CN105263319A - 具有经修饰的糖基化的蛋白及其生产方法 - Google Patents
具有经修饰的糖基化的蛋白及其生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
在一个方面,本公开提供具有经修饰的糖基化的蛋白及其生产方法。在一个方面,本公开提供用于生产具有经修饰的糖基化的蛋白的转基因动物和细胞。在一些实施方案中,经修饰的糖基化是增加的唾液酸化。
Description
相关申请
本申请根据美国法典35§119(e)要求2013年2月13日提交的标题为“具有经修饰的糖基化的蛋白及其生产方法”的美国临时申请系列号61/764,502的权益,其全部公开通过提述完整并入本文。
技术领域
本公开涉及蛋白和蛋白生产方法的领域。
技术背景
蛋白在乳腺中的转基因产生允许大量蛋白的产生,包括治疗性蛋白。然而,在乳腺中产生的蛋白的糖基化模式有时候与血清产生的蛋白的糖基化模式不同。因此,需要修饰乳腺产生的蛋白的糖基化的方法。
发明简述
在一个方面,本公开提供具有经修饰的糖基化的蛋白及其生产方法。一方面,本公开提供用于生产具有经修饰的糖基化的蛋白的转基因动物和细胞。在一些实施方案中,所述经修饰的糖基化是增加的唾液酸化。
在一个方面,本公开提供生产具有经修饰的糖基化的蛋白的方法,所述方法包含提供转基因的哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达,其中所述转基因哺乳动物在乳腺中表达蛋白,并且从所述转基因哺乳动物的乳腺中收获所述蛋白。
在一个方面,本公开提供生产具有经修饰的糖基化的蛋白的方法,所述方法包括提供乳腺上皮细胞,其已经经过修饰以具有增加的唾液酸转移酶表达,其中所述乳腺上皮细胞表达蛋白,并且从所述乳腺上皮细胞中收获所述蛋白。
在本文提供的方法的一些实施方案中,与在尚未修饰为具有增加的唾液酸转移酶表达的转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中产生的蛋白相比,糖基化是经修饰的。在本文提供的方法的一些实施方案中,所述经修饰的糖基化是增加的唾液酸化。
在一个方面,本公开提供生产具有增加的唾液酸化的蛋白的方法,所述方法包含提供转基因的哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达,其中所述转基因哺乳动物在乳腺中表达蛋白,并且从所述转基因哺乳动物的乳腺中收获具有增加的唾液酸化的蛋白。
在本文提供的方法的一些实施方案中,与在尚未修饰为具有增加的唾液酸转移酶表达的转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中产生的蛋白相比,唾液酸化是增加的。
在本文提供的方法的一些实施方案中,所述具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白是人蛋白。在本文提供的方法的一些实施方案中,所述具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白是抗体。在本文提供的方法的一些实施方案中,所述具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白是抗凝血酶。在本文提供的方法的一些实施方案中,所述具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白是α-1抗胰蛋白酶。
在一个方面,本公开提供了根据本文中提供的任何方法生产的具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白。
在一个方面,本公开提供组合物,其包含根据本文提供的任意方法生产的具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白,所述组合物进一步包含乳。
在一个方面,本公开提供在乳腺中增加唾液酸转移酶活性的方法,所述方法包含提供转基因哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达。
在一个方面,本公开提供生产唾液酸转移酶的方法,所述方法包含提供转基因哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达,以及从所述转基因哺乳动物的乳腺中收获唾液酸转移酶。在本文提供的方法的一些实施方案中,所述方法进一步包括使用唾液酸转移酶来使蛋白唾液酸化。
在一个方面,本公开提供在乳腺中增加唾液酸转移酶活性的方法,所述方法包含生成转基因的哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达。在一个方面,本公开提供生产唾液酸转移酶的方法,所述方法包含生成转基因的哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达,并从所述转基因哺乳动物的乳腺中收获唾液酸转移酶。在本文提供的方法的一些实施方案中,所述方法进一步包含使用唾液酸转移酶来使蛋白唾液酸化。在一些实施方案中,将唾液酸转移酶置于与所述蛋白接触。
在一个方面,本公开提供根据本文提供的任意方法生产的唾液酸转移酶。
在一个方面,本公开提供组合物,其包含根据本文提供的任意方法生产的唾液酸转移酶,并进一步包含乳。
在本文提供的方法、蛋白、组合物、转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的一些实施方案中,转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞已经通过将编码唾液酸转移酶的核酸序列引入所述转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的基因组中来修饰。
在本文提供的方法、蛋白、组合物、转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的一些实施方案中,在转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中表达的蛋白由引入所述转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的基因组中的核酸序列编码。
在一个方面,本公开提供转基因哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达。在本文提供的转基因哺乳动物的一些实施方案中,所述转基因哺乳动物进一步在乳腺中表达外源性蛋白。在本文提供的转基因哺乳动物的一些实施方案中,所述外源性蛋白是人蛋白。在本文提供的转基因哺乳动物的一些实施方案中,外源性蛋白是抗体。在本文提供的转基因哺乳动物的一些实施方案中,所述外源性蛋白是抗凝血酶。在本文提供的转基因哺乳动物的一些实施方案中,所述外源性蛋白是α-1抗胰蛋白酶。
在一个方面,本公开提供乳腺上皮细胞,其已经经过修饰以具有增加的唾液酸转移酶表达。在本文提供的乳腺上皮细胞的一些实施方案中,所述乳腺上皮细胞进一步表达外源性蛋白。在本文提供的乳腺上皮细胞的一些实施方案中,所述外源性蛋白是人蛋白。在本文提供的乳腺上皮细胞的一些实施方案中,外源性蛋白是抗体。在本文提供的乳腺上皮细胞的一些实施方案中,所述外源性蛋白是抗凝血酶。在本文提供的乳腺上皮细胞的一些实施方案中,所述外源性蛋白是α-1抗胰蛋白酶。
