JP2023535524A - 胚双子化法 - Google Patents

Abstract

本開示は、一般に、連続増殖、例えば３回以上の増殖を行うことにより、１つ以上のドナー胚から複数の胚を生産する方法、および動物の育種における当該方法の適用に関する。本開示は、１６細胞胚または予備圧縮桑実胚からの胚細胞と発育上に同等な胚細胞を含むドナー胚から複数の一卵性胚を生産する方法にも関する。【選択図】図１

Description

本開示は、一般に、連続増殖サイクル、例えば３回以上の増殖を行うことにより、１つ以上のドナー胚から複数の胚を生産する方法、および動物の育種における当該方法の適用に関する。本開示は、１６細胞胚または予備圧縮桑実胚からの胚細胞と発育上に同等な胚細胞を含むドナー胚から複数の一卵性胚を生産する方法にも関する。

生殖補助技術（ＡＲＴ）は特に過去数十年の間に大きな進歩を遂げた。人工授精（ＡＩ）はまだ牛の集団の遺伝的利得を実現する最も（コスト的に）効果的な方法であり、乳業で広く用いられている。この点で、冷凍精液と胚の世界市場は好調が続き、ＡＩによって数百万頭の牛が飼育され、世界では毎年１００万個以上の胚が移植されている。乳業ではＡＩのために精液を提供する大多数のトップレベルのサイアーは胚移植（ＥＴ）に由来するものであり、発情周期と排卵を制御する方法の改善により、ＡＩ、ドナー牛の過排卵、およびＥＴレシピエントの管理のためのより効果的なプログラムがもたらされる。ＡＲＴにおけるこれらの進歩にもかかわらず、各胚の生産に関連する費用のため、生産者による多重排卵と胚移植（ＭＯＥＴ）などの生殖技術への利用はまだ限られている。そのため、従来のＡＩと異なり、ＭＯＥＴが生産者によって従来の繁殖方法として利用される可能性は低い。

最近では、胚の二等分によって、卵割期の胚から分離された割球から遺伝的に同じ一卵性双胎を生産するアプローチが報告されている。ＡＲＴの「ツールボックス」へのこの新たな追加は、エキサイティングで、生産者に（サイアーの遺伝子に加えて）メス（ダム）の遺伝子をより効果的に捉えせ、選択させることができるが、他のＥＴおよびＩＶＦに基づくアプローチのような胚双子化の商業レベルでの広範な採用は、生産者にとって法外なコストと技術のスケーリングに関連する挑戦によって妨げられる可能性がある。

したがって、これらの制限のうちの１つ以上を解決し、産業での適用を支援するために、胚増殖の改善されたアプローチが必要である。

本開示は、１つ以上のドナー胚から複数の胚を生産する方法に広く関する。この点で、本発明者らは、得られた胚が胚盤胞期まで膨張する前に、少なくとも２つの胚細胞を含むウシドナー胚を連続的に３回以上増殖させることができることを初めて示した。このようにして、本発明者らは、初期無傷ドナー胚を直接に胚盤胞になるまで単純に培養する場合よりも、本明細書に記載の連続増殖法を用いた初期ドナー胚からの胚盤胞回収の効率が著しく（例えば、最大６倍まで）高いことを示した。

また、本発明者らは、本明細書に記載の連続増殖ステップを採用して胚をさらに増殖させる場合を含め、１６細胞胚または予備圧縮桑実胚からの胚細胞と発育上に同等な１つ以上の胚細胞を含むウシ胚をドナー胚として使用して複数の一卵性胚を生産することができることをさらに初めて示した。通常、８細胞、１６細胞、３２細胞、６４細胞胚に由来する細胞と発育上に同等な割球の異種混合物を含む、より発達したドナー胚から始め、本発明者らは、初期無傷ドナー胚を直接に胚盤胞になるまで単純に培養する場合よりも、本明細書に記載の増殖方法を用いた胚盤胞回収の効率が著しく高い（例えば、連続増殖を採用した場合に最大１０倍高い）ことを示した。

一例では、本開示は、１つ以上のドナー胚を増殖させる方法を提供し、この方法は、
（ｉ）少なくとも２つの胚細胞を含む１つ以上のドナー胚を得るステップ、
（ｉｉ）前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離するステップ、
（ｉｉｉ）それぞれが少なくとも２つの胚細胞を含む複数の胚を生産するのに適した条件下で、前記胚細胞を体外で膨張させるステップ、
（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）で生産された、後続の増殖においてドナー胚として使用される前記複数の胚のうちの１つ以上を単離するステップ、および
（ｖ）前記ステップ（ｉ）～（ｉｖ）を「ｎ」（「ｎ」≧３）回繰り返すステップを含む。

別の例では、本開示は、ドナー胚を増殖させる方法を提供し、この方法は、
（ｉ）１６細胞胚または予備圧縮桑実胚からの胚細胞と発育上に同等な１つ以上の胚細胞を含むドナー胚を得るステップ、
（ｉｉ）前記ドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離するステップ、
（ｉｉｉ）前記ドナー胚から複数の一卵性胚を生産するのに適した条件下で、前記胚細胞を体外で膨張させるステップ、および
（ｉｖ）複数の一卵性胚盤胞を生産するのに適した条件下で、前記複数の一卵性胚を培養するステップを含む。

前記複数の一卵性胚を培養して前記複数の胚盤胞を生産する前記ステップの前に、前記方法は、
（ｉ）後続の増殖においてドナー胚として使用するために生産された前記複数の一卵性胚のうちの１つ以上を単離するステップであって、後続の増殖のために単離された各ドナー胚が少なくとも２つの胚細胞を含むステップ、
（ｉｉ）前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離するステップ、
（ｉｉｉ）それぞれが少なくとも２つの胚細胞を含む複数の胚を生産するのに適した条件下で、前記胚細胞を体外で膨張させるステップ、
（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）で生産された、後続の増殖においてドナー胚として使用される前記複数の胚のうちの１つ以上を単離するステップ、および
（ｖ）複数の胚盤胞を生産するのに適した条件下で前記複数の胚を培養する前に、前記ステップ（ｉ）～（ｉｖ）を「ｎ」回繰り返すステップをさらに含んでもよい。

一例では、前記ドナー胚を、各部分（またはデミ胚）が１つ以上の胚細胞を含む２つ以上の部分に分割することによって、前記１つ以上の胚細胞を各ドナー胚から分離することを達成する。一例では、少なくとも１つのドナー胚を２つの部分に分割してもよい。一例では、少なくとも１つのドナー胚を３つの部分に分割してもよい。一例では、少なくとも１つのドナー胚を４つの部分に分割してもよい。一例では、少なくとも１つのドナー胚を５つ以上の部分に分割してもよい。

上記の各例では、マイクロサージカル器具を使用して、ドナー胚を分割または切断し得る。例えば、ブレード（例えば、メスの刃またはその一部）、細いガラス針またはレーザー（例えば、レーザー支援生検）を用いたマイクロダイセクションによって、ドナー胚を分割または切断し得る。他の例では、ナノダイセクション（例えば、フェムト秒レーザーパルスまたはナノメス付きの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ））によって、ドナー胚を分割または切断し得る。

別の例では、透明帯（ＺＰ）を破壊し、前記ドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を単離することによって、各ドナー胚から前記１つ以上の胚細胞を分離することを達成する。本明細書では、これは「解凍」または「解凍法」と呼ばれる。この例によれば、ＺＰを破壊し得、１つ以上のドナー胚から胚細胞のうちの１つ以上を単離し得る。一例では、ＺＰを酵素的または機械的に破壊する。例えば、前記ＺＰを酵素的または機械的に破壊し、マイクロピペットを使用して前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を吸引することにより、前記胚細胞を単離し得る。

別段の記載がない限り、「ｎ」は１以上である。例えば、「ｎ」は２以上であってもよい。例えば、「ｎ」は３以上であってもよい。「ｎ」が３以上である例によれば、「ｎ」は４以上であってもよい。例えば、「ｎ」は５以上であってもよい。例えば、「ｎ」は６、７、８、９または１０以上であってもよい。

一例では、本開示の方法により、１６個以上の一卵性胚を生産する。一例では、本開示の方法により、３２個以上の一卵性胚を生産する。一例では、本開示の方法により、６４個以上の一卵性胚を生産する。一例では、本開示の方法により、１２８個以上の一卵性胚を生産する。一例では、本開示の方法により、２５６個以上の一卵性胚を生産する。一例では、本開示の方法により、５１２個以上の一卵性胚を生産する。

一例では、胚発生を促進し得る１つ以上の因子の存在下で、前記胚細胞またはそれを含む胚を培養し得る。例えば、（例えば収穫を目的として）、一卵性胚を形成し、膨張させるために、胚発生を促進し得る１つ以上の因子の存在下で、胚細胞を培養し得る。

別の例では、全能性の促進および／または胚発生の抑制もしくは防止が可能な１つ以上の因子の存在下で、前記胚細胞またはそれを含む胚を培養し得る。例えば、母性ｍＲＮＡのクリアランスを促進し得る１つ以上の因子の存在下で、前記胚細胞またはそれを含む胚を培養し得る。

別段の記載がない限り、圧縮がまだ発生していない場合、上記ドナー胚または各ドナー胚は、約２～約３００個の胚細胞、例えば、約２～約２５６個の胚細胞または約２～約６４個の胚細胞を含む。例えば、圧縮がまだ発生していない場合、上記ドナー胚または各ドナー胚は、約１００～約２５６個の胚細胞を含んでもよい。例えば、圧縮がまだ発生していない場合、上記ドナー胚または各ドナー胚は、約６４～約１２８個の胚細胞を含んでもよい。例えば、圧縮がまだ発生していない場合、上記ドナー胚または各ドナー胚は、約３２～約６４個の胚細胞を含んでもよい。例えば、圧縮がまだ発生していない場合、上記ドナー胚または各ドナー胚は、約１６～約３２個の胚細胞を含んでもよい。例えば、圧縮がまだ発生していない場合、上記ドナー胚または各ドナー胚は、約２～約３２個の胚細胞を含んでもよい。例えば、圧縮がまだ発生していない場合、上記ドナー胚または各ドナー胚は、約２～約１６個の胚細胞を含んでもよい。例えば、上記ドナー胚または各ドナー胚は、約２～約８個の胚細胞を含んでもよい。

ドナー胚が１６細胞胚または予備圧縮桑実胚からの胚細胞と発育上に同等な１つ以上の胚細胞を含む一例によれば、ドナー胚は、約１２～約３２個のまだ圧縮されていない胚細胞を含んでもよい。この例によれば、ドナー胚は、８細胞胚からの胚細胞と発育上に同等な１つ以上の胚細胞、１６細胞胚からの胚細胞と発育上に同等な１つ以上の胚細胞、３２細胞胚からの胚細胞と発育上に同等な１つ以上の胚細胞、および／または６４細胞胚からの胚細胞と発育上に同等な１つ以上の胚細胞を含んでもよい。

上記の各例では、脊椎動物からドナー胚を得ることができる。

一例では、脊椎動物は哺乳類種であってもよい。

一例では、哺乳類種は家畜種であってもよい。例えば、家畜種はウシ種であってもよい。例えば、家畜種はヒツジ種（すなわち、羊）であってもよい。例えば、家畜種はブタ種（すなわち、豚）であってもよい。例えば、家畜種はウマ種（すなわち、馬）であってもよい。例えば、家畜種はヤギ種（すなわち、山羊）であってもよい。例えば、家畜種はシカ種（すなわち、鹿）であってもよい。例えば、家畜種はラクダ種（例えば、駱駝またはアルパカ）であってもよい。

いくつかの例では、ステップ（ｉ）で得られたドナー胚のうちの１つ以上が体内受精で生産される。他の例では、ステップ（ｉ）で得られたドナー胚のうちの１つ以上が体外受精（ＩＶＦ）で生産される。

いくつかの例では、ステップ（ｉ）で得られたドナー胚のうちの１つ以上が新鮮である。他の例では、ステップ（ｉ）で得られたドナー胚のうちの１つ以上が凍結保存されている。例えば、ドナー胚が解凍されてもよい。

