胞先培養於一操作液中去除一透明帶。
28. 如請求項25所述仔豬之培育方法，其中，該供核細胞含有外源基因。
29. 如請求項28所述仔豬之培育方法，其中，該供核細胞進一步進行滿盤培養或血清飢餓培養。
30. 如請求項28所述仔豬之培育方法，其中，該供核細胞包含細胞株細胞、未株化初代細胞、體細胞、成體幹細胞、胚幹細胞或生殖細胞。
31. 如請求項28所述仔豬之培育方法，其中，該供核細胞為遺傳物質未經改變或遺傳物質經改變者。
32. 如請求項28所述仔豬之培育方法，其中，該供核細胞為經純化或未經純化者。
33. 如請求項25所述仔豬之培育方法，其中，各該卵母細胞核質具有一第一極體和該染色質。
34. 如請求項25所述仔豬之培育方法，其中，該供核細胞與該些卵母細胞質第一次融合及第二次融合係利用電融合。
35. 如請求項25所述仔豬之培育方法，其中，激活處理係電激活並將該二次重組胚培養於含激酶抑制劑6-DMAP之一激活培養液中。
36. 如請求項25所述仔豬之培育方法，其中，該些四細胞重組胚聚合時機為母源性基因表現轉為胚源控制時期之後。