CN1525977A - 人血清白蛋白的纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从生产人血清白蛋白(hSA)的宿主细胞的内源血清白蛋白中纯化hSA的方法。该方法包括提供含hSA及宿主细胞的血清白蛋白的样品，将样品上样到亲和柱上，该柱结合hSA的亲和力大于其结合宿主细胞血清白蛋白的亲和力，从亲和柱上洗脱结合的hSA，并将洗脱的hSA结晶，本发明还涉及包含由本发明的方法生产的hSA的组合物。

Description

人血清白蛋白的纯化
相关申请
本申请要求于2001年6月13日提交的专利USSN 60/297,884的优先权。此处该专利作为参考文献引用。
发明背景
在血液中，血清白蛋白是含量最多的蛋白质之一。血液中它们具有例如脂肪酸之类疏水分子的载体的作用，并且与有机分子结合将其隔离直至可将其清除，起到澄清剂的作用。由于它们在血液中含量丰富，血清白蛋白是决定血液性质，尤其是血清性质的主要决定因素。
第二次世界大战中，人们认识到可以将hSA(人血清白蛋白)配制成生理性适用溶液来制成人类血液的代用品(人造血液)，用来补偿创伤或外科手术造成的失血。参见Cohn et al.(1946)，J.Amer.Chem.Soc.68：459-75。实际上，由于人体可以迅速地补充丧失的血细胞并且不会出现血型相容性的问题，大多数情况下这种人造血液都是理想的血液替代品。此外，hSA溶液比真正的血液具有远远更长的保质期。然而由于血液中hSA的含量高，即使生产极少量的人造血液也需要高度纯化的大量hSA。
转基因动物中hSA的重组生产非常吸引人，因为可以迅速从中获得大量的蛋白质，因此就有可能大批量地生产人造血液。令人遗憾的是，重组生产的hSA不能直接使用：首先除了将hSA从宿主样品中存在的其他分子如脂类、小分子物质、蛋白质和病毒病原体中提纯，还必须从宿主动物的血清白蛋白中将其纯化。其次，目前从转基因动物源获得的样品中着手生产人造血液级hSA的工序即费时又昂贵。至少部分原因是适合作转基因宿主的动物中存在与之高度相似的血清白蛋白，将hSA从中分离存在相当难度。因而尽管在转基因动物中重组生产hSA具有产生大量纯净hSA和人造血液的潜力，其可行性受到经济因素的限制。
发明概述
本发明部分基于一种可区分人血清白蛋白(hSA)和宿主细胞血清白蛋白的分离方法的发现，宿主细胞可以是例如来自于转基因乳制品动物的转基因宿主细胞。hSA的转基因生产会形成同时含有hSA和动物内源血清白蛋白的产品。然而，通常必须获得纯化的hSA，其中不含杂质，尤其是非人类动物来源的血清白蛋白。从获自于转基因动物，比如转基因乳制品动物的样品中将hSA纯化，这个过程可能由于此类动物血清白蛋白和hSA高度的同源性而复杂化。举例来说hSA和牛血清白蛋白(BSA)非常相似。令人惊喜的是已发现使用一种方案可以适当和有效地从宿主细胞血清白蛋白中纯化转基因生产的hSA，该方案包括：澄清含有hSA和内源血清白蛋白的样品，用选择性结合hSA的树脂进行亲和层析，待蛋白质从亲和柱上洗脱后将hSA结晶。
因此，从一方面来看，本发明的特点是一种从含有hSA和宿主血清白蛋白的样品中纯化人血清白蛋白(hSA)的方法，该方法包括：
从宿主细胞获得含有hSA和宿主血清白蛋白的样品；
上样到结合hSA的亲和柱，例如，与宿主血清白蛋白相比该柱与hSA有更强的结合亲和力；
将结合的hSA从亲和柱上洗脱下来；
并且将洗脱的hSA结晶。
一些实施方案中样品获自于转基因非人类动物。该动物可为哺乳动物，比如有蹄类动物(如：牛，山羊、或绵羊)、猪、小鼠或者兔。样品可以从例如哺乳动物的乳汁、血液或者组织(例如组织匀浆)中获得。其他实施方案中，样品从鸟类如鸡、火鸡、鸭子、野鸡或者鸵鸟中获得。举例来说，样品可以获自鸟类的卵、血液或者组织(例如组织匀浆)。优选实施方案中，所选动物为哺乳动物，且样品为乳汁。