在本文提供的方法、蛋白、组合物、转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的一些实施方案中,所述转基因哺乳动物是有蹄类动物。在一些实施方案中,所述有蹄类动物是山羊。
在本文提供的方法、蛋白、组合物、转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的一些实施方案中,唾液酸转移酶的表达在乳启动子的控制下。在一些实施方案中,所述乳启动子是山羊β酪蛋白启动子。
在本文提供的方法、蛋白、组合物、转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的一些实施方案中,所述唾液酸转移酶是β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶(beta-galactosamidealpha-2,6-sialyltranferase)。
在本文提供的方法、蛋白、组合物、转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的一些实施方案中,所述唾液酸转移酶是β-半乳糖酰胺α-2,3-唾液酸转移酶。
本发明的每种限制可以涵盖本发明的各种实施方案。因此,预期每种涉及任意一种元素或元素组合的本发明的限制可以包括在本发明的每个方面中。本发明在其应用上不限于以下描述中所列或图中显示的组分的构建和排列的细节。本发明能够有其它实施方案并能够以各种方式实践或实施。另外,本文使用的措辞和术语用于描述的目的,而不应理解为限制性的。
附图简述
图仅为说明性的,对于本公开的启用不是必须的。
图1示出了与人蛋白(SEQIDNO:2)比较(标示为“对象”的底部序列)ST6β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶GENEID:100861310ST6GAL1[山羊]的序列(SEQIDNO:1)(标示为“查询”的上部序列)。
图2提供了ST6β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶基因的图示。
图3提供了等电点聚焦(IEF)凝胶,显示具有增加的唾液酸水平的蛋白。图3A描述了两块凝胶:左侧组中的凝胶显示了pI标准梯(第1道),α-抗胰蛋白酶(AAT,第2道),以及使用商业化的唾液酸转移酶混合物处理的AAT(第3道)。右侧组中的凝胶描述了pI标准梯(第1道),使用唾液酸转移酶处理前的AAT(第2道),使用商业化的唾液酸转移酶混合物处理后的AAT(第3道),或使用从转基因山羊的乳中纯化的单个唾液酸转移酶处理后的AAT(第4和5道)。图3B描绘了凝胶,其示出了(AAT的一种唾液酸化形式)(第1道),使用从产生唾液酸转移酶的转基因山羊的乳处理的AAT(第2道和第7道),使用来自对照动物的乳处理的AAT(第3和8道),使用来自对照动物的乳和转基因产生的唾液酸转移酶处理的AAT(第4道),使用缓冲液和转基因产生的唾液酸转移酶处理的AAT(第5道),以及使用缓冲液处理的AAT(第6道)。
图4提供的图解示出了使用转基因产生的唾液酸转移酶在体外使α1抗胰蛋白酶唾液酸化。
图5示出了在乳腺中过表达唾液酸转移酶的转基因山羊(第2列)和对照动物(第1列)中乳铁蛋白的唾液酸化。
图6示出了在产生唾液酸转移酶和AAT两者(顶部图)和仅产生AAT(底部图)的山羊的乳腺中,AAT的“体内”唾液酸化。
图7示出了与血浆衍生的AAT(pdAAT)相比,ST3和ST6唾液酸化的转基因产生的AAT的药代动力学特性。
发明详述
在一个方面,本公开提供具有经修饰的糖基化的蛋白及其生产方法。在一个方面,本公开提供用于生产具有经修饰的糖基化的蛋白的转基因哺乳动物和细胞。
在一个方面,本公开提供具有增加的唾液酸化的蛋白及其生产方法。在一个方面,本公开提供用于生产具有增加的唾液酸化的蛋白的转基因哺乳动物和细胞,其中所述转基因哺乳动物或细胞经修饰以具有增加的唾液酸转移酶表达。
在转基因非人哺乳动物的乳腺中生产蛋白具有允许大量蛋白产生的优势。多种蛋白可以在乳腺中产生,并且在非人哺乳动物中转基因生产已经用于产生人治疗性蛋白,例如血清蛋白。转基因产生的血清蛋白的一个例子是一种转基因产生的抗凝血酶,其已经在美国和欧洲批准应用(见,例如,US5,843,705,US6,441,145,US7,019,193和US7,928,064)。
在乳腺中转基因产生的蛋白与“天然”蛋白具有相同的氨基酸序列,只要引入转基因哺乳动物中的编码所述蛋白的核酸与“天然”蛋白相同。然而,如果所述转基因蛋白是糖蛋白,那么与“天然”蛋白相比,在转基因非人哺乳动物的乳腺中产生的蛋白的糖基化模式可以有不同。例如,与从血清中分离的相同蛋白相比,乳腺产生的蛋白可以具有更低的唾液酸化水平(见例如Edmunds,T,etal.,Blood91(12),1998,4561-4571;Geun-CheolGiletal.,Glycobiology18(7),2008,526–539)。重组产生的蛋白和天然蛋白之间糖基化的差异并不是乳腺中产生的重组(转基因)蛋白所独有的。重组蛋白的几乎任何产生方法(例如在CHO细胞中产生)可以导致与天然蛋白相比的糖基化差异,这仅仅是因为细胞类型之间糖基化酶的不同可用度和活性。重组产生的蛋白的糖基化的差异可以是相关或不相关的。重组糖蛋白,甚至是治疗性蛋白,即使糖基化与天然蛋白不同,仍然可以具有所需的生物学特性。然而,在一些情况下,糖基化的差异可以是优选的,因为不同的糖基化可以给重组产生的蛋白提供与天然蛋白相比不同的功能特性(例如,更慢的清除速率)。
然而,在一些情况下,需要重组产生的蛋白的糖基化模式与天然蛋白(例如,存在于血流中的蛋白)的糖基化模式类似或相同。
多种方法可用于修饰重组产生的蛋白的糖基化。例如,可以将特定糖基化酶的抑制剂添加到产生蛋白的细胞,导致产生的蛋白的经修饰的糖基化。另外,糖基化的蛋白可以在产生后修饰,例如通过将所述蛋白与一种或多种糖基化酶温育和/或通过化学反应修饰糖基化。
在一个方面,本公开提供生产具有经修饰的糖基化的蛋白的方法。在一个方面,本公开提供转基因哺乳动物,用于生产具有经修饰的糖基化的蛋白。在一些实施方案中,所述转基因哺乳动物允许在乳腺中产生具有经修饰的糖基化的蛋白。
在一个方面,本公开提供生产具有经修饰的糖基化的蛋白的方法。在一个方面,本公开提供用于生产具有经修饰的糖基化的蛋白的细胞。在一些实施方案中,所述细胞是乳腺上皮细胞。
在一个方面,本公开提供具有经修饰的糖基化的蛋白。在一些实施方案中,所述蛋白是人蛋白。
在一个方面,本公开提供生产具有经修饰的糖基化的蛋白的方法,其包含提供或产生转基因哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达,其中所述转基因哺乳动物在乳腺中表达蛋白,并从所述转基因哺乳动物的乳腺中收获所述蛋白。在一些实施方案中,与尚未修饰为具有增加的唾液酸转移酶表达的转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中产生的蛋白相比,糖基化是经修饰的。在一些实施方案中,经修饰的糖基化是增加的唾液酸化。
