CN116761894A - 胚胎孪生化方法 - Google Patents
胚胎孪生化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116761894A CN116761894A CN202180066715.5A CN202180066715A CN116761894A CN 116761894 A CN116761894 A CN 116761894A CN 202180066715 A CN202180066715 A CN 202180066715A CN 116761894 A CN116761894 A CN 116761894A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- embryos
- donor
- embryo
- embryonic cells
- produced
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 286
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 266
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims abstract description 294
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 116
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 26
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 108
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 38
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 36
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 claims description 36
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 claims description 30
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 29
- 244000144972 livestock Species 0.000 claims description 29
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 27
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 claims description 22
- 210000000625 blastula Anatomy 0.000 claims description 20
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 19
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 16
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 10
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 6
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 claims description 5
- 238000003890 embryo preservation Methods 0.000 claims 1
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 abstract description 2
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 60
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 41
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 35
- 230000008569 process Effects 0.000 description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 16
- 238000011161 development Methods 0.000 description 16
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 16
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 12
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 11
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 11
- 235000014510 cooky Nutrition 0.000 description 11
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 10
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 8
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 7
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 7
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 7
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 7
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 7
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 6
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 6
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 6
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 6
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 4
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 4
- 241000289419 Metatheria Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 208000025174 PANDAS Diseases 0.000 description 4
- 208000021155 Paediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infection Diseases 0.000 description 4
- 240000004718 Panda Species 0.000 description 4
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 4
- 241000282806 Rhinoceros Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 4
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102000006277 CDX2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010083123 CDX2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 3
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 3
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 3
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000218213 Morus <angiosperm> Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 238000003927 comet assay Methods 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 210000005002 female reproductive tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 210000000973 gametocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- 210000001667 gestational sac Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N (7-aminophenothiazin-3-ylidene)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[NH2+])C=C2SC3=CC(N)=CC=C3N=C21 PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 1
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029803 blastocyst development Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000008144 egg development Effects 0.000 description 1
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000000370 laser capture micro-dissection Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001489 optical tweezers Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 239000010690 paraffinic oil Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000007788 roughening Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