上記の各例では、前記方法は、１つ以上の遺伝子スクリーニング基準、遺伝子診断基準、および／または１つ以上の形態学的基準に基づいて、ステップ（ｉ）で得られたドナー胚のうちの１つ以上を選択するステップをさらに含んでもよい。例えば、ステップ（ｉ）の前に、選択ステップを実行してもよい。

一例では、関心のある形質に関連する１つ以上の遺伝子マーカー（例えば、ＳＮＰ対立遺伝子またはハプロタイプ）が存在するか否かについて、１つ以上のドナー胚をスクリーニングすることで、遺伝子スクリーニング基準を決定し得る。一例では、表現型生産形質、薬剤耐性、害虫および／または寄生虫に対する感受性、および性別（すなわち、胚がオスかメスかを判定すること）から、関心のある形質を選択する。

一例では、１つ以上の症状、疾患、またはそれらの素因に関する遺伝子診断に基づいて、ドナー胚のうちの１つ以上を選択し得る。

一例では、胚の健康を示す１つ以上の形態学的特徴に基づいて、ドナー胚のうちの１つ以上を選択し得る。

上記の各例では、ドナー胚のうちの１つ以上を遺伝子組換えし得る。例えば、その中に含まれる胚細胞のゲノムに外因性核酸を導入することによって、ドナー胚のうちの１つ以上を遺伝子組換えし得る。例えば、その中に含まれる胚細胞のゲノムを編集することによって、ドナー胚のうちの１つ以上を遺伝子組換えし得る。

一例では、ドナー胚のうちの１つ以上は、そこから生産された胚および／または前記胚から生産された動物のトレーサビリティのためのユニークな遺伝子タグまたは核酸識別子を含む。例えば、遺伝子組換えを使用して、ユニークな遺伝子タグまたは核酸識別子を導入し得る。

上記の各例では、前記方法は、体外で複数の胚を膨張させて胚盤胞を形成するステップを含む。例えば、前記方法は、体外で胚を拡張させて、着床の準備が整った成熟した胚盤胞を形成するステップを含んでもよい。

前記方法は、この方法によって生産された複数の胚を収穫するステップをさらに含んでもよい。例えば、前記方法は、胚が胚盤胞期まで成熟した時点でそれらを収穫するステップを含んでもよい。

いくつかの例では、前記収穫された胚のうちの１つ以上を胚保持培地に保存する。例えば、収穫された胚のうちの１つ以上を約４℃で保存してもよい。

いくつかの例では、前記収穫された胚のうちの１つ以上を凍結保存する。冷凍保存された胚を約－１８０℃～約－１９６℃で保存してもよい。例えば、冷凍保存された胚を約－１９６℃で液体窒素に保存してもよい。

いくつかの例では、本開示の方法は、前記方法により生産された前記胚のうちの１つ以上を、１つ以上のレシピエントメスの輸卵管に移植するステップをさらに含む。

また、本開示は、本開示の方法によって生産された１つ以上の胚を提供する。一例では、前記１つ以上の胚を約４℃で胚ストレージまたは移植培地で提供し得る。別の例では、前記１つ以上の胚を凍結保存し得る。

一例では、胚は哺乳類種（例えば、非ヒト哺乳類種）に由来してもよい。一例では、非ヒト哺乳類種は家畜種である。例えば、家畜種はウシ種であってもよい。例えば、家畜種はヒツジ種（すなわち、羊）であってもよい。例えば、家畜種はブタ種（すなわち、豚）であってもよい。例えば、家畜種はウマ種（すなわち、馬）であってもよい。例えば、家畜種はヤギ種（すなわち、山羊）であってもよい。例えば、家畜種はシカ種（すなわち、鹿）であってもよい。例えば、家畜種はラクダ種（例えば、駱駝またはアルパカ）であってもよい。

また、本開示は、動物を飼育する方法を提供し、この方法は、
（ｉ）本開示の方法により生産された胚のうちの１つ以上を、１つ以上のレシピエントメスの輸卵管に移植して、妊娠を成立させるステップ、および
（ｉｉ）妊娠したレシピエントメスから分娩により動物を生産するステップを含む。

一例では、前記動物は脊椎動物である。例えば、脊椎動物は、哺乳類、両生類、爬虫類、魚類または鳥類であってもよい。

１つの特定の例では、前記動物は哺乳類、例えば、非ヒト哺乳類である。上記方法を使用して生産され得る例示的な非ヒト哺乳類には、家畜種（例えば、牛、水牛、豚、羊、山羊、駱駝、鹿、馬など）、伴侶動物（例えば、犬、猫など）、実験動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギなど）、非ヒト霊長類（アカゲザル、マーモセットなど）、および野生動物種（例えば、有袋類、猫、サイ、ジャイアントパンダなど）がある。１つの特定の例では、本開示の方法は、牛を飼育するために使用することができる。別の例では、本開示の方法は、羊を飼育するために使用することができる。別の例では、本開示の方法は、豚を飼育するために使用することができる。別の例では、本開示の方法は、山羊を飼育するために使用することができる。別の例では、本開示の方法は、馬を飼育するために使用することができる。

図１は、２細胞期胚からの４回の解凍における割球と発育中の胚の分類スキームの概略図である。左側は、受精卵期から胚盤胞期までの着床前受胎産物の正常な発育を表す。解凍プロシージャにおいて、透明帯（ＺＰ）（受胎産物を囲む灰色の帯）を取り除いて、受胎産物内の個々の割球を分離する（連続分割の回数ｎ＝１）。２細胞受胎産物から単離された個々の割球は、１：２と呼ばれる。そして、２：４と名付けられたペアを形成するように、これらの割球を発育させる。卵割の後、これらの２：４割球に対してもう一回解凍を行うことができ（連続分割の回数ｎ＝２）、その解凍において、割球が１：４に分離される。このプロセスを繰り返して、それぞれｎ＝３とｎ＝４の２回の連続分割をさらに行う。これらの割球が発育につれて、後続の相当する着床前受胎産物の段階に移行し、そのため分母がそれに応じて変化する。１：１６段階の後、割球を圧縮し、キャビテートして、胚盤胞に相当するものを形成することができる。

一般的な技術と定義
特に別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者（例えば、動物栄養、飼料配合、微生物学、家畜管理など）によって一般に理解されるものと同じ意味を持つとみなされるべきである。

本明細書で使用されるように、単数形の場合であっても、文脈に別段の規定がない限り、これらの単語の複素形を含む。

「および／または」という用語、例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、「ＸおよびＹ」あるいは「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解され、かつ、両方の意味またはいずれかの意味を明確に支持するものとみなされるべきである。

本明細書全体を通して、単語「含む」または「含んだ」もしくは「含んでいる」などの変形は、記載された要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップのグループを含むことを示唆するものとして理解されるが、他の要素、整数もしくはステップ、または他の要素、整数もしくはステップのグループを除外することを示唆するものではない。

本明細書では、「約」という用語は近似を表すために用いられる。「約」という用語が数値範囲と関連して使用される場合、列挙された数値の上下に境界を拡張することによって、その範囲を修正する。一般に、本明細書では、「約」という用語は、数値を１０％で上下（より高くまたはより低く）して、記載された値より上または下に修正するために用いられる。

当業者であれば、本開示が、具体的に記載されたもの以外の変形および修正を受けやすいことを理解するであろう。本開示がそのようなすべての変形および修正を含むことを理解するべきである。本開示は、本明細書で個別にまたは一括して言及または指示されているすべてのステップ、特徴、組成物および化合物、ならびにこれらのステップまたは特徴のうちの任意の２つ以上の任意およびすべての組み合わせをも含む。したがって、本開示の任意の特定の態様または実施形態の各特徴は、必要な修正を加えて、本開示の任意の他の態様または実施形態に適用され得る。

本開示は、例示のみを目的とする本明細書に記載された具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではない。本明細書に記載されるように、機能的に同等な製品、組成物および方法は明らかに本開示の範囲内にある。

本明細書全体を通して、特に別段の記載がない限り、あるいは文脈上別段の要件がない限り、単一のステップ、単一の物質組成物、ステップのグループまたは物質組成物のグループへの言及は、これらのステップ、物質組成物、ステップのグループまたは物質組成物のグループのうちの１つまたは複数（すなわち、１つ以上）を包含するべきである。

具体的な定義
本明細書では、使用される「胚」という用語は、２つの半数体配偶子細胞（例えば、未受精の卵母細胞と精子細胞）が結合して二倍体全能性細胞（例えば、受精の卵子）を形成する際に形成される受精卵、および後続の細胞分裂（すなわち、胚の卵割）から生じる胚（桑実胚期（すなわち、内細胞塊が圧縮されている間）と、栄養外胚葉と内細胞塊が分化した胚盤胞期とを含む）のことを指す。

本明細書で使用されるように、「桑実胚」という用語は胚発育の１つの段階を指す。桑実胚は、透明帯と呼ばれる糖タンパク質の膜に含まれる細胞球（割球と呼ばれる）からなる早期胚である。（ウシについて図１に示すように）一連の卵割イベントを経て、単細胞受精卵から桑実胚を生産する。桑実胚の形成の前に、「圧縮」という重要なイベントがあり、その過程で、（種によって異なる）約８～３２個の細胞を含む胚は、細胞の形態と細胞間の接着に変化が起こり、この固体細胞球の形成が始まる。「桑実胚」は通常（種によって異なる）１６～３２個ほどの細胞を含み、かつ桑に似ていることから、桑実胚（ラテン語ｍｏｒｕｓ：桑）と呼ばれる。ウシ種の場合、圧縮のプロセスは通常１６細胞期以降に発生し、発育中の胚は３２細胞期で早期の桑実胚期に達し、このとき、胚細胞（または割球）の間の細胞間接着が進み、胚は圧縮された内細胞塊（ＩＣＭ）を含む。

細胞分化とキャビテーションのプロセスを経て、桑実胚は胚盤胞を生み出す。本明細書で使用されるように、「胚盤胞」という用語は、全能性胚性幹細胞を含む内細胞塊（ＩＣＭ）または胎芽胚と、後に胎盤を形成する細胞外層または栄養膜とを有する胚を指すと理解されるべきである。栄養膜は、内細胞塊と、胞胚腔と呼ばれる液体で満たされた胚盤胞腔とを取り囲んでいる。胚盤胞には、通常、７０～３００個の胚細胞が含まれている（胚の種や成熟度によって異なる場合がある）。いくつかの例では、胚盤胞は、約６４～約１２８個の細胞を含んでもよい。いくつかの例では、胚盤胞は、約１２８～約２５６個の細胞を含んでもよい。いくつかの例では、胚盤胞は、１５０～２５６個の細胞を含んでもよい。いくつかの例では、胚盤胞は、約２５６個の細胞を含んでもよい。

本明細書で使用されるように、「胚細胞（単数）」または「胚細胞（複数）」という用語は、受精卵期から胚盤胞期までの発育中の胚内のすべての全能性細胞を包含することを意図している。例えば、受精卵期から桑実胚期までの発育中の胚（「割球」とも呼ばれる）の内部から得られる胚細胞は全能性胚細胞である。同様に、胚盤胞の内細胞塊から得られる胚細胞は全能である可能性がある。

本明細書で使用されるように、「全能性」という用語は、任意タイプの細胞を生み出すことができる細胞を説明するために用いられる。例えば、胚細胞の場合、「全能性」細胞とは、胚の中であらゆるタイプの細胞を生み出すことができ、最終的には体内の異なる組織（例えば、皮膚、骨、骨髄、筋肉など）にとって必要な特殊な細胞のいずれかに分化することができる細胞のことである。「全能性」という用語は、「多能性」という用語と区別され、後者は、発育中の細胞塊内の特定の細胞亜集団に分化するが、任意タイプの細胞もあらゆるタイプの細胞も生じない可能性のある細胞を指す。

