CN1183247C - 膜受损的经冷冻干燥的精子或精子头部及其制法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种冷冻干燥精子以获得至少一个重建精子的方法，精子的头部(胞核)能使卵母细胞受精产生活的后代。已被冷冻干燥并保藏于室温真空下的精子的活动力在重新水化后没有恢复。它们的质膜被破坏，它们在常规意义上均是“死的”。然而，当用显微外科手术方法将它们注射入卵母细胞内时，它们的胞核转变成雄性前核并参与正常的胚胎发育。

Description

膜受损的经冷冻干燥的精子或精子头部及其制法
本申请要求了1998年10月23日提交的美国专利申请No.09/177,391的优先权，而该申请又要求了1998年3月20日和1998年6月19日提交的美国临时专利申请No.60/078,925和60/089,938的优先权。
美国政府在本发明中有一个已支付的许可，并且在一定情况下有权根据卫生部国立卫生研究院资助合同No.R01-HD-03402中的条款要求专利所有人以合理的条件许可他人使用。
                               发明背景
本发明涉及精子的冷冻干燥、用重建的冷冻干燥的精子使卵母细胞受精，以及从其发育成活的后代。
利用冷冻保护剂来成功地冷冻保藏精子以及长时期保藏冷冻精子的能力已经使动物饲养以及人类生殖医学有了很大改进。已经发现，冷冻保护的冻融精子通常重新获得活动能力，并能几乎与新鲜精子一样有效地受精。
常规方法是将精子长期保藏在液氮(-196℃)中来冷冻保藏牛和人的精子。然而，常规长期保藏精子是非常昂贵的，因为需要持续提供液氮。而且，在世界上某些地区，将精子保藏在液氮内可能是不方便的和/或昂贵的，例如在不易获得液氮(或甚至是干冰)的发展中国家。常规方法冷冻的精子的运输也很成问题，因为它可能需要运输大的液氮罐或使用含有液氮或干冰的特殊运输容器。因此，人们作了很多尝试来保藏精子而无需保藏在液氮内。例如，如果能将有受精能力的精子以冻干状态在常温下或普通冰箱内保藏，则维持和运输成本将大幅度下降。
据信第一次记载冷冻干燥精子的尝试是在1949年，当时将1毫升(ml)家禽精液与等体积的含有20-30％甘油的Ringer′s溶液混合，在蒸馏瓶上涂成一薄层，通过除去90％的水来“冷冻干燥”。据报道，当制备物在放回室温后2小时内重新水化(rehydrate)时，多达50％的精子重新获得活动能力。然而，却没有测定重新水化的精子的受精能力。
随后有人尝试用冷冻干燥的精子来产生活的后代，但没有成功。例如，已经报道说，在用冷冻干燥后立即重建且显示出50％精子活动能力的公牛精子对母牛人工授精后，生出一头活的小牛。还有报道说，用冷冻干燥的精子授精后得到了12头正常的家兔仔。然而，创始人均不能重复这些结果，本领域其他工作人员也不能复制和证实这些结果。
通过研究正常的和冻融的精子性质和受精能力，已经知道，为了使精子支持正常的胚胎发育，从常规意义讲精子无需是“活”的(即具有完整的质膜)。例如，在胞质内精子注射(ICSI)技术中，选出能游动的人精子。它们在注射入卵母细胞之前通过其尾部的侵蚀性磨损而被立即固定(“杀死”)，导致质膜破坏。曾报道，精子固定显著提高了ICSI的受精成功率。也已报道，当小鼠精子悬浮在没有冷冻保护剂的介质中，然后立即冷冻在液氮中时，如活/死细胞染色所判断，100％的精子是“死亡的”，而将解冻的精子头部显微注射入卵母细胞后，却仍产生了正常的胚胎发育。还有报道说，将无冷冻保护剂时冻融灭活的精子显微注射入卵母细胞后，生出了两头正常的小牛。
尽管已知将冻干的仓鼠和人精子头部注入仓鼠卵母细胞内能形成看上去正常的前核，但是却从未确定过这些精子头部是否能支持正常的胚胎发育。另外，已经证实，当精子被冷冻并干燥至水分含量分别小于30％、7％和0.5％时，分别发生活动力丧失、顶体破坏和酶释放。还得到了这样的证据，即精子中的细胞蛋白因脱水低于6％水分而改变。
鉴于前述内容，需要一种可靠的能再现的方法来冷冻干燥精子，使冻干精子在环境温度、普通冰箱温度或更低温度下长期保存期间保留其受精能力。还需要一种精子注射方法，该方法采用重新水化的冻干的精子使受体卵母细胞受精，从而产生正常的活后代。
                              发明概述
本发明提供一种冷冻干燥精子来获得至少一个头部(胞核)能使卵母细胞受精产生活后代的重建精子的方法。本发明的方法包括下列步骤：(a)收集活的精子；(b)将精子悬浮在悬浮培养基中；(c)冷冻精子悬液；和(d)将精子悬液干燥至水分含量低于1％、较佳的低于0.01％、更佳的低于0.001％、特别佳的低于0.00001％。该方法还包括使经冷冻干燥的精子悬液从新水化的步骤，其中至少一个重新水化的精子头部保留其遗传完整性，并能使卵母细胞受精产生活的后代。如下所述，该方法可能还包括在重新水化前保藏经冷冻干燥的精子的步骤。
为了获得活的后代，至少将重新水化精子的头部(胞核)插入分离的卵母细胞内，形成受精的卵母细胞。可用显微注射、较佳的是压电驱动的显微注射来将精子头部注入卵母细胞内。较佳的，胞核的插入在重新水化后1小时以内进行。然后使受精的卵母细胞发育成胚胎，并植入代孕母亲的子宫内，该卵母细胞在子宫内发育成活的后代。
在一些种类动物(例如大多数真兽亚纲动物，包括人)中，受精卵母细胞的正常胚胎发育还需要随精子胞核插入的亲代中心体。当精子头部和尾部分开时，中心体通常与精子头部的后端或精子尾部的前端连接。因此，在本发明的实施方案中，来自另一精子的与精子连接的中心体可以和精子头部同时插入，或可以和精子尾部同时插入或连续插入。另外，精子胞核和中心体的插入可通过将一个完整的重新水化的精子插入卵母细胞来实现。
已经发现，用本发明方法冷冻干燥过的精子可在环境温度(例如室温)至冰箱温度(例如约4℃)的温度范围内保藏至少三个月，或更佳的至少一年，而不丧失其遗传完整性或受精能力。因此，用本发明方法制得的冷冻干燥的精子可以在常温或冰箱温度下运输至世界上几乎任何地方期间保留其(受精)能力，并且在不易获得液氮或干冰的场所在环境或冰箱温度下能短期保藏。较佳的，经冷冻干燥的精子的长期(例如无限期)保藏宜在低于4℃的温度(例如-20℃或更低)下进行。
本发明的方法可用来冷冻干燥无脊椎动物和脊椎动物的精子，这些动物包括，但不局限于，无脊椎动物如海胆、鲍鱼、龙虾、有壳的水生动物等，以及脊椎动物如鱼类、两栖类、爬虫类、鸟类和所有哺乳动物。