- C12N15/8771—Bovine embryos
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
- A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/35—Polyols, e.g. glycerin, inositol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/99—Serum-free medium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明总体上涉及通过连续增殖(例如,通过进行3轮或更多轮增殖)从一个或多个供体胚胎生产多个胚胎的方法,以及这种方法在动物育种中的应用。本发明还涉及从供体胚胎产生多个单合子胚胎的方法,供体胚胎包含胚胎细胞,胚胎细胞在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞。
Description
相关申请数据
本申请要求2020年7月31日提交的第2020902691号澳大利亚临时申请的优先权,其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明一般涉及通过连续增殖周期(例如,通过执行三轮或更多轮增殖)从一个或多个供体胚胎生产多个胚胎的方法,以及这种方法在动物育种中的应用。本发明还涉及从供体胚胎产生多个单合子胚胎的方法,所述供体胚胎包含在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞的胚胎细胞。
背景技术
辅助生殖技术(ART)已经取得了巨大的进步,特别是在过去的几十年中。人工授精(AI)仍然是在牛群中获得遗传增益的最(成本)有效的方法,并广泛应用于乳制品行业。在这方面,全球市场对于冷冻精液和胚胎仍然是强有力的,其中数百万的牛由AI繁殖,每年全世界转移超过一百万个胚胎。乳制品行业中为人工授精提供精液的大多数顶级父系都来自胚胎移植(ET),控制发情周期和排卵的方法的改进导致了人工授精、供体奶牛的超排卵和ET受体的管理更加有效。尽管这些技术在ART中有所进步,但由于生产每一个胚胎的相关费用,生产商对多次排卵和胚胎移植(MOET)等生殖技术的吸收仍然有限。与常规AI不同,MOET因此不可能被生产者用作常规繁殖方法。
最近,已经报道了通过胚胎分割以及从卵裂期胚胎分离出的卵裂球来生产遗传上相同的单卵双胞胎的方法。虽然ART“工具箱”的这种新的增加是令人兴奋的,并且将使生产者能够更有效地捕获和选择雌性(母畜)遗传学(除了种系遗传学之外),但是在商业水平上广泛采用胚胎孪生,如其他基于ET和IVF的方法,可能受到生产者的高昂成本以及与技术规模相关的挑战的阻碍。
因此,需要改进的胚胎增殖方法来解决这些限制中的一个或多个并帮助工业摄取。
发明内容
本发明广泛地涉及从一个或多个供体胚胎产生多个胚胎的方法。在这点上,本发明人首次表明,包含至少2个胚胎细胞的牛供体胚胎可以在将所得胚胎扩增到囊胚阶段之前通过≥3个连续的增殖轮进行增殖。在这样做的过程中,本发明人已经表明,使用本文所述的连续增殖方法从初始供体胚胎中恢复囊胚的效率显著高于(例如,高达6倍)如果初始完整供体胚胎直接培养至囊胚。
本发明人还首次表明,包含一个或多个胚胎细胞的牛胚胎可用作供体胚胎以产生多个单合子胚胎,所述胚胎细胞在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞,包括当使用本文所述的连续增殖步骤以进一步增殖胚胎时。从这些更发育的供体胚胎开始,所述供体胚胎通常包含发育上等同于来自8-,16-,32-和64-细胞胚胎的细胞的卵裂球的异种混合物,本发明人已经表明,使用本文所述的增殖方法回收囊胚的效率显著高于(例如,当使用连续增殖时高达10倍)最初完整的供体胚胎被简单地直接培养到囊胚。
在一个示例中,本发明提供了一种增殖一个或多个供体胚胎的方法,所述方法包括:
(i)获得包含至少两个胚胎细胞的一个或多个供体胚胎;
(ii)从一个或多个供体胚胎中分离所述胚胎细胞的一个或多个;
(iii)在适于产生多个胚胎的条件下体外扩增所述胚胎细胞,每个包含至少两个胚胎细胞;
(iv)分离在(iii)中产生的所述多个胚胎中的一个或多个以在随后的增殖中用作供体胚胎;以及
(v)重复步骤(i)-(iv)‘n’次,其中‘n’为≥3。
在另一个实施例中,本发明提供了一种繁殖供体胚胎的方法,所述方法包括:
(i)获得包含一个或多个胚胎细胞的供体胚胎,所述胚胎细胞在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞;
(ii)从所述供体胚胎中分离一个或多个胚胎细胞;
(iii)在适于从所述供体胚胎产生多个单合子胚胎的条件下体外扩增所述胚胎细胞;以及
(iv)在适于产生多个单合子囊胚的条件下培养所述多个单合子胚胎。
在培养所述多个纯合胚胎以产生所述多个囊胚的步骤之前,所述方法还可包括以下步骤:
(i)分离产生的多个单合子胚胎中的一个或多个以在随后的增殖中用作供体胚胎,其中分离用于随后的增殖的每个供体胚胎包含至少两个胚胎细胞;
(ii)从一个或多个供体胚胎中分离所述胚胎细胞的一个或多个;
(iii)在适于产生多个胚胎的条件下体外扩增所述胚胎细胞,每个包含至少两个胚胎细胞;
(iv)分离在(iii)中产生的所述多个胚胎中的一个或多个以在随后的增殖中用作供体胚胎;以及
(v)在适于产生多个囊胚的条件下培养所述多个胚胎之前,重复步骤(i)-(iv)‘n’次。
在一个实施例中,从每个供体胚胎分离一个或多个胚胎细胞是通过将供体胚胎分成两个或更多个部分来实现的,每个部分(或半胚胎)包含一个或多个胚胎细胞。在一个实施例中,至少一个供体胚胎可以分成两个部分。在一个实施例中,至少一个供体胚胎可以分成三个部分。在一个实施例中,至少一个供体胚胎可以分成四个部分。在一个实施例中,至少一个供体胚胎可以分成五个或更多个部分。
在上述每个实施例中,可以用显微外科器械切开或切割供体胚胎。例如,可以使用刀片(例如,解剖刀片或其部分)、细玻璃针或激光(例如,激光辅助活检),通过显微切割来切开或切割供体胚胎。在其他实施例中,可以通过纳米切割(例如,使用飞秒激光脉冲或具有纳米尺度的原子力显微镜(AFM))来切开或切割供体胚胎。
在另一个实施例中,从每个供体胚胎中分离一个或多个胚胎细胞是通过破坏透明带(ZP),并从供体胚胎中分离一个或多个胚胎细胞来实现的。这在本文中称为“解拉锁”或“解拉锁方法”。根据该实施例,可以破坏ZP并从一个或多个供体胚胎中分离一个或多个胚胎细胞。在一个实施例中,ZP被酶或机械破坏。例如,可以用酶或机械方法破坏ZP,用微量移液管从所述一个或多个供体胚胎中吸出所述一个或多个胚胎细胞,从而分离所述胚胎细胞。
除非另有说明,否则‘n’为≥1。例如,‘n’可以是≥2。例如,‘n’可以是≥3。根据其中‘n’是≥3的示例,‘n’可以是≥4。例如,‘n’可以是≥5。例如,‘n’可以等于6、或7或8或9或10或更大。
在一个实施例中,通过本发明的方法产生16个或更多个单合子胚胎。在一个实施例中,通过本发明的方法产生32个或更多个单合子胚胎。在一个实施例中,通过本发明的方法产生64个或更多个单合子胚胎。在一个实施例中,通过本发明的方法产生128个或更多个单合子胚胎。在一个实施例中,通过本发明的方法产生256个或更多个单合子胚胎。在一个实施例中,通过本发明的方法产生512个或更多个单合子胚胎。
在一个实施例中,胚胎细胞或包含它们的胚胎可以在一种或多种能够促进胚胎发生的因子存在下培养。例如,胚胎细胞可以在一种或多种能够促进胚胎发生的因子存在下培养,以形成和扩增单卵合胚胎,例如用于收获。
在另一个实施例中,胚胎细胞或包含它们的胚胎可以在一种或多种能够促进全能性和/或抑制或防止胚胎发生的因子存在下培养。例如,胚胎细胞或包含它们的胚胎可以在一种或多种能够促进母体mRNA清除的因子存在下培养。
除非另有说明,该供体胚胎或每个供体胚胎包含约2至约300个胚胎细胞,例如约2至约256个胚胎细胞或约2至约64个胚胎细胞,条件是还没有发生致密。例如,该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约100至约256个胚胎细胞,条件是尚未发生致密。例如,该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约64至约128个胚胎细胞,条件是尚未发生致密。例如,该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约32至约64个胚胎细胞,条件是尚未发生致密。例如,该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约16至约32个胚胎细胞,条件是尚未发生致密。例如,该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约2至约32个胚胎细胞,条件是尚未发生致密。例如,该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约2至约16个胚胎细胞,条件是尚未发生致密。例如,该供体胚胎或每个供体胚胎可包含约2至约8个胚胎细胞。
根据供体胚胎包含一个或多个胚胎细胞的实施例,胚胎细胞在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞,供体胚胎可包含约12至约32个尚未致密的胚胎细胞。根据该实施例,供体胚胎可包含一个或多个发育上等同于来自8-细胞胚胎的胚胎细胞的胚胎细胞、一个或多个发育上等同于来自16-细胞胚胎的胚胎细胞的胚胎细胞、一个或多个发育上等同于来自32-细胞胚胎的胚胎细胞的胚胎细胞、和/或一个或多个发育上等同于来自64-细胞胚胎的胚胎细胞的胚胎细胞。
在上述每个实施例中,供体胚胎可以从脊椎动物获得。
在一个实施例中,脊椎动物可以是哺乳动物物种。
在一个实施例中,哺乳动物物种可以是家畜物种。例如,家畜物种可以是牛物种。例如,家畜物种可以是绵羊物种(即绵羊)。例如,家畜物种可以是猪物种(即猪)。例如,家畜物种可以是马物种(即,马)。例如,家畜物种可以是山羊物种(即山羊)。例如,牲畜物种可以是鹿物种(即鹿)。例如,家畜物种可以是骆驼物种(例如,骆驼或羊驼)。
在一些实施例中,在步骤(i)中获得的供体胚胎中的一个或多个是通过体内受精产生的。在其他实施例中,在步骤(i)中获得的供体胚胎中的一个或多个是通过体外受精(IVF)产生的。
在一些实施例中,在步骤(i)获得的一个或多个供体胚胎是新鲜的。在其他实施例中,在步骤(i)获得的一个或多个供体胚胎已经被冷冻保存。例如,供体胚胎可以解冻。
在每个前述实施例中,所述方法进一步可以包括基于一个或多个遗传筛选标准、遗传诊断和/或一个或多个形态学标准选择在步骤(i)获得的一个或多个供体胚胎。例如,选择步骤可以在步骤(i)之前执行。