本明細書で使用されるように、「一卵性胚」という用語は、単一の受精卵から形成または派生した２つ以上の胚を指すと理解されるべきである。

本明細書で使用される「半胚」という用語は、分割または切断された胚の一部を意味すると理解されるべきである。例えば、二等分された胚は、それぞれが胚細胞を含む２つの半胚を生産する。同様に、それぞれが胚細胞を含む３つの部分に切断された胚は、３つの半胚を生じさせる。

本明細書で使用されるように、「動物」という用語は、哺乳類（すなわち、非ヒト哺乳類）、両生類、爬虫類、魚類、鳥類などのすべての脊椎動物を含むと理解されるべきである。一例では、動物は哺乳類である。本開示の方法が有用であり得る例示的な哺乳類には、家畜（例えば、牛、水牛、豚、羊、山羊、駱駝、鹿、馬など）、伴侶動物（例えば、犬、猫など）、実験動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギなど）、非ヒト霊長類（アカゲザル、マーモセットなど）、および野生動物種（例えば、有袋類、大型猫、サイ、ジャイアントパンダなど）がある。１つの特定の例では、本開示の方法は、牛（すなわち、ウシ種）にとって有用であり得る。

双子化法
本開示は、一般に、本明細書では「双子化」とも呼ばれる胚の増殖方法に関し、特に、１つ以上の初期ドナー胚から複数の胚を生産することができる方法に関する。本明細書では、１つ以上の初期ドナー胚から複数の胚を生産するためのいくつかのアプローチまたは「双子化技術」が記載されている。

一例では、本開示の方法は、
（ｉ）少なくとも２つの胚細胞を含む１つ以上のドナー胚を得るステップ、
（ｉｉ）前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離するステップ、
（ｉｉｉ）それぞれが少なくとも２つの胚細胞を含む複数の胚を生産するのに適した条件下で、前記胚細胞を体外で膨張させるステップ、
（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）で生産された、後続の増殖においてドナー胚として使用される前記複数の胚のうちの１つ以上を単離するステップ、および
（ｖ）前記ステップ（ｉ）～（ｉｖ）を「ｎ」（「ｎ」≧３）回繰り返すステップという一般的な方法ステップを有する。

別の例では、本明細書に記載された「双子化技術」を使用してドナー胚を増殖させる本開示の方法は、
（ｉ）１６細胞胚または予備圧縮桑実胚からの胚細胞と発育上に同等な１つ以上の胚細胞を含むドナー胚を得るステップ、
（ｉｉ）前記ドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離するステップ、
（ｉｉｉ）前記ドナー胚から複数の一卵性胚を生産するのに適した条件下で、前記胚細胞を体外で膨張させるステップ、および
（ｉｖ）複数の一卵性胚盤胞を生産するのに適した条件下で、前記複数の一卵性胚を培養するステップという一般的な方法ステップを有する。

後者の方法では、前記複数の一卵性胚を培養して前記複数の胚盤胞を生産する前記ステップの前に、前記方法は、
（ｉ）後続の増殖においてドナー胚として使用するために生産された前記複数の一卵性胚のうちの１つ以上を単離するステップであって、後続の増殖のために単離された各ドナー胚が少なくとも２つの胚細胞を含むステップ、
（ｉｉ）前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離するステップ、
（ｉｉｉ）それぞれが少なくとも２つの胚細胞を含む複数の胚を生産するのに適した条件下で、前記胚細胞を体外で膨張させるステップ、
（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）で生産された、後続の増殖においてドナー胚として使用される前記複数の胚のうちの１つ以上を単離するステップ、および
（ｖ）複数の胚盤胞を生産するのに適した条件下で前記複数の胚を培養する前に、前記ステップ（ｉ）～（ｉｖ）を「ｎ」回繰り返すステップをさらに含んでもよい。

本明細書に記載されるように、元のドナー胚から複数の胚を生産するために、本方法のステップ（ｉ）～（ｉｖ）を「ｎ」回繰り返し得る。（１）初期ドナー胚における胚細胞の数、（２）そこから胚細胞を分離するために用いられる技術、および（３）別段の記載がない限り、に応じて、ステップ（ｉ）～（ｉｖ）が実行される繰り返し回数（すなわち、「ｎ」）は異なる場合がある。この点で、「ｎ」は、別段の記載がない限り、１以上であってもよい。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上であってもよい。「ｎ」が３以上であることを必要とする方法の例によれば、「ｎ」は、３、４、５、６、７、８、９または１０以上であってもよい。

一実施形態では、採用される「双子化技術」を「切断法」または「カット法」とする。本実施形態によれば、ステップ（ｉ）における１つ以上の初期ドナー胚を、例えばほぼ均等な割合で、１つ以上の胚細胞を含む２つの部分に切断（または分割）する。次に、上記ステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）で述べたように、両方の半胚を体外で膨張させて、２つの一卵性胚を生産する。次に、ステップ（ｉｖ）では、新たに増殖した胚をドナー胚として使用して、ステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）のプロセスを繰り返す。ステップ（ｖ）に示すように、前サイクルで生産された胚を次のサイクルのドナー胚として使用して、このプロセスを「ｎ」回（１回を１サイクルと呼ぶ）繰り返すことができる。このように、切断法を用いた増殖は、新たなサイクルごとに、生産される一卵性胚の数を前サイクルに比べて２倍にすることができる。切断法を用いて行われるサイクルの回数は、多くの要因（例えば、生産される胚の数、開始ドナー胚の数、ドナー胚の発育段階、介在サイクルに当該方法から胚が収穫されるかどうかなど）に影響されるため、変化する場合がある。

一例では、１つ以上の初期ドナー胚は、それぞれ少なくとも２つの胚細胞を含み、切断法を用いて行われるサイクルの最小回数は、３回であってもよい（すなわち、ｎ≧３）。

別の例では、１つ以上の初期ドナー胚は、それぞれ１６細胞胚または予備圧縮桑実胚からの胚細胞と発育上に同等な１つ以上の胚細胞を含む。この例によれば、切断法を用いて実行されるサイクルの最小回数は、１回であってもよい（すなわち、ｎ≧１）。

さらに別の例では、初期ドナー胚は４細胞胚であり、所望の結果は、少なくとも１６個の一卵性胚の生産である。この例によれば、初期ドナー胚から少なくとも１６個の一卵性胚を生産するためには、「切断法」のみで最低４サイクル（すなわち、ｎ≧４）が必要となる。しかしながら、切断法は、少なくとも５サイクル（すなわち、ｎ＝５）、少なくとも６サイクル（すなわち、ｎ＝６）、または少なくとも７サイクル（すなわち、ｎ＝７）、などを含んでもよい。この点で、当業者であれば、初期ドナー胚から生産される胚の数と各サイクル後の胚回収の効率に基づいて、切断法を用いて実行されるサイクル回数が簡単に変化（例えば、増加）することがあることを理解するであろう。

別の実施形態では、採用される「双子化技術」を「クッキーカッター法」とする。本実施形態によれば、ステップ（ｉ）における１つ以上の初期ドナー胚を、例えばほぼ均等な割合で、それぞれが１つ以上の胚細胞を含む３つ、４つ、５つ以上の部分に切断（または分割）して、次に、上記ステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）に従って、それらを体外で膨張させて３つ以上の一卵性胚を生産する。次に、ステップ（ｉｖ）では、新たに生産された胚（または「双子化した」胚）をドナー胚として使用して、このプロセスを繰り返す。ステップ（ｖ）に示すように、前サイクルで生産された胚を次のサイクルのドナー胚として使用して、このプロセスを「ｎ」回（１回を１サイクルと呼ぶ）繰り返すことができる。「クッキーカッター」法を用いて行われるサイクルの回数は、生産される胚の数、各サイクルにドナー胚が切断される部分の数（３つ以上の部分であってもよく、サイクルごとに変化してもよい）、開始ドナー胚の数、ドナー胚の発育段階、介在サイクルに当該方法から胚が収穫されるかどうかなど多くの要因に依存する。したがって、サイクル回数が変化する場合がある。

一例では、１つ以上の初期ドナー胚は、それぞれ少なくとも４つの胚細胞を含み、クッキーカッター法を用いて行われるサイクルの最小回数は、３回であってもよい（すなわち、ｎ≧３）。

別の例では、１つ以上の初期ドナー胚は、それぞれ１６細胞胚または予備圧縮桑実胚からの胚細胞と発育上に同等な１つ以上の胚細胞を含む。この例によれば、クッキーカッター法を用いて実行されるサイクルの最小回数は、１回であってもよい（すなわち、ｎ≧１）。

さらに別の例では、初期ドナー胚は４細胞胚であり、所望の結果は、少なくとも１６個の一卵性胚の生産である。この例によれば、ドナー胚が各サイクルで３つの部分に切断されると仮定すると、「クッキーカッター」法は、初期ドナー胚から少なくとも１６個の一卵性胚を生産するために、最低で少なくとも３回のサイクル（すなわち、ｎ≧３）を含んでもよい。しかしながら、クッキーカッター法は、少なくとも４サイクル（すなわち、ｎ＝４）、少なくとも５サイクル（すなわち、ｎ＝５）、または少なくとも６サイクル（すなわち、ｎ＝６）、などを含んでもよい。この切断法によれば、当業者であれば、初期ドナー胚から生産される胚の数と各サイクル後の胚回収の効率に基づいて、クッキーカッター法を用いて実行されるサイクルの回数が変化することがあることを理解するであろう。

また、「クッキーカッター」法で各ドナー胚が分割される部分の数（すなわち、生産された半胚の数）は、各サイクル内およびサイクル間で変化し得ることも想定される。この点で、ドナー胚が分割される部分の数は、生産される胚の数、および胚の健康、胚の段階（例えば、胚細胞数）などの他の要因などに依存し得る。

本開示の切断法および／またはクッキーカッター法を用いて増殖させることができる胚には、２細胞期から胚盤胞期までの着床前の胚が含まれる。いくつかの例では、より多くの全能性胚細胞を有する分割用のドナー胚、例えば約７０～３００個の胚細胞を含む胚盤胞を選択することが有利であり得る。他の例では、ドナー胚は、例えば約３０～７０個の胚細胞からなる後期桑実胚から早期胚盤胞までであってもよい。さらに別の例では、ドナー胚は、例えば約１６～３２個の胚細胞からなる桑実胚であってもよい。さらに別の例では、ドナー胚は、２～約１６個の胚細胞からなる前桑実胚期胚であってもよい。いずれの場合も、当業者であれば、各段階の発育中の胚が有する胚細胞の数は種によって変化する可能性があることを理解するであろう。

１つ以上のドナー胚を複数の半胚に切断または分割する各実施形態では、当該技術分野において公知の任意の胚分割手段を用いて、胚を切断（または分割）するプロセスを実行し得る。例えば、ブレード（例えば、メスの刃またはその一部）、細いガラス針などの圧力に依存するマイクロサージカル器具を用いた機械的解剖によって、ドナー胚を分割または切断し得る。代替的にまたは追加的に、レーザーすなわちレーザー支援生検を用いて、ドナー胚を分割または切断し得る。他の例では、ナノダイセクションベースのツール（例えば、フェムト秒レーザーパルスまたはナノメス付きの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ））によって、ドナー胚を分割または切断し得る。しかしながら、当該技術分野において公知の任意の手段を採用し得ることが考えられる。

さらなる実施形態では、採用される「双子化技術」を「解凍法」とする。本実施形態によれば、透明帯（ＺＰ）を破壊または「解凍」し、ドナー胚内から胚細胞のうちの１つ以上を単離することによって、ドナー胚から胚細胞のうちの１つ以上を分離する。本実施形態によれば、ドナー胚の透明帯を破壊してそこに含まれる胚細胞を放出し、その後、上記ステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）に従って、胚細胞を（単独で、またはグループ／クラスターで）単離し、体外で独立に膨張させて、複数の胚を生産する。このようにして、単離された各胚細胞または各胚細胞クラスター（すなわち、２つ以上の細胞が一緒に分離されている場合）を膨張させて、胚（例えば、ＺＰを持たない胚）になる。ステップ（ｉｖ）では、新たに生産された胚をドナー胚として使用して、このプロセスを繰り返す。ステップ（ｖ）に示すように、前サイクルで生産された胚を次のサイクルのドナー胚として使用して、このプロセスを「ｎ」回（１回を１サイクルと呼ぶ）繰り返すことができる。「解凍」法を用いて行われるサイクルの回数は、生産される胚の数、開始ドナー胚の数、介在サイクルに当該方法から胚が収穫されるかどうか、およびドナー胚内の胚細胞の数などの様々な要因に依存し、後者は任意の１つのドナー胚から生産できる一卵性胚の数の上限を決定する。

