EA023193B1 - Среда для культивирования клеток для экспрессии белков adamts - Google Patents

Среда для культивирования клеток для экспрессии белков adamts Download PDF

Info

Publication number
EA023193B1
EA023193B1 EA201270224A EA201270224A EA023193B1 EA 023193 B1 EA023193 B1 EA 023193B1 EA 201270224 A EA201270224 A EA 201270224A EA 201270224 A EA201270224 A EA 201270224A EA 023193 B1 EA023193 B1 EA 023193B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
culture medium
exactly
culture
zinc
Prior art date
Application number
EA201270224A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201270224A1 (ru
Inventor
Леопольд Грилльбергер
Александра Шпенгер
Майнхард Хасслахер
Рана Грилльбергер
Манфред Райтер
Original Assignee
Бакстер Интернэшнл Инк.
Бакстер Хелткэр С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бакстер Интернэшнл Инк., Бакстер Хелткэр С.А. filed Critical Бакстер Интернэшнл Инк.
Publication of EA201270224A1 publication Critical patent/EA201270224A1/ru
Publication of EA023193B1 publication Critical patent/EA023193B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24087—ADAMTS13 endopeptidase (3.4.24.87)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/22—Zinc; Zn chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/95—Protein-free medium and culture conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/99—Serum-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к культуральным средам, которые применимы для экспрессии белков ADAMTS, таких как ADAMTS13. Также предлагаются способы экспрессии и очистки белков ADAMTS. В некоторых вариантах среды и способы согласно изобретению применимы для экспрессии белков ADAMTS, обладающих высокими удельными активностями. Также предлагаются композиции белков ADAMTS, например ADAMTS13, с высокими удельными активностями, которые экспрессированы и очищены согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении.

Description

Белки ΆΌΆΜΤδ (дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина типа I) представляют собой семейство металлопротеиназ, содержащих несколько консервативных доменов, включая цинкзависимый каталитический домен, богатый цистеином домен, подобный дезинтегрину домен и по меньшей мере один, а в большинстве случаев несколько повторов тромбоспондина типа I (обзор см. в публикации №сйокоп с1 а1., ВМС Ενοί ΒίοΙ. 2005 РеЬ 4; 5(1):11). Такие белки, которые эволюционно родственны семействам металлопротеиназ ΛΌΛΜ и ММР (1опе8 С.С., Сигг Рйатш Вю1ес1то1. 2006 РеЬ; 7(1):25-31), являются секретируемыми ферментами, которые связаны с рядом заболеваний и состояний, включая тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТР) (Моаке ЕЬ., §еш1и Нета1о1. 2004 1аи; 41(1):4-14), соединительнотканные заболевания, злокачественные опухоли, воспаление (№сйо18ои е1 а1.) и тяжелую малярию, вызванную Р1а8тобшт ГаШрагит (Ьаткш е1 а1., РЬоЗ РаШод. 2009 Маг; 5(3):е1000349). В связи с указанной ассоциацией ферменты ΆΌΆΜΤδ были признаны потенциальными терапевтическими мишенями для ряда патологий (1опе8 С.С., Сигг Р1агт Вю1ес1то1. 2006 РеЬ; 7(1):2531). Соответственно, существует необходимость в способах получения больших количеств белков ΆΌΆΜΤδ, обладающих высокими удельными активностями, которые не содержат примесей, таких как вирусы, ГЭКРС (ΒδΕ) и патогены, подобные бактериям Μусοр1а8та.
Для культивирования клеток, особенно эукариотических клеток, и более конкретно, клеток млекопитающих, постоянно требуется использование специальных культуральных сред, обеспечивающих питательные вещества, которые необходимы для эффективного роста клеток и для продуцирования биологических продуктов, особенно биофармацевтических веществ, таких как, например, рекомбинантные белки, антитела, вирусы, вирусные антигены и вирусоподобные частицы. Для эффективного продуцирования указанных биологических продуктов важно достижение оптимальной плотности клеток, а также увеличение самой экспрессии белка, чтобы получить максимальный выход продукта.
В составы сред для культивирования клеток дополнительно вводили ряд добавок, включая неидентифицированные компоненты, подобные фетальной сыворотке теленка (РСδ), несколько полученных от животных белков и/или гидролизатов бычьего белка, а также гидролизаты белков, полученных из растений или дрожжей.
Как правило, сыворотка или полученные из сыворотки вещества, такие как, например, альбумин, трансферрин или инсулин, могут содержать нежелательные агенты, которые могут загрязнять культуры клеток и полученные из них биологические продукты. Кроме того, полученные из сыворотки человека добавки необходимо тестировать в отношении всех известных вирусов, включая вирусы гепатита и ВИЧ, которые могут передаваться через сыворотку. Кроме того, бычья сыворотка и полученные из нее продукты несут риск заражения ГЭКРС. Кроме того, все полученные из сыворотки продукты могут быть загрязнены неизвестными веществами. При использовании в культуре клеток сыворотки или белковых добавок, полученных от человека или из животных источников, существуют многочисленные проблемы (например, варьирующий качественный состав разных партий и риск загрязнения микоплазмой, вирусами или ГЭКРС), особенно если клетки используют в производстве лекарственных средств или вакцин для введения человеку.
Поэтому было предпринято множество попыток получения эффективных систем хозяев и условий культивирования, которые не требуют использования сыворотки или других соединений животных белков.
Такие бессывороточные среды были разработаны на основе белковых экстрактов, полученных из растений или дрожжей. Например, известно, что соевые гидролизаты применимы для процессов ферментации и могут усиливать рост многих требовательных к среде организмов, дрожжей и грибов. В публикации \νϋ 96/26266 описано, что продукты расщепления папаином соевой муки являются источником углеводов и азота, и многие компоненты можно использовать в культурах тканей. Ргапек е1 а1. (Вю1есйпо1оду Ртодтезз (2000) 16, 688-692) описали стимулирующие рост и продуктивность эффекты определенных пептидных фракций гидролизатов сои и пшеницы.
В νθ 96/15231 описана бессывороточная среда, состоящая из синтетической минимальной необходимой среды и дрожжевого экстракта, для размножения клеток позвоночных и способа получения вирусов. Состав среды, состоящей из основной среды для культуры клеток, содержащей пептид риса и экстракт дрожжей и продукт его ферментативного расщепления, и/или липид растений, для роста клеток животных описан в νθ 98/15614. Среда, содержащая очищенный соевый гидролизат, для культивирования рекомбинантных клеток описана в νθ 01/23527. В νθ 00/03000 описана среда, которая содержит соевый гидролизат и дрожжевой экстракт, но также требует присутствия рекомбинантных форм животных белков, таких как факторы роста.
- 1 023193
В ЕР-А-0481791 описана биохимически определенная культуральная среда для культивирования сконструированных клеток СНО, которая не содержит белков, липидов и углеводов, выделенных из животного источника, дополнительно содержащая рекомбинантный инсулин или аналог инсулина, от 1 до 0,025% мас./об. расщепленного папаином соевого пептона и путресцин. В \УО 98/08934 описана бессывороточная культура эукариотических клеток, содержащая гидролизованные соевые пептиды (1-1000 мг/л), от 0,01 до 1 мг/л путресцина и разнообразные компоненты животного происхождения, включая альбумин, фетуин, различные гормоны и другие белки. В контексте настоящего описания следует отметить, что путресцин, как известно, также содержится в стандартных средах, подобных ΌΜΕΜ/среде Хама Р12, в концентрации 0,08 мг/л.
Однако растительные и/или дрожжевые гидролизаты представляют собой неопределенные смеси олигопептидов и других неизвестных компонентов и примесей. Кроме того, качество коммерчески доступных партий гидролизатов сильно варьирует. В результате имеет место широкое варьирование при получении рекомбинантных белков или вирусных продуктов (до трехкратного варьирования) в зависимости от партий используемых гидролизатов (варьирование от партии к партии). Такой недостаток сказывается на пролиферации клеток, а также экспрессии белка в каждой клетке. В публикации И8 2007/0212770 описаны различные не содержащие животных белков и не содержащие животных олигопептидов, химически определенные культуральные среды, которые применимы для получения биофармацевтических препаратов рекомбинантных белков в большом масштабе.
Один из представителей семейства ΑΌΑΜΤ8, ΑΌΑΜΤ813, расщепляет фактор фон Виллебранда (уУР) между остатками Туг1605 и Μβΐ 1606, и такая функция ответственна за распад крупных мультимеров уУР ίη νίνο. Утрата активности ΑΌΑΜΤ813 связывали с рядом состояний, таких как ТТР (ΜοαΚο ТЬ., 8ет1п Нета(о1. 2004 1ап; 41(1):4-14), острое и хроническое воспаление (СЬаиЬап е( а1., 1 Εχρ Μβά. 2008 8ер 1; 205(9):2065-74), и совсем недавно с тяжелой малярий, вызываемой Р1а8шобшш Га1арагит (Ьагкт е( а1., РЬо8 Ра(Нод. 2009 Μ3Γ; 5(3):е1000349).
Тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТР) представляет собой расстройство, характеризуемое тромботической микроангиопатией, тромбоцитопенией и тромбозом микрососудов, который может вызывать различные степени ишемии тканей и инфаркта. Клинически пациентов с ТТР диагностируют по симптомам, таким как тромбоцитопения, шизоциты (фрагменты эритроцитов) и повышенные уровни лактатдегидрогеназы ^оаке ТЬ. ТйтотЬоПс тюгоапдюра1Ые8. N Епд1 1 Μеб. 2002; 347:589-600; Μοаке ТЬ. νοη У111еЬгапб Гас(ог, ΑΌΑΜΤ813, апб 1йтотЬойс (НготЬосу(орешс ригрига. 8етш Нета(о1. 2004; 41:4-14; 8аб1ег ТЕ, Μοаке ТЬ, Μ^уаίа Τ., Сеогде ΤΝ. Кесеп( аб\'апсе8 ш (НготЬоЛс (НготЬосуЮрешс ригрига. Нета(о1оду (Ат 8ос. Нета!о1 Ебис Ргодгат). 2004:407-423; 8аб1ег ТЕ. №ν сопсер(8 ш топ \УП1еЬгапб б18еа8е. Аппи Κ£ν Μеб. 2005; 56:173-191).
В 1982 г. Μοаке с соавторами обнаружили необычно крупные мультимеры фактора фон Виллебранда (РР-АУР) в плазме пациентов с хронической рецидивирующей ТТР (Поаке ТЬ., Кибу С.К., Τγό11 ТН., \Уеш8(е1п Μ.Τ, Со1аптпо Ν.Μ., А/осаг 1., 8ебег К.Н., Нопд 8.Ь., Эеук|п Ό. ипи8иа11у 1агде р1а8та Гас(ог У111:уоп УШеЬгапб Гас(ог тиШтетз ш сНгошс те1ар8шд 1йтотЬобс (НготЬосуЮрешс ригрига. N Епд1 1 Μеб. 1982; 307:1432-1435). Связь между υΠνΜΡ и ТТР была подтверждена независимыми данными, полученными Еиг1ап с соавторами и Τί^-ιί и Пап, о том, что большинство пациентов, страдающих от ТТР, имеют недостаточное количество в плазме металлопротеазы, в настоящее время известной как ΑΌΑΜΤ813, которая расщепляет у\УР (Риг1ап Μ., КоЬ1е8 К., 8о1еп(На1ег Μ., \Уа88тег Μ., 8апбо/ Р., Ьаешт1е В. ОеПшегК ас11У11у оГ топ УШеЬтапб Гас1ог-с1еау|пд рго1еа§е ш сНгошс те1ар8шд (НготЬоЛс (НготЬосуЮрешс ригрига. В1ооб. 1997; 89:3097-3103; Τ8а^ НУР 8и88тап Ι.Ι., ОшзЬитд Ό., ЬапкНоГ Н., 81хша ТТ, №де1 К.Ь. Рто1ео1убс с1еатаде оГ гесотЫпап( !уре 2А топ УШеЬтапб ГасЮг ти1ап18 К834У апб К834Ц: шЫЬИюп Ьу бохусусНпе апб Ьу топос1опа1 апЛЬобу УР-1. В1ооб. 1997; 89:1954-1962; Τ8а^ НУР Пап Е.С. АпЛЬоб1е8 (о топ УШеЬтапб ГасЮг-скауищ рго(еа8е ίη аси(е (НготЬоЛс (НготЬосуЮрешс ригрига. N Епд1 1 Μеб. 1998; 339:1585-1594).
Протеаза ΑΌΑΜΤ813 является гликозилированным белком с молекулярной массой 190 кД, продуцируемым, главным образом, в печени (Лету С.С., №сНо18 У.С., Ь1ап Е.С., Еогоиб Τ., ΜсС1^ηι^ск Ι.Ν., ΜсСее ВМ, Уапд Α.Υ., 81еш1ешак Ό.Κ., 8(агк К.К., Стирро К., 8агобе К., 81шпп 8.В., СНапбгахекагап V., 8(аЬ1ег 8.Р., 8аЬю Н., ВоиЬа88иа Е.Е., ир8На\у ΤΌ., 1т., СиъЬигд Ό., Τ8а^ НМ Μυ^ίΗ^ ίη а тетЬег оГ (Не ΑΌΑΜΤ8 депе Гатбу саи8е (НготЬоЛс (НготЬосуЮрешс ригрига. №((иге. 2001; 413:488-494; Риркауа К., 8и/ик| Н., ΜсΜи11еη В., СНипд Ό. РипПсаЛоп оГ Нитап топ ХУШеЬгапб Гас1ог-с1еау|пд рго(еа8е апб ίΐ8 1бепЛПсаЛоп а8 а пеу тетЬег оГ (Не те(а11орго(е1па8е Гатбу. В1ооб. 2001; 98:1662-1666; ΖΠη§ X., СНипд Ό., Τакауата Τ.Κ., Μ^πΐ8 Е/Μ., 8аб1ег ТЕ., Риркауа К. 8(гис(иге оГ уоп ХУШеЬгапб Гасΐο^-с1еаν^ηд рго(еа8е (ΑΌΑΜΤ813), а те(а11орго(еа8е пуокеб ίη (НготЬоЛс (НготЬосуЮрешс ригрига. ί Вю1. СНет. 2001; 276:41059-41063; 8осрта К., Μ^ωπ Ν., Ниа8Ыта Μ., Μаеба Н., Натато(о Τ., №(кадак1 Τ., №/а1Л С. А поте1 Нитап те(а11орго(еа8е 8уп(Не81/еб ίη (Не 1кег апб 8есге(еб бКо (Не Ь1ооб: ро881Ь1у, (Не уоп ХУШеЬгапб Гас(ог-с1еа\апд рго(еа8е; 1 ВюсНет (Покуо). 2001; 130:475-480; СеггЙ8еп Н.Е., КоЬ1е8 К., Ьатт1е В., Риг1ап Μ. Рагба1 атто ааб 8ес.|иепсе оГ ршгйеб уоп ХУШеЬгапб Гас(ог-с1еа\апд рго(еа8е. В1ооб. 2001; 98:16541661).
Показано, что мутации в гене ΑΌΑΜΤ813 вызывают ТТР (Ьету С.С., №сНо18 У.С., Ь1ап Е.С.,
- 2 023193
Рогоиб Т., МсСНпйск ΙΝ., МсСее В.М., Уап§ Α.Υ., 81ет1ешак Ό.Κ., 8(агк К.К., Сгирро К., 8агобе К., 8Нигш 8.В., СНапбгакекагап V., 81аЪ1ег 8.Р., 8аЫо Н., ВоиНакк1га Е.Е., ИркНате ΙΌ., 1г., СшкЪигд Ό., Тка1 Н.М. Ми!айопк ш а тетЪег о! (Не АЭАМТ8 депе ГатПу сайке (НготЪойс (НготЬосуЮрешс ригрига. №Киге. 2001; 413:488-494). Идиопатическая ТТР, часто вызываемая аутоантителами, ингибирующими активность АЭАМТ8-13, является более распространенным расстройством, которое встречается у взрослых и детей старшего возраста и может рецидивировать с регулярными интервалами у 11-36% пациентов (Тка1 Н.М., Ыап Е.С. АпйЪоб1ек (о уоп УШеЪгапб Гас(ог-с1еаутд рго!еаке ш аси(е (НготЪойс (НготЬосуЮрешс ригрига. N Епд1 1 Меб. 1998; 339:1585-1594; Риг1ап М., Ьатт1е В. ЭеПшепсу оГ уоп ХУШеЬгапб Гас(ог-с1еаутд рго1еаке ш ГатШа1 апб ассщиеб (НготЪойс (НготЬосуЮрешс ригрига. ВаПНегек СПп Наета(о1. 1998; 11:509514).
Не нейтрализующие аутоантитела также могут ингибировать активность АЭАМТ813 благодаря индукции выведения из циркуляции (8сНей1шдег Р., КпоЪ1 Р., Тгайпег В., РЫшаиег В., МоНг С., Эоска1 М., Иогпег Р., Ктедег М. ШппеийаП/тд 1дМ апб 1дС апйЪоФек (о уоп ХУШеЬгапб ГасЮг-с1еауШд рго(еаке (АЭАМТ8-13) ш а райей \\йН (НготЪойс (НгошЪосуЮретс ригрига. В1ооб. 2003; 102:3241-3243). Активность АЭАМТ813 в плазме у здоровых взрослых людей колеблется в диапазоне от 50 до 178% (Моаке ЕЬ. ТНгошЪойс (НготЬосуЮрешс ригрига апб (Не Нето1уйс игеппс купбготе. АгсН Ра(Но1 ЬаЪ Меб. 2002; 126:1430-1433). У большинства пациентов с наследственной или приобретенной ТТР активность АЭАМТ813 в плазме отсутствует или составляет менее 5% от нормальной активности. Без лечения уровень смертности в случае ТТР превышает 90%, но плазмотерапия снижала смертность приблизительно до 20% (Моаке ЕЬ. ТНгошЪойс (НгошЪосуЮретс ригрига апб 1Не Нето1убс игетю купбготе. АгсН Ра(Но1 ЬаЪ Меб. 2002; 126:1430-1433).
уХУР, синтезированный в мегакариоцитах и эндотелиальных клетках, хранится в α-гранулах тромбоцитов и тельцах Вейбеля-Палада, соответственно, в виде сверхкрупных уХУР (ИЬ-уУР) (Моаке ЕЬ., Кибу С.К., Тго11 кН., ХУетк(ет М.к, Со1апшпо КМ., А/осаг 1., 8ебег К.Н., Нопд 8.Ь., Иеукш Ό. Ипикиайу 1агде р1акта Гас(ог νίΠΛΌκ ХУШеЬгапб Гас(ог тиШтегк ш сНгошс ге1аркшд (НготЪойс (НготЬосуЮрешс ригрига. N Епд1 1 Меб. 1982; 307:1432-1435; ХУадпег Ό.Ό., О1тк(еб кВ., Магбег V.! 1ттшю1осаП/а(юп оГ уоп ХУШеЬгапб рго(ет ш ХУеШе1-Ра1абе Ъоб1ек оГ Нитап епбо1ЬеНа1 се11к. 1 Се11 Вю1. 1982; 95:355-360; Уадпег Ό.Ό., ВопГапО К. уоп ХУШеЬгапб Гас(ог апб 1Не епбоШеНит. Мауо СНп Ргос. 1991; 66:621-627; 8рот Ь.А., Магбег ν.Ε, Уадпег Ό.Ό. уоп УШеЪгапб Гас(ог ге1еакеб Ггот УеШе1-Ра1абе Ъоб1ек Ыпбк тоге а\аб1у (о ех1гасе11и1аг тайтх Лап (На( кесге(еб сопк(ШШуе1у. В1ооб. 1987; 69:1531-1534; Тка1 Н.М., №де1 К.Ь., На(сНег νΒ., 8икктап, ί.ί. Епбо(НеНа1 се11-бепуеб ШдН то1еси1аг №е1дН( уоп УШеЪгапб Гас(ог щ сопуег(еб нИо (Не р1акта тиШтег рабет Ъу дгапи1осу(е рго(еакек. ВюсНет ВюрНук Кек Соттип. 1989; 158:980-985; Тка1 Н.М., №де1 К.Ь., На(сНег νΒ., 8икктап ί.ί. МиЮтепс сотрокйюп оГ епбо(НеНа1 се11бепуеб уоп УШеЪгапб Гас(ог. В1ооб. 1989; 73:2074-2076). После секреции из эндотелиальных клеток такие мультимеры ИЬ-уУР расщепляются в кровообращении под действием АЭАМТ813 на серию более мелких мультимеров в конкретных участках расщепления в молекуле уХУР (Тка1 Н.М., №де1 К.Ь., На(сНег ν.Β., 8икктап ί.ί. Епбо(НеПа1 се11-бепуеб ШдН то1еси1аг \уе1дН( уоп УШеЪгапб Гас(ог ίκ сопуег(еб т(о 1Не р1акта ти1Нтег райегп Ъу дгапШосуЮ рго(еакек. ВюсНет ВюрНук Кек Соттип. 1989; 158:980-985; Эеп( кА., Са1Ъикега М., Киддей 2.М. Не(егодепеНу оГ р1акта уоп ХУШеЬгапб Гас(ог тиШтегк гекиШпд Ггот рго(ео1ук1к оГ 1Не сопкШией киЪийГ 1 СНп 1пуек(. 1991; 88:774-782; Риг1ап М., КоЪ1ек К., АГГоНег Ό., Меуег Ό., ВаШоб Р., Ьатт1е В. Тпр1е( к(гис(иге оГ уоп УШеЪгапб Гас(ог гейес(к рго(ео1уйс бедгабабоп оГ ШдН то1еси1аг №е1дН( ти1Нтегк. Ргос №Ш Асаб 8с1 И8А. 1993; 90:7503-7507).
АЭАМТ813 расщепляет связь Туг842-Ме(843 в центральном домене А2 зрелой субъединицы уХУР и требует присутствия цинка или кальция для своей активности (Ией кА., Вегко\\й/ 8.Ό., Уаге 1., Какрег С.К., Киддей 2.М. 1бепййсайоп оГ а с1еауаде кНе бНесНпд (Не 1ттипосНетюа1 бе(ес(юп оГ то1еси1аг аЪпогтаНйек ш 1уре 11А уоп УШеЪгапб Гас(ог. Ргос №Ш Асаб 8с1 И8А. 1990; 87:6306-6310). уХУР существует в форме клубка пряжи и нитчатой форме, как видно под электронным микроскопом (81ау(ег Н., Ьокса1/о 1., Воскепк(еб( Р., Напбш К.1. №Шуе соиГогшайоп оГ Нитап уоп УШеЪгапб рго(ет. Апа1уык Ъу е1ес(гоп тюгоксору апб диак1-е1акйс ПдН( ксайейпд. 1 Вю1 СНет. 1985; 260:8559-8563). Кроме того, атомносиловая микроскопия подтверждает, что уХУР существует в глобулярной конформации в статических условиях и в подвергнутом фолдингу нитчатом состоянии после воздействия сдвигового напряжения (81еб1еск1 С.А., Ьекйй В.к, Койке-МагсНай К.К., Ерре11 8.к, ХУПкоп Ό. Ь., МагсНай К.Е. 8Неаг-берепбеп( сНапдек ш (Не (Нгее-бшюпкюшП кйийиге оГ Нитап уоп УШеЪгапб Гас(ог. В1ооб. 1996; 88:2939-2950). Такое явление может иметь место также ш у|уо, когда один конец филамента уХУР заякорен на поверхности.