在一个实施例中,遗传筛选标准可以通过筛选一个或多个供体胚胎与感兴趣性状相关的一个或多个遗传标记(例如SNP等位基因或单倍型)的存在与否来确定。在一个实施例中,感兴趣的性状选自表型生产性状、药物抗性、对害虫和/或寄生虫的易感性、和性别(即,确定胚胎是雄性还是雌性)。
在一个实施例中,一个或多个供体胚胎可以基于多种病症、疾病或其素质的遗传诊断来选择。
在一个实施例中,可以基于指示胚胎健康的一个或多个形态特征来选择一个或多个供体胚胎。
在上述每个实施例中,一个或多个供体胚胎可以是遗传修饰的。例如,一个或多个供体胚胎可以通过将外源核酸导入其中包含的胚胎细胞的基因组而被遗传修饰。例如,一个或多个供体胚胎可以通过编辑其中包含的胚胎细胞的基因组进行遗传修饰。
在一个实施例中,一个或多个供体胚胎包含独特的遗传标记或核酸标识符,用于追踪由其产生的胚胎和/或由所述胚胎产生的动物。例如,可以使用遗传修饰引入独特的遗传标记或核酸标识符。
在前述实施例的每一个中,方法包括多个胚胎以形成囊胚。例如,方法可包括体外扩增胚胎以形成准备植入的成熟囊胚。
方法可以进一步包括收获通过该方法产生的多个胚胎。例如,方法可以包括一旦胚胎成熟到囊胚期就收获胚胎。
在一些实施例中,将一个或多个收获的胚胎保存在胚胎保存培养基中。例如,一个或多个收获的胚胎可以储存在约4℃。
在一些实施例中,冷冻保存一个或多个收获的胚胎。冷藏胚胎可在约-180℃至约-196℃下储存。例如,冷藏的胚胎可以在约-196℃储存在液氮中。
在一些实施例中,本发明的方法还包括将通过所述方法产生的一个或多个胚胎转移到一个或多个受体雌性动物的输卵管。
本发明还提供了通过本发明的方法产生的一个或多个胚胎。在一个实施例中,一个或多个胚胎可以在大约4℃的胚胎贮存或转移培养基中提供。在另一个实施例中,一个或多个胚胎可以是冷藏的。
在一个实施例中,胚胎来自哺乳动物物种(例如,非哺乳动物物种)。在一个实施例中,非人哺乳动物物种是家畜物种。例如,家畜物种可以是牛物种。例如,家畜物种可以是绵羊物种(即绵羊)。例如,家畜物种可以是猪物种(即猪)。例如,家畜物种可以是马物种(即,马)。例如,家畜物种可以是山羊物种(即山羊)。例如,牲畜物种可以是鹿科物种(即鹿)。例如,牲畜物种可以是骆驼科物种(例如骆驼或羊驼)。
本发明还提供了一种繁殖动物的方法,包括:
(i)将通过本发明的方法产生的一个或多个胚胎转移到一个或多个受体雌性动物的输卵管以建立妊娠;
(ii)通过分娩从所述怀孕受体雌性产生所述动物。
在一个实施例中,这种动物是脊椎动物。例如,脊椎动物可以是哺乳动物、两栖动物、爬行动物、鱼或鸟。
在一个具体实施例中,动物是哺乳动物,例如非人哺乳动物。可以使用该方法生产的示例性非人哺乳动物包括家畜物种(例如,牛、水牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、鹿、马等),伴侣动物(例如,狗、猫等),实验室动物(例如,大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、兔等),非人灵长类(猕猴和狨猴等)和野生物种(例如,有袋类动物、猫、犀牛、大熊猫等)。在一个具体实施例中,本发明的方法可以用于繁殖牛。在另一个实施例中,本发明的方法可用于繁殖绵羊。在另一个实施例中,本发明的方法可用于繁殖猪。在另一个实施例中,本发明的方法可用于繁殖山羊。在另一个实施例中,本发明的方法可用于繁殖马。
附图说明
图1是在4轮2细胞期胚胎的拉开过程中,卵裂球和发育胚胎的分类方案的示意图。左手侧代表着从合子阶段到囊胚阶段的植入前孕体发育的正常发育。在拉开过程中,除去透明带(ZP)(围绕着孕体的灰色带)以分离孕体内的单个卵裂球(连续分裂数,n=1)。分离自2细胞孕体的单个卵裂球称为1:2。然后使这些卵裂球发育形成称为2:4的对。切割后,这些2:4的卵裂球可以进行另一轮的拉开(连续分裂数,n=2),其中卵裂球将分离为1:4。对另外两轮连续分裂重复该过程,分别为n=3和n=4。当这些卵裂球发育时,它们过渡到随后的等效植入前孕体阶段,因此分母相应地改变。在1:16阶段后,卵裂球可以致密化,然后形成囊胚等同物。
具体实施方式
一般技术和定义
除非另外具体定义,否则本文使用的所有技术和科学术语应具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义(例如动物营养、饲料配方、微生物学、牲畜管理)。
如本文所用,单数形式的“一”、“一个”和“该”包括这些词语的复数形式,除非上下文另外明确指出。
术语“和/或”,例如“X和/或Y”应被理解为表示“X和Y”或“X或Y”,并且应被理解为对这两种含义或无论哪种含义提供明确的支持。
在整个说明书中,单词“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变体将被理解为暗示包括陈述的元素、整数或步骤,或元素、整数或步骤的组,但不排除任何其他元素、整数或步骤,或元素、整数或步骤的组。
术语“约”在本文中用于表示大约。当术语“约”与数值范围结合使用时,其通过将边界延伸到所述数值的上方和下方来修饰该范围。通常,术语“约”在本文中用于修饰高于和低于所述值10%、向上或向下(更高或更低)的数值。
本领域技术人员将理解,本发明除了具体描述的之外,还可以进行变化和修改。应当理解,本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还单独或共同包括本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物,以及所述步骤或特征中的任何和所有组合或任何两个或更多个。因此,本发明的任何特定方面或实施方案的每个特征可以比照适用于本发明的任何其他方面或实施方案。
本发明的范围不受这里描述的特定实施方案的限制,这里描述的特定实施例仅用于示例的目的。如本文所述,功能上等同的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。
在整个说明书中,除非另有特别说明或上下文另有要求,提及单个步骤、物质组合物、一组步骤或一组物质组合物应理解为包含一个和多个(即一个或多个)那些步骤、物质组合物、一组步骤或一组物质组合物。
具体定义
术语“胚胎”在本文中用于指当两个单倍体配子细胞(例如,未受精的卵母细胞和精子细胞)联合形成二倍体全能细胞(例如,受精卵)时形成的合子,以及由随后的细胞分裂(即,胚胎分裂)产生的胚胎,包括桑椹胚期(即,当内细胞团已经致密时)和具有分化的滋养外胚层和内细胞团的囊胚期。
如本文所用,术语“桑椹胚”是指胚胎发育阶段。桑椹胚是早期胚胎,其由包含在称为透明带的糖蛋白膜内的细胞球(称为卵裂球)组成。桑椹胚由单细胞合子通过一系列切割事件产生(其在图1中针对牛举例说明)。桑椹胚形成之前的关键事件是“致密”,其中含有约8-32个细胞(取决于物种)的胚胎经历细胞形态和细胞-细胞粘附的变化,这引发该细胞实心球的形成。“桑椹胚”通常包含约16-32个细胞(取决于物种),并且类似于桑葚,因此命名为桑椹胚(拉丁,桑属:桑椹)。在牛物种的情况下,致密过程通常发生在16-细胞期后,发育中的胚胎在32-细胞期达到桑椹胚早期,此时胚胎细胞(或卵裂球)之间的细胞-细胞粘附进展,胚胎包含致密的内细胞团(ICM)。
通过涉及细胞分化和空化的过程,桑椹胚产生囊胚。如本文所用,术语“囊胚”应理解为指具有内细胞团(ICM)的胚胎,或包含全能胚胎干细胞的胚细胞,和随后形成胎盘的细胞外层,或滋养层。滋养层围绕内细胞团和称为囊胚腔的充满液体的囊胚腔。囊胚通常包含70-300个胚胎细胞(其可根据胚胎的物种和成熟度而变化)。在一些实施例中,囊胚可包含约64至约128个细胞。在一些实施例中,囊胚可包含约128至约256个细胞。在一些实施例中,囊胚可包含150-256个细胞。在一些实施例中,囊胚可包含约256个细胞。
如本文所用,术语“胚胎细胞”或“胚胎细胞”旨在包括发育中的胚胎内从受精卵到囊胚期的所有全能细胞。例如,从受精卵发育到桑椹胚期的胚胎中获得的胚胎细胞(也称为“卵裂球”)是全能胚胎细胞。同样,从囊胚的内细胞团获得的胚胎细胞可以是全能的。
如本文所用,术语“全能”用于描述能够产生任何细胞类型的细胞。例如,在胚胎细胞的上下文中,“全能”细胞是能够在胚胎中产生所有细胞类型并最终在身体中不同组织(例如皮肤、骨、骨髓和肌肉等)所需的任何一种特化细胞中分化的细胞。术语“全能性”与术语“多能性”不同,后者是指分化为发育中的细胞群内的细胞的特定亚群但可能不产生任何和所有细胞类型的细胞。
如本文所用,术语“单合子胚胎”应理解为意指由单个合子形成或衍生的两个或更多个胚胎。
本文所用的术语“半胚胎”应理解为是指胚胎被分裂或切割后的一部分。例如,二等分的胚胎将产生两个半胚胎,每个包含胚胎细胞。同样,被切成三个部分的胚胎将产生三个半胚胎,每个部分包含胚胎细胞。
如本文所用,术语“动物”应理解为包括所有脊椎动物,如哺乳动物(即非人哺乳动物)、两栖动物、爬行动物、鱼和鸟。在一个实施例中,动物是哺乳动物。本发明的方法可用于的示例性哺乳动物家畜(例如,牛、水牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、鹿、马等),伴侣动物(例如,狗、猫等),实验室动物(例如,大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、兔等),非人灵长类(猕猴和狨猴等)和野生物种(例如,有袋类动物、大猫、犀牛、大熊猫等)。在一个具体实施例中,本发明的方法可用于牛(即,牛物种)。
孪生方法
本发明总体上涉及增殖胚胎的方法,在本文中也称为“孪生”,并且具体地,涉及能够从一个或多个初始供体胚胎产生多个胚胎的方法。本文描述了用于从一个或多个初始供体胚胎产生多个胚胎的若干方法或‘孪生技术’。
在一个实施例中,本发明的方法具有以下一般方法步骤:
(i)获得包含至少两个胚胎细胞的一个或多个供体胚胎;
(ii)从一个或多个供体胚胎中分离所述胚胎细胞的一个或多个;
(iii)在适于产生多个胚胎的条件下体外扩增所述胚胎细胞,每个包含至少两个胚胎细胞;
(iv)分离在(iii)中产生的所述多个胚胎中的一个或多个以在随后的增殖中用作供体胚胎;以及
(v)重复步骤(i)-(iv)‘n’次,其中‘n’为≥3。
在另一个实施例中,使用本文所述的‘孪生技术’扩增供体胚胎的本发明的方法具有以下一般方法步骤:
(i)获得包含一个或多个胚胎细胞的供体胚胎,所述胚胎细胞在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞;
(ii)从所述供体胚胎中分离一个或多个胚胎细胞;
(iii)在适于从所述供体胚胎产生多个单合子胚胎的条件下体外扩增所述胚胎细胞;以及
(iv)在适于产生多个单合子囊胚的条件下培养所述多个单合子胚胎。
在后一种方法中,在培养所述多个纯合胚胎以产生所述多个囊胚的步骤之前,所述方法还可包括以下步骤:
(i)分离产生的多个单合子胚胎中的一个或多个以在随后的增殖中用作供体胚胎,其中分离用于随后的增殖的每个供体胚胎包含至少两个胚胎细胞;
(ii)从一个或多个供体胚胎中分离所述胚胎细胞的一个或多个;
(iii)在适于产生多个胚胎的条件下体外扩增所述胚胎细胞,每个包含至少两个胚胎细胞;
(iv)分离在(iii)中产生的所述多个胚胎中的一个或多个以在随后的增殖中用作供体胚胎;以及
(v)在适于产生多个囊胚的条件下培养所述多个胚胎之前,重复步骤(i)-(iv)‘n’次。