完全な圧縮前の透明帯に囲まれた全能性胚細胞を含む任意のドナー胚（すなわち、２細胞期の胚から早期予備圧縮桑実胚期の胚まで）に対して、解凍法を実行し得ることが考えられる。一例では、２細胞ドナー胚を使用して、解凍法を行う。一例では、４細胞ドナー胚を使用して、解凍法を行う。一例では、８細胞ドナー胚を使用して、解凍法を行う。一例では、１６細胞ドナー胚を使用して、解凍法を行う。特定の例では、当該方法は、圧縮が完全でない早期桑実胚期までを含む異なる発育段階のドナー胚を使用して実施される。好ましい例では、透明帯内の胚細胞は圧縮されていない。

一例では、１つ以上の初期ドナー胚は、それぞれ少なくとも２つの胚細胞を含み、解凍法を用いて行われるサイクルの最小回数は、３回であってもよい（すなわち、ｎ≧３）。

別の例では、１つ以上の初期ドナー胚は、それぞれ１６細胞胚または予備圧縮桑実胚からの胚細胞と発育上に同等な１つ以上の胚細胞を含む。この例によれば、切断法を用いて実行されるサイクルの最小回数は、１回であってもよい（すなわち、ｎ≧１）。１６個の割球を含む単一ドナー胚が初期ドナー胚として使用される一例によれば、解凍法は、初期ドナー胚から少なくとも約１６個の一卵性胚を生産するために単一のサイクルのみを必要とする場合がある。別の例では、解凍法の実行は、８～１２個の割球を含む初期ドナー胚（すなわち、８細胞期胚）から開始してもよい。この例によれば、解凍法は、初期ドナー胚から少なくとも約１６個の一卵性胚を生産するために、２サイクル（すなわち、ｎ＝２）を必要とする場合がある。例えば、各サイクルのドナー胚が８細胞期で「解凍」される解凍法の２サイクルは、約６４～約１００個の一卵性胚を生産することが可能である。したがって、本明細書に記載の「切断法」や「クッキーカッター法」に比べて、「解凍法」を使用すると、所望の数の胚を達成するために、より少ないサイクルが必要となり得ることが理解されるであろう。

「切断法」や「クッキーカッター法」と同様に、当業者であれば、「解凍法」を用いて行われるサイクルの回数は、初期ドナー胚から生産される一卵性胚の数と各ドナー胚内の胚細胞の数に応じて変化することがあることを理解するであろう。

解凍法における透明帯の破壊（「補助孵化」とも知られる）は、当該技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して実行し得る。この点で、生殖補助の分野において胚の孵化を支援するために様々な技術を採用することが知られており、例えば、Ｈａｍｍａｄｅｈｅｔａｌ．，（２０１１）Ｊ．Ａｓｓｉｓｔ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｇｅｎｅｔ．，２８（２）：１１９－１２８に記載のように、酸性タイロード液、プロテイナーゼ、ピエゾンバイブレーターマニピュレーターおよびレーザーを用いた部分的な機械的ゾナダイセクション、ゾナドリルおよびゾナ薄化などが挙げられる。また、ナノダイセクション（例えば、フェムト秒レーザーパルスまたはナノメス付きの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ））によって、透明帯を破壊し得ることが考えられる。

透明帯を破壊するための本開示の解凍法には、上述した技術のいずれか１つ以上を採用してもよい。

透明帯が破壊されると、胚細胞（例えば、割球）を単離し得、適切であれば、新鮮な培養培地に移植して膨張させ得る。胚細胞を含む個々の細胞を単離するための多くの方法が当該技術分野において公知であり、本明細書では考えられる（例えば、Ｚｈｕ ａｎｄ Ｍｕｒｔｈｙ（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．，２（１）：３－７に記載されているように）。細胞を単離するための技術には、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、誘電泳動デジタル選別、免疫磁気細胞分離、免疫外科、動水力学的トラップ、レーザー捕捉マイクロダイセクション、機械的解剖、マニュアルピッキング、マイクロ流体、マイクロマニピュレーション、ナノダイセクション、連続希釈、ラマンピンセット、およびそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。破壊された透明帯から単一の胚細胞または胚細胞凝集体を単離するために、本開示の方法においてこれらの技術のいずれか１つまたはそれらの組み合わせを使用することが考えられる。１つの特定の例では、マイクロ流体を採用して、個々の胚細胞を単離する。

本明細書に記載の方法の各実施形態において、ドナー胚を切断または分割するか、または透明帯の破壊（すなわち、透明帯の「解凍」）を可能にするために、ドナー胚を固定化することが望ましい場合がある。胚を固定化する方法は当該技術分野において公知であり、それらの方法または技術のいずれか１つ以上が、本開示の方法において使用され得る。本開示の方法での使用が考えられる例示的な方法は、例えば胚を収容した容器の表面を粗面化したり、タンパク質を含まない培養培地を用いたり、培養容器に胚の外膜に付着する材料を塗布することによって、透明帯に吸引を適用すること、容器に窪みや袋小路を形成すること、胚を捕捉する装置を構築すること、または表面に胚を付着させることを含む。

本明細書に記載されるように、本開示の方法を用いてドナー胚から分離された胚細胞または胚細胞を含む半胚を体外で培養して、膨張させて、複数の胚（例えば、一卵性胚）を生産する。

様々な発育段階において、体外で胚を培養する方法論は、当該技術分野において公知であり、本明細書で考えられている。例示的な方法は、本明細書では実施例１～５に記載される。当業者であれば、培養条件が、発育中の胚を発育の胚盤胞期まで成長させるために重要であり、胚の発育段階に応じて変更／調製され得、また、胚の発育（例えば、卵割）の速度を制御して、本開示の方法の増殖ステップを実行するのに十分な時間窓を提供し得ることを理解するであろう。例えば、胚の培養では、発育中の胚の成長を最適化するように、温度やＣＯ２レベルなどの変数を制御することができる。例えば、胚の発育に最適な温度は、約３２℃～約４０℃、好ましくは約３５℃～３９℃、特に好ましくは３７℃の温度である。培養環境における胚の発育に最適なＣＯ２レベルは、約１％ＣＯ２～約１０％ＣＯ２、好ましくは約３％ＣＯ２～約８％ＣＯ２、さらに好ましくは約５％ＣＯ２である。

胚細胞や胚を培養および拡大するための適切な培地は、当該技術分野において公知である。例えば、体内で発生するのと同等の速度で胚が胚盤胞まで成熟することを可能にする培養培地は、ＳｕｍｍｅｒｓａｎｄＢｉｇｇｅｒｓ（２００３）ＨｕｍａｎＲｅｐｒｏｄＵｐｄａｔｅ，９：５５７－５８２に記載されている。これらの培養培地の多くは、卵の放出、受精、発育の際にメスの生殖管で見られるイオン、アミノ酸、糖の濃度に大まか基づいている（ＧａｒｄｎｅｒａｎｄＬａｎｅ（１９９８）ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ１３：１４８－１６０）。通常、インキュベーター外での配偶子の取り扱い、卵胞の洗浄、マイクロマニピュレーションを伴うプロシージャには、リン酸緩衝液やＨＥＰＥＳ有機緩衝液を含む培養培地が使用される。ほとんどの培養培地は、重炭酸／ＣＯ２緩衝系を利用して、ｐＨを適切な範囲（例えば、ｐＨ７．２～７．４）に保っている。培養培地の浸透圧は、通常、２７５～２９０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの範囲である。また、培地の蒸発を防ぎ、一定の浸透圧を維持するために、パラフィンオイル（または胚に無害な代替オイル）で胚を培養することもできる。このオイルはまた、インキュベーターから胚を取り出して顕微鏡で評価する際のｐＨと温度の変動を最小限に抑える。

適切な培養培地には、通常、約５～２０％（それぞれｗ／ｖまたはｖ／ｖ）の濃度で添加されるアルブミンまたは合成血清などのタンパク質源も含まれる。また、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＣａＣｌ_２２Ｈ_２Ｏ、ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ、またはＮａＨＣＯ_３などの塩源を培地に添加してもよい。メスの生殖管には炭水化物が存在するため、培養培地には、通常、炭水化物源も含まれる。アミノ酸とともに、これらは発育中の胚の主要なエネルギー源となる。８細胞までの受精卵の発育をサポートする培養培地は、ピルビン酸と乳酸を含む。市販の培地にはグルコースを含まないものもあれば、通常の授精過程で精子の要求を満たすために非常に低濃度のグルコースを添加したものもある。８細胞胚の胚盤胞期までの発育をサポートする培地は、低濃度のピルビン酸と乳酸を含み、高濃度のグルコースを含む。培養培地にアミノ酸を補充することも、胚の発育にとって望ましい場合がある。８細胞までの受精卵の発育をサポートする培地には、通常、プロリン、セリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸などの非必須アミノ酸を補充する。８細胞胚の胚盤胞期までの発育をサポートする培地にも、通常、シスチン、ヒスタジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、バリン、アルゼンチン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンなどの必須アミノ酸を補充する。また、培養培地は、ビタミンを含んでもよい。

また、培養培地は、抗生物質を含んでもよい。ＡＲＴラボの大半は、微生物成長のリスクを最小限に抑えるために、抗生物質を含む培養培地を実際に使用している。最も一般的に使われる抗生物質は、ペニシリン（β－ラクタム系グラム陽性菌が細胞壁の完全性を阻害する）とストレプトマイシン（アミノグリコシド系グラム陰性菌がタンパク質合成を阻害する）である。

本開示の方法において胚を培養するのに有用であり得る胚発育用の順次培地の３つの例は、Ｇ１／Ｇ２（Ｇａｒｄｎｅｒｅｔａｌ，（１９９８）Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ１３：３４３４）、ＵｎｉｖｅｒｓａｌＩＶＦＭｅｄｉｕｍ／ＭＳ（Ｂｅｒｔｈｅｕｓｓｅｎｅｔａｌ．，（１９９７）、およびＰＩ／ＢｌａｓｔｏｃｙｓｔＭｅｄｉｕｍ（Ｂｅｈｒｅｔａｌ．，（１９９８）Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．０－２６２）である。異なる発育段階の胚を培養するための培地は、種々の供給源から購入することができる。

胚発育のための他の例示的な培養培地は、本明細書では実施例１～５に記載され、本開示の方法での使用が考えられる。

いくつかの例では、胚細胞の全能性の促進および／または胚発生の抑制もしくは防止が可能な１つ以上の因子の存在下で、胚細胞および／または発育中の胚を培養する。胚発生を防止するまたは胚発生を減速させるために、このような因子を培養培地に添加し得、それによって、細胞分化が起こり始まる前にステップ（ｉ）～（ｉｖ）の追加のサイクルを行うさらなる機会を提供し得る。胚細胞の全能性を促進する因子および／または胚発生を抑制もしくは防止する因子は、当該技術分野において公知であり、本明細書ではその使用が考えられる。例えば、胚細胞の全能性を促進する因子および／または胚発生を抑制もしくは防止する因子としては、早期胚によって生産されるｍｉＲＮＡの安定性や活性を阻害する抗ｍｉＲおよび／またはリボザイムが挙げられる。例示的な抗ｍｉＲは、母性ｍＲＮＡのクリアランスを促進する、胚によって表現されるｍｉＲＮＡを標的とし得る（例えば、ｍｉＲ－３０ファミリーを標的とする抗ｍｉＲ）。

