CN1334870A - 通过胞质内精子注射进行哺乳动物基因转移 - Google Patents

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Abstract

将精子头和编码转基因的外源核酸共同注射到未受精的小鼠卵母细胞中,结果产生表达转基因的胚胎,这反映出核酸和精子头在共同注射前发生结合。将共注射获得的胚胎非选择性地转移到代孕母亲中,产生了表达被整合的转基因的后代。

Description

通过胞质内精子注射进行哺乳动物基因转移
本申请要求了美国临时专利申请60/096,078(1998年8月11日提交)和60/133,970(1999年5月13日提交)的优先权。
美国政府在本发明中有一个已支付的许可，并且在一定情况下有权根据国立儿童健康与人类发育研究所资助合同No.HD-34362中的条款要求专利所有人以合理的条件许可他人。
                            发明背景
转基因动物对于科学、药物和农业用途很重要。用基因工程改造的牲畜在牛奶中产生外来蛋白被认为是一种适合用于生产治疗性重组蛋白的系统。另外，将人基因插入诸如猪等动物的基因组中就可使这些动物作为活的器官或细胞“工厂”用于生产不会被人免疫系统排斥的人器官或细胞。
现已报道了几种方法通过将外来DNA导入其体细胞和生发细胞来获得转基因哺乳动物。这些方法中有一种是前核显微注射，该方法已被广泛采用，它在1980年代早期首先从小鼠模型发展而成。前核显微注射需要将转基因(tg)DNA注射入单细胞胚的前核中[J.W.Gordon，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，7380(1980)；J.W.Gordon和F.H.Ruddle，Science 214，1244(1981)；R.D.Palmiter和R.L.Brinster，Annu.Rev.Genet.20，465(1986)；和J.W.Gordon，Int.Rev.Cytol.115，171(1989)]。尽管小鼠中前核合子的产生是简单的，但是对于诸如较大的商用动物品种等动物种类却不一定如此。例如，在牛和猪中，当大量脂质使得合子变得不透明时，合子是难以进行前核注射的基质；相反，小鼠的合子是透明的。
通过DNA构建物转染获得的转基因胚干细胞(ES)已被用于获得牛、羊等的嵌合动物。该方法涉及将携带有所需突变的基因工程改造的ES细胞注射入处于胚胎发育的桑椹胚期(约20-50个细胞)或胚泡期(约100个细胞)的受精胚中。植入后，这些胚胎通常形成嵌合的动物，该动物随后与野生型动物交配，导致ES细胞衍生的基因组的种系传递的频度不同(通常等于0)。由于转基因的效率低且需要大量受体动物进行胚胎转移，因此用该方法很难产生大的转基因动物。
上述的前核显微注射方法和ES细胞转染方法至今均未能得到受控制或预期的tg插入结果，因为异源DNA导入细胞通常会导致不利的“位置”或拷贝数效应，这些效应是由转基因或其多个拷贝整合到宿主基因组中的准随机方式引起的(J.W.Gordon，同上)。因此，这些方法生产大的转基因动物的效率很低。
已经报道，用转染了能同源重组的DNA构建物的小鼠ES细胞系可较好地控制转基因整合的结果[M.J.Evans和M.H.Kaufman，Nature 292，154(1981)；M.Kuehn，等人，同上，326，295(1987)]。这些“基因导向”的ES细胞是这样的细胞，其中一个或多个特异性基因以非常精确的方式经剔除或修饰而不影响整个基因组的其它任何基因座。已经建立了“无限增殖的”转基因ES细胞系，并在体外作了充分地特性鉴定，以确认构建物整合位点。然而，基因导向目前还局限于存在已确定种系贡献的ES细胞系的一种动物—小鼠。
改进哺乳动物种系的现有策略的限制刺激着寻找另一种方法，包括用重组逆转录病毒来感染卵母细胞或植入前的胚胎[D.Jahner，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，6927(1985)；A.W.S.Chan，等人，同上，95，14028(1998)]，和用复制缺陷型腺病毒介导的输送系统[Y.Kanegae，等人，Nucl.Acids Res.23，3816(1995)]。然而，病毒方案暗示克隆需要额外的步骤，且必须对重组腺病毒和逆转录病毒工程改造需要有专业的防范设施。用这些方法输送病毒还需要显微注射设备或是从卵母细胞中除去透明带。
另有报道，体外受精(IVF)期间可用精子作为输送DNA的载体[M.Lavitrano，等人，Cell 57，717(1989)]。在该方法中，用活的精子作为将重组DNA导入体外卵母细胞的载体。尽管精子介导DNA转移给后代具有明显简化转基因动物的产生的潜力，但是关于活精子方法促进转基因的效率方面还有很多争论，因为它持续产生转基因动物的能力不可靠[M.Lavitrano，等人，1989，同上；R.N.Brinster，等人，Cell 59，239(1989)；B.Maione，等人，Mol.Reprod.Dev.50，406(1998)]。在一份报道中，已经证实外源DNA能以可逆方式修饰完整精子[M.Lavitrano，等人，Mol.Reprod.Dev.，31，161(1992)]，暗示膜结构可能对精子头与外源重组DNA的稳定连接起了屏障作用。在另一个报道中，活小鼠精子与质粒DNA体外培育2小时显示出外源DNA有些被胞核和质膜吸收。如6小时前于输精管内注入质粒DNA，来自输精管的精子也显示出有些胞核吸收。然而，这些精子都不能用来使卵母细胞受精[E.Huguet和P.Esponda，Mol.Reprod.Dev.，51，42(1998)]。
因此，仍然需要一种能可靠地用来产生转基因动物的有效的转基因转移方法。更具体地说，需要一种获得经基因工程改造的牲畜或其它大动物用作药物“工厂”和异种移植用人器官或细胞来源的有效的方法。
                        发明概述
本发明提供了一种获得转基因胚胎的方法，该方法包括下列步骤：将外源核酸和膜被破坏的精子头或脱膜的精子头一起插入未受精卵母细胞胞质，形成转基因受精的卵母细胞，使该转基因受精的卵母细胞发育成转基因胚胎，如果需要，发育成活的后代。共同插入的步骤宜包含使膜被破坏的或脱膜的精子头与外源核酸预培育30秒至大约5分钟的步骤，培育时间通常约为45秒至3分钟，更典型的约为1分钟至2分钟。精子头和外源核酸的共同插入卵母细胞是通过显微注射实现的，较佳的是用压电驱动的显微注射来实现。与膜经破坏或脱膜的精子头混合的外源核酸可含有多个转基因，用以产生多个转基因的转基因胚胎。
适用于本发明的膜经破坏的精子头可从冻融的精子或重新水化的冻干的精子获得。用冻干法保藏精子并用所得重建的冻干精子来使卵母细胞体外受精产生胚胎和活后代的方法是我们的待批美国专利申请No.09/177,391(1998年10月23日提交)中的主题，该文内容纳入本文作为参考。适用于本发明的脱膜精子头包含胞核和核周物质，它可通过洗涤剂处理新鲜精子来获得(如下所述)。
本发明的方法可用来产生转基因胚胎或诸如灵长类动物、羊、牛、猪、熊、猫、狗、马和啮齿类动物等哺乳动物的活后代。该方法还可用来产生转基因的无脊椎动物，例如但不局限于海胆、龙虾、鲍鱼或有壳的水生动物。该方法还可用来产生转基因鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类。本文已经发现，用本发明方法产生的活的转基因后代(起始动物(founder animal))本身能产生转基因后代，这表明转基因稳定地整合到起始动物的基因组中，且起始动物具有生殖力。
本文描述的哺乳动物转基因方法与以前的体外方法形成对比，以前的方法是将外源DNA前核注射入受精的卵母细胞中，或是将活的完整的精子与外源DNA混合并用这些经处理的精子使卵母细胞受精，从而形成转基因胚胎。在本发明方法中，未受精的中期II卵母细胞的使用显示出该方法比需要受精卵的方法更为简化和容易。另外，用胞质内精子注射(ICSI)进行转基因可避免前核显微注射的某些缺点。例如，使用管尖大100倍(例如直径1微米的前核显微注射管口约为0.78μm2，而直径为10微米的ICSI管口约为78μm2)的显微注射移液管有利于处理大的构建物，例如酵母或哺乳动物人工染色体。另外，利用本发明的方法，转基因DNA与膜破坏或脱膜的精子头的连接暗示着兆碱基和亚兆碱基构建物可进一步得到稳定和保护。
                        附图简述
图1的显微照片描述了通过小鼠精子头的典型矢状切面，其中精子是完整(新鲜)的(A)、或膜已被Triton X-100破坏(B)、经过冻融(C)、或冷冻干燥(D)。ac，顶体帽；eq，赤道段；pa，顶体后区。
图2的显微照片描述了单发(single-shot)双重转基因产生的转基因胚胎。用经pCX-LacZ和pCX-EGFP tg DNA混合物预培养的精子显微注射卵母细胞。图2A、2B和2C(X400)分别显示了3.5天后的相同的胚胎，图2A：用Hoffman调节相差显微镜观察，不染色；图2B：长波长(480nm)紫外光下观察的GFP表达；图2C：用X-gal染色来观察β-半乳糖苷酶表达。
图3的显微照片描述了对转基因起始动物和非转基因对照动物尾端活检物的分析。(图3A)非转基因(a)(小鼠16)和转基因的有绿色荧光(b)(小鼠3)小鼠系尾端的荧光立体显微镜检查(X40)。绿色荧光皮肤可通过非绿色毛发来看出。(图3B)用pCX-EGFP片段作为探针，对对照B6D2F1(野生型，wt)(0)以及小鼠3(5-9)、19(＞50)、28(5-9)和41(2)的总DNA进行Southern印迹分析。每个基因组中估计的转基因拷贝数显示在括号内。(图3C)对小鼠16、17、30、36、47、49、对照B6D2F1(野生型)、小鼠3、19、28和41的总DNA进行PCR分析。
                                发明详述
本发明提供了获得转基因胚胎的方法，该方法是将外源核酸和膜经破坏的精子头或脱膜的精子头一起共同插入到未受精的卵母细胞内。本发明的方法包括下列步骤：(i)获得膜破坏的精子或脱膜的精子头，(ii)使膜破坏的精子或脱膜的精子头与含有所需基因的外源核酸混合，和(iii)将外源核酸和膜破坏的精子头或脱膜的精子头共同插入到分离的未受精的卵母细胞内，以形成表达所需转基因的转基因胚胎。该方法还包括这样一个步骤，即将转基因胚胎植入代孕母亲子宫内，使该胚胎发育成活的转基因后代。