如本文所述,方法的步骤(i)-(iv)可以重复‘n’次,以便从原始供体胚胎产生多个胚胎。根据(1)初始供体胚胎中胚胎细胞的数量,(2)用于从中分离胚胎细胞的技术,和(3)除非另有说明,要进行的步骤(i)-(iv)的重复次数,即“n”,可以变化。在这点上,并且除非另有说明,‘n’可以是≥1,例如1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9或10或更多。根据其中该方法要求‘n’是≥3的实施例,‘n’可以是3、或4、或5、或6、或7、或8、或9或10或更多。
在一个实施例中,所采用的‘孪生化技术’被指定为“切割方法(cutting method/cut method)”。根据该实施方案,将步骤(i)的一个或多个初始供体胚胎切割(或分裂)成包含一个或多个胚胎细胞的两部分(例如,大约相等的比例)。然后如上述步骤(i)-(iii)所述,在体外扩增两个半胚以产生两个单卵胚。然后在步骤(iv)中使用新扩增的胚胎作为供体胚胎重复步骤(i)-(iii)中的过程。如步骤(v)所示,该过程可以重复‘n’次(每次称为循环),使用从前一循环产生的胚胎作为随后循环的供体胚胎。这样,使用切割方法的每个新的增殖周期能够使相对于前一周期产生的单合子胚胎的数量加倍。使用切割方法进行的循环的数量将取决于许多因素(例如,待产生的胚胎的数量,起始供体胚胎的数量,供体胚胎的发育阶段,在插入循环期间是否从该方法收获任何胚胎等),并且因此可以变化。
在一个实施例中,一个或多个初始供体胚胎各自包含至少2个胚胎细胞,使用切割方法进行的最小循环数可以是三,即n≥3。
在另一个实施例中,所述一个或多个初始供体胚胎各自包含一个或多个胚胎细胞,所述胚胎细胞在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞。根据该示例,使用切割方法执行的最小循环数可以是一,即n≥1。
在另一个实施例中,初始供体胚胎是4细胞胚胎,所需结果是产生至少16个单合子胚胎。根据该实施例,仅使用“切割方法”将需要最少四个循环(即,n≥4),以便从初始供体胚胎产生至少16个单合子胚胎。然而,切割方法可包括至少五个循环(即,n等于5)或至少六个循环(即,n等于6)或至少七个循环(即,n等于7)等。在这点上,本领域技术人员将理解,使用切割方法进行的循环数可以简单地基于从初始供体胚胎产生的胚胎数和每个循环后胚胎回收的效率而变化(例如,增加)。
在另一个实施例中,所采用的‘孪生技术’被指定为“饼干切割方法”。根据该实施方案,将步骤(i)的一个或多个初始供体胚胎切割(或分裂)成三个、四个、五个或更多个部分(例如,大约相等的比例),每个部分包含一个或多个胚胎细胞,然后根据上述步骤(i)-(iii)将其体外扩增以产生三个或更多个单合子胚胎。然后在步骤(iv)中使用新产生的(或“孪生的”)胚胎作为供体胚胎重复该过程。如步骤(v)所示,该过程可以重复‘n’次(每次称为循环),使用从前一循环产生的胚胎作为随后循环的供体胚胎。使用“饼干切割器”方法进行的循环次数将取决于多个因素,包括:要生产的胚胎的数量,供体胚胎在各个周期的每一个中被切割成的部分的数量(可以是三个或更多个部分,并且可以在周期之间变化),起始供体胚胎的数量,供体胚胎的发育阶段,在插入周期期间是否从该方法收获任何胚胎等。因此,周期的数量可以变化。
在一个实施例中,一个或多个初始供体胚胎各自包含至少4个胚胎细胞,并且使用饼干切割器方法进行的最小循环数可以是三,即n≥3。
在另一个实施例中,所述一个或多个初始供体胚胎各自包含一个或多个胚胎细胞,所述胚胎细胞在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞。根据该示例,使用饼干切割器执行的最小循环数可以是一,即n≥1。
在另一个实施例中,初始供体胚胎是4细胞胚胎,所需结果是产生至少16个单合子胚胎。根据该实施例,并且假定供体胚胎在每个循环中被切成三个部分,“饼干切割器”方法可以包括最少至少三个循环(即,n≥3),以便从初始供体胚胎产生至少16个单合子胚胎。然而,饼干切割器方法可以包括至少四个循环(即,n等于4),或至少五个循环(即,n等于5),或至少六个循环(即,n等于6),等等。根据切割方法,本领域技术人员将理解,使用饼干切割器方法进行的循环数可以基于从初始供体胚胎产生的胚胎数和每个循环后胚胎回收的效率而变化。
还设想每个供体胚胎使用“饼干切割器”方法分裂成的部分的数量(即产生的半胚胎的数量)可在每个循环内以及循环之间变化。在这点上,供体胚胎分裂成的部分的数量可取决于待产生的胚胎的数量和其他因素,例如胚胎健康、胚胎阶段(例如胚胎细胞数量)等。
可以使用本发明的切割方法和/或饼干切割方法繁殖的胚胎包括植入前从2细胞阶段到囊胚阶段的胚胎。在一些实施例中,可能有利的是选择用于分裂的供体胚胎,其具有更多数量的全能胚胎细胞,例如包含约70-300个胚胎细胞的囊胚。在其他实施例中,供体胚胎可以是晚期桑椹胚至早期囊胚,例如包含约30-70个胚胎细胞。在另一个实施例中,供体胚胎可以是桑椹胚,例如包含约16-32个胚胎细胞。在另一个实施例中,供体胚胎可以是包含2-约16个胚胎细胞的胎前期胚胎。在每种情况下,技术人员将理解在每个阶段具有发育胚胎的胚胎细胞的数量可以在物种之间变化。
在一个或多个供体胚胎被切割或分裂成多个半胚胎的每个实施方案中,切割(或分裂)胚胎的过程可以使用本领域已知的用于分裂胚胎的任何方法进行。例如,可以使用依赖于压力的显微外科器械,例如刀片(例如手术刀刀片或其部分)或细玻璃针,通过机械解剖来分割或切割供体胚胎。备选地或另外地,可以使用激光即激光辅助活组织检查分割或切割供体胚胎。在其他实施例中,可以使用基于纳米切割的工具(例如,使用飞秒激光脉冲或具有纳米尺度的原子力显微镜(AFM))来分割或切割供体胚胎。然而,预期可以采用本领域已知的任何手段。
在另一实施例中,所采用的“孪生技术”被称为“拉开(unzip)法”。根据该实施方案,通过破坏或“拉开”透明带(ZP)并从供体胚胎内分离一个或多个胚胎细胞,来从供体胚胎中分离一个或多个胚胎细胞。根据该实施方案,破坏供体胚胎的透明带以释放其中包含的胚胎细胞,然后分离胚胎细胞(单独或以组/簇的形式)并在体外独立扩增以根据上述步骤(i)-(iii)产生多个胚胎。以此方式,每个分离的胚胎细胞或每个胚胎细胞簇(即,其中两个或更多个细胞被分离在一起)被扩增以变成胚胎(例如,无ZP的胚胎)。在步骤(iv)中使用新产生的胚胎作为供体胚胎重复该过程。如步骤(v)所示,该过程可以重复‘n’次(每次称为循环),使用从前一循环产生的胚胎作为随后循环的供体胚胎。使用“拉开”方法进行的循环数将取决于各种因素,包括要产生的胚胎数,起始供体胚胎数,在插入循环期间是否从该方法收获任何胚胎,和供体胚胎中胚胎细胞的数量,后者决定了从任何一个供体胚胎可以产生多少个单合子胚胎的上限。
预期在完全致密之前,可以对包含被透明带包围的全能胚胎细胞的任何供体胚胎进行解压方法(即,2细胞期胚胎至早期预致密桑椹胚期胚胎)。在一个实施例中,使用2细胞供体胚胎进行拉开方法。在一个实施例中,使用4细胞供体胚胎进行拉开方法。在一个实施例中,使用8细胞供体胚胎进行拉开方法。在一个实施例中,使用16细胞供体胚胎进行拉开方法。在某些实施例中,该方法使用不同发育阶段的供体胚胎进行,直到并包括未完全致密的桑椹胚早期阶段。在优选的实施例中,透明带内的胚胎细胞不是致密的。
在一个实施例中,一个或多个初始供体胚胎各自包含至少2个胚胎细胞,使用拉开方法进行的最小循环数可以是三,即n≥3。
在另一个实施例中,所述一个或多个初始供体胚胎各自包含一个或多个胚胎细胞,所述胚胎细胞在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞。根据该示例,使用切割方法执行的最小循环数可以是一,即n≥1。根据将包含16个卵裂球的单个供体胚胎用作初始供体胚胎的一个实施例,拉开方法可能仅需要单个循环以从初始供体胚胎产生至少约16个单合子胚胎。在另一个实施例中,可以从包含8-12个卵裂球的初始供体胚胎(即,8细胞期胚胎)开始进行解压方法。根据该实施例,拉开方法可能需要两个循环(即,n等于2)以从初始供体胚胎产生至少约16个单合子胚胎。例如,其中每个周期的供体胚胎在8细胞期被“拉开”的拉开方法的两个周期能够产生约64到约100个单合子胚胎。因此,应当理解,与本文所述的“切割方法”和“饼干切割器方法”相比,使用“拉开法”获得所需数量的胚胎可能需要更少的循环。
如同“切割方法”和“饼干切割方法”一样,本领域技术人员将理解,使用“拉开方法”进行的循环数可以基于从初始供体胚胎产生的单合子胚胎的数量和每个供体胚胎中胚胎细胞的数量而变化。
可以使用本领域已知的任何合适的方法,在拉开(unzip)法(也称为“辅助孵化”)中进行透明带的破裂。在这点上,已知在辅助生殖领域中使用多种技术来辅助胚胎孵化,包括部分机械透明带切割、透明带钻孔和透明带薄化,使用酸酪蛋白,蛋白酶,压电振动器操纵器和激光器,例如Hammadeh et al.,(2011)J.Assist.Reprod.Genet.,28(2):119-128。还预期透明带可通过纳米切割(例如,使用飞秒激光脉冲或具有纳米尺度的原子力显微术(AFM))破坏。
任何一种或多种上述技术可用于本发明的拉开法以破坏透明带。
一旦透明带被破坏,就可以分离胚胎细胞(例如,卵裂球),并且如果合适,转移到新鲜培养基中用于扩增。用于分离单个细胞(包括胚胎细胞)的许多方法是本领域已知的并且在本文中考虑(例如,Zhu and Murthy(2013)Curr.Opin.Chem.Eng.,2(1):3-7;)。用于分离细胞的技术包括但不限于荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)、介电泳数字分选、免疫磁性细胞分离、免疫手术、流体动力学捕获、激光捕获显微切割、机械解剖、手工挑选、微流体、显微操作、纳米切割、系列稀释、拉曼镊子及其组合。这些技术中的任一种或其组合预期用于本发明的方法中以从破裂的透明带分离单个胚胎细胞或胚胎细胞的聚集体。在一个具体实施例中,使用微流体技术分离单个胚胎细胞。
在本文所述方法的每个实施方案中,可能需要固定供体胚胎以切割或分裂供体胚胎或使透明带破裂,即“拉开”透明带。固定胚胎的方法是本领域已知的,并且这些方法或技术中的任何一种或多种可用于本发明的方法中。预期用于本发明的方法的示例性方法包括向透明带施加抽吸,在容器中形成凹陷或盲肠,构建捕获胚胎的装置,或使胚胎粘附到表面,例如通过粗糙化含有胚胎的容器的表面,使用无蛋白质培养基或用粘附到胚胎外膜的材料涂覆培养容器。
如本文所述,使用本发明的方法从供体胚胎分离的胚胎细胞或包含胚胎细胞的半胚胎在体外培养并扩增以产生多个胚胎,例如单合子胚胎。
在不同发育阶段体外培养胚胎的方法学是本领域已知的并在本文中考虑。示例性方法描述于本文的实施例1-5中。技术人员将理解,培养条件对于使发育中的胚胎生长至囊胚发育阶段是重要的,并且可以根据胚胎发育阶段来改变/定制,以及控制胚胎发育速率(例如,分裂)以提供足够的时间窗来执行本发明的方法的增殖步骤。例如,在胚胎培养期间,可以控制诸如温度和CO2水平的变量以优化发育中的胚胎的生长。例如,胚胎发育的最佳温度为约32℃至约40℃,优选约35℃至39℃,特别优选37℃的温度。培养环境中用于胚胎发育的最佳CO2水平为约1%CO2至约10%CO2,优选约3%CO2至约8%CO2,甚至更优选约5%CO2。