具体而言，本发明提供了一种膜受损的经冷冻干燥的精子，它们包含具有受精能力的胞核，所述精子已被冷冻干燥至水分含量低于1％，并能在重新水化后通过显微插入使分离的卵母细胞受精产生活的后代。本发明还提供了一种膜受损的经冷冻干燥的精子头部，它们包含具有受精能力的胞核，所述精子头部已被冷冻干燥至水分含量低于1％，并能在重新水化后通过显微插入使分离的卵母细胞受精产生活的后代。
本发明另一方面提供一种安瓿，它含有上述精子或精子头部。
本发明另一方面提供了一种获得上述膜受损的经冷冻干燥的精子的方法，该方法包括下列步骤：
收集活的成熟的精子；
将精子悬浮在生理性悬浮培养液中；
冷冻精子悬液，形成冷冻的精子；和
在真空下将冷冻的精子干燥至水分含量低于1％，形成经冷冻干燥的精子，该精子包含具有受精能力的胞核，能在重新水化后通过显微插入使分离的卵母细胞受精产生活的后代。
本发明另一方面提供了一种获得上述膜受损的经冷冻干燥的精子头部的方法，该方法包括下列步骤：
收集活的成熟的精子；
将精子悬浮在生理性悬浮培养液中；
使精子脱膜以形成脱膜的精子头部；
冷冻精子悬液，形成冷冻的精子头部；和
在真空下将冷冻的精子头部干燥至水分含量低于1％，形成经冷冻干燥的精子头部，该精子头部包含具有受精能力的胞核，能在重新水化后通过显微插入使分离的卵母细胞受精产生活的后代。
本发明还提供了一种用膜受损的精子或精子头部使哺乳动物卵母细胞受精的方法，该方法包括下列步骤：
从哺乳动物收集活的成熟的精子；
将精子悬浮在生理性悬浮培养液中；
将精子悬液冷冻成冷冻的精子；
在真空下将冷冻的精子干燥至水分含量低于1％，形成经冷冻干燥的精子；
使经冷冻干燥的精子重新水化；
分离出经重新水化的膜受损的精子或精子头部，它们包含具有受精能力的胞核，能在重新水化后经显微插入使分离的卵母细胞受精产生活的后代；
分离出该种类动物的卵母细胞；将膜受损的精子或精子头部插入该分离的卵母细胞内，形成受精的卵母细胞。
                               附图简述
本专利的文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付所需费用后，专利商标局将提供具有彩色附图的本专利副本。
图1是含有冷冻干燥的小鼠精子的真空密封安瓿的照片。每个安瓿底部的白色粉末是含有精子的经干燥的CZB培养液。
图2A是冷冻干燥的小鼠精子在重新水化后立即拍摄的显微照片。根据保藏期间对干燥样品处理得轻微还是粗糙，没有尾部或有尾部断裂的精子头部的部分是不同的。
图2B显示未冷冻的正常精子头部前端区域的纵向横截面的电子显微照片。
图2C显示重新水化后冻干精子头部在重新水化后的前端区域纵向和横向横截面的电子显微照片。缺少了质膜(p)和顶体物质(ac)。(ia)＝顶体内膜，(oa)＝顶体外膜，(n)＝胞核。
图3是CD-1(白化体)代孕母亲生出的三只幼鼠(黑色)的照片。这些幼鼠从注射了B6D2F1精子的B6D2F1卵母细胞发育而来，而该B6D2F1精子在冷冻干燥后室温下放置了一个月。
                              发明详述
在哺乳动物正常受精期间，有受精能力的精子沿雌性的生殖道上行，钻过卵母细胞的外壳，然后与卵母细胞融合。精子与卵母细胞的融合触发卵母细胞激活。激活的卵母细胞恢复减数分裂，卵母细胞染色体转变成雌性前核。同时，卵母细胞内的精子胞核解凝聚，转变成雄性前核。然后，完全发育的雌性和雄性前核联合，这些前核的染色体混合在一起。得到的受精卵发育成活的后代。
本发明提供了一种冷冻干燥精子的方法，该精子在重新水化后能使分离的卵母细胞受精产生活的后代。用本发明方法产生的冻干的精子保留了其遗传和繁殖能力，即使在重新水化后，它们也不能游动，在常规意义下是“死”的。当将本发明精子的整个精子或分离的精子头部(即含有包括胞核的所有头部组分)或脱膜(demembranating)的精子或精子头部(即保留了胞核和核周物质，但是缺少质膜)直接注入卵母细胞内后，却发生了能导致产生活后代的正常受精和胚胎发育。较佳的，将精子头部(胞核)直接插入卵母细胞的胞质内。精子头部的插入可通过显微注射、较佳的是压电驱动的显微注射来进行。如下文进一步描述的，一些种类动物的受精卵母细胞的胚胎发育可能需要同时或依次注入精子中心体。如果中心体在冷冻干燥过程中没有存活，则可从未冷冻的精子收获中心体用来插入卵母细胞内。
现在将更详细地描述本发明用来制备有受精能力的冷冻干燥的精子的方法，及其在体外受精程序中的各个步骤及分步骤。
精子的制备。
为了确保在本发明的冷冻干燥过程中有尽可能多的冷冻干燥精子保留其遗传完整性，较佳的是在本发明方法中采用生理上成熟的精子。在成熟精子中，DNA与称为鱼精蛋白的碱性蛋白结合在一起。在哺乳动物中，鱼精蛋白通过二硫键充分交联。这使精子胞核稳定，并使它们能非常耐受物理和化学破坏。胞核鱼精蛋白的交联主要发生在精子转移通过附睾期间。因此在附睾内的以及射精(精液)中的哺乳动物精子通常在生理上比在睾丸内的精子更成熟，因此在本发明方法中是较佳的，至少在哺乳动物是如此。
无脊椎动物和脊椎动物的成熟精子可用本领域技术人员已知的方法来收集。例如啮齿类动物(如小鼠、金色(Syrian)仓鼠、豚鼠)、家兔等的成熟精子可以从尾附睾收集；而在其他种类的动物如人、猪、马、公牛、山羊、禽等情况下，可以从能育雄性刚射出的精液分离集成熟精子。鱼(例如剑尾(swordtail)，Xiphophorus helleri)以及无脊椎动物如海胆(Tripneustes gratilla)的精子可以从成熟雄性的睾丸收集得到。
下面是从尾附睾获得精子的一个方法例子。取出成熟雄性小鼠(出生后约8周)的尾附睾。除去尾附睾表面的血液和脂肪组织。然后将其压缩，释放出稠密的精子团。将1滴(约2微升)精子团置于1.5毫升聚丙烯离心试管的底部，用0.5毫升温热的生理培养液(如CZB培养液、磷酸盐缓冲液或等渗盐溶液)覆盖。37℃下约10至20分钟后，可以从上清液中收集到游动的精子。
下面是从精液中获得精子方法的一个例子。使新鲜射出的人精液在室温下(约25℃)液化约30分钟。然后用约10毫升盐水稀释精液，并过滤通过大约两层滤纸，除去碎片。然后400xg离心滤液大约10分钟，将沉淀的精子重悬于生理溶液中至所需浓度，用于冷冻干燥过程。
下面是从睾丸获得精子的方法的一个例子。将切下的睾丸置于红细胞裂解缓冲液(例如155毫摩尔NH4Cl，10毫摩尔KHCO3，2毫摩尔EDTA，pH7.2-7.4)中，用一把细剪刀剪碎，并通过约两层滤纸过滤除去碎片。然后离心滤液(例如700xg，5分钟)，将沉淀重悬于生理溶液中至所需浓度，用于冷冻干燥过程。
不论采用何种方法来制备精子，回收得到的精子有50％以上应是能游动的。