其他实施方案中，样品为培养的细胞如哺乳动物细胞、鸟类细胞、鱼类细胞或者昆虫细胞的培养基。一些实施方案中，培养的细胞为转基因细胞。举例来说，培养的细胞可包含转基因，该转基因包含在合适调控元件控制下的编码hSA的核酸序列。
一些实施方案中，本发明方法中使用的样品为通过例如离心之类标准脱脂质程序进行脱脂的乳汁。
在相关实施方案中，本发明方法中使用的乳汁(例如脱脂质乳汁)样品经过了除酪蛋白处理。举例来说，通过降低乳汁的pH值形成包含酪蛋白的重沉淀物可以将乳汁中酪蛋白的水平降至最低。在优选实施方案中，通过加酸将乳汁的pH值降低，例如向乳汁中加稀乙酸之类的稀酸。在优选实施方案中乳汁的pH值降至约4.2至4.8。在一些实施方案中，通过过滤除去乳汁中酪蛋白的重沉淀物，例如使用切向流微过滤法。其他实施方案中，从乳汁中通过离心除去酪蛋白的重沉淀物。在另一些其他实施方案中，不使用酸性沉淀酪蛋白，通过切向流过滤将酪蛋白从样品中除去。
一些实施方案中，本发明方法中使用的样品可以是已除净酪蛋白的脱脂质乳汁。此处该样品称为“澄清的乳汁样品”。
澄清的hSA样品可以进行亲和层析或者在此之前再进行一道或更多道纯化程序。一些实施方案中纯化的hSA样品存在于适于亲和柱上样的盐缓冲液中。例如，盐缓冲液可以包含例如pH为8.5的250mM NaCl以及低浓度的非离子去垢剂。
一些实施方案中，本发明方法包括使用与hSA样品(例如澄清的hSA样品)中的hSA蛋白质结合的亲和柱，其中亲和柱包含合成树脂。在Prometic Biosciences Blue SA柱中发现适于结合hSA的人造树脂，该柱使用染料活性蓝2(Reactive Blue 2)的修饰体作为亲和配基。在优选实施方案中，亲和柱，例如合成树脂亲和柱，基本不和hSA样品中多数甚至大多数非hSA蛋白质结合(例如乳清蛋白质)。在特别优选的实施方案中，亲和柱，例如合成树脂亲和柱，与非人血清白蛋白的亲和力，例如牛血清白蛋白之类的哺乳动物血清白蛋白，比其与hSA的亲和力低。
在相关实施方案中，本发明方法包括使用与hSA样品(例如澄清hSA样品)中hSA蛋白质结合的亲和柱，其中亲和柱配基和hSA间的作用可被脂肪酸分子破坏。优选的实施方案中，脂肪酸分子为辛酸盐。
一些实施方案中，本发明方法包括将hSA样品(例如澄清hSA样品)加到柱上后对亲和柱进行清洗。优选实施方案中，清洗缓冲液与上样缓冲液相同。合适的清洗缓冲液包含例如pH为8.5的250mM NaCl以及低浓度的非离子去垢剂。
一些实施方案中，本发明方法包括使用洗脱缓冲液将与亲和柱结合的hSA蛋白质洗脱，从而制得亲和纯化的hSA样品，其中洗脱缓冲液基本不引起与亲和柱结合的非血清白蛋白蛋白质的洗脱。使用Prometic Biosciences Blue SA柱时，合适的缓冲液可由磷酸盐缓冲液和与亲和柱上亲和配基竞争结合hSA的脂肪酸分子组成。一些实施方案中，洗脱缓冲液包含约pH为6.0的20-50mM磷酸盐溶液。一些实施方案中，洗脱缓冲液包含脂肪酸辛酸盐，如浓度约为20mM。
一些实施方案中，本发明方法包括将亲和纯化所得hSA样品再上样到亲和柱，清洗结合hSA的亲和柱并且洗脱结合在亲和柱上的hSA，从而获得两次亲和纯化的hSA样品。在其他一些实施方案中，亲和纯化后的hSA样品可以不止一次再上样到亲和柱，例如三次纯化的hSA样品。
之后亲和纯化的hSA样品可以进行结晶或者在结晶之前再进行一道或多道额外的纯化程序。