下面将更详细地描述本发明方法各步骤和亚步骤的实施方案。
新鲜精子的制备
无脊椎动物和脊椎动物的新鲜精子可用本领域技术人员已知的方法来收集。例如啮齿类动物(如小鼠、金色(Syrian)仓鼠、豚鼠)、家兔等的成熟精子可以从附睾尾收集；而在其他种类的动物如人、猪、马、公牛、山羊、禽等情况下，可以从能育雄性刚射出的精液分离出成熟精子。鱼(例如剑尾鱼(swordtail)，Xiphophorus helleri)以及无脊椎动物如海胆(Tripneustes gratilla)的精子可以从成熟雄性的睾丸收集得到。
下面是从附睾尾获得精子的一个方法例子。摘取成熟雄性小鼠(出生后约8周或以上)的附睾尾。除去附睾尾表面的血液和脂肪组织。然后将其压缩，释放出稠密的精子团。将1滴(约2微升)精子团置于1.5毫升聚丙烯离心试管底部，用0.5毫升温热的生理培养液(如CZB培养液(其组成如下所述)、磷酸盐缓冲盐水或等渗盐溶液)覆盖。置37℃下约10至20分钟后，可以从上清液中收集到游动的精子。
下面是从精液中获得精子方法的一个例子。使新鲜射出的人精液在室温下(约25℃)液化约30分钟。然后用约10毫升盐水稀释精液，并过滤通过大约两层纱纸，除去碎片。然后以400xg离心该滤液大约10分钟，将沉淀的精子重悬于生理溶液中至所需浓度。
下面是从睾丸获得精子的方法的一个例子。将切下的睾丸置于红细胞裂解缓冲液(例如155mM NH4Cl，10mM KHCO3，2mM EDTA，pH 7.2-7.4)中，用细剪刀剪碎，并通过约两层纱纸过滤除去碎片。然后离心滤液(例如700xg，5分钟)，将沉淀重悬于生理溶液中至所需浓度。
图1(A)中描述了具有完整原生质和顶体膜的如此回收的小鼠精子，该图是通过小鼠精子头的典型矢状切面的显微照片，其中＂ac＂代表顶体帽，＂eq＂代表赤道段，＂pa＂代表顶体后区。将精子悬于备用于冻融或冷冻干燥过程的下述生理培养基中。或者，可对精子作进一步加工，以获得脱膜的精子头。
膜破坏的精子的制备
膜破坏的新鲜精子
如上所述获得的新鲜精子的膜可通过机械方式来破坏，例如在显微注射移液管中通过施加来自压电驱动显微注射单元(如下所述)的单脉冲，使精子头与尾部离位。本文所用的术语“新鲜的”精子指这些用于显微注射到未受精卵母细胞中的膜被破坏的精子，它们与以前IVF报道中用作输送DNA的载体的“活的”精子不同。
冻融的精子
冷冻然后融化精子，使质膜破坏，质膜破坏可通过如下文详细描述的存活力染色技术来测定，该技术能区分质膜完整(活的)和质膜受损(死的)细胞。如此冻融的膜受破坏的精子在常规意义上认为是“死的”。冻融精子可根据T.Wakayama，等人，J.Reprod.Fert.112，11(1996)和S.Kuretake，等人，Biology ofReproduction 55，789(1996)中描述的方法来制备。具体地说，将小鼠附睾精子悬于CZB培养基中，然后用或不用诸如18％(w/v)蜜三糖的冷冻保护剂冷却至-20℃、-50℃或-196℃，冷冻保藏1-28天，然后融化，当其头部显微注射到未受精卵母细胞中后，它能支持发育成正常能育的活后代。
在冷冻小鼠附睾精子的典型方法中，CZB培养基中的精子浓度约为3-10×106/毫升。将100微升精子悬液一份转移到1.5毫升聚丙烯微量离心管(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)中，与含有或不含36％(w/v)D(+)-蜜三糖(最终浓度为18％蜜三糖)的等体积CZB培养基充分混合。将50微升此悬浮液分散在有标记的1毫升低温小管(A/SNUNC，Copenhagen)中。紧密盖上小管，直接置于-20℃或-50℃冷冻机或液氮(-196℃)中。样品保藏期为1天至4周。
至于融化，将小管从冷冻机或液氮中取出，在24或26℃的水或空气中放置大约10分钟。现在融化的精子悬液就可用于如下所述的胞质内精子注射(ICSI)。
尽管这里描述了针对小鼠附睾精子获得冻融精子的方法，但是本领域技术人员无需过多实验就可将该方法改用于其它脊椎动物和无脊椎动物的精子。
重新水化的冻干的精子
冻干的精子使质膜受到破坏，质膜破坏可通过能区分质膜完整(活的)和质膜受损(死的)细胞的存活力染色技术(如下所述)来测定。如此冻干的膜受破坏的精子在常规意义上认为是“死的”。冻干精子可根据T.Wakayama及R.Yanagimachi，NatureBiotechnology 16，639，(1998)以及我们的待批美国专利申请No.09/177,391(1998年10月23日)中描述的方法来制备。具体地说，该专利申请公开了一种可用于冻干脊椎动物和无脊椎动物精子的通用方法。在一个典型的方法中，将小鼠附睾精子悬于(1)不含乙二胺四乙酸(EDTA)、含有4毫克/毫升BSA的CZB培养基中，或(2)添加了10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中，然后在液氮中冷冻，干燥至含水量接近0％，冻干保藏长达6个月，然后重新水化，当精子重新水化且精子头显微注入未受精的卵母细胞中后，精子支持发育成正常能育的活后代。
在一个典型的冷冻小鼠附睾精子的方法中，CZB或DMEM培养基中的精子浓度约为3-10×106/毫升。将精子悬液一份(100微升)置于2毫升安瓿(Wheaton Scientific，Millville，NJ，目录号651506)中，将安瓿直接放入液氮中。10分钟后，将安瓿放入与冷冻干燥系统(10-020型，VirTis Co.，Gardner，NY)相连的预冷(-50℃)冷冻瓶中。入口压力约为1微米汞柱。大约12小时后，在系统中充入气体干燥罐(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA目录号09-204)提供的氩气后，从系统中取出冷冻瓶。将每个安瓿与真空泵相连，在99％以上的气体被抽出后，密封安瓿结构。安瓿各自用铝箔包裹，于暗处室温(约25℃)或4℃下保藏待用，最多可保藏1年。
为了重新水化上述冷冻干燥的精子，将上述制得的含冻干精子的安瓿打开，将100微升蒸馏水加入安瓿内，形成重建的精子悬液。
尽管这里描述了针对小鼠附睾精子来获得重新水化的冷冻干燥的精子的方法，但是本领域技术人员无需过多实验就可将该方法改用于其它脊椎动物和无脊椎动物的精子，正如美国专利申请No.09/177,391中指出的那样。
已经注意到，精子头注射后卵母细胞的激活和正常受精的发生率看来随冻干精子重新水化后的时间的增加而减少。重新水化和注射之间可允许的时间可能因动物种类而异；然而，作为一个例子，对于小鼠精子，该期间宜为1小时或更少。
脱膜精子头的制备
脱膜的精子头是缺少所有膜(包括质膜以及顶体内膜和外膜)、但是保留了胞核和核周物质的经洗涤剂抽提的头部。例如，可用含有或不含SDS(十二烷基硫酸钠)的Triton X-100处理使精子头脱膜。Triton X-100是熟知的非离子表面活性剂，它广泛用于在非变性条件下除去膜组分。SDS是阴离子洗涤剂，用来使各种蛋白(包括膜蛋白)增溶。在小鼠中，用Triton X-100脱膜的精子头表明能激活卵母细胞，导致正常的胚胎发育。
下面是对精子头脱膜的一个典型方法。对上述制得的精子悬液一份进行超声处理。例如，将上述从附睾尾、睾丸或精液中收集的精子悬浮在5毫升BM缓冲液(75mM氯化钠、24mM EDTA和50mM Tris-HCl，pH 7.2)中，在Biosonik超声仪(BronwillScientific，Rochester，NY)以70-80％输出功率超声处理30秒。该处理使95％以上的精子断头。为了使精子头脱膜，使超声后的精子悬液以700xg离心5分钟，用BM缓冲液洗涤沉淀，然后在室温下用1％Triton X-100(以NIM培养液配制)处理5分钟(NIM培养液由123.0mM氯化钾、2.6mM氯化钠、7.8mM磷酸二氢钠、1.4mM磷酸二氢钾、3mM EDTA二钠组成，pH 7.2)。然后用NIM培养液充分洗涤头部，并重悬于精子悬浮培养液中。
精子存活力的测定
图1(B)，(C)和(D)的显微照片代表了通过精子头前区的矢状切面，这些图表明，经Triton X-100(洗涤剂)处理(B)、冻融(C)或冷冻干燥(D)的精子中除赤道区以外的质膜和顶体膜不存在或被破坏。精子存活力可用能区分常规意义上是活的或死的精子的任何染色方法来测定。一种适用于本发明的市售的存活力测试试剂盒是购自Molecular Probes，Eugene，Oregon的Live/dead FertiLight，它能在碘化丙锭/SYBR 14染色后根据UV显微镜下的荧光图案来区分质膜完整的(活的)和质膜受损的(死的)细胞。具有完整质膜的“活的”精子的胞核荧光呈绿色，而“死”的精子胞核的荧光呈亮橙红色。预期上述所有用物理膜破坏、冻融、冻干和脱膜过程制得的精子在常规意义下都是“死”的。
含有转基因的外源核酸的选择和制备
根据本发明，基因转化是将外源外来DNA稳定地整合到受精卵的基因组内，包括将外来DNA整合到宿主细胞胞核DNA和/或线粒体中的胞外DNA中。外来DNA是受精卵在转化前并不固有的(或通常不存在的)、或是通常不以一个以上拷贝存在的遗传物质。然而，“外来”DNA可包括固有基因或基因序列的另一拷贝，它们为了共抑制的目的而导入。
外来遗传物质可包括任何来源的DNA，这些来源包括但不局限于，植物、细菌、病毒、噬菌体、质粒、质体、哺乳动物和合成的DNA构建物。DNA可以是环形的或线形的，可以是单链或双链。DNA可以有义或反义的构型、以单链或双链形式插入宿主细胞DNA。插入宿主细胞的所有或部分DNA可以整合入宿主的基因组中。
含有特异性基因的质粒和其它克隆载体的选择和/或合成构建是本领域中熟知的。嵌合质粒的合成构建物含有感兴趣的基因，且通常含有从不同来源获得的启动子和/或前导序列，以实现插入宿主基因组。尽管原核克隆载体序列对显微注射基因的整合频度没有明显的影响，但是注意到，它们能严重地抑制导入哺乳动物(如小鼠)种系的真核基因的表达[见，B.Hogan，等人，《小鼠胚胎的操作》E部分，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，22页(1994)]。因此，可以建议在将其导入诸如小鼠的哺乳动物种系之前除去克隆基因的基本上所有的载体序列，如果希望基因表达最优的话。载体序列可用用本领域技术人员已知的方法根据载体上的限制性位点用限制性酶来除去，以产生含有所需基因、启动子、增强子等的片段。