将如此回收得到的精子重悬于下文所述的用于冷冻干燥过程的生理培养基中。或者，精子可在冷冻干燥前经历进一步加工，以获得脱膜的精子头部。
脱膜精子头部的制备
脱膜精子头部是经洗涤剂抽提过的头部，它缺少所有的膜(包括质膜和顶体内膜和外膜)，但是保留了胞核和核周物质。例如，可用含有或不含SDS(十二烷基硫酸钠)的Triton X-100处理使精子头部脱膜。Triton X-100是熟知的非离子表面活性剂，它广泛用于在非变性条件下除去膜组分。SDS是阴离子洗涤剂，用来使各种蛋白(包括膜蛋白)溶解。在小鼠中，用Triton X-100脱膜的精子头部表明能激活卵母细胞，导致正常的胚胎发育。
下面是对精子头部脱膜的一个典型方法。对上述制得的精子悬液等份进行超声处理。例如，将上述从尾附睾、睾丸或精液中收集的精子悬浮在5毫升BM缓冲液(75毫摩尔氯化钠、24毫摩尔EDTA和50毫摩尔Tris-HCl，pH7.2)中，在Biosonik超声仪(Bronwill Scientific，Rochester，NY)以70-80％输出功率超声处理30秒。该处理使95％以上的精子去顶。为了使精子头部脱膜，使超声后的精子悬液700xg离心5分钟，用BM缓冲液洗涤沉淀，然后在室温下用1％Triton X-100(以NIM培养液配制)处理5分钟。(NIM培养液由123.0毫摩尔氯化钾、2.6毫摩尔氯化钠、7.8亳摩尔磷酸二氢钠、1.4毫摩尔磷酸二氢钾、3毫摩尔EDTA二钠组成，pH7.2)。然后用NIM培养液充分洗涤头部，并重悬于用于冷冻干燥过程的精子悬浮培养液中。
精子悬浮培养液
在冷冻干燥制备时，将精子(或脱膜的精子头部)悬浮在生理溶液中，该溶液足以在正常条件下支持至少精子胞核的完整性。该溶液应是平衡盐溶液，至少具有合适的渗透压和pH。没有一种培养基能支持所有种类动物的精子存活。例如，对于海胆精子合适的溶液是海水，具有大约1000渗透压毫摩尔的渗透压，pH值约为8.2。然而，海水会立即杀死哺乳动物精子。哺乳动物精子要求溶液的渗透压约为300渗透压毫摩尔，pH为7.0-7.6。然而，该溶液会杀死海胆精子。
鉴于前述内容，必须根据涉及的动物种类、按照本领域技术人员熟知的标准来选择精子用悬浮培养液。这种选自无需作过多的实验。因为为了通过注射使卵母细胞成功地受精，精子不必是膜完整的(它们可以是“死”的)，因此悬浮培养液中绝对不需要冷冻保护剂如甘油等。
包装
精子悬浮液可以放在各种不同的容器内，这些容器包括但不局限于，带有螺帽的玻璃安瓿或塑料冷冻管(冷冻瓶)，或可将悬液抽入塑料吸管内，该吸管在冷冻干燥过程后可通过粉末密封剂、加热或用尼龙塞来密封。每一包装物中精子悬液的体积并不是关键。通常，在2毫升安瓿内采用约50-100微升的体积。
精子的冷冻干燥
精子悬液可用已知的方法缓慢或迅速冷冻。例如，可用本领域熟知的方法将悬液冷冻在液氮蒸气内或机械(电子)冷冻器的致冷空气中。冷却和冷冻可通过人工静态或分步方案来进行，或在电子自动化以及程控液氮进料系统中实施。可采用不同的冷冻速度(例如1℃-25℃/分钟)。例如，可以在-196℃下进行冷冻步骤10分钟。
在成功地以液氮蒸气冷冻吸管、安瓿或冷冻管内的悬液时可作各种改进。可采用液氮致冷机，将带雪茄管的金属容器(罐)、带有吸管的其他支架、或带安瓿或冷冻管的支架或框架直接放在液氮蒸气中。
冷冻的精子悬液在真空下的干燥可用本领域技术人员已知的各种不同系统来实现。例如，一种已知的装置是VirTis型号10-020(VirTis Co.，Gardiner，NY)。将悬液干燥至水分含量低于1％量。然而，水分含量宜低于0.01％，更佳的低于0.001％，尤其佳的是低于0.00001％。带有冷冻干燥的精子的容器宜为真空密封的，或在惰性气体(氮气或氩气)存在下密封。
保藏
带有冷冻干燥的精子的容器宜保藏在暗处，或用铝箔等包裹。对于长期保藏，较佳的是将该容器保藏在-20℃或更低的温度下。与用相当方法冷冻干燥的细菌、真菌等一样，预计冷冻干燥的精子胞核在这些保藏条件下将无限期地保留其遗传完整性。然而，该容器可在环境温度(如室温)或常规的冰箱温度(约4℃)保藏超过3个月而不损害冷冻干燥的精子胞核使卵母细胞受精的能力。因此，冷冻干燥的精子可以运输，而无需特殊的条件或大容器。
冷冻干燥的精子的重新水化
冷冻干燥的精子制备物宜通过加入纯水来重新水化，加入体积与精子悬液在冷冻干燥前的初始体积相同。一旦重新水化后，任何生理盐溶液，如0.9％盐溶液或CZB培养液(见下文)可用于稀释。稀释体积并不关键。最终的重新水化的培养基中的精子浓度应当足以帮助重新获得单个精子或单个精子头，便于将精子注射入卵母细胞内(如下所述)。
卵母细胞激活以及注射精子头部后的正常受精的发生率看来随精子重新水化后的时间增加而降低。重新水化和注射之间允许的时间在各动物种类之间可能不同；然而，作为一个例子，对于小鼠精子的时间宜为1小时或更短。
重新水化的冷冻干燥的精子的显微镜检查
冷冻干燥后重新水化的精子不能游动。可采用能区分常规意义上活的或死的精子的染色方法，以评价精子的生存力。一种用于本发明的合适的市售的生存力测试试剂盒是购自Molecular Probes，Eugene，Oregon的Live/dead FertiLight，它能在碘化丙啶/SYBR 14染色后根据UV显微镜下的荧光图案来区分质膜完整的(活的)和质膜被损伤的(死的)细胞。具有完整质膜的“活的”精子的胞核荧光呈绿色，而“死”的精子胞核的荧光呈亮橙红色。预计所有受检测的精子在常规意义下都是“死”的。
图2A是典型的冷冻干燥的小鼠精子在重新水化后立即拍摄的显微照片。一些精子的头部和尾部分开。根据保藏时对干燥样品处理是轻微还是粗鲁，尾部断裂或没有尾部的精子比例可能是不同的。将有或没有尾部的精子用于下述的注射程序。
图2B和2C中分别描述了新鲜的(非冷冻干燥的)、活的精子与用本发明方法冷冻干燥并重新水化的精子之间的差别。每张图显示了通过精子头部前端区域的纵向横截面。尽管冷冻干燥并重新水化的精子保留了胞核(n)，一部分顶体外膜(oa)和一部分顶体内膜(ia)，但却缺少质膜(p)和顶体物质(ac)。
受体卵母细胞
受体卵母细胞可以这样获得，例如通过注射促性腺激素(例如依次给予马和人绒毛膜促性腺素)诱导动物排卵或超排卵，以及在排卵预计时间(例如小鼠注射人绒毛膜促性腺素后13-15小时)立即用外科方法收获输卵管卵细胞。或者，收集卵巢卵母细胞，培养在培养基中使它们成熟，这是本领域技术人员所知道的。较佳的培养基例子是添加了牛血清白蛋白(BSA)的改进的Eagle培养基(MEM)，如Downs，S.M.和A.M.Mastropolo在Develop.Biol.162：154-168，1994中所述用于小鼠卵母细胞的培养基。