当業者であれば、培養条件が胚細胞の全能性の状態の維持にも寄与し得ることを理解するであろう。従って、胚細胞、胚または半胚の培養中に、細胞または胚の密度、温度およびＣＯ２レベルなどの変数を制御して、培養胚の発育速度を調節／制御することができる。

本明細書に記載されるように、本開示の方法は、また、胚を体外で培養して膨張させて、胚盤胞を形成するステップを含んでもよい。次いで、例えば、貯蔵および／またはレシピエントメス内への着床のために、胚盤胞を収穫することができる。したがって、上記方法のいくつかの段階では、胚発生を促進し得る１つ以上の因子の存在下で、胚細胞および／または発育中の胚を培養し得る。例えば、収穫のために胚盤胞期まで胚を培養するために用いられる培養培地に、胚発生を促進し得る因子（すなわち、胚発生因子）を添加し得る。胚発生を促進する因子は、当該技術分野において公知であり、本明細書では考えられる。

当業者であれば、胚発生を促進するために、例えば胚密度、温度およびＣＯ２レベルなどの培養条件を変更および／または最適化できることも理解するであろう。

本明細書に記載の様々な双子化技術（すなわち、「切断法」、「クッキーカッター法」、および「解凍法」）を互いに組み合わせて使用し得ることも考えられる。例えば、本開示の方法は、「切断法」または「クッキーカッター法」でドナー胚が２つ以上の半胚に分割／切断される１サイクル以上と、それに続いて、早期サイクルによって生産された膨張半胚に対して行われる「解凍法」の１サイクル以上とを含んでもよい。これらのアプローチを組み合わせることで、生産される胚の数を最適化することができ、同時に、実行する必要があるサイクルの数を最小限に抑えることができる。これらの技術を組み合わせた別の例によれば、本開示の方法は、複数の割球（例えば、１６個の割球）を生産するための「解凍法」の１サイクル以上と、それに続いて、胚の数をさらに２、３または４倍に増加させるために割球から膨張させた胚に対して行われる「切断法」または「クッキーカッター法」の１サイクル以上とを含んでもよい。この最後の例によれば、「解凍法」の１サイクル以上を実験室で行い、後続の「切断法」または「クッキーカッター法」のサイクルを着床の前に現場で行うことができる。この点で、当業者であれば、本開示の方法において、本明細書に記載の様々な双子化技術を組み合わせ得ることを理解するであろう。

本明細書に記載されるように、本方法のステップ（ｉ）で得られるドナー胚は、複数の全能性胚細胞を含む任意の胚の段階のもの、例えば、着床前の２細胞期胚から胚盤胞期胚であってもよい。しかしながら、本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、特定の発育段階の胚および／または特定の数の胚細胞を含む胚が好ましい場合がある。この点を説明するために、「解凍法」を実施して割球の単離を可能にする場合には予備圧縮の胚が好ましい。いくつかの例では、ドナー胚は２細胞期にある。いくつかの例では、ドナー胚は４細胞期にある。いくつかの例では、ドナー胚は８細胞期にある。いくつかの例では、ドナー胚は１６細胞期にある。いくつかの例では、ドナー胚は桑実胚である。他の例では、ドナー胚は胚盤胞（孵化前）である。したがって、上記方法に有用なドナー胚は、例えば、約４～約２５６個の胚細胞、または約１００～約２５６個の胚細胞、または約７０～約１００個の胚細胞、または約３０～約７０個の胚細胞、または約１６～約３０個の胚細胞、または約４～約１６個の胚細胞、または約４～約８個の胚細胞、または約２～約４個の胚細胞など、約２～３００個の胚細胞を含んでもよい。

本明細書に記載されるように、ドナー胚が得られる動物の種は、哺乳類の種、両生類の種、爬虫類の種、魚類の種、および鳥類の種（例えば、家禽）を含む任意の脊椎動物であってもよい。

一例では、動物は哺乳類、例えば、非ヒト哺乳類である。本開示の方法が有用であり得る例示的な非ヒト哺乳類には、家畜種（例えば、牛、水牛、豚、羊、山羊、駱駝、鹿、馬など）、伴侶動物（例えば、犬、猫など）、実験動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギなど）、非ヒト霊長類（アカゲザル、マーモセットなど）、および野生動物種（例えば、有袋類、猫、サイ、ジャイアントパンダなど）がある。

１つの特定の例では、本開示の方法を使用して、ウシ種において複数の胚（例えば、一卵性胚）を生産することができる。別の例では、本開示の方法を使用して、羊から複数の胚（例えば、一卵性胚）を生産することができる。別の例では、本開示の方法を使用して、豚から複数の胚（例えば、一卵性胚）を生産することができる。別の例では、本開示の方法を使用して、山羊から複数の胚（例えば、一卵性胚）を生産することができる。別の例では、本開示の方法を使用して、馬から複数の胚（例えば、一卵性胚）を生産することができる。別の例では、本開示の方法を使用して、ラクダ種において複数の胚（例えば、一卵性胚）を生産することができる。

本開示の方法の最初のサイクルで使用されるドナー胚を体内で（例えば、妊娠した動物の胚を従来通り洗浄することによって）準備してもよいし、体外受精（ＩＶＦ）方法により準備してもよい。

一例では、体内方法により、本方法の最初のサイクルで使用されるドナー胚を準備する。例えば、卵母細胞を体内で受精させ（例えば、交尾後または人工授精により）、その後の胚を従来の胚洗浄により妊娠したメスから回収してもよい。一例では、ドナー胚は多重排卵胚移植（ＭＯＥＴ）によって生産され、これにより、受精前にドナーメスにホルモン、主に卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を投与し、循環する雌動物の卵巣を刺激して多重排卵を誘発する。

別の例では、体外方法論（すなわち、ＩＶＦ）により、本方法の最初のサイクルで使用されるドナー胚を準備する。ＩＶＦを用いた胚の生産方法は、当該技術分野において公知である。ＩＶＦは、通常、卵胞吸引によるドナー動物からの卵母細胞の生産、次いで、生産された胚が所望の発育段階に達するまでの体外成熟、受精、培養を含む。便利なことに、このアプローチは、制御された条件下で、特定の価値を有する生きている動物から胚を繰り返し生産することを可能にする。ＩＶＦによる胚の生産方法は、ＢｅｒｌｉｎｇｕｅｒＦ．「ＥｍｂｒｙｏＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｉｎ：ＡｎｉｍａｌｓＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＬｉｖｅｓｔｏｃｋ、生命維持システム百科事典（ＥＯＬＳＳ）に掲載されており、その内容全体が本明細書に組み込まれる。

本方法の最初のサイクルで使用されるドナー胚は、体内で生産されるか体外で生産されるかにかかわらず、新鮮であってもよいし、解凍されたものであってもよい（すなわち、解凍された冷凍保存胚）ことも考えられる。一例では、ドナー胚は新鮮である。別の例では、ドナー胚は、解凍された冷凍保存胚である。

本開示の方法において有用なドナー胚は、遺伝子組換えを経たものである場合もある。例えば、ドナーから生産されるすべての胚が遺伝子組換えを有するように、本方法を実施する前にドナー胚内の胚細胞を遺伝子組換えし得る。一例では、その中に含まれる胚細胞のゲノムに外因性核酸を導入することによって、ドナー胚を遺伝子組換えする。外因性核酸は、関心のある形質に関連する遺伝子または遺伝子座の代替対立遺伝子であってもよい。あるいは、外来核酸は導入遺伝子であってもよい。別の例では、その中に含まれる胚細胞のゲノムを編集すること（すなわち、ゲノム編集）によって、ドナー胚を遺伝子組換えし得る。ゲノム編集は、挿入、欠失、置換、逆位または転座からなる群から選択され得る。例えば、ゲノム編集は、関心のある形質に関連する遺伝子または遺伝子座の既存の対立遺伝子を代替対立遺伝子に置き換えるために、核酸配列またはその中の１つ以上のヌクレオチド位置の挿入、欠失および／または置換であってもよい。

ゲノム編集を採用して、単独にまたは組み合わせて考慮されると、発育中の胚にユニークな遺伝子プロファイルまたはフィンガープリントを提供する１つ以上の遺伝子組換え（例えば、ヌクレオチド置換）を導入することもできる。そして、このユニークな遺伝子プロファイルまたはフィンガープリントを使用して、ドナー胚から生産された胚（および胚から生産された動物）を識別および／または追跡することができる。例えば、ユニークな遺伝子プロファイルまたはフィンガープリントを生成するために、ドナー胚内の胚細胞に対して、ゲノムのセーフハーバー領域内の１つ以上の保守的ヌクレオチド置換を実行し得る。

好ましくは、遺伝子組換えまたは編集は、組換えされた細胞（およびそこから生じる動物）に由来する発育中の胚内のすべての後続細胞が組換えを含むように、単一細胞段階で起こる。しかしながら、遺伝子組換えイベントが１回以上の細胞分裂の後に起こり、また、ドナー胚内のすべての胚細胞が組換えされるわけではない場合、ドナー胚は、組換え／編集された細胞に由来する一部の細胞と、組換え／編集されていない細胞に由来する一部の細胞とを有する、組換え／編集イベントのモザイクであってもよい。

当該技術分野では、標的化ヌクレアーゼを用いて細胞のゲノムを遺伝子組換えする多くの方法が記載されている。これらには、（１）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）または他のＣａｓシステム、（２）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、（３）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および（４）ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼがあるが、それらに限定されない。ドナー胚を遺伝子組換えするために、細胞を遺伝子組換えするこれらの他の方法を本開示の方法において使用することが考えられる。

本開示の方法は、上記方法を用いて増殖させるドナー胚の選択を支援するための１つ以上のステップをさらに含んでもよい。例えば、本方法は、ステップ（ｉ）の前に、１つ以上の遺伝子スクリーニング基準、遺伝子診断基準、および／または１つ以上の形態学的基準に基づいて、ドナー胚を選択することを含んでもよい。

一例では、例えば家畜種の場合のように商業的に重要な生産形質などの関心のある表現型形質（の有利なバリアント）に関連する１つ以上の遺伝子マーカー（例えば、ＳＮＰ対立遺伝子またはハプロタイプ）が存在するか否かについてスクリーニングすることによって、遺伝子スクリーニング基準を決定し得る。例示的な関心のある表現型形質としては、生産形質（例えば、成長率、繁殖力、飼料転換効率など）、薬剤耐性、害虫および／または寄生虫に対する感受性、性別（すなわち、オスまたはメス）などが挙げられるが、それらに限定されない。このようにして、本開示の方法による増殖のためのドナー胚をエリート動物から得ることができる。

代替的にまたは追加的に、１つ以上の症状、疾患、またはそれらの素因に関する遺伝子診断に基づいて、ドナー胚を選択してもよい。この点で、胚の着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）がＩＶＦの分野ではより一般的になってきている。ＰＧＤテストは、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）という２つの方法論に主に焦点を当てる。しかしながら、ＰＧＤのための多くの技術が当該技術分野において公知であり、ドナー胚を選択するために、これらの技術のうちの１つ以上を本開示の方法で使用し得る。これらの技術には、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、プライムドインサイチュー標識（ＰＲＩＮＳ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、ＣＯＭＥＴ分析（単細胞ゲル電気泳動）、ヘテロ二重鎖分析、サザン分析、および変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）分析に依存する方法が含まれるが、それらに限定されない。

代替的にまたは追加的に、胚の健康を示す形態学的特徴などの１つ以上の形態学的特徴に基づいて、ドナー胚を選択してもよい。

本明細書に記載されるように、本開示の方法を用いて所望の数の胚（例えば、一卵性胚）を生産すると、これらの胚は、体外で所望の胚発育期（例えば、着床前胚盤胞）まで成熟し、培養培地から収穫し得る。そして、収穫された胚は、レシピエントメスに移植されるまで、および／または凍結保存されるような時期になるまで、適切な胚保持または移植培地に保存し得る。本明細書では、任意の市販の胚保持および移植培地を用いることが考えられる。胚がレシピエントメスに移植される前の短期間（例えば、輸送中）に保存される例によれば、特定の保持または移植培地の仕様に応じて、収穫された胚を約２℃～約８℃で保存してもよい。いくつかの好ましい例では、収穫された胚を約４℃で保存する。