一些实施方案中，本发明方法包括向样品中加入结晶剂将亲和纯化的hSA样品(例如通过一次或两次亲和纯化的hSA样品)结晶。许多结晶剂都可以加入hSA溶液作为结晶引发剂，其包括聚乙二醇(PEG)、硫酸铵和/或磷酸盐。优选的实施方案中，结晶剂为磷酸盐溶液。在一项优选的实施方案中，作为结晶剂的磷酸盐加入样品中至最终浓度为2.7至2.8M磷酸盐。一些实施方案中，结晶剂中还包含与hSA结合的脂肪酸分子，例如辛酸盐。优选方案中，通过例如过滤的方法将结晶的hSA蛋白质从结晶溶液(即母液)中分离出来，用缓冲液清洗，并且用适当的溶剂(例如水)再次溶解。其他实施方案中，结晶的hSA蛋白质可以通过例如使用一种溶剂或风干的方法进行干燥。干燥后的hSA蛋白质晶体便可进行储存，比如在室温储存以长期使用，并可随意运输。一些实施方案中，干燥后的结晶hSA可再溶于适当的溶剂(例如水)。
另一方面，本发明的特点是一种将hSA从其他不同物种的血清白蛋白相分离的方法。该方法包括：
获得还含有其他物种血清白蛋白的hSA样品；
将hSA样品上样到亲和柱，相对于与其他物种血清白蛋白的结合，该亲和柱对hSA具有更高的结合亲和力；
将hSA从亲和柱上洗脱；
并且将洗脱的hSA进行结晶。
一些实施方案中，样品从非人类动物上获得。该动物可以是哺乳动物，例如有蹄类动物(例如牛、山羊或绵羊)、猪或者兔。样品可以从例如哺乳动物的乳汁、血液或者组织(例如组织匀浆)中获得。其他实施方案中，样品从鸟类如鸡、火鸡、鸭子、野鸡或者鸵鸟中获得。举例来说，样品可获自鸟类的卵、血液或者组织(例如组织匀浆)。优选实施方案中，该动物为转基因动物。优选实施方案中，该动物为哺乳动物，且样品为乳汁，例如从转基因哺乳动物中获得的乳汁。
其他实施方案中，样品为培养的细胞如哺乳动物细胞、鸟类细胞、鱼类细胞或者昆虫细胞的培养基。在一些实施方案中，培养的细胞是转基因细胞。举例来说，培养的细胞可含有在合适调控元件控制下的编码hSA的核酸序列的转基因。
一些实施方案中，本发明方法中使用的样品为通过例如离心之类标准脱脂质程序已除去脂质的乳汁。
在相关实施方案中，本发明方法中使用的样品为经过除酪蛋白处理的乳汁(例如脱脂乳汁)。举例来说，通过降低乳汁的pH值形成包含酪蛋白的重沉淀物可以将乳汁中酪蛋白去除。在优选实施方案中，通过加酸将乳汁的pH值降低，例如向乳汁中加稀乙酸之类的稀酸。在优选实施方案中乳汁的pH值降至约4.2至4.8。在一些实施方案中，从乳汁中通过过滤除去酪蛋白的重沉淀物，例如使用切向流微过滤法。其他实施方案中，从乳汁中通过离心除去酪蛋白的重沉淀物。在另一些其他实施方案中，不使用酸性沉淀酪蛋白，通过切向流过滤将酪蛋白从样品中除去。
一些实施方案中，本发明方法中使用的样品可以是已去除酪蛋白的脱脂质乳汁。此处该样品称为“澄清的乳汁样品”。
优选的实施方案中，将hSA样品上样至亲和柱，从亲和柱上洗脱和/或按此处描述将其结晶。
另一方面，该发明包括一种包含hSA和非人类哺乳动物血清白蛋白的组合物，其中非人类哺乳动物的血清白蛋白的浓度低于5、4、3、2或者1ppm。优选实施方案中，hSA和非人类哺乳动物的血清白蛋白的比例低于1∶1,000、1∶10,000、1∶100,000。
附图简述
图1描绘的是一种具有染料配基的层析树脂，包括染料活性蓝2，该染料已知与血清白蛋白结合。R基团可以由数种不同化合物，例如-NH-C6H4-(间位)SO3H，-NH-C6H4-(邻位)SO3H，或者其混合物取代。载体为琼脂糖。
发明详述
脱脂乳汁
通过离心之类标准脱脂质程序将获自转基因哺乳动物的乳汁样品进行脱脂。此处“脱脂质乳汁”这个术语指的是撇去脂皮的乳汁。其他已知的方法包括将乳汁撇脂皮和/或沉淀方法来获得脱脂质样品，参见例如H.E.Swaisgood，Developments in Dairy Chemistry，I：Chemistry of Milk Protein，Applied Science Publishers，NY，1982.