体外成功受精所需的精子组分
已经知道，在小鼠，正常的受精可通过将分离的精子头部注射入卵母细胞中来实现，且质膜、顶体膜和所有尾部组分并非正常胚胎发育所必需的。小鼠以及可能大多数常用实验室啮齿类动物是“例外的”，因为精子中心体并非正常受精所必需，且在正常受精期间，精子颈部区域内的精子中心体注定会在受精后的卵母细胞内退化。
相反，在大多数其他真兽亚纲哺乳动物(包括牛和人)中，精子中心体在形成微管中起关键作用，而微管又是雄性和雌性前核联合以及以后在胚胎发育期间的断裂所必需的。因此，在这些动物种类中，精子胞核(头部)和中心体导入卵母细胞似乎是产生正常后代所必需的。目前还不知道所有种类动物的精子中心体在冷冻干燥中是否能存活。如果不存活，则必须将未冷冻精子的中心体与经冷冻干燥的精子头部一起注入卵母细胞，以保证正常的胚胎发育。然而，导入数量过多的中心体将导致前核发育异常和胚胎发育异常。
当头部和尾部分开时，中心体通常与精子头部的后端或精子尾部的前端相连接。因此，可将精子中心体与精子头部同时插入卵母细胞内，或同时或连续将精子尾部插入来插入精子中心体。另外，精子胞核和中心体的插入可通过将完整的重新水化的精子插入卵母细胞内来实现。
将精子胞核插入受体卵母细胞
可以将整个精子插入受体卵母细胞的细胞质内，但是在精子较大的动物种类中，宜通过显微注射技术将分离的精子头部(胞核)直接注射入受体卵母细胞的细胞质内。在将重新水化的精子头部或重新水化的脱膜精子头部注射入受体卵母细胞中的较佳实施方案中，宜采用压电驱动的微量移液管。
市售的合适的压电驱动装置是Prime Tech Ltd.(Tsukuba，Ibaraki-ken，Japan)生产的名称为″压电微量操作仪/压电冲击驱动单元(Piezo Micromanipulator/Piezo ImpactDrive Unit)″。该单元利用压电效应以高度控制的快速方式使(注射)移液管夹持器向前推进非常短的距离(约0.5微米)。每一脉冲的强度和时间可以不同，并由一控制单元调控。
为了注射入卵母细胞，按照生产商说明书将单个精子(首先是尾部)吸入注射移液管中，该移液管具有内径约5微米的短的平头嘴部，其安装在压电驱动单元中。向精子颈部区域施加一个或数个压电脉冲，使精子头部和尾部分开。然后将头部深深吸入移液管内。
在注射精子头部(胞核)的整个过程中，用常规的夹持移液管来固定卵母细胞。使含有所选精子头部的注射移液管嘴部与卵母细胞的透明带密切接触，施加数个压电脉冲(用控制器设定强度等级为1-5，速度为4-6)，以推进移液管，同时维持其中稍稍呈负压。当移液管嘴部通过透明带后，将产生得到的透明带栓(堵塞物)挤入卵黄周隙，将精子头部向前推至其靠近移液管嘴。然后将移液管嘴与质膜并列，并向卵母细胞的对侧面推进，直至夹持移液管几乎到达卵母细胞皮质的对侧。现在，卵母细胞质膜深深地套在注射针嘴的周围。在施加1至2次压电脉冲(强度为1-2，速度为1)后，卵膜被移液管嘴刺破，表现为清晰可见的卵膜迅速松弛。然后，将精子头部和伴随的最少量(约6pL)培养基挤入卵质。然后轻轻抽出移液管，使新导入的胞核留在卵母细胞的细胞质内。该方法进行得很迅速，通常一批可进行10-15个卵母细胞，而这些卵母细胞其它时间则是维持在培养条件下。
备选的显微注射方案也可用来插入精子头部，其中采用的是常规的注射移液管。采用常规移液管来将精子头部注入仓鼠卵母细胞的合适的显微注射方法例子在Yanagida，K.，Yanagimachi，R.，Perreault，S.D.和R.G.Kleinfeld，Biology of Reproduction44，440-447(1991)中有所描述，关于该方法的公开内容被纳入本文作参考。
显微注射精子头部/脱膜精子头部提供了几个优点。首先，用显微注射输送精子头部适用于各种精子类型，不管其大小形态等如何。第二，显微注射能在注射精子头部时仔细地控制附加试剂(和供体精子头部一起)共同注射入卵母细胞内。这些在下文有举例说明。第三，在用压电驱动显微注射插入精子头部的本发明实施方案中，提供了一种迅速有效地加工样品的方法，从而减少了对经受操作的精子和卵母细胞的损伤。某些种类动物(如小鼠)的卵母细胞不易用常规针头来进行显微注射，而压电驱动的显微注射提供了高的成功率。
受精的卵母细胞的激活
已经知道，可通过注射单个完整的小鼠精子或其分离的头部来激活小鼠卵母细胞。分离的精子尾部不能激活卵母细胞。在圆形精子细胞转变成精子时，通常会出现有活性的精子携带的卵母细胞激活因子。这些因子并非高度种类特异性的，因为注射外源种类(如仓鼠、家兔、猪、人、甚至是鱼)的精子也可激活小鼠卵母细胞。已有报道说，一种这样的激活因子是存在于顶体赤道段区域内的33千道尔顿的蛋白。该蛋白称为振荡蛋白(oscillin)，它容易通过简单的冻融从成熟(仓鼠)精子中抽提得到。除了振荡蛋白外，成熟精子看来还携带了另一种激活因子，该因子不易被抽提，但是可通过用Triton X-100和SDS依次处理精子来获得。还不知道可抽提的振荡蛋白和耐受冻融抽提的因子在生物学和化学上是否相同。
已经知道，在Triton X-100存在下超声处理的精子头部丧失了除胞核和核周物质外的所有组分。然而，当用显微外科方法注入卵母细胞内后，这些经Triton X-100处理过的精子头部(具有胞核和核周物质，但是没有质膜)能象完整精子一样有效地激活卵母细胞。
如下文实施例所述的，至少在小鼠情况下，精子携带的卵母细胞激活分子必定对冷冻干燥有耐受力，因为在注射入冷冻干燥的精子头部后存活的大多数卵母细胞能被正常地激活和受精。
如果在其他动物种类中，精子头部的注射没有起激活卵母细胞的作用，则激活可能是通过单性生殖方式发生的，例如通过电激活、注射入一种或多种激活卵母细胞的物质、或将卵母细胞转移到含有一种或多种激活卵母细胞的物质的培养基中。能提供激活刺激(或激活刺激组合)的试剂包括，但不局限于，精子细胞质激活因子以及某些药理学化合物(如Ca2+和其他信号转导调节剂)，它们可与精子头部共同注射或在注射精子头后通过显微注射来导入。将受精的卵母细胞转移至含有一种或多种激活性化合物亚组的培养基中后，就可提供某些激活刺激，这些激活化合物包括Ca2+释放刺激剂(如咖啡碱，Ca2+离子载体如A23187和离子霉素，以及乙醇)、磷蛋白信号传导的调节剂(例如2-氨基嘌呤、星形孢菌素和鞘氨醇)、蛋白合成的抑制剂(例如A23187、环己酰胺)、6-二甲基氨基嘌呤或前述物质的组合(例如6-二甲基氨基嘌呤和离子霉素)。在本发明的一个实施方案中，是通过在含有2-10毫摩尔Sr2+、不含Ca2+的CZB培养液中培育1-6小时来激活小鼠卵母细胞的。