また、収穫された胚を冷凍保存してもよい。当該技術分野で胚の凍結保存に用いられる主要な技術は、ガラス化保存と緩慢プログラマブル凍結（ＳＰＦ）であり、両方とも本明細書では考えられる。この例によれば、収穫された胚を、適切な冷凍保存培地（例えば、エチレングリコール冷凍媒体または類似物）に移植して凍結保存し、解凍使用および／または出荷まで約－１８０℃～約－１９６℃に保持することができる。例えば、冷凍保存された胚を約－１９６℃で液体窒素に保存してもよい。

本開示の方法は、商業的な家畜の育種への適用に加えて、動物の保護および管理の分野への適用も考えられる。例えば、本開示の方法を用いて絶滅危惧種または脅威種（野生動物および家畜化された種を含む）から得られたドナー胚から生産された胚を、バイオバンクに寄託し、および／または育種プログラムのために配布することができる。これは、絶滅危惧種または脅威種の育種プログラムや個体群管理を支援する可能性がある。したがって、いくつかの例では、上記方法は、本開示の方法によって準備された１つ以上の凍結保存された胚をバイオバンクに寄託するステップをさらに含んでもよい。

収穫された胚が新鮮な状態でレシピエントメスに移植される実施形態によれば、本開示の方法は、一卵性胚のうちの１つ以上を１つ以上のレシピエントメスの輸卵管に移植するステップをさらに含んでもよい。胚移植の方法は、当該技術分野において公知である。例えば、カテーテルまたは他の手段を用いて、手動で胚を移植してもよい。

したがって、本開示は、動物を飼育する方法をさらに提供し、この方法は、
（ｉ）本明細書に記載の方法により生産された複数の胚のうちの１つ以上を、１つ以上のレシピエントメスの輸卵管に移植して、妊娠を成立させるステップ、および
（ｉｉ）妊娠したレシピエントメスから分娩により動物を生産するステップを含む。

本明細書に記載されるように、動物は、哺乳類の種、両生類の種、爬虫類の種、魚類の種、および鳥類の種（例えば、家禽）を含む任意の脊椎動物であってもよい。１つの特定の例では、前記動物は哺乳類、例えば、非ヒト哺乳類である。本開示の方法が有用であり得る例示的な非ヒト哺乳類には、家畜種（例えば、牛、水牛、豚、羊、山羊、駱駝、鹿、馬など）、伴侶動物（例えば、犬、猫など）、実験動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギなど）、非ヒト霊長類（アカゲザル、マーモセットなど）、および野生動物種（例えば、有袋類、猫、サイ、ジャイアントパンダなど）がある。１つの特定の例では、本開示の方法は、牛を飼育するために使用することができる。別の例では、本開示の方法は、羊を飼育するために使用することができる。別の例では、本開示の方法は、豚を飼育するために使用することができる。別の例では、本開示の方法は、山羊を飼育するために使用することができる。別の例では、本開示の方法は、馬を飼育するために使用することができる。別の例では、本開示の方法は、ラクダ科動物（例えば、アルパカ）を飼育するために使用することができる。

実施例
実施例１：「切断法」を用いた胚の連続双子化
本実施例では、一卵性胚などの複数の胚を生産するために「切断法」を実行する実験ステップを概説する。

ＭＯＥＴによって生産されるＵｌｔｒａｂｌａｃｋ乳牛から得られる３６個ドナー（胚盤胞）胚は、Ｎｉｎｄｏｏｉｎｂａｈ（Ｂｅａｕｄｅｓｅｒｔ、ＱＬＤ、オーストラリア）から得られる。３６個のＭＯＥＴ胚を次のテストグループに分ける。
対照グループ：未切断のままにする６個の胚
テストグループ１：１回の二等分を経る６個の胚
テストグループ２：２回の連続の二等分（すなわち、二等分と膨張の２回連続サイクル）を経る６個の胚
テストグループ３：３回の連続の二等分（すなわち、二等分と膨張の３回連続サイクル）を経る６個の胚
テストグループ４：４回の連続の二等分（すなわち、二等分と膨張の４回連続サイクル）を経る６個の胚
テストグループ５：５回の連続の二等分（すなわち、二等分と膨張の５回連続サイクル）を経る６個の胚

テストグループ１では、マイクロダイセクションにより、ドナー胚盤胞胚を二等分する。二等分の後、胚の半分を２、４または６日間培養して、内細胞塊（ＩＣＭ）の数、栄養層の数、および総胚生存率の回復を評価する。形態学的胚スコアリング、ＩＣＭマーカー（例えば、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４など）の免疫組織化学、栄養膜マーカー（ＣＤＸ２）、および生細胞／死細胞染色による固定胚の分析を行って、最適な培養条件を決定する。それぞれの３～８個の胚から単離されたＲＮＡ上のｑＰＣＲによって、結果を検証する。

二等分された胚におけるＩＣＭの膨張に最適であるとテストグループ１で特定された培養条件は、テストグループ２～５において進められる。上記のテストグループ１について記載された分析を用いて、連続二等分の成功を評価する。

テストグループ３、４、５のそれぞれについて、連続二等分プロセスの後に膨張した健康そうな胚をレシピエントに移植して、妊娠率と子孫の健全な発育を評価する。

実施例２：「クッキーカッター法」を用いた複数の一卵性胚の生産
本実施例では、複数の一卵性胚を生産するための「クッキーカッター法」を実施する際に行われる実験ステップをを概説する。

ＭＯＥＴによって生産されるＵｌｔｒａｂｌａｃｋ乳牛から得られる２４個ドナー（胚盤胞）胚は、Ｎｉｎｄｏｏｉｎｂａｈ（Ｂｅａｕｄｅｓｅｒｔ、ＱＬＤ、オーストラリア）から得られる。２４個のＭＯＥＴ胚を次のテストグループに分ける。
対照グループ：未切断のままにする６個の胚
テストグループ１：二等分を経る６個の胚
テストグループ２：四分の一になる６個の胚
テストグループ３：八分の一に切断される６個の胚

すべての胚分割は、Ｎｉｎｄｏｏｉｎｂａｈの獣医によって、テストグループの基準に従って行われる。

対照グループの６個の胚は未培養であるが、分割によって生産された胚断片／切片を最大７日間培養して、内細胞塊の数、栄養膜の数、胚生存率の回復を評価する。

培養後、形態学的胚スコアリング、ＩＣＭマーカー（例えば、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４など）の免疫組織化学、栄養膜マーカー（ＣＤＸ２）、および生細胞／死細胞染色による３～８個の固定胚の分析を行う。それぞれの３～８個の胚から単離されたＲＮＡ上のｑＰＣＲによって、結果を検証する。

実施例３：「解凍法」を用いた複数の一卵性胚の生産
本実施例では、単一のドナー胚から複数の一卵性胚を生産するために「解凍法」を実行する実験ステップを概説する。

Ｎｉｎｄｏｏｉｎｂａｈ（Ｂｅａｕｄｅｓｅｒｔ、ＱＬＤ、オーストラリア）の移動実験室を使用して、１頭の雄牛からの精液で授精された時限受精卵母細胞を提供する。８個の４細胞ドナーと４個の８細胞胚が提供される。

公開されたプロトコルに従った胚のプロナーゼ処理を利用して胚の透明帯を破壊した後、単一の割球および双割球凝集体を単離して、膨張のために培養培地を含むマルチウェルプレートの別々のウェルに堆積させる。

培養後、形態学的胚スコアリング、ＩＣＭマーカー（例えば、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４など）の免疫組織化学、栄養膜マーカー（ＣＤＸ２）、および生細胞／死細胞染色による固定胚の分析を行う。それぞれの３～８個の胚から単離されたＲＮＡ上のｑＰＣＲによって、結果を検証する。

１２個の最も外観の良い膨張割球凝集体を７日間培養し、４個の最も外観の良い胚盤胞（単一の割球または双割球に由来するかどうかにかかわらず）をレシピエントに移植して、妊娠率と子孫の健全な発育を評価する。

実施例４：連続分割による複数の胚の生産
本実施例では、本発明者らが「解凍法」を用いてドナー胚（本明細書では、受胎産物とも呼ばれる）の連続増殖を行って、複数の胚盤胞を生産した実験が記載される。本実施例により、「解凍」技術を用いた本開示の連続増殖方法は、増殖なしの無傷受胎産物の標準培養に比べて、胚盤胞生産の効率を著しく向上させることができることが実証される。

方法
受胎産物の培養培地の準備
薬剤およびストック液
別段の記載がない限り、表１に従って、培地を培養および解凍するためのストック液を調製した。この研究で使用されたすべての培地試薬はシグマから入手した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を用いてストック液を調製した。蒸気圧浸透圧計（Ｗｅｓｃｏｒ）を用いて、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水により、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨＣＯ_３の浸透圧をそれぞれ２０００ｍＯｓｍ、２００ｍＯｓｍ、２０００ｍＯｓｍに調整した。

表１、培養および解凍用の培地を準備するために用いられるストック液

受胎産物培養および解凍用の培地の準備
ＮｂｒｙｏＩＶＣ－２Ｃａ^２＋培地が受胎産物解凍プロシージャに使用され、ＮｂｒｙｏＩＶＣ－３培地が解凍前後（発育８日目まで）の受胎産物培養に使用された。表２に示す順序に従ってストック液を添加することで、培地を準備した。２ＭＮａＯＨを添加して、培地のｐＨを７．４に調整した。浸透圧計（Ｗｅｓｃｏｒ）を用いて、培地の浸透圧をテストした。ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水の添加により、浸透圧を２７０ｍＯｓｍに調整した。最後に、脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（ＦＡＦ－ＢＳＡ）を４ｍｇ／ｍＬの濃度で培地に添加し、０．２２μｍシリンジフィルター（ミリポア）で培地を濾過滅菌した。培地を４℃で最大２週間保存した。

表２、ＮｂｒｙｏＩＶＣ－２ Ｃａ^２＋フリーおよびＮｂｒｙｏＩＶＣ－３培地の組成物

プロナーゼ調製
プロナーゼは、解凍プロシージャ中に透明帯（ＺＰ）を除去するために用いられるタンパク質分解酵素である。最終濃度０．３ｍｇ／ｍＬのプロナーゼをＨＥＰＥＳ緩衝液－ＮｂｒｙｏＩＶＣ－３中で調製した。そして、０．２２μｍシリンジフィルターで濾過滅菌し、等分し、－２０℃で保存した。

ウシ受胎産物の体外発育
ウシの受精卵の生産
ＡｒｔＳｏｌｕｔｉｏｎｓの商業プロトコルを用いたＩＶＦにより、ウシの受精卵を生産した。標準プロシージャに従って、Ｎｉｎｄｏｏｎｉｂａｈの牛農場から収集された卵巣から、ウシの卵母細胞を体外で成熟させた（ＩＶＭ）。そして、２４時間のＩＶＭの後、成熟した卵母細胞は、Ｎｉｎｄｏｏｎｉｂａｈの牛農場からの生殖能力が証明された１頭の雄牛の解凍精液で、体外受精した。ＩＶＦから２４時間後、仮定した受精卵をＶｉｔｒｏＣｌｅａｖｅ（ＡｒｔＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）体外培養（ＩＶＣ）培地に移動させた。別段の記載がない限り、受精卵をＶｉｔｒｏＣｌｅａｖｅ（ＡｒｔＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）ＩＶＣ培地で、３８．５℃で、７％Ｏ_２および５％ＣＯ_２の下で培養した。ＩＶＦの後、受精卵をそれぞれ２５～３２時間、３２～４２時間、４２～５２時間、９６～１００時間で、２細胞、４細胞、８細胞、１６細胞まで培養した。