在一个方面,本公开提供生产具有经修饰的糖基化的蛋白的方法,其包括提供或产生乳腺上皮细胞,其已经经过/被修饰以具有增加的唾液酸转移酶表达,其中乳腺上皮细胞表达蛋白,并从所述乳腺上皮细胞中收获所述蛋白。在一些实施方案中,与尚未修饰为具有增加的唾液酸转移酶表达的转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中产生的蛋白相比,糖基化是经修饰的。在一些实施方案中,所述经修饰的糖基化是增加的唾液酸化。
在一个方面,本公开提供生产具有增加的唾液酸化的蛋白的方法,所述方法包括提供转基因动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达,其中所述转基因哺乳动物在乳腺中表达蛋白,并从所述转基因哺乳动物的乳腺中收获具有增加的唾液酸化的蛋白。在一些实施方案中,与尚未修饰为具有增加的唾液酸转移酶表达的转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中产生的蛋白相比,唾液酸化是增加的。
如用于本文,具有经修饰的糖基化的蛋白指代具有源自在转基因哺乳动物的乳腺或乳腺上皮细胞中的生成的糖基化模式的蛋白,其中所述乳腺或乳腺上皮细胞具有增加的唾液酸转移酶表达。与不具有增加的唾液酸转移酶表达的转基因哺乳动物的乳腺或乳腺上皮细胞中产生的相同蛋白相比,糖基化是经修饰的。在一些实施方案中,所述经修饰的糖基化是增加的唾液酸化(例如,寡甘露糖链上唾液酸基团的数量增加)。在一些实施方案中,与不具有增加的唾液酸转移酶表达的转基因哺乳动物的乳腺或乳腺上皮细胞中产生的相同蛋白相比,蛋白的唾液酸化增加了10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,或100%或更多。可以通过例如使用HPLC/MS分析蛋白的糖基化来确定唾液酸化水平。
应当理解与不具有增加的唾液酸转移酶表达的转基因哺乳动物的乳腺或乳腺上皮细胞中产生的相同蛋白相比,唾液酸化的水平增加。如本文所定义的,具有增加的唾液酸化的蛋白与“天然蛋白”(例如,肝中产生的蛋白)相比可以仍然具有更低的唾液酸化水平。在一些实施方案中,与“天然蛋白”的唾液酸化水平相比,具有增加的唾液酸化的蛋白具有至少10%,至少20%,至少30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少90%,至少100%,至少200%,至少300%或更多的唾液酸化水平。如本文所示,在乳腺和乳腺上皮细胞中唾液酸转移酶的表达水平比在其它器官和细胞(例如,肝)中的表达水平低。因而,乳腺或乳腺上皮细胞中产生的糖蛋白通常会比其他器官或细胞(例如肝)中产生的相同蛋白具有更低的唾液酸化水平。即使所述乳腺或乳腺上皮细胞已经根据本文提供的方法修饰为具有增加的唾液酸转移酶表达,该水平可能是较低的。
应当进一步理解在具有增加的唾液酸转移酶表达的转基因哺乳动物的乳腺或乳腺上皮细胞中产生蛋白可以导致经修饰的糖基化,其不限于增加的唾液酸化。例如,增加的唾液酸转移酶可用度产生较短的寡糖链,因为它们被唾液酸封帽,从而阻止单糖的进一步添加。另外,例如,增加的唾液酸转移酶可用度可以引起糖基化底物的不同可用度,从而导致具有不同单糖模式的寡糖侧链的合成。
预期根据本文提供的方法,可以产生多种具有经修饰的糖基化(例如,增加的唾液酸化)的蛋白。在一些实施方案中,所述蛋白是外源性蛋白(例如,不在转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的基因组中天然存在的蛋白,例如在转基因山羊中的人蛋白)。在一些实施方案中,所述具有经修饰的糖基化的蛋白是人蛋白。根据本文提供的方法可以产生的具有经修饰的糖基化的蛋白包括抗体和在血液稳态中有活性的糖蛋白,例如抗凝血酶和α-抗胰蛋白酶。在一些实施方案中,所述“待修饰”的蛋白是在转基因哺乳动物的乳腺或乳腺上皮细胞中表达的蛋白,因为其由引入转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的基因组中的核酸序列编码。然而,在一些实施方案中,根据本文提供的方法产生的具有经修饰的糖基化的蛋白是在乳腺或乳腺上皮细胞中天然表达的蛋白,例如乳铁蛋白。
在一个方面,本公开提供在乳腺中增加唾液酸转移酶活性的方法,包含提供转基因哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达。在一个方面,本公开提供在乳腺上皮细胞中增加唾液酸转移酶活性的方法,包含提供或产生乳腺上皮细胞,其已经经过/被修饰以具有增加的唾液酸转移酶表达。如用于本文,增加的表达指代与未修饰的(“天然的”)乳腺或未修饰的乳腺上皮细胞相比表达增加。应当理解,并示于本文,未修饰的乳腺或未修饰的乳腺上皮细胞具有唾液酸转移酶的一些残留的表达。因此,在一些实施方案中,与乳腺或乳腺上皮细胞中唾液酸转移酶的天然表达相比,在乳腺或乳腺上皮细胞中增加的唾液酸转移酶表达为2x更高或更多,3x更高或更多,4x更高或更多,5x更高或更多,10x更高或更多,20x更高或更多,50x更高或更多,100x更高或更多,1000x更高或更多。
乳腺或乳腺上皮细胞可以通过多种方式修饰来增加唾液酸转移酶的表达。在一些实施方案中,通过上调一种或多种在基因组中天然存在的唾液酸转移酶的表达来增加表达。在一些实施方案中,通过对基因组中引入新的乳腺特异性启动子到一个或多个天然存在于基因组中的唾液酸转移酶的上游来增加表达。在一些实施方案中,已经通过向转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的基因组中引入编码唾液酸转移酶的核酸序列来修饰所述转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞。应当理解,经过修饰以表达唾液酸转移酶的转基因动物和乳腺上皮细胞还可以表达待修饰的蛋白(例如,外源性蛋白)。
唾液酸转移酶是酶的糖基转移酶组的成员。唾液酸转移酶是一种能够将唾液酸转移到寡糖上的酶,包括在糖蛋白上发现的寡糖。通常来说,唾液酸转移酶将唾液酸引入到复合糖(glycoconjugate)糖链的末端位置上。唾液酸转移酶根据其比活分类,通常分为三组:α-2,6-唾液酸转移酶,α-2,3-唾液酸转移酶,和α-2,8-唾液酸转移酶,它们分别能够通过α-2,6-,α-2,3-,和α-2,8-连接引入唾液酸基团(见,Harduin-Lepersetal.,Thehumansialyltransferasefamily,Biochimie83:727-737,2001)。
α-2,6-唾液酸转移酶进一步分类为将唾液酸附接到半乳糖上的唾液酸转移酶(“ST6GalI”,“β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶”或“ST6β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶1”),和将唾液酸附接到GalNAc上的唾液酸转移酶(“ST6GalNAcI-VI”)。β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶介导唾液酸残基转移到二糖上的末端Gal残基,所述二糖作为游离二糖找到,或作为N-连接或O-连接寡糖的末端单元找到。因此,在一些实施方案中,本公开提供允许N-连接的唾液酸化的方法和组合物。在一些实施方案中,本公开提供允许O-连接的唾液酸化的方法和组合物。
GalNAcα-2,6-唾液酸转移酶可以将唾液酸附接到非末端GalNAc残基。
α-2,3-唾液酸转移酶介导通过2,3连接将唾液酸转移到糖脂和糖蛋白上的末端Gal残基。