从样品中去除酪蛋白
本发明方法包括减少乳汁样品，例如脱脂质乳汁样品中酪蛋白水平。优选，在与进行该步骤之前样品中酪蛋白的水平相比，该步骤能使样品中酪蛋白的水平至少降低70％、80％、90％、95％甚至更多。
使用本领域熟知的不同方法可以减少样品中的酪蛋白水平。举例来说，可以通过酸沉淀减少样品的酪蛋白水平。优选该酸为稀酸。可用于沉淀样品中酪蛋白的酸有例如乙酸、硫酸以及磷酸。优选该酸为乙酸。通过向样品中加入酸，样品的pH值降至约4.0至5.5、约4.1至5.2、约4.2至5.0或约4.2至4.8。酸化的样品然后即可进行离心或者切向流过滤来除去已沉淀的酪蛋白。在如U.S.专利号4,644,056中对酸沉淀酪蛋白有进一步详细的描述。
可使用标准台式离心机在约2500至500×G的条件下进行离心。另外，可以使用例如Alfa Laval或者Westphalia连续流盘叠离心机进行离心。这些后面所说的离心机尤其适于进行大量离心。
酸化的样品可进行切向流过滤，将样品通过带有足够孔径滤膜的横向流动滤器，可至少挡住沉淀的酪蛋白的一部分(“滞留物”)，同时让含有hSA的样品(“渗透物”或者“滤出液”)通过该滤膜。在切向流过滤中，要过滤的样品与膜状滤器平行流动，且滤出液穿过滤器。优选，膜为一层空心纤维滤筒，孔径大小平均约为0.08至1.2μm。市面上可购得的膜孔径平均为约0.1至1.2μm。举例来说，优选实施方案中可使用Ceramem 0.2μm陶瓷块。其他实施方案中，空心纤维滤筒为A/G Technologies 750K截流空心纤维。切向流过滤法的实例可在如U.S.专利号4,644,056中找到。
其他实施方案中，可以不将样品酸化而将样品酪蛋白水平降低。举例来说，可以将样品通过U.S.专利号6,268,487中所阐述的切向流微过滤法处理。
不管样品在进行切向流过滤之前酸化与否，至少一部分的酪蛋白会被膜所滞留，而大部分的hSA仍留在滤出液中。优选条件下，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％甚至样品中更多的hSA在经过切向流过滤后会保留在滤出液中。该滤出液随后可用于下一步对hSA进行纯化。
亲和层析
可以用多种途径进行亲和层析，并可使用化学合成树脂(例如染料配基树脂)或者蛋白质偶联树脂(例如抗体偶联树脂)。参见例G.Hermanson等人，Immobilized Affinity Ligand Techniques，NewYork：Academic Press 1992。当决定选用何种树脂纯化如hSA之类的目的蛋白质时，需要考虑的关键参数包括制造亲和柱的成本、柱的可测量性、柱的瞬时质量(temporal quality)(即在重复使用后用柱纯化所得产物的质量)。蛋白偶联树脂(例如抗体偶联或者肽结合区域偶联树脂)对目的分子具有高的结合特异性，通常其结合常数可达到约10-7至10-10M，但是受限于其成本、可测量性以及寿命。另外，有时目的蛋白质一旦结合到蛋白质偶联树脂上后，处理程序上如果不破坏树脂则难以将目的蛋白质回收。化学合成树脂往往比蛋白质偶联树脂价格低廉，更易扩大规模，寿命更长，但往往特异性较低，其结合常数约为10-5至10-9M。
在本发明方法中使用的亲和柱可包括化学合成树脂或蛋白质偶联树脂。优选，亲和柱包括化学合成树脂。化学合成树脂的配基和hSA的亲和力至少要达到10-5M，且更优选至少达到10-6M，甚至达到10-7M或更低值。适于在本发明方法中使用的柱为Cibacron Blue 3GA柱，该产品在市面上广为出售，具有如图1所示的结构，其中R基团为以下结构的混合物：-NH-C6H4-(间位)SO3H，和-NH-C6H4-(邻位)SO3H。另一适于本发明方法的柱为Prometic Biosciences Blue SA柱，该产品为染料配基柱家族中的一员，具有如图1所示的树脂结构。一方面来看，染料配基柱为Cibacron Blue 3GA柱的变体之一，其中的R基团不是混合物而是单一的-NH-C6H4-(间位)SO3H或者-NH-C6H4-(邻位)SO3H成分。优选，化学合成树脂与hSA的亲和力比它与其他血清白蛋白亲和力高至少2、5、10、20、50甚至100倍，其他血清白蛋白例如BSA一类的非人类哺乳动物血清白蛋白。