Тромбы у пациентов с ТТР состоят из небольшого количества фибрина и, главным образом, из уХУР и тромбоцитов, свидетельствуя о том, что причиной тромбоза является опосредованная уУР агрегация тромбоцитов (Акаба Υ., 8ит1уокЫ А., НауакШ Т., 8и/ит1уа 1., Каке(аШ К. 1ттипоН1к(осНет1к(гу оГ уакси1аг 1екюп ш (НготЪойс (НготЬосуЮрешс ригрига, тейН крета1 геГегепсе (о Гас(ог VIII ге1а(еб апйдеп. ТНготЪ Кек. 1985; 38:469-479). Пациенты с рецидивирующей ТТР имеют сверхкрупные мультимеры в плазме. Мультимеры ий-уХУР накапливаются с течением времени, так как длительное присутствие ингибитора (анти-АОАМТ313-Ат) снижает активность АЭАМТ813. Мультимеры ий-уХУР являются гиперактивными и разворачиваются в результате сдвигового напряжения, вызывая агрегацию тромбоцитов, приводя- 3 023193 щую к внутрисосудистому тромбозу (Т8а1 Η М. Уои \УП1еЬгапб Гас1ог. ΑΌΑΜΤδ13, апб ШготЪойс ΙΙιιόιπЪосуФретс ригрига. 1 Мо1 Меб. 2002; 80:639-647; Т§а1 Η.Μ. Оейаеису оГ ΑΌΑΜΤδ-13 ίη ШтотЪойс апб биотЬосуЮрешс ригрига. 1 ТйготЪ Наеток!. 2003; 1:2038-2040; б18си881оп 2040-2035).
Предполагается, что присутствие гиперреактивных мультимеров иЬ-ν^Ε в плазме из-за недостаточности ΑΌΑΜΤδ13 может быть ассоциировано с повышенным риском артериального тромбоза, связанного с коронарной болезнью сердца.
Так как белки ΑΌΑΜΤδ вовлечены в ряд заболеваний и состояний, в данной области существует необходимость способов крупномасштабного получения рекомбинантных белков ΑΌΑΜΤδ, обладающих высокой удельной активностью, которые подходят для приготовления и введения фармацевтических препаратов. Настоящее изобретение относится к способам, которые удовлетворяют указанные и другие потребности в данной области для получения и очистки белков ΑΌΑΜΤδ.
Сущность изобретения
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белков дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина (ΑΌΑΜΤδ). В некоторых вариантах способы, предлагаемые в изобретении, преимущественно приводят к повышенным уровням экспрессия и к получению белков ΑΌΑΜΤδ со значимо повышенными активностями. Такие улучшенные свойства в одном примере могут быть достигнуты благодаря добавлению в культуральную среду, применяемую для экспрессии белков ΑΌΑΜΤδ, повышенных уровней различных компонентов, таких как кальций, цинк или никотинамид (витамин В3). В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является белок ΑΌΑΜΤδ13.
В другом аспекте изобретение относится к способам увеличения экспрессии и/или уровней активности белка ΑΌΑΜΤδ посредством культивирования рекомбинантных клеток, несущих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ, в не содержащих животных белков и химически определенных средах в условиях периодической культуры, культуры с подпиткой или непрерывной культуры клеток. В некоторых вариантах такие способы включают применение периодического культивирования, культивирования с подпиткой, проточного культивирования или культивирования клеток в хемостате, причем культивирование может быть осуществлено либо в виде суспензии клеток, либо в виде прикрепленных клеток. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является белок ΑΌΑΜΤδ13.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам уменьшения степени утраты активности во время очистки белка ΑΌΑΜΤδ. В некоторых вариантах способы включают добавление в буферы для очистки дополнительных уровней кальция и/или цинка. В конкретном варианте способы относятся к стабилизации активности белка ΑΌΑΜΤδ во время стадии ультрафильтрации и/или диафильтрации, используемых в ходе очистки. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является белок ΑΌΑΜΤδ13.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способам получения белка ΑΌΑΜΤδ с повышенной активностью для применения при получении фармацевтической композиции. В некоторых вариантах такие способы включают применение не содержащих животных белков и/или химически определенных культуральных сред в условиях, подходящих для повышенной экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ, обладающего повышенной активностью. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является белок ΑΌΑΜΤδ13.
В родственном аспекте настоящее изобретение относится к не содержащим животных белков, не содержащим олигопептидов и химически определенным средам, которые применимы для экспрессии белков ΑΌΑΜΤδ, обладающих высокой удельной активностью. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является белок ΑΌΑΜΤδ13.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Объемная ΕΚΕΤδ-ν^Ε73-продуктивность рекомбинантного ΑΌΑΜΤδ13 человека, экспрессированного в клетках СНО, культивируемых в не содержащей животных белков среде в различных условиях температуры и рН. Результаты различных экспериментов по культивированию клеток показаны в виде (А) изображения в изолиниях и (В) графика поверхности, представляющих нормализованную объемную ЕΒΕΤδ-V\VЕ73-продγктивностъ ΑΌΑΜΤδ13 в виде функции температуры и рН культуры.
Фиг. 2. Уровни удельной активности (РКЕ/^-У^Е73/антиген по данным ΕΡΙδΑ) клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный ΑΌΑΜΤδ13 человека, культивируемых в не содержащей животных белков среде в различных условиях температуры и рН. Результаты различных экспериментов по культивированию клеток показаны в виде (А) изображения в изолиниях и (В) графика поверхности, представляющих удельную активность в виде функции температуры и рН культуры.
Подробное описание изобретения
Ι. Введение
Белки ΑΌΑΜΤδ (т.е. ΑΌΑΜΤδ-1-ΑΌΑΜΤδ-20) представляют собой семейство секретируемых цинковых металлопротеиназ, которые имеют общую модульную организацию доменов (см. обзор Е1аппегу С.К, Егоп! ВюксЕ 2006 1ап 1; 11:544-69). Все белки ΑΌΑΜΤδ имеют общую структуру коровых доменов, состоящих из сигнального пептида, за которым следует продомен, цинкзависимый металлопротеиназный каталитический домен, подобный дезинтегрину домен, повтор тромбоспондина типа I, богатый цистеином домен и спейсерный домен (Άрΐе δ.δ., 1 Вю1 Сйет. 2009 Εθν 13; 284 (46) :31493-7). Кроме
- 4 023193 того, все они, кроме ΑΌΑΜΤδ-4, содержат по меньшей мере еще один повторяющийся домен тромбоспондина типа I, и многие из белков ΑΌΑΜΤδ содержат один или несколько дополнительных вспомогательных доменов. Причем сообщалось, что все белки ΑΡΑΜΤδ, по-видимому, содержат по меньшей мере один участок связывания кальция и по меньшей мере один участок связывания цинка, локализованные в каталитическом домене металлопротеиназы (ΑηύΐΌίηί с1 а1., 1. Рто1еоте Кек., 2005, 4(3), рр 881-888).
Сообщалось о биологической роли белков ΑΌΑΜΤδ в случае различных заболеваний и состояний, включая антиангиогенез, интерстициальный фиброз почек, ремоделирование кости, фолликулогенез яичников, атеросклероз, развитие мочеполовой системы и рост опухолей/ремоделирование (ΑΌΑΜΤδ-1); синдром Элерса-Данлоса типа 7С и дерматоспараксис крупного рогатого скота (ΑΡΑΜΤδ-2); артрит, атеросклероз и тендинопатию (ΑΌΑΜΤδ-4); артрит и глиобластому (ΑΌΑΜΤδ-5); артрит (ΑΡΑΜΤδ-7); антиангиогенез, злокачественное новообразование головного мозга, артрит и атеросклероз (ΑΌΑΜΤδ-8); артрит (ΑΡΑΜΤδ-9, 12); тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ΑΡΑΜ^-Π); и антитромбоз/инсульт (ΑΌΑΜΤδ 18) (обзор см. в публикации Пи аиб Пи, Ореп Λссекк Кйеита1о1о§у Кекеатей аиб Кемеик 2009:1 121-131).
Рекомбинантный ΑΡΑΜΤδ13 (Α13) ранее экспрессировали в клетках млекопитающих, однако удельная активность широко варьировала в зависимости от условий культивирования. Было обнаружено, что многие коммерчески доступные культуральные среды недостаточны для экспрессии А13 с высокими удельными активностями, выраженными в виде отношения активности, измеряемой в анализе ΡΚΕΤδУ\УР73. к содержанию антигена, которое определяют методом ΕΜδΑ. В одном аспекте способы, предлагаемые в настоящем изобретении, основаны на нескольких полезных данных, которые позволяют осуществлять в культуре клеток экспрессию А13, обладающего повышенными уровнями общей и удельной активности.
Исследования, описанные в настоящей публикации, показывают, что некоторая минимальная концентрация кальция в культуральной среде, приблизительно от 0,5 мМ до приблизительно 1,5 мМ, требуется для экспрессии активного А13. Кроме того, было обнаружено, что при добавлении в культуральную среду повышенных уровней цинка полученный экспрессированный белок А13 обладал более высокой общей и удельной активностью. Например, в культурах с добавлением дополнительного количества цинка в концентрации в 2-3 раза выше нормальной концентрации, по сравнению с концентрациями в стандартных химически определенных средах, таких как основанные на ΌΜΕΜ/Ρ12 среды, удельная активность А13 была значимо повышена. Кроме того, дополнительное увеличение удельной активности А13 может быть достигнуто за счет увеличения концентрации никотинамида (витамина В3) приблизительно от 2 мг/л, как в стандартных основанных на ΌΜΕΜ/Ρ12 средах, до приблизительно 7 мг/л. При культивировании рекомбинантных клеток СНО или ΗΕΚ293 в средах с добавлением дополнительного кальция, цинка и/или никотинамида, могут быть получены удельные активности, составляющие по меньшей мере приблизительно от 500 миллиединиц/мкг, 1000 миллиединиц/мкг до приблизительно 2000 миллиединиц/мкг рекомбинантного А13 человека в крупномасштабных экспрессирующих культурах. Ранее не сообщалось о таких уровнях удельной активности рекомбинантно полученных белков А13. Преимущественно такие повышенные уровни активности А13 были достигнуты в химически определенной среде, не содержащей полученных от животных компонентов, обеспечивающей возможность стабильной и воспроизводимой экспрессии белков ΑΌΑΜΤδ в крупном масштабе, подходящем для получения белков для производства фармацевтических препаратов. Кроме того, такие среды не содержат даже рекомбинантных белков, например инсулина, что приводит к получению продуктов, которые можно более безопасно использовать в препаратах для фармацевтического введения.
Настоящее изобретение также относится к способам, которые предотвращают потерю активности и удельной активности во время стандартной ультра/диафильтрации и других стадий очистки.
Предпочтительно было обнаружено, что при добавлении в буфер, используемый для диафильтрации, дополнительного количества кальция и цинка можно достичь значимого снижения потери активности А13, измеряемой в анализе ΡΚΕΤδ-ν^Ρ73.
Соответственно, вследствие общей взаимосвязи структуры-функции между представителями семейства ΑΡΑΜΤδ секретируемых металлопротеиназ, способы, предлагаемые в настоящем изобретении, обеспечивают экспрессию всех белков ΑΡΑΜΤδ в культуре клеток и извлечение из культуральной среды.
II. Определения
В используемом в настоящем описании смысле термины витамин В3, никотинамид, ниацинамид, ниацин и никотиновая кислота могут быть использованы взаимозаменяемо по отношению к любому представителю семейства витаминов В3. Соответственно, любой представитель данного семейства может быть использован для дополнения среды, применяемой в способах согласно настоящему изобретению.
В используемом в настоящем описании смысле белок ΑΌΑΜΤδ относится к полипептиду дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина типа I из семейства металлопротеиназ. Представители данного семейства включают белки человека ΑΌΑΜΤδ1 (ΝΜ_006988), ΑΌΑΜΤδ2 (ΝΜ_014244; ΝΜ_021599), ΑΡΑΜΤδ3 (ΝΜ_014243), ΑΡΑΜΤδ4 (ΝΜ_005099), ΑΡΑΜΤδ5
- 5 023193 (ΝΜ_007038), ΑΌΑΜΤ86 (ΝΜ_014273), ΑΌΑΜΤ87 (ΝΜ_0142727), ΑΌΑΜΤ88 (ΝΜ_007037), ΑΌΑΜΤ89 (ΝΜ_182920; ΝΜ_182921; ΝΜ_020249), ΑΌΑΜΤ810 (ΝΜ_030957), ΑΌΑΜΤ812 (ΝΜ_030955),
ΑΌΑΜΤ813 (ΝΜ_139025; ΝΜ_139026; ΝΜ_139027; ΝΜ_139028), ΑΌΑΜΤ814 (ΝΜ_139155;
ΝΜ_080722), ΑΌΑΜΤ815 (ΝΜ_139055), ΑΌΑΜΤ816 (ΝΜ_139056), ΑΌΑΜΤ817 (ΝΜ_139057),
ΑΌΑΜΤ818 (ΝΜ_199355; ΝΜ_139054), ΑΌΑΜΤ819 (ΝΜ_133638) и ΑΌΑΜΤ820 (ΝΜ_025003, ΝΜ_175851). Белки ΛΌΛΜΤδ включают как полноразмерные белки, так и частичные полипептиды, которые проявляют, по меньшей мере, частичную биологическую активность, например по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более активности, проявляемой полноразмерным белком, в частности протеазной активности, проявляемой полноразмерным белком. В некоторых случаях белок ΛΌΛΜΤδ будет модифицирован посттрансляционно либо ίη νίνο, либо ίη νίΐτο, например, ферментативными или химическими способами. Понятно, что белки ΑΌΑΜΤ8 согласно настоящему изобретению включают альтернативно сплайсируемые изоформы, консервативно модифицированные белки, по существу, идентичные белки, гомологи и тому подобное.
В контексте настоящего изобретения белок ΑΌΑΜΤ8 включает любого представителя семейства ΛΌΛΜΤ8. например млекопитающего, такого как примат, человек, обезьяна, кролик, свинья, грызун, мышь, крыса, хомячок, песчанка, собака, кошка, и его биологически активные производные. Также включены мутантные белки ΑΌΑΜΤ8 и варианты белков ΑΌΑΜΤ8, обладающие активностью, так же как функциональные фрагменты и слитые белки белков ΑΌΑΜΤ8. Кроме того, белки ΑΌΑΜΤ8 согласно изобретению могут дополнительно содержать метки, которые облегчают очистку, регистрацию или и то и другое. Белки ΑΌΑΜΤ8, описанные в настоящей публикации, могут быть дополнительно модифицированы терапевтическим остатком или остатком, подходящим для визуализации ίη νίΐτο или ίη νίνο.
В используемом в настоящем описании смысле термин белок ΑΌΑΜΤ813 относится к любому белку или полипептиду с активностью ΑΌΑΜΤ813, в частности, способностью расщеплять пептидную связь между остатками Τυγ-842 и ΜοΙ-843 ννΡ. В иллюстративном варианте белок ΛΌΛΜΤ813 относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая в высокой степени сходна с аминокислотной последовательностью ΝΡ_620594 (ΑΌΑΜΤ813, изоформа 1, препробелок) или аминокислотами 75-1427 ΝΡ_620594 (ΑΌΑΜΤ813, изоформа 1, зрелый полипептид). В другом варианте белок ΑΌΑΜΤ813 относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая в высокой степени сходна с аминокислотной последовательностью ΝΡ_620596 (ΛΌΛΜΤ813, изоформа 2, препробелок) или аминокислотами 75-1371 ΝΡ_620594 (ΛΌΛΜΤ813, изоформа 2, зрелый полипептид). В еще одном варианте белки ΛΌΛΜΤ813 включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, в высокой степени сходную с аминокислотной последовательностью ΝΡ_620595 (ΑΠΑΜΤ813, изоформа 3, препробелок) или аминокислотами 75-1340 ΝΡ_620595 (ΑΌΑΜΤ813, изоформа 1, зрелый полипептид). В используемом в настоящем описании смысле белок ΑΌΑΜΤ813 включает природные варианты с расщепляющей γ\νΡ активностью и искусственные конструкции с расщепляющей ν\νΡ активностью. В используемом в настоящем изобретении смысле ΑΠΑΜΤ813 охватывает любые природные варианты, альтернативные последовательности, изоформы или мутантные белки, которые сохраняют некоторую базальную активность. Примеры мутаций ΑΠΑΜΤ813, встречающихся в популяции человека, включают, без ограничения, Κ7ν, ν88Μ, Η96Ό, К102С, Κ193ν, Τ196Ι, Η234Ρ, Α250ν, Κ268Ρ, ν390Ο Κ398Η, 044813 Ρ456Η, Р457Б, С508У, К528С, Р618А, Κ625Η, Ι673Ρ, К692С, Α732ν, 8903Б, С908У, С951С, С982К, С1024С, А1033Т, Κ1095ν, К1123С, С1213У, Τ1226Ι, Ο1239ν, Κ1336ν, многие из которых, как было обнаружено, ассоциированы с тромботической тромбоцитопенической пурпурой (ТТР). Белки ΑΠΑΜΤ813 также включают полипептиды, содержащие посттрансляционные модификации. Например, было показано, что ΑΠΑΜΤ813 модифицирован Ν-ацетилглюкозамином (О1сΝΑο) по остаткам 614, 667 и 1354, и было высказано предположение, что остатки 142, 146, 552, 579, 707, 828 и 1235 также могут быть модифицированы таким образом.
Протеолитически активный рекомбинантный ΑΌΑΜΤ813 может быть получен при экспрессии в культурах клеток млекопитающих, как описано в публикации Ркнтанег с соавторами (2002, Β1οοά. 15; 100(10):3626-32) и в И8 2005/0266528, описание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей. Способы получения рекомбинантной культуры экспрессирующих ΑΠΑΜΤ813 клеток описаны в публикации Ркнтаисг В., 8сйей1тдег Ρ. (8стт Ηетаΐο1. 2004 ίαη; 41(1):24-33), содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей.
В используемом в настоящем описании смысле одну единицу активности ΑΠΑΜΤ8 определяют как количество активности в 1 мл объединенной нормальной плазмы человека, независимо от используемого анализа. Например, когда белком ΑΌΑΜΤ8 является ΑΌΑΜΤ813, одной единицей ΡΡΕΤ8У^Р73-активности белка ΑΌΑΜΤ813 является количество активности, необходимой для расщепления такого же количества субстрата ΡΚΕΤ8-ννΡ73 (Кюкате с1 а1., Вг ί Шета^. 2005 Αρτ; 129(1):93-100), которое расщепляется одним миллилитром объединенной нормальной плазмы человека. В соответствующем случае, активность ΑΠΑΜΤ813 может быть определена в функциональных анализах, таких как функциональные анализы с использованием модифицированных пептидов факторов фон Виллебранда в качестве субстрата для ΑΌΑΜΤ813 (Ττίροάί е1 а1. ί Τίποπιό Ηаетο8ΐ. 2008 8ер.; 6(9):1534-41). Предпочти- 6 023193 тельный способ определения активности рекомбинантного ΛΌΛΜΤ§13 человека описан Осггйесп с соавторами (Аееау оГ νοη ^ШеЬгаиб ГаеЮг (у^Р)-с1еаушд ргоЮаес Ьаесб оп Десгсаесб со11адсп ЬшДшд аГПпИу оГ бедгабсб ννΡ: а Юо1 Гог 1йс Фадпо818 оГ ШготЬойс ШготЬосуФретс ригрига (ΤΤΡ). ТЬготЬ Настое! 1999; 82:1386-1389). В одном варианте, чтобы считаться белком ΛΌΛΜΤδΠ, который определен выше, полипептид или белок должен обладать активностью в расщеплении ν\νΡ. составляющей по меньшей мере 1% активности нативного ΛΌΛΜΤ§13. В других вариантах белок ΛΌΛΜΤδ13 будет обладать активностью, составляющей по меньшей мере 10% активности нативного ΛΌΛΜΤδΠ. В следующих вариантах белок ΛΌΛΜΤδΠ будет обладать активностью, составляющей по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% активности нативного ΛΌΛΜΤδΠ. Количество белка ΛΌΛΜΤ§13 также может быть определено путем измерения антигена ΛΌΛΜΤ§13, например, с использованием способа ЕЬ18Л, описанного Ктсдсг с соавторами (2006, ОпотЬ Настое!. 2006 95(2):212-20).
В используемом в настоящем описании смысле мкг ΛΌΛΜΤδΠ или мкг антигена ΛΌΛΜΤδΠ означает количество ΛΌΛΜΤδΠ, которое обеспечивает такой же уровень регистрируемого белка в анализе ЕЬРЗЛ, как и 1 мл объединенной нормальной плазмы человека. Такое определение основано на опубликованных оценках, свидетельствующих о том, что 1 мг ΛΌΛΜΤ§13 присутствует в 1 мл нормальной плазмы человека и, следовательно, является приблизительным измерением.
В используемом в настоящем описании смысле термин биологически активное производное при использовании в контексте белка ΛΌΛΜΤδ также охватывает полипептиды, полученные с использованием методики рекомбинантной ДНК. Такая методика может включать любой способ, известный в данной области для (ί) получения рекомбинантной ДНК посредством генетической инженерии, например, благодаря обратной транскрипции РНК и/или амплификации ДНК, (ίί) введения рекомбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки с использованием трансфекции, т.е. посредством электропорации или микроинъекции, (ίίί) культивирования указанных трансформированных клеток, например, непрерывным или периодическим образом, (ίν) экспрессии белка ΛΌΛΜΤδ, например, конститутивно или после индукции, и (ν) выделения указанного белка ΛΌΛΜΤδ, например, из культуральной среды или сбором трансформированных клеток, чтобы (νί) получить, по существу, очищенный рекомбинантный белок ΛΌΛΜΤδ, например, с использованием ионообменной хроматографии, эксклюзионной хроматографии по размеру, аффинной хроматографии, хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия и тому подобное. Термин биологически активное производное также включает химерные молекулы, такие как, например, белок ΛΌΛΜΤδ или его функциональный фрагмент, в сочетании со вторым полипептидом, например доменом иммуноглобулина Рс или доменом альбумина, чтобы улучшить биологические/фармацевтические свойства, такие как, например, время полужизни белка ΛΌΛΜΤδ в системе кровообращения млекопитающего, в частности человека.
В используемом в настоящем описании смысле термин ультрафильтрация охватывает множество способов мембранной фильтрации, в которых гидростатическое давление продавливает жидкость, преодолевая сопротивление полупроницаемой мембраны. Суспендированные твердые вещества и растворенные вещества с высокой молекулярной массой задерживаются, тогда как вода и растворенные вещества с низкой молекулярной массой проходят через мембрану. Указанный процесс разделения часто используют для очистки и концентрирования растворов макромолекул (103-106 Да), особенно растворов белков. Имеется несколько мембран для ультрафильтрации в зависимости от размера молекул, которые они задерживают. Ультрафильтрация обычно характеризуется использованием мембран с размером пор от 2 нм до 0,05 мкм и рабочего давления от 1 до 10 бар (0,1-1 МПа), и она особенно применима для отделения коллоидов, подобных белкам, от небольших молекул, подобных сахарам и солям. Напротив, нанофильтрация является другим управляемым давлением способом фильтрации, обычно характеризуемым использованием мембраны с размером пор от 0,5 до 2 нм и рабочего давления от 5 до 40 бар (0,5-4 МПа). Нанофильтрацию часто используют для осуществления разделения сахаров, других органических молекул и поливалентных солей, с одной стороны, и одновалентных солей и воды, с другой. В общем, ультрафильтрацию можно осуществлять в режиме тупиковой фильтрации или в режиме тангенциальнопроточной фильтрации (ΤΡΡ).
В используемом в настоящем описании смысле термин диафильтрация относится к другому способу мембранной фильтрации, иногда называемому тангенциально-проточной фильтрацией (ΤΡΡ), где жидкость прокачивают насосом тангенциально по отношению к поверхности мембраны для ультрафильтрации. Обычно жидкость концентрата разбавляют буфером для диафильтрации после пропускания над мембраной и затем возвращают на мембрану непрерывным проточным способом. В общем, диафильтрация может быть осуществлена либо в режиме тупиковой фильтрации, либо в режиме тангенциально-проточной фильтрации (ΤΡΡ). В связи с этим, одну систему можно использовать как для операций ультрафильтрации, так и для операций диафильтрации, например, чтобы сначала сконцентрировать образец с использованием ультрафильтрации, а затем осуществить замену буфера диафильтрацией.
В используемом в настоящем описании смысле термин полиамин относится к любой группе органических соединений, состоящих из углерода, азота и водорода и содержащих две или больше аминогрупп. Например, термин охватывает молекулы, выбранные из группы, состоящей из кадаверина, путресцина, агматина, орнитина, спермина и спермидина.