导入基因的表达水平主要取决于启动子强度以及转染细胞中整合的DNA的拷贝数。因此，表达载体采用非常强的启动子，例如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV-IE)、胞质β-肌动蛋白启动子和腺病毒主要晚期启动子。
DNA成功输送入细胞可通过“报道”基因的表达来初步评价。报道基因是用于转化的DNA的一个组分，它可与赋予其它所需特性的转基因相同或不同。该报道基因赋予转化细胞或组织的特性通常容易用组织化学或荧光试验来检测。有许多常用的体外报道基因可用来定量测定转染效率，且含有报道转基因的众多质粒和克隆载体可从商业途径购得，本领域技术人员已知的例如有Sratagene，Inc.，LaJolla，CA和Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto。用于本发明的典型的报道基因包括，但不局限于，分泌型碱性磷酸酶[SEAP]、β-半乳糖苷酶(β-gal)、火萤萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶(CAT)。体内报道物试验，如原位β-gal染色、原位β-葡糖醛酸酶(GUS)试验和原位萤光素酶试验也可用来检测固定细胞或组织切片中的基因转移。这些过程能在用酶促底物或抗体染色后显示出转染的细胞。在这些过程中，大肠杆菌LacZ基因表达后的原位β-gal染色是一种广泛使用的方法，因为该方法简单、灵敏。在该过程中，β-gal与X-gal底物的反应产生了易在光学显微镜下显色的深蓝色，从而提供了直接测定转染效率的方法。
水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)已经成为一种监测各种细胞和生物体中基因表达和蛋白质位置的重要的报道物[R.Y.Tsien，Annu.Rev.Biochem.67，509(1998)；G.Zhang，等人，Biochemical and Biophysical Research Communications 227，707-711(1996)；T.Takada，等人，Nature Biotechnology 15，458-460(1997)]。由于GFP不需要任何底物来用于检测，因此它是选择转基因胚胎的合适的标记物。当细胞被UV或蓝光激发时，真核细胞中表达的GFP产生绿色荧光。GFP中的发色团是蛋白质一级结构中固有的，且来自GFP的荧光不需要其它辅因子、底物或其它基因产物。GFP荧光是稳定的，不依赖于动物种类，可用荧光显微镜检技术、流式细胞计数和肉眼成像来作非侵入性地监测。为了增强受蓝光激发时的GFP荧光强度，已经构建出了增强型GFP(EGFP)变体(pEGFP-C1购自Clonteeh Laboratories)，它含有人CMV的立即早期启动子和SV40聚腺苷酸化信号，以推动哺乳动物细胞中EGFP基因的表达。
精子与含有所需转基因的载体片段的混合
上述制得的精子可以不经进一步制备(新鲜的)或在经受上述三种膜破坏过程之一后与载体片段混合。在典型的混合过程中，将1微升含有载体片段(约2.5毫微克/微升)的DNA溶液与9微升诸如CZB或NIM的生理培养基中含有大约2-5×105个精子的悬浮液混合，混合用移液管进行，使最终DNA片段浓度为7毫微克/微升。在室温(约25℃)或冰上培育该混合物约30秒至5分钟，通常约45秒至3分钟，更典型的约1-3分钟，较佳的大约1分钟。精子和DNA片段的浓度，以及培育时间和温度可以因片段大小、精子大小等本领域技术人员已知的因素而异。
精子和DNA片段的混合物的显微注射通常在室温下在精子-DNA混合后的一小时内或精子脱膜后的1小时内进行。
卵母细胞受体
可用于本发明方法的卵母细胞受体包括从动物收集获得的未成熟(例如GV期)并随后在体外成熟的、以及成熟的(即MetII期)卵母细胞。成熟的卵母细胞可以这样获得，例如，通过注射促性腺素或其它激素(例如依次给予马和人绒毛膜促性腺激素)诱导动物超排卵，然后在排卵后不久(例如在家猫开始动情后80-84小时，奶牛开始动情后72-96小时，以及小鼠开始动情后13-15小时)用外科方法收获卵细胞。在只能获得未成熟卵母细胞时，将它们培养在促进成熟的培养基中，直至它们进展至Met II期；这称为体外成熟(“IVM”)。未成熟牛卵母细胞的IVM方法在WO98/07841中有所描述，未成熟小鼠卵母细胞的IVM方法在Eppig & Telfer(Methods in Enzymology 225，77-84，Academic Press，1993)中有所描述。
已有报道说，受精时卵母细胞的体内成熟阶段对于产生胚胎的体外胞核转移方法的成功是很重要的。已知卵母细胞细胞质的化学成分变化贯穿于整个成熟过程中。例如，与成熟有关的胞质活性中期促进因子(“MPF”)在处于第一次减数分裂中期的未成熟卵母细胞中最高，随着第一极体的形成和排出而下降，在MetII时再次达到高水平。MPF活性在停滞于MetII的卵母细胞中保持高水平，在卵母细胞激活后迅速降低。通常，哺乳动物胞核转移的报道描述了采用MetII卵母细胞作为受体。MetII卵母细胞是准备被有受精能力的精子激活的细胞类型。当将一个细胞胞核引入未受精的MetII卵母细胞(即MPF活性高的卵母细胞)的细胞质中后，细胞核膜破裂(如果它有的话)，染色质凝缩，导致形成中期染色体。
用外科手段从输卵管收获得到卵母细胞-卵丘细胞复合物形式的受体卵母细胞，置于诸如Hepes-CZB培养基(如下所述)等缓冲培养基中。用诸如0.1％牛睾丸透明质酸酶(例如300USP单位/毫克，ICN Pharmaceuticals，Costa Mesa，CA)等分散性酶分散卵丘细胞。较佳的是，在进一步处理前，将无卵丘细胞的卵母细胞置于在含5％(v/v)CO2的空气中、37.5℃、矿物油(例如购自E.R.Squibb和Sons，Princeton，NJ)下平衡的培养基(如CZB培养基)中短于1小时。
成功体外受精所需的精子组分
已经知道，在小鼠中，正常受精可通过将分离的精子头注射入卵母细胞中来实现，质膜和顶体膜以及所有尾部组分是正常胚胎发育所非必需的。小鼠，可能大多数常用实验室啮齿类动物是“例外的”，因为正常受精不需要精子中心体，在正常受精期间，精子颈区的精子中心体注定会在受精后在卵母细胞中退化。
相反，在大多数其它真兽亚纲哺乳动物(包括牛和人)中，精子中心体在雄性和雌性前核合并所必需的微管形成以及随后胚胎发育期间的卵裂中起重要作用。因此，在这些动物种类中，为了产生正常的后代，精子核(头)以及中心体必须都导入卵母细胞中。现在还不知道是否所有动物种类的精子中心体均能在冻融、冻干或洗涤剂脱膜后存活。如果不能，必须将未经冷冻的精子的中心体与经过冻融、冻干或脱膜的精子头一起注射入卵母细胞，以便保证正常的胚胎发育。然而，引入过多的中心体会导致前核发育以及胚胎发育不正常。
当精子头和尾分离时，中心体通常与精子头后端或精子尾前端相连。因此，精子中心体可能与精子头一起同时插入卵母细胞，也可能通过同时或依次插入精子尾来插入。
将精子胞核插入受体卵母细胞
整个精子可以和外源核酸一起共同注射入受体卵母细胞的胞质内，但是对于精子较大的动物种类来说，宜用显微注射技术将分离的精子头(胞核)直接注射入受体卵母细胞的细胞质内。在将外源核酸以及冻融的、重新水化的冻干精子头或脱膜精子头一起共同显微注射入受体卵母细胞的较佳方法中，采用的是压电驱动的微量移液方法。
合适的压电驱动单元由Prime Tech Ltd.(Tsukuba，Ibaraki-ken，Japan)以压电显微操作仪/压电冲击驱动单元(Piezo Micromanipulator/Piezo Impact Drive Unit)的名称出售。该单元利用压电效应使(注射)移液管支架以受高度控制的快速方式向前推进非常小的距离(约0.5微米)。每次脉冲之间的强度和间隔可以变化，由一个控制单元调节。
为了注射入卵母细胞，首先将精子/精子头与外源核酸混合物中的单个精子注射移液管中，尾部(如果它有尾部的话)首先抽入，该移液管具有内径约为5微米的短的平嘴，并根据生产商说明书安置在压电驱动的单元中。向颈区施加一个或数个压电脉冲，以分离精子头和尾。然后将头部深深吸入移液管。或者，可将精子/精子头和外源核酸混合物中的单个精子头抽入注射移液管，用于注射入卵母细胞。
在精子头(胞核)和外源核酸共同注射的整个过程中，用常规夹持移液管固定卵母细胞。使含有所选精子头的注射移液管嘴与卵母细胞的透明带紧密接触，施加数个压电脉冲(用控制器设定强度等级为1-5，速度为4-6)，以推进移液管，同时维持移液管内轻度负压。当移液管嘴通过透明带时，将获得的透明带堵塞物挤入卵周隙，精子头被向前推至靠近移液管嘴。然后将移液管嘴置于质膜附近，并向卵母细胞的相对面推进，夹持移液管几乎到达卵母细胞皮质的对侧。现在，卵母细胞质膜被深深地套在注射针嘴周围。施加1至2次压电脉冲(通常强度为1-2，速度为1)后，卵膜在移液管嘴处被刺破，表现为清晰可见的卵膜迅速松弛。然后，将精子头和伴随的最少量(约6pl)的含有外源核酸的培养基排入卵浆中。然后轻轻抽出移液管，使新导入的头部留在卵母细胞的细胞质内。该方法的进行很迅速，通常一批10-15个卵母细胞，它们在其它时间维持在培养状态下。
采用常规注射移液管的其它显微注射方案也可用于该共同注射过程。采用常规移液管将精子头注射入仓鼠卵母细胞的合适显微注射方法例子在Yanagida，K.，Yanagimachi，R.，Perreault，S.D.和R.G.Kleinfeld，Biology of Reproduction 44，440-447(1991)中有所描述，有关这些方法的公开内容被纳入本文作参考。
外源核酸与精子/精子头/脱膜精子头的共同显微注射提供了几个优点。首先，用显微注射输送精子/精子头适用于各种类型的精子，无论其大小、形态等如何。第二，显微注射在注射时能仔细控制使其它试剂(除了上述的外源核酸)和供体精子/精子头一起共同注射入卵母细胞。这些在下文有例举。第三，在本发明的实施方案中，精子/精子头的插入靠的是压电驱动的显微注射，因此提供了迅速有效的样品处理，从而减少了经历操作时精子和卵母细胞的损伤。一些种类动物(如小鼠)的卵母细胞不适合用常规针头作显微注射，而压电驱动的显微注射提供了高成功率。