用于培养和扩增胚胎细胞和胚胎的合适培养基是本领域已知的。例如,在Summersand Biggers(2003)Human Reprod Update,9:557-582中描述了允许胚胎以与体内发生的那些相当的速率成熟为囊胚的培养基。许多这些培养基松散地基于在卵释放、受精和发育时在雌性生殖道中发现的离子、氨基酸和糖的浓度(Gardner and Lane(1998)Hum Reprod13:148-160)。通常,含有磷酸盐缓冲液或Hepes有机缓冲液的培养基用于涉及在培养箱外处理配子、冲洗卵泡和显微操作的程序。大多数培养基利用碳酸氢盐/CO2缓冲系统将pH保持在合适的范围内,例如pH7.2-7.4。培养基的摩尔渗透压浓度通常在275-290mosmol/kg的范围内。胚胎也可以在石蜡油(或对胚胎无毒的其他油)下培养,以防止培养基蒸发,保持恒定的渗透压。当将胚胎从培养箱中取出用于显微镜评价时,油还使pH和温度的波动最小化。
合适的培养基通常还含有蛋白质源,例如白蛋白或合成血清,其以约5至20%(分别为w/v或v/v)的浓度加入。还可以向培养基中加入盐源,例如NaCl、KCl、KH2PO4、CaCl22H2O、MgSO47H2O、或NaHCO3。培养基通常还含有碳水化合物源,因为碳水化合物存在于雌性生殖道中。它们与氨基酸一起是发育中的胚胎的主要能量来源。支持受精卵发育至8细胞的培养基含有丙酮酸盐和乳酸盐。一些商业培养基不含葡萄糖,而另一些则添加了极低浓度的葡萄糖以满足常规授精过程中精子的需要。支持8细胞胚胎发育直至囊胚期的培养基含有低浓度的丙酮酸盐和乳酸盐类以及高浓度的葡萄糖。用氨基酸补充培养基对于胚胎发育也是理想的。支持受精卵发育至8-细胞的培养基通常补充有非必需氨基酸,如脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸。支持8细胞胚胎发育直至囊胚期的培养基通常还补充有必需氨基酸,例如胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、硫堇、色氨酸。培养基还可以含有维生素。
培养基还可以含有抗生素。大多数ART实验室确实使用含有抗生素的培养基以最小化微生物生长的风险。最常用的抗生素是青霉素(β-内酰胺革兰氏阳性菌干扰细胞壁完整性)和链霉素(氨基糖苷类革兰氏阴性菌干扰蛋白质合成)。
可用于在本发明的方法中培养胚胎的用于胚胎发育的顺序培养基的三个实施例是:G1/G2(Gardner et al,(1998)Hum.Reprod.13:3434);Universal IVF Medium/MS(Bertheussen et al.,(1997);和PI/囊胚培养基(Behr et al.,(1998)Am.Soc.Rep.Med.0-262)用于在不同发育阶段培养胚胎的培养基可从多种来源商购获得。
用于胚胎发育的其他示例性培养基描述于本文的实施例1-5中,并且预期用于本发明的方法中。
在一些实施例中,在一种或多种能够促进胚胎细胞的全能性和/或抑制或防止胚胎发生的因子存在下培养胚胎细胞和/或发育中的胚胎。可以将这些因子加入到培养基中,以防止或减缓胚胎发生,从而在细胞分化开始发生之前提供进一步进行步骤(i)-(iv)的额外循环的机会。促进胚胎细胞全能性和/或抑制或防止胚胎发生的因子是本领域已知的,并考虑用于本文。例如,促进胚胎细胞全能性和/或抑制或防止胚胎发生的因子包括阻断早期胚胎产生的miRNA稳定性或活性的抗Mirs和/或核酶。示例性抗-Mir可以靶向胚胎表达的促进母体mRNA清除的miRNA(例如,靶向miR-30家族的抗-Mir)。
本领域技术人员将理解,培养条件也可有助于维持胚胎细胞的全能状态。因此,在胚胎细胞、胚胎或半胚胎的培养期间,可以控制诸如细胞或胚胎密度、温度和CO2水平的变量以调节/控制培养的胚胎的发育速率。
如本文所述,本发明的方法还包括体外培养和扩增胚胎以形成囊胚,然后收获囊胚(例如,用于储存和/或植入受体雌性)。因此,在该方法的某些阶段,胚胎细胞和/或发育中的胚胎可以在一种或多种能够促进胚胎发生的因子存在下培养。例如,可以将能够促进胚胎发生的因子(即,胚胎发生因子)添加到用于将胚胎培养到囊胚阶段以便收获的培养基中。促进胚胎发生的因子是本领域已知的并在本文中考虑。
本领域技术人员还将理解,为了促进胚胎发生,可以改变和/或优化培养条件,例如胚胎密度、温度和CO2水平。
还可以设想,本文所述的各种孪生技术,即“切割方法”、“饼干切割方法”和“拉开方法”,可以彼此组合使用。例如,本发明的方法可以包括一个或多个循环,其中使用“切割方法”或“饼干切割方法”将供体胚胎分裂/切割成两个或更多个半胚胎,然后对早期循环产生的扩增的半胚胎进行一个或多个循环的“拉开方法”。组合这些方法可以优化产生的胚胎的数量,同时使需要进行的循环的数量最小化。根据组合了这些技术的另一个实施例,本发明的方法可以包括一个或多个循环的“拉开法”以产生多个卵裂球(例如,16个卵裂球),接着是一个或多个循环的“切割法”或“饼干切割器法”,这些胚胎从这些卵裂球扩展,由此将胚胎的数量进一步增加2、3或4倍。根据该最后的示例,“拉开法”的一个或多个循环可以在实验室中执行,并且“切割法”或“饼干切割法”的后续循环可以在植入之前在现场执行。在这点上,本领域技术人员将理解,本文描述的各种孪生技术可以结合在本发明的方法中。
如本文所述,在所述方法的步骤(i)中获得的供体胚胎可以是任何胚胎期,其包括多个全能胚胎细胞,例如植入前2细胞期胚胎至囊胚期胚胎。然而,对于本文所述方法的某些实施方案,特定发育阶段的胚胎和/或包含特定数量胚胎细胞的胚胎可能是优选的。为了说明这一点,当进行“拉开(unzip)法”以能够分离卵裂球时,预致密的胚胎是优选的。在一些实施例中,供体胚胎处于2细胞期。在一些实施例中,供体胚胎处于4细胞期。在一些实施例中,供体胚胎处于8细胞期。在一些实施例中,供体胚胎处于16细胞期。在一些实施例中,供体胚胎是桑椹胚。在其他实施例中,供体胚胎是囊胚(孵化前)。因此,可用于该方法的供体胚胎可包含约2至300个胚胎细胞,例如约4至约256个胚胎细胞、或约100至约256个胚胎细胞、或约70至约100个胚胎细胞、或约30至约70个胚胎细胞、或约16至约30个胚胎细胞、或约4至约16个胚胎细胞、或约4至约8个胚胎细胞、或约2至约4个胚胎细胞。
如本文所述,获得供体胚胎的动物物种可以是任何脊椎动物,包括哺乳动物物种、两栖动物物种、爬行动物物种、鱼物种和鸟物种(例如家禽)。
在一个实施例中,动物是哺乳动物,例如非人哺乳动物。本发明的方法可用于的示例性非人哺乳动物包括家畜物种(例如牛、水牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、鹿、马等),伴侣动物(例如狗、猫等),实验室动物(例如大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、兔等),非人灵长类动物(猕猴和狨猴等)和野生物种(例如有袋类动物、猫、犀牛、大熊猫等)。
在一个特定实施例中,本发明的方法可用于在牛物种中产生多个胚胎(例如,单合子胚胎)。在另一个实施例中,本发明的方法可用于从绵羊产生多个胚胎(例如,单合子胚胎)。在另一个实施例中,本发明的方法可用于从猪产生多个胚胎(例如,单合子胚胎)。在另一个实施例中,本发明的方法可用于从山羊产生多个胚胎(例如,单合子胚胎)。在另一个实施例中,本发明的方法可用于从马产生多个胚胎(例如,单合子胚胎)。在另一个实施例中,本发明的方法可用于在骆驼物种中产生多个胚胎(例如,纯合胚胎)。
在本发明的方法的第一循环中使用的供体胚胎可以在体内制备(例如,通过常规地从怀孕动物冲洗胚胎)或通过体外受精(IVF)方法制备。
在一个实施例中,在该方法的第一个周期中使用的供体胚胎通过体内方法制备。例如,卵母细胞可以在体内受精(例如,在交配后或通过人工授精),随后通过常规胚胎冲洗从妊娠雌性中取出胚胎。在一个实施例中,供体胚胎通过多次排卵胚胎移植(MOET)产生,由此供体雌性在受精前施用激素,主要是促卵泡激素(FSH),以刺激循环雌性动物的卵巢,从而诱导多次排卵。
在另一个实施例中,在该方法的第一个周期中使用的供体胚胎通过体外方法即IVF制备。使用IVF生产胚胎的方法在本领域是公知的。IVF通常涉及通过卵泡抽吸从供体动物产生卵母细胞,随后进行体外成熟、受精和培养直到所得胚胎达到所需发育阶段。方便地,该方法允许在受控条件下从具有特定价值的活体动物重复产生胚胎。胚胎的IVF生产方法描述于生命支持系统百科全书(EOLSS)牲畜中的动物生产”Animals Production inLivestock”中Berlinguer F.“胚胎生产”,其全部内容并入本文。
还预期在该方法的第一个周期中使用的供体胚胎,无论通过体内或体外手段产生,可以是新鲜的或解冻的(即,解冻的冷藏胚胎)。在一个实施例中,供体胚胎是新鲜的。在另一个实施例中,供体胚胎是解冻的冷藏胚胎。
可用于本发明方法的供体胚胎也可经历遗传修饰。例如,供体胚胎内的胚胎细胞可以在进行该方法之前进行遗传修饰,使得从供体产生的所有胚胎都携带遗传修饰。在一个实施例中,通过将外源核酸导入其中包含的胚胎细胞的基因组来遗传修饰供体胚胎。外源核酸可以是与目的性状相关的基因或基因座的替代等位基因。或者,外源核酸可以是转基因。在另一个实施例中,可以通过编辑其中包含的胚胎细胞的基因组(即基因组编辑)来遗传修饰供体胚胎。基因组编辑可选自插入、缺失、取代、倒位或易位。例如,基因组编辑可以是核酸序列或其中的一个或多个核苷酸位置的插入、缺失和/或替换,以便用备选等位基因替换与感兴趣性状相关的基因或基因座的现有等位基因。
基因组编辑也可用于引入一种或多种遗传修饰(例如,核苷酸取代),其单独或组合考虑在发育中的胚胎中提供独特的遗传谱或指纹。然后该独特的遗传图谱或指纹可用于鉴定和/或追踪由供体胚胎(和由其产生的动物)产生的胚胎。例如,可以对供体胚胎内的胚胎细胞进行基因组安全港区内的一个或多个保守核苷酸取代,以产生独特的遗传图谱或指纹。
优选地,遗传修饰或编辑发生在单细胞阶段,使得衍生自修饰细胞(和由其产生的动物)的发育中的胚胎中的所有后续细胞包含修饰。然而,如果遗传修饰事件发生在一个或多个细胞分裂之后,并且供体胚胎内不是所有的胚胎细胞都被修饰,那么供体胚胎可以是修饰/编辑事件的嵌合体,因为它将具有一些衍生自修饰/编辑细胞的细胞和一些衍生自未修饰/未编辑细胞的细胞。
本领域描述了许多使用靶向核酸酶遗传修饰细胞基因组的方法。这些包括但不限于(1)成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(Cas9)或其他Cas系统,(2)转录激活物样效应物核酸酶(TALEN),(3)锌指核酸酶(ZFN),和(4)归巢核酸内切酶或大范围核酸酶。这些是用于遗传修饰细胞的其他方法,预期用于本发明的方法中以遗传修饰供体胚胎。
本发明的方法还可以包括一个或多个步骤以帮助选择使用该方法增殖的供体胚胎。例如,该方法可以包括在步骤(i)之前基于一个或多个遗传筛选标准、遗传诊断和/或一个或多个形态学标准选择供体胚胎。
在一个实施例中,遗传筛选标准可以通过筛选与感兴趣的表型性状(例如商业上重要的生产性状,如家畜物种的情况)相关(有利的变体)的一种或多种遗传标记(例如SNP等位基因或单元型)的存在或不存在来确定。感兴趣的示例性表型性状包括但不限于生产性状(例如生长速率、繁殖力、饲料转化效率等)、药物抗性、对害虫和/或寄生虫的易感性,以及性别(即雄性或雌性)。以这种方式,使用本发明的方法增殖的供体胚胎可以从优良动物获得。