- 7 023193
В некоторых вариантах химически определенной культуральной среды, используемой для экспрессии белка ΆΌΛΜΤ8, концентрация полиамина, присутствующего в среде, находится в диапазоне концентраций приблизительно от 0,5 мг/л до приблизительно 30 мг/л, или приблизительно от 0,5 мг/л до приблизительно 20 мг/л, или приблизительно от 0,5 мг/л до приблизительно 10 мг/л, или приблизительно от 1 мг/л до приблизительно 10 мг/л, или приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 10 мг/л, или приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 8 мг/л, или приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 5 мг/л. В одном конкретном варианте полиамином является путресцин в концентрации приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 8 мг/л.
В используемом в настоящем описании смысле термин химически определенная среда относится к синтетической ростовой среде, в которой идентифицированы все компоненты и известна их концентрация. Химически определенные среды не содержат бактериальных, дрожжевых, животных или растительных экстрактов, хотя они могут содержать или не содержать отдельные полученные из растений или животных компоненты (например, белки, полипептиды и т.д.). Не ограничивающие примеры коммерчески доступных химически определенных сред включают различные среды ΕΧ-СЕЬЬ® (8АЕС Вю8шепсе8, 1пс.), различные модифицированные по Дульбекко среды Игла (ΌΜΕ) (8щта-Л1бпс11 Со; 8АЕС Вю8аепсе8, 1пс.), питательную смесь Хама (8щта-Л1бпс11 Со; 8АЕС Вюкаепсек, 1пс.), и тому подобные. Способы получения химически определенных культуральных сред известны в данной области и описаны, например, в патентах США № 6171825 и 6936441, \УО 2007/077217 и публикациях заявок на выдачу патентов США № 2008/0009040 и 2007/0212770, содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей.
В используемом в настоящем описании смысле термин не содержащая олигопептидов среда относится к не содержащей белков среде, которая не содержит олигопептидов, таких как, например, олигопептиды, полученные из гидролизата белка. В одном варианте среда не содержит олигопептидов, имеющих двадцать или больше аминокислот. В одном варианте осуществления настоящего изобретения среда не содержит олигопептидов, имеющих пятнадцать или больше аминокислот. В другом варианте осуществления изобретения среда не содержит олигопептидов, имеющих десять или больше аминокислот. В одном варианте среда не содержит олигопептидов, имеющих семь или больше аминокислот. В другом варианте среда не содержит олигопептидов, имеющих пять или больше аминокислот. В еще одном варианте среда не содержит олигопептидов, имеющих три или больше аминокислот. Согласно следующему варианту осуществления настоящего изобретения среда не содержит олигопептидов, имеющих две или больше аминокислот. Способы получения не содержащей олигопептидов культуральной среды известны в данной области, например описаны в патентах США № 6171825 и 6936441, в \УО 2007/077217 и в публикациях заявок на выдачу патентов США № 2008/0009040 и 2007/0212770, содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей.
В используемом в настоящем описании смысле термин бессывороточная культуральная среда относится к культуральной среде, в которую не добавлена сыворотка животных. Хотя зачастую бессывороточные среды представляют собой химически определенные среды, в бессывороточные среды могут быть добавлены отдельные животные или растительные белки или фракции белков. Способы получения бессывороточной культуральной среды известны в данной области, например, описаны в патентах США № 6171825 и 6936441, в \УО 2007/077217 и в публикациях заявок на выдачу патентов США № 2008/0009040 и 2007/0212770, содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей.
В используемом в настоящем описании смысле термин культуральная среда, не содержащая животных белков относится к культуральной среде, которая не дополнена сывороткой, белком или фракцией белка животных. Хотя зачастую культуральные среды, не содержащие животных белков, представляют собой химически определенные среды, культуральные среды, не содержащие животных белков, могут содержать растительные или дрожжевые гидролизаты. Способы получения культуральной среды, не содержащей животных белков, известны в данной области, например, описаны в патентах США № 6171825 и 6936441, \УО 2007/077217 и публикациях заявок на выдачу патентов США № 2008/0009040 и 2007/0212770, содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей.
Экспрессирующий вектор представляет собой конструкцию нуклеиновой кислоты, созданную рекомбинантно или синтетически, содержащую ряд специальных элементов нуклеиновой кислоты, которые обеспечивают возможность транскрипции конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Экспрессирующий вектор может быть частью плазмиды, вируса или фрагмента нуклеиновой кислоты. Обычно экспрессирующий вектор содержит нуклеиновую кислоту, которую необходимо транскрибировать, функционально связанную с промотором.
Термин гетерологичный при использовании в отношении частей нуклеиновой кислоты указывает, что нуклеиновая кислота содержит две или больше подпоследовательностей, которые не встречаются в такой же взаимосвязи друг с другом в природе. Например, нуклеиновую кислоту обычно получают путем рекомбинации, и она имеет две или больше последовательностей из неродственных генов, скомбинированных для того, чтобы получить новую функциональную нуклеиновую кислоту, например, промо- 8 023193 тор из одного источника и кодирующую область из другого источника. Подобным образом, термин гетерологичный белок указывает, что белок содержит две или больше подпоследовательности, которые не встречаются в такой же взаимосвязи друг с другом в природе (например, слитый белок).
Промотор определяют как ряд регуляторных последовательностей нуклеиновой кислоты, которые управляют транскрипцией нуклеиновой кислоты. В используемом в настоящем описании смысле промотор содержит необходимые последовательности нуклеиновой кислоты вблизи стартового сайта транскрипции, например, как в случае промотора для полимеразы II, элемент ТАТА. Промотор также необязательно включает дистальные энхансерный или репрессорный элементы, которые могут быть расположены на расстоянии до нескольких тысяч пар оснований от стартового сайта транскрипции. Конститутивным промотором является промотор, который активен в большинстве условий окружающей среды и условий развития. Индуцируемым промотором является промотор, который активен при регуляции условиями окружающей среды и регуляции в ходе развития. Термин функционально связанный относится к функциональной связи между последовательностью регуляции экспрессии нуклеиновой кислоты (такой как промотор или ряд сайтов связывания факторов транскрипции) и второй последовательностью нуклеиновой кислоты, причем последовательность регуляции экспрессии управляет транскрипцией нуклеиновой кислоты, соответствующей второй последовательности.
В используемом в настоящем описании смысле термин приблизительно означает приблизительный диапазон плюс или минус 10% от указанного значения. Например, выражение приблизительно 20% охватывает диапазон 18-22%.
III. Экспрессия белков ΑΌΑΜΤ8
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина (ΑΌΑΜΤ8), обладающего высокой удельной активностью. В одном варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8, в культуральной среде, дополненной по меньшей мере одним компонентом, выбранным из кальция, цинка и никотинамида (витамина В3). В конкретном варианте белок ΑΌΑΜΤ8 экспрессируется в среде с добавлением по меньшей мере двух компонентов, выбранных из кальция, цинка и никотинамида (витамина В3). В еще одном варианте культуральную среду дополняют кальцием, цинком и никотинамидом (витамином В3). В некоторых вариантах культуральная среда, применяемая для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8, может включать не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду.
В одном аспекте предлагаются способы получения белка ΑΌΑΜΤ8. В одном варианте способы включают стадии культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8, в культуральной среде, дополненной по меньшей мере одним компонентом из цинка, кальция и никотинамида; извлечения фракции супернатанта из культуры; осуществления стадии центрифугирования или фильтрации, чтобы удалить любые остаточные клетки; осуществления стадии ультрафильтрации, чтобы сконцентрировать белок ΑΌΑΜΤ8; и осуществления стадии диафильтрации с использованием буфера, содержащего, по меньшей мере, кальций или цинк. В некоторых вариантах концентрация кальция может составлять по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,3, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 5 или более 5 мМ кальция. В других вариантах концентрация цинка может составлять по меньшей мере приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 или более 10 мкМ цинка. В некоторых вариантах собранный материал, бесклеточный супернатант или буфер для диафильтрации содержит комбинацию кальция и цинка в указанных выше концентрациях. В некоторых вариантах предел отсечения мембран для ультрафильтрации и/или диафильтрации может составлять, например, приблизительно 150 или 125, или 100, или 75, или 50, или 30, или 10, или менее 10 кД. В некоторых вариантах белком ΑΌΑΜΤ8 является ΑΌΑΜΤ813 или его биологически активное производное. В конкретном варианте белком ΑΌΑΜΤ813 является белок ΑΌΑΜΤ813 человека или его биологически активное производное. В некоторых вариантах культуральной средой, применяемой в способе, может быть не содержащая животных белков, не содержащая олигопептидов или химически определенная среда.
В одном варианте способ дополнительно включает стадию очистки, выбранную из группы, состоящей из ионообменной хроматографии, эксклюзионной хроматографии по размеру, аффинной хроматографии и хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия.
В еще одном варианте добавка цинка может быть осуществлена путем добавления препарата белка или полипептида, содержащего цинк. Например, обычные препараты инсулина содержат цинк в таких концентрациях, что добавление в среду приблизительно от 1 мг/л до приблизительно 10 мг/л инсулина также может приводить к добавлению приблизительно от 0,03 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ цинка, как рассчитано на основе подробной монографии для новолина N !ппоБе1 §иЬЦ, рекомбинантного инсулина человека, которую можно найти на сервере Мебксаре. Соответственно, в одном варианте культуральная среда, применяемая для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8, может быть дополнена содержащим цинк препаратом инсулина.
Базовая среда, которую дополняют цинком, кальцием и/или никотинамидом (витамином В3), как описано в настоящей публикации, выбранная для культивирования линии клеток хозяев, не является решающей для настоящего изобретения и может быть любой средой или сочетанием сред, известных в
- 9 023193 данной области, которые подходят для культивирования клеток млекопитающих. Такие среды, как модифицированная по Дульбекко среда Игла, среда Хама Р-12, минимальная необходимая среда Игла и среда ΚΡΜΙ-1640 и тому подобное, являются коммерчески доступными. Добавление факторов роста, таких как рекомбинантный инсулин, является необязательным.
В одном варианте базовая среда, применяемая для культивирования клетки, экспрессирующей белок ΛΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤ§13), может содержать смесь одной или нескольких коммерчески доступных химически определенных сред, например, модифицированной по Дульбекко среды Игла (ΌΜΕΜ) и среды Хама Р-12, которая дополнена одним или несколькими другими компонентами, отличными от цинка, кальция и никотинамида (витамина В3). Не ограничивающие примеры компонентов, которые можно использовать для дополнения коммерчески доступной среды, включают незаменимые аминокислоты (например, глутамин), неионогенные поверхностно-активные вещества (например, синпероник), первичные амины (например, этаноламин), полиамины (например, путресцин), следовые количества металлов (например, железа) и буферные средства (например, бикарбонат натрия). В конкретном варианте средой является среда ВС8, которая представлена в табл. 1. В другом конкретном варианте среда представляет собой среду ВАСИ, например среду ВАСИ-А13.
Таблица 1. Состав среды для культивирования клеток ВС8
Компонент Концентрация [г/кг]
ΒΜΕΜ/ΗΑΜ'Ξ Р12 11,75
Ь-глутамин 0,9
Синпероник 1,00
Этаноламин 0,00153
Путресцин.2НС1 0,0036
РеЗО4.7Н2О 0,0006
ЫаНСОз 2,0
Исторически, клетки животных культивировали в средах, содержащих сыворотку животных. Однако такие среды не полностью определены и несут риск инфекции. Поэтому специалисты в данной области разработали не содержащие белков среды, которые либо совсем не содержат никаких белков, либо не содержат, по меньшей мере, какого-либо белка, который не получен рекомбинантно. Сывороточный альбумин человека обычно используют в качестве добавки в бессывороточную культуру для получения рекомбинантных белков. Предпочтительные среды включают среды, описанные в патентах США № 6171825 и 6936441, в \УО 2007/077217 и в публикациях заявок на выдачу патентов США № 2008/0009040 и 2007/0212770.
Необязательно, неионогенное поверхностно-активное вещество, такое как полипропиленгликоль (например, плюроник® Р-61, плюроник® Р-68, плюроник® Р-71, плюроник® Р-108 или синпероник®), может быть добавлено в среду в качестве противопенного средства. Такое средство обычно применяют для защиты клеток от негативного действия аэрации (барботирования). Количество неионогенного поверхностно-активного вещества может быть в диапазоне от 0,05 до 10 г/л, предпочтительно от 0,1 до 5 г/л.
Среда, описанная в И8 6936441, особенно хорошо подходит для культивирования клеток СНО, но также может быть использована для других клеток. Другой подходящей средой является не содержащая олигопептидов среда, описанная в заявке на выдачу патента США № 2007/0212770 (Вах1ет 1и1егпайопа1 1пс., Вах1ет НеаНйсате 8.А.).
- 10 023193
Таблица 2. Примеры концентраций цинка, кальция и никотинамида (витамина В3), которые могут быть использованы для добавок в культуральные среды, применимые для экспрессии белка ΛΌΛΜΤδ
По меньшей мере 2 мкМ цинка Вар. 1 По меньшей мере 0,5 мМ кальция Вар, 2 По меньшей мере 2 мг/л никотинамида Вар. 3
По меньшей мере 5 мкМ цинка Вар. 4 По меньшей мере 1,5 мМ кальция Вар. 5 По меньшей мере 7 мг/л никотинамида Вар. 6
От 2 ДО 12 мкМ цинка Вар. 7 От 0,5 до 1,5 мМ кальция Вар. 8 От 2 до 7 мг/л никотинамида Вар. 9
От 5 мкМ до 12 мкМ цинка Вар. 10 По меньшЪй мере 0,6 мМ, 0,7 мМ, 0,8 мМ, 0,9 мМ, 1,0 мМ, 1,1 мМ, 1,2 мМ, 1,3 мМ, 1,4 мМ, 1,5 мМ, 1,6 мМ, 1,7 мМ, 1,8 мМ, 1,9 мМ, 2,0 мМ, 2,25 мМ, 2.5 мМ, 2,75 ММ, 3,0 мМ, 3.5 мМ, 4,0 мМ, 4,5 мМ, 5,0 мМ или больше кальция Вар. 11 По меньшей мере 3 мг/л, 4 мг/л, 5 мг/л, 6 мг/л, 7 мг/л, 8 мг/л, 9 мг/л, 10 мг/л, 15 мг/л, 20 мг/л или больше никотинамида Вар. 12
По меньшей мере 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 11 мкМ, 12 мкМ, 13 мкМ, 14 мкМ, 15 мкМ, 20 МКМ, 25 мкМ, 30 мкМ или больше цинка Вар. 13
*Вар. = Вариант
В одном варианте настоящее изобретение относится к способу экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина (ΛΌΛΜΤδ), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδ, в культуральной среде, содержащей по меньшей мере один из компонентов: цинк в концентрации по меньшей мере приблизительно 2 мкМ или кальций в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,5 мМ. В одном варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδΙ. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΑΌΛΜΤδ2. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ3. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ4. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδ5. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδό. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδ7. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδδ. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδ9. в другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΑΌΛΜΤδΙΟ. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΑΌΑΜΤδΙΤ В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδ12. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΑΌΛΜΤδ13. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδ14. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδ15. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδΙό. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΑΌΛΜΤδ17. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδ18. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδ19. В другом варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδ20. В предпочтительном варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΑΌΛΜΤδ13.
В одном варианте культуральная среда содержит по меньшей мере приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда содержит приблизительно от 2 мкМ до приблизительно 12 мкМ цинка. В еще одном варианте культуральная среда содержит по меньшей мере приблизительно 5 мкМ цинка. В одном варианте культуральная среда содержит приблизительно от 5 мкМ до приблизительно 12 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда содержит по меньшей мере приблизительно 0,5 мМ кальция. В еще одном варианте культуральная среда содержит приблизительно от 0,5 мМ до приблизительно 1,5 мМ кальция. В одном варианте культуральная среда содержит по меньшей мере приблизительно 2 мкМ цинка и по меньшей мере приблизительно 0,5 мМ кальция.
В следующих вариантах было обнаружено, что добавление никотинамида (витамина В3) дополнительно усиливает экспрессию и повышает удельную активность белков ΛΌΛΜΤδ в культуре клеток. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит по меньшей мере приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит по меньшей мере приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В еще одном варианте культуральная среда содержит приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 10 мг/л никотинамида (витамина В3).
В некоторых вариантах культуральная среда представляет собой не содержащую животных белков культуральную среду. В другом варианте культуральная среда представляет собой химически определенную среду. В некоторых вариантах культуральная среда может содержать один или несколько поли- 11 023193 аминов. В конкретном варианте полиамином является путресцин, например, в концентрации по меньшей мере 0,5 мг/л. В конкретном варианте культуральная среда содержит приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 8 мг/л путресцина.
В некоторых вариантах клетка или линия клеток, используемых в культуре, представляет собой бактериальную клетку, дрожжевую клетку, клетку насекомого, клетку птицы или клетку млекопитающего. В конкретном варианте линия клеток представляет собой линию клеток человека, линию клеток хомячка или линию клеток мыши. В более конкретном варианте линией клеток является линия клеток СНО, ВНК или НЕК. В предпочтительном варианте линией клеток является линия клеток СНО.
В некоторых вариантах нуклеиновая кислота, кодирующая белок ΆΌΆΜΤδ, содержит регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок ΆΌΆΜΤδ. В одном варианте регуляторной последовательностью является промотор. В некоторых вариантах промотор является конститутивным промотором. В других вариантах промотор является индуцируемым промотором.
В некоторых вариантах способы, предлагаемые в настоящем описании, включают применение системы непрерывной культуры клеток (т.е. непрерывное культивирование клеток). В одном варианте система непрерывной культуры представляет собой систему хемостатной культуры (т.е. культивирование клеток в хемостате). В другом варианте система непрерывной культуры представляет собой систему турбидостатной культуры (т.е. культивирование клеток в турбидостате). В еще одном варианте система непрерывной культуры представляет собой систему перфузируемой культуры (т.е. культивирование клеток с перфузией). В некоторых вариантах система непрерывной культуры может функционировать в режиме суспензии. В других вариантах система непрерывной культуры может функционировать в режиме прикрепления клеток. В некоторых вариантах режим прикрепления включает использование микроносителя, например, пористого микроносителя.
В некоторых вариантах способы, предлагаемые в изобретении, включают применение системы периодической культуры клеток (т.е. периодическое культивирование клеток). В одном варианте система периодической культуры представляет собой систему культуры в виде отдельных партий (т.е. культивирование по одной партии культуры). В другом варианте система периодической культуры представляет собой систему культуры с подпиткой (т.е. культивирование клеток с подпиткой). В еще одном варианте система периодической культуры представляет собой систему культуры с выходом множества партий (т.е. культивирование с многократным получением партий). В некоторых вариантах система периодической культуры может функционировать в режиме суспензии. В других вариантах система периодической культуры может функционировать в режиме прикрепления. В некоторых вариантах режим прикрепления включает использованием микроносителя, например, пористого микроносителя.
В некоторых вариантах культуру можно поддерживать при температуре приблизительно от 35°С до приблизительно 37°С. В других вариантах культуру можно поддерживать при рН приблизительно от 6,9 до приблизительно 7,3. В конкретном варианте культуру можно поддерживать при рН приблизительно от 7,05 до приблизительно 7,15.
В некоторых вариантах способы, предлагаемые в настоящем изобретении, будут давать белки ΆΌΆΜΤδ13 в культуральной среде (т.е. экспрессируемые ΛΌΆΜΤδ13) с удельными активностями, составляющими по меньшей мере 600 единиц на миллиграмм белка ΆΌΆΜΤδ13. В других вариантах удельная активность может составлять по меньшей мере 800 единиц на миллиграмм белка ΆΌΛΜΤδ13. В других вариантах удельная активность может составлять по меньшей мере 1000 единиц на миллиграмм белка ΛΌΛΜΤδ13. В других вариантах удельная активность может составлять по меньшей мере 1500 единиц на миллиграмм белка ΛΌΛΜΤδ13. В других вариантах удельная активность может составлять по меньшей мере 2000 единиц на миллиграмм белка ΛΌΆΜΤδ13.
В других вариантах способы обеспечивают получение культур, которые дают по меньшей мере 400 единиц активности ΛΌΆΜΤδ13 на литр культуры в сутки (единиц/л/сутки). В одном варианте способы обеспечивают получение культур, которые дают по меньшей мере 800 единиц активности ΆΌΛΜΤδ13 на литр культуры в сутки (единиц/л/сутки).
А. ΆΌΆΜΤδ 13
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ13, обладающего повышенной общей и/или удельной активностью. Было обнаружено, что предпочтительно путем дополнения ростовой среды кальцием, цинком и/или никотинамидом (витамином В3) полипептиды ΆΌΆΜΤδ13, обладающие высокой удельной активностью, могут быть рекомбинантно экспрессированы и извлечены из культуры клеток.
Способы экспрессии ΆΌΆΜΤδ13 предложены в публикации νθ 2009/086309, содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей. В указанной публикации описаны подходящие способы и условия культивирования, которые можно поддерживать на протяжении культивирования. Как описано в настоящей публикации, культуры клеток, используемые для экспрессии белков ΆΌΆΜΤδ13, обычно можно поддерживать при температуре приблизительно от 34 до 37°С и рН приблизительно от 6,8 до 7,3.
Способы контролирования температуры и рН при культивировании хорошо известны в данной об- 12 023193 ласти и, как правило, основаны на использовании датчиков, которых помещают в биореактор или помещают в петли, по которым циркулирует культуральная среда, или помещают в отбираемые образцы культуральной среды. Подходящие встроенные в систему рН-сенсоры включают сенсор Μей1е^ То1ейо 1пРго 3100/125/Р1100 (Μей1е^-Τо1еάо 1п§о1ф 1пс., ВейГогф ΜΑ). Способы изменения конкретного параметра для того, чтобы поддерживать его на предварительно определяемом уровне, также хорошо известны. Например, поддержание постоянной температуры обычно заключается в нагревании или охлаждении биореактора или подаваемой среды (если осуществляют процесс с подпиткой или непрерывный процесс); поддержание постоянного рН обычно заключается в подборе и введении достаточного количества подходящего буфера (обычно бикарбоната) и добавление при необходимости кислоты, такой как хлористо-водородная кислота, или щелочи, такой как гидроксид натрия, бикарбонат натрия или их смесь, в подаваемую среду для подпитки. Возможно калибровка встроенного в систему датчика рН может отклоняться с течением времени, например, в течение периодов времени, составляющих дни или недели, в течение которых культивируют клетки. В таком случае может быть полезным повторная установка встроенного в систему датчика с использованием измерений, полученных от недавно откалиброванного дополнительного, не входящего в систему датчика.
В одном варианте способы включают культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, дополненной по меньшей мере одним компонентом, выбранным из кальция, цинка и никотинамида (витамина В3). В конкретном варианте белок ΑΌΑΜΤδ экспрессируется в среде, дополненной по меньшей мере двумя компонентами, выбранными из кальция, цинка и никотинамида (витамина В3). В еще одном варианте культуральная среда дополнена кальцием, цинком и никотинамидом (витамином В3). В некоторых вариантах культуральная среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную культуральную среду.
1. Добавка цинка
Преимущественно было обнаружено, что повышенная ферментативная активность и удельная активность ΑΌΑΜΤδ13 может быть извлечена из культуры клеток, выращенной в среде, дополненной цинком. Например, в примере 1 показано, что белок ΑΌΑΜΤδ13, экспрессированный в культуральной среде, содержащей 1,432 мг/л ΖηδΟ4·7Η2Ο (5 мкМ цинка), имеет на 40-100% более высокую удельную активность, чем белок ΑΌΑΜΤδ13, экспрессированный в культуральной среде, содержащей только 0,432 мг/л ΖηδΟ4·7Η2Ο (1,5 мкМ цинка) (сравн. табл. 10 и 11). Кроме того, такой эффект воспроизводим, как показано в примере 2 (сравн. таблицу 13 и 14); примере 4 (табл. 16 и 19); и примере 5 (табл. 20 и 21).
Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), обладающего повышенной удельной активностью, посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), в культуральной среде, дополненной цинком, например, содержащей по меньшей мере 2 мкМ цинка. Подобным образом, настоящее изобретение также относится к способам получения композиции белка ΑΌΑΜΤδ (например, композиции ΑΌΑΜΤδ13), имеющей повышенную общую активность или удельную активность, посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), в культуральной среде, дополненной цинком, например, содержащей по меньшей мере 2 мкМ цинка.
В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В одном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В следующих вариантах культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. Подходящие диапазоны концентрации цинка обычно определяют по токсичности для культуры клеток, которая может возникать в присутствии высоких концентраций цинка, например, при концентрациях выше 20, 25, 30, 40 мкМ и тому подобное. Как будет понятно специалисту в данной области, степень, в которой концентрации цинка являются ингибирующими для конкретной системы культивирования, будет в высокой степени зависеть, наряду с другими факторами, от типа клетки, используемой для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ, компонентов используемой культуральной среды и рабочего режима, используемого для культивирования (например, периодический по сравнению с непрерывным; суспензия по сравнению с прикрепленными клетками; хемостат по сравнению с перфузией; и т.д.). В некоторых случаях могут потребоваться более высокие концентрации цинка, когда компоненты культуральной среды могут связывать цинк из раствора, например, в случаях, когда культуральная среда содержит альбумин. Соответственно, подходящие диапазоны концентрации цинка обычно определяют в соответствии с типом культи- 13 023193 вируемых клеток, используемой средой и рабочим режимом. Специалист легко сможет определить подходящие верхние пределы использования добавки цинка на основании используемой индивидуальной системы культивирования.
В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΛΌΆΜΤ§13), включающий культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤ§13, в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤ§13, в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В одном варианте не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом варианте не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда содержит точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В следующих вариантах не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΛΌΛΜΤ§13), включающий культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδ13. в химически определенной культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδΠ, в химически определенной культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В одном варианте химически определенная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом варианте химически определенная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В следующих вариантах не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В некоторых вариантах химически определенная среда не будет содержать полученных от животных белков и/или полипептидов. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΆρΛΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδΠ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδΠ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤ§13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδΠ, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤ§13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или по меньшей мере приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК 293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΛΌΛΜΤ§13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδΠ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка, в условиях непрерывного культивирования или куль- 14 023193 тивирования с подпиткой. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условиями непрерывного культивирования являются условия культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условия непрерывного культивирования представляют собой условия культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток ΗΕΚ293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей 36°С. В одном варианте температуру культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток ΗΕΚ293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
- 15 023193
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка, при этом рН культуры поддерживают на уровне или приблизительно от 6,9 до 7,3. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка, при этом рН культуры поддерживают на уровне или приблизительно от 6,9 до 7,3. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΡΑΜ^^Η, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка, при этом рН культуры поддерживают на уровне или приблизительно от 6,9 до 7,3. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΡΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка, при этом рН культуры поддерживают на уровне или приблизительно от 6,9 до 7,3. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΡΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка, при этом рН культуры поддерживают на уровне или приблизительно от 6,9 до 7,3. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΡΑΜΤδ13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток ΗΕΚ293 или линия клеток ΒΗΚ. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, равной или приблизительно составляющей от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В одном варианте культуральная среда, применяемая для экспрессии белка ΑΡΑΜΤδ, может быть дополнена цинком в конечной концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно от 2 мкМ до по меньшей мере приблизительно 12 мкМ. В некоторых вариантах культуральная среда может быть дополнена цинком в конечной концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 2 мкМ или по меньшей мере приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или более высокие уровни цинка. Как правило, можно использовать любую соль цинка для дополнения среды согласно изобретению, не ограничивающие примеры приемлемых солей включают ΖηδΟ4·7Η2Ο, ΖηδΟ3·2Η2Ο, (С..11,Ο );Ζιΐ;·2ΙΙΤλ ΖηΒτ2, ΖηΒτ2·2Η2Ο, ΖηΟ12, Ζη(ΝΟ3)2·6Η2Ο, Ζη(Η2ΡΟ4)2·Η2Ο, (С2Н3О2)^ш2Н2О и тому подобное. В некоторых вариантах фармацевтически приемлемую соль цинка используют для дополнения культуральных сред согласно изобретению.
2. Добавка кальция
Было успешно обнаружено, что повышенная ферментативная активность и удельная активность ΑΌΑΜΤδ13 может быть извлечена из культуры клеток, выращенной в среде, дополненной кальцием. Традиционные среды для культивирования клеток, например ΌΜΕΜ/Ρ12, обычно содержали приблизительно 1 мМ кальция. Исторически такие высокие уровни кальция вводили в среду, способствующую росту культур прикрепленных клеток. Однако в настоящее время коммерчески доступные среды, предназначенные для суспензионных культур, содержат значительно более низкие уровни кальция, например приблизительно 0,1 мМ кальция. Такие более низкие уровни кальция используют исходя из того, что необходимо предотвратить агрегацию клеток, культивируемых способами на основе выращивания в суспензии. Известно, что более низкие уровни кальция достаточны для размножения клеток в суспензии и экспрессии рекомбинантных белков, однако авторы изобретения обнаружили, что такие низкие уровни кальция недостаточны для экспрессии белков ΑΌΑΜΤδ (например, Λ^ΑΜΤδ13).
Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), обладающего повышенной удельной активностью, посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), в культуральной среде, дополненной кальцием, например, содержащей по меньшей мере
- 16 023193
0,5 мМ кальция. Подобным образом, настоящее изобретение также относится к способам получения композиции белка ΑΌΑΜΤδ (например, композиции ΛΌΆΜΤ813), обладающего повышенной общей активностью или удельной активностью, посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΆΜΓ8 (например, ΆΌΆΜΤ813), в культуральной среде, дополненной кальцием, например, содержащей по меньшей мере 0,5 мМ кальция.
В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΆΌΑΜΤ813), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В одном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В других вариантах культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5,
2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция.
В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤ813), включающий культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В одном варианте не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В других вариантах не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤ813), включающий культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑϋΑΜΤδ13, в химически определенной культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в химически определенной культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В одном варианте химически определенная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В других вариантах не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В некоторых вариантах химически определенная среда не будет содержать полученных от животного белков и/или полипептидов. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑϋΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая
- 17 023193 может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤ813), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5,
2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция, в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤ813), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В других вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей 36°С. В одном варианте температуру культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концен- 18 023193 трации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΛΌΛΜΤ§13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤ§13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция, при этом рН культуры поддерживают точно или приблизительно на уровне от 6,9 до 7,3. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΆΜΤ§13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция, при этом рН культуры поддерживают точно или приблизительно на уровне от 6,9 до 7,3. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδΠ, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция, при этом рН культуры поддерживают точно или приблизительно на уровне от 6,9 до 7,3. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδΠ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция, при этом рН культуры поддерживают точно или приблизительно на уровне от 6,9 до 7,3. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤ§13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 3 0 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΛΌΛΜΤ§13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδΠ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤ§13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда
- 19 023193 дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΆΌΆΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΆΌΆΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В еще одном родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΆΌΆΜΤδ13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΆΌΆΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΆΌΆΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В еще одном родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΆΌΆΜΤδ13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополни- 20 023193 тельно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5,
2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В еще одном родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток ΗΕΚ293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
Как правило, можно использовать любую соль кальция для дополнения среды согласно изобретению. Не ограничивающие примеры приемлемых солей включают СаС12, СаРРО3^2Н2О, Са12, СаВг2, (С2Н3О2)2Са, (СНО2)2Са, (СбН7О6)2Са, (С6Н5О7)2Са32Н2О и тому подобное. В некоторых вариантах используют фармацевтически приемлемую соль кальция для дополнения культуральных сред согласно изобретению.
3. Добавка никотинамида (витамина В3)
Было успешно обнаружено, что повышенная ферментативная активность и удельная активность ΑΌΑΜΤδ13 может быть извлечена из культуры клеток, выращенной в среде, дополненной никотинамидом (витамином В3). Например, пример 2 показывает, что белок ΑΌΑΜΤδ13, экспрессированный в культуральной среде, содержащей 7 мг/л никотинамида (витамина В3), обладает на 60% более высокой удельной активностью, чем белок ΑΌΑΜΤδ13, экспрессированный в культуральной среде, содержащей только 2 мг/л никотинамида (табл. 13; сравн. дни 4 и 7 с 11 днем). Удивительно, что такое действие является синергетическим с действием добавки цинка, так как экспрессия ΑΌΑΜΤδ13 в среде, содержащей 7 мг/л никотинамида (витамина В3) и 5 мкМ цинка, приводит к увеличению удельной активности белка ΑΌΑΜΤδ13 на 200-300% (сравн. табл. 14 (11 день) с табл. 13 (4 и 7 дни)).
Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), обладающего повышенной удельной активностью, посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), в культуральной среде, дополненной никотинамидом (витамином В3), например, содержащей по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина В3). Подобным образом, настоящее изобретение также относится к способам получения композиции белка ΑΌΑΜΤδ (например, композиции ΑΌΑΜΤδ13), обладающего повышенной общей активностью или удельной активностью, посредством
- 21 023193 культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), в культуральной среде, дополненной никотинамидом (витамином В3), например, содержащей по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина В3).
В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤ813), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В одном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3). В других вариантах культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3). Подходящие диапазоны концентраций никотинамида (витамина В3) обычно определяют на основании токсичности для культуры клеток, которая может возникать в присутствии высоких концентраций никотинамида (витамина В3), например, при концентрациях выше чем 15, 20, 30, 40 мг/л и тому подобное. Как будет понятно специалисту в данной области, степень, в которой концентрации никотинамида (витамина В3) ингибируют конкретную систему культивирования, будет в значительной мере зависеть, наряду с другими факторами, от типа клетки, используемой для экспрессии белка ΑΒΑΜΤ8, компонентов используемой культуральной среды и рабочего режима, используемого для культивирования (например, периодический по сравнению с непрерывным; суспензия по сравнению с прикрепленными клетками; хемостат по сравнению с перфузией; и т.д.). В некоторых случаях могут требоваться более высокие концентрации никотинамида (витамина В3), когда компоненты культуральной среды могут связывать никотинамид (витамин В3) из раствора. Соответственно, подходящие диапазоны концентраций никотинамида (витамина В3) обычно определяют в соответствии с типом культивируемых клеток, используемой средой и рабочим режимом. Специалист легко сможет определить подходящие верхние пределы использования добавки никотинамида (витамина В3) на основании используемой индивидуальной системы культивирования.
В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤ813), включающий культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΒΑΜΤ813, в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В одном варианте не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3). В других вариантах не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3). В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤ813), включающий культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в химически определенной культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в химически определенной культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В одном варианте химически определенная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3). В других вариантах не содержащая животных белков и/или полипептидов культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3). В некоторых вариантах химически определенная среда не будет содержать полученных от животного белков и/или полипептидов. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤ813), причем способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую ки- 22 023193 слоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3). В других вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3). В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток ΗΕΚ293 или линия клеток ВИК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3), в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3), в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3), в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В следующих вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3), в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток ΗΕΚ293 или линия клеток ВΗΚ. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3), при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3), при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида, при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В других вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3), при этом культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей 36°С. В одном варианте температуру культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7
- 23 023193 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤ§13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΛΌΛΜΤ§13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδΠ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3), при этом рН культуры поддерживают на уровне точно или приблизительно от 6,9 до 7,3. В другом варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδΠ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3), при этом рН культуры поддерживают на уровне точно или приблизительно от 6,9 до 7,3. В одном варианте способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΒΛΜΤ§13, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3), при этом рН культуры поддерживают на уровне точно или приблизительно от 6,9 до 7,3. В других вариантах способ включает культивирование клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤ§13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3), при этом рН культуры поддерживают точно или приблизительно от 6,9 до 7,3. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, равной или приблизительно составляющей от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδΠ, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΛΌΛΜΤ§13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδΠ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или
- 24 023193 рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток ΗΕΚ293 или линия клеток ΒΗΚ. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В еще одном родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток ΗΕΚ293 или линия клеток ΒΗΚ. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В еще одном родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирова- 25 023193 ния или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды, В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 2 0 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В другом родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В еще одном родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В некоторых вариантах культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤδ13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΑΜΤδ13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1,
1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования
- 26 023193 или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ§13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤ§13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ§13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1,
1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ§13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤ§13), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ§13, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В другом родственном варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В некоторых вариантах культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ§13, явля- 27 023193 ется клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В другом варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤ813), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В другом родственном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В некоторых вариантах культуральная среда содержит точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3) и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
В одном варианте предлагается способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΌΑΜΤ813), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей цинк, кальций и никотинамид (витамин В3). В некоторых вариантах цинк присутствует в культуральной среде в концентрации, составляющей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 5, от 2 до 12 мкМ, от 5 до 12 мкМ или по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше. В некоторых вариантах кальций присутствует в культуральной среде в концентрации, составляющей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5, 1,5, от 0,5 до 1,5 или по меньшей мере 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2,
1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше. В некоторых вариантах никотинамид (витамин В3) присутствует в культуральной среде в концентрации, составляющей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 7, от 2 до 7 мг/л или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или больше.
Как специально описано в настоящей публикации и указано в виде вариантов 14-93 (табл. 3-6), предполагается любое сочетание концентраций трех компонентов (т.е. цинка, кальция и никотинамида (витамина В3)) для применения в способах согласно изобретению. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. В конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования в хемостате. В другом конкретном варианте условием непрерывного культивирования является условие культивирования с перфузией. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, коди- 28 023193 рующую белок ΑΌΑΜΤ§13, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин.
Таблица 3. Примеры вариантов культуральных сред, содержащих по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина В3), которые применимы для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ§13
По меньшей мере 0,5 мМ кальция По меньшей мере 1,5 мМ кальция От 0,5 мМ до 1,5 мМ кальция По меньшей мере 0,6 мМ, 0,7 мМ, 0,8 мМ, 0,9 мМ, 1,0 мМ, 1,1 мМ, 1,2 мМ, 1,3 мМ, 1.4 мМ, 1,5 мМ, 1,6 мМ, 1,7 мМ, 1,8 мМ, 1,9 мМ, 2,0 мМ, 2,25 мМ, 2,5 мМ, 2,75 мМ, 3,0 мМ, 3.5 мМ, 4,0 мМ, 4,5 мМ, 5,0 мМ или больше кальция
По меньшей мере 2 мкм цинка Вар. 14 Вар. 15 Вар. 16 Вар. 17
По меньшей мере 5 мкМ цинка Вар. 18 Вар. 19 Вар. 20 Вар. 21
От 2 мкМ до 12 мкМ цинка Вар. 22 Вар. 23 Вар. 24 Вар. 25
От 5 мкМ до 12 мкМ цинка Вар. 2б Вар. 27 Вар. 28 Вар. 29
По меньшей мере 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 11 мкМ, 12 мкМ, 13 мкМ, 14 мкМ, 15 мкМ, 20 мкМ, 25 мкМ, 30 мкМ или больше цинка Вар. 30 Вар. 31 Вар. 32 Вар. 33
*Вар. = вариант
Таблица 4. Примеры вариантов культуральных сред, содержащих по меньшей мере 7 мг/л никотинамида (витамина В3), которые применимы для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ§13
По меньшей мере 0,5 мМ кальция По меньшей мере 1,5 мМ кальция От 0,5 мМ до 1,5 мМ кальция По меньшей мере 0,6 мМ, 0,7 мМ, 0,8 мМ, 0,9 мМ, 1,0 мМ, 1,1 мМ, 1,2 мМ, 1,3 мМ, 1.4 мМ, 1,5 мМ, 1,6 мМ, 1,7 мМ, 1,8 мМ, 1,9 мМ, 2,0 мМ, 2,25 мМ, 2.5 мМ, 2,75 мМ, 3,0 мМ, 3,5 мМ, 4,0 мМ, 4,5 мМ, 5,0 мМ или больше кальция
По меньшей мере 2 мкМ цинка Вар. 34 Вар. 35 Вар. 36 Вар. 37
По меньшей мере 5 мкМ цинка Вар. 38 Вар. 39 Вар. 40 Вар. 41
От 2 мкМ до 12 мкМ цинка Вар. 42 Вар. 43 Вар. 44 Вар. 45
От 5 мкМ до 12 мкМ цинка Вар. 46 Вар. 47 Вар. 48 Вар. 49
По меньшей мере 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 11 мкМ, 12 мкМ, 13 мкМ, 14 мкМ, 15 мкМ, 20 мкМ, 25 мкМ, 30 мкМ или больше цинка Вар. 50 Вар. 51 Вар. 52 Вар. 53
*Вар. = вариант
- 29 023193
Таблица 5. Примеры вариантов культуральных сред, содержащих от 2 до 7 мг/л никотинамида (витамина В3), которые применимы для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ13
По меньшей мере 0,5 мМ кальция По меньшей мере 1,5 мМ кальция От 0,5 мМ до 1,5 мМ кальция По меньшей мере 0,6 мМ, 0,7 мМ, 0,8 мМ, 0,9 мМ, 1,0 мМ, 1,1 ММ, 1,2 мМ, 1,3 мМ, 1.4 мМ, 1,5 мМ, 1,6 мМ, 1,7 мМ, 1,8 ММ, 1,9 мМ, 2,0 ММ, 2,25 мМ, 2.5 мМ, 2,75 мМ, 3,0 мМ, 3,5 мМ, 4,0 мМ, 4,5 мМ, 5,0 мМ или больше кальция
По меньшей мере 2 мкМ цинка Вар. 54 Вар. 55 Вар. 56 Вар. 57
По меньшей мере 5 мкМ цинка Вар. 58 Вар. 59 Вар. 60 Вар. 61
От 2 мкМ до 12 мкМ цинка Вар. 62 Вар. 63 Вар. 64 Вар. 65
От 5 мкМ до 12 мкМ цинка Вар. 66 Вар. 67 Вар. 68 Вар. 69
По меньшей мере 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 11 мкМ, 12 мкМ, 13 мкМ, 14 мкМ, 15 мкМ, 20 мкМ, 25 мкМ, 3 0 мкМ или больше цинка Вар. 70 Вар. 71 Вар. 72 Вар. 73
*Вар. = вариант
Таблица 6. Примеры вариантов культуральных сред, содержащих по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или больше никотинамида (витамина В3), которые применимы для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ13
По меньшей мере 0,5 мМ кальция По меньшей мере 1,5 мМ кальция От 0,5 мМ до 1,5 мМ кальция По меньшей мере 0,6 мМ, 0,7 мМ, 0,8 мМ, 0,9 мМ, 1,0 мМ, 1,1 мМ, 1,2 мМ, 1,3 мМ, 1.4 мМ, 1,5 мМ, 1,6 мМ, 1,7 мМ, 1,8 мМ, 1,9 мМ, 2,0 мМ, 2,25 мМ, 2.5 ММ, 2,75 мМ, 3,0 мМ, 3,5 мМ, 4,0 ММ, 4,5 ММ, 5,0 мМ или больше кальция
По меньшей мере 2 мкМ цинка Вар. 74 Вар. 75 Вар. 76 Вар. 77
По меньшей мере 5 мкМ цинка Вар. 78 Вар. 79 Вар. 80 Вар. 81
От 2 мкМ до 12 мкМ цинка Вар. 82 Вар. 83 Вар. 84 Вар. 85
От 5 мкМ до 12 мкМ цинка Вар. 86 Вар. 87 Вар. 88 Вар. 89
По меньшей мере 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, б мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 11 мкМ, 12 мкМ, 13 мкМ, 14 мкМ, 15 мкМ, 20 мкМ, 25 мкМ, 30 мкМ или больше цинка Вар. 90 Вар. 91 Вар. 92 Вар. 93
*Вар. = вариант
В. Клетки-хозяева и векторы
Рекомбинантные белки ΆΌΆΜΤδ могут быть получены в результате экспрессии в любой подходящей прокариотической или эукариотической системе хозяев. Примеры эукариотических клеток включают, без ограничения, клетки млекопитающих, такие как СНО, ί'Όδ, НЕК293, ВНК, δΙ<-^ρ и НерС2; клетки насекомых, например, клетки δΡ9, клетки δΡ21, клетки δ2 и клетки Шдй РКе; и дрожжевые клетки, например, клетки δ;κΠι;·ιΐΌΐη\^5 или δсЬ^ζο5ассЬа^οтусе5. В одном варианте белки ΆΌΆΜΤδ могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, дрожжевых клетках, клетках насекомых, клетках птиц,
- 30 023193 клетках млекопитающих и тому подобное. Например, в линии клеток человека, линии клеток хомячка или линии клеток мыши. В одном конкретном варианте линией клеток является линия клеток СНО, ВНК или НЕК. В предпочтительном варианте линией клеток является линия клеток СНО.
В одном варианте клетка может представлять собой любую клетку млекопитающего, которую можно культивировать предпочтительно в условиях производственного процесса (т.е. по меньшей мере в 1 л), чтобы получить требуемый белок ΛΌΛΜΤδ, такой как ΛΌΛΜΤδ13. Примеры включают линию клеток почки обезьяны СУ1, трансформированную δν40 (ίΌδ-7, АТСС СКЬ 1651); линию клеток эмбриональной почки человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, ОгаЬат с! а1., ί. Осп νΐΐΌΐ., 36:59 (1977)); клетки почки сирийского хомячка (ВНК, ЛТСС ССЬ 10); клетки яичника китайского хомячка/-ОНРК, такие как субклон Όυΐ<Χ-Β 11 (СНО, иЕаиЬ апЕ СЬа81п, Ргос. Νηΐ1. АсаЕ. δά. υδΑ, 77:4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (ТМ4, Μа!Ье^, Вю1. КергоЕ, 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (Ον1 АТСС ССЬ 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (νΈΚΟ-76, АТСС СКЬ-1587); клетки карциномы шейки матки человека (НсЬа, АТСС ССЬ 2); клетки почки собаки (ЫОСК, АТСС ССЬ 34); клетки печени крысы ВиГГа1о (ВКЬ 3А, АТСС СКЬ 1442); клетки легкого человека (ν138, АТСС ССЬ 75); клетки печени человека (Нер О2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС ССЬ51); клетки ΤΚΙ (ΜаίЬе^ е! а1., Аппа1е Ν.Υ. АсаЕ. δα., 383:44-68 (1982)); клетки ЫКС 5; клетки Ρδ4; и линию гепатомы человека (Нер О2). Предпочтительно линия клеток является линией клеток грызунов, особенно линией клеток хомячка, такой как СНО или ВНК.
Широкое множество векторов можно использовать для экспрессии белка Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13), и векторы могут быть выбраны из эукариотических и прокариотических экспрессирующих векторов. В некоторых вариантах предлагается плазмидный вектор для применения для экспрессии белка Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13). Как правило, плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, которые получены от вида, совместимого с клеткой-хозяином, используют применительно к таким хозяевам. Вектор может нести сайт репликации, а также маркирующие последовательности, которые способны обеспечивать фенотипическую селекцию трансформированных клеток. Плазмида будет содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13), функционально связанную с одной или несколькими регуляторными последовательностями, например, с промотором.
Предпочтительным способом получения подходящих клонов клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный белок Α^ΑΜΤδ, является следующий способ. Дефицитную по ННРК линию клеток СНО НиКХ-В 11 трансфицируют ННРК-экспрессирующим вектором, чтобы обеспечить возможность экспрессии соответствующего рекомбинантного белка, по существу, как описано в патенте США № 5250421 (КаиГтап е! а1., ОепеЕсе 1п8Й!и!е, 1пс.). Селекцию осуществляют путем выращивания в среде, не содержащей гипоксантина/тимидина (НТ), и осуществляют амплификацию соответствующей области, кодирующей экспрессию рекомбинантного белка Α^ΑΜΤδ и гена ОНРК, размножая клетки в условиях возрастающих концентраций метотрексата. В соответствующих случаях линии клеток СНО могут быть адаптированы для роста в не содержащей сыворотки и/или белков среде, по существу, как описано в υδ 6100061 (КеЬег е! а1., 1ттипо АкЕепдеееШсЬай).