受精卵母细胞的激活
已知小鼠卵母细胞可通过注射入单个完整的小鼠精子或其分离的头部来激活。分离的精子尾不能激活卵母细胞。活性精子携带的卵母细胞激活因子通常在圆形精子细胞转变成精子时出现。这些因子的作用并不具非高度种类特异性，因为注射外源种类(如仓鼠、家兔、猪、人、甚至是鱼)的精子也可激活小鼠卵母细胞。已有报道说，一种这样的激活因子是存在于顶体赤道段区域内的33千道尔顿的蛋白。该蛋白称为振荡蛋白(oscillin)，它容易通过简单的冻融从成熟(仓鼠)精子中抽提得到。除了振荡蛋白外，成熟精子看来还携带了另一种激活因子，该因子不易被抽提，但是可通过用Triton X-100和SDS依次处理精子来获得。还不知道易抽提的振荡蛋白和抗冻融抽提的因子在生物学和化学上是否相同。
已经知道，在Triton X-100存在下超声处理的精子头丧失了除胞核和核周物质外的所有组分。然而，当用显微外科方法注入卵母细胞内后，这些经Triton X-100处理过的精子头(具有胞核和核周物质，但是没有质膜)能象完整精子一样有效地激活卵母细胞。
如我们的待批美国专利申请No.09/177,391和T.Wakayama，等人(同上)中所述的，至少在小鼠中，精子携带的卵母细胞激活分子必定对冻融和冷冻干燥有耐受力，因为在注射入冻融或冻干的精子头后存活的大多数卵母细胞能被正常地激活和受精。
如果在其他动物种类中，精子头的注射没有起激活卵母细胞的作用，则激活可能是通过单性生殖方式发生的，例如通过电激活、注射入一种或多种激活卵母细胞的物质、或将卵母细胞转移到含有一种或多种激活卵母细胞的物质的培养基中。能提供激活刺激(或激活刺激组合)的试剂包括，但不局限于，精子细胞质激活因子以及某些药理学化合物(如Ca2+和其他信号转导调节剂)，它们可在精子头以及外源核酸共同注射的同时或之后通过显微注射来导入。将受精的卵母细胞转移至含有激活性化合物亚组的一个或多个成员的培养基中后，就可提供某些激活刺激，这些激活化合物包括Ca2+释放刺激剂(如咖啡碱，Ca2+离子载体如A23187和离子霉素，以及乙醇)、磷蛋白信号传导的调节剂(例如2-氨基嘌呤、星形孢菌素和鞘氨醇)、蛋白合成的抑制剂(例如A23187、环己酰亚胺)、6-二甲基氨基嘌呤或前述物质的组合(例如6-二甲基氨基嘌呤和离子霉素)。在一个典型的方法中，是通过在含有2-10mM Sr2+、不含Ca2+的CZB培养液中培育1-6小时来激活小鼠卵母细胞的。
胚胎发育产生活的胎儿和后代
在形成前核后，可以体外培养胚胎，直至其达到2-8细胞阶段或桑椹胚/胚泡阶段，此时可将胚胎转移到代孕母亲的输卵管或子宫内。
与精子头同时注射生物学感兴趣的物质
在本发明的一个实施方案中，将精子头和外源核酸共同显微注射入卵母细胞时允许在将精子头注射入卵母细胞之前、期间或之后导入一种或多种具有改变胚胎发育结果潜力的物质。例如，可在精子头和外源核酸的共同注射之前或之后通过显微注射将其它核糖核酸(RNA)或DNA导入卵母细胞。例如，注射入携带所需顺式活性信号的重组DNA可导致重组DNA上的序列通过已存在的或共注射的转录因子来转录，随后表达出对发育抑制因子有拮抗作用、或对胚胎发育有正作用的编码蛋白质。另外，转录物可具有针对编码发育抑制蛋白的mRNA的反义活性。或者，可通过注射入核酸(或其衍生物)来实现反义调节，这些核酸能通过与没有在卵母细胞中先行转录的它们的核酸靶标直接相互作用来发挥抑制作用。
通过本发明方法导入的重组DNA(线形或其它形状)可含有一个功能性复制子，该复制子含有一个或多个在启动子控制下表达的功能性基因，该基因能表现出从窄到宽的发育表达分布图。例如，当启动子仅在早期受精卵中有活性时，该启动子可能指导立即而简短的表达。导入的DNA可能在胚胎发育期间的某一时刻丧失，或整合入一个或多个基因组基因座，在所得转基因个体的整个生命中稳定地复制。在一个实施方案中，编码推定的“抗衰老”蛋白(如端粒酶或超氧化物歧化酶)的DNA构建物可通过显微注射来导入卵母细胞。另外，也可直接注射这些蛋白。
                            实施例
为描述本发明的方法，评价了膜破坏的和/或脱膜的精子将含有表达报道基因的质粒的复制缺陷型片段转移到未受精卵母细胞内的能力，以及转基因小鼠胚胎及其活的转基因后代的发育。用报道基因使我们能直接鉴定表达转基因的胚胎和活后代。
本文描述的例子不起限制作用，本领域技术人员会认识到其它转基因、除小鼠外的其它来源的精子和卵母细胞以及其它生理介质或试剂也可用于本发明的方法。
材料和试剂
所有无机和有机化合物均购自Sigma Chemical Co.，(St.Louis，MO)，除非另有所述。
在外源DNA和膜破坏的精子或脱膜精子头的共同注射前，将收获的卵母细胞培养在CZB培养液(Chatot，等人，1989.J.Reprod.Fert.86，679-688)中。CZB培养基包含81.6mM氯化钠、4.8mM氯化钾、1.7mM氯化钙、1.2mM硫酸镁、1.8mM磷酸二氢钾、25.1mM碳酸氢钠、0.1mM EDTA二钠、31mM乳酸钠、0.3mM丙酮酸钠、7单位/毫升青霉素G、5单位/毫升硫酸链霉素和4毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA)。用于从输卵管收集卵母细胞、随后的处理以及显微操作的培养液是改进的CZB，它含有20mMHepes、减少量的碳酸氢钠(5mM)和3毫克/毫升BSA。该培养液在这里称为Hepes-CZB。为了显微注射的目的，较佳的是将BSA置于含有0.1毫克/毫升聚乙烯醇(PVA，可溶于冷水，平均分子量为10×103)的Hepes CZB中，因为与BSA相比，PVA能在更长时间内使注射移液管壁粘度更低，这在重复使用单根移液管进行精子头/卵母细胞的多次转移期间是有利的。两种培养基的pH均约为7.4。在室温下(23℃-25℃)空气中，在矿物油下的Hepes缓冲的CZB(Hepes-CZB)中进行所有卵母细胞的操作。
用于分离新鲜精子的培养基是CZB培养基。将冻融的和重新水化的冻干精子悬于CZB培养基或123.0mM氯化钾、2.6mM氯化纳、7.8mM磷酸二氢钠、1.4mM磷酸二氢钾、3mM EDTA二钠组成的胞核分离培养基(NIM)中。加入少量1M HCl调节其pH值至7.2。用于脱膜的新鲜精子收获在NIM中，且在NIM中用Triton X-100进行抽提处理。洗涤后，将脱膜的精子头悬于NIM或CZB培养基中。在精子(在CZB或NIM中)和外源DNA一起培育后，在混合物中添加PVP(平均分子量为360,000，ICNBiochemicals，Costa Mesa，CA)。
动物
这些实施例中所用的动物按照夏威夷大学实验动物服务部(Laboratory AnimalService at the University of Hawaii)以及实验资源国立研究委员会研究所的实验动物管理和使用委员会(Committee on Care and Use of Laboratory Animals of the Institute ofLaboratory Resources National Research Council)制定的指南(DHEW公布号[NIH]80-23，1985年修订)来饲养。动物的处理方法得到夏威夷大学动物管理和使用委员会的监督和批准。
                      实施例1
                   卵母细胞的制备
通过连续(相隔48小时)注射7.5国际单位(IU)的妊娠的母马血清促性腺激素和7.5国际单位的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，诱导成熟B6D2F1(C57BL/6×DBA/2)雌小鼠超排卵。注射hCG后14小时，从输卵管收集卵丘-卵母细胞复合物，用添加了牛睾丸透明质酸酶(300USP单位/毫升，ICN Biochemicals，Costa Mesa，CA)的Hepes-CZB培养基处理3分钟，使卵丘细胞分散。在注射精子胞核前，清洗卵母细胞，并在5％(v/v)CO2空气中、37℃下平衡的矿物油下的CZB培养基中保藏最高4小时。
                       实施例2
                  新鲜精子的制备
从B6D2F1雄性小鼠的附睾尾收集新鲜的精子。用手指挤压每个附睾，同时用锋利的钳子刺穿其远侧部。将从附睾中渗出的稠密的精液团转移到培养皿中。将数滴(约2微升)精子置于1.5毫升聚丙烯微量离心管(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)的底部，用0.2-0.5毫升CZB培养基覆盖。培育大约20分钟后，收集上方0.4毫升的培养基并检查。该悬浮液中90％以上的精子(每毫升约3-10×106个)能活泼地游动。
                      实施例3
                  冻融精子的制备
根据T.Wakayama，D.G.Whittingham和R.Yanagimachi，J.Reprod.Fert.，112，11-17，1998中描述的方法制备冻融的精子。简言之，将附睾尾获得的精子几滴置于1.5毫升聚丙烯离心管底部，用0.5毫升温热的CZB覆盖。37℃下约20分钟后，收集上方0.2毫升的培养基。每毫升悬浮液含有大约3-10×106个。将一份(100微升)精子悬液转移到1.5毫升聚丙烯微量离心管中，与含有或不含36％(w/v)D(+)-蜜三糖的等体积CZB培养基充分混合。蜜三糖的最终浓度分别为18％或0％(w/v)。将各悬液一份(50微升)分散在有标记的1毫升低温小管(A/S NUNC，Copenhagen)中。紧密盖上每个小管，直接置于-20℃或-50℃冷冻机或液氮(-196℃)中。所有样品保藏期为1天至4周。
为了融化，将小管从冷冻机或液氮中取出，在24-26℃的水或空气中放置大约10分钟。如上文所述的那样，用市售的精子存活力测试试剂盒(Live/dead FertiLight，Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon)检查融化的精子悬液样品的游动力和“活力”。所有在不存在蜜三糖时冷冻的精子不能游动，是“死的”(膜被破坏)。在蜜三糖存在下在任一温度冷冻的精子至少有97％不能游动，是“死的”。
洗涤融化的精子悬液一次，重悬于400微升CZB培养液中，然后与外源DNA混合。