α-2,8-唾液酸转移酶通常涉及多聚唾液酸链的生成。
在一些实施方案中,所述唾液酸转移酶是β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶(“ST6Gal”),α-N-乙酰氨基半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶,β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶,N-乙酰氨基半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶(N-acetyllactosaminidealpha-2,3-sialyltransferase),α-N-乙酰基-神经糖苷α-2,8-唾液酸转移酶(alpha-N-acetyl-neuraminidealpha-2,8-sialyltransferase)、或乳糖神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶(lactosylceramidealpha-2,3-sialyltransferase)。在一些实施方案中,所述唾液酸转移酶是β-半乳糖酰胺α-2,3-唾液酸转移酶。人唾液酸转移酶的序列提供于例如Harduin-Lepersetal.,(Thehumansialyltransferasefamily,Biochimie83:727-737,2001)。
根据本发明的方法使用的唾液酸转移酶的物种通常与转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的物种相同。例如,山羊唾液酸转移酶引入转基因山羊或山羊乳腺上皮细胞中。然而,应当理解使用的唾液酸转移酶也可以来自于与转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞不同的物种。在一些实施方案中,引入转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中的唾液酸转移酶来自于与待修饰的蛋白相同的物种(例如,人唾液酸转移酶用于产生具有增加的唾液酸化的人抗体)。在一些实施方案中,所述转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞转基因表达来自相同物种的唾液酸转移酶和外源性蛋白(例如,山羊对于人唾液酸转移酶和人治疗性抗体两者是转基因的)。
在一个方面,本公开提供治疗炎症的方法和组合物。已证明静脉内施用的Ig的抗炎活性源自在其Fc连接的聚糖上具有末端α-2,6-唾液酸连接的IgG分子子集。通过向所有Fc连接的聚糖上引入末端α-2,6-唾液酸连接,静脉内施用的Ig群体的抗炎活性增加(见,例如Anthonyetal.,Identificationofareceptorrequiredfortheanti-inflammatoryactivityofIVIG,PNAS105:19571-19578,2008)。本文提供的方法允许在转基因动物的乳腺和乳腺上皮细胞中产生外源性蛋白,例如治疗性抗体,其具有增加的α-2,6-唾液酸化水平。因此,本文提供的方法允许在转基因动物的乳腺和乳腺上皮细胞中产生外源性蛋白,例如治疗性抗体,其具有增加的抗炎特性。
应当理解本文提供的增加治疗性抗体的抗炎特性的方法可以应用于任意治疗性抗体。因此,在一些实施方案中,本公开提供具有增加的抗炎活性的治疗性抗体。应当进一步理解提供用于产生具有增加的抗炎活性的抗体的方法可以应用于抗炎抗体,从而提供具有协同的作用模式(通过结合抗炎目标和通过其Fc连接的聚糖上的α-2,6-唾液酸连接)的抗炎抗体。用于抗炎治疗的治疗性抗体包括抗-TNFα抗体例如英利昔单抗(infliximab)/Remicade(Centocor),一种小鼠-人嵌合单克隆抗TNF抗体,阿达木单抗(adalimumab)/Humira(Abbott),一种全人抗TNF抗体,以及高利单抗(golimumab)/Simponi(Centocor)一种全人抗TNF抗体,基于抗体的治疗性TNF-α结合剂,包括依那西普(Etanercept)/Enbrel(Amgen),一种TNF受体的胞外域融合到Ig1的Fc区的融合蛋白,和赛妥珠单抗聚乙二醇(certolizumabpegol)/Cimzia(UCB),一种人源化单克隆抗TNF抗体的聚乙二醇化的Fab’片段。用于抗炎治疗的治疗性抗体也包括非TNF-α的抗细胞因子抗体例如抗IL5(例如,美泊利单抗(mepolizumab)),抗IL2(例如,达利珠单抗(daclizumab)),抗IL4和抗IL13抗体。用于抗炎治疗的治疗性抗体也包括抗IgE抗体(例如奥玛珠单抗(omalizumab)),抗CD62抗体,以及其它。
因此,在一个方面,本公开提供转基因动物(和乳腺上皮细胞),其在乳腺中产生外源性治疗性抗体方面是转基因的,并且在产生唾液酸转移酶方面是转基因的。由这些动物和细胞产生的治疗性抗体在其Fc连接的聚糖上具有增加的末端α-2,6-唾液酸连接水平,因此具有增加的抗炎活性(与在唾液酸转移酶表达方面不是转基因的转基因动物和乳腺细胞中产生的治疗性抗体相比)。在一些实施方案中,所述转基因动物(和乳腺上皮细胞)在乳腺中产生外源性抗炎抗体方面是转基因,并且在产生唾液酸转移酶方面是转基因的。在一些实施方案中,所述抗炎抗体是抗TNF-α抗体。在一些实施方案中,所述抗炎抗体是阿达木单抗。
在一个方面,本公开提供治疗受试者中炎症的方法,包含将本文提供的具有增加的抗炎特性的抗体施用到所述受试者。
在一个方面,本公开提供产生唾液酸转移酶的方法,包含提供或产生转基因哺乳动物,其已经经过/被修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达,并且从所述转基因哺乳动物的乳腺收获唾液酸转移酶。在一些实施方案中,通过向转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的基因组中引入编码唾液酸转移酶的核酸序列来修饰所述转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞。
在一些实施方案中,根据本文提供的方法产生的唾液酸转移酶用于使蛋白唾液酸化。
在一个方面,本公开提供唾液酸转移酶,其通过提供已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达的转基因哺乳动物,并且从所述转基因哺乳动物的乳腺中收获唾液酸转移酶来产生。在一些实施方案中,通过向转基因哺乳动物的基因组中引入编码唾液酸转移酶的核酸序列来修饰所述转基因哺乳动物。
在一些实施方案中,所述唾液酸转移酶在还包含乳的组合物中。
在一个方面,本公开提供如下产生的具有经修饰的糖基化的蛋白,即提供或产生已经经过/被修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达的转基因哺乳动物,其中所述转基因哺乳动物在乳腺中表达所述蛋白,并且从所述转基因哺乳动物的乳腺中收获具有经修饰的糖基化的蛋白。在一些实施方案中,已经通过向转基因哺乳动物细胞的基因组中引入编码唾液酸转移酶的核酸序列来修饰所述转基因哺乳动物。