В другом предпочтительном варианте подходящие клетки НЕК293 получают в результате трансфекции конструкцией, содержащей селектируемый маркер гигромицина, и селекции трансформантов на основании резистентности к антибиотику.
Способность некоторых вирусов инфицировать клетки или проникать в клетки в результате опосредованного рецепторами эндоцитоза и стабильно и эффективно интегрироваться в геном клеткихозяина и экспрессировать вирусные гены делает их привлекательными кандидатами для переноса чужеродных нуклеиновых кислот в клетки (например, клетки млекопитающих). Соответственно, в некоторых вариантах вирусный вектор используют для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13), в клетку-хозяина для экспрессии. Вирусный вектор будет содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13), функционально связанную с одной или несколькими регуляторными последовательностями, например, с промотором. Альтернативно, вирусный вектор может не содержать регуляторную последовательность, и вместо нее управление экспрессией белка Α^ΑΜΤδ будет основано на регуляторной последовательности, имеющейся в клетке-хозяине. Не ограничивающие примеры вирусных векторов, которые можно использовать для доставки нуклеиновой кислоты, включают аденовирусные векторы, ΑΑV-векторы и ретровирусные векторы.
В одном варианте аденовирусный экспрессирующий вектор включает такие конструкции, содержащие аденовирусные последовательности, достаточные для поддержания упаковки конструкции и, в конечном итоге, экспрессии конструкции Α^ΑΜΤδ, которая была в нем клонирована. Аденовирусные векторы обеспечивают возможность введения чужеродных последовательностей длиной до 7 т.н. (ОгипЬаие е! а1., δет^ηа^ ш ^го1о§у, 200(2):535-546, 1992)).
В другом варианте можно использовать аденоассоциированный вирус (АА'У), чтобы ввести нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13), в клетку-хозяина для экспрессии. Системы ΑΑV были описаны ранее и, как правило, хорошо известны в данной области
- 31 023193 (КеНеНег апб ^8, Вю1есНтдие8, 17(6):1110-7, 1994; Сойеп е( а1., Ргос Nаί1Αсаб 8с1 υ8Α, 89(13):60946098, 1992; Сипе1, Ν;·ι( 1ттип, 13(2-3):141-64, 1994; Μиζусζка, Сигг Пр Μ^ι^^ 1ттипо1, 158:97-129, 1992). Подробности, касающиеся создания и применения векторов τΑΑν, описаны, например, в патентах США № 5139941 и 4797368, каждый из которых включен в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей.
В одном варианте можно использовать ретровирусный экспрессирующий вектор для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), в клетку-хозяина для экспрессии. Такие системы были описаны ранее и, как правило, хорошо известны в данной области (Μ;·ιηη е( а1., Се11, 33:153-159, 1983; №со1а8 апб КиЫп8(е1п, Ιη: Vес(ο^8: Α 8иг\'еу оГ то1еси1аг с1отпд тес(ог8 апб (Ней и8е8, Кобпдие/ апб ЭепНагб(, еб8., 8(опеНат: ВийегуогП, рр. 494-513, 1988; Τет^η. Ιη: Сепе ΤΐΉη8&Γ, КисНег1ара(1 (еб.), Νρ» Υο^к: Р1епит Рге88, рр. 149-188, 1986). В конкретном варианте ретровирусным вектором является лентивирусный вектор (см., например, №-11бий е( а1., 8с1епсе, 272(5259):263267, 1996; ΖυΓί^γ е1 а1., №1 Вю1есНпо1, 15(9):871-875, 1997; В1отег е1 а1., ί Пго1., 71(9):6641-6649, 1997; патенты США № 6013516 и 5994136).
Не ограничивающие примеры векторов для прокариотической экспрессии включают плазмиды, такие как рК8ЕХ рЕк ιτΕΑΌ и т.д., причем промоторы, используемые в прокариотических экспрессирующих векторах, включают 1ас, (гс, Ггр, ^есΑ. а^аВΑ^ и т.д. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (ί) в случае экспрессии в дрожжах такие векторы, как ρΑО, рР1С, ρΥΕ8, ρΜΕΤ, в которых использованы такие промоторы, как АОХ1, СΑР, СΑ^1, Αυ^ и т.д.; (ίί) в случае экспрессии в клетках насекомых такие векторы, как рМТ, рАс5, р1В, ρΜΕВ, ρВΑС и т.д., в которых использованы такие промоторы, как РН, р10, ΜΤ, Ас5, Ор1Е2, др64, ро1Н и т.д., и (ίίί) в случае экспрессии в клетках млекопитающих такие векторы, как р8^, ρСΜV, ρКс/К8V, ρс^NΑ3, ρВРV и т.д., и векторы, полученные из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса, ретровирусы и т.д., с использованием таких промоторов, как СΜV, 8ν40, ЕР-1, иЬС, Ρ^ν, ΑΌν, ВРV и βактина.
В некоторых вариантах способы культивирования клеток согласно изобретению могут включать использование микроносителя. Настоящее изобретение наряду с другими аспектами относится к способам крупномасштабной экспрессии белков ΑΌΑΜΤ8. В некоторых вариантах культивирование клеток может быть осуществлено в больших биореакторах в условиях, подходящих для обеспечения площади поверхности для специфичного культивирования в больших объемах, чтобы получить высокие плотности клеток и высокую экспрессию белка. Одним из способов обеспечения таких условий роста является использование микроносителей для культуры клеток в биореакторах с механическим перемешиванием. В другом варианте такие требования роста удовлетворяются благодаря использованию суспензионной культуры клеток.
С. Способы культивирования
В некоторых вариантах способы согласно настоящему изобретению могут включать использование системы культивирования клеток, функционирующей в периодическом или непрерывном режиме работы. Например, когда используют периодические культуры клеток, они могут функционировать в режиме получения единичных партий, режиме с подпиткой или режиме получения множества партий. Подобным образом, непрерывное культивирование клеток может быть осуществлено, например, в режиме перфузии, турбидостатном или хемостатном режиме. Периодическое и непрерывное культивирование клеток может быть осуществлено либо в условиях поддержания суспензии или в условиях прикрепленных клеток. В случае культивирования в условиях суспензии клетки будут свободно суспендированы и перемешаны в культуральной среде. Альтернативно, в условиях прикрепления клетки будут связаны с твердой фазой, например, микроносителем, пористым микроносителем, дисковидным носителем, керамическим картриджем, полым волокном, плоским листом, гелевым матриксом и тому подобное.
Периодическое культивирование обычно является крупномасштабным культивированием, при котором инокулят клеток культивируют до максимальной плотности в реакторе или ферментере и собирают и обрабатывают в виде одной партии. Культура с подпиткой обычно представляет собой периодическую культуру, которую дополняют либо свежими питательными веществами (например, ограничивающими рост субстратами), либо добавками (например, предшественниками продуктов). Раствор для подпитки обычно является высококонцентрированным, чтобы избежать разбавления содержимого биореактора. При культивировании с многократным получением партий клетки помещают в культуральную среду и выращивают до требуемой плотности клеток. Затем, чтобы избежать наступления фазы снижения и гибели клеток, культуру разбавляют полной ростовой средой перед достижением максимальной концентрации клеток. Количество и частота разбавления широко варьируют и зависят от параметров роста линии клеток и возможностей способа культивирования. Процесс можно повторять столько, сколько требуется, и если клетки и среду не удаляют при субкультивировании, то объем культуры будет периодически увеличиваться при осуществлении каждого разбавления. С возрастающим объемом можно справляться при наличии реактора достаточного размера, позволяющего производить разбавления в сосуде, или посредством разделения разбавленной культуры на несколько сосудов. Целесообразность такого типа культивирования заключается в поддержании клеток в состоянии экспоненциального роста. Серийное суб- 32 023193 культивирование отличается тем, что объем культуры всегда периодически возрастает, возможны многократные сборы клеток, клетки продолжают расти и процесс может продолжаться столько, сколько требуется. В некоторых вариантах белок ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) может быть извлечен после сбора супернатанта периодической культуры.
Непрерывная культура может быть суспензионной культурой, в которую непрерывно поступают питательные вещества благодаря подаче свежей среды, при этом объем культуры обычно поддерживается постоянным посредством одновременного удаления израсходованной среды. В способах с использованием хемостата и турбидостата извлеченная среда содержит клетки. Таким образом, клетки, остающиеся в сосуде для культивирования клеток, должны расти, чтобы поддерживать стационарное состояние. В хемостатном способе скорость роста обычно контролируют, регулируя скорость разведения, т.е. скорость, с которой добавляют свежую среду. Скорость роста клеток в культуре можно регулировать, например, на уровне субмаксимальной скорости роста, за счет изменения скорости разбавления. Напротив, в случае турбидостатного способа скорость разбавления устанавливают так, чтобы обеспечить максимальную скорость роста, которую клетки могут достигать в данных рабочих условиях, таких как рН и температура.
В случае культивирования с перфузией извлекаемая среда лишена клеток, которые остаются в сосуде для культивирования, например, в результате фильтрования или способов центрифугирования, которые приводят к возвращению клеток в культуру. Однако обычно мембраны, используемые для фильтрования, не удерживают 100% клеток, и поэтому часть клеток удаляется при извлечении среды. Это может быть не критичным для функционирования перфузионных культур при высоких скоростях роста, поскольку основная часть клеток остается в сосуде для культивирования.
Систему реактора с механическим перемешиванием можно использовать для периодического и непрерывного культивирования клеток, осуществляемого в режимах культивирования в суспензии или в прикрепленном состоянии. Обычно система реактора с механическим перемешиванием может функционировать в виде любого обычного реактора с механическим перемешиванием с любым типом мешалки, таким как мешалка Раштона, гидрокрыло, мешалка с наклонными лопастями или в виде гребного пропеллера.
Способы согласно изобретению могут включать использование культивирования клеток с подпиткой или непрерывное культивирование клеток, такое как культивирование клеток с перфузией или хемостатное культивирование, для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ. В некоторых вариантах было обнаружено, что среды для культивирования с подпиткой, дополненные цинком в концентрациях, составляющих по меньшей мере приблизительно до 12 мкМ, обеспечивали экспрессию белка ΑΌΑΜΤδ с повышенными удельными активностями (табл. 20). Причем в случае культур с подпиткой, дополненных цинком в конечной концентрации 12 мкМ, характерные скорости роста клеток и общая активность не изменялись, тогда как удельные активности экспрессированных белков ΑΌΑΜΤδ13 продолжали увеличиваться. Полученные данные отличались от результатов, которые наблюдали в экспериментах с использованием культивирования клеток в хемостате. В таких экспериментах дополнение культуральной среды цинком в конечной концентрации 5 мкМ приводило к повышению удельной активности ΑΌΑΜΤδ13 в супернатанте (табл. 21). Однако при более высоких уровнях добавок, 8,5 и 12 мкМ, характерные скорости роста клеток и общие выходы белка ΑΌΑΜΤδ13 снижались, хотя удельная активность ΑΌΑΜΤδ13 в супернатанте культуры оставалась высокой.
Соответственно, в одном варианте способы согласно изобретению включают использование культивирования клеток с подпиткой средой, содержащей цинк в концентрации, составляющей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ, точно или приблизительно от 2 до 5 мкМ, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В некоторых вариантах концентрация цинка может составлять по меньшей мере приблизительно от 5 мкМ до по меньшей мере приблизительно 12 мкМ. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду.
1. Непрерывная культура
Преимущественно настоящее изобретение относится к способам экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ, например ΑΌΑΜΤδ13, с высокой удельной активностью в непрерывной культуре. Такие способы обеспечивают возможность длительной экспрессии и очистки белков ΑΌΑΜΤδ из одной культуры в течение длительных периодов времени. В частности, было обнаружено, что высокие уровни экспрессии и удельной активности белка ΑΌΑΜΤδ13 можно поддерживать по меньшей мере в течение 53 дней в 10литровом хемостатном биореакторе в условиях, предлагаемых в настоящем изобретении (пример 3, см. табл. 15). В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
Соответственно, в одном варианте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) с высокой специфичностью в течение длительного периода времени. В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 суток или, по меньшей мере, точно или приблизительно в течение 14, 21, 28 суток, или, по меньшей
- 33 023193 мере, точно или приблизительно в течение 5, 6, 7 недель, или, по меньшей мере, точно или приблизительно в течение 2 месяцев или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В некоторых таких вариантах уровень экспрессии, активности или удельной активности общего белка ΑΌΑΜΤδ поддерживают в культуре в течение длительного периода времени. В других вариантах характерную скорость роста, плотность клеток и тому подобное поддерживают в культуре в течение длительного периода времени. В некоторых вариантах культуральная среда может быть дополнена по меньшей мере одним компонентом из кальция, цинка или никотинамида (витамина В3), например, в концентрации, соответствующей любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9). В одном конкретном варианте способ включает использование культивирования клеток в хемостате. В другом варианте способ включает использование культивирования клеток в турбидостате. В еще одном варианте способ включает использование культивирования клеток с перфузией. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
В одном варианте методику непрерывного культивирования клеток можно использовать для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) в культуре клеток, содержащей цинк, кальций и/или никотинамид (витамин В3) в концентрации согласно любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9), в течение по меньшей мере 7 суток. В другом варианте методику непрерывного культивирования клеток можно использовать для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) в культуре клеток, содержащей цинк, кальций и/или никотинамид (витамин В3) в концентрации согласно любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9), в течение по меньшей мере 14 суток. В другом варианте методику непрерывного культивирования клеток можно использовать для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) в культуре клеток, содержащей цинк, кальций и/или никотинамид (витамин В3) в концентрации согласно любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9), в течение по меньшей мере 21 суток. В другом варианте методику непрерывного культивирования клеток можно использовать для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) в культуре клеток, содержащей цинк, кальций и/или никотинамид (витамин В3) в концентрации согласно любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9), в течение по меньшей мере 1 месяца. В другом варианте методику непрерывного культивирования клеток можно использовать для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) в культуре клеток, содержащей цинк, кальций и/или никотинамид (витамин В3) в концентрации согласно любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9), в течение по меньшей мере 2 месяцев. В другом варианте методику непрерывного культивирования клеток можно использовать для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) в культуре клеток, содержащей цинк, кальций и/или никотинамид (витамин В3) в концентрации согласно любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9), в течение по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или больше месяцев. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
В некоторых вариантах способы экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) могут включать использование непрерывного культивирования клеток в среде, содержащей цинк в концентрации, составляющей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка, точно или приблизительно от 2 до 5 мкМ цинка, точно или приблизительно от 3 до 5 мкМ цинка, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка, в течение по меньшей мере 7 суток. В одном конкретном варианте способ включает использование культивирования клеток в хемостате. В другом варианте способ включает использование культивирования клеток в турбидостате. В еще одном варианте способ включает использование культивирования клеток с перфузией. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
В одном варианте способ экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ включает культивирование в условиях непрерывной культуры клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка, в течение по меньшей мере 7 суток. В других вариантах культуральная среда будет содержать по меньшей мере приблизительно 3 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда будет содержать по меньшей мере приблизительно 5 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда будет содержать точно или приблизительно от 2 до 5 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда будет содержать точно или приблизительно от 3 до 5 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда будет содержать точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда будет содержать точно или приблизительно от 3 до 12 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда будет содержать точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда будет содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В одном конкретном варианте способ включает использование культивирования клеток в хемостате. В другом вари- 34 023193 анте способ включает использование культивирования клеток в турбидостате. В еще одном варианте способ включает использование культивирования клеток с перфузией. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤ8 является ΑΌΑΜΤ813.
В одном варианте способ экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 включает культивирование в условиях непрерывной культуры клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция, в течение по меньшей мере 7 суток. В других вариантах культуральная среда будет содержать по меньшей мере приблизительно 1,0 мМ кальция. В другом варианте культуральная среда будет содержать по меньшей мере приблизительно 1,5 мМ кальция. В другом варианте культуральная среда будет содержать точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В другом варианте культуральная среда будет содержать точно или приблизительно от 1,0 до 1,5 мМ кальция. В другом варианте культуральная среда будет содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В одном конкретном варианте способ включает использование культивирования клеток в хемостате. В другом варианте способ включает использование культивирования клеток в турбидостате. В еще одном варианте способ включает использование культивирования клеток с перфузией. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤ8 является ΑΌΑΜΤ813.
В одном варианте способ экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 включает культивирование в условиях непрерывной культуры клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΠΑΜ^^Η), в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3), в течение по меньшей мере 7 суток. В других вариантах культуральная среда будет содержать по меньшей мере приблизительно 5 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте культуральная среда будет содержать по меньшей мере приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте культуральная среда будет содержать точно или приблизительно от 2 до 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте культуральная среда будет содержать точно или приблизительно от 5 до 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте культуральная среда будет содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или больше никотинамида (витамина В3). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В одном конкретном варианте способ включает использование культивирования клеток в хемостате. В другом варианте способ включает использование культивирования клеток в турбидостате. В еще одном варианте способ включает использование культивирования клеток с перфузией. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤ8 является ΑΌΑΜΤ813.
В одном варианте способ экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 включает культивирование в условиях непрерывной культуры клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), в культуральной среде, дополненной и цинком и кальцием, в течение по меньшей мере 7 суток. В некоторых вариантах концентрации цинка и кальция могут быть любыми, выбранными из концентраций, описанных в настоящей публикации. В некоторых вариантах концентрации цинка и кальция будут соответствовать одному из вариантов 94-113 (табл. 7). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В одном конкретном варианте способ включает использование культивирования клеток в хемостате. В другом варианте способ включает использование культивирования клеток в турбидостате. В еще одном варианте способ включает использование культивирования клеток с перфузией. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤ8 является ΑΒΑΜΈ^.
В одном варианте способ экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 включает культивирование в условиях непрерывной культуры клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), в культуральной среде, дополненной и цинком и никотинамидом (витамином В3), в течение по меньшей мере 7 суток. В некоторых вариантах концентрации цинка и никотинамида (витамина В3) могут быть любыми, выбранными из концентраций, описанных в настоящей публикации. В некоторых вариантах концентрации цинка и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 114-133 (табл. 8). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2
- 35 023193 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В одном конкретном варианте способ включает использование культивирования клеток в хемостате. В другом варианте способ включает использование культивирования клеток в турбидостате. В еще одном варианте способ включает использование культивирования клеток с перфузией. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΆΌΆΜΤδ является ΆΌΆΜΤδ13.
В одном варианте способ экспрессии белка ΛΌΆΜΤδ включает культивирование в условиях непрерывной культуры клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΆΜΤδ (например, ΛΌΛΜΤδ13), в культуральной среде, дополненной и кальцием и никотинамидом (витамином В3), в течение по меньшей мере 7 суток. В некоторых вариантах концентрации кальция и никотинамида (витамина В3) могут быть любыми, выбранными из концентраций, описанных в настоящей публикации. В некоторых вариантах концентрации кальция и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 134-149 (табл. 9). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В одном конкретном варианте способ включает использование культивирования клеток в хемостате. В другом варианте способ включает использование культивирования клеток в турбидостате. В еще одном варианте способ включает использование культивирования клеток с перфузией. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΛΌΆΜΤδ является ΆΌΛΜΤδ13.
В одном варианте способ экспрессии белка ΛΌΆΜΤδ включает культивирование в условиях непрерывной культуры клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΆΜΤδ (например, ΛΌΆΜΤδ13), в культуральной среде, дополненной цинком, кальцием и никотинамидом (витамином В3), в течение по меньшей мере 7 суток. В некоторых вариантах концентрации цинка, кальция и никотинамида (витамина В3) могут быть любыми, выбранными из концентраций, описанных в настоящей публикации. В некоторых вариантах концентрации цинка, кальция и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 14-93 (табл. 3-6). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В одном конкретном варианте способ включает использование культивирования клеток в хемостате. В другом варианте способ включает использование культивирования клеток в турбидостате. В еще одном варианте способ включает использование культивирования клеток с перфузией. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΆΌΆΜΤδ является ΑΌΆΜΤδ13.
В одном варианте культуру поддерживают при плотности клеток, составляющей приблизительно от 0,5х106 до 4х107 клеток/мл, в течение длительного периода времени. В других вариантах поддерживают плотность клеток, соответствующую концентрации приблизительно от 1,0 х106 до приблизительно 1,0х107 клеток/мл, в течение длительного периода времени. В других вариантах поддерживают плотность клеток, соответствующую концентрации приблизительно от 1,0х106 до приблизительно 4,0х106 клеток/мл, в течение длительного периода времени. В других вариантах поддерживают плотность клеток, соответствующую концентрации приблизительно от 1,0х106 до приблизительно 4,0х106 клеток/мл, в течение длительного периода времени. В следующих вариантах можно поддерживать плотность, соответствующую концентрации приблизительно от 2,0х106 до приблизительно 4,0х106 или приблизительно от 1,0х106 до приблизительно 2,5х106, или приблизительно от 1,5х106 до приблизительно 3,5х106, или в любом другом сходном диапазоне, в течение длительного периода времени. Плотность клеток, при которой поддерживают культуру клеток для получения рекомбинантного белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), будет зависеть от условий культивирования и среды, используемой для экспрессии белка. Специалист в данной области легко сможет определить оптимальную плотность клеток для культуры клеток, продуцирующих белок ΆΌΆΜΤδ. В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В одном конкретном варианте способ включает использование культивирования клеток в хемостате. В другом варианте способ включает использование культивирования клеток в турбидостате. В еще одном варианте способ включает использование культивирования клеток с перфузией. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΛΌΆΜΤδ является ΛΌΆΜΤδ13.
В других вариантах способы экспрессии ΆΌΆΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 500 единиц активности ΆΌΆΜΤδ13 на литр культуры в сутки (500 единиц/л/сутки), например, единиц ΡΚЕΤδ-V\VΡ73-активности. с удельной активностью, составляющей, по меньшей мере, точно или приблизительно 500 единиц/мг А13. В других вариантах способы экспрессии ΆΌΆΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 600 единиц/л/сутки.
- 36 023193
В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 700 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 800 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 900 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 1000 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 1100 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 1200 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 1300 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 1400 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 1500 единиц/л/сутки. В следующих вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 2000 единиц/л/сутки. В одном конкретном варианте способ включает использование культивирования клеток в хемостате. В другом варианте способ включает использование культивирования клеток в турбидостате. В еще одном варианте способ включает использование культивирования клеток с перфузией. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
В другом варианте способы обеспечивают возможность длительной экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ13 с высокими удельными активностями, например, с удельной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 600 единиц/мг белка А13 или по меньшей мере приблизительно 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 или больше единиц/мг белка А13, в течение длительного периода времени. В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В одном конкретном варианте способ включает использование культивирования клеток в хемостате. В другом варианте способ включает использование культивирования клеток в турбидостате. В еще одном варианте способ включает использование культивирования клеток с перфузией. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
2. Периодическая культура
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ, например ΑΌΑΜΤδ13, с высокой удельной активностью в периодической культуре. В некоторых вариантах культуральная среда может представлять собой среду, дополненную по меньшей мере одним компонентом из кальция, цинка или никотинамида (витамина В3), например, в концентрации согласно любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9). В одном конкретном варианте способ включает использование культивирования клеток в виде отдельных партий. В другом варианте способ включает использование культивирования клеток с подпиткой. В еще одном варианте способ включает использование культивирования клеток с многократным получением партий. В некоторых вариантах культивирование можно осуществлять в виде периодических суспензионных культур. В других вариантах культивирование можно осуществлять в виде периодических прикрепленных культур. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
В одном варианте методику культивирования клеток с подпиткой или многократным получением партий можно использовать для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) в культуре клеток, содержащей цинк, кальций и/или никотинамид (витамин В3) в концентрации согласно любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9), в течение по меньшей мере 7 суток. В другом варианте методику культивирования клеток с подпиткой или многократным получением партий можно использовать для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) в культуре клеток, содержащей цинк, кальций и/или никотинамид (витамин В3) в концентрации согласно любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9), в течение по меньшей мере 14 суток. В другом варианте методику культивирования клеток с подпиткой или с многократным получением партий можно использовать для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) в культуре клеток, содержащей цинк, кальций и/или никотинамид (витамин В3) в концентрации согласно любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9), в течение по меньшей мере 21 суток. В другом варианте методику культивирования клеток с подпиткой или с многократным получением партий можно использовать для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) в культуре клеток, содержащей цинк, кальций и/или никотинамид (витамин В3) в концентрации согласно любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9), в течение по меньшей мере 1 месяца. В другом варианте методику культивирования клеток с подпиткой или с многократным получением партий можно использовать для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) в культуре клеток, содержащей цинк, кальций и/или никотинамид (витамин В3) в концен- 37 023193 трации согласно любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9), в течение по меньшей мере 2 месяцев. В другом варианте методику культивирования клеток с подпиткой или с многократным получением партий можно использовать для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13) в культуре клеток, содержащей цинк, кальций и/или никотинамид (витамин В3) в концентрации согласно любому из вариантов 1-149 (табл. 2-9), в течение по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или больше месяцев. В некоторых вариантах культивирование можно осуществлять в виде суспензионных периодических культур. В других вариантах культивирование можно осуществлять в виде прикрепленных периодических культур. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΆΌΆΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
В некоторых вариантах способы экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13) могут включать использование культивирования клеток с подпиткой или с многократным получением партий в среде, содержащей цинк в концентрации, составляющей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка, точно или приблизительно от 2 до 5 мкМ цинка, точно или приблизительно от 3 до 5 мкМ цинка, точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка, или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка, в течение по меньшей мере 7 суток. В некоторых вариантах культивирование можно осуществлять в виде суспензионных периодических культур. В других вариантах культивирование можно осуществлять в виде прикрепленных периодических культур. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΆΌΆΜΤδ является ΆΌΆΜΤδ 13.