解凍用のプレートとディッシュの準備
０．１％ＰＶＡのプレコートプレート
ＺＰフリーの受胎産物がプレートに付着するのを避けるために、９６ウェルの円底板（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルを、それぞれのウェルに滅菌水内の５０μＬ滅菌０．１％ＰＶＡを添加するようにコーティングし、３８．５℃で一晩インキュベートした。次いで、滅菌水で各ウェルを３回洗浄して、未結合ＰＶＡを除去した。その後、プレートを乾燥させ、密閉して、使用時まで４℃で保存した。

解凍ディッシュ
解凍プロシージャの前に、２０μＬのプロナーゼ液滴、ＮｂｒｙｏＩＶＣ－２ Ｃａ^２＋フリー、および鉱油（ＣｏｏｐｅｒｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を重ねたＮｂｒｙｏＩＶＣ－３培地を含む５５ｍｍペトリディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、３８．５℃で、７％Ｏ_２、５％ＣＯ_２の下で少なくとも６０分間平衡化した。

解凍後培養システム
解凍後、０．１％ＰＶＡでプレコートされた９６ウェルプレートを利用して、個々の割球を培養した。各ウェルには、５０μＬのＮｂｒｙｏＩＶＣ－３または２０μＬのＶｉｔｒｏＢｌａｓｔ（ＡｒｔＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）ＩＶＣ培地が含まれ、培地の蒸発を避けるために鉱油が重ねられた。分離された割球を各ウェルに移植する前に、培地を含むプレートを、３８．５℃で、７％Ｏ_２、５％ＣＯ_２の下で少なくとも６０分間平衡化した。

連続解凍プロシージャ
すべてのウシ受胎産物解凍プロシージャは、３７℃に加熱されたプレート付きの解剖顕微鏡下で行われた。１回目の連続解凍（連続ｎ＝１）において、２細胞、４細胞、８細胞、１６細胞受胎産物のいずれかを、７％Ｏ_２、５％ＣＯ_２の雰囲気の加湿インキュベーター内で３８．５℃で２分間プロナーゼ処理して、周囲のＺＰを除去した。ＺＰが溶解したら、３つの２０μＬ ＮｂｒｙｏＩＶＣ－３液滴の培地で受胎産物を洗浄して残りのプロナーゼを洗い流し、３８．５℃で７％Ｏ_２、５％ＣＯ_２の下で１０分間インキュベートした。その後、ＺＰフリーの受胎産物をＮｂｒｙｏＩＶＣ－２Ｃａ^２＋フリー培地に移植し、３８．５℃で７％Ｏ_２、５％ＣＯ_２の下で３分間置いて、細胞間の接触を減らした。そして、ＮｂｒｙｏＩＶＣ－２Ｃａ^２＋フリー培地で、マイクロピペット（直径約１２０μｍ）を用いた吸引により、各受胎産物の割球を分離した。３８．５℃で、７％Ｏ_２、５％ＣＯ_２の下で、割り当て培地を含むＰＶＡプレコートウェル内で、個々の割球を個別に培養した。

数回の解凍プロシージャ（連続ｎ＝２、連続ｎ＝３、または連続ｎ＝４）を経た割球を、分割後に解凍した。２回目の解凍プロシージャ（連続ｎ＝２）では、３８．５℃で、７％Ｏ_２、５％ＣＯ_２の下で、卵割を経た割球をＮｂｒｙｏＩＶＣ－２Ｃａ^２＋フリー培地に１～３分間置いていた。前述したように、マイクロピペットを用いた吸引により、割球を分離し、割り当て培地を含むＰＶＡプレコートウェル内で個別に培養した。３回目の解凍プロシージャ（連続ｎ＝３）と４回目の解凍プロシージャ（連続ｎ＝４）では、このプロセスを繰り返した。割球の発育状態（卵割、圧縮、キャビテーション、小胚盤胞）に基づいて、着床前の発育の８日目まで、割球を１２～２４時間ごとにスコアリングした。キャビティが受胎産物の体積の半分より大きく、ＩＣＭ細胞の凝集クラスターがある場合、受胎産物は、胚盤胞として分類された。

実施例４の命名と定義
本明細書に記載されるように、用語「胚」は、２つの半数体配偶子細胞（例えば、未受精の卵母細胞と精子細胞）が結合して二倍体全能性細胞（例えば、受精の卵子）を形成する際に形成される受精卵、ならびに後続の細胞分裂（すなわち、胚の卵割）から生じる胚（桑実胚期（すなわち、約１６細胞期）と、栄養外胚葉と内細胞塊が分化した胚盤胞期とを含む）のことを指す。本明細書に記載の「受胎産物」とは、受精から原始線条の出現（ウシにおける発育の１８日目に相当）までの発育中の胚である。本発明者らがウシの受精卵と個々の割球を受精後８日まで（胚盤胞期まで）培養したので、「受胎産物」という用語は、発育中の実体を説明するために使用されてきた。

２細胞、４細胞、８細胞、１６細胞期受胎産物から単離された割球は、本明細書では、それぞれ「１：２」、「１：４」、「１：８」、および「１：１６」割球と呼ばれ、分子が細胞塊中の割球の数を表し、分母が割球の相当する受胎産物段階を表す。図１は、連続ｎ＝４回の解凍による２細胞受胎産物の解凍に関するこの命名システムを示す。図１は、２細胞期胚からの４回の解凍における割球と発育中の胚の分類スキームの概略図である。図１の左側は、受精卵期から胚盤胞期までの着床前受胎産物の正常な発育を表す。図１の右側に示されている解凍プロシージャでは、ＺＰを除去して、受胎産物内の個々の割球を分離する（連続ｎ＝１）。２細胞受胎産物から単離された個々の割球は、１：２と呼ばれる。そして、２：４と名付けられたペアを形成するように、これらの割球を発育させる。卵割の後、これらの２：４割球に対してもう一回解凍を行うことができ（連続ｎ＝２）、その解凍において、割球が１：４に分離される。このプロセスをｎ回繰り返すことができる（例えば、ｎ＝３および／またはｎ＝４以上）。これらの割球が発育につれて、後続の相当する着床前受胎産物の段階に移行し、そのため分母がそれに応じて変化する。１：１６段階の後、割球を圧縮し、キャビテートして、胚盤胞に相当するものを形成することができる。

結果
連続ｎ＝４解凍プロシージャを介した２細胞ウシ受胎産物の解凍
合計２８個の２細胞ウシ受胎産物を解凍した。連続ｎ＝１解凍プロシージャの後、５６個の１：２割球を得た（表２、と図１の命名説明を参照）。１：２割球の５５／５６は２：４に分割され、そのうち４８個がもう一回の解凍（連続ｎ＝２）を経た。連続ｎ＝２解凍の後、１：４割球の９１／９６は２：８に分割され、そのうち８１個がもう一回の解凍（連続ｎ＝３）を経た。連続ｎ＝３解凍プロシージャの後、１：８割球の１４５／１６２は２：１６に分割され、そのうち１００個がもう一回の解凍（連続ｎ＝４）を経た。連続ｎ＝１、ｎ＝２、およびｎ＝３の個々の割球のすべてを５０μＬのＮｂｒｙｏＩＶＣ－３培地で培養した。最後に、連続ｎ＝４解凍プロシージャの後、１９９個の１：１６割球が得られ、２０μＬのＶｉｔｒｏＢｌａｓｔ（ＡｒｔＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）ＩＶＣ培地で胚盤胞期に相当する段階まで進行させた。この１９９個の１：１６割球のうち、１７１個（８５．９％）：分割、１５６個（７８．４％）：圧縮、１２７個（６３．８％）：キャビテーション、５３個（２６．６％）：進行して小胚盤胞を形成した。

文献は、無傷なウシ受胎産物が約３０％の効率（表２に示すように）で胚盤胞期まで培養されることを一貫して報告しており、これは家畜胚の培養と移植の方面で豊富な経験を持つ発明者の経験である。したがって、本明細書に記載の解凍プロシージャを行わずに２８個の２細胞ドナー受胎産物を培養していた場合、約３０％の効率に基づいて、収量が８個の胚盤胞になると予想される。上記の連続解凍プロシージャを使用することで、本発明者らは、初期２８個のドナー受胎産物から５３個の胚盤胞を生産することができ、それによって、無傷受胎産物の培養に比べて胚盤胞生産の効率を約６倍向上させる。

表２、連続解凍プロシージャ（連続ｎ＝４）によって解凍された２細胞ウシ受胎産物に由来する胚盤胞に相当するものの発育

実施例５：≧８細胞ウシ胚の解凍による複数の胚の生産
本実施例では、本発明者らが「解凍法」を用いて≧８細胞ドナー受胎産物の解凍を行って、複数の胚盤胞を生産した実験が記載される。

方法
培養培地、培養条件、受胎産物の解凍プロシージャは、一般に、実施例４の「方法」セクションに記載されているとおりである。

簡単に言えば、合計１９頭のウシの≧８細胞期受胎産物を解凍した。解凍された受胎産物には、８～４３の細胞が含まれた。２０μＬのＶｉｔｒｏＢｌａｓｔ（ＡｒｔＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）ＩＶＣ培地で、分離された割球を個別に培養した。受胎産物中の細胞の卵割が同期していないので、これらの受胎産物中には、１：８、１：１６、１：３２、１：６４割球からなる割球発育の異質段階が存在する。その結果、各タイプの割球を個別に分析した。

結果
１９個の受胎産物から５３個の１：８割球が得られ、そのうち、３８個（７１．７％）：分割、３４個（６４．１％）：圧縮、２５個（４７．２％）：キャビテーション、２１個（３９．６％）：胚盤胞を形成した（表２．２）。また、１６２個の１：１６割球が得られ、そのうち、１２６個（５０％）：分割、１０５個（６４．８％）：圧縮、９９個（６１．１％）：キャビテーション、３６個（２２．２％）：胚盤胞を形成した。５４個の１：３２割球が得られ、そのうち、４７個（８７．０％）：分割、４５個（８３．３％）：圧縮、４４個（８１．４％）：キャビテーション、３個（５．６％）：胚盤胞を形成した。いくつかの１：３２割球はペアで培養された（すなわち、２：３２）。具体的には、解凍プロシージャから２個の２：３２割球が得られ、そのうち、２個（１００％）：分割、１個（５０．０％）：圧縮、１個（５０．０％）：キャビテーション、０個（０％）：胚盤胞を形成した。最後、２７個の１：６４割球が得られ、そのうち、１３個（４８．１％）：分割、１１個（４０．７％）：圧縮、１１個（４０．７％）：キャビテーション、１個（３．７％）：胚盤胞を形成した。全体的に、最初の１９個のドナー受胎産物から、合計６１個の胚盤胞ができた。これを表３にまとめる。

発育上に１６細胞、３２細胞、６４細胞胚と同等な割球からなる受胎産物を含む、≧８細胞期受胎産物から初めて、本発明者らは、「解凍」法を用いた胚増殖が胚盤胞生産の効率を著しく向上させることができることを示した。この点で、本発明者らが初期１９個のドナー受胎産物から６１個の胚盤胞を生産することができたが、これは、無傷受胎産物の培養に比べて胚盤胞生産の効率の１０倍の増加を表す（これは、通常、前述のように約３０％の効率を達成する）。

表３、１つの連続解凍プロシージャ（連続ｎ＝１）によって解凍された≧８細胞ウシ受胎産物に由来する胚盤胞に相当するものの発育

当業者であれば、本開示の広い一般的範囲から逸脱することなく、上述した実施形態に多くの変更および／または修正を加えることができることを理解するであろう。したがって、本実施形態は、すべての点で限定的ではなく例示的であると考えられる。

（関連出願）
本出願は、２０２０年７月３１日に出願されたオーストラリア仮出願番号２０２０９０２６９１の優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（付記）
（付記１）
１つ以上のドナー胚を増殖させる方法であって、
（ｉ）少なくとも２つの胚細胞を含む１つ以上のドナー胚を得るステップ、
（ｉｉ）前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離するステップ、
（ｉｉｉ）それぞれが少なくとも２つの胚細胞を含む複数の胚を生産するのに適した条件下で、前記胚細胞を体外で膨張させるステップ、
（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）で生産された、後続の増殖においてドナー胚として使用される前記複数の胚のうちの１つ以上を単離するステップ、および
（ｖ）前記ステップ（ｉ）～（ｉｖ）を「ｎ」（「ｎ」≧３）回繰り返すステップを含む、方法。