如图1(C)所述，用电子显微镜检查确认膜的破坏。顶体帽的膜破坏最明显。
                       实施例4
             重新水化的冷冻干燥的精子的制备
根据T.Wakayama和R.Yanagimachi，Nature Biotechnology 16，638-640，1998以及我们的待批美国专利申请No.09/177,391中描述的方法制备重新水化的冷冻干燥的精子。简言之，将上述制得的小鼠精子悬液一份(100微升)转移到1.5毫升聚丙烯微量离心管中，与1毫升不含EDTA、含有4毫克/毫升BSA的CZB培养基或添加了10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)充分混合。37.5℃下培育30分钟后，从试管中取出0.3-0.5毫升的上方培养基。每毫升悬浮液含有大约3-10×106个精子。
将精子悬液一份(100微升)置于2毫升安瓿(Wheaton Scientific，Millville，NJ)中，将安瓿直接放入液氮中。10分钟后，将安瓿放入与冷冻干燥系统(10-020型，VirTis Co.，Gardner，NY)相连的预冷(-50℃)的冷冻瓶中。入口压力约为1微米汞柱。大约12小时后，在系统中充入气体干燥罐(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA目录号09-204)提供的氩气后，从系统中取出瓶。每个安瓿与真空泵相连，在99％以上的气体被抽出后，密封安瓿结构。每一安瓿用铝箔包裹，于暗处保藏于室温(约25℃)或4℃下。
为了重新水化，将上述制得的含冻干精子的安瓿打开，将100微升蒸馏水加入安瓿内，形成重建的精子悬液。
如图1(D)所示，用电子显微镜检查确认膜的破坏。顶体帽的膜破坏最明显。
                        实施例5
                  脱膜精子头的制备
如下分离出用于Triton X-100抽提的精子：在0-1℃的NIM培养基中将两个附睾尾切细，过滤所得精子悬浮液，获得最终体积为900微升。至于Triton X-100抽提，在900微升NIM中的精子悬液中加入100微升0.5％(v/v，在NIM中)Triton X-100，并在冰上研磨混合30秒。在20000xg、2℃下离心细胞1分钟使其沉淀，并充分重悬于2毫升冰冷的NIM中，然后于20000xg、2℃下重新沉淀2分钟。将最终的沉淀物重悬于400微升CZB或NIM中。
如图1(B)所示，用电子显微镜检查确认精子头脱膜。顶体帽的膜破坏最明显。
                           实施例6
                        转基因的制备
增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因是质粒pCX-EGFP的大的(3.5kb)Sal GI-BamHI片段。该片段携带有从强的巨细胞病毒-IE-鸡β-肌动蛋白增强子-启动子组分表达出的EGFP基因，但是缺少真核细胞复制起点。[H.Niwa，K.Yamamura，J.Miyazaki，Gene 108，193(1991)；G.Zhang，G.Vanessa，S.R.Kain，Biochemical and BiophysicalResearch Communications 227，707(1996)；T.Takada，等人，Nature Biotechnology 15，458(1997)]。用限制性酶Sal GI和Bam HI消化质粒pCX-EGFP，并用本领域技术人员已知的方法纯化，获得含有EGFP基因的3.5kb的片段。
用Sal GI或Xho I和Sal GI消化，获得px-CANLacZ的纯化的携带lacZ的线形片段。px-CANLacZ XhoI-Sal GI片段缺少复制起点。px-CANLacZ编码的β-半乳糖苷酶含有胞核定位信号。
在下述的一些实验中，用Sal GI和Pst I消化产生pCX-LacZ Sal GI-Pst I片段，获得质粒pCX-LacZ的片段。pCX-LacZ是pCX-EGFP的衍生物，其中EGFP基因被编码β-半乳糖苷酶的基因代替。
                           实施例7
              DNA片段和精子的混合物的制备
如下所述，使上述制得的精子不经进一步制备(新鲜的)或在经受上述三种膜破坏过程(冻融，冷冻干燥，或用Triton X-100抽提)之一后与DNA片段混合。
用移液管使1微升上述含有GFP基因的片段与9微升前述制得的精子悬浮液(含有2-5×105个精子)混合，提供最终浓度为7毫微克/微升的DNA GFP片段。类似地，使1微升的Sal GI或Xho I/Sal GI片段分别与9微升一份的精子悬液混合，使Sal GIpx-CANLacZ片段的最终浓度分别为4.5毫微克/微升和9毫微克/微升。
在用单发双重转基因于一次显微共注射后产生两个转基因共表达的胚胎的某些实验中，在注射前，将精子头与两个转基因，即含有pCX-EGFP Sal Gi-Bam HI片段(最终浓度为2.5毫微克/微升)和pCX-LacZ Sal GI-PstI片段(最终浓度为2.5毫微克/微升)的单一DNA溶液混合。
在室温下(约25℃)或冰上培育上述DNA-精子混合物1分钟，然后与聚乙烯吡咯烷酮(PVP，平均分子量为360000)溶液混合至最终浓度约为10％(w/v)PVP。
在一些实验中，为了确定与质粒片段培育后洗涤精子的影响，在与pCX-EGFPDNA混合并培育1分钟后，立即将DNA-精子混合物分成两个5微升的等份。将一等份(洗涤的精子)与50微升冰冷的新鲜的CZB或NIM充分混合来稀释并洗涤。然后使两个等份在20000xg、2℃下沉淀2分钟。仔细地除去经洗涤的精子等份的上清液，用5微升新鲜的CZB或NIM代替。用第二一份的上清液来重悬其自己的沉淀物。(因此，该样品未经洗涤)。
在某些实验中，为了确定单独注射DNA片段而不共注射精子的作用，在注射前将新鲜的质粒pCX-EGFP的Sal GI-Bam HI片段(7毫微克/微升，在NIM中)的稀释液与等体积的PVP 20％(v/v)混合。
对于所有实验，然后都是将上述获得的混合物置于显微镜台上进行如下所述的显微注射。所有注射均在精子与DNA混合或精子与Triton X-100混合后1个小时内在室温下Hepes-CZB培养基中进行。
                          实施例8
             将精子胞核显微注射到卵母细胞中
为了将精子头和外源DNA共注射入制得的卵母细胞内，用塑料平皿(100毫米×150毫米；Falcon Plastics，Oxnard，CA，目录号1001)的盖子(深度为10毫米)制得显微注射室。将两滴圆形液滴和一滴伸长的液滴沿平皿的中心线放置成一排。第一滴液滴(2微升；直径为2毫米)用于洗涤移液管(Hepes-CZB，含有12％[w/v]PVP，平均分子量为360000道尔顿)。第二滴(2微升；直径为2毫米)是如上所述制得的含有精子与DNA片段的混合物。第三滴伸长的液滴(6微升；宽2毫米，长6毫米)是用于卵母细胞的Hepes-CZB培养液。这些液滴的每一滴均用矿物油(E.R.Squibb and Sons，Princeton，NJ)覆盖。将平皿置于倒置显微镜相差镜头的载物台上。
用前面描述的压电显微注射仪方法，采用Prime Tech Ltd.(Tsukuba，Ibaraki-ken，Japan)的MB-U型压电显微操作仪，将精子胞核和外源DNA共同显微注射入卵母细胞中。该单元采用压电效应来使移液管夹持器以非常高的速度一次推进非常小的距离(例如0.5微米)。脉冲的强度和速度由控制仪来调控。
为了注射入上述制得的卵母细胞内，将与外源DNA混合的单个精子头吸入已经和压电移液管驱动单元相连的注射移液管(嘴部内径约5微米)中。在采用整个精子时，首先将单个精子的尾部先吸入注射移液管。向精子颈部区域施加一个或数个压电脉冲，使精子头和尾部分开。脉冲的强度和速度(频率)由控制仪PMAS-CT01(控制仪设定等级：强度2，速度1)调控。然后将头部深深吸入移液管内，将少量(约0.5微升)水银置于注射移液管的近端。精子头和尾的离位破坏了膜，因此表示了用于这些实施例的新鲜精子与以前报道的活精子通过IVF促进转基因的不同之处。
同时，将成熟的未受精的卵母细胞置于显微镜载物台上的Hepes-CZB培养液内。用夹持移液管夹持卵母细胞，使注射移液管嘴在3点钟位置与透明带紧密接触。施加数个压电脉冲(强度为1-2，速度为1-2)，以推进移液管，同时向其施加稍稍的负压。当移液管嘴部通过透明带后，就将移液管内透明带圆柱状片段挤入卵周隙。在将精子头向前推至靠近移液管嘴后，用机械方式推进移液管，直至其嘴部几乎到达卵母细胞皮质的对侧。施加1或2次压电脉冲(强度为1-2，速度为1)，刺破卵膜，将精子头挤入卵质中。据估计，每次注射从移液管内部排除大约1皮升(pl)的含有外源DNA的混合物。然后轻轻抽出移液管，使精子头留在卵质内。
所有注射在Hepes-CZB中室温下进行。每个卵母细胞注射一个精子头。用该方法在10-15分钟内可显微注射约5-20个卵母细胞。弃去在注射后不久裂解的卵母细胞。
在确定不共注射精子而单独注射DNA片段的效果的实验中，每个卵母细胞中注射上述的大约1皮升含质粒pCX-EGFP的Sal GI-Bam HI片段的PVP。室温下回收5-10分钟后，将已注射的卵母细胞转移到不含Ca2、含有10mM SrCl2和胞质分裂阻滞剂细胞松弛素B(5微克/毫升)的CZB中，37℃培育6小时。没有被精子或精子头激活的卵母细胞必须用其它方式来激活，以便使胚胎发育。用锶离子来激活是本领域技术人员已知的众多单性生殖激活方法中的一种，该方法在我们的待批美国专利申请09/132,104(1998年8月10日)中有所描述，关于卵母细胞激活的内容全部纳入本文作为参考。用胞质分裂阻滞剂防止染色体挤出是本领域技术人员熟知的。美国专利申请No.09/132,104中涉及阻滞卵母细胞中胞质分裂的内容也纳入本文作为参考。
然后将单性生殖激活的卵母细胞转移到CZB培养基中，在下述的标准胚胎培养条件下继续培养。3.5天后在培养物中用下述方法评价胚胎的GFP表达。
                         实施例9
    卵母细胞的检查、胚胎培养和转移至代孕母亲