В одном варианте способ экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ включает культивирование в условиях культуры с подпиткой или культуры с получением многократных партий клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция, в течение по меньшей мере 7 суток. В других вариантах культуральная среда будет содержать по меньшей мере приблизительно 1,0 мМ кальция. В другом варианте культуральная среда будет содержать по меньшей мере приблизительно 1,5 мМ кальция. В другом варианте культуральная среда будет содержать точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В другом варианте культуральная среда будет содержать точно или приблизительно от 1,0 до 1,5 мМ кальция.
В другом варианте культуральная среда будет содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В некоторых вариантах культивирование можно осуществлять в виде суспензионных периодических культур. В других вариантах культивирование можно осуществлять в виде прикрепленных периодических культур. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΆΌΆΜΤδ является ΆΌΆΜΤδ13.
В одном варианте способ экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ включает культивирование в условиях культуры с подпиткой или культуры с многократным получением партий клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3), в течение по меньшей мере 7 суток. В других вариантах культуральная среда будет содержать по меньшей мере приблизительно 5 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте культуральная среда будет содержать по меньшей мере приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте культуральная среда будет содержать точно или приблизительно от 2 до 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте культуральная среда будет содержать точно или приблизительно от 5 до 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте культуральная среда будет содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или больше никотинамида (витамина В3). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В некоторых вариантах культивирование можно осуществлять в виде суспензионных периодических культур. В других вариантах культивирование можно осуществлять в виде прикрепленных периодических культур. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΆΌΆΜΤδ является ΆΌΆΜΤδ13.
В одном варианте способ экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ включает культивирование в условиях культуры с подпиткой или культуры с многократным получением партий клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), в культуральной среде, дополненной и
- 38 023193 цинком и кальцием, в течение по меньшей мере 7 суток. В некоторых вариантах концентрации цинка и кальция могут быть любыми, выбранными из концентраций, описанных в настоящей публикации. В некоторых вариантах концентрации цинка и кальция будут соответствовать одному из вариантов 94-113 (табл. 7). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В некоторых вариантах культивирование можно осуществлять в виде суспензионных периодических культур. В других вариантах культивирование можно осуществлять в виде прикрепленных периодических культур. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
В одном варианте способ экспрессии белка ΛΌΛΜΤδ включает культивирование в условиях культуры с подпиткой или культуры с многократным получением партий клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), в культуральной среде, дополненной и цинком и никотинамидом (витамином В3), в течение по меньшей мере 7 суток. В некоторых вариантах концентрации цинка и никотинамида (витамина В3) могут быть любыми, выбранными из концентраций, описанных в настоящей публикации. В некоторых вариантах концентрации цинка и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 114-133 (табл. 8). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В некоторых вариантах культивирование можно осуществлять в виде суспензионных периодических культур. В других вариантах культивирование можно осуществлять в виде прикрепленных периодических культур. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
В одном варианте способ экспрессии белка ΛΌΛΜΤδ включает культивирование в условиях культуры с подпиткой или культуры с многократным получением партий клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδ (например, ΑΌΛΜΤδ13), в культуральной среде, дополненной и кальцием и никотинамидом (витамином В3), в течение по меньшей мере 7 суток. В некоторых вариантах концентрации кальция и никотинамида (витамина В3) могут быть любыми, выбранными из концентраций, описанных в настоящей публикации. В некоторых вариантах концентрации кальция и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 134-149 (табл. 9). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В некоторых вариантах культивирование можно осуществлять в виде суспензионных периодических культур. В других вариантах культивирование можно осуществлять в виде прикрепленных периодических культур. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδ13.
В одном варианте способ экспрессии белка ΛΌΛΜΤδ включает культивирование в условиях культуры с подпиткой или культуры с многократным получением партий клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), в культуральной среде, дополненной цинком, кальцием и никотинамидом (витамином В3), в течение по меньшей мере 7 суток. В некоторых вариантах концентрации цинка, кальция и никотинамида (витамина В3) могут быть любыми, выбранными из концентраций, описанных в настоящей публикации. В некоторых вариантах концентрации цинка, кальция и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 14-93 (табл. 3-6). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В некоторых вариантах культивирование можно осуществлять в виде суспензионных периодических культур. В других вариантах культивирование можно осуществлять в виде прикрепленных периодических культур. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
В одном варианте культуру поддерживают при плотности клеток, составляющей приблизительно от 0,5х106 до 4х107 клеток/мл, в течение длительного периода времени. В других вариантах поддерживают плотность клеток, соответствующую концентрации приблизительно от 1,0 х106 до приблизительно 1,0х107 клеток/мл, в течение длительного периода времени. В других вариантах поддерживают плотность клеток, соответствующую концентрации приблизительно от 1,0х106 до приблизительно 4,0х106 клеток/мл, в течение длительного периода времени. В других вариантах поддерживают плотность клеток, соответствующую концентрации приблизительно от 1,0х106 до приблизительно 4,0х106 клеток/мл, в течение длительного периода времени. В следующих вариантах можно поддерживать плотность клеток, соответствующую концентрации приблизительно от 2,0х106 до приблизительно 4,0х106 или приблизи- 39 023193 тельно от 1,0х106 до приблизительно 2,5х106, или приблизительно от 1,5х106 до приблизительно 3,5х106, или в любом другом сходном диапазоне, в течение длительного периода времени. Плотность клеток, при которой поддерживают культуру клеток для получения рекомбинантного белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), будет зависеть от условий культивирования и среды, используемой для экспрессии белка. Специалист в данной области легко сможет определить оптимальную плотность клеток для культуры клеток, продуцирующих белок ΑΌΑΜΤδ. В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В некоторых вариантах культивирование можно осуществлять в виде суспензионных периодических культур. В других вариантах культивирование можно осуществлять в виде прикрепленных периодических культур. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ 13.
В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 500 единиц активности ΑΌΑΜΤδ13 на литр культуры в сутки (500 единиц/л/сутки), например, единиц ΕΚΕΤδ-νχνΡ'73-активности. с удельной активностью, составляющей, по меньшей мере, точно или приблизительно 500 единиц/мг А13. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 600 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 700 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 800 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 900 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 1000 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 1100 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 1200 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 1300 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 1400 единиц/л/сутки. В других вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 1500 единиц/л/сутки. В следующих вариантах способы экспрессии ΑΌΑΜΤδ13 обеспечивают получение, по меньшей мере, точно или приблизительно 2000 единиц/л/сутки. В некоторых вариантах культивирование можно осуществлять в виде суспензионных периодических культур. В других вариантах культивирование можно осуществлять в виде прикрепленных периодических культур. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
В другом варианте способы обеспечивают длительную экспрессию белка ΑΌΑΜΤδ13 с высокими удельными активностями, например удельной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 600 единиц/мг белка А13 или по меньшей мере приблизительно 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 или больше единиц/мг белка А13, в течение длительного периода времени. В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В некоторых вариантах культивирование можно осуществлять в виде суспензионных периодических культур. В других вариантах культивирование можно осуществлять в виде прикрепленных периодических культур. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ 13.
3. Условия культивирования
Неожиданно также было обнаружено, что жизнеспособность клеток и активность ΑΌΑΜΤδ13 могут быть повышены за счет небольших изменений температуры и рН культуры клеток. Как можно видеть на фиг. 2, удельная активность экспрессированного ΑΌΑΜΤδ13 сильно повышена, когда клетки, несущие нуклеотид, кодирующий белок ΑΌΑΜΤδ13, культивируют при рН ниже приблизительно 7,30. Температура, хотя и в меньшей степени, также является фактором, который вносит вклад в удельную активность ΑΌΑΜΤδ13 в таких исследованиях. Подобным образом, было обнаружено, что объемная продуктивность А13 (измеренная по ΕΚ.ΕΤδ-ν\νΕ73) в супернатантах культур, выращенных при рН приблизительно от 6,80 до приблизительно 7,3, была значительно увеличена по сравнению с уровнями рН выше или ниже указанного диапазона. На продуктивность ΑΌΑΜΤδ13 также влияла температура культуры. Максимальная активность обнаружена в культурах, выращенных при температуре приблизительно от 34°С до приблизительно 37°С.
В других вариантах способы экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ включают стадию поддержания темпера- 40 023193 туры культуральной среды на уровне приблизительно от 34 до приблизительно 37°С. В некоторых вариантах культуральную среду можно поддерживать при температуре 36,5°С или ниже, 36,0°С или ниже, 35,5°С или ниже или ниже 35,0°С. В конкретном варианте температуру поддерживают на уровне приблизительно 36°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при сочетании температуры и диапазонов рН, указанных выше, например, 36,5°С или ниже и рН, например, 7,15 или меньше. В предпочтительном варианте культуру поддерживают при температуре 36,0°С и рН 7,10.
Соответственно, в некоторых вариантах способы экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 включают стадию поддержания рН культуральной среды на уровне рН приблизительно от 6,8 до 7,3. В некоторых вариантах рН может иметь значение приблизительно от 7,0 до приблизительно 7,25 или приблизительно от 7,05 до приблизительно 7,15. В некоторых вариантах рН можно поддерживать на уровне рН 7,20 или меньше, 7,15 или меньше, 7,10 или меньше или 7,05 или меньше. В одном конкретном варианте рН культуральной среды поддерживают на уровне рН приблизительно 7,1.
В одном варианте изобретение относится к способу экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8, который включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), при температуре, составляющей точно или приблизительно от 34°С до приблизительно 37°С, при рН точно или приблизительно от 6,8 до 7,3. В другом варианте температура культуры будет составлять точно или приблизительно от 35°С до приблизительно 37°С и рН будет составлять точно или приблизительно от 6,8 до 7,3. В другом варианте температура культуры будет составлять точно или приблизительно от 35,5°С до приблизительно 36,5°С и рН будет составлять точно или приблизительно от 6,8 до 7,3. В другом варианте температура культуры будет составлять точно или приблизительно 36°С и рН будет составлять точно или приблизительно от 6,8 до 7,3. В одном варианте культуральная среда будет дополнена цинком. В другом конкретном варианте культуральная среда будет дополнена кальцием. В другом конкретном варианте культуральная среда будет дополнена никотинамидом (витамином В3). В одном варианте культуральная среда будет дополнена цинком и кальцием. В одном варианте концентрации цинка и кальция будут соответствовать одному из вариантов 94-113 (табл. 7). В другом варианте культуральная среда будет дополнена цинком и никотинамидом (витамином В3). В одном варианте концентрации цинка и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 114-133 (табл. 8). В другом варианте культуральная среда будет дополнена кальцием и никотинамидом (витамином В3). В одном варианте концентрации кальция и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 134-149 (табл. 9). В еще одном варианте культуральная среда будет концентрирована цинком, кальцием и никотинамидом (витамином В3). В одном варианте концентрации цинка, кальция и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 14-93 (табл. 3-6).
В другом варианте изобретение относится к способу экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8, включающему культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), при температуре, составляющей точно или приблизительно от 34°С до приблизительно 37°С, при рН точно или приблизительно от 6,9 до 7,25. В другом варианте температура культуры будет составлять точно или приблизительно от 35°С до приблизительно 3 7°С и рН будет составлять точно или приблизительно от 6,9 до 7,25. В другом варианте температура культуры будет составлять точно или приблизительно от 35,5°С до приблизительно 36,5°С и рН будет составлять точно или приблизительно от 6,9 до 7,25. В другом варианте температура культуры будет составлять точно или приблизительно 36°С и рН будет составлять точно или приблизительно от 6,9 до 7,25. В одном варианте культуральная среда будет дополнена цинком. В другом конкретном варианте культуральная среда будет дополнена кальцием. В другом конкретном варианте культуральная среда будет дополнена никотинамидом (витамином В3). В одном варианте культуральная среда будет дополнена цинком и кальцием. В одном варианте концентрации цинка и кальция будут соответствовать одному из вариантов 94-113 (табл. 7). В другом варианте культуральная среда будет дополнена цинком и никотинамидом (витамином В3). В одном варианте концентрации цинка и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 114-133 (табл. 8). В другом варианте культуральная среда будет дополнена кальцием и никотинамидом (витамином В3). В одном варианте концентрации кальция и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 134-149 (табл. 9). В еще одном варианте культуральная среда будет концентрирована цинком, кальцием и никотинамидом (витамином В3). В одном варианте концентрации цинка, кальция и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 14-93 (табл. 3-6).
В другом варианте изобретение относится к способу экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8, включающему культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), при температуре, составляющей точно или приблизительно от 34°С до приблизительно 37°С, при рН точно или приблизительно от 7,0 до 7,20. В другом варианте температура культуры будет составлять точно или приблизительно от 35°С до приблизительно 37°С и рН будет составлять точно или приблизительно от 7,0 до 7,20. В другом варианте температура культуры будет составлять точно или приблизительно от 35,5°С до приблизительно 36,5°С и рН будет составлять точно или приблизительно от 7,0 до 7,20. В другом варианте температура культуры будет составлять точно или приблизительно 36°С и рН будет составлять точно или приблизительно от 7,0 до 7,20. В одном варианте культуральная среда будет дополнена цинком. В другом конкретном варианте культуральная среда будет дополнена кальци- 41 023193 ем. В другом конкретном варианте культуральная среда будет дополнена никотинамидом (витамином В3). В одном варианте культуральная среда будет дополнена цинком и кальцием. В одном варианте концентрации цинка и кальция будут соответствовать одному из вариантов 94-113 (табл. 7). В другом варианте культуральная среда будет дополнена цинком и никотинамидом (витамином В3). В одном варианте концентрации цинка и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 114-133 (табл. 8). В другом варианте культуральная среда будет дополнена кальцием и никотинамидом (витамином В3). В одном варианте концентрации кальция и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 134-149 (табл. 9). В еще одном варианте культуральная среда будет концентрирована цинком, кальцием и никотинамидом (витамином В3). В одном варианте концентрации цинка, кальция и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 14-93 (табл. 3-6).
Принцип выращивания клеток на микроносителях впервые описан уап \Уе/е1 (уап \Уе/е1 ΑΕ., №1иге 1967 ОсЕ 7; 216(5110):64-5) и предусматривает прикрепление клеток на поверхности небольших твердых частиц, суспендируемых в среде для роста. Такие способы обеспечивают высокие отношения поверхности к объему и, следовательно, обеспечивают эффективное потребление питательных веществ. Кроме того, в случае экспрессии секретируемых белков в линиях эукариотических клеток, повышенное отношение поверхности к объему обеспечивает более высокие уровни секреции и, следовательно, более высокие выходы белка в супернатанте культуры. Наконец, такие способы позволяют легко увеличивать масштаб эукариотических экспрессирующих культур.
Клетки, экспрессирующие белок ΑΌΑΜΤδ, могут быть связаны со сферическим или пористым микроносителем во время роста культуры клеток. Микроноситель может представлять собой микроноситель, выбранный из группы, состоящей из микроносителей на основе декстрана, коллагена, пластика, желатина и целлюлозы и других веществ, которые описаны ВиИет (1988, в δρ^е^ апй СпГГпк, Лп^та1 се11 Вю1есЬпо1о§у, 3:283-303). Таким образом, согласно одному варианту осуществления изобретения клетки, экспрессирующие белок ΑΌΑΜΤδ, культивируют на сферических микроносителях. Согласно другому варианту осуществления изобретения клетки, экспрессирующие белок ΑΌΑΜΤδ, культивируют на пористых микроносителях. Также можно выращивать клетки до биомассы на сферических микроносителях и субкультивировать клетки, когда они достигнут конечной биомассы в ферментере и перед получением экспрессируемого белка на пористом микроносителе или наоборот. Сферическими микроносителями являются носители, выбранные из группы, состоящей из носителей с гладкой поверхностью, таких как СуЮйех™ I, СуЮйех™ 2 и СуЮйех™ 3 (ΟΕ НеаНЬсате), и макропористых микроносителей, таких как Су(ороге™ I, СуЮроге™ 2, Су1о1ше™ 1 и С’уЮПпе™ 2 (ΟΕ НеаИЬсате).
IV. Культуральные среды
В одном аспекте настоящее изобретение относится к культуральным средам, которые применимы для экспрессии белков ΑΌΑΜΤδ, обладающих высокими удельными активностями. Преимущественно было обнаружено, что при дополнении культуральной среды различными компонентами, такими как сочетания цинка, кальция и никотинамида (витамина В3), активности ферментов ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), экспрессированных в клетках, культивируемых в такой среде, значительно повышаются, причем ферменты экспрессируются на таких же высоких уровнях или даже более высоких уровнях, чем в случае клеток, культивируемых в средах без добавок.
Способы получения не содержащих животных белков и химически определенных культуральных сред известны в данной области, например, описаны в патентах США № 6171825 и 6936441, в \УО 2007/077217 и в публикациях заявок на выдачу патентов США № 2008/0009040 и 2007/0212770, описания которых включены в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей. В одном варианте культуральная среда, используемая в способах, описанных в настоящей публикации, представляет собой не содержащую животных белков или не содержащую олигопептидов среду. В некоторых вариантах культуральная среда может быть химически определенной. В некоторых вариантах культуральные среды могут содержать по меньшей мере один полиамин в концентрации приблизительно от 0,5 мг/л до приблизительно 10 мг/л.
Соответственно, в одном варианте предлагается культуральная среда, в которую добавлены дополнительно кальций, цинк и/или витамин В3. В некоторых вариантах среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную среду. В некоторых вариантах не содержащую животных белков или не содержащую олигопептидов среду получают согласно инструкциям, описанным в патентах США № 6171825 и 6936441, в \УО 2007/077217 и заявках на выдачу патентов США № 2008/0009040 и 2007/0212770, содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей, и в среду добавляют дополнительно кальций, цинк и/или витамин В3. В конкретном варианте химически определенная культуральная среда может представлять собой среду, сходную с модифицированной по Дульбекко средой Игла (ΌΜΕΜ), в которую добавлены дополнительно кальций, цинк и/или витамин В3, чтобы повысить удельную активность белка ΑΌΑΜΤδ, экспрессированного в клетке, культивируемой в среде. В следующих вариантах культуральная среда не содержит животных компонентов. В другом варианте культуральная среда содержит белок, например животный белок из сыворотки, такой как фетальная сыворотка теленка. В дру- 42 023193 гом варианте культура содержит добавленные экзогенно рекомбинантные белки. В другом варианте белки получены от сертифицированного не содержащего патогенов животного.
В некоторых вариантах культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 10 мг/л. В одном варианте культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В некоторых вариантах полиамин выбран из группы, состоящей из орнитина, путресцина, спермина или спермидина, или тому подобное. В предпочтительном варианте полиамином является путресцин. В конкретном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л путресцина.
В одном варианте предлагается культуральная среда для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В одном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В следующих вариантах культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ, или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка.
В общем, можно использовать любую соль цинка для добавления в среды согласно изобретению, не ограничивающие примеры приемлемых солей включают ΖηδΟ4·7Η2Ο, ΖηδΟ3·2Η2Ο, (Ο6Η5Ο7)2Ζη3·2Η2Ο, ΖηΒτ2, ΖηΒτ2·2Η2Ο, Ζηί,’Κ Ζη(ΝΟ3)2·6Η2Ο, Ζη(Η2ΡΟ4)2·Η2Ο, (Ο2Η3Ο2)2Ζη·2Η2Ο и тому подобное. В некоторых вариантах используют фармацевтически приемлемую соль цинка для добавления в культуральные среды согласно изобретению. В других вариантах можно использовать препарат пептида или белка, содержащий цинк, например, препарат инсулина, для добавления в культуру, предлагаемую в настоящем изобретении.
В другом варианте предлагается культуральная среда для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В другом варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В одном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В следующих вариантах культуральная среда может содержать , по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ, или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция.
В общем, может быть использована любая соль кальция для добавки в среды согласно изобретению, не ограничивающие примеры приемлемых солей включают СаС12, СаΡΡΟ3·2Η2Ο, Сак, СаВг2, (С2Н3О2)2Са, (СНО2)2Са, (С6Н7О6)2Са, (С6Н5О7)2Са3^2Н2О и тому подобное. В некоторых вариантах используют фармацевтически приемлемую соль кальция для добавки в культуральные среды согласно изобретению.
В другом варианте предлагается культуральная среда для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте культуральная среда содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В одном варианте культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 мг/л до 10 мг/л никотинамида (витамина В3). В других вариантах культуральная среда может содержать, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3).
Преимущественно было обнаружено, что при дополнении культуральной среды и цинком и кальцием удельная активность белка ΑΌΑΜΤδ13, экспрессированного в культуральной среде, значительно возрастает. Соответственно, в одном варианте культуральные среды, предлагаемые в настоящем изобретении для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), могут быть дополнены и цинком и кальцием. Например, культуральная среда может быть дополнена цинком и кальцием на уровнях, представленных в табл. 7, т.е. на уровне, соответствующем любому из вариантов 94-113.
- 43 023193
Таблица 7. Примеры вариантов культуральных сред, дополненных цинком и кальцием, которые применимы для экспрессии белка АБАМТ813
По меньшей мере 0,5 мМ кальция По меньшей мере 1,5 мМ кальция От 0,5 мМ до 1,5 мМ кальция По меньшей мере 0,6 мМ, 0,7 мМ, 0,8 ММ, 0,9 мМ, 1,0 мМ, 1,1 мМ, 1,2 мМ, 1,3 мМ, 1.4 мМ, 1,5 мМ, 1,6 мМ, 1,7 мМ, 1,8 мМ, 1,9 мМ, 2,0 мМ, 2,25 мМ, 2.5 мМ, 2,75 мМ, 3,0 мМ, 3,5 мМ, 4,0 мМ, 4,5 мМ, 5,0 мМ или больше кальция
По меньшей мере 2 мкМ цинка Вар. 94 Вар. 95 Вар. 96 Вар. 97
По меньшей мере 5 мкМ цинка Вар. 98 Вар. 99 Вар. 100 Вар. Ю1
От 2 мкМ до 12 мкМ цинка Вар. 102 Вар. 103 Вар. 104 Вар. 105
От 5 мкМ до 12 мкМ цинка Вар. 106 Вар. 107 Вар. 108 Вар. 109
По меньшей мере 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 11 мкМ, 12 мкМ, 13 мкМ, 14 мкМ, 15 мкМ, 20 мкМ, 25 мкМ, 30 мкМ или больше цинка Вар. 110 Вар. 111 Вар. 112 Вар. 113
*Вар. = вариант
Подобным образом, было обнаружено, что при дополнении культуральной среды и цинком и никотинамидом (витамином В3) удельная активность белка АБАМТ813, экспрессированного в культуральной среде, синергетически возрастала. Например, такой эффект можно видеть в примере 2 (сравн. день 11 в табл. 14 и дни 4 и 7 в табл. 13). Соответственно, в одном варианте культуральные среды, предлагаемые в настоящем изобретении для экспрессии белка АБАМТ8 (например, АБАМТ813), могут быть дополнены и цинком и никотинамидом (витамином В3). Например, культуральная среда может быть дополнена цинком и никотинамидом (витамином В3) на уровнях, указанных в табл. 8, т.е. на уровне, соответствующем любому из вариантов 114-133.