在一些实施方案中,所述具有经修饰的糖基化的蛋白在还包含乳的组合物中。在一些实施方案中,所述具有经修饰的糖基化的蛋白是人蛋白。在一些实施方案中,所述具有经修饰的糖基化的蛋白是抗体,抗凝血酶或α抗胰蛋白酶。
转基因动物
在一个方面,本公开提供转基因哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达。在一些实施方案中,所述转基因哺乳动物是有蹄类动物。在一些实施方案中,所述有蹄类动物是山羊。
在一个方面,本公开提供乳腺上皮细胞,其已经经过修饰以具有增加的唾液酸转移酶表达。
在一些实施方案中,已经通过向转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的基因组中引入编码唾液酸转移酶的核酸序列来修饰所述转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞。在一些实施方案中,唾液酸转移酶的表达在乳启动子的控制下。在一些实施方案中,所述乳启动子是山羊β酪蛋白启动子。
在一个方面,本公开提供产生具有经修饰的糖基化的蛋白的方法,其中所述待修饰的蛋白表达于乳腺或乳腺上皮细胞中。在一些实施方案中,在转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中表达的蛋白由引入所述转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞基因组中的核酸编码。在一些实施方案中,唾液酸转移酶的表达在乳启动子的控制下。在一些实施方案中,所述乳启动子是山羊β酪蛋白启动子。
在一个方面,本公开提供转基因非人哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达。在一些实施方案中,所述在乳腺中具有增加的唾液酸表达的转基因非人哺乳动物还在乳腺中表达转基因蛋白(例如,外源性蛋白)。
在一个方面,本公开提供乳腺上皮细胞,其具有增加的唾液酸转移酶表达。在一些实施方案中,所述具有增加的唾液酸表达的乳腺上皮细胞还表达重组蛋白(例如,外源性蛋白)。
在一个方面,本公开提供生产唾液酸转移酶的方法,包含在转基因非人哺乳动物的乳中的表达,所述动物具有由核酸构建体编码的唾液酸转移酶。在一个方面,本公开提供生产具有经修饰的糖基化的蛋白的方法,包含在转基因非人哺乳动物的乳中的表达,所述转基因非人哺乳动物在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达和由核酸构建体编码的转基因蛋白(例如,外源性蛋白)。
在一些实施方案中,生产唾液酸转移酶或具有经修饰的糖基化的蛋白的方法包含:
(a)使用编码唾液酸转移酶和/或待修饰的蛋白的转基因DNA构建体转染非人哺乳动物细胞;
(b)选择其中所述转基因DNA构建体已经插入细胞的基因组中的细胞;和
(c)进行第一次核转移规程来产生非人转基因哺乳动物,其对于唾液酸转移酶和/或待修饰的蛋白是杂合的,并且能够在其乳中表达所述唾液酸转移酶和/或具有经修饰的糖基化的蛋白,和可选地
(d)重复一个或多个步骤来建立能够在乳腺中表达唾液酸转移酶和待修饰的蛋白两者的转基因哺乳动物。
在一个方面,本公开提供以下方法:
(a)提供非人转基因哺乳动物,其经工程化而表达唾液酸转移酶和待修饰的蛋白(例如,外源性蛋白)
(b)在所述非人转基因哺乳动物的乳中表达唾液酸转移酶和待修饰的蛋白;和
(c)分离乳中产生的具有经修饰的糖基化的蛋白。
也可以根据本领域已知的方法(见例如美国专利号5,945,577)产生转基因哺乳动物。适合用于转基因表达的哺乳动物包括但不限于山羊、绵羊、野牛、骆驼、母牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼(llama)。适合的哺乳动物还包括牛动物、山羊动物、绵羊动物和猪动物,其分别涉及牛、山羊、绵羊和猪的各个物种。适合的动物还包括有蹄类动物。如本文所使用的,“有蹄类动物”是或者指有蹄的,通常食草的四足哺乳动物,包括但不限于,绵羊、猪、山羊、牛和马。在一个实施方案中,所述哺乳动物通过使用分开的构建体共转染原代细胞来产生。这些细胞接着用于核转移。或者,如果使用显微注射来产生所述转基因哺乳动物,那么可以注射所述构建体。
在一个蛋白(例如,唾液酸转移酶)上转基因的哺乳动物可以与在待修饰的蛋白上转基因的哺乳动物杂交,从而产生在唾液酸转移酶和对于待修饰的蛋白两者上转基因的哺乳动物。
克隆将导致转基因哺乳动物的多样性:每一个能够产生唾液酸转移酶和其它感兴趣的基因构建体。产生方法包括使用克隆的哺乳动物和那些哺乳动物的后代。在一些实施方案中,所述克隆的动物是山羊动物,牛动物或小鼠。克隆也包含胎儿的核转移,核转移,组织和器官移植以及嵌合后代的建立。
克隆过程的一个步骤包含将细胞的基因组转移到去核的卵母细胞中,所述基因组含有编码唾液酸转移酶和/或待修饰的蛋白的转基因。如本文所使用的,“转基因”是指通过人为插入细胞或其祖先中,并成为从该细胞发育的动物的基因组的一部分的核酸分子的任意片段。此类转基因可以包括对于转基因哺乳动物而言部分或全部外源性(例如外来)的基因,或可以表示与哺乳动物的内源性基因具有同一性的基因。
合适的哺乳动物卵母细胞来源包括山羊、绵羊、母牛、猪、兔、豚鼠、小鼠、仓鼠、大鼠、非人灵长类,等等。优选地,卵母细胞从有蹄动物获得,并最优选是山羊或牛。卵母细胞的分离方法是本领域已知的。基本上,所述方法包括从哺乳动物(例如山羊)的卵巢或生殖道分离卵母细胞。一种现成的有蹄动物卵母细胞来源来自激素诱导的雌性动物。为了技术(如遗传工程、核转移和克隆)的成功使用,优选地,可以在体内使卵母细胞成熟,之后这些细胞可以用作核转移的受体细胞,以及之后它们由精细胞受精以发育成胚胎。中期第II阶段的卵母细胞(其已经在体内成熟)已经成功用于核转移技术中。基本上,在动情期开始后或注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)或类似激素后几小时,通过外科手术从非超排卵或超排卵的哺乳动物收集成熟的中期II卵母细胞。
一种用于预测在乳腺中表达的重组蛋白的数量和质量的工具是通过诱导泌乳(EbertKM,1994)。诱导的泌乳允许从转基因生产的早期阶段起而不是从怀孕导致的首次自然泌乳(其至少迟一年)起表达和分析蛋白质。泌乳的诱导可以使用激素或手动完成。
在一些实施方案中,根据本文提供的方法产生的唾液酸转移酶和/或具有经修饰的糖基化的蛋白的组合物进一步包含乳。
在一些实施方案中,本文提供的方法包括从转基因哺乳动物的乳中收获(例如,分离)唾液酸转移酶和/或具有经修饰的糖基化的蛋白的步骤(见,例如Pollocketal.,JournalofImmunologicalMethods,Volume231,Issues1-2,10December1999,Pages147-157)。
用于产生转基因哺乳动物的构建体
在一些实施方案中,为了通过核转移产生含有构建体(例如,编码唾液酸转移酶和/或待修饰的蛋白)的原代细胞系用于产生转基因哺乳动物(例如,山羊),可以将所述构建体转染到原代(山羊)皮肤上皮细胞中,将所述原代皮肤上皮细胞克隆扩增并完全表征来评估转基因拷贝数量,转基因结构完整性以及染色体整合位点。如本文使用的,“核转移”指代一种克隆方法,其中来自供体细胞的核移植到去核的卵母细胞中。