在含5％(v/v)CO2的空气中平衡的矿物油下37℃的CZB中培育注射了精子头-外源DNA的卵母细胞，5-6小时后用倒置显微镜检查。具有两个明显的前核和第二极体的那些卵母细胞被认为是正常受精的，让它们在CZB中培养4天。将达到桑椹胚或胚泡阶段的那些受精卵转移到受体雌鼠(通常为CD-1雌性白化体)的子宫角内，该雌鼠在3天前已经和切除输精管的CD-1雄鼠交配过，以使胚胎发育阶段与子宫内膜的阶段同步。将平均数目为八个的桑椹胚/胚泡转移到每个子宫角内。使雌鼠分娩和喂养其代孕的后代。随机选出一些成熟的雄性和雌性后代并交配以检查它们的生育力。
                       实施例10
                 检查胚胎的转基因表达
显微注射3-3.5天后，用具有UV光源(480纳米)和异硫氰酸荧光素滤片的表面荧光显微镜检查胚胎的GFP表达。这能清楚地鉴定出没有荧光的(不表达GFP)、荧光弱的和荧光强的胚胎和嵌合体，然后给予相应的评分。
如T.Tsukul等人，Nature Biotechnology 14，982(1996)中所述，在室温下用含有1％(v/v)甲醛、0 2％(v/v)戊二醛和BSA(5毫克/毫升)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.6)固定5分钟后，测定第3天的胚胎中px-CANLacZβ-半乳糖苷酶的表达。用含有BSA(5毫克/毫升)的PBS充分洗涤固定的胚胎，然后在含有BSA(5毫克/毫升)、4mM铁氰化钾、4mM亚铁氰化钾、2mM氯化镁和5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)(1毫克/毫升)的PBS中于37℃培育5小时染色。用光学显微镜检查并给胚胎评分。
在两个转基因与精子头共注射的实验中，用上述方法首先评价3-3.5天胚胎的GFP表达，然后评价β-半乳糖苷酶表达。为了制成照片，将胚胎封固在显微镜载玻片和盖波片之间，收集图象以显示固定前的发育和GFP表达，进行染色以显示LacZ表达。
                         实施例11
                检查活后代的转基因表达
在分娩后1-4天，检查从上述植入代孕母亲的胚胎获得的活后代的异位GFP表达。在UV光源(480纳米)的入射照射下，明显能观察到皮肤呈绿色，即有GFP表达。
                         实施例12
                转基因的基因组整合的分析
用Southern印迹或聚合酶链反应(PCR)来物理分析尾尖基因组DNA。对3-6周龄的随机选出的绿色小鼠幼崽及其非绿色的同窝出生的幼崽进行尾尖活检。用本领域技术人员熟知的方法从尾尖组织抽提出总基因组DNA。在装有480/440纳米滤片的荧光立体显微镜下对尾进行拍照。
至于Southern印迹分析，用Eco RI消化每份样品10微克基因组DNA，以pCX-EGFP的733碱基对的Eco RI片段进行探测。为了检出GFP基因，每个反应用1微克基因组DNA进行PCR，PCR采用正向(TTGAATTCGCCACCATGGTGAGC)和反向(TTGAATTCTTACTTGTACAGCTCG-TCC)寡核苷酸引物。反应参数为95℃9分钟(1轮)，94℃45秒，60℃30秒，72℃45秒(40轮)。电泳分离PCR产物，用溴化乙锭染色后显示。
用编码外源报道物的DNA或精子头或两者显微注射中期II卵母细胞后产生的胚胎中的转基因表达
在精子和DNA预培养1分钟然后共注射后体外培育3.5天的胚胎中，记录GFP和β-半乳糖苷酶的表达。如上所述，用表面荧光显微镜检测GFP，用染色检测β-半乳糖苷酶。结果示于表1。当pCX-EGFP DNA与新鲜精子共注射时，含有荧光卵裂球的胚胎的比例最低(26％)，但当DNA与经Triton X-100处理(64％)、冻融(82％)或冻干(87％)而膜受破坏的精子共注射时，该比例升高至较高的数值。经线性px-CANLacZDNA片段以及冻融或冻干精子共注射的未受精的卵母细胞也产生了高比例的表达lacZ转基因产物β-半乳糖苷酶的胚胎(92％或94％)。另外，精子头和两种不同转基因DNA(分别编码GFP和LacZ)的混合物的共注射产生了一次显微注射就表达两种转基因的胚胎。图2描述了用此单发双重转基因法产生的转基因胚胎。用已经与pCX-LAcZ和pCX-EGFP转基因DNA混合物预培育的精子显微注射入卵母细胞。图2A、2B和2C(X400)分别显示了3.5天后的相同的胚胎，图2A：用Hoffinan调节相差显微镜观察，不染色；图2B：长波长(480nm)紫外光下观察的GFP表达；图2C：用X-gal染色来观察β-半乳糖苷酶表达。
总之，上述数据表明膜被破坏的精子头与外源核酸共注射入未受精的卵母细胞能有效地产生转基因胚胎。
与pCS-EGFP DNA混合后经新鲜培养基洗涤的精子保留了产生荧光性卵裂球的能力，但是与未经洗涤的对应物相比，其效率稍低(63％对80％)(表1)。这提示外源DNA和精子在混合时迅速结合(在注射前)。
为了调查卵母细胞内是否会发生类似的相互作用(注射后)，我们依次注射入精子头和pCX-EGFP DNA，在注射前不混合。我们始终不能发现有外源(GFP)DNA表达，即使75％的阳性对照胚胎(表1中的冻融的精子头和pCX-EGFP共注射)有荧光。与500皮克/微升pCX-EGFP(而不是50皮克/微升)共注射的冻融精子头产生了可观察到有GFP表达的胚泡。该GFP检测临界值(相当于每毫升有50-500皮克pCX-EGFP DNA)代表了注射的每皮升中平均有15-150个分子。
与和精子头共注射相反，单独注射相似量的GFP转基因DNA不排除良好的单性生殖发育(98％的在注射后存活的卵母细胞发育至桑椹胚-胚泡阶段)(表1)。然而，得到的胚胎没有一个显示出能观察到转基因表达。因此，在不存在精子头时，几乎没有转基因表达或具转录活性的转基因DNA的表染色体持续(epichromosomalpersistence)。
表1的数据支持了这样一个概念，即可以想像到注射前外源DNA和精子头亚膜结构之间的结合主要涉及核周基质的碱性蛋白[F.J.Longo，等人，J.Cell Biol.105，1105(1987)]。在我们实验室的其它实验中，我们发现精子胞核含有至少一种核酸内切酶，25℃脱膜的精子迅速丧失支持全部胚胎发育的能力[B.Maione，等人，DNACell Biol.16，1087(1997)]。因此，这里所用的精子基因组DNA不可能不受损，这与促进卵母细胞介导的转基因整合的单链断裂的存在相符。
我们好奇地发现，在精子头-pCX-EGFP共注射后出现含GFP阳性和阴性卵裂球(+/-桑椹胚-胚泡)的嵌合胚胎，但是在单独注射pCX-EGFP DNA后没有这种卵裂球(表1)。这种+/-嵌合体的频度暗示转基因DNA整合有时延迟至ICSI后细胞周期的第一个S期后。如果转基因DNA和精子头不共同注射，这种延迟的整合看来就不会发生。该现象的一种解释是精子衍生的物质使外源DNA在早期胚胎内稳定，从而有助于延迟整合；在不存在该物质(例如在单性生殖生物中)时，外源DNA会在能够整合前降解。
在共注射精子头-pCX-EGFP后，胚胎发育的潜力随所含的荧光性卵裂球的比例的增加而减小(表1)。相反，精子头-pxCANLacZ共注射后的转基因表达没有抑制胚胎发育(表1)。不希望受理论的束缚，这可能反映了GFP表达有不利的影响。即，早期的胚胎发育可能对伴随GFP发色团成熟而放出H2O2非常敏感(R.Y.Tsien，同上)。
用编码外源报道物的DNA或精子头或两者显微注射入中期II的卵母细胞后产生的活后代中的转基因表达。
为了确定转基因DNA构建物的基因组整合是否能在活后代(起始小鼠)中表现出来，将经受三种膜破坏过程之一的精子头与pCX-EGFP DNA一同注射。如上所述，在体外培养所得胚胎3.5-4天(至桑椹胚-胚泡阶段)，然后非选择性地(即不根据荧光)转移到代孕母亲体内。转基因整合的表型分析是在长波长紫外光下分别检查转基因小鼠和非转基因的对照小鼠的尾尖活检物(分别如图3A(a)和图3A(b)所示)。转基因小鼠的发绿色荧光的皮肤可通过非绿色的毛发来显示。就皮肤中可观察到的GFP表达而言，高比例(17-21％)的后代是转基因的(表2)。该表达效率不取决于用来制备精子的膜破坏方法。合子发育至足月的比例对三组膜破坏精子头的每一组是相当的(12％-14％)，但是比无外源DNA存在时显微注射作类似处理的精子头后获得的比例低。
这些数据与表1所示的结果相符。数据表明，含有GFP阴性细胞的胚胎比含全部为阳性的细胞的更能可能发育至足月。另外，评为阴性的某些活后代可能是从培养3.5天时含有GFP阳性和阴性细胞的嵌合胚胎产生的。不希望受理论的束缚，可认为共注射的pCX-EGFP DNA可能对植入前和植入后的胚胎发育均有不利的影响。然而，还不知道对植入后发育的抑制是转基因表达的结果还是外源DNA本身存在的结果。
用Southern印迹(图3B)或PCR(图3C)对尾尖总基因组DNA进行物理分析，结果表明，所有表现出绿色荧光的起始小鼠系具有转基因，包括最初评为表型阴性、但是活检的尾尖表现出GFP表达的一个小鼠。在这三例中，PCR证明缺少可检测的绿色荧光的起始动物中存在有转基因。不希望受理论的束缚，认为不表达转基因是因为转基因整合基因座局部区域有顺式活性元件。图3B中描述了对照B6D2F1(野生型)(0)以及起始小鼠3(5-9)、19(＞50)、28(5-9)和41(2)用pCX-EGFP片段作探针的总DNA的Southern印迹分析，其中估计的每个基因组中转基因拷贝数显示在括号内。Southern印迹分析表明起始动物中的转基因拷贝数为≤1至＞50。该结果与前核显微注射后的转基因整合方式相似。基因组pCX-EGFP DNA的物理鉴定和GFP表达的效率表明转基因DNA在整合时没有经历总体重排。
图3C中描述了小鼠16、17、30、36、47、49、对照B6D2F1(野生型)、3、19、28和41的总DNA的PCR分析结果，并确认小鼠17、3、19和28中存在GFP转基因。
随机选出12个表达GFP的起始动物(8个雌性，4个雄性，来自表2和类似的系列)与非转基因动物杂交，除一个例子(雌性)外，所有动物均产生幼崽。在11个能育的起始动物中，8个产生的幼崽皮肤异位表达GFP，频度为27％-50％(平均为40％)。在大多数情况下，转基因遗传的方式与单个基因座GFP基因的孟德尔种系传递相符。