胚胎发育产生活的胎儿和后代
在形成前核后，可以体外培养胚胎，直至其达到2-8细胞阶段或桑椹胚/胚泡阶段，此时可将胚胎转移到代孕母亲的输卵管或子宫内。
与精子头部同时注射生物学感兴趣的物质
在本发明的一个实施方案中，将精子头部显微注射入卵母细胞时可允许在将精子头部导入卵母细胞之前、期间或之后导入一种或多种具有改变胚胎发育结果潜力的试剂。例如，可在注射精子头部之前或之后通过显微注射将核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)导入卵母细胞。例如，注射入携带所需顺式活性信号的重组DNA可导致重组DNA上的序列通过常驻的或共注射的转录因子来转录，随后表达出对发育抑制因子有拮抗作用、或对胚胎发育有正作用的编码蛋白质。另外，转录物可具有针对编码发育抑制蛋白的mRNA的反义活性。或者，可通过注射入核酸(或它们的衍生物)来实现反义调节，这些核酸能通过与没有在卵母细胞中先行转录的它们的核酸靶标直接反应来发挥抑制作用。
通过本发明方法导入的重组DNA(线形或其它形状)可含有一个功能性复制子，该复制子含有一个或多个在启动子控制下表达的功能性基因，该基因能表现出从窄到宽的发育表达分布图。例如，当启动子仅在早期受精卵中有活性时，该启动子可能指导立即而简短的表达。导入的DNA可能在胚胎发育期间的某一时刻丧失，或整合入一个或多个基因组基因座，在所得转基因个体的整个生命中稳定地复制。在一个实施方案中，编码推定“抗老化”蛋白(如端粒酶或超氧化物歧化酶)的DNA构建物可通过显微注射来导入卵母细胞。另外，可直接注射这些蛋白。
                             实施例
下列实施例描述了本发明的方法以及从注射了重建的经冷冻干燥的精子的卵母细胞发育成活的后代。具体地说，这些实施例描述了从小鼠卵母细胞来发育产生正常的小鼠，这些卵母细胞中注射了重建的经冷冻干燥的小鼠精子头部(胞核)，该精子曾保藏在室温(约25℃)或冰箱(约4℃)下。如下所述，在冷冻干燥前的精子悬浮培养液是CZB或DMEM。
本文中这些实施例的目的只是列举可用于本发明方法的来自一种动物的卵母细胞和精子、精子悬浮培养液、冷冻方案、保藏条件、重新水化的介质等例子，并没有限制性，因为本领域技术人员能够容易地认识到本发明实施方案的其它例子。
材料和试剂
所有无机和有机化合物均购自Sigma Chemical Co.，(St.Louis，MO)，除非另有所述。
在注射精子前，将收获的卵母细胞保持在CZB培养液(Chatot，等人，1989.J.Reprod.Fert.86，679-688)中。CZB培养液包含81.6毫摩尔氯化钠、4.8毫摩尔氯化钾、1.7毫摩尔氯化钙、1.2毫摩尔硫酸镁、1.8毫摩尔磷酸二氢钾、25.1毫摩尔碳酸氢钠、0.1毫摩尔EDTA二钠、31毫摩尔乳酸钠、0.3毫摩尔丙酮酸钠、7单位/毫升青霉素G、5单位/毫升硫酸链霉素和4毫克/毫升牛血清白蛋白。用于从输卵管收集卵母细胞、随后的处理以及显微操作的培养液是改进的CZB，它含有20毫摩尔Hepes、减少量的碳酸氢钠(5毫摩尔)和3毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA)。培养液在这里称为Hepse-CZB。为了显微注射的目的，较佳的是将BSA置于含有0.1毫克/毫升聚乙烯醇(PVA，可溶于冷水，平均分子量为10×103)的Hepes CZB中，因为与BSA相比，PVA能在更长时间内使注射移液管壁粘度更低，这在重复使用单根移液管进行多个精子头部/卵母细胞的多次转移期间是有利的。
在冷冻干燥前，采用两种不同的精子悬浮培养液来悬浮精子：(1)没有乙二胺四乙酸(EDTA)、含有4毫克/毫升BSA的CZB培养液；和(2)添加了10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的Dulbecco改进的Eagle培养液(DMEM)。
进行初步实验以调查哪个是用于此目的的“最佳”的精子悬浮培养液，实验这样进行：首先将新鲜精子悬浮在CZB培养液内，然后离心并重悬于下文列出的一种培养液内，然后立即对精子冷冻干燥。测试的精子悬浮培养液包括：(a)蒸馏水，(b)含34％蔗糖的蒸馏水，(c)180毫克/毫升蜜三糖加上5毫克/毫升BSA，(d)0.9％氯化钠和5毫克/毫升BSA，(e)0.9％氯化钠和1毫克/毫升葡萄糖加上5毫克/毫升BSA，以及(f)不含乳酸盐和钙盐的CZB。只有最后的培养液(f)显示出在冷冻干燥期间能象常规CZB一样好地保持了精子胞核发育的能力(数据未显示)。
动物
这些实施例中所用的动物按照夏威夷大学实验动物服务部(Laboratory AnimalService at the University of Hawaii)以及实验资源国立研究委员会研究所的实验动物管理和使用委员会(Committee on Care and Use of Laboratory Animals of the Institute ofLaboratory Resources National Research Council)制定的指南(DHEW公布号[NIH]80-23，1985年修订)来饲养。动物的处理方法得到夏威夷大学动物管理和使用委员会的监督和批准。
                              实施例1
                             精子的制备
制得四种不同的冷冻干燥的精子制备物，以用来阐述精子悬浮培养液、保藏温度和保藏时间对冷冻干燥的精子胞核注入卵母细胞后参与活后代发育的能力的影响，如下文及表1所述。对于每种制备物，采用成熟B6D2F1雄性小鼠的两个尾附睾。用手指挤压每个附睾，同时用锋利的钳子刺穿其远侧部。将从附睾中渗出的稠密的精液团转移到1.5毫升聚丙烯管中，管内含有1毫升上述两种测试培养液CZB或DMEM的一种。37.5℃下培育30分钟后，从管中取出上部0.3-0.5毫升培养液。该悬浮液中90％以上的精子(每毫升约3-10×106个)能活泼地游动。
                              实施例2
                           精子的冷冻干燥