或者,或另外,供体胚胎可基于对一种或多种病症、疾病或其易感性的遗传诊断来选择。在这方面,胚胎的植入前遗传诊断(PGD)已经成为IVF领域中更常见的地方。PGD测试主要集中于两种方法:荧光原位杂交(FISH)和聚合酶链反应(PCR)。然而,本领域已知许多用于PGD的技术,并且这些技术中的一种或多种可用于本发明的方法中以选择供体胚胎。这些方法包括但不限于依赖于聚合酶PCR,FISH,单链构象多态性(SSCP)、限制性片段长度多态性(RFLP)、引物原位标记(PRINS)、比较基因组杂交(CGH)、COMET分析(单细胞凝胶电泳)、异源双链分析、Southern分析和变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析的方法。
或者,或另外,供体胚胎可基于一种或多种形态特征,如指示胚胎健康的形态特征来选择。
如本文所述,一旦使用本发明的方法产生期望数量的胚胎(例如,单合子胚胎),这些胚胎可以在体外成熟至期望的胚胎发育阶段(例如,植入前囊胚)并从培养基收获。然后可以将收获的胚胎保存在合适的胚胎保存或转移培养基中,直到它们转移到受体雌性和/或直到胚胎冷藏的时间。本文考虑使用任何市售的胚胎保持和转移培养基。根据胚胎在转移到受体雌性动物之前(例如在运输过程中)短期储存的实施例,收获的胚胎可以储存在约2℃至约8℃之间,这取决于特定保存或转移介质的规格。在一些优选的实施例中,收获的胚胎储存在约4℃。
收获的胚胎也可以冷藏保存用于储存。本领域中用于胚胎低温保藏的主要技术是玻璃化和程序冷冻(SPF),这两种技术都在本文中考虑。根据该实施例,可以将收获的胚胎转移到合适的冷冻保存培养基(例如,含有乙二醇冷冻培养基或类似物)中,冷冻保存,并维持在约-180℃至约-196℃,直到它们解冻用于使用和/或它们被运输。例如,冷藏的胚胎可以在约-196℃储存在液氮中。
除了本发明的方法在商业家畜育种中的应用之外,还预期本发明的方法可以在动物保护和管理领域中具有应用。例如,使用本发明的方法从濒危或威胁物种(包括野生动物和驯养物种)获得的供体胚胎产生的胚胎可以用生物库存放和/或散布用于育种程序。这可以帮助育种计划和管理濒危或威胁物种的种群。因此,在一些实施例中,所述方法还可以包括将通过本发明的方法制备的一个或多个冷藏胚胎用生物库(biobank)存放。
根据将收获的胚胎新鲜转移至受体雌性动物的实施方案,本发明的方法可进一步包括将一个或多个单合子胚胎转移至一个或多个受体雌性动物的输卵管。胚胎移植的方法是本领域已知的。例如,可以使用导管或其他装置手动转移胚胎。
因此,本发明还提供了一种繁殖动物的方法,包括:
(i)将通过本文所述的方法产生的多个胚胎中的一个或多个转移到一个或多个受体雌性动物的输卵管以建立妊娠;以及
(ii)通过分娩从所述怀孕受体雌性产生所述动物。
如本文所述,动物可以是任何脊椎动物,包括哺乳动物物种、两栖动物物种、爬行动物物种、鱼类物种和鸟(例如家禽)物种。在一个具体实施例中,动物是哺乳动物,例如非人哺乳动物。本发明的方法可用于的示例性非人哺乳动物包括家畜物种(例如牛、水牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、鹿、马等),伴侣动物(例如狗、猫等),实验室动物(例如大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、兔等),非人灵长类动物(猕猴和狨猴等)和野生物种(例如有袋类动物、猫、犀牛、大熊猫等)。在一个具体实施例中,本发明的方法可以用于繁殖牛。在另一个实施例中,本发明的方法可用于繁殖绵羊。在另一个实施例中,本发明的方法可用于繁殖猪。在另一个实施例中,本发明的方法可用于繁殖山羊。在另一个实施例中,本发明的方法可用于繁殖马。在另一个实施例中,本发明的方法可用于繁殖骆驼科动物(例如,羊驼)。
实施例
实施例1使用“切割方法”连续孪生胚胎
该实施例概述了进行“切割方法”以产生多个胚胎(例如,单合子胚胎)的实验步骤。
从MOET生产的超黑奶牛获得的36个供体(囊胚)胚胎从Nindooinbah(Beaudesert,昆士兰州,澳大利亚)获得。将36个MOET胚胎分成以下测试组:
1.对照组-六个胚胎保持未切割
2.试验组1-六个胚胎进行单个二等分
3.测试组2-六个胚胎经历两个连续的二等分(即,二等分和扩展的两个连续循环)
4.试验组3-六个胚胎进行三个连续二等分(即,三个连续的二等分和扩增循环)
5.试验组4-六个胚胎经历四个连续的二等分(即,四个连续的二等分和扩增循环)
6.测试组5-六个胚胎经历五个连续的二等分(即,五个连续的二等分和扩增循环)
对于试验组1,通过显微切割将供体囊胚胚胎二等分。二等分后,将胚胎半数培养2、4或6天,以评估内细胞团(ICM)数、滋养层数和总胚胎存活率的恢复。通过形态胚胎评分,ICM标记(例如Nanog、SOX2、OCT4等)的免疫组织化学、滋养层标记(CDX2)和活/死细胞染色对固定的胚胎进行分析以确定最佳培养条件。通过对分离自相应3-8个胚胎的RNA的qPCR验证结果。
在测试组2-5中采用在测试组1中鉴定为对于等分胚胎中ICM扩增最佳的培养条件。使用上述测试组1描述的分析评估连续二等分的成功。
对于测试组3、4和5中的每一个,将在连续二等分过程后已经扩增并且似乎是健康的胚胎植入接受者中以评估后代的妊娠率和健康发育。
实施例2使用“饼干切割方法”产生多个单合子胚
该实施例概述了当进行“饼干切割方法”以产生多个单合子胚胎时所进行的实验步骤。
从MOET生产的超黑奶牛获得的24个供体(囊胚)胚胎从Nindooinbah(Beaudesert,昆士兰州,澳大利亚)获得。将24个MOET胚胎分成以下测试组:
1.对照组-六个胚胎保持未切割
2.试验组1-六个胚胎进行二等分
3.测试组2-六个胚胎进行四等分
4.测试组3-六个胚胎切成八分之一
所有胚胎分裂由兽医在Nindooinbah根据试验组标准进行。
对照组中的六个胚胎未培养,而通过分裂产生的胚胎碎片/切片培养长达七天以评估内细胞团数、滋养层数和胚胎存活的恢复。
培养后,通过形态胚胎评分,ICM标记(例如Nanog、SOX2、OCT4等)的免疫组织化学、滋养层标记(CDX2)和活/死细胞染色对固定的3-8个胚胎进行分析。通过对分离自相应3-8个胚胎的RNA的qPCR验证结果。
实施例3使用“拉开方法”产生多个单合子胚
该实施例概述了进行“拉开方法”以从单个供体胚胎产生多个单合子胚胎的实验步骤。
Nindooinbah(Beaudesert,QLD,Australia)的流动实验室用于提供用来自单个公牛的精液授精的定时受精卵母细胞:提供八个4细胞供体和四个8细胞胚胎。
根据公开的方案用链霉蛋白酶处理胚胎以破坏胚胎的透明带,此后分离单个卵裂球和双卵裂球聚集体,并沉积在含有用于扩增的培养基的多孔板的单独孔中。
培养后,通过形态胚胎评分,ICM标记(例如Nanog、SOX2、OCT4等)的免疫组织化学、滋养层标记(CDX2)和活/死细胞染色对固定的胚胎进行分析。通过对分离自相应3-8个胚胎的RNA的qPCR验证结果。
将12个看起来最好的膨大的卵裂球聚集物培养至7天,并将4个看起来最好的囊胚(来自单个卵裂球或双卵裂球)植入受体以评估妊娠率和后代的健康发育。
实施例4通过连续分裂产生多个胚胎
该实施例描述了实验,其中发明人使用“拉开方法”进行供体胚胎(在本文中也称作孕体)的连续增殖以产生多个囊胚。该实施例证明,在这种情况下使用“拉开”技术的本发明的连续增殖方法能够相对于没有增殖的完整孕体的标准培养显著提高囊胚产生的效率。
方法
孕体培养基制备
化学品和储备溶液
除非另有说明,根据表1制备用于培养和拉开培养基的储备溶液;本研究中使用的所有培养基试剂均得自Sigma。使用水制备储备溶液。蒸汽压渗透压计(Wescor)用于使用/>水将NaCl、KCl和NaHCO3的渗透压分别调节至2000mOsm、200mOsm和2000mOsm。
表1.用于制备培养和拉开培养基的原液。
用于孕体培养和拉开的培养基的制备
在拉开之前和之后(直到发育的第8天),NbryoIVC-2Ca2+培养基用于孕体拉开过程,NbryoIVC-3培养基用于孕体培养。通过按照表2中所列顺序添加储备溶液来制备培养基。通过加入2M氢氧化钠将培养基的pH调节至7.4。使用渗透压计(Wescor)测试培养基的渗透压。通过加入将渗透压调节至270mOsm。最后,将无脂肪酸的牛血清白蛋白(FAF-BSA)以4mg/mL的浓度加入培养基中,并用0.22μm注射器式滤器(Millipore)将培养基过滤灭菌。将培养基在4℃下储存最多两周。
表2.NbryoIVC-2无Ca2+和NbryoIVC-3培养基的组成
链霉蛋白酶制备
链霉蛋白酶是用于在拉开过程中去除透明带(ZP)的蛋白水解酶。链霉蛋白酶在HEPES缓冲的-NbryoIVC-3中以0.3mg/mL的终浓度制备。然后将其通过0.22μm注射器式滤器过滤灭菌,等分并储存在-20℃。
牛孕体的体外发育
牛受精卵生产
牛受精卵通过IVF使用ArtSolutions的商业方案生产。按照标准方法,从Nindoonibah牛场收集的卵巢中体外成熟牛卵母细胞。在IVM 24小时后,成熟的卵母细胞然后用来自Nindoonibah牛场的已证明能育性的单头公牛的解冻精液体外受精。在IVF 24小时后,将推定的受精卵移至体外培养(IVC)培养基中的VitroCleave(ArtSolutions)。除非另有说明,合子在VitroCleave(ArtSolutions)IVC培养基中在38.5℃,7%O2和5%CO2下培养。IVF后,将合子分别培养至2细胞、4细胞、8细胞或16细胞25-32小时、32-42小时、42-52小时、96-100小时。
用于拉开的板和盘的制备
具有0.1%PVA的预涂板
为了避免无ZP的孕体粘附到板上,通过向每个孔中加入50μL无菌0.1%PVA的无菌水来包被96孔圆底板(Corning)的孔,并使其在38.5℃孵育过夜。然后用无菌水洗涤各孔三次以除去未结合的PVA。然后将板干燥,密封并在4℃下储存直至使用。
拉开盘
在拉开步骤之前,将含有20μL链霉蛋白酶液滴、无Ca2+NbryoIVC-2和NbryoIVC-3介质(覆盖有矿物油(Coopers Scientific)的55mm陪氏培养皿(Corning)在38.5℃,7%O2,5%CO2下平衡至少60min。
拉开后培养系统
用0.1%PVA预包被的96孔板用于拉开后单个卵裂球的培养。每个孔含有50μL的NbryoIVC-3或20μL的(ArtSolutions)IVC培养基,并用矿物油覆盖以避免培养基蒸发。将具有培养基的板在38.5℃在7%O2,5%CO2下平衡至少60分钟,然后将分离的卵裂球转移到每个孔中。
系列拉开程序
在解剖显微镜下用加热至37℃的板进行所有牛孕体-拉开程序。在第一次系列拉开(系列n=1)中,用链霉蛋白酶处理2-,4-,8-或16-细胞孕体,以除去周围的ZP,在7%O2和5%CO2的气氛中在加湿培养箱中在38.5℃处理2分钟。一旦ZP溶解,通过三滴20μL的NbryoIVC-3培养基洗涤孕体,以冲洗掉任何残留的链霉蛋白酶,并在38.5℃,7%O2和5%CO2下培养10分钟。然后在38.5℃,7%O2和5%CO2下,将无ZP的孕体转移到无Ca2+NbryoIVC-2培养基中3分钟,以减少细胞-细胞接触。然后,在无Ca2+NbryoIVC-2培养基中,使用微量移液管(~120μm直径)通过抽吸分离每个卵中的卵裂球。在38.5℃,7%O2,5%CO2下,在含有分配培养基的PVA预涂布孔中单独培养单个卵裂球。