Таблица 8. Примеры вариантов культуральных сред, дополненных цинком и никотинамидом (витамином В3), которые применимы для экспрессии белка АБАМТ813
По меньшей мере 2 мг/л никотинамида По меньшей мере 7 мг/л никотинамида От 2 мг/л до 7 мг/л никотинамида По меньшей мере 3 мг/л, 4 мг/л, 5 мг/л, 6 мг/л, 7 мг/л, 8 мг/л, 9 мг/л, 10 мг/л, 15 мг/л, 20 мг/л или больше никотинамида
По меньшей мере 2 мкМ цинка Вар. 114 Вар. 115 Вар. 116 Вар. 117
По меньшей мере 5 мкМ цинка Вар. 118 Вар. 119 Вар. 120 Вар. 121
От 2 мкМ до 12 мкМ цинка Вар. 122 Вар. 123 Вар. 124 Вар. 125
От 5 мкМ до 12 мкМ цинка Вар. 126 Вар. 127 Вар. 128 Вар. 129
По меньшей мере 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, б мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 11 мкМ, 12 мкМ, 13 МКМ, 14 мкМ, 15 мкМ, 20 МКМ, 25 мкМ, 30 мкМ или больше цинка Вар. 130 Вар. 131 Вар. 132 Вар. 133
*Вар. = вариант
Преимущественно было обнаружено, что при дополнении культуральной среды и никотинамидом и кальцием удельная активность белка АБАМТ813, экспрессированного в культуральной среде, значительно возрастает. Соответственно, в одном варианте культуральные среды, предлагаемые в настоящем изобретении для экспрессии белка АБАМТ8 (например, АБАМТ813), могут быть дополнены и никотинамидом (витамином В3) и кальцием. Например, культуральная среда может быть дополнена никотинамидом (витамином В3) и кальцием на уровнях, представленных в табл. 9, т.е. на уровне, соответствую- 44 023193 щем любому из вариантов 134-149.
Таблица 9. Примеры вариантов культуральных сред, дополненных никотинамидом (витамином В3) и кальцием, которые применимы для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ13
По меньшей мере 2 мг/л никотинамида По меньшей мере 7 мг/л никотинамида От 2 мг/л до 7 мг/л никотинамида По меньшей мере 3 мг/л, 4 мг/л, 5 мг/л, 6 мг/л, 7 мг/л, 8 мг/л, 9 мг/л, 10 мг/л, 15 мг/л, 20 мг/л или больше никотинамида
По меньшей мере 0,5 мМ кальция Вар. 134 Вар. 135 Вар. 136 Вар. 137
По меньшей мере 1,5 мМ кальция Вар. 138 Вар. 139 Вар. 140 Вар. 141
От 0,5 мМ до 1,5 мМ кальция Вар. 142 Вар. 143 Вар. 144 Вар. 145
По меньшей мере 0,6 мМ, 0,7 мМ, 0,8 мМ, 0,9 мМ, 1,0 мМ, 1,1 мМ, 1,2 мМ, 1,3 мМ, 1,4 мМ, 1,5 мМ, 1,6 мМ, 1,7 ММ, 1,8 мМ, 1,9 мМ, 2,0 ММ, 2,25 мМ, 2.5 мМ, 2,75 мМ, 3,0 мМ, 3.5 мМ, 4,0 мМ, 4,5 мМ, 5,0 мМ или больше кальция Вар. 146 Вар. 147 Вар. 148 Вар. 149
Вар. = вариант
В некоторых вариантах культуральная среда, предлагаемая в изобретении, может быть представлена в жидкой или сухой или порошкообразной форме. Среда может быть предварительно разделена на аликвоты в количестве, подходящем для одного применения, или представлена в большем количестве, которое можно использовать более чем для одной культуры клеток. Как правило, среда согласно изобретению будет представлена в стерильной форме. Соответственно, настоящее изобретение также относится к наборам для экспрессии или получения белка ΆΌΆΜΤδ13, причем наборы содержат культуральную среду, подходящую для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ, обладающего высокой удельной активностью.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к культуральным средам, применимым для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13) с высокими удельными активностями. В одном варианте культуральная среда содержит по меньшей мере приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда содержит приблизительно от 2 до приблизительно 12 мкМ цинка. В еще одном варианте культуральная среда содержит по меньшей мере приблизительно 5 мкМ цинка. В одном варианте культуральная среда содержит приблизительно от 5 до приблизительно 12 мкМ цинка. В другом варианте культуральная среда содержит по меньшей мере приблизительно 0,5 мМ кальция. В еще одном варианте культуральная среда содержит приблизительно от 0,5 до приблизительно 1,5 мМ кальция. В одном варианте культуральная среда содержит по меньшей мере приблизительно 2 мкМ цинка и по меньшей мере приблизительно 0,5 мМ кальция.
В других вариантах было обнаружено, что добавление никотинамида (витамина В3) дополнительно усиливает экспрессию и повышает удельную активность белков ΆΌΆΜΤδ в культуре клеток. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит по меньшей мере приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит по меньшей мере приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В еще одном варианте культуральная среда содержит приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 10 мг/л никотинамида (витамина В3).
В некоторых вариантах культуральная среда представляет собой не содержащую животных белков культуральную среду. В другом варианте культуральная среда является химически определенной средой. В некоторых вариантах культуральная среда может содержать один или несколько полиаминов. В конкретном варианте полиамином является путресцин, например, в концентрации, составляющей по меньшей мере 0,5 мг/л. В конкретном варианте культуральная среда содержит приблизительно от 2 мг/л до приблизительно 8 мг/л путресцина.
1. Не содержащие белков культуральные среды
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к культуральным средам для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), которые не содержат экзогенно добавленных белков. Не содержащая белков культуральная среда и родственные термины относятся к культуральной среде, в которой отсутствует белок, происходящий из источника, экзогенного для клеток или из других клеток, отличных от клеток в культуре, которые естественным образом выделяют белки во время роста. В одном
- 45 023193 варианте предлагается культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), которая не содержит экзогенно добавленного белка (т.е. не содержит белков) и дополнена цинком, кальцием и/или никотинамидом (витамином В3). В некоторых вариантах не содержащая белков культуральная среда содержит полиамин. Например, в концентрации, составляющей по меньшей мере 2 мг/л или точно или приблизительно от 2 до 30 мг/л или точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. Примеры не содержащих белков культуральных сред описаны в патентах США № 6171825 и 6936441, в \У0 2007/077217 и в публикациях заявок на выдачу патентов США № 2008/0009040 и 2007/0212770, содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей.
В одном варианте предлагается не содержащая белков культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка, или точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В других вариантах предлагается не содержащая белков культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка.
В другом варианте предлагается не содержащая белков культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция, или точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В следующих вариантах предлагается не содержащая белков культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция.
В еще одном варианте предлагается не содержащая белков культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3), по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3), или точно или приблизительно от 2 мг/л никотинамида (витамина В3). В следующих вариантах предлагается не содержащая белков культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или больше никотинамида (витамина В3).
2. Не содержащие олигопептидов культуральные среды
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к культуральным средам для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), которые не содержат экзогенно добавляемых олигопептидов. В одном варианте предлагается культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), которая не содержит экзогенно добавляемых олигопептидов (т.е. не содержит полипептидов) и дополнена цинком, кальцием и/или никотинамидом (витамином В3). В некоторых вариантах не содержащая олигопептидов культуральная среда содержит полиамин. Например, в концентрации, составляющей по меньшей мере 2 мг/л или точно или приблизительно от 2 до 30 мг/л, или точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. Примеры не содержащих олигопептидов культуральных сред описаны в патентах США № 6171825 и 6936441, в \У0 2007/077217 и в заявках на выдачу патентов США № 2008/0009040 и 2007/0212770, содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей.
В одном варианте предлагается не содержащая олигопептидов культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка, или точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В других вариантах предлагается не содержащая олигопептидов культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка.
В другом варианте предлагается не содержащая олигопептидов культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция, или точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В других вариантах предлагается не содержащая олигопептидов культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция.
В еще одном варианте предлагается не содержащая олигопептидов культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3), по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3), или точно или приблизительно от 2 мг/л никотинамида (витамина В3). В других вариантах предлагается не содержащая олигопептидов культуральная среда для экспрессии белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6,
- 46 023193
7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или больше никотинамида (витамина В3).
3. Бессывороточные культуральные среды
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к культуральным средам для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), которая не содержит сыворотки. В одном варианте предлагается культуральная среда для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), которая не содержит экзогенно добавляемой сыворотки (т.е. бессывороточная среда) и дополнена цинком, кальцием и/или никотинамидом (витамином В3). В некоторых вариантах бессывороточная культуральная среда содержит полиамин. Например, в концентрации, составляющей по меньшей мере 2 мг/л или точно или приблизительно от 2 до 30 мг/л, или точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. Примеры бессывороточных культуральных сред описаны в патентах США № 6171825 и 6936441, в νθ 2007/077217 и в публикациях заявок на выдачу патентов США № 2008/0009040 и 2007/0212770, содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей. В одном варианте предлагается бессывороточная культуральная среда для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка, или точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В других вариантах предлагается бессывороточная культуральная среда для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка.
В другом варианте предлагается бессывороточная культуральная среда для экспрессии белка ΑΒΑΜΈ (например, ΑΒΑΜΤ813), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция, или точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В других вариантах предлагается бессывороточная культуральная среда для экспрессии белка ΑΒΑΜΤ8 (например, ΑΒΑΜ^^), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция.
В еще одном варианте предлагается бессывороточная культуральная среда для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3), по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3), или точно или приблизительно от 2 мг/л никотинамида (витамина В3). В других вариантах предлагается бессывороточная культуральная среда для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813) содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или больше никотинамида (витамина В3).
4. Культуральные среды, не содержащие животных белков
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к культуральным средам для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), которые не содержат животных белков. В одном варианте предлагается культуральная среда для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΒΑΜΤ813), которая не содержит экзогенно добавляемых животных белков или полипептидов (т.е. не содержит животных белков) и дополнена цинком, кальцием и/или никотинамидом (витамином В3). В некоторых вариантах не содержащая животных белков культуральная среда содержит полиамин. Например, в концентрации, составляющей по меньшей мере 2 мг/л или точно или приблизительно от 2 до 30 мг/л, или точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. Примеры не содержащих животных белков культуральных сред описаны в патентах США № 6171825 и 6936441, в νθ 2007/077217 и в публикациях заявок на выдачу патентов США № 2008/0009040 и 2007/0212770, содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей.
В одном варианте предлагается не содержащая животных белков культуральная среда для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΒΑΜΤ813), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка, точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка, или точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В других вариантах предлагается не содержащая животных белков культуральная среда для экспрессии белка ΑΒΑΜΤ8 (например, ΑΒΑΜΤ813), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка.
В другом варианте предлагается не содержащая животных белков культуральная среда для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΒΑΜΤ813), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция, или точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В следующих вариантах предлагается не содержащая животных белков культуральная среда для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция.
В еще одном варианте предлагается не содержащая животных белков культуральная среда для экспрессии белка ΑΒΑΜΤ8 (например, ΑΒΑΜΤ813), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3), по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никоти- 47 023193 намида (витамина В3), или точно или приблизительно от 2 мг/л никотинамида (витамина В3). В других вариантах предлагается не содержащая животных белков культуральная среда для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), содержащая, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 2 0 мг/л или больше никотинамида (витамина В3).
V. Очистка белков ΑΌΑΜΤδ
ΑΌΑΜΤδ13 секретируется в плазму ш νίνΌ, где он функционирует, регулируя свертывающую активность, посредством расщепления крупных мультимеров νΨΕ. Способность клеток млекопитающих секретировать ΑΌΑΜΤδ13 после экспрессии можно использовать при получении и очистке композиций ΑΌΑΜΤδ13 в культуре клеток. Например, при экспрессии рекомбинантного ΑΌΑΜΤδ13 в культуре клеток млекопитающих, композиции ΑΌΑΜΤδ13 могут быть легко извлечены непосредственно из супернатанта культуры без необходимости в сборе и лизисе клеток. Это позволяет использовать такие методики, как непрерывное культивирование клеток (например, культивирование клеток с перфузией или культивирование клеток в хемостате), с получением больших количеств белка без многократных лаг-периодов и периодов восстановления культуры. В одном аспекте изобретения предлагаются способы очистки белков ΑΌΑΜΤδ, обладающих высокой удельной активностью, из культуры клеток.
Соответственно, в одном варианте белки ΑΌΑΜΤδ13 экспрессируют в культуре и извлекают непосредственно из супернатанта культуры. Таким образом, белки ΑΌΑΜΤδ13 извлекают путем изъятия части культуры и очистки ΑΌΑΜΤδ13 от других компонентов супернатанта. В общем, такой способ заключается в отделении любых клеток, которые извлечены вместе с супернатантом, с помощью фильтрования или центрифугирования, и в осуществлении одной или нескольких стадий очистки ΑΌΑΜΤδ13 из супернатанта.
В публикации заявки на выдачу патента США № 2005/0266528 и в публикации 2йеп§ с соавторами (2001, В1ооб, 98:1662-1666), содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей) предлагаются примеры способов очистки ΑΌΑΜΤδ13. Очищенный ΑΌΑΜΤδ13 может быть получен в виде препарата обычными способами и использован терапевтически, например, для лечения ТТР.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам получения композиции белка ΑΌΑΜΤδ (например, композиции ΑΌΑΜΤδ13). В первом варианте способ включает стадии: (а) культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ, в не содержащей животных белков культуральной среде; (Ъ) извлечения фракции супернатанта из культуры; (с) осуществления стадии фильтрования или центрифугирования для удаления оставшихся клеток; (б) осуществления стадии ультрафильтрации для концентрирования белка ΑΌΑΜΤδ; и (е) осуществления стадии диафильтрации с использованием буфера, содержащего по меньшей мере приблизительно 0,5 мкМ цинка и по меньшей мере приблизительно 0,1 мМ кальция; с получением, таким образом, композиции ΑΌΑΜΤδ.
В некоторых вариантах стадия культивирования клетки включает периодическое культивирование клеток. В других вариантах стадия культивирования клетки включает непрерывное культивирование клеток.
В некоторых вариантах культуральная среда содержит кальций. В конкретном варианте культуральная среда содержит по меньшей мере 0,5 мМ кальция. В других вариантах культуральная среда содержит цинк. В конкретном варианте культуральная среда содержит по меньшей мере 2 мкМ цинка. В других вариантах культуральная среда содержит никотинамид (витамин В3). В конкретном варианте культуральная среда содержит по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина В3). В некоторых вариантах буфер для диафильтрации содержит по меньшей мере приблизительно 5 мкМ цинка и по меньшей мере приблизительно 2 мМ кальция.
В некоторых вариантах теряется менее чем приблизительно 20% удельной активности ΑΌΑΜΤδ13, начиная с конца стадии (с) и до конца стадии (е). В других вариантах теряется менее чем приблизительно 10% удельной активности ΑΌΑΜΤδ13, начиная с конца стадии (с) и до конца стадии (е). В других вариантах композиция ΑΌΑΜΤδ13 обладает удельной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 1000 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 обладает удельной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 1500 единиц/мг.
А. Замена буфера
Обычно, при очистке секретируемого белка из супернатанта культуры первая стадия способа очистки заключается в замене культуральной среды забуференным раствором, который облегчает дальнейшую очистку представляющего интерес белка. Существует несколько возможных вариантов для замены культуральной среды на буфер, включая без ограничения диафильтрацию, диализ, способы замены буфера, гель-фильтрацию, хроматографию и тому подобное.
Было обнаружено, что композиции белка ΑΌΑΜΤδ13 теряют значительную часть своей удельной активности во время таких стадий очистки, которые требуют введения новых буферов, например, при диафильтрации, диализе, замене буфера, хроматографии и подобных стадиях, независимо от продолжительности периода времени от сбора супернатанта из культуры до стадии очистки. Однако авторы настоящего изобретения преимущественно обнаружили, что при введении цинка и кальция в буфер, вводимый в систему, такую как система на стадии диафильтрации, диализа, замены буфера, гель- 48 023193 фильтрации и хроматографии, такие высокие удельные активности композиции ΑΌΑΜΤ813 сохраняются. В качестве доказательства, в примере 6 показано, что диафильтрация композиции ΑΌΑΜΤ813 с использованием буфера, в котором отсутствуют кальций и цинк, приводит к потере в среднем почти 25% удельной активности композиции, тогда как включение кальция и цинка почти полностью предотвращает такую потерю (табл. 22). Соответственно, настоящее изобретение относится к способам снижения потери активности композиций белка ΑΌΑΜΤ8 после диафильтрации или подобных способов, например диализа, замены буфера, хроматографии, благодаря введению цинка и кальция в буферную систему.
В одном варианте предлагается способ очистки композиции белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), причем способ включает стадии: (а) культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), в культуральной среде; (Ь) извлечения части супернатанта культуральной среды, содержащего белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813); и (с) замены супернатанта культуральной среды буферным раствором, содержащим цинк и кальций, с получением, таким образом, композиции белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813). В одном варианте культуральная среда содержит цинк, кальций и необязательно никотинамид (витамин В3). В предпочтительном варианте стадия культивирования клетки включает непрерывное культивирование (например, культивирование с перфузией или культивирование в хемостате). В другом предпочтительном варианте культуру поддерживают при температуре от 34 до 37°С. В еще одном предпочтительном варианте культуру поддерживают при рН от 6,9 до 7,2.
В одном конкретном варианте стадия замены супернатанта культуральной среды буферным раствором включает использование буфера, содержащего, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мкМ цинка. В другом варианте буфер содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В некоторых вариантах концентрация кальция может составлять по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,3, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 5 мМ или больше кальция. В некоторых вариантах концентрация цинка может составлять по меньшей мере приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 мкМ или больше цинка. Как правило, любое сочетание концентраций, указанных выше, является подходящим для использования в способах согласно настоящему изобретению.
В одном варианте предлагается способ замены буфера в композиции белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813) посредством осуществления замены буфера (например, диафильтрацией, диализом, гельфильтрацией и т.д.) с использованием буфера, содержащего кальций и цинк. В одном конкретном варианте способ включает использование буфера, содержащего, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мкМ цинка. В другом варианте буфер содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 1 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 1 мкМ цинка. В одном варианте буфер содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте буфер содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В следующих вариантах буфер содержит от 0,5 до 5 мМ кальция и от 0,5 до 5 мкМ цинка. В некоторых вариантах концентрация кальция может составлять по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,3, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 5 мМ или больше кальция. В некоторых вариантах концентрация цинка может составлять по меньшей мере приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 мкМ или больше цинка. В некоторых вариантах собранный материал, бесклеточный супернатант или буфер для диафильтрации содержит сочетания кальция и цинка в указанных выше концентрациях.
В другом варианте предлагается способ стабилизации ферментативной активности белка ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813) после экспрессии в культуре клеток, включающий добавление в содержащий клетки собранный материал, бесклеточный супернатант или буфер для диафильтрации, используемый для концентрирования или замены буфера в растворе ΑΌΑΜΤ8, кальция и цинка. В одном конкретном варианте способ включает использование буфера, содержащего, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мкМ цинка. В другом варианте буфер содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В некоторых вариантах концентрация кальция может составлять по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,3, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 5 мМ или больше кальция. В некоторых вариантах концентрация цинка может составлять по меньшей мере приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 мкМ или больше цинка. В некоторых вариантах собранный материал, бесклеточный супернатант или буфер для диафильтрации содержит сочетания кальция и цинка в указанных выше концентрациях.
В других вариантах способы, предлагаемые в настоящем изобретении, приводят к потере менее чем 15% удельной активности, имеющейся на любой отдельной стадии. В предпочтительном варианте способы, предлагаемые в настоящем изобретении, приводят к потере менее чем 10% удельной активности после любой отдельной стадии. В конкретном варианте менее чем 15% удельной активности, присутствующей в извлеченном супернатанте культуры, теряется во время начальной стадии замены буфера (например, во время диафильтрации или диализа). В предпочтительном варианте менее чем 10% удельной активности, присутствующей в извлеченном супернатанте культуры, теряется на начальной стадии замены буфера (например, во время диафильтрации или диализа).
- 49 023193
В. Хроматография
В некоторых вариантах композицию белка Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13) дополнительно обогащают, осуществляя одну или несколько хроматографических стадий. В одном варианте предлагается способ осуществления обогащения композиции белка Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13), причем способ включает стадии: (а) культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13); в культуральной среде; (Ь) извлечения части супернатанта культуральной среды, содержащего белок Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13); (с) замены супернатанта культуральной среды забуференным раствором, содержащим цинк и кальций, с образованием первой композиции белка Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13); и (ά) дополнительного обогащения белка Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13) путем осуществления хроматографической стадии с получением, таким образом, обогащенной композиции Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13). В одном варианте культуральная среда содержит цинк, кальций и необязательно никотинамид (витамин В3). В предпочтительном варианте стадия культивирования клетки включает непрерывное культивирование (например, культивирование с перфузией или культивирование в хемостате). В другом предпочтительном варианте культуру поддерживают при температуре от 34 до 37°С. В еще одном предпочтительном варианте культуру поддерживают при рН от 6,9 до 7,2.
В одном конкретном варианте стадия замены супернатанта культуральной среды забуференным раствором и/или хроматографическая стадия включает использование буфера, содержащего, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мкМ цинка. В предпочтительном варианте обе стадии включают использование буферов, содержащих, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мкМ цинка. В другом варианте буфер содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В некоторых вариантах концентрация кальция может составлять по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,3, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 5 мМ или больше кальция. В некоторых вариантах концентрация цинка может составлять по меньшей мере приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 мкМ или больше цинка. Как правило, любое сочетание концентраций, указанных выше, является подходящим для использования в способах согласно настоящему изобретению.
В одном варианте предлагается способ сохранения удельной активности композиции белка Α^ΑΜΤδ (например, Α^ΑΜΤδ13) во время хроматографической стадии посредством добавления в буфер (буферы), используемый на хроматографической стадии, цинка и кальция. В одном конкретном варианте способ включает использование буфера, содержащего, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мкМ цинка. В другом варианте буфер содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В некоторых вариантах концентрация кальция может составлять по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,3, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 5 мМ или больше кальция. В некоторых вариантах концентрация цинка может составлять по меньшей мере приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 мкМ или больше цинка. Как правило, любое сочетание концентраций, указанных выше, является подходящим для использования в способах согласно настоящему изобретению.
Не ограничивающие примеры способов хроматографии, которые можно использовать для очистки композиции белка Α^ΑΜΤδ (например, композиции Α^ΑΜΤδ13), включают анионообменную хроматографию (АЕС), катионообменную хроматографию (СЕС), хроматографию на основе гидрофобного обмена (Н1С), хроматографию на гидроксиапатите (НАР), иммуноаффинную хроматографию, эксклюзионную хроматографию по размеру (т.е. гель-фильтрацию) или другую подходящую хроматографическую стадию. Хроматографические стадии могут быть осуществлены либо в режиме хроматографии в объеме партии, либо в режиме хроматографии на колонке. В некоторых вариантах буферы, используемые для осуществления любого из указанных способов хроматографии, будут содержать цинк и кальций. В одном конкретном варианте способ включает использование буфера, содержащего, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мкМ цинка. В другом варианте буфер содержит, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мМ кальция и, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В некоторых вариантах концентрация кальция может составлять по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,3, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 5 мМ или больше кальция. В некоторых вариантах концентрация цинка может составлять по меньшей мере приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 5, 10 мкМ или больше цинка. Как правило, любое сочетание концентраций, указанных выше, является подходящим для использования в способах согласно настоящему изобретению.