尽管本发明已经参照较佳实施方案作了描述，但应理解这并不意味着本发明局限于所公开的具体形式。相反，这意味着覆盖了在本发明精神和范围内的所有改进和变化形式。
                           表1
         将编码外源报道物的DNA或精子头或两者显微注射入
        中期II卵母细胞中后产生的胚胎的体外培养和转基因表达
        第3天时全部桑椹胚-胚泡(m-b)和荧光(GFP)或染色(LacZ)片段*        精子处理    卵母细胞数 m-b(％)     -§        +/-§       +**§pCX-EGFP      无(新鲜)     162       134(83)a     100    13        21apCX-EGFP   Triton X-100    270       212(79)a     75     37        100bpCX-EGFP       冻融        313       155(50)b     28     31        96bpCX-EGFP       冻干        278       154(55)b     20     23        111bpx-CANLacZ     冻融        151       110(73)a     7      45        58bpx-CANLacZ     冻干        136       106(78)a     8      32        66bpCX-EGFP       洗涤        153       114(75)c     43     4         67cpCX-EGFP       未洗涤      117       83(71)c      17     3         63c
           ①冻融→②pGX-EGFP               71        56(79)        56     0         0①pCX-EGFP→
           ②冻融      51        35(69)        35     0         0pCX-EGFP单独   -           49        48(98)        48     0         0
*外源DNA片段是pCX-EGFP-Bam HI-Sal GI或px-CANLacZ-Sal GI，Sal GI-XhoI或XhoI。
在比较同一栏中有上标＂a＂和＂b＂的数值时，它们差别显著(P＜0.05)。同一栏中具有上标＂c＂的数值差别不显著。
§转基因表达：-，阴性；+，阳性；+/-，m-b含有+和-细胞(嵌合体)。
                表2
    表型转基因(绿色)幼崽及其同胞动物的发育精子处理*   卵母细胞数    转移的m-b    总幼崽数    +(绿色)幼崽§冻干            116           67(4)        14            3**冻融            97            53(3)        12            2**Triton X-100      218           150(9)       31            6**
*每一行记录了以脱膜精子头和质粒pCX-EGFP片段共注射的卵母细胞产生的胚胎和幼崽的发育。
m-b，桑椹胚-胚泡。括号内的数值表示用作胚胎转移受体的代孕母亲数。
§转基因表达：+在其皮肤上异位表达GFP的阳性幼崽。
**数值没有显著差异。

Claims (21)

1.一种获得转基因胚胎的方法，该方法包括下列步骤：
将外源核酸和膜受破坏的精子头或脱膜精子头共同插入未受精的卵母细胞中，形成受精的转基因卵母细胞；和
使受精的转基因卵母细胞发育成转基因胚胎。
2.根据权利要求1所述的方法，其中共同插入步骤用压电驱动的显微注射来实现。
3.根据权利要求2所述的方法，其中将外源核酸和膜受破坏的精子头共同注射到未受精卵母细胞的胞质内。
4.根据权利要求1所述的方法，其中膜受破坏的精子头从经过冷冻和融化的精子获得。
5.根据权利要求1所述的方法，其中膜受破坏的精子头从重新水化的冷冻干燥的精子获得。
6.根据权利要求1所述的方法，其中精子头是包含胞核和核周物质的脱膜的头部。
7.根据权利要求6所述的方法，其中膜受破坏的精子头从经洗涤剂处理的精子获得。
8.根据权利要求1所述的方法，其中未受精的卵母细胞是中期II的卵母细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中共插入步骤包括首先使膜受破坏的或脱膜的精子头与外源核酸预培育第一段时间的分步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一段时间为30秒至5分钟。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一段时间为45秒至3分钟。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一段时间为1分钟至2分钟。
13.根据权利要求1所述的方法，其中外源核酸包含多个转基因。
14.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括使转基因胚胎发育成活后代的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中使胚胎发育的步骤包括将转基因胚胎移植到代孕母亲体内的分步骤。
16.根据权利要求1所述的方法，其中卵母细胞和精子头来自哺乳动物。
17.根据权利要求15所述的方法，其中哺乳动物选自灵长类动物、羊、牛、猪、熊、猫、狗、马和啮齿类动物。
18.根据权利要求1所述的方法，其中卵母细胞和精子头来自无脊椎动物。
19.根据权利要求1所述的方法，其中卵母细胞和精子头来自鱼类、两栖动物、爬行动物或鸟类。
20.根据权利要求1所述的方法，其中卵母细胞和精子头来自海胆、龙虾、鲍鱼或有壳的水生动物。
21.一种获得转基因胚胎的方法，该方法包括下列步骤：
获得膜受破坏的或脱膜的精子头；
将膜受破坏的或脱膜的精子头与含有所需基因的外源核酸混合；
将该混合物共同注射到分离的未受精的中期II的卵母细胞中，形成受精的转基因卵母细胞；和
使受精的转基因卵母细胞发育成转基因胚胎。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019113743A1 (zh) * 2017-12-11 2019-06-20 清华大学 基因改造方法

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030079240A1 (en) * 1997-12-18 2003-04-24 Newman Stuart A. Chimeric embryos and animals containing human cells
US7241617B2 (en) * 1998-07-03 2007-07-10 Dnavec Research, Inc. Sendai viral vectors comprising foreign genes inserted between the R1 and R2 Loci
US20040088748A1 (en) * 1999-05-13 2004-05-06 Perry Anthony C.F. Method of performing transgenesis
US20010044937A1 (en) * 1999-12-17 2001-11-22 Gerald Schatten Methods for producing transgenic animals
US7094601B2 (en) * 2000-05-16 2006-08-22 The General Hospital Corporation Microinjection of cryoprotectants for preservation of cells
US20020045156A1 (en) * 2000-05-16 2002-04-18 Mehmet Toner Microinjection of cryoprotectants for preservation of cells
US20040040051A1 (en) * 2001-01-19 2004-02-26 Whitehead Institute For Biomedical Research Generation of non-human mammals by nuclear cloning
US20080124787A1 (en) * 2001-02-13 2008-05-29 Avigenics, Inc. Microinjection devices and methods of use
US7339090B2 (en) 2001-02-13 2008-03-04 Avigenics, Inc. Microinjection devices and methods of use
US20020116732A1 (en) * 2001-02-13 2002-08-22 Leandro Christmann Microinjection assembly and methods for microinjecting and reimplanting avian eggs
EP1438401B1 (en) 2001-09-18 2011-06-15 Synageva BioPharma Corp. Production of a transgenic avian by cytoplasmic injection
US7550650B2 (en) 2001-09-18 2009-06-23 Synageva Biopharma Corp. Production of a transgenic avian by cytoplasmic injection