可以通过筛选来自选择的动物(例如有蹄类,啮齿类等)的基因组材料或逆向翻译(reverse-translated)的信使RNA的文库(从序列数据库例如NCBI、Genbank获得),或通过获得唾液酸转移酶和/或待修饰的蛋白的序列,来获得感兴趣蛋白(例如唾液酸转移酶)的编码序列。所述序列可以克隆到适合的质粒载体中,并在适合的宿主生物中放大,如大肠杆菌。在载体的扩增后,可以将DNA构建体切出,从载体的剩余部分纯化,并引入可以用于生成转基因哺乳动物的表达载体中。所述转基因哺乳动物将具有整合到它们的基因组中的所需的转基因蛋白。
在载体的扩增后,可以使用适合的5’和3’控制序列切出DNA构建体,从载体的剩下部分纯化出来并用于产生转基因哺乳动物,所述转基因哺乳动物在其基因组中整合了所需的非糖基化的相关转基因蛋白。相反地,对于一些载体,如酵母人工染色体(YACs),没有必需从载体移除组装的构建体;在这些情况中,扩增的载体可以直接用于制造转基因哺乳动物。编码序列可以可操作连接到控制序列,其使得编码序列能够在转基因非人哺乳动物的乳中表达。
适合用于在转基因哺乳动物的乳中指导产生唾液酸转移酶和/或待修饰的蛋白生成的DNA序列可以携带衍生于天然来源的乳蛋白的5’启动子区。该启动子因此在激素和组织特异性因子的控制下,并在泌乳中的乳腺组织中最有活性。在一些实施方案中,所述启动子是山羊β酪蛋白启动子。所述启动子可以可操作地连接到指导蛋白前导序列产生的DNA序列,所述蛋白前导序列指导转基因蛋白穿过乳腺上皮分泌到乳中。在一些实施方案中,可以添加3’序列来改善mRNA的稳定性,所述3’序列可以衍生于天然分泌的乳蛋白。
如本文所使用的,“前导序列”或“信号序列”是编码蛋白质分泌信号的核酸序列,当与编码转基因蛋白的下游核酸分子可操作地连接时指导分泌。所述前导序列可以是天然的人前导序列,人为来源的前导序列,或从与用于指导转基因编码序列转录的启动子相同的基因获得,或从通常从细胞(例如哺乳动物乳腺上皮细胞)分泌的另一种蛋白获得。
在一些实施方案中,所述启动子是乳特异性启动子。如本文所使用的,“乳特异性启动子”是在分泌蛋白到乳中的细胞(例如乳腺上皮细胞)中天然指导基因表达的启动子,包括例如酪蛋白启动子,例如α-酪蛋白启动子(例如αS-1酪蛋白启动子和αS2-酪蛋白启动子),β-酪蛋白启动子(例如山羊β酪蛋白基因启动子(DiTullio,BIOTECHNOLOGY10:74-77,1992),γ-酪蛋白启动子,κ-酪蛋白启动子,乳清酸性蛋白(WAP)启动子(Gortonetal.,BIOTECHNOLOGY5:1183-1187,1987),β-乳球蛋白启动子(Clarketal.,BIOTECHNOLOGY7:487-492,1989),以及α-乳清蛋白启动子(Soulieretal.,FEBSLETTS.297:13,1992)。乳腺组织中特异性活化的启动子也包括在这一定义中,如例如小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)的长末端重复序列(LTR)启动子。
如本文所使用的,编码序列和调控序列当它们以如下的方式连接时称为“可操作地连接”,所述方式使得将编码序列的表达或转录置于调控序列的影响或控制下。为了将编码序列翻译成为功能性的蛋白,所述编码序列可操作地连接到调控序列。如果对5’调控序列中启动子的诱导导致编码序列的转录,并且两个DNA序列之间连接的性质没有(1)导致移码突变的引入,(2)干扰启动子区指导编码区转录的能力,或(3)干扰对应的RNA转录物翻译成为蛋白的能力,则两个DNA序列称为可操作地连接。因此,如果启动子区能够实现DNA序列的转录,使得所得的转录物可以翻译成为所需的蛋白或多肽,则启动子区可操作地连接到编码序列。
如本文所使用的,“载体”可以是可以通过限制和连接接受期望的序列插入以在不同遗传环境之间转运或用于在宿主细胞中表达的众多核酸的任一个。载体通常由DNA组成,虽然也可用RNA载体。载体包括但不限于质粒和噬菌粒。克隆载体是能够在宿主细胞中复制,并且特征还在于一个或多个内切核酸酶限制性位点的载体,在所述内切核酸酶限制性位点处所述载体以可确定的方式剪切,并可以对该内切核酸酶限制性位点连接期望的DNA序列,使得新的重组载体保留其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况中,所需序列的复制可以随着质粒在宿主细菌中拷贝数量的增加发生多次,或者由于宿主通过有丝分裂复制每个宿主仅发生一次。在噬菌体的情况中,复制可以在溶解期期间活跃地发生,或在溶原性期期间被动地发生。表达载体是可以通过限制和连接接受期望的DNA序列插入,使得其可操作连接到调控序列并可以表达为RNA转录物的载体。载体可以进一步含有一个或多个标志物序列,其适合用于鉴定已经或尚未用所述载体转化或转染的细胞。标志物包括例如编码增加或减少对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白的基因,编码其活性可通过本领域已知的标准测定法检测的酶(例如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)的基因,以及明显影响转化或转染的细胞、宿主、集落或斑块的表型的基因。优选的载体是那些能够自主复制并表达其可操作地连接的DNA片段中存在的结构基因产物的载体。
本发明通过以下实施例进一步阐述,其决不应解释为进一步的限制。贯穿本申请所引用的所有参考文献(包括文献参考文献、公告的专利、公布的专利申请,以及共同待批的专利申请)的全部内容在此通过提述并入本文,尤其是对于在上文中引用的教导。然而,对任意参考文献的引用不意图承认该参考文献是现有技术。
实施例
实施例1
测定乳腺中唾液酸转移酶的水平
乳腺中产生的蛋白的不完全唾液酸化的一个原因可以是与通常分泌血清蛋白的肝中发现的唾液酸转移酶水平相比,乳腺中唾液酸转移酶的水平的限制。为了评估这一假说,从来自山羊肝的cDNA文库中分离了2,6唾液酸转移酶基因。该cDNA在Northern印迹中用作探针来测定乳腺相对肝中的基因表达水平。通过Northern印迹,在乳腺中发现的唾液酸转移酶表达的水平约为肝中发现的水平的百分之一,提示乳腺中的唾液酸化能力的限制。
从山羊肝克隆ST6Gal1
使用从山羊肝分离的RNA构建了cDNA文库。人ST6的已知序列用于设计能够扩增山羊序列的PCR引物。在RT-PCR反应后,分离了编码2,6唾液酸转移酶(ST6Gal1)的全长cDNA。山羊ST6Gal1的蛋白序列与人蛋白的序列相当(见图1:GENEID:100861310ST6GAL1,ST6β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶1[山羊];图1描述了ST6Gal1的山羊(顶部:“查询”;SEQIDNO:1)和人序列(底部:“对象”,SEQIDNO:2))。
编码2,6唾液酸转移酶的基因连接到山羊β酪蛋白表达载体,产生质粒BC2541ST6Gal1(见图2)。该载体包括山羊β酪蛋白启动子来对山羊乳腺指导连接基因的表达。
转基因山羊的产生
BC2541ST6Gal1转基因用于产生在其乳腺中表达ST6Gal1的转基因山羊。所得山羊在它们的基因组中携带β酪蛋白唾液酸转移酶。如下文所示,所述转基因山羊在它们的乳中产生唾液酸转移酶。
在乳腺中产生了唾液酸转移酶(“体外”活性)
使用测试唾液酸转移酶的酶促活性的测定法,证实了转基因山羊的乳腺中的唾液酸转移酶的存在。即,唾液酸转移酶可以使N-连接复合糖上的暴露的1,4半乳糖唾液酸化。