经过几轮拉开程序(系列n=2、系列n=3或系列n=4)的卵裂球在分裂后拉开。在第二拉开步骤(系列n=2)中,将裂解的卵裂球在38.5℃,7%O2和5%CO2下置于无Ca2+NbryoIVC-2培养基中1-3分钟。如前所述,通过使用微量移液管抽吸,分离卵裂球并在含有分配培养基的PVA预包被孔中单独培养。在第三拉开过程(系列n=3)和第四拉开过程(系列n=4)中重复该过程。每12-24小时对卵裂球进行评分,直到植入前发育的第8天,根据它们的发育状况(分裂的、致密的、空化的和小的囊胚)。当腔大于孕体囊的一半体积并且存在ICM细胞的内聚簇时,孕体囊被分类为囊胚。
实施例4的命名和定义
如本文所述,术语“胚胎”是指当两个单倍体配子细胞(例如,未受精的卵母细胞和精子细胞)联合形成二倍体全能细胞(例如,受精卵)时形成的受精卵,以及由随后的细胞分裂(即,胚胎分裂)产生的胚胎,包括桑椹胚期(即,约16细胞期)和具有分化的滋养外胚层和内细胞团的囊胚期。本文所述的“孕体”是发育中的胚胎从受精直到出现原始条纹(相当于在牛中发育的第18天)。由于本发明人培养了牛受精卵和单个卵裂球直到受精后八天(到囊胚期),所以使用术语“孕体”来描述发育实体。
从2-、4-、8-、16-细胞期孕体中分离的卵裂球在本文中分别称为“1:2”、“1:4”、“1:8”和“1:16”卵裂球,其中分子表示细胞团中的卵裂球的数量,分母表示卵裂球的等同孕体阶段。图1示出了关于通过系列n=4个拉开轮的2细胞孕体的拉开的该命名系统。图1是在4轮2细胞期胚胎的拉开过程中,卵裂球和发育胚胎的分类方案的示意图。图1的左手侧代表着从合子阶段到囊胚阶段的植入前孕体发育的正常发育。在图1的右手侧示出的拉开过程中,去除ZP以分离孕体内的单个卵裂球(序列n=1)。从2细胞孕体分离的单个卵裂球称为1:2。然后使这些卵裂球发育形成称为2:4的对。切割后,这些2:4的卵裂球可以被带到另一轮的拉开(系列N=2),其中卵裂球将被分离成1:4。该过程可以重复n次,例如n=3和/或n=4或更多。当这些卵裂球发育时,它们过渡到随后的等效植入前孕体阶段,因此分母相应地改变。在1:16阶段后,卵裂球可以致密化,然后形成囊胚等同物。
结果:
通过系列n=4个拉开程序拉开2细胞牛孕体。
总共28个2细胞牛受过拉开。在系列n=1拉开步骤后,获得56个1:2卵裂球(参见表2;以及用于说明术语的图1)。55/56的1:2卵裂球分成2:4,其中48个被带到另一个拉开轮,系列n=2。在系列n=2个拉开后,将91/96的1:4卵裂球分成2:8,其中81个被带到另一个拉开轮,系列n=3。在系列n=3的拉开程序后,将1:8卵裂球的145/162分成2:16,其中100个被带到另一个拉开循环,系列n=4。将系列n=1、n=2和n=3中的所有单个卵裂球在50μL的NbryoIVC-3培养基中培养。最后,在系列n=4个拉开步骤后,获得199个1:16的卵裂球,并在20μL的体外胚细胞(ArtSolutions)IVC培养基中进行至囊胚等同阶段。在这些199个1:16卵裂球中,171个(85.9%)分裂,156个(78.4%)致密,127个(63.8%)空化和53个(26.6%)进展形成小囊胚。
文献一致地报道了完整的牛孕体以~30%的效率培养至囊胚期(如表2所示),并且这是在家畜的胚胎培养和转移中具有广泛经验的发明人的经验。因此,如果在不进行本文所述的拉开步骤的情况下培养28个2-细胞供体孕体,基于~30%的效率预计将产生8个囊胚。使用上述系列拉开方法,本发明人能够从最初的28个供体孕体产生53个囊胚,从而相对于完整孕体的培养提高了大约6倍的囊胚产生效率。
表2.通过系列拉开程序(系列n=4)从拉开的2细胞牛孕体获得的囊胚等同物的发育
实施例5通过拉开≥8细胞牛胚胎产生多个胚胎
该实施例描述了本发明人使用“拉开方法”进行≥个8细胞供体孕体的拉开以产生多个囊胚的实验。
方法
用于拉开孕体的培养基,培养条件和程序一般如实施例4的“方法”部分所述。
简言之,对总共19个牛≥8细胞期孕体进行拉开。孕体包含在8到43个细胞之间。将分离的卵裂球在20μL VitroBlast(ArtSolutions)IVC培养基中单独培养。由于孕体中细胞的分裂不是同步的,因此在这些孕体中存在卵裂球发育的异质阶段,包括1:8、1:16、1:32和1:64卵裂球。结果,分别分析每种类型的卵裂球。
结果:
从19个孕体中,获得53个1:8卵裂球,其中38个(71.7%)分裂,34个(64.1%)致密,25个(47.2%)空化和21个(39.6%)形成囊胚(表2.2)。此外,获得162个1:16的卵裂球,其中126个(50%)分裂,105个(64.8%)致密,99个(61.1%)空化,36个(22.2%)形成囊胚。获得54个1:32卵裂球,其中47个(87.0%)分裂,45个(83.3%)致密,44个(81.4%)空化,3个(5.6%)形成囊胚。将一些1:32卵裂球成对培养(即2:32)。具体地,两个2:32卵裂球对是从拉开过程获得的,其中2个(100%)分裂,1个(50.0%)致密,1个(50.0%)空化并且没有形成囊胚。最后,获得27个1:64的卵裂球,其中13个(48.1%)分裂,11个(40.7%)致密,11个(40.7%)空化,1个(3.7%)形成囊胚。总共从最初的19个供体孕体中产生了61个囊胚。这总结在表3中。
从≥8-细胞期的孕体,包括包含在发育上等同于16-,32-和64-细胞胚胎的卵裂球的孕体开始,本发明人已经使用“拉开”方法的胚胎增殖能够显著提高囊胚产生的效率。在这点上,本发明人能够从最初的19个供体孕体产生61个囊胚,这代表囊胚产生效率相对于完整受孕者的培养增加10倍(其通常实现约30%的效率,如上所述)。
表3通过一系列拉开程序(系列N=1)从拉开的≥8-细胞牛孕体获得的囊胚等同物的发育
本领域技术人员将理解,在不脱离本发明的广泛一般范围的情况下,可以对上述实施例进行许多变化和/或修改。因此,本实施例在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的。
Claims (37)
1.一种繁殖一个或多个供体胚胎的方法,所述方法包括:
(i)获得包含至少两个胚胎细胞的一个或多个供体胚胎;
(ii)从一个或多个供体胚胎中分离所述胚胎细胞的一个或多个;
(iii)在适于产生多个胚胎的条件下体外扩增所述胚胎细胞,每个包含至少两个胚胎细胞;
(iv)分离在(iii)中产生的所述多个胚胎中的一个或多个以在随后的增殖中用作供体胚胎;以及
(v)重复步骤(i)-(iv)‘n’次,其中‘n’为≥3。
2.如权利要求1所述的方法,其中n等于≥4。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中从在(i)中获得的供体胚胎产生16个或更多个单合子胚胎。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述一个或多个供体胚胎各自包含2至64个胚胎细胞。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述一个或多个供体胚胎各自包含2至16个胚胎细胞。
6.一种繁殖供体胚胎的方法,所述方法包括:
(i)获得包含一个或多个胚胎细胞的供体胚胎,所述胚胎细胞在发育上等同于来自16细胞胚胎或预致密桑椹胚的胚胎细胞;
(ii)从所述供体胚胎中分离一个或多个胚胎细胞;
(iii)在适于从所述供体胚胎产生多个单合子胚胎的条件下体外扩增所述胚胎细胞;以及
(iv)在适于产生多个单合子囊胚的条件下培养所述多个单合子胚胎。
7.如权利要求6所述的方法,其中在培养所述多个纯合胚胎以产生所述多个囊胚的步骤之前,所述方法进一步包括以下步骤:
(i)分离产生的多个单合子胚胎中的一个或多个以在随后的增殖中用作供体胚胎,其中分离用于随后的增殖的每个供体胚胎包含至少两个胚胎细胞;
(ii)从一个或多个供体胚胎中分离所述胚胎细胞的一个或多个;
(iii)在适于产生多个胚胎的条件下体外扩增所述胚胎细胞,每个包含至少两个胚胎细胞;
(iv)分离在(iii)中产生的所述多个胚胎中的一个或多个以在随后的增殖中用作供体胚胎;以及
(v)在适于产生多个囊胚的条件下培养所述多个胚胎之前,重复步骤(i)-(iv)‘n’次。
8.如权利要求7所述的方法,其中n等于≥2。
9.如权利要求7所述的方法,其中n等于≥3。
10.如权利要求7所述的方法,其中n等于≥4。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法,其中从一个或多个供体胚胎中分离所述一个或多个胚胎细胞是通过将供体胚胎分成多个部分来实现的,每个部分包含一个或多个胚胎细胞。
12.如权利要求11所述的方法,其中使用显微外科刀片或激光进行所述一个或多个供体胚胎的分裂。
13.如权利要求1至10中任一项所述的方法,其中从所述一个或多个供体胚胎中分离所述一个或多个胚胎细胞是通过破坏透明带(ZP),并从所述一个或多个供体胚胎中分离所述一个或多个胚胎细胞来实现的。
14.如权利要求13所述的方法,其中用酶或机械方法破坏透明带,用微量移液管从所述一个或多个供体胚胎中吸出所述一个或多个胚胎细胞,从而分离所述胚胎细胞。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法,其中所述胚胎细胞在一种或多种能促进胚胎发生的因子存在下培养。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法,其中所述胚胎细胞在一种或多种能促进全能性的因子存在下培养。
17.如权利要求1至16中任一项所述的系统,其中所述供体胚胎来自哺乳动物物种。
18.如权利要求17所述的方法,其中所述哺乳动物物种是家畜物种。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述家畜物种是牛物种。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法,其中步骤(i)中的一个或多个供体胚胎通过体内受精产生。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法,其中步骤(i)中的一个或多个供体胚胎通过体外受精(IVF)产生。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法,其中步骤(i)中的一个或多个供体胚胎是新鲜的。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法,其中步骤(i)中的一个或多个供体胚胎已经被冷冻保存。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法,进一步包括在步骤(i)之前基于一种或多种遗传筛选标准、遗传诊断和/或一种或多种形态学标准选择所述一个或多个供体胚胎。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法,其中所述一个或多个供体胚胎已被遗传修饰。
26.如权利要求25所述的方法,其中所述一个或多个供体胚胎包含用于从中产生的胚胎和/或从所述胚胎产生的动物的可追溯性的独特遗传标签或标识符。