将精子悬浮液等份(100微升)置于2毫升安瓿(Wheaton Scientific，Millville，NJ，目录号No.651506)内，将安瓿直接放入液氮中。10分钟后，将安瓿放在与冷冻干燥系统(10-020型，VirTis Co.，Gardner，NY)相连的预冷(-50℃)的冷冻瓶内。入口压力约为1毫乇(Torr)。约12小时后，用气体干燥罐(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA目录号09-204)提供的氩气充满该瓶，然后将其从系统中取出。将99％以上的气体抽出后，将每个安瓿与一真空泵相连，并用火焰封口。用铝箔个别包裹安瓿，并于室温下(约25℃)或4℃下保藏于暗处。
图1中描述了如上所述制得的含冻干小鼠精子的安瓿。每个安瓿底部的白色粉末是含有精子的经干燥的CZB培养液。
                              实施例3
                      冷冻干燥的精子的重新水化
将上述制得的含冻干精子的安瓿打碎，将100微升蒸馏水加入安瓿内，形成重建的精子悬液。然后，使5微升精子悬液与含有12％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量为360000)的50微升Hepes-CZB充分混合。用显微镜观察重新水化的精子，只选出具有完整头部和尾部的那些作进一步操作。
                              实施例4
                        冷冻干燥的精子的运输
进行一个实验，以确证用本发明方法制得的经冷冻干燥的精子是否能运输至外国且仍然保留其在重新水化后使卵母细胞受精的能力。在本实验中，在从夏威夷火奴鲁鲁到日本的三周旅程期间，人工携带数瓶含冷冻干燥的附睾精子的安瓿。在冷冻干燥前，精子悬浮于CZB培养液中。没有采取特殊的措施来保藏精子，只是在整个旅程中用铝箔包裹安瓿并置于纸板箱内。环境温度在5℃和30℃之间变化。在返回火奴鲁鲁的一周后，使精子重新水化并用于本发明的方法中。
                              实施例5
                           卵母细胞的准备
每只小鼠注射7.5国际单位(IU)的怀孕母马血清促性腺激素，48小时后注射7.5IU的人绒毛膜促性腺素(hCG)，诱使成熟的B6D2F1(C57BL/6×DBA/2)雌鼠过度排卵。注射hCG14小时后，从输卵管收集卵丘-卵母细胞复合体，用含有牛睾丸透明质酸酶(300USP U/毫升；ICN Biochemicals，Costa Mesa，CA)的Hepes-CZB培养液处理3分钟以分散卵丘细胞。注射精子胞核前，用CZB培养液洗涤卵母细胞，并在5％CO2的空气下在CZB培养液中37℃保藏最多4小时。
                              实施例6
                  将精子胞核显微注射到卵母细胞内
为了将精子头部注射入制得的卵母细胞内，用塑料平皿(100毫米×150毫米；Falcon Plastics，Oxnard，CA，目录号1001)的盖子(深度为10毫米)制得显微注射室。沿平皿的中心线放置一排两滴圆形液滴和一滴伸长的液滴。第一滴液滴(约2微升；直径为2毫米)用于洗涤移液管(Hepes-CZB，含有12％[w/v]PVP，平均分子量为360000道尔顿)。第二滴(约2微升；直径为2毫米)是如上所述制得的含有重新水化的冷冻干燥的精子的CZB或DMEM悬液。第三滴伸长的液滴(6微升；宽2毫米，长6毫米)是用于卵母细胞的Hepes-CZB培养液。这些液滴的每一滴用矿物油(Squibb andsons)覆盖。将平皿置于倒置显微镜相差镜头的载物台上。
用前面描述的压电显微注射仪方法，采用Prime Tech Ltd.(Tsukuba，Ibaraki-ken，Japan)的MB-U型压电操作仪，将精子胞核显微注射入卵母细胞中。该单元采用压电效应来使移液管夹持器以非常高的速度推进非常小的距离(例如0.5微米)。脉冲的强度和速度由控制仪来调控。
为了注射入上述制得的卵母细胞内，将单个精子(首先是尾部)吸入已经和压电移液管驱动单元相连的注射移液管(嘴部内径约5微米)中。向精子颈部区域施加一个或数个压电脉冲，使精子头部和尾部分开。脉冲的强度和速度(频率)由控制仪PMAS-CT01(控制仪设定等级：强度2，速度1)调控。然后将头部深深吸入移液管内，将少量(约0.5微升)水银置于注射移液管的毗邻端。
同时，将成熟的未受精的卵母细胞置于显微镜载物台上的Hepes-CZB培养液内。用夹持移液管夹持卵母细胞，使注射移液管嘴部在3点钟位置与透明带紧密接触。施加数个压电脉冲(强度为1-2，速度为1-2)，以推进移液管，同时向其施加稍稍的负压。当移液管嘴部通过透明带后，就将嘴内透明带圆柱状片段挤入卵黄周隙。在将精子头部向前推至靠近移液管嘴后，用机械方式推进移液管，直至其嘴部几乎到达卵母细胞皮质的对侧。施加1或2次压电脉冲(强度为1-2，速度为1)，刺破卵膜，将精子头部和最少量(约6pL)伴随的精子悬浮培养液挤入卵质中。在尽可能多地取回培养液后，轻轻抽出移液管，使精子头部留在卵质内。所有注射在精子重新水化1小时以内在Hepes-CZB中室温下(23-27℃)进行。每个卵母细胞注射一个精子头部。用该方法在10-15分钟内可显微注射约5-20个卵母细胞。
                              实施例7
                      卵母细胞的检查和胚胎转移
在含5％CO2的空气内，将注射了精子头部的卵母细胞37℃培育在CZB内，5-6小时后用倒置显微镜检查。具有两个明显的前核和第二个极体的那些卵母细胞被认为是正常受精的，让它们在CZB中培养4天。将达到桑椹胚或胚泡阶段的那些受精卵转移到受体CD-1雌鼠(白化体)的子宫角内，该雌鼠在3天前已经和切除输精管的CD-1雄鼠交配过，以使胚胎发育阶段与子宫内膜的阶段同步。将平均数目为八个的桑椹胚/胚泡转移到每个子宫角内。使雌鼠接生和喂养其代孕的后代(有黑色、棕色或灰色的皮毛)。随机选出一些成熟的雄性和雌性后代并交配以检查它们的生育力。
                              结果
重新水化的、冷冻干燥的精子的显微镜检查
用显微镜观察重新水化的精子，结果显示100％的精子不能游动。用能区分质膜完整的(活的)或质膜受损伤的(死的)细胞的市售的细胞生存力测试试剂盒(Live/deadFertiLight，Molecular Probes，Eugene，Oregon)，根据UV显微镜下的荧光图案来评价精子存活力。具有完整质膜的“活的”精子的胞核呈绿色荧光，而“死”的精子胞核呈亮橙红色荧光。在冷冻干燥和重新水化后，检查来自四只雄鼠的10000个以上的精子。经该试验评价，所有检查的精子均是“死的”。