重组α-1抗胰蛋白酶(AAT)当产生于转基因山羊的乳中时为50%唾液酸化的,而从血清分离的AAT为几乎完全唾液酸化的(例如,市售的)。在转基因山羊的乳中产生的重组α-1抗胰蛋白酶作为靶标用于使用转基因山羊的乳中产生的唾液酸转移酶的唾液酸化反应。来自在乳腺中表达唾液酸转移酶的山羊的乳以及核苷酸糖CMP-唾液酸与唾液酸化不足的AAT孵育。另外,市售的唾液酸转移酶用作对照。通过在等点聚焦凝胶(IRF凝胶)上运行孵育的ATT,确认了孵育后唾液酸添加到唾液酸化不足的AAT。蛋白(AAT)上唾液酸化水平的增加导致较低的等电点(pI),导致该蛋白在凝胶上运行较慢。预期重组AAT(其为50%唾液酸化)比阳性对照(从血清分离的完全唾液酸化的AAT)在凝胶上运行更高。
图3A的左边组示出了唾液酸化实验,其比较AAT(第2道)和使用市售的唾液酸转移酶的混合物处理的唾液酸化不足的AAT(第3道)。正如预期的,经受唾液酸转移酶的AAT(第3道)在IEF凝胶上比没有经历唾液酸转移酶的AAT(第2道)运行更低。
图3A的右边组中描述了相似的结果。使用唾液酸转移酶混合物(第3道)或来自乳的唾液酸转移酶的纯化批次(第4和5道)处理唾液酸化不足的AAT与未处理的唾液酸化不足的AAT(第2道)相比导致唾液酸化水平的增加以及向下的移动。
图3B描述的凝胶示出了一种唾液酸化形式的AAT(第1道),使用来自产生唾液酸转移酶的转基因山羊的乳处理的AAT(第2道和第7道),使用来自对照动物的乳处理的AAT(第3道和第8道),使用来自对照动物的乳和转基因产生的唾液酸转移酶处理的AAT(第4道),使用缓冲液和转基因产生的唾液酸转移酶处理的AAT(第5道),以及使用缓冲液处理的AAT(第6道)。
因此,如图3所示,转基因山羊的乳中产生的唾液酸转移酶ST6Gal1“在体外”是有活性的,并能使唾液酸化不足的AAT唾液酸化到血浆衍生的完全唾液酸化的AAT的水平。
使用转基因产生的唾液酸转移酶处理的AAT的糖基化模式
从转基因动物的乳中纯化转基因产生的唾液酸转移酶,并用于使目标蛋白:唾液酸化不足的AAT唾液酸化。将唾液酸化不足的AAT经受唾液酸转移酶后,评价AAT的糖基化来确认唾液酸是否添加到AAT糖基化侧链的暴露的Gal残基。
如图4所示,使用从产生唾液酸转移酶的转基因山羊的乳收获的唾液酸转移酶进行“体外”唾液酸化将AAT上的大多数单唾液酸化的双触角复合糖转化为双唾液酸化的形式。下方的图示出了唾液酸化前的AAT而上方的图示出了经受唾液酸化之后的AAT。
乳腺中的唾液酸转移酶活性(“体内”)
对在乳腺中转基因产生的唾液酸转移酶评价其增加也由乳腺分泌的重组蛋白的唾液酸化水平的能力。
为了测试ST6Gal1在乳腺是否有活性,评价了内源性蛋白的唾液酸化水平。乳铁蛋白是一种内源性乳产生的蛋白,其携带三个N-连接的糖基化位点。从携带ST6Gal1基因并在其乳中产生唾液酸转移酶的山羊乳中分离了乳铁蛋白(图5,第2列)。也从对照动物分离了乳铁蛋白,该对照动物不携带ST6Gal1基因(图5,第1列)。两种乳铁蛋白样品连同重复制备物使用N-聚糖酶处理,用2-氨基苯甲酸(2-AA)衍生化,并通过HILICLC-MS/(MS)用荧光检测分析糖基化模式。结果(图5)表明在转基因哺乳动物中,唾液酸转移酶的活性增加,因为乳铁蛋白上双唾液酸化的N-连接的糖的量从总糖的25%增加到34%。双唾液酸化的增加与单唾液酸化的糖的转化相关,这从对照中的18%减少到表达唾液酸转移酶的山羊中的5%。因此,乳腺中产生的ST6Gal1将大多数唾液酸化不足的单-唾液酸化的N-连接的糖转化为双-唾液酸化的形式。因此,ST6Gal1唾液酸转移酶在乳腺中有活性,并能够在乳腺中将唾液酸添加到糖蛋白。
转基因产生的蛋白的唾液酸化
乳腺中唾液酸转移酶的表达增加应该导致也在乳腺中产生的重组蛋白的唾液酸化的增加。如上文所示,ST6Gal1当分泌到乳中时在“体外”对AAT有活性。AAT也用于评价转基因表达的唾液酸转移酶使转基因表达的蛋白唾液酸化的能力。ST6Gal1和AAT两者在相同乳腺中共表达。这通过将携带AAT的山羊品系与携带ST6Gal1的山羊杂交,产生携带这两种构建体的哺乳动物来完成。携带用于在乳中表达AAT的基因构建体(BC30)的雄性山羊与超排卵的ST6Gal1雌性杂交。分离来自此杂交的胚胎并植入养育母本中。26只动物通过这一规程出生。在基因测试后,鉴定了2只携带AAT和ST6Gal1基因构建体的雌性。另外,鉴定了4只仅携带AAT构建体的雌性,提供阴性对照。
在3个月龄时,对携带ST6Gal和AAT基因两者的动物(以及对照动物)诱导泌乳。从携带ST6Gal1的动物以及对照动物分离AAT。分析蛋白的糖基化,包括唾液酸含量。如图6所示,对照AAT动物上的双触角N-连接的糖为50%双唾液酸化的(底部图)。然而,从携带ST6Gal1构建体的品系分离的AAT为完全唾液酸化的。AAT上唾液酸水平的增加提示过表达的唾液酸转移酶提高乳腺表达的重组蛋白唾液酸化的能力。
实施例2
测定乳腺中2,3唾液酸转移酶的水平
从来自山羊肝的cDNA文库分离了2,3唾液酸转移酶的基因。该基因文库在Northern印迹中用作探针来测定乳腺相对于肝中所述基因的表达水平。与肝相比在乳腺中2,3唾液酸转移酶表达的减少提示乳腺中2,3唾液酸转移酶能力的限制。
从山羊肝中克隆ST2Gal1
使用从山羊肝分离的RNA构建了cDNA文库。使用人ST3的序列来设计能够扩增山羊序列的PCR引物。RT-RCR反应后,分离编码2,3唾液酸转移酶(ST3Gal1)的全长cDNA。编码2,3唾液酸转移酶的基因连接到山羊β酪蛋白表达载体来产生质粒(如BC2541ST3Gal1),其包括山羊β-酪蛋白启动子来指导连接的基因在乳腺中表达。
转基因山羊的产生
使用含有ST3Gal1的转基因来产生在其乳腺中表达ST3Gal1的转基因山羊。所得的山羊在它们的基因组中携带β-酪蛋白唾液酸转移酶基因,并在它们的乳中产生唾液酸转移酶。
在乳腺中产生唾液酸转移酶(“体外”活性)
使用测试唾液酸转移酶的酶促活性的测定法,测定了转基因山羊的乳腺中唾液酸转移酶的存在。例如,唾液酸转移酶可以使N-连接的复合糖上暴露的1,4半乳糖唾液酸化。
转基因山羊的乳中产生的重组α-1抗胰蛋白酶作为靶标以用转基因山羊的乳中产生的2,3唾液酸转移酶进行唾液酸化反应。来自在乳腺中表达唾液酸转移酶的山羊的乳以及核苷酸糖CMP-唾液酸与唾液酸化不足的AAT孵育。另外,市售的唾液酸转移酶用作对照。通过在等点聚焦凝胶(IRF凝胶)上运行孵育的ATT确认孵育后唾液酸添加到唾液酸化不足的AAT。蛋白(AAT)上唾液酸化水平的增加导致较低的等电点(pI),导致该蛋白在凝胶上运行较慢。预期重组AAT(其为50%唾液酸化的)比阳性对照(从血清分离的完全唾液酸化的AAT)在凝胶上运行更高。
使用转基因产生的ST3处理的AAT的糖基化模式
从转基因动物的乳中纯化转基因产生的2,3唾液酸转移酶,并用于使唾液酸化不足的AAT唾液酸化。在唾液酸化不足的AAT经受唾液酸转移酶后,评价AAT的糖基化来确认唾液酸是否添加到AAT的糖基化侧链的暴露的Gal残基。
唾液酸转移酶在乳腺中的活性(“体内”)
对在乳腺中转基因产生的2,3唾液酸转移酶评价其增加也由乳腺分泌的重组蛋白,或由乳腺分泌的内源性蛋白(例如,乳铁蛋白)的唾液酸化水平的能力。
转基因产生的蛋白的唾液酸化
乳腺中唾液酸转移酶的增加表达可以导致也在乳腺中产生的重组蛋白的唾液酸化的增加。AAT用于评价转基因表达的唾液酸转移酶使转基因表达的蛋白唾液酸化的能力。ST3Gal1和AAT两者在相同乳腺中共表达。这通过将携带AAT的山羊品系与携带ST3Gal1的山羊杂交,产生携带这两种构建体的哺乳动物来完成。携带用于在乳中表达AAT的基因构建体(BC30)的雄性山羊与超排卵的ST6Gal1雌性杂交。分离来自此杂交的胚胎并植入养育母本中。测试后代并鉴定那些携带AAT和ST3Gal1基因构建体两者的后代。仅携带AAT构建体的其它后代可以用作阴性对照。