适合将含hSA的样品上到亲和柱的上样缓冲液取决于特定的柱。另外，本领域的技术人员会认识到对于任何特定柱均有多种适于hSA样品上样的缓冲液。对Prometic Biosciences Blue SA柱优选的上样缓冲液包括如：pH为8-9的50至250mM盐(例如NaCl或KCl)，以及低浓度的非离子去垢剂(例如0.01％至0.1％聚山梨醇酯20，即Tween 20)。澄清的hSA样品在加到柱上之前优选进行渗滤(diafilter)，将澄清的hSA样品的缓冲液替换成合适的柱上样缓冲液。澄清的hSA样品还可以进行过滤以增加样品中hSA蛋白质的浓度。
合适的柱清洗缓冲液基本上与适用的上样缓冲液相同(比如等同于)。清洗缓冲液中存在的去垢剂(例如聚山梨醇酯20)有助于从柱(例如Prometic Biosciences Blue SA柱)上除去非人血清白蛋白(例如BSA)，而hSA和柱的结合不受影响。
类似地，将hSA从与之结合的柱上洗脱的洗脱缓冲液依赖于柱的原本属性。本领域的技术人员会认识到，同样也存在多种不同的洗脱缓冲液适合从特定的与hSA结合的柱上将其洗脱。对于PrometicBiosciences Blue SA柱来说，合适的洗脱缓冲液包括如：pH为5至7的30至50mM磷酸盐(例如磷酸钾和磷酸钠的混合物)，优选pH值为5.5至6.5，以及10-30mM辛酸盐。其他脂肪酸分子可以用来代替辛酸盐，包括如，短链、中等链或者长链脂肪酸，例如硬脂酸盐、月桂酸盐、豆蔻酸盐和油酸盐。优选，和其他结合在柱上的非血清白蛋白蛋白质(例如，血蛋白，乳蛋白，或组培培养蛋白质)相比，特定洗脱缓冲液洗脱hSA更容易，洗脱力是前者的2、5、10、20、50、100甚至更高倍。
如上面所讨论的，蛋白质偶联亲和柱也可以用于本发明方法。将hSA从含有其他非人类血清白蛋白(例如，非人类血清白蛋白如BSA)样品中纯化的典型蛋白质偶联亲和柱含有重组的白蛋白结合区(ABD)蛋白质，该蛋白质固定在交联的琼脂糖树脂上。重组的白蛋白结合区蛋白质在Johansson等人，J.Mol.Biol.1997，266：859-865中有描述。优选条件下，ABD柱对hSA的亲和力至少比对其他血清白蛋白的亲和力强10、20、50、100、500甚至1000倍，其他血清白蛋白如非人类哺乳动物血清白蛋白，例如BSA。
适用于ABD偶联柱的平衡和清洗缓冲液可包括如pH4.5至6.5的10-50mM乙酸盐，优选pH值为约5.0至6.0，以及50-250mM盐，优选浓度为100-150mM。可包含的盐有如NaCl或KCl。上样之前，澄清的hSA样品应调节到pH为4.5至6.5，优选pH值为5.0至6.0。可通过加酸(例如稀硫酸或磷酸)完成，或者根据hSA样品的pH值，用碱调节(例如稀NaOH)或通过缓冲液交换(例如渗滤)将缓冲液换成平衡和冲洗缓冲液。该澄清的hSA样品在上样到柱上之前还可进行过滤以增加hSA蛋白质的浓度。使用低pH缓冲液，比如pH值为2.3至2.8，优选2.5左右，可以将hSA从ABD偶联柱上洗脱。洗脱缓冲液可包括25至100mM甘氨酸或者0.2至1.0M乙酸。优选，所用洗脱缓冲液洗脱hSA比洗脱结合在柱上非血清白蛋白容易2、5、10、20、50、100甚至更多倍。
优选，洗脱液中至少能回收加到亲和柱上的样品中的hSA的85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％甚至更多。类似地，优选洗脱液中非hSA蛋白质杂质的浓度降低为加到亲和柱上的hSA样品中的五分之一、十分之一、一百分之一、一千分之一甚至更低。此类杂质包括非hSA血液蛋白质(例如凝固蛋白质、脱辅基脂蛋白质、生长因子)、乳汁蛋白质(例如非人类哺乳动物血清白蛋白(如BSA)、β-乳球蛋白、α-乳球蛋白以及例如IgG之类的抗体)、卵蛋白(例如溶菌酶)或者为条件细胞培养基中的常见蛋白质(例如BSA或生长因子)。
作为本发明方法的一部分亲和层析步骤可选重复。这种情况下过一次柱的洗脱液只要进行渗滤将洗脱缓冲液换成合适的柱上样缓冲液。渗滤之前洗脱液可选进行过滤以减少样品中脂肪酸的量并浓缩hSA。在本发明方法中重复亲和层析步骤时可使用多个亲和柱。举例来说，可将化学合成树脂柱(例如Cibacron Blue 3GA柱或PrometicBiosciences Blue SA柱)和蛋白质偶联柱(例如ABD柱)结合使用。柱的使用顺序并不重要，不过优选先使用化学合成树脂柱以尽量延长蛋白质偶联柱的使用寿命。
一些实施方案中，本发明方法包括连续进行亲和层析，例如在模拟移动床系统上进行。
结晶
此处所用“结晶的hSA”指的是hSA区别于其不定型固体状态的晶体固体状态。晶体的特征在于具有晶格结构、特征晶型，以及诸如折射率这样的光学特性。可以通过以下方法测定hSA是否为晶体：光学显微技术、电子显微技术、x-射线粉末衍射、固体核磁共振(NMR)或者偏振光显微技术。显微技术除了可以用来测定晶体以单晶或多晶形式存在以外，还可以测定晶体长度、直径、宽度、大小和形状。
可以通过向含有hSA的溶液(例如亲和纯化的hSA样品)中加入盐、PEG和/或者有机溶剂来形成hSA晶体。可用来结晶hSA的无机盐包括硫酸铵、氯化钠、氯化钾、磷酸钠(例如磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钠)、磷酸钾(例如，磷酸二氢钾和/或偏磷酸钾)或者其混合物。用于结晶hSA的无机盐优选磷酸钠和/或磷酸钾。可以同无机盐一起向hSA样品中加入脂肪酸分子(例如辛酸盐或其他中等链或长链脂肪酸)促进结晶。举例来说，在5-15℃时向hSA样品中逐渐加入含有pH为6.2的4M磷酸盐(4M NaH2PO4和4M K2HPO4按70∶30体积比的混合物)和1至3mM辛酸盐的溶液。磷酸盐终浓度达到约2.7M至2.8M时hSA的结晶开始形成。
优选，在结晶样品中的hSA至少有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％甚至更多得到回收，例如在重新溶解的样品中。另外，优选，结晶的hSA样品中非hSA蛋白质浓度在重新溶解后减少1、2、3、4、5、10、20甚至更多倍。此类杂质包括非hSA血液蛋白质(例如凝固蛋白质、脱辅基脂蛋白质、生长因子)、乳汁蛋白质(例如非人类哺乳动物血清白蛋白(如BSA)、β-乳球蛋白、α-乳球蛋白以及例如IgG之类的抗体)、卵蛋白(例如溶菌酶)或者为条件细胞培养基中的常见蛋白质(例如BSA或生长因子)。
hSA晶体可以从母液中分离，比如使用漏斗(例如布氏漏斗或同类装置)，并用如pH为6.2的2.8M磷酸盐缓冲液清洗。分离出的hSA晶体可以干燥并储藏。或者将分离出的hSA晶体再溶解在合适的溶剂中，比如水或者适用于肠胃外用药的稀盐溶液(例如NaCl)。
储存
在纯化过程中不同时刻均可将纯化的hSA进行过滤(例如无菌过滤)并且在无菌容器中储存。储存时间长(数日或数月)，而且便于运输。举例来说，经过澄清(即去除脂质以及其他步骤，就如乳汁脱脂和脱酪蛋白)、亲和柱纯化、结晶，或用活性炭处理hSA之后进行储存。
肠胃外制剂
按此处描述所制备的hSA样品可以结合到药物组合物中。此类组合物的特点是包含hSA和药用载体。此处的术语“药用载体”包括溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂以及诸如此类与药物施用相兼容的物质。药物组合物中也可以结合补充的活性成分。
药物组合物的设计要与其施用的预期途径相兼容。对hSA优选的施用途径为肠胃外施用。用于肠胃外应用的溶液或悬浮液可包括以下组分：灭菌稀释剂诸如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘氨酸、丙二醇或者其他合成溶剂；抗细菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液可为乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐以及诸如氯化钠或葡萄糖之类调节张力的试剂。可以通过如盐酸或氢氧化钠之类的酸或碱调节pH值。肠胃外制剂可用安瓿瓶、一次性注射器或者玻璃质或塑料质的多剂量药瓶封装。
将肠胃外组合物配制成剂量单位形式更利于方便施用和剂量统一化。此处所用剂量单位形式指的是适合治疗对象使用的单元剂量的物理独立单位；每单位包含据计算可产生预期疗效并与必需药物载体相连的预定量的hSA。
实施例
实施例1：从转基因牛乳汁中纯化hSA
从含有重组hSA产物的去脂质(脱脂)转基因乳汁开始，用乙酸(10-15％)将产物流酸化至pH4.2至4.8以沉淀酪蛋白。用切向流微过滤除去沉淀的酪蛋白，使用标准TFF系统，其带有包括Ceramem0.2μm陶瓷块或A/G Technologies 750K截流空心纤维的滤筒。
产物使用Prometic Biosciences Blue SA柱进行亲和层析纯化。上样/清洗缓冲条件含有pH8-9的50-250mM离子强度的NaCl以及低浓度聚山梨醇酯20(Tween 20)。产物用含有10-30mM辛酸盐pH为5.5-6.5的20-50mM磷酸盐缓冲液洗脱。
在批量反应箱中进行产物结晶，在5-15℃控制加入pH为6.2的4M磷酸盐(4M NaH2PO4和4M K2HPO4按70∶30体积比的混合物)和1至3mM辛酸盐，至磷酸盐终浓度为2.7-2.8M。使用布氏漏斗过滤将晶体与母液分离，用2.8M磷酸盐缓冲液清洗，按前面所述方法制备并重新溶解于水。结果如下表格1所示。
表格1
工序 代表性步骤hSA产量 ppm bSA  ppm BLG  ppm ALA  ppm IgG
脱脂质乳汁 100％ 1×105  5×106  1×106  7×105
酸沉淀酪蛋白 95％ ND  ND  ND  ND
第一次染料配基层析 95％ 350  1000  550  175
第二次染料配基层析 95％ 15  50  25  50
结晶 80％ 5  5 ＜0.4  ＜0.4
通过个别蛋白质ELISA分析进行纯度测定。
ppm-百万分之(每克hSA中杂质的微克量)
BSA-牛血清白蛋白
BLG-β-乳球蛋白
ALA-α-乳清蛋白
IgG-γ-球蛋白G
实施例2：使用两种不同亲和柱纯化hSA
从含有重组hSA产物的去脂质(脱脂)转基因乳汁开始，样品按实施例1中所述方法酸沉淀酪蛋白而澄清。随后按前面所述进行染料配基亲和层析。
最后，对染料配基亲和纯化的洗脱液进行ABD蛋白质配基层析。使用的ABD柱平衡和清洗缓冲液含有pH5.0-6.0的10-50mM乙酸以及100-150mM NaCl。上样至ABD柱之前，加入烯酸将hSA样品pH值调节至5.0-6.0。使用pH为2.5的25-100mM甘氨酸缓冲液将hSA洗脱。纯化结果如表格2所示。
表格2
工序                  代表性步骤hSA产量  ppm bSA    ppm IgG
澄清的样品流          99％               2×104    1×104
染料配基层析          95％               300        30
ABD蛋白质配基层析     95％               3          3
此处引用的出版物和专利的内容归入参考文献。

Claims (29)

1.一种从含有人血清白蛋白(hSA)和宿主细胞血清白蛋白的样品中纯化hSA的方法，包括：
从宿主细胞获得含有hSA和宿主细胞血清白蛋白的样品；
上样至亲和柱，该亲和柱结合hSA的亲和力高于与宿主细胞的血清白蛋白的结合亲和力；
从亲和柱上洗脱结合的hSA；和
将洗脱下的hSA结晶。
2.权利要求1中所述方法，其中样品从转基因非人类动物中获得。
3.权利要求2中所述方法，其中动物选自牛、绵羊、山羊、猪、小鼠和兔。
4.权利要求2中所述方法，其中样品从哺乳动物的乳汁、血液或组织中获得。
5.权利要求1中所述方法，其中样品为用于培养细胞的培养基。
6.权利要求2中所述方法，其中样品获自其乳腺上皮细胞产hSA的转基因哺乳动物的乳汁。
7.权利要求6中所述方法，其中方法还包含将乳汁样品脱脂质。
8.权利要求6中所述方法，其中方法还包含对乳汁样品进行除酪蛋白处理。
9.权利要求8中所述方法，其中通过酸沉淀、离心或切向流过滤去除酪蛋白。
10.权利要求6中所述方法，其中样品为澄清的乳汁样品。
11.权利要求10中所述方法，其中澄清的乳汁样品在盐缓冲液中。
12.权利要求11中所述方法，其中盐缓冲液包含pH为8.5的250mMNaCl和低浓度的非离子去垢剂。
13.权利要求11中所述方法，其中亲和柱包含合成配基树脂。
14.权利要求13中所述方法，其中合成配基树脂使用染料活性蓝2或者被修饰的染料活性蓝2作为配基。
15.权利要求1中所述方法，其中与其结合hSA的亲和力相比，该亲和柱与宿主细胞血清白蛋白基本不结合。
16.权利要求1中所述方法，还包含上样到柱上后对亲和柱进行清洗。
17.权利要求16中所述方法，其中清洗缓冲液包含pH为8.5的250mM NaCl以及低浓度的非离子去垢剂。
18.权利要求1中所述方法，其中使用洗脱缓冲液将hSA从亲和柱上洗脱下来，该缓冲液基本不引起结合亲和柱的非血清白蛋白蛋白质的洗脱。
19.权利要求18中所述方法，其中洗脱缓冲液包含磷酸缓冲液和与柱上亲和配基竞争结合hSA的脂肪酸分子。
20.权利要求19中所述方法，其中洗脱缓冲液包含pH约为6.0的20-50mM磷酸。
21.权利要求19中所述方法，其中脂肪酸分子为辛酸盐。
22.权利要求1中所述方法，还包含将亲和纯化的hSA样品上样到亲和柱或是第二根亲和柱，清洗结合hSA的亲和柱并且洗脱亲和柱上结合的hSA，从而获得两次亲和纯化的hSA样品。
23.权利要求1中所述方法，其中通过向样品中加入结晶剂使结合的hSA结晶。
24.权利要求23中所述方法，其中结晶剂选自聚乙二醇(PEG)、硫酸铵、磷酸盐或其混合物。
25.权利要求23中所述方法，其中结晶剂为磷酸盐，且加至终浓度为2.7至2.8M。
26.权利要求23中所述方法，其中结晶剂还包含与hSA结合的脂肪酸分子。
27.权利要求27中所述方法，其中脂肪酸分子为辛酸盐。
28.权利要求1中所述方法，其中从结晶溶液中将结晶的hSA分离出来。
29.包含按权利要求1中所述方法制成的hSA的组合物。
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