US20040210955A1 (en) * 2001-10-26 2004-10-21 Hidenori Akutsu Preparation of spermatozoa for ICSI-mediated transgenesis and methods of using the same
US20040006157A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-08 Gloster Daniel F. Ultra violet curable 100 percent solids inks
US20040172667A1 (en) * 2002-06-26 2004-09-02 Cooper Richard K. Administration of transposon-based vectors to reproductive organs
US20040235011A1 (en) * 2002-06-26 2004-11-25 Cooper Richard K. Production of multimeric proteins
US7527966B2 (en) * 2002-06-26 2009-05-05 Transgenrx, Inc. Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector
US8071364B2 (en) 2003-12-24 2011-12-06 Transgenrx, Inc. Gene therapy using transposon-based vectors
AU2005226779B8 (en) 2004-02-24 2011-03-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Rab9A, Rab11A, and modulators thereof related to infectious disease
ES2245591B1 (es) * 2004-04-06 2007-04-01 Consejo Sup. Investigaciones Cientificas Nuevo procedimiento para generar animales transgenicos no humanos, y los animales transgenicos asi obtenidos.
US20060294606A1 (en) * 2004-05-18 2006-12-28 Istefo Moisyadi Tn5 transposase-mediated transgenesis
US20060130157A1 (en) 2004-10-22 2006-06-15 Kevin Wells Ungulates with genetically modified immune systems
CA2585970A1 (en) 2004-10-27 2006-05-04 Vanderbilt University Mammalian genes involved in infection
CA2909775A1 (en) 2005-08-09 2007-03-29 Revivicor, Inc. Transgenic ungulates expressing ctla4-ig and uses thereof
US20100272706A1 (en) 2007-06-22 2010-10-28 Jason Mercer Antivirals
WO2010036979A2 (en) * 2008-09-25 2010-04-01 Transgenrx, Inc. Novel vectors for production of interferon
US9150880B2 (en) * 2008-09-25 2015-10-06 Proteovec Holding, L.L.C. Vectors for production of antibodies
WO2010036978A2 (en) * 2008-09-25 2010-04-01 Transgenrx, Inc. Novel vectors for production of growth hormone
ES2548377T3 (es) 2008-10-27 2015-10-16 Revivicor, Inc. Ungulados inmunodeprimidos
WO2010118360A1 (en) * 2009-04-09 2010-10-14 The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Production of proteins using transposon-based vectors
WO2010144611A2 (en) * 2009-06-10 2010-12-16 3-V Biosciences, Inc. Antivirals that target transporters, carriers, and ion channels
US10202615B2 (en) 2010-12-10 2019-02-12 Vanderbilt University Mammalian genes involved in toxicity and infection
ES2680636T3 (es) 2011-02-14 2018-09-10 Revivicor Inc. Cerdos genéticamente modificados para xenotrasplante de xenoinjertos vascularizados y derivados de los mismos
US20150025306A1 (en) * 2013-07-19 2015-01-22 Elwha Llc Methods and Systems for Utilizing Sperm for Molecular Delivery
US20150024497A1 (en) * 2013-07-19 2015-01-22 Elwha Llc Methods and Systems for Utilizing Sperm for Molecular Delivery
RU2613788C1 (ru) * 2015-12-15 2017-03-21 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Метод биопсии клеток трофобласта при множественных клетках, не участвующих в компактизации на стадии бластоцисты в программах преимплантационного генетического скрининга эмбрионов человека
WO2018015497A2 (en) 2016-07-21 2018-01-25 ObsEva S.A. Oxytocin antagonist dosing regimens for promoting embryo implantation and preventing miscarriage
KR102036723B1 (ko) 2018-02-09 2019-11-26 재단법인 대구경북과학기술원 세포질내 정자 주입 시스템 및 이를 이용한 정자 주입 방법
CN114667141A (zh) 2019-09-03 2022-06-24 奥布赛瓦股份公司 用于促进胚胎移植和预防流产的催产素拮抗剂给药方案
US20230102503A1 (en) 2020-02-10 2023-03-30 ObsEva S.A. Biomarkers for oxytocin receptor antagonist therapy
WO2023250101A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Gameto, Inc. Compositions and methods for inducing oocyte maturation
US11744920B1 (en) 2022-08-12 2023-09-05 Gameto, Inc Implant for ovarian decline and methods of manufacturing an implant for ovarian decline
WO2024054644A2 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Gameto, Inc. Production and applications of ovarian and uterine organoids
WO2024206245A1 (en) 2023-03-24 2024-10-03 Gameto, Inc. Methods and compositions for producing ovarian support cell co-culture

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6641526B1 (en) * 1998-03-20 2003-11-04 University Of Hawaii Development of normal offspring from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa
NZ509861A (en) 1998-08-11 2004-01-30 Teruhiko Wakayama Method of performing transgenesis

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019113743A1 (zh) * 2017-12-11 2019-06-20 清华大学 基因改造方法

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