在3月龄时,对携带ST3Gal和AAT基因两者的动物(以及对照动物)诱导泌乳。从携带ST3Gal1的动物以及对照动物分离AAT,并可以分析蛋白的糖基化,包括唾液酸含量。
实施例3:药代动力学特征
如图7中所示,通过在25小时的时间段里分析AAT浓度的演变,将已经通过ST3或ST6唾液酸化的转基因产生的AAT的药代动力学特征与血浆来源的AAT(pdAAT)比较。
图7表明通过ST3或ST6唾液酸化的AAT具有比无唾液酸化的AAT(pdAAT)更好的半衰期。
等同方案
前述的书面说明书认为足以使本领域的技术人员能够实施本发明。本发明的范围不限制于提供的实施例,因为实施例旨在说明本发明的某些方面和实施方案。其它功能上等同的实施方案都在本发明的范围之内。根据前述的说明书,除了本文所示和所描述的那些外,对本发明的各种修改将对于本领域的技术人员变得明显,并落在所附的权利要求的范围内。本发明的优点和目的不必要包含在本发明的每个实施方案中。
Claims (38)
1.一种生产具有经修饰的糖基化的蛋白的方法,所述方法包括:
提供转基因哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达,
其中所述转基因哺乳动物在乳腺中表达蛋白,并
从所述转基因哺乳动物的乳腺中收获所述蛋白。
2.一种生产具有经修饰的糖基化的蛋白的方法,所述方法包括:
提供乳腺上皮细胞,其已经经过修饰以具有增加的唾液酸转移酶表达,
其中所述乳腺上皮细胞表达蛋白,并
从所述乳腺上皮细胞中收获所述蛋白。
3.权利要求1或权利要求2的方法,其中与尚未修饰为具有增加的唾液酸转移酶表达的转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中产生的蛋白相比,所述糖基化是经修饰的。
4.权利要求1-3任一项的方法,其中所述经修饰的糖基化是增加的唾液酸化。
5.一种生产具有增加的唾液酸化的蛋白的方法,所述方法包括:
提供转基因哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达,
其中所述转基因哺乳动物在所述乳腺中表达蛋白,并
从所述转基因哺乳动物的乳腺中收获具有增加的唾液酸化的蛋白。
6.权利要求4或权利要求5的方法,其中与尚未修饰为具有增加的唾液酸转移酶表达的转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中产生的蛋白相比,所述唾液酸化是增加的。
7.权利要求1-6任一项的方法,其中所述具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白是人蛋白。
8.权利要求1-7任一项的方法,其中所述具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白是抗体。
9.权利要求1-7任一项的方法,其中所述具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白是抗凝血酶。
10.权利要求1-7任一项的方法,其中所述具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白是α-1抗胰蛋白酶。
11.根据权利要求1-10任一项的方法生产的具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白。
12.一种组合物,其包含权利要求11的具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白,进一步包含乳。
13.一种增加乳腺中的唾液酸转移酶活性的方法,所述方法包括:
提供转基因哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达。
14.一种生产唾液酸转移酶的方法,所述方法包括:
提供转基因哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达,并
从所述转基因哺乳动物的乳腺中收获所述唾液酸转移酶。
15.权利要求14的方法,其进一步包括使用所述唾液酸转移酶使蛋白唾液酸化。
16.权利要求15的方法,其中将所述唾液酸转移酶置于与所述蛋白接触。
17.根据权利要求15或16的方法生产的唾液酸转移酶。
18.一种组合物,其包含权利要求17的唾液酸转移酶,进一步包含乳。
19.根据前述权利要求任一项的方法,其中已经通过将编码唾液酸转移酶的核酸序列引入转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的基因组中来修饰所述转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞。
20.根据前述权利要求任一项的方法,其中在所述转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中表达的蛋白由引入到所述转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的基因组中的核酸序列编码。
21.一种转基因哺乳动物,其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达。
22.权利要求21的转基因哺乳动物,其中所述转基因动物在乳腺中进一步表达外源性蛋白。
23.权利要求22的转基因哺乳动物,其中所述外源性蛋白是人蛋白。
24.权利要求22或权利要求23的转基因哺乳动物,其中所述外源性蛋白是抗体。
25.权利要求22或权利要求23的转基因哺乳动物,其中所述外源性蛋白是抗凝血酶。
26.权利要求22或权利要求23的转基因哺乳动物,其中所述外源性蛋白是α-1抗胰蛋白酶。
27.一种乳腺上皮细胞,其已经经过修饰以具有增加的唾液酸转移酶表达。
28.权利要求27的乳腺上皮细胞,其中所述乳腺上皮细胞进一步表达外源性蛋白。
29.权利要求28的乳腺上皮细胞,其中所述外源性蛋白是人蛋白。
30.权利要求28或权利要求29的乳腺上皮细胞,其中所述外源性蛋白是抗体。
31.权利要求28或权利要求29的乳腺上皮细胞,其中所述外源性蛋白是抗凝血酶。
32.权利要求28或权利要求29的乳腺上皮细胞,其中所述外源性蛋白是α-1抗胰蛋白酶。
33.前述权利要求任一项的方法,其中所述转基因哺乳动物是有蹄类动物。
34.权利要求33的方法,其中所述有蹄类动物是山羊。
35.前述权利要求任一项的方法、细胞或哺乳动物,其中唾液酸转移酶和/或所述蛋白的表达在乳启动子的控制下。
36.权利要求35的方法、细胞或哺乳动物,其中所述乳启动子是山羊β酪蛋白启动子。
37.前述权利要求任一项的方法、细胞或哺乳动物,其中所述唾液酸转移酶是β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶。
38.前述权利要求任一项的方法、细胞或哺乳动物,其中所述唾液酸转移酶是β-半乳糖酰胺α-2,3-唾液酸转移酶。
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