（付記２）
ｎは４以上である、付記１に記載の方法。

（付記３）
前記ステップ（ｉ）で得られたドナー胚から１６個以上の一卵性胚を生産する、付記１または２に記載の方法。

（付記４）
前記１つ以上のドナー胚は、それぞれ２～６４個の胚細胞を含む、付記１～３のいずれか１つに記載の方法。

（付記５）
前記１つ以上のドナー胚は、それぞれ２～１６個の胚細胞を含む、付記１～４のいずれか１つに記載の方法。

（付記６）
ドナー胚を増殖させる方法であって、
（ｉ）１６細胞胚または予備圧縮桑実胚からの胚細胞と発育上に同等な１つ以上の胚細胞を含むドナー胚を得るステップ、
（ｉｉ）前記ドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離するステップ、
（ｉｉｉ）前記ドナー胚から複数の一卵性胚を生産するのに適した条件下で、前記胚細胞を体外で膨張させるステップ、および
（ｉｖ）複数の一卵性胚盤胞を生産するのに適した条件下で、前記複数の一卵性胚を培養するステップを含む、方法。

（付記７）
前記複数の一卵性胚を培養して前記複数の胚盤胞を生産する前記ステップの前に、前記方法は、
（ｉ）後続の増殖においてドナー胚として使用するために生産された前記複数の一卵性胚のうちの１つ以上を単離するステップであって、後続の増殖のために単離された各ドナー胚が少なくとも２つの胚細胞を含む、ステップ、
（ｉｉ）前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離するステップ、
（ｉｉｉ）それぞれが少なくとも２つの胚細胞を含む複数の胚を生産するのに適した条件下で、前記胚細胞を体外で膨張させるステップ、
（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）で生産された、後続の増殖においてドナー胚として使用される前記複数の胚のうちの１つ以上を単離するステップ、および
（ｖ）複数の胚盤胞を生産するのに適した条件下で前記複数の胚を培養する前に、前記ステップ（ｉ）～（ｉｖ）を「ｎ」回繰り返すステップをさらに含む、付記６に記載の方法。

（付記８）
ｎは２以上である、付記７に記載の方法。

（付記９）
ｎは３以上である、付記７に記載の方法。

（付記１０）
ｎは４以上である、付記７に記載の方法。

（付記１１）
前記ドナー胚を、各部分が１つ以上の胚細胞を含む複数の部分に分割することによって、前記１つ以上の胚細胞を前記１つ以上のドナー胚から分離することを達成する、付記１～１０のいずれか１つに記載の方法。

（付記１２）
マイクロサージカルブレードまたはレーザーを使用して、前記１つ以上のドナー胚の分割を行う、付記１１に記載の方法。

（付記１３）
透明帯（ＺＰ）を破壊し、前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を単離することによって、前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離することを達成する、付記１～１０のいずれか１つに記載の方法。

（付記１４）
前記ＺＰを酵素的または機械的に破壊し、マイクロピペットを使用して前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を吸引することにより、前記胚細胞を単離する、付記１３に記載の方法。

（付記１５）
胚発生を促進し得る１つ以上の因子の存在下で、前記胚細胞を培養する、付記１～１４のいずれか１つに記載の方法。

（付記１６）
全能性を促進し得る１つ以上の因子の存在下で、前記胚細胞を培養する、付記１～１５のいずれか１つに記載の方法。

（付記１７）
前記ドナー胚が哺乳類種に由来する、付記１～１６のいずれか１つに記載の方法。

（付記１８）
前記哺乳類種が家畜種である、付記１７に記載の方法。

（付記１９）
前記家畜種がウシ種である、付記１８に記載の方法。

（付記２０）
前記ステップ（ｉ）における前記１つ以上のドナー胚が体内受精で生産される、付記１～１９のいずれか１つに記載の方法。

（付記２１）
前記ステップ（ｉ）における前記１つ以上のドナー胚が体外受精（ＩＶＦ）で生産される、付記１～２０のいずれか１つに記載の方法。

（付記２２）
前記ステップ（ｉ）における前記１つ以上のドナー胚が新鮮である、付記１～２１のいずれか１つに記載の方法。

（付記２３）
前記ステップ（ｉ）における前記１つ以上のドナー胚が凍結保存されている、付記１～２２のいずれか１つに記載の方法。

（付記２４）
前記ステップ（ｉ）の前に、１つ以上の遺伝子スクリーニング基準、遺伝子診断基準、および／または１つ以上の形態学的基準に基づいて、前記１つ以上のドナー胚を選択するステップをさらに含む、付記１～２３のいずれか１つに記載の方法。

（付記２５）
前記１つ以上のドナー胚が遺伝子組換えされている、付記１～２４のいずれか１つに記載の方法。

（付記２６）
前記１つ以上のドナー胚は、そこから生産された胚および／または前記胚から生産された動物のトレーサビリティのためのユニークな遺伝子タグまたは識別子を含む、付記２５に記載の方法。

（付記２７）
前記生産された複数の胚を体外で膨張させて、胚盤胞を形成する、付記１～２６のいずれか１つに記載の方法。

（付記２８）
前記方法により生産された前記胚を収穫するステップをさらに含む、付記１～２７のいずれか１つに記載の方法。

（付記２９）
前記収穫された胚のうちの１つ以上を胚保持培地に保存する、付記２８に記載の方法。

（付記３０）
前記収穫された胚のうちの１つ以上を約４℃で保存する、付記２９に記載の方法。

（付記３１）
前記収穫された胚のうちの１つ以上を凍結保存する、付記２８に記載の方法。

（付記３２）
前記方法により生産された前記胚のうちの１つ以上を、１つ以上のレシピエントメスの輸卵管に移植するステップをさらに含む、付記１～３１のいずれか１つに記載の方法。

（付記３３）
付記１～３２のいずれか１つに記載の方法により生産された１つ以上の胚。

（付記３４）
動物を飼育する方法であって、
（ｉ）付記１～３２のいずれか１つに記載の方法により生産された胚のうちの１つ以上を、１つ以上のレシピエントメスの輸卵管に移植して、妊娠を成立させるステップ、および
（ｉｉ）妊娠した前記レシピエントメスから分娩により動物を生産するステップを含む、方法。

（付記３５）
前記動物が哺乳類種である、付記３４に記載の方法。

（付記３６）
前記哺乳類種が家畜種である、付記３５に記載の方法。

（付記３７）
前記家畜種がウシ種である、付記３６に記載の方法。

Claims (37)

1. １つ以上のドナー胚を増殖させる方法であって、
   （ｉ）少なくとも２つの胚細胞を含む１つ以上のドナー胚を得るステップ、
   （ｉｉ）前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離するステップ、
   （ｉｉｉ）それぞれが少なくとも２つの胚細胞を含む複数の胚を生産するのに適した条件下で、前記胚細胞を体外で膨張させるステップ、
   （ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）で生産された、後続の増殖においてドナー胚として使用される前記複数の胚のうちの１つ以上を単離するステップ、および
   （ｖ）前記ステップ（ｉ）～（ｉｖ）を「ｎ」（「ｎ」≧３）回繰り返すステップを含む、方法。
2. ｎは４以上である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ステップ（ｉ）で得られたドナー胚から１６個以上の一卵性胚を生産する、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記１つ以上のドナー胚は、それぞれ２～６４個の胚細胞を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記１つ以上のドナー胚は、それぞれ２～１６個の胚細胞を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. ドナー胚を増殖させる方法であって、
   （ｉ）１６細胞胚または予備圧縮桑実胚からの胚細胞と発育上に同等な１つ以上の胚細胞を含むドナー胚を得るステップ、
   （ｉｉ）前記ドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離するステップ、
   （ｉｉｉ）前記ドナー胚から複数の一卵性胚を生産するのに適した条件下で、前記胚細胞を体外で膨張させるステップ、および
   （ｉｖ）複数の一卵性胚盤胞を生産するのに適した条件下で、前記複数の一卵性胚を培養するステップを含む、方法。
7. 前記複数の一卵性胚を培養して前記複数の胚盤胞を生産する前記ステップの前に、前記方法は、
   （ｉ）後続の増殖においてドナー胚として使用するために生産された前記複数の一卵性胚のうちの１つ以上を単離するステップであって、後続の増殖のために単離された各ドナー胚が少なくとも２つの胚細胞を含む、ステップ、
   （ｉｉ）前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離するステップ、
   （ｉｉｉ）それぞれが少なくとも２つの胚細胞を含む複数の胚を生産するのに適した条件下で、前記胚細胞を体外で膨張させるステップ、
   （ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）で生産された、後続の増殖においてドナー胚として使用される前記複数の胚のうちの１つ以上を単離するステップ、および
   （ｖ）複数の胚盤胞を生産するのに適した条件下で前記複数の胚を培養する前に、前記ステップ（ｉ）～（ｉｖ）を「ｎ」回繰り返すステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. ｎは２以上である、請求項７に記載の方法。
9. ｎは３以上である、請求項７に記載の方法。
10. ｎは４以上である、請求項７に記載の方法。
11. 前記ドナー胚を、各部分が１つ以上の胚細胞を含む複数の部分に分割することによって、前記１つ以上の胚細胞を前記１つ以上のドナー胚から分離することを達成する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. マイクロサージカルブレードまたはレーザーを使用して、前記１つ以上のドナー胚の分割を行う、請求項１１に記載の方法。
13. 透明帯（ＺＰ）を破壊し、前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を単離することによって、前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を分離することを達成する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記ＺＰを酵素的または機械的に破壊し、マイクロピペットを使用して前記１つ以上のドナー胚から前記胚細胞のうちの１つ以上を吸引することにより、前記胚細胞を単離する、請求項１３に記載の方法。
15. 胚発生を促進し得る１つ以上の因子の存在下で、前記胚細胞を培養する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 全能性を促進し得る１つ以上の因子の存在下で、前記胚細胞を培養する、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記ドナー胚が哺乳類種に由来する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記哺乳類種が家畜種である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記家畜種がウシ種である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ステップ（ｉ）における前記１つ以上のドナー胚が体内受精で生産される、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記ステップ（ｉ）における前記１つ以上のドナー胚が体外受精（ＩＶＦ）で生産される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記ステップ（ｉ）における前記１つ以上のドナー胚が新鮮である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記ステップ（ｉ）における前記１つ以上のドナー胚が凍結保存されている、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記ステップ（ｉ）の前に、１つ以上の遺伝子スクリーニング基準、遺伝子診断基準、および／または１つ以上の形態学的基準に基づいて、前記１つ以上のドナー胚を選択するステップをさらに含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記１つ以上のドナー胚が遺伝子組換えされている、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記１つ以上のドナー胚は、そこから生産された胚および／または前記胚から生産された動物のトレーサビリティのためのユニークな遺伝子タグまたは識別子を含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記生産された複数の胚を体外で膨張させて、胚盤胞を形成する、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記方法により生産された前記胚を収穫するステップをさらに含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記収穫された胚のうちの１つ以上を胚保持培地に保存する、請求項２８に記載の方法。
30. 前記収穫された胚のうちの１つ以上を約４℃で保存する、請求項２９に記載の方法。
31. 前記収穫された胚のうちの１つ以上を凍結保存する、請求項２８に記載の方法。
32. 前記方法により生産された前記胚のうちの１つ以上を、１つ以上のレシピエントメスの輸卵管に移植するステップをさらに含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法により生産された１つ以上の胚。
34. 動物を飼育する方法であって、
    （ｉ）請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法により生産された胚のうちの１つ以上を、１つ以上のレシピエントメスの輸卵管に移植して、妊娠を成立させるステップ、および
    （ｉｉ）妊娠した前記レシピエントメスから分娩により動物を生産するステップを含む、方法。
35. 前記動物が哺乳類種である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記哺乳類種が家畜種である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記家畜種がウシ種である、請求項３６に記載の方法。