27.如权利要求1至26中任一项所述的系统,其中所产生的多个胚胎在体外扩增以形成囊胚。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法,进一步包括收获由所述方法产生的胚胎。
29.如权利要求28所述的方法,其中所述收获的胚胎的一个或多个保存在胚胎保存培养基中。
30.如权利要求29所述的方法,其中所述收获的胚胎的一个或多个储存在约4℃。
31.如权利要求28所述的方法,其中冷冻保存所述收获的胚胎的一个或多个。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法,进一步包括将所述方法产生的所述胚胎的一个或多个转移到一个或多个受体雌性动物的输卵管中。
33.通过权利要求1至32中任一项所述的方法产生的一个或多个胚胎。
34.一种繁育动物的方法,其包括:
(i)将通过权利要求1至32中任一项所述的方法产生的所述胚胎的一个或多个转移至一个或多个受体雌性动物的输卵管以建立妊娠;以及
(ii)通过分娩从所述怀孕受体雌性产生所述动物。
35.如权利要求34所述的方法,其中所述动物是哺乳动物物种。
36.如权利要求35所述的方法,其中所述哺乳动物物种是家畜物种。
37.如权利要求36所述的方法,其中所述家畜物种是牛物种。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AU2020902691 | 2020-07-31 | ||
AU2020902691A AU2020902691A0 (en) | 2020-07-31 | Methods of embryo twinning | |
PCT/AU2021/050836 WO2022020907A1 (en) | 2020-07-31 | 2021-07-30 | Methods of embryo twinning |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116761894A true CN116761894A (zh) | 2023-09-15 |
Family
ID=80037875
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202180066715.5A Pending CN116761894A (zh) | 2020-07-31 | 2021-07-30 | 胚胎孪生化方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20240052303A1 (zh) |
EP (1) | EP4189099A1 (zh) |
JP (1) | JP2023535524A (zh) |
KR (1) | KR20230054683A (zh) |
CN (1) | CN116761894A (zh) |
AR (1) | AR123099A1 (zh) |
AU (1) | AU2021317747A1 (zh) |
CA (1) | CA3190505A1 (zh) |
CL (1) | CL2023000286A1 (zh) |
MX (1) | MX2023001353A (zh) |
WO (1) | WO2022020907A1 (zh) |
-
2021
- 2021-07-30 CA CA3190505A patent/CA3190505A1/en active Pending
- 2021-07-30 US US18/018,831 patent/US20240052303A1/en active Pending
- 2021-07-30 AR ARP210102132A patent/AR123099A1/es unknown
- 2021-07-30 JP JP2023507292A patent/JP2023535524A/ja active Pending
- 2021-07-30 KR KR1020237007072A patent/KR20230054683A/ko unknown
- 2021-07-30 CN CN202180066715.5A patent/CN116761894A/zh active Pending
- 2021-07-30 WO PCT/AU2021/050836 patent/WO2022020907A1/en active Application Filing
- 2021-07-30 AU AU2021317747A patent/AU2021317747A1/en active Pending
- 2021-07-30 EP EP21850880.2A patent/EP4189099A1/en active Pending
- 2021-07-30 MX MX2023001353A patent/MX2023001353A/es unknown
-
2023
- 2023-01-30 CL CL2023000286A patent/CL2023000286A1/es unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2021317747A1 (en) | 2023-03-30 |
MX2023001353A (es) | 2023-04-26 |
CL2023000286A1 (es) | 2023-09-01 |
US20240052303A1 (en) | 2024-02-15 |
AR123099A1 (es) | 2022-10-26 |
KR20230054683A (ko) | 2023-04-25 |
CA3190505A1 (en) | 2022-02-03 |
JP2023535524A (ja) | 2023-08-17 |
WO2022020907A1 (en) | 2022-02-03 |
EP4189099A1 (en) | 2023-06-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Byrne et al. | Analysis of apoptosis in the preimplantation bovine embryo using TUNEL | |
Funahashi et al. | In vitro development of in vitro-matured porcine oocytes following chemical activation or in vitro fertilization | |
Honaramooz et al. | Recent advances in application of male germ cell transplantation in farm animals | |
Kane | A review of in vitro gamete maturation and embryo culture and potential impact on future animal biotechnology | |
Wang et al. | Transgenic goats produced by DNA pronuclear microinjection of in vitro derived zygotes | |
JP5439677B2 (ja) | 透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を調製するための方法及び培地、該方法により調製された哺乳動物卵を用いた受精方法 | |
Kim et al. | Improved preimplantation development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos by caffeine treatment | |
Feng et al. | Fertilization and early embryology: Effect of different co-culture systems in early human embryo development | |
Hasler et al. | In vitro fertilization | |
Ogura et al. | Microinsemination and nuclear transfer using male germ cells | |
US20240052303A1 (en) | Methods of embryo twinning | |
Geber et al. | Laboratory techniques for human embryos | |
Choi et al. | Developmental competence and cryotolerance of caprine parthenogenetic embryos cultured in chemically defined media | |
WO2023141683A1 (en) | Methods of embryo multiplication | |
Gordon | Large-scale production of cattle embryos by in vitro culture methods. | |
Bori | Developmental potency of goat embryos produced by intra cytoplasmic sperm injection and in vitro fertilization. | |
Picard et al. | The micromanipulation of farm animal embryos | |
KR101985924B1 (ko) | 세포질 이식을 이용한 복제배아의 재프로그래밍 효율 향상 방법 | |
Ocampo et al. | Blastocyst formation of pig embryos derived from in vitro fertilization of in vitro matured pig oocytes in the amniotic fluid of a developing chick embryo | |
KR20080077779A (ko) | 돼지 배아의 체외배양 방법 | |
Anderson | Manipulation of the mammalian embryo | |
Fair et al. | Developments in the use of embryo technologies in dairy cows | |
RU2730597C2 (ru) | Криоконсервация эмбрионов копытных | |
Van Nguyen et al. | Influence of fetal calf serum on the production of bovine embryos in vitro | |
Kharche et al. | Parthenogenesis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |