CN1650003A - 选择用于哺乳动物种中核转移的细胞系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了数据证明包括融合和卵裂指数(单独或组合)的步骤中细胞系的融合性能是选择将成功用于核转移或显微注射程序的细胞系的一种方法。选择细胞系的这个技术和方法提供了用于在各种哺乳动物非人种(包括山羊、猪、啮齿动物、灵长目、兔子和牛)中产生活后代的能够核转移的活化和融合胚胎的制备方法的另外替代方法和改进。

Description

选择用于哺乳动物种中核转移的细胞系的方法
发明领域
本发明涉及选择用于非人哺乳动物中核转移或核显微注射步骤的优等细胞系的改进方法。更特别地，本发明通过提供能够预先选择优等细胞系的标准而提供了改进这种转基因程序结果的方法。
发明背景
本发明一般地涉及体细胞核转移(SCNT)领域和产生期望的转基因动物。更特别地，它涉及选择、产生和繁殖得自体细胞的优等细胞系的方法，转化这些细胞系的方法，和使用这些转化细胞和细胞系来产生转基因非人哺乳动物种的方法。典型地，这些转基因动物将用于产生感兴趣的分子，包括生物药剂、抗体和重组蛋白。
对具有某些期望性状或特征，如体重，奶含量，产奶量，泌乳间隔长度和抗病性增加的动物渴望已久。传统育种方法能够产生带有一些特定期望性状的动物，但是常常这些性状伴随很多不需要的特征，并且费时、昂贵和不可靠。而且，这些方法完全不能允许特定动物系产生基因产物，如所述物种的遗传互补物(genetic complement)中本来完全没有的期望的蛋白治疗剂(如牛奶中的人或人源化抗体)。
能够产生转基因动物的技术的发展提供了产生被改造携带特殊性状或被设计表达治疗或商业价值的某些蛋白或其它分子化合物的动物的特别精确方法。那就是，转基因动物是携带在发育早期已被故意导入现存体细胞和/或生殖系细胞的基因的动物。当动物发育和生长时，改造给动物的蛋白产物或特殊发育改变变得明显。
目前，可利用的产生转基因家畜的技术效率低并且费时，典型地产生有活力胚胎的百分比很低，常常是由于细胞系选择技术低劣或被选择细胞的活力低下。
在转基因发展过程中，在靶细胞核的遗传互补物中DNA序列被典型地随机插入，可引起各种问题。这些问题的第一个是插入失活，它是由于编码或调节序列被新来DNA破坏造成的必需基因失活。另一个问题是该转基因可能根本不掺入，或掺入但不表达。更多问题是由于遗传物质中位置效应造成的调控不准确的可能性。这是指用相同转基因构建体产生的不同建立者(founder)动物之间基因表达水平和基因调节准确度的变异性。因此，产生大量建立者动物并且常常证实少于5％的动物以保证转基因系维持的方式表达该转基因并不罕见。
另外，产生转基因家畜的效率低，100个后代中产生1个转基因的效率并不罕见(Wall，1997)。结果，产生转基因动物相关的费用可以多至每个表达动物25-50万美元(Wall，1997)。
核转移和显微注射的现有方法典型地使用不考虑限制与转基因动物产生所需程序相关的细胞质量的客观因素而选择的胚胎和体细胞和细胞系。这种类型的工作和细胞来源以Campbell等(Nature，1996)和Stice等(Biol.Reprod.，1996)为代表。在这两个研究中，细胞系得自妊娠小于10天的胚胎。在两个研究中，选择的细胞维持在饲养层防止待用于克隆过程的供体细胞明显分化，但没有使用其它选择方法、技术或程序。本发明使用基于至少一个客观适应性测试中它们的性能，由于它们作为核转移和显微注射程序的细胞核来源的适合性而选择的分化细胞。本发明也包括也可以使用本发明方法筛选的胚胎细胞类型与从分化供体核开始的克隆胚胎的用途。
因此，尽管各种方法已经产生了几个不同物种的转基因动物，但是仍缺乏以合理费用，容易和可重复产生能够表达高产量期望蛋白或表现插入转基因引起的遗传改变的转基因动物的方法。
因此，需要选择作为核转移程序中细胞核来源的细胞系的改进方法，它将允许转基因动物发展中生产效率增加。本发明接着提高了选择对于核转移或显微注射程序最佳的细胞系的能力。当前，次等细胞系作为核转移程序中细胞核来源可引起相当大程度的成功和失败，本发明将提高这些效率。
发明概述
简而言之，本发明提供了通过核转移方法克隆非人哺乳动物的改进方法，包括：获得待用作核转移程序的供体核来源的期望的分化哺乳动物细胞系；从与作为供体核来源的细胞相同的物种的哺乳动物获得至少一个卵母细胞；除去该至少一个卵母细胞的核；将期望的分化细胞或细胞核转移到去核卵母细胞中；同时融合和活化细胞偶联体(cellcouplet)，形成第一转基因胚胎；活化没有融合产生第一转基因胚胎的细胞-偶联体；培养活化的第一转基因胚胎直到超过2细胞发育期；和将第一转基因胚胎转移到合适的宿主哺乳动物中，使得该胚胎发育为胎儿，其中根据卵裂和/或融合模式的客观参数选择待用作细胞核的期望的分化哺乳动物细胞系。典型地，通过使用如下供体核完成上面的方法，在所述分化哺乳动物细胞或细胞核插入所述去核卵母细胞前，供体核中已插入、除去或修饰期望基因。也要注意的事实是使用的卵母细胞在去核前优选在体外成熟。
此外，本发明的方法也通过使用被去核并与供体体细胞融合并同时活化的停滞在中期II期的山羊(caprine)卵母细胞，能够优化转基因动物的产生。分析一个转基因克隆动物的奶表明人的期望靶转基因蛋白产物的产量水平高。
指出本发明也可以用于增加可用于例如细胞、组织和器官移植的CICM细胞、胎儿或后代的可利用性也很重要。通过从动物取出胎儿或成年细胞并在克隆程序中使用它，各种细胞、组织和可能器官当它们通过器官发生而发育时可从克隆的胎儿获得。细胞、组织和器官也可以从克隆的后代分离。这个方法可提供很多医学和兽医治疗，包括细胞和基因治疗的“材料”来源。如果细胞被转移回到该细胞所来源的动物，那么避免了免疫排斥。而且，因为可从这些克隆分离很多细胞类型，所以其它方法学如造血嵌合性(chimericism)可用于避免相同物种动物间以及种间的免疫排斥。
附图简述
图1显示了通过核转移产生克隆动物的方法的概括性图。
优选实施方案的描述
说明书中下列缩写具有指定的意思：
缩写解释：
体细胞核转移(SCNT)
培养的内细胞团细胞(CICM)
核转移(NT)
合成的输卵管液(SOF)
胎牛血清(FBS)
聚合酶链式反应(PCR)
牛血清白蛋白(BSA)
术语解释：
牛-牛各个种所有的或与之相关的
山羊-山羊各个种所有的或与之相关的
细胞偶联体(couplet)-融合和/或活化前的去核卵母细胞和体细胞或胎儿细胞核。
细胞松弛素(Cytocholasin)-B-某些真菌的代谢产物，它选择性和可逆地阻断胞质分裂，而不影响核分裂。
胞质体-真核细胞的细胞质物质。
融合玻片-以固定距离分离放置的平行电极(parallelelectrodes)的玻片。细胞偶联体放置于电极之间接受电流进行融合和活化。
细胞核-细胞的核，通过去核得自细胞，被狭窄的细胞质边缘和质膜环绕。
核转移-或“核移植”是指克隆方法，其中供体细胞核被移植到去核卵母细胞中。
单性生殖的(parthenogenic)-来自无精子穿透的卵母细胞的胚胎的发育。
重建胚胎-重建胚胎是通过去核程序其遗传物质已经被除去的卵母细胞。通过融合事件后将成年或胎儿体细胞的遗传物质放置于该卵母细胞中，它已被“重建”。
体细胞-生物体除了生殖细胞以外的任何细胞。
体细胞核转移-也称作治疗性克隆，是体细胞与去核卵母细胞融合的方法。体细胞的核提供遗传信息，而卵母细胞提供营养和胚胎发育所需的其它产能物质。一旦发生融合，细胞就是全能的，并最终发育为胚泡，在此点分离内细胞团。
转基因生物-一种生物，其中被实验转移了来自另一个生物的遗传物质，使得该宿主获得了其染色体组成中被转移基因的遗传性状。
根据本发明，提供了具有增强效率的哺乳动物优等基因型的增殖，包括山羊和牛。这将允许具有证明的遗传优越性或其它期望性状的成年动物的增殖，优越性这里包括细胞质量的客观测试中成功的性能和转基因动物产生的适合性。例如，产生很多重要哺乳动物物种的成功率将提高，这些动物包括山羊、啮齿动物、牛和兔子。通过本发明，有潜在数十亿个胎儿或成年细胞，它们可以被获得并用于克隆程序和接着将根据表明对产生转基因动物所需的程序、方法和技术的适合性的客观参数而被测试。这将潜在地短期产生很多相同后代，降低涉及的整体费用并提高效率。
此外，本发明涉及克隆程序，其中利用得自体细胞细胞系或分化胎儿或成年哺乳动物细胞系的细胞核。这些细胞系包括使用血清饥饿的分化胎儿或成年山羊或牛(如情况可以是)细胞群和细胞系，其如下文所述随后再导入血清，这些细胞被移植到与供体核相同物种的去核卵母细胞中。该核被重新编程以指导克隆胚胎的发育，该胚胎接着可转移给受体雌性动物而产生胎儿和后代，或用于产生培养的内细胞团细胞(CICM)。克隆胚胎也可以与受精胚胎组合产生嵌合胚胎、胎儿和/或后代。
尽管最早被Campbell等(1996)报道，但是Wilmut等，(1997)报道了他们成功的克隆工作的融合比率和胚胎发育，但是没有证明这些参数中哪一个还是二者对统计上显著优于另一个细胞系的一个细胞系重要。很多其它研究连续报道了仅融合比率(Kasinathan等，2001；Lai等，2001；Keefer等，2002；Reggio等，2001；和Fitchev等，1999)，融合和卵裂(Kato等，2000；Zakhartchenko等，1996；Zakhartchenko等，2001；Verma等，2000；Liu等，2001；Park等，2001；和Booth等，2001)或不融合卵裂(Kuholzer等，2001；Zou等，2002；和Kou等，2000)。这些报道也没有指出或说明基于统计学显著高的融合和/或卵裂比率，给定细胞系用作核转移程序中细胞核来源是优等的。
本发明通过同时融合和活化，两个事件之间不含延迟，也提供了体细胞核转移效率的增加。本研究的目的是调查融合和/或卵裂之间的联系作为细胞系用于产生核转移程序中有活力后代的潜力的标志。
供体细胞核与去核胞质体的融合，和所得偶联体的随后活化是用体细胞核转移成功产生活后代所需的重要步骤。供体细胞核与胞质体的电融合是最常使用的方法。然而更重要的是，已经发表了核转移方法学中使用的启动很多家畜物种中胚胎发育过程的几种活化方法，和活化步骤的时间选择。在哺乳动物中，尽管物种间有差异，但是最初信号转导事件和随后受精时精子诱导的Ca+2振荡是导致卵母细胞活化和胚胎发育的正常过程(Fissore等，1992和Alberio等，2001)。目前利用Ca+2动员的化学和电方法活化体细胞核转移产生的偶联体。然而，这些方法不产生与典型的体内受精模式中精子类似的Ca+2振荡模式。
自从利用体细胞的绵羊的首次成功报道，核转移已经发生了显著的进步(Wilmut等，1997)。自那时以后已经从体细胞不同程度成功地克隆了很多其它物种(Baguisi等，1999和Cibelli等，1998)。也已经报道了很多其它胎儿和成年体细胞组织类型(Zou等，2001和Wells等，1999)，以及胚胎(Yang等，1992；Bondioli等，1990；和Meng等，1997)。重建时期细胞核处于的细胞周期阶段也已经被证明为不同实验室方法中的关键(Kasinathan等，Biol.Reprod.2001；Lai等，2001；Yong等，1998；和Kasinathan等，Nature Biotech.2001)。
现有技术依靠使用早期胚胎的随机来源的分裂球进行核转移程序。这个方法受可利用胚胎分裂球数量少和不能将外源遗传物质导入这种细胞的限制。相比之下，分化胚胎、胎儿或成年体细胞可起进行核转移的细胞核供体的作用的发现提供了生殖系修饰的广泛可能性。根据本发明，使用重组的体细胞系进行核转移，和通过选择可更成功用于核转移方法的优等细胞系，包括使用“重建”胚胎，来提高这个程序的效率，不仅增加传统转染方法的效率，而且在克服了建立者镶嵌性问题的同时实质性地增加转基因动物产生的效率。
我们以前表明同时电融合和活化可成功产生山羊物种和其它动物的活后代。在我们最近的一组实验中，我们研究了初次成功同时电融合和活化之后，使用另外的电活化事件来更接近地模拟精子诱导的Ca+2振荡并通过体细胞核转移产生胚胎和活后代。最后，我们确定了初次同时电融合和活化事件中没有成功融合的供体细胞核与去核胞质体再次融合，通过体细胞核转移产生山羊胚胎和活后代的能力。
细胞核与去核胞质体电融合的效率基于使用的物种和细胞类型而变化。然而，在我们对于山羊的实验中，并且如其他人报道的(Baguisi等，1999；和Stice等，1992)，存在着初次融合尝试过程中没有成功融合的偶联体亚群。在这些实验中，我们确定了不成功的初次同时电融合和活化事件后另外的再次融合尝试，通过体细胞核转移产生山羊胚胎和活后代的能力。在实验中，数据表明，与单独同时电融合和活化(Baguisi等，1999)，或初次成功同时电融合和活化后单一另外电活化事件相比，再次融合在产生活后代能力上是有能力的并且更有效。在随后实验中，我们证实了我们的观察，未融合偶联体的再次融合能够产生能在受孕55天建立妊娠的核转移胚胎。
因此，通过本发明转基因动物山羊中采用的方法和系统，通过体细胞核转移已经产生了转基因动物，通过使用客观的细胞选择标准增加了它的效率。
尽管为理解的目的以例证和实例方式有些详细地描述了前面的发明，但是可实施某些改变和修改对本领域技术人员很明显。因此，说明书和实施例不应该被解释为限制本发明的范围，本发明范围由所附权利要求描述。
Wilmut等和Campbell等报道了使用单一电脉冲进行重建胚胎的融合，随后在胚胎化学活化前延迟几个小时。其它报道已经示范了可用于各种物种活化的不同的电和化学刺激(Koo等，2000；和Fissore A.等)。本发明通过同时融合和活化，两个事件之间不含延迟，给活化和融合胚胎使用随后的另外电脉冲，提供了体细胞核转移的用途。然而，这里提供的细胞选择技术通过改善那些过程中使用的“起始材料”或细胞将改进广泛的核转移技术，包括Wilmut等和Campbell等提供的更传统方法。同样，这里利用的关于山羊细胞和细胞系的技术也对各种其它哺乳动物细胞系有用。本发明的方法依赖于被研究细胞的特征，即卵裂和/或融合作为客观标准，而不管物种如何。因此，本发明提供了核转移技术，它提供了提高的效率和使得产生转基因动物或细胞系的方法更可靠和有效。
材料和方法
用作卵母细胞供体的供体雌性动物的动情期同步化和超排卵及显微操作如Gavin W.G.1996所述实施，该文献特别引入这里作为参考。原代体细胞的分离和建立，用作细胞核供体的体细胞的转染和制备也如前述实施。原代体细胞是从使用标准的基于脂质的转染方案，用感兴趣基因转染的动物组织得到的分化的非生殖细胞。测试转染细胞，如Baguisi等1999所述培养和制备转基因阳性细胞用作核转移的供体细胞。也应该记住可以用DNA染料Hoechst 33342或使核酸可见的其它荧光敏感成分对卵母细胞染色或不染色来实施去核和重建步骤。然而优选使用大约0.1-5.0μg/ml Hoechst 33342来着色中期板上的遗传物质。
可以用大约0.1-5.0μg/ml Hoechst 33342染色和紫外线照明遗传物质/中期板，但也可以不染色卵母细胞和紫外线照明遗传物质/中期板来实施去核和重建。去核和重建后，在补充了胎牛血清(1％至15％)，加100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的平衡合成输卵管液体培养基(SOF/FBS)中培养细胞核/胞质体偶联体。融合前偶联体在37-39℃，含大约5％CO2的空气的潮湿气室中培养至少30分钟。
使用由两个电极组建的融合玻片实施融合。融合玻片置于融合皿里面，皿中充满足够量的融合缓冲液以覆盖融合玻片的电极。从培养温箱中取出细胞偶联体并通过融合缓冲液洗涤。使用立体显微镜，电极间等距放置偶联体，细胞核/胞质体连接处与电极平行。在这些实验中，使用BTX ECM 2001电子细胞操作仪给细胞偶联体施加大约2.0至3.0kV/cm，20(可以是20-60)μ秒的初次单一同时融合和活化电脉冲。融合处理的细胞偶联体转移到一滴新鲜融合缓冲液中。通过平衡SOF/FBS洗涤融合处理的偶联体，接着转移到含或不含细胞松弛素-B(1至10μg/ml)的平衡SOF/FBS中。细胞偶联体在37-39℃，含大约5％CO2的空气的潮湿气室中培养。
融合后大约30分钟开始，确定细胞核/胞质体的融合。初次融合和活化处理后1小时(15分钟-1小时)开始，融合的偶联体接受大约2.0kV/cm 20(20-60)μ秒的另外单一电脉冲(双脉冲)以促进另外的活化。可供选择地，初次融合和活化处理后1小时(15分钟-1小时)开始，另一组融合细胞偶联体以十五分钟的间隔接受大约2.0kV/cm 20μ秒的三次另外的单一电脉冲(四脉冲)，以促进另外的活化。初次融合和活化处理后1小时开始，用大约2.6至3.2kV/cm 20(20-60)μ秒的单一电脉冲再次融合未融合的细胞偶联体以促进融合。所有融合和融合处理的细胞偶联体返回到含(1至10μg/ml)或不含细胞松弛素-B的SOF/FBS中。细胞偶联体在含大约5％CO2的空气的潮湿气室中37-39℃培养至少30分钟。
再次融合后30分钟开始，确定细胞核/胞质体再次融合的成功。用平衡SOF/FBS洗涤融合处理的细胞偶联体，接种转移到含或不含放线菌酮的平衡SOF/FBS中。细胞偶联体在含大约5％CO2的空气的潮湿气室中37-39℃培养达4小时。
放线菌酮处理后，用补充牛血清白蛋白(0.1％至1.0％)加100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的平衡SOF培养基(SOF/BSA)充分洗涤细胞偶联体。细胞偶联体转移到平衡SOF/BSA中，在含大约6％O2，5％CO2，余量为氮的潮湿组合孵育室中37-39℃静置培养24-48小时。适当发育(在24至48小时，1细胞到8细胞)年龄的核转移胚胎转移给同步化代理受体。
表1表示的数据来自于2001年9月至2002年2月初期间发育生产建立者转基因动物的生产性核转移工作。这个表详述了实验室生产成果，特别是胚胎收集、去核、融合、卵裂和转移数据。
表1.核转移数据2001/2002季
2001/2002季(2001年8月27日-2002年2月8日)
总排卵                              7151
#供体                               495
排卵/供体                           14.4
#回收的卵                           4201(排卵的59％)
#卵/供体                            8.5
#排出&抽吸的卵                      4452
#去核的                             4215(回收卵母细胞的95％)
#重建的                             3947(去核卵母细胞的94％)
#尝试融合的偶联体                   3633(重建卵母细胞的92％)
#融合的偶联体                       2904(尝试融合的80％)
#卵裂                               1145(融合的偶联体的39％)(在48小时
                                    是58％)
#转移的核转移胚胎                   2120
#受体                               345
#胚胎/受体                          6.1(范围1-15)
#妊娠                               24(40)/305(7.9％)，19周
#后代                               未决
下表2中可找到本发明的更多相关信息，数据基于由妊娠对未妊娠动物分开的融合和卵裂比率，表明给定细胞群或细胞系融合和/或卵裂比率高的时候，该细胞系在预测发育性妊娠和转基因动物出生方面具有更大整体成功。
表2.基于融合和卵裂的GTC核转移妊娠总结
                     NT受体US阳性(第50天)          NT受体US阴性
#受体                26                            139
#实验                17                            35
#细胞系              13                            15
#尝试融合            826                           1424
#融合的(％)          686a(83)                     1093b(77)
融合范围(％)         (57-100)                      (32-100)
#在48小时卵裂/#      239/339(71)a                 376/721(52)b
融合(％)
(范围％)             (57-92)                       (22-93)
a，b行内不同上标的值显著不同(P＜0.001)。
预先选择优等细胞系用于核转移程序的能力具有明显的含义。如本文中参考的出版物所见，大量核转移工作成功有限。在很多这些出版物中，进行了相当量的工作，结果很少或完全缺乏各个细胞(细胞核)系出生的后代。
任何核转移程序成功的首要是具有去核胞质体与细胞核的充分融合。然而同等重要的是重建胚胎(细胞核和胞质体)如正常胚胎一样发生行为和卵裂及发育为有活力的胎儿并最终发育为活后代。上面详述的这个实验室的结果表明融合和卵裂分开或联合具有以统计学显著性方式预测哪些细胞系利于核转移程序的能力。尽管单独每个参数可辅助预先选择利用哪个细胞系，但联合可加强选择细胞系的结果。
根据本发明，当评价细胞系用于核转移程序时，在它们各自出版物中的某些细胞系或细胞群相对于融合、融合和卵裂、或单独卵裂的特征是重要的并且具有统计学显著性。进一步，本发明的原理证明，胚胎的核指数(来自具有核的重建核转移胚胎的分裂球数量)也是细胞系性能的相关标志。
实质上，本发明通过单独或组合地使用融合和卵裂指数，提供了选择在增加核转移程序的成功启动和结果中有用的优等细胞系的方法。
山羊
用作本研究的细胞和细胞系供体的一群纯育的和混合繁殖的无瘙痒病的Alpine、Saanen和Toggenburg奶山羊按Good AgriculturalPractice(GAP)指南维持。
山羊胎儿体细胞系的分离
待用作细胞核供体的原代山羊胎儿成纤维细胞细胞系得自35和40天的胎儿。手术取出胎儿并放置于平衡磷酸缓冲盐水(PBS，无Ca++/Mg++)中。切碎在0.025％胰蛋白酶，0.5mM EDTA，38℃中10分钟的胎儿组织制备单一细胞悬液。用胎儿细胞培养基[补充核苷、0.1mM2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素(10,000 I.U.每种/毫升)的含10％胎牛血清(FBS)的平衡培养基-199(M199，Gibco)]洗涤细胞，并培养在25cm2的瓶中。培养4天后通过胰蛋白酶作用收集原代胎儿细胞的汇合单层，接着维持在培养中或冷冻保存。
用于胚胎重建的供体细胞的制备
胎儿体细胞接种在含胎儿细胞培养基的4孔板上并维持在培养中(5％CO2，39℃)。48小时后，用新鲜的低血清(0.5％FBS)胎儿细胞培养基替换培养基。低血清培养基后接下来的2-7天，每48至72小时用低血清胎儿细胞培养基替换培养基，胰蛋白酶作用收集体细胞(待用作细胞核供体)。与去核卵母细胞融合前，细胞重新悬于补充2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素(10,000 I.U.每种/毫升)的含10％FBS的平衡M199中至少6小时。
卵母细胞收集
如前所述(Gavin W.G.，1996)进行卵母细胞供体雌性动物的同步和超排卵，并以48小时间隔与切除输精管的雄性动物交配。收集后，卵母细胞培养在补充2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素(10,000 I.U.每种/毫升)的含10％FBS的平衡M199中。
胞质体制备和去核
去核前15至30分钟，所有卵母细胞用细胞松弛素-B(Sigma，在含10％FBS的M199中5μg/ml)处理。用25至30μm玻璃吸管通过抽吸第一极体和极体周围环绕的相邻细胞质(～30％细胞质)以除去中期板，除去中期-II期卵母细胞的核。去核后，立即重建所有卵母细胞。
核转移和重建
在与卵母细胞去核中使用的相同培养基中进行供体细胞注射。使用玻璃吸管将一个供体细胞放置于透明带和卵质膜之间。电融合和活化程序前，细胞-卵母细胞偶联体在SOF中培养30至60分钟。重建的卵母细胞在融合缓冲液(300mM甘露醇，0.05mM CaCl2，0.1mM MgSO4，1mMK2HPO4，0.1mM谷胱甘肽，0.1mg/ml BSA)中平衡2分钟。在含2个制成“融合玻片”(500μm间隙；BTX-Genetronics，San Diego，CA)的不锈钢电极，充满融合介质的融合室中室温下进行电融合和活化。
使用融合玻片实施融合。融合玻片置于融合皿里面，皿中充满足够量的融合缓冲液以覆盖融合玻片的电极。从培养温箱这取出偶联体并通过融合缓冲液洗涤。使用立体显微镜，电极间等距放置偶联体，细胞核/胞质体连接处与电极平行。应该注意应用给偶联体促进活化和融合的电压范围可以从1.0kV/cm至10.0kV/cm。然而优选初次单一同时融合和活化电脉冲具有2.0至3.0kV/cm的电压范围，最优选在2.5kV/cm，优选至少20μ秒的持续时间。使用BTX ECM 2001电子细胞操作仪将此应用给细胞偶联体。微脉冲的持续时间可以从10至80μ秒变化。此过程之后，处理的偶联体典型地转移到一滴新鲜融合缓冲液中。通过平衡SOF/FBS洗涤融合处理的偶联体，接着转移到含或不含细胞松弛素-B的平衡SOF/FBS中。如果使用细胞松弛素-B，其浓度可以从1至15μg/ml变化，最优选5μg/ml。偶联体在含大约5％CO2的空气的潮湿气室37-39℃中培养。应该注意本文公开内容中提供的任何方案中，细胞松弛素-B可以使用甘露醇替代(基于HEPES缓冲的甘露醇(0.3mm)的含Ca+2和BSA的培养基)。
融合后10至90分钟开始，最优选在融合后30分钟开始，确定真实细胞核/胞质体融合的存在。为了本发明的目的，融合的偶联体可以接受另外活化处理(双脉冲)。这个另外脉冲在电压强度方面可以从0.1至5.0kV/cm变化，时间范围10至80μ秒。然而优选地，融合偶联体将接受0.4或2.0kV/cm的另外单一电脉冲(双脉冲)20μ秒。另外脉冲的给予可以在首次脉冲后至少15分钟小时开始，然而最优选，在初次融合和活化处理后30分钟至2小时开始这次另外脉冲以促进另外活化。在其它实施方案中，用单一电脉冲再次融合未融合的偶联体。这次另外脉冲的电压范围和时间可从1.0kV/cm至5.0kV/cm至少10μ秒变化，发生在初次融合脉冲后至少15分钟。然而更优选地，这次另外脉冲是2.2kV/cm至3.2kV/cm，至少20μ秒，在初次融合和活化处理后30分钟至1小时开始以促进融合。所有融合的和融合处理的偶联体返回SOF/FBS加5μg/ml细胞松弛素-B。偶联体在含大约5％CO2的空气的潮湿气室中37-39℃培养至少20分钟，优选30分钟。
本发明方法的另一版本对于细胞偶联体提供了另外的单一电脉冲(双脉冲)，优选2.0kV/cm，至少20μ秒，在初次融合和活化处理后至少15分钟，优选30分钟至1小时开始，以促进另外的活化。这次另外活化脉冲的电压范围可以从1.0至6.0kV/cm变化。
可供选择地，在随后的努力中，剩余融合的偶联体接受至少三次另外单一电脉冲(四脉冲)，最优选2.0kV/cm，20μ秒，间隔15至30分钟，在初次融合和活化处理后至少30分钟开始，以促进另外的活化。然而，应该注意在这个另外方案中，另外活化脉冲的电压范围可以从1.0至6.0kV/cm变化，持续时间可以从10μ秒至60μ秒变化，在初次融合处理后可以短至15分钟，或长至4小时开始。在随后实验中，用2.6至3.2kV/cm，20μ秒，在初次融合和活化处理后1小时开始的单一电脉冲再次融合未融合的偶联体以促进融合。所有融合的和融合处理的偶联体返回含或不含细胞松弛素-B的平衡SOF/FBS。如果使用细胞松弛素-B，其浓度可以从1至15μg/ml变化，最优选5μg/ml。偶联体在含大约5％CO2的空气的潮湿气室37-39℃中培养至少30分钟。可以使用甘露醇替换细胞松弛素-B。
再次融合后30分钟开始，确定细胞核/胞质体再次融合的成功。用平衡SOF/FBS洗涤融合处理的偶联体，接着转移到加5μg/ml放线菌酮的平衡SOF/FBS中。偶联体在有含大约5％CO2的空气的潮湿气室37-39℃中培养达4小时。
放线菌酮处理后，用补充至少0.1％牛血清白蛋白，优选至少0.7％，优选0.8％，加100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的平衡SOF培养基(SOF/BSA)充分洗涤偶联体。偶联体转移到平衡SOF/BSA中，在含大约6％O2，5％CO2，余量为氮的潮湿组合孵育室中37-39℃静置培养24-48小时。适当发育(在24至48小时，1细胞到8细胞)年龄的核转移胚胎转移给同步化代理受体。
核转移胚胎培养和转移给受体
所有核转移胚胎在矿物油覆盖的含10％FBS的50μl小滴SOF中培养。胚胎转移给受体雌性动物之前，胚胎培养物在含5％CO2潮湿39℃温箱中维持48小时。如前所述实施受体的胚胎转移(Baguisi等，1999)。
妊娠和围产期护理
对于山羊，持续动情期第一天后的第25天开始，超声波检查法确定妊娠。每周评估雌性动物直到受孕75天，和其后每月一次估计胎儿活力。对于持续超过152天的妊娠，用5mg PGF2α(Lutalyse，Upjohn)促进分娩。处理后24小时内发生分娩。出生后立即从母畜移开小山羊，并在分娩后1小时内接受热处理的初乳。
克隆动物的基因分型
出生后不久，从克隆的雌性动物(如山羊)和代孕雌亲获得血液样品和耳朵皮肤活检组织进行基因组DNA分离。使用特定转基因靶蛋白的引物，通过PCR首先分析每个样品，接着用那个特定靶蛋白的cDNA，进行Southern印迹分析。对于每个样品，用EcoRI(New England Biolabs，Beverly，MA)消化5μg基因组DNA，在0.7％琼脂糖凝胶(SeaKem，ME)中电泳并在本领域已知标准步骤后用毛细管转移固定到尼龙膜(MagnaGraph，MSI，Westboro，MA)上。使用以Prime-It试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)用32P dCTP标记的1.5kb Xho I至Sal IhAT cDNA片段探测膜。在65℃杂交过夜。用0.2X SSC，0.1％ SDS洗涤印迹和用X-OMATTM AR胶片曝光48小时。
在本发明的开发过程中实施的实验中，在去核和重建之后，细胞核/胞质体偶联体在补充了1％至15％胎牛血清，优选10％FBS，加100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的平衡合成输卵管液培养基(SOF/FBS)中培养。融合前，偶联体在具有含大约5％CO2的空气的潮湿气室中37-39℃培养至少30分钟。
通过提供导致转基因胚胎产生的程序中使用的优等细胞，本发明允许增加转基因程序的效率。这些转基因胚胎可以植入代孕动物或可以克隆繁殖和保存或利用。也通过将增强和改善的核转移程序与体外修饰和选择这些细胞的能力组合，这个程序比以前的转基因胚胎技术更有效。根据本发明，这些转基因克隆胚胎可以用于产生CICM细胞系或其它胚胎细胞系。因此，本发明消除了得到和体外维持有助于基因工程技术的未分化、未选择、随机细胞系的需要。
因此，在一个方面，本发明提供了克隆哺乳动物的方法。通常，可以用核转移方法产生哺乳动物，所述方法包括下列步骤：
(i)获得待用作供体核来源的期望的分化哺乳动物细胞；
(ii)从与供体核来源细胞相同的物种的哺乳动物获得卵母细胞；
(iii)将所述卵母细胞去核；
(iv)将所述期望的分化细胞或细胞核转移给去核的卵母细胞；
(v)同时融合和活化该细胞偶联体，形成第一转基因胚胎；
(vi)通过提供第二个活化电震扰(electrical shock)来继续活化没有融合产生第一转基因胚胎的细胞偶联体，形成第二转基因胚胎；
(vii)培养所述的活化的第一和/或第二转基因胚胎直到超过2细胞发育期；和
(viii)将所述第一和/或第二转基因胚胎转移给宿主哺乳动物，使得该胚胎发育为胎儿。
本发明也包括克隆基因工程或转基因哺乳动物的方法，其中分化的哺乳动物细胞或细胞核插入去核卵母细胞之前，分化的哺乳动物细胞或细胞核中被插入、除去或修饰期望的基因。
本发明也提供了根据上面的方法获得的哺乳动物，和那些哺乳动物的后代。本发明优选用于克隆山羊或牛，但可以用于任何哺乳动物物种。本发明进一步提供了核转移胎儿和核转移和嵌合后代在细胞、组织和器官移植领域中的用途。
在另一个方面，本发明提供了制备CICM细胞的方法。该方法包括：
(i)获得待用作供体核来源的期望的分化哺乳动物细胞；
(ii)从与供体核来源细胞相同的物种的哺乳动物获得卵母细胞；
(iii)将所述卵母细胞去核；
(iv)将所述期望的分化细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞；
(v)同时融合和活化细胞偶联体，形成第一转基因胚胎；
(vi)通过提供至少一个另外的活化方案包括另外的电震扰来活化没有融合产生第一转基因胚胎，但在初次电震扰后被活化的细胞偶联体，形成第二转基因胚胎；
(vii)培养所述的活化的第一和/或第二转基因胚胎直到超过2细胞发育期；和
(viii)培养从所述培养的活化胚胎获得的细胞，得到CICM细胞。
这里所述方法得到的CICM细胞也有利地用于细胞、组织和器官移植领域，或制备胎儿或后代，包括转基因胎儿或后代。分化的哺乳动物细胞是经过了早期胚胎阶段的那些细胞。分化的细胞可以得自外胚层、中胚层或内胚层组织或细胞层。
也可以使用可供选择的方法，其中细胞偶联体可接受多次电震扰来增强融合和活化。通常，通过核转移方法产生哺乳动物，所述方法包括下列步骤：
(i)获得待用作供体核来源的期望的分化哺乳动物细胞；
(ii)从与供体核来源细胞相同的物种的哺乳动物获得卵母细胞；
(iii)将所述卵母细胞去核；
(iv)将所述期望的分化细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞中；
(v)对细胞偶联体采用至少两次电震扰，启动所述细胞偶联体的融合和活化成为活化和融合的胚胎。
(vii)培养所述的活化和融合的胚胎直到超过2细胞发育期；和
(viii)将所述的第一和/或第二转基因胚胎转移至宿主哺乳动物，使得该胚胎发育为胎儿；
其中，所述至少两次电震扰的第二次在初次电震扰之后至少15分钟给予。
哺乳动物细胞，包括人细胞，可以用熟知方法获得。例如，本发明中有用的哺乳动物细胞包括上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、单个核细胞、成纤维细胞、心肌细胞和其它肌细胞等。此外，用于核转移的哺乳动物细胞可以从不同器官获得，如皮肤、肺脏、胰腺、肝脏、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾脏、尿道和其它泌尿器官等。这些仅仅是合适供体细胞的实例。合适的供体细胞，即本主题发明中有用的细胞可以从机体的任何细胞或器官获得并可根据它们在融合和/或卵裂研究中的表现筛选。这个方法接着将提供转基因动物产生的整体增加。
成纤维细胞是理想的细胞类型，因为它们可从发育的胎儿和成年动物大量获得。成纤维细胞是多少分化的，因此，以前认为是用于克隆程序的不佳细胞类型。重要的是，这些细胞容易在体外增殖，倍增时间快，并可以克隆繁殖用于基因打靶程序，和本发明提供的客观筛选或多次筛选技术。再者本发明是新的，因为使用分化的细胞类型。本发明是有利的，因为这些细胞容易增殖，遗传修饰和体外选择。
卵母细胞的合适哺乳动物来源包括山羊、绵羊、母牛、猪、兔子、豚鼠、小鼠、仓鼠、大鼠、灵长目等。优选，该卵母细胞从山羊和有蹄类动物获得，最优选山羊。分离卵母细胞的方法是本领域熟知的。实质上，这将包括从哺乳动物如山羊的卵巢或生殖道分离卵母细胞。山羊卵母细胞容易获得的来源是来自激素诱导的雌性动物。
为了技术如基因工程、核转移和克隆的成功使用，在卵母细胞可以用作受体细胞进行核转移之前，和它们可以被精子细胞受精发育为胚胎之前，优选卵母细胞可在体内成熟。已经在体内成熟的中期II期卵母细胞已经成功用于核转移技术。基本上，动情发作过去或注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)或类似激素过去几个小时，通过手术从非超排卵或超排卵的动物收集成熟的中期II卵母细胞。
此外，应该注意通过转基因技术修饰动物基因组的能力提供了制备重组蛋白的新的可供选择技术。转基因畜牧动物的奶中人重组药物的产生解决了与微生物生物反应器(如缺乏翻译后修饰、不正确的蛋白折叠、高纯化费用)或动物细胞生物反应器(如高资本费用、昂贵培养基、低产量)相关的很多问题。
已报道了去核和核转移时卵母细胞的成熟阶段对核转移方法的成功很重要(First和Prather 1991)。通常，成功的哺乳动物胚胎克隆实践使用中期II期卵母细胞作为受体卵母细胞，因为在这个时期据信该卵母细胞可以被或足以被“活化”从而如同它对受精精子一样处理导入的核。对于家畜，特别是山羊，卵母细胞活化期通常发生在精子接触和穿透进入卵母细胞质膜的时间。
固定时间的成熟期(范围从大约10至40小时，优选大约16-18小时)之后，将卵母细胞去核。去核前，优选取出卵母细胞并放置于含1毫克每毫升透明质酸酶的EMCARE培养基中，然后除去丘细胞。这可通过用很细小孔的吸移管重复吸吹或通过简单涡旋实行。剥脱的卵母细胞接着筛选极体，并选择中期II卵母细胞，如极体的存在所确定的，然后用于核转移。去核如下。
可以用已知方法实行去核，例如如美国专利4,994,384所述，它引入这里作为参考。例如，中期II期卵母细胞放置于EMCARE培养基中，优选含7.5微克每毫升细胞松弛素B，用于立即去核，或可放置于合适的培养基中，例如胚胎培养基如CR1aa，加10％FBS，接着之后去核，优选不超过24小时后，和更优选16-18小时后去核。
可以用显微手术使用微量吸管除去极体和相邻细胞质完成去核。接着可筛选该卵母细胞鉴定其中已成功去核的那些。这个筛选可以通过用1微克每毫升33342 Hoechst染料在EMCARE或SOF中对卵母细胞染色，接着在紫外线照射少于10秒下观察卵母细胞来实行。已成功去核的卵母细胞接着可放置于合适的培养基中。
在本发明中，受体卵母细胞将优选是在体外或体内成熟开始后大约10小时至大约40小时去核，更优选在体外或体内成熟开始后大约16小时至大约24小时，最优选在体外或体内成熟开始后大约16-18小时时去核。
接着，与去核卵母细胞相同物种的单一哺乳动物细胞转移至用于产生活化胚胎的去核卵母细胞的卵周隙中。哺乳动物细胞和去核卵母细胞将用于根据本领域已知方法产生活化胚胎。例如，可以通过电融合来融合细胞。通过提供足以引起质膜瞬间打破的电脉冲来完成电融合。这种质膜的打破非常短，因为膜迅速重新形成。因此，如果诱导两相邻膜打破和重新形成时脂双层混合，在这两个细胞之间将开放小的通道。由于这种小开口的热力学不稳定性，它扩大直到两个细胞变成一个。Prather等的美国专利4,997,384提供了这个方法更多讨论(其全部内容引入这里作为参考)。可以使用各种电融合介质，包括如蔗糖、甘露醇、山梨醇和磷酸盐缓冲溶液。也可以使用仙台病毒作为融合剂来完成融合(Ponimaskin等，2000)。
而且，在有些情况下(如小供体核)，优选将核直接注射给卵母细胞而不是使用电穿孔融合。Collas和Barnes，Mol.Reprod.Dev.，38：264-267(1994)中公开了这种技术，其全部内容引入这里作为参考。
可以用已知方法活化该活化的胚胎。这种方法包括如在亚生理温度下培养活化胚胎，主要是通过给活化胚胎应用寒冷，或实际上凉的温度震扰。这可以通过在室温培养活化胚胎来最方便地进行，室温相对于胚胎正常暴露的生理温度条件是寒冷的。
可供选择地，可以应用已知活化剂完成活化。例如，已经表明受精过程中精子穿透卵母细胞活化灌注卵母细胞而产生更多数量的成活妊娠和核转移后的多个遗传学相同的小牛。而且，可以使用如电和化学震扰等处理在融合后活化NT胚胎。合适的卵母细胞活化方法是Susko-Parrish等的美国专利5,496,720的主题，其全部内容引入这里作为参考。
另外，对于选择的优越细胞系，最好同时实行活化，尽管确实存在顺序活化的方案。在活化方面，发生下列细胞事件：
(i)增加卵母细胞中二价阳离子的水平，和
(ii)降低卵母细胞中细胞蛋白的磷酸化。
上面的事件可以通过将二价阳离子如镁、锶、钡或钙，例如以离子载体的形式导入卵母细胞的细胞质而外源性地刺激发生。增加二价阳离子水平的其它方法包括使用电震扰，用乙醇处理和用笼形螯合剂(cagedchelators)处理。可以用已知方法降低磷酸化，如添加激酶抑制剂，如丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，如6-二甲基-氨基嘌呤，星形孢菌素，2-氨基嘌呤和鞘氨醇。可供选择地，通过将磷酸酶，如磷酸酶2A和磷酸酶2B导入卵母细胞可以抑制细胞蛋白的磷酸化。
因此，应该理解，本发明这里提供的增加活化和融合的“重建胚胎”的可利用性的实施方案仅仅是举例说明本发明原理的应用。由前述说明书明显可知这里公开的选择用于核转移或显微注射程序的细胞或细胞系的改进方法的各种形式、使用方法和原理应用方面的变化是新的，并且可以被修改和/或采用而不背离本发明的精神，或所附权利要求的范围。
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Claims (53)

1.一种通过核转移方法克隆非人哺乳动物的方法，包括
(i)获得待用作供体核来源的期望的分化哺乳动物细胞；
(ii)从与供体核来源细胞相同的物种的哺乳动物获得至少一个卵母细胞；
(iii)将所述至少一个卵母细胞去核；
(iv)将所述期望的分化细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞中；
(v)同时融合和活化细胞偶联体，形成第一转基因胚胎；
(vi)活化初次电震扰后被活化的细胞偶联体，产生转基因胚胎；
(vii)培养所述的活化的第一和/或第二转基因胚胎直到超过2细胞发育阶段；和
(viii)将所述第一和/或第二转基因胚胎转移至宿主哺乳动物中，使得该胚胎发育为胎儿；
(ix)其中根据卵裂和/或融合模式的客观参数来选择待用作细胞核的期望的分化哺乳动物细胞系。
2.权利要求1的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自中胚层。
3.权利要求1的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自内胚层。
4.权利要求1的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自外胚层。
5.权利要求1的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自胎儿体细胞组织。
6.权利要求1的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自胎儿体细胞。
7.权利要求1的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自成纤维细胞。
8.权利要求1的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自有蹄类动物。
9.权利要求1或8的方法，其中所述供体细胞或供体细胞核来自选自牛、绵羊、猪、马、山羊和水牛组成的组的有蹄类动物。
10.权利要求1的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自成年非人哺乳动物体细胞。
11.权利要求1的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞选自由上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和肌细胞组成的组。
12.权利要求1的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自选自皮肤、肺脏、胰腺、肝脏、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾脏和尿道的器官。
13.权利要求1的方法，其中在去核前，所述的至少一个卵母细胞在体内成熟。
14.权利要求1的方法，其中在去核前，所述的至少一个卵母细胞在体外成熟。
15.权利要求1的方法，其中所述的非人哺乳动物是啮齿动物。
16.权利要求1的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞是非静止体细胞或分离自所述非静止体细胞的核。
17.权利要求1或8的方法，其中胎儿发育为后代。
18.权利要求1的方法，其中所述的至少一个卵母细胞在体外成熟开始后大约10至60小时被去核。
19.权利要求1的方法，其中在所述分化哺乳动物细胞或细胞核插入所述去核卵母细胞前，在所述分化哺乳动物细胞或细胞核中插入、除去或修饰目的基因。
20.权利要求1或19的方法产生的后代。
21.权利要求19的后代，进一步包括其中由所述核转移程序产生的后代是嵌合的。
22.权利要求1的方法，其中在克隆方案中使用细胞松弛素-B。
23.权利要求1的方法，其中在克隆方案中不使用细胞松弛素-B。
24.一种制备培养的内细胞团细胞的方法，包括：
(i)获得待用作供体核来源的期望的分化哺乳动物细胞；