注射了冷冻干燥精子头部的小鼠卵母细胞的发育
如表1所述，1353个卵母细胞中有1236个(91.4％)在显微外科手术注射后存活，在存活者中，有1157个(93.6％)被精子胞核激活并正常受精，不论精子悬浮培养液是CZB还是DMEM，保藏温度为25℃还是4℃，保藏时间为1天、2周、1个月还是3个月。
在这些实验中，安瓿的最长保藏期为4℃3个月。在这些实验中，来自三只雌鼠的57个卵母细胞中注射了保藏了3个月的精子。95％的经注射的卵母细胞在显微外科手术后存活，它们均正常受精。91％的受精卵在体外发育至桑椹胚/胚泡。将46个胚胎中的14个(30％)转移到三只代孕母鼠中发育成正常的成年鼠。
大多数(90％-93％)的受精卵(已注射了CZB悬浮的精子头部，这些精子头部冷冻干燥后于25℃或4℃保藏了1天至2周，并重新水化)在体外发育至桑椹胚/胚泡，其中的25-34个(20％-29％)在转移到代孕母鼠体内后发育成正常的后代。尽管注射了在重新水化前25℃下保藏1个月的CZB悬浮的冻干精子的受精卵发育至桑椹胚/胚泡的百分数较低(76％)，但其中的16个(18％)在转移到代孕母鼠体内后发育成正常的后代。从受精卵(受精卵中注射了经冷冻干燥、4℃下保藏3个月的CZB悬浮的精子头部)衍生获得的32个转移胚胎中有9个(28％)发育成正常的后代。总之，当采用CZB悬浮的冻干精子时，在转移562个胚胎(从显微外科手术中存活并正常受精的664个卵母细胞发育而来)后，总共产生143个活的后代，总成功率为21.5％。
在注射了冷冻干燥后于25℃保藏1天至1个月或4℃最多3个月的DMEM悬浮的精子头的受精卵中，大多数(79％-91％)也在体外发育至桑椹胚/胚泡。总之，将显微外科手术中存活并正常受精的493个卵母细胞发育而来的326个胚胎转移后，总共产生92个活的后代，总成功率为18.7％。
如图1b所示，所有后代均正常生长。它们的性别比例约为1∶1。从12个实验组的每一组中随机选出两只完全成长的雌鼠和两只雄鼠，使它们交配。所有小鼠均表明是能生育的，并生出了数量正常的幼仔(8-12)。
冷冻干燥的精子的运输对受精能力的影响
在运去运回日本并在返回火奴鲁鲁后重建的精子中，随机选出29个精子，分别注射入卵母细胞内。23个卵母细胞(79％)存活并正常受精。有19个(83％)体外发育至桑椹胚/胚泡。在转移到代孕母鼠体内后，其中有3个(16％)足月分娩。所有三只小鼠(2只雌鼠和1只雄鼠)长成能生育的成年鼠。
鉴于前述实施例，已经证明小鼠精子能在冷冻干燥后保留其遗传稳定性。没有理由认为其它种类动物(包括无脊椎动物和脊椎动物)的精子行为会有所不同。
尽管本发明已经参照较佳的实施方案作了描述，但应理解这并不意味着本发明局限于所公开的具体形式。相反，这意味着覆盖了在本发明精神和范围内的所有改进和变化形式。
                                              表1
                           注射了冷冻干燥的精子的小鼠卵母细胞的发育
精子悬       样品保藏                               注射了精子的卵母细胞                  转移的胚   活的后代[范
浮培养液 温度(℃)  时间  注射的卵母细胞 存活的卵母细胞 正常受精的卵母细 达到桑椹胚/胚泡阶 胎数(代孕  围]*数(总数％)
                          总数(实验数)      数(％)        胞数(％)       段的数目(％)     母亲数)
CZB        25°          1天      155(5)          135(87)       133(99)a      120(90)c        116(8)    34(29)[0-71]
                   2周      158(4)          144(91)       141(98)a      131(93)e        126(8)    25(20)[0-30]k
                   1个月    130(4)          120(92)       117(98)a      89(76)f         87(5)     16(18)[5-33]k
           4°            2周      137(4)          126(92)       123(98)a      114(93)g        105(7)    27(26)[0-45]
                   1个月    131(4)          117(89)       112(96)a      98(88)h         96(6)     32(33)[14-65]l
                   3个月    40(2)           38(95)        38(100)b      35(92)h         32(2)     9(28)[26-31]
DMEM       25°          1天      128(3)          116(91)       104(90)b      95(91)e         95(6)     29(31)[18-47]l
                   2周      109(2)          102(94)       85(83)c       67(79)i         60(3)     8(13)[0-20]m
                   1个月    113(2)          106(94)       74(70)d       47(64)j         47(3)     8(17)[0-24]
           4°            2周      83(2)           79(95)        79(100)a      69(87)h         56(3)     20(36)[21-46]l