(ii)从与供体核来源细胞相同的物种的哺乳动物获得至少一个卵母细胞；
(iii)将所述至少一个卵母细胞去核；
(iv)将期望的分化细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞中；
(v)同时融合和活化细胞偶联体，形成第一转基因胚胎；
(vi)活化初次电震扰后被活化的细胞偶联体，形成第一转基因胚胎；和
(vii)培养从所述培养的活化胚胎获得的细胞以得到培养的内细胞团细胞；
(viii)其中根据卵裂和/或融合模式的客观参数来选择待用作细胞核的期望的分化哺乳动物细胞系。
25.权利要求24的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自中胚层。
26.权利要求24的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自内胚层。
27.权利要求24的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自外胚层。
28.权利要求24的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自胎儿体细胞组织。
29.权利要求24的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自胎儿体细胞。
30.权利要求24的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自成纤维细胞。
31.权利要求24的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自有蹄类动物。
32.权利要求24或31的方法，其中所述供体细胞或供体细胞核来自选自由牛、绵羊、猪、马、山羊和水牛组成的组的有蹄类动物。
33.权利要求24的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自成年哺乳动物体细胞。
34.权利要求24的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞选自上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和肌细胞。
35.权利要求24的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞来自选自皮肤、肺脏、胰腺、肝脏、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾脏和尿道的器官。
36.权利要求24的方法，其中在去核前，所述的至少一个卵母细胞在体内成熟。
37.权利要求24的方法，其中在去核前，所述的至少一个卵母细胞在体外成熟。
38.权利要求24的方法，其中所述哺乳动物细胞来自啮齿动物。
39.权利要求24的方法，其中所述待用作供体核或供体细胞核来源的供体分化哺乳动物细胞是非静止体细胞或分离自所述非静止体细胞的核。
40.权利要求24或31的方法，其中任何所述培养的内细胞团细胞胎儿发育为非人后代。
41.权利要求24的方法，其中所述的至少一个卵母细胞在体外成熟开始后大约10至60小时被去核。
42.权利要求24的方法，其中在所述分化哺乳动物细胞或细胞核插入所述去核卵母细胞前，在所述分化哺乳动物细胞或细胞核中插入、除去或修饰目的基因。
43.权利要求24或42的方法产生的后代。
44.权利要求42的后代，进一步包括其中由所述核转移程序产生的任何非人后代是嵌合的。
45.权利要求24的方法，其中在该方案中使用细胞松弛素-B。
46.权利要求24的方法，其中在该方案中不使用细胞松弛素-B。
47.权利要求24的方法，其中在该方案中使用细胞松弛素-B。
48.权利要求24的方法，其中所述培养的内细胞团细胞用于发育移植用的功能器官。
49.权利要求24的方法，其中所述培养的内细胞团细胞用于器官发生。
50.一种通过核转移方法克隆非人哺乳动物的方法，包括：
(i)获得待用作供体核来源的期望的分化哺乳动物细胞；
(ii)从与供体核来源细胞相同的物种的哺乳动物获得至少一个卵母细胞；
(iii)将所述卵母细胞去核；
(iv)将期望的分化细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞中；
(v)对细胞偶联体施加至少两次电震扰以启动所述细胞偶联体的融合和活化成为活化和融合的胚胎。
(vii)培养所述的活化和融合的胚胎直到超过2细胞发育阶段；
(viii)将所述的第一和/或第二转基因胚胎转移至宿主哺乳动物中，使得该胚胎发育为胎儿；
其中所述至少两次电震扰的第二次在初次电震扰之后至少15分钟给予；
其中在所述分化哺乳动物细胞或细胞核插入所述去核卵母细胞前，在所述分化哺乳动物细胞或细胞核中插入、除去或修饰目的基因；和
其中根据卵裂和/或融合模式的客观参数来选择待用作细胞核的期望的分化哺乳动物细胞系。
51.一种通过核转移克隆非人哺乳动物的改进方法，包括将非人哺乳动物供体细胞或非人哺乳动物供体细胞核导入与供体细胞或供体细胞核相同物种的非人哺乳动物的去核卵母细胞，形成核转移(NT)单位，将NT单位植入所述物种的替代母亲的子宫内，和允许该NT单位发育为克隆哺乳动物，其中改进包括利用预先筛选的分化哺乳动物细胞系作为细胞核，所述细胞核是根据成功的卵裂模式选择的。
52.一种通过核转移克隆非人哺乳动物的改进方法，包括将非人哺乳动物供体细胞或非人哺乳动物供体细胞核导入与供体细胞或供体细胞核相同物种的非人哺乳动物的去核卵母细胞，形成核转移(NT)单位，将NT单位植入所述物种的替代母亲的子宫内，和允许该NT单位发育为克隆哺乳动物，其中改进包括利用预先筛选的分化哺乳动物细胞系作为细胞核，所述细胞核是根据成功的融合模式选择的。
53.一种通过核转移克隆非人哺乳动物的改进方法，包括将非人哺乳动物供体细胞或非人哺乳动物供体细胞核导入与供体细胞或供体细胞核相同物种的非人哺乳动物的去核卵母细胞，形成核转移(NT)单位，将NT单位植入所述物种的替代母亲的子宫内，和允许该NT单位发育为克隆哺乳动物，其中改进包括利用预先筛选的分化哺乳动物细胞系作为细胞核，所述细胞核是根据成功的卵裂和融合模式选择的。
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PB01 Publication
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