                   1个月    152(3)          137(90)       135(99)a      114(84)h        54(3)     22(41)[15-60]n
                   3个月    17(1)           16(94)        16(100)        14(88)           14(1)     5(35)[35-35]

Claims (48)

1.一种膜受损的经冷冻干燥的精子，它们包含具有受精能力的胞核，所述精子已被冷冻干燥至水分含量低于1％，并能在重新水化后通过显微插入使分离的卵母细胞受精产生活的后代。
2.根据权利要求1所述的膜受损的经冷冻干燥的精子，其中经冷冻干燥的精子在重新水化前保藏一段时间。
3.根据权利要求2所述的膜受损的经冷冻干燥的精子，其中经冷冻干燥的精子保藏在室温下。
4.根据权利要求2所述的膜受损的经冷冻干燥的精子，其中经冷冻干燥的精子保藏在4℃下。
5.根据权利要求2所述的膜受损的经冷冻干燥的精子，其中经冷冻干燥的精子保藏在-20℃或比-20℃更低的温度下。
6.根据权利要求2所述的膜受损的经冷冻干燥的精子，其中保藏时间长达3个月。
7.根据权利要求1所述的膜受损的经冷冻干燥的精子，其中精子来自脊椎动物。
8.根据权利要求7所述的膜受损的经冷冻干燥的精子，其中精子来自哺乳动物。
9.根据权利要求7所述的膜受损的经冷冻干燥的精子，其中精子来自小鼠。
10.一种膜受损的经冷冻干燥的精子头部，它们包含具有受精能力的胞核，所述精子头部已被冷冻干燥至水分含量低于1％，并能在重新水化后通过显微插入使分离的卵母细胞受精产生活的后代。
11.根据权利要求10所述的膜受损的经冷冻干燥的精子头部，其中经冷冻干燥的精子头部在重新水化前保藏一段时间。
12.根据权利要求11所述的膜受损的经冷冻干燥的精子头部，其中经冷冻干燥的精子头部保藏在室温下。
13.根据权利要求11所述的膜受损的经冷冻干燥的精子头部，其中经冷冻干燥的精子头部保藏在4℃下。
14.根据权利要求11所述的膜受损的经冷冻干燥的精子头部，其中经冷冻干燥的精子头部保藏在-20℃或比-20℃更低的温度下。
15.根据权利要求11所述的膜受损的经冷冻干燥的精子头部，其中保藏时间长达3个月。
16.根据权利要求11所述的膜受损的经冷冻干燥的精子头部，其中头部是含有胞核和核周物质的脱膜头部。
17.根据权利要求10所述的膜受损的经冷冻干燥的精子头部，其中精子头部来自脊椎动物。
18.根据权利要求17所述的膜受损的经冷冻干燥的精子头部，其中精子头部来自哺乳动物。
19.根据权利要求17所述的膜受损的经冷冻干燥的精子头部，其中精子头部来自小鼠。
20.一种安瓿，它含有权利要求1所述的膜受损的经冷冻干燥的精子或权利要求10所述的膜受损的经冷冻干燥的精子头部。
21.一种获得权利要求1所述的膜受损的经冷冻干燥的精子的方法，该方法包括下列步骤：
收集活的成熟的精子；
将精子悬浮在生理性悬浮培养液中；
冷冻精子悬液，形成冷冻的精子；和
在真空下将冷冻的精子干燥至水分含量低于1％，形成经冷冻干燥的精子，该精子包含具有受精能力的胞核，能在重新水化后通过显微插入使分离的卵母细胞受精产生活的后代。
22.根据权利要求21所述的方法，其中精子来自脊椎动物。
23.根据权利要求21所述的方法，其中精子来自哺乳动物。
24.根据权利要求21所述的方法，其中精子来自小鼠。
25.根据权利要求21所述的方法，其中冷冻步骤在-196℃下进行10分钟。
26.根据权利要求21所述的方法，该方法还包括在重新水化步骤前将经冷冻干燥的精子保藏一段时间的步骤。
27.根据权利要求26所述的方法，其中经冷冻干燥的精子保藏在室温下。
28.根据权利要求26所述的方法，其中经冷冻干燥的精子保藏在4℃下。
29.根据权利要求26所述的方法，其中经冷冻干燥的精子保藏在-20℃或比-20℃更低的温度下。
30.根据权利要求26所述的方法，其中保藏时间长达3个月。
31.一种获得权利要求10所述的膜受损的经冷冻干燥的精子头部的方法，该方法包括下列步骤：
收集活的成熟的精子；
将精子悬浮在生理性悬浮培养液中；
使精子脱膜以形成脱膜的精子头部；
冷冻精子悬液，形成冷冻的精子头部；和
在真空下将冷冻的精子头部干燥至水分含量低于1％，形成经冷冻干燥的精子头部，该精子头部包含具有受精能力的胞核，能在重新水化后通过显微插入使分离的卵母细胞受精产生活的后代。
32.根据权利要求31所述的方法，其中脱膜步骤包括用洗涤剂处理精子的步骤。
33.根据权利要求32所述的方法，其中脱膜步骤还包括用表面活性剂处理精子的步骤。
34.根据权利要求31所述的方法，其中精子来自脊椎动物。
35.根据权利要求31所述的方法，其中精子来自哺乳动物。
36.根据权利要求31所述的方法，其中精子来自小鼠。
37.根据权利要求31所述的方法，其中冷冻步骤在-196℃下进行10分钟。
38.根据权利要求31所述的方法，该方法还包括在重新水化步骤前将经冷冻干燥的精子保藏一段时间的步骤。
39.根据权利要求38所述的方法，其中经冷冻干燥的精子头部保藏在室温下。
40.根据权利要求38所述的方法，其中经冷冻干燥的精子头部保藏在4℃下。
41.根据权利要求38所述的方法，其中经冷冻干燥的精子头部保藏在-20℃或比-20℃更低的温度下。
42.根据权利要求38所述的方法，其中保藏时间长达3个月。
43.一种用膜受损的精子或精子头部使哺乳动物卵母细胞受精的方法，该方法包括下列步骤：
从哺乳动物收集活的成熟的精子；
将精子悬浮在生理性悬浮培养液中；
将精子悬液冷冻成冷冻的精子；
在真空下将冷冻的精子干燥至水分含量低于1％，形成经冷冻干燥的精子；
使经冷冻干燥的精子重新水化；
分离出经重新水化的膜受损的精子或精子头部，它们包含具有受精能力的胞核，能在重新水化后经显微插入使分离的卵母细胞受精产生活的后代；
分离出该种类动物的卵母细胞；将膜受损的精子或精子头部插入该分离的卵母细胞内，形成受精的卵母细胞。
44.根据权利要求43所述的方法，其中插入步骤通过压电驱动的显微注射来实现。
45.根据权利要求43所述的方法，该方法还包括在冷冻步骤前使精子脱膜形成脱膜精子头部的步骤。
46.根据权利要求43所述的方法，其中插入步骤还包括插入活精子中心体的分步骤。
47.根据权利要求43所述的方法，其中精子来自小鼠。
48.根据权利要求43所述的方法，其中在重新水化后1至60分钟内注射精子。
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