Любую подходящую анионообменную смолу можно использовать в способах, предлагаемых в настоящем изобретении. Не ограничивающие примеры анионообменных смол, подходящих для использования, включают смолы на основе диэтиламиноэтила (ОЕАЕ), четвертичного аминоэтила (ЦАЕ) и четвертичного аммония (О).
Любую подходящую катионообменную смолу можно использовать в способах, предлагаемых в настоящем изобретении. Не ограничивающие примеры катионообменных смол, подходящих для использования, включают смолы на основе карбоксиметила (СЫ), сульфопропила (δΡ), метилсульфоната (δ).
- 50 023193
Любую подходящую смолу на основе на гидроксиапатита или другой формы кальция можно использовать в способах, предлагаемых в настоящем изобретении. Не ограничивающие примеры подходящих смол включают гидроксиапатитные смолы, фторапатитные смолы, фторгидроксиапатитные смолы и тому подобное.
Любую смолу, подходящую для хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия, можно использовать в способах, предлагаемых в настоящем изобретении. Не ограничивающие примеры подходящих смол включают фенилсодержащие смолы, метилсодержащие смолы, бутилсодержащие смолы, октилсодержащие смолы и тому подобное.
В некоторых вариантах белок ΑϋΑΜΤδ13 (например, ΑϋΑΜΤδ13) может быть дополнительно обогащен путем осуществления иммуноаффинной хроматографии, например, с использованием смол, конъюгированных с антителом, аптамером или другой связывающей молекулой, высокоспецифичной по отношению к белку ΑϋΑΜΤδ13 (например, ΑϋΑΜΤδ13).
В одном варианте способ уменьшения потери активности ΑϋΑΜΤδ приводит к общей потере, составляющей менее 20%, во время любой отдельной стадии, включая, но этим не ограничиваясь, замену буфера, диафильтрацию, диализ, гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, нанофильтрацию, ультрафильтрацию, стерильную фильтрацию и тому подобное. В других вариантах способы, предлагаемые в настоящем изобретении, приводят к потере менее 15% удельной активности, присутствующей во время осуществления любой отдельной стадии. В предпочтительном варианте способы, предлагаемые в настоящем изобретении, приводят к потере менее 10% удельной активности после наличия во время осуществления любой отдельной стадии. В конкретном варианте теряется менее 15% удельной активности, присутствующей в извлеченном супернатанте культуры, во время осуществления стадии замены буфера (например, во время диафильтрации или диализа). В предпочтительном варианте теряется менее 10% удельной активности, присутствующей в извлеченном супернатанте культуры, во время осуществления начальной стадии замены буфера (например, во время диафильтрации или диализа).
С. Инактивация и/или удаление вирусов
В некоторых вариантах способы, предлагаемые в настоящем изобретении для получения композиции ΑϋΑΜΤδ (например, ΑϋΑΜΤδ13), будут дополнительно включать по меньшей мере одну стадию инактивации или удаления вирусов. В некоторых вариантах способы, предлагаемые в настоящем изобретении, будут включать по меньшей мере две или по меньшей мере три стадии инактивации или удаления вирусов. Не ограничивающие примеры стадий инактивации или удаления вирусов, которые можно использовать в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, включают обработку растворителем с детергентом (публикации Ного\\Л/ с1 а1., Βίοοά Соади1 ИЬгто1у515 1994 (5 δυρρΐ 3): δ21-δ28 и КгеП с1 а1., ΤπιηδΓιϊδίοη 2003, (43):1023-1028, содержание которых специально включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей), нанофильтрацию (публикации НататоЮ с1 а1., Уох δ;·ιη§ 1989, (56):230-236 и Уиака с1 а1., I Сеп У1го1. 1991 (72 (ρΐ 8)):2021-2024, содержание которых специально включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей). В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способам получения композиции ΑϋΑΜΤδ (например, ΑϋΑΜΤδ13), включающим обработку растворителем и детергентом и нанофильтрацию.
В одном варианте предлагается способ получения безопасной с точки зрения вирусного заражения композиции белка ΑϋΑΜΤδ (например, ΑϋΑΜΤδ13), причем способ включает стадии: (а) культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑϋΑΜΤδ (например, ΑϋΑΜΤδ13), в культуральной среде; (Ь) извлечения части супернатанта культуральной среды, содержащего белок ΑϋΑΜΤδ (например, ΑϋΑΜΤδ13); (с) замены супернатанта культуральной среды забуференным раствором, содержащим цинк и кальций, с образованием первой композиции белка ΑϋΑΜΤδ (например, ΑϋΑΜΤδ13); (ά) необязательно дополнительного обогащения белка ΑϋΑΜΤδ (например, ΑϋΑΜΤδ13) с использованием хроматографической стадии; и (е) осуществления по меньшей мере одной стадии инактивации или удаления вируса с получением, таким образом, безопасной с точки зрения вирусного заражения композиции ΑϋΑΜΤδ (например, ΑϋΑΜΤδ13). В одном варианте культуральная среда содержит цинк, кальций и необязательно никотинамид (витамин В3). В предпочтительном варианте стадия культивирования клетки включает непрерывное культивирование (например, культивирование с перфузией или культивирование в хемостате). В другом предпочтительном варианте культуру поддерживают при температуре от 34 до 37°С. В еще одном предпочтительном варианте культуру поддерживают при рН от 6,9 до 7,2. В одном варианте стадией удаления вируса является нанофильтрация.
1. Обработка растворителем и детергентом (δ/ϋ)
Чтобы инактивировать различные вирусные загрязнения, которые могут присутствовать в культуре ΑϋΑΜΤδ, один или несколько промежуточных растворов ΑϋΑΜΤδ (например, ΑϋΑΜΤδ13) могут быть подвергнуты обработке растворителем и детергентом (δ/ϋ). Способы обработки растворов детергентами хорошо известны в данной области (обзор см. в публикации Ре11е1лег ΙΡ еΐ а1., Βе5ΐ Ргас1 Кек СИп НаетаЮ1. 2006; 19(1):205-42, содержание которой специально включено в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей). Как правило, можно использовать любую стандартную δ/ϋобработку в сочетании со способами, предлагаемыми в настоящем изобретении. Например, пример про- 51 023193 токола δ/Ό-обработки приведен ниже.
В одном варианте тритон Х-100, твин-20 и три(н-бутил)фосфат (таВР) добавляют к промежуточному раствору ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13) в конечных концентрациях, составляющих точно или приблизительно 1,0, 0,3 и 0,3% соответственно. Затем смесь перемешивают при температуре точно или приблизительно от 18 до 25°С в течение по меньшей мере приблизительно 1 ч.
2. Нанофильтрация и ультра/диафильтрация
Чтобы уменьшить вирусную нагрузку в композиции белка ΆΌΆΜΤδ (например, ΆΌΆΜΤδ13), предлагаемой в настоящем изобретении, композицию можно подвергнуть нанофильтрации с использованием подходящего устройства для нанофильтрации. В некоторых вариантах устройство для нанофильтрации будет иметь средний размер пор, составляющий точно или приблизительно от 15 до 200 нм. Примеры нанофильтров, подходящих для такого использования, включают, без ограничения, ΌνΌ, Όν 50, Όν 20 (Ра11), ^гезоке ЫРР®, ^те8оке ΝΡΚ® (Μ^11^рο^е). Р1аηονа® 15Ν, 20Ν, 35Ν и 75Ν (Р1апονа). В конкретном варианте нанофильтр может иметь средний размер пор, составляющий точно или приблизительно от 15 до 72 нм, или точно или приблизительно от 19 до 35 нм, или точно или приблизительно 15, 19, 20, 35 или 72 нм. В предпочтительном варианте нанофильтр будет иметь средний размер пор, составляющий точно или приблизительно 19, 20 или 35 нм, такой как фильтр Л8а1й РЬ-ΆΝθνΆ® 20Ν или РЬ-ΆΝθνΆ® 35Ν, или их эквиваленты.
После нанофильтрации фильтрат необязательно можно концентрировать посредством ультрафильтрации и/или можно корректировать состав буфера посредством диафильтрации. В некоторых вариантах ультрафильтрацию осуществляют в кассете с ситом с открытыми каналами, и мембрана для ультрафильтрации имеет номинальный предел отсечения по молекулярной массе (NΜVСО) точно или приблизительно менее чем 175 кД, или точно или приблизительно менее чем 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или меньше кД. В предпочтительном варианте мембрана для ультрафильтрации имеет NΜVСО не более чем 30 кД. В другом предпочтительном варианте мембрана для ультрафильтрации имеет ΝΜνί'Ό не более чем 30 кД.
3. Лиофилизация и тепловая обработка
В других вариантах вирусная активность лиофилизированной композиции белка ΆΌΆΜΤδ13 (например, ΆΌΆΜΤδ13), которая ранее могла быть подвергнута обработке на других стадиях инактивации или удаления вирусов, таких как нанофильтрация, может быть дополнительно снижена тепловой обработкой лиофилизированной композиции. Тепловые обработки для инактивации вирусной нагрузки в факторах крови хорошо известны в данной области (например, см. публикации Р18/к1е\\ю/ е1 а1., ΤΙιιόιιΦ Ке8. 1987 М 15; 47(2):235-41; Р18/к1е№Ю7 е1 а1., Сигг δΐιιύ Нета1о1 В1ооД Τπιη8Γιΐ8. 1989; (56):44-54; Ер81ет апб Риске, Лгск Ра11ю1 ЬаЬ Μеά. 1990 Μ;ιγ; 114(3):335-40).
VI. Композиции ΆΌΆΜΤδ
Преимущественно было обнаружено, что белки ΆΌΆΜΤδ, такие как ΆΌΆΜΤδ13, экспрессированные в культурах клеток, дополненных цинком, кальцием и/или никотинамидом (витамином В3), имеют неожиданно высокие удельные активности. Как указано в настоящем описании, были разработаны способы, обеспечивающие непрерывную экспрессию и извлечение таких белков ΆΌΆΜΤδ с высокими удельными активностями. Например, способы непрерывного культивирования клеток, предлагаемые в настоящем изобретении, обеспечивают возможность экспрессии более чем 1 мг ΆΌΆΜΤδ13 на литр в сутки с удельной активностью более чем 1000 единиц/мг в течение более чем одной недели или дольше. Подобным образом, в настоящем изобретении также предлагаются способы снижения потери активности, с которой обычно сталкиваются во время очистки белка ΆΌΆΜΤδ13.
Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к композициям белков ΆΌΆΜΤδ (например, композициям ΆΌΆΜΤδ13), экспрессированным в культуре клеток согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении. Например, предлагаются композиции белков ΆΌΆΜΤδ, в которых белок экспрессирован в результате культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΆΌΆΜΤδ, в культуральной среде, дополненной по меньшей мере одним компонентом, выбранным из кальция, цинка и никотинамида (витамина В3). Также предлагаются композиции белков ΆΌΆΜΤδ (например, композиции ΆΌΆΜΤδ13), которые очищены согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении. Например, предлагаются композиции белков ΆΌΆΝΤδ, которые были очищены согласно способу, включающему стадию замены буфера, причем буфер для замены содержит цинк и кальций. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения композицией белка ΆΌΆΜΤδ является композиция ΆΌΆΜΤδ13.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композициям белков ΆΌΆΜΤδ (например, композициям ΆΌΆΜΤδ13), которые получены способом, включающим экспрессию белка ΆΌΆΜΤδ в культуре клеток согласно любому способу, предлагаемому в настоящем изобретении. В предпочтительном варианте белком ΆΌΆΜΤδ является ΆΌΆΜΤδ13.
В родственном аспекте настоящее изобретение относится к композициям белков ΆΌΆΜΤδ (например, композициям ΆΌΆΜΤδ13), которые получены способом, включающим введение и цинка и кальция по меньшей мере в один буфер во время очистки белка ΆΌΆΜΤδ из культуральной среды. В предпочти- 52 023193 тельном варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
Настоящее изобретение относится к композициям белков ΛΌΛΜΤδ (например, композициям ΑΌΑΜΤδ13), полученным способом, предлагаемым в настоящем изобретении. В одном варианте композицию ΛΌΛΜΤδ (например, композицию ΑΌΑΜΤδ13) получают в результате культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδ, в культуральной среде, дополненной по меньшей мере одним компонентом, выбранным из кальция, цинка и никотинамида (витамина В3). В конкретном варианте композицию ΛΌΛΜΤδ получают посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδ, в культуральной среде, дополненной по меньшей мере двумя компонентами, выбранными из кальция, цинка и никотинамида (витамина В3). В еще одном варианте культуральную среду дополняют кальцием, цинком и никотинамидом (витамином В3). В некоторых вариантах культуральная среда может представлять собой не содержащую животных белков, не содержащую олигопептидов или химически определенную культуральную среду. В предпочтительном варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΛΌΛΜΤδ 13.
В одном варианте композицию белка ΛΌΛΜΤδ (например, композицию ΑΌΑΜΤδ13) получают посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ цинка. В другом варианте композицию получают посредством культивирования клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 5 мкМ цинка. В одном варианте композицию получают в результате культивирования клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδ, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. В другом варианте композицию получают в результате культивирования клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδ, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. В следующих вариантах композицию получают в результате культивирования клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мкМ, или, по меньшей мере, точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или больше цинка. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В другом варианте рН культуры поддерживают на уровне, составляющем точно или приблизительно от 6,9 до 7,3. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывной культуры. В конкретных вариантах способ осуществляют в условиях культивирования в хемостате, турбидостате или культивирования с перфузией в режиме суспензии. В других конкретных вариантах способ осуществляют в условиях культивирования в хемостате, турбидостате или культивирования с перфузией в режиме прикрепления. В другом варианте способ осуществляют в условия периодического культивирования. В конкретных вариантах способ осуществляют в условиях культивирования с получением единичных партий, с многократным получением партий или культивирования с подпиткой в режиме суспензии. В других конкретных вариантах способ осуществляют в условиях культивирования с получением единичных партий, с многократным получением партий или культивирования с подпиткой в режиме прикрепления. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΛΌΛΜΤδ, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 3 0 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В предпочтигельном варианте белком ΛΌΛΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
В одном варианте композиции белка ΛΌΛΜΤδ (например, композиции ΑΌΑΜΤδ13) культуральная среда, используемая для экспрессии белка ΛΌΛΜΤδ, может быть дополнена цинком в конечной концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно от 2 мкМ до по меньшей мере приблизительно 12 мкМ. В некоторых вариантах культуральная среда может быть дополнена цинком в конечной концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 2 мкМ или по меньшей мере приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ, или более высокие уровни цинка. Как правило, можно использовать любую соль цинка для добавки в среды согласно изобретению, не ограничивающие примеры подходящих солей включают ΖηδΟ4·7Η2Ο, ΖηδΟ3·2Η2Ο, (С6Н5О7)^Пз-2Н2О, ΖηΒτ2, ΖηΒτ2·2Η2Ο, ΖηΟ2, Ζη(ΝΟ3)2·6Η2Ο, Ζη^ΡΟ^ΉΟ, (^^Ο^Ζη^^Ο и тому подобное. В некоторых вариантах используют фармацевтически приемлемую соль цинка для добавления в культуральные среды согласно изобрете- 53 023193 нию. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
В другом варианте композицию белка ΑΌΑΜΤδ (например, композицию ΑΌΑΜΤδ13) получают посредством культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. В другом варианте композицию ΑΌΑΜΤδ получают в результате культивирования клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Λ^ΛΜΤδ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 1,5 мМ кальция. В одном варианте композицию ΑΌΑΜΤδ получают в результате культивирования клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. В других вариантах композицию ΑΌΑΜΤδ получают в результате культивирования клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,5 мМ или, по меньшей мере, точно или приблизительно 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мМ или больше кальция. В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В другом варианте рН культуры поддерживают на уровне, составляющем точно или приблизительно от 6,9 до 7,3. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывной культуры. В конкретных вариантах способ осуществляют в условиях культивирования в хемостате, турбидостате или культивирования с перфузией в режиме суспензии. В других конкретных вариантах способ осуществляют в условиях культивирования в хемостате, турбидостате или культивирования с перфузией в режиме прикрепления. В другом варианте способ осуществляют в условиях периодического культивирования. В конкретных вариантах способ осуществляют в условиях культивирования с получением единичных партий, с многократным получением партий или культивирования с подпиткой в режиме суспензии. В других конкретных вариантах способ осуществляют в условиях культивирования с получением единичных партий, с многократным получением партий или культивирования с подпиткой в режиме прикрепления. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток ΗΕΚ293 или линия клеток ΒΗΚ. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 мг/л до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
Как правило, можно использовать любую соль кальция для добавления в среды согласно изобретению. Не ограничивающие примеры приемлемых солей включают СаС12, СаΡΡΟ3·2Η2Ο, Сак, СаВг2, (С2Н3О2)2Са, (СНО2)2Са, (С6Н7О6)2Са, (С6Н5О7)2Сау2Н2О и тому подобное. В некоторых вариантах используют фармацевтически приемлемую соль кальция для добавления в культуральные среды согласно изобретению.
В другом варианте композицию белка ΑΌΑΜΤδ (например, композицию ΑΌΑΜΤδ13) получают в результате культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2 мг/л никотинамида (витамина В3). В другом варианте композицию ΑΌΑΜΤδ получают в результате культивирования клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 7 мг/л никотинамида (витамина В3). В одном варианте композицию ΑΌΑΜΤδ получают в результате культивирования клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ, в культуральной среде, содержащей точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3). В других вариантах композицию ΑΌΑΜΤδ получают в результате культивирования клетки млекопитающего, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ, в культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л, или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3). В одном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно от 35 до 37°С. В конкретном варианте культуру поддерживают при температуре, составляющей точно или приблизительно 36°С. В другом варианте рН культуры поддерживают на уровне, составляющем точно или приблизительно от 6,9 до 7,3. В одном варианте температуру и/или рН культуры поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток. В одном варианте способ осуществляют в условиях непрерывной культуры. В конкретных вариантах способ осуществляют в условиях культивирования в хемостате, турбидостате или культивирования с перфузией в режиме суспензии. В других конкретных
- 54 023193 вариантах способ осуществляют в условиях культивирования в хемостате, турбидостате или культивирования с перфузией в режиме прикрепления. В другом варианте способ осуществляют в условиях периодического культивирования. В конкретных вариантах способ осуществляют в условиях культивирования с получением единичных партий, с многократным получением партий или культивирования с подпиткой в режиме суспензии. В других конкретных вариантах способ осуществляют в условиях культивирования с получением единичных партий, с многократным получением партий или культивирования с подпиткой в режиме прикрепления. В одном варианте клеткой, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8, является клетка млекопитающего. В конкретных вариантах клеткой млекопитающего является клетка хомячка, человека или мыши. В конкретном варианте клеткой является линия клеток СНО, линия клеток НЕК293 или линия клеток ВНК. В другом варианте клетку млекопитающего культивируют в не содержащей животных белков и/или полипептидов культуральной среде. В еще одном варианте клетку млекопитающего культивируют в синтетической культуральной среде, которая может не содержать или может содержать животные белки и полипептиды. В одном варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. В другом варианте культуральная среда дополнительно содержит полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. В конкретном варианте полиамином является путресцин. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤ8 является ΑΌΑΜΤ813.
В одном варианте композицию ΑΌΑΜΤ8 получают в результате культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), в культуральной среде, дополненной и цинком и кальцием. В некоторых вариантах концентрации цинка и кальция могут быть любыми, выбранными из концентраций, описанных в настоящей публикации. В некоторых вариантах концентрации цинка и кальция будут соответствовать одному из вариантов 94-113 (табл. 7). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В одном варианте культивирование представляет собой культивирование с перфузией. В другом варианте культивирование представляет собой культивирование в хемостате. В других вариантах культивирование представляет собой культивирование с подпиткой или культивирование с многократным получением партий. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤ8 является ΑΌΑΜΤ813.
В одном варианте композицию ΑΌΑΜΤ8 получают в результате культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), в культуральной среде, дополненной и цинком и никотинамидом (витамином В3). В некоторых вариантах концентрации цинка и никотинамида (витамина В3) могут быть любыми, выбранными из концентраций, описанных в настоящей публикации. В некоторых вариантах концентрации цинка и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 114-133 (табл. 8). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В одном варианте культивирование представляет собой культивирование с перфузией. В другом варианте культивирование представляет собой культивирование в хемостате. В других вариантах культивирование представляет собой культивирование с подпиткой или с многократным получением партий. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤ8 является ΑΌΑΜΤ813.
В одном варианте композицию ΑΌΑΜΤ8 получают в результате культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), в культуральной среде, дополненной и кальцием и никотинамидом (витамином В3). В некоторых вариантах концентрации кальция и никотинамида (витамина В3) могут быть любыми, выбранными из концентраций, описанных в настоящей публикации. В некоторых вариантах концентрации кальция и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 134-149 (табл. 9). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14, 21, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В одном варианте культивирование представляет собой культивирование с перфузией. В другом варианте культивирование представляет собой культивирование в хемостате. В других вариантах культивирование представляет собой культивирование с подпиткой или с многократным получением партий. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤ8 является ΑΌΑΜΤ813.
В одном варианте композицию ΑΌΑΜΤ8 получают в результате культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΌΑΜΤ8 (например, ΑΌΑΜΤ813), в культуральной среде, дополненной цинком, кальцием и никотинамидом (витамином В3). В некоторых вариантах концентрации цинка, кальция и никотинамида (витамина В3) могут быть любыми, выбранными из концентраций, описанных в настоящей публикации. В некоторых вариантах концентрации цинка, кальция и никотинамида (витамина В3) будут соответствовать одному из вариантов 14-93 (табл. 3-6). В некоторых вариантах культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток или по меньшей мере 14 суток, 21 суток, 28 суток, или по меньшей мере 5, 6, 7 недель, или по меньшей мере 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. В одном варианте культивирование представляет собой
- 55 023193 культивирование с перфузией. В другом варианте культивирование представляет собой культивирование в хемостате. В других вариантах культивирование представляет собой культивирование с подпиткой или с многократным получением партий. В предпочтительном варианте белком ΑΌΑΜΤδ является ΑΌΑΜΤδ13.
В другом варианте предлагаются композиции ΑΌΑΜΤδ13 с высокими удельными активностями, например, с удельной активностью, составляющей по меньшей мере 600 единиц/мг белка А13. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 700 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 800 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 900 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1000 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1100 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1200 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1300 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1400 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1500 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1600 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1700 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1800 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1900 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 2000 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 2100 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 2200 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 2300 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 2400 единиц/мг. В другом варианте композиция ΑΌΑΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 2500 единиц/мг.
VII. Примеры
Пример 1
Эксперименты с подпиткой осуществляли с использованием выращиваемых в биореакторе культур рекомбинантной линии клеток НЕК293 1020/1013-2, экспрессирующих ΑΌΑΜΤδ13 человека, в химически определенной среде βΑΟΌ-ΑΠ. Исследовали влияние добавки в культуральную среду дополнительного цинка.
Рекомбинантные клетки НЕК293, экспрессирующие ΑΌΑΜΤδ13 человека, культивировали в виде культур клеток с подпиткой в биореакторах объемом 1,5 л с лопастной мешалкой, с поточным контролем рН на уровне рН 7,20 при 37°С, с концентрацией растворенного кислорода 20% от полного насыщения воздуха. Суспензию клеток переносили в 2 идентичных биореактора, содержащих основанную на ^ΜΕΜ/Ρ12 химически определенную культуральную среду (ВΆС^-Ά13; табл. 12). Две культуры выращивали в средах ΕΑΡΌ-ΑΠ. приготовленных либо с 0,432 мг/л 2^О4-7Н2О, как в ^ΜΕΜ/Ρ12, либо с дополнительным добавлением 1 мг/л 2^О4-7Н2О с получением конечной концентрации 1,432 мг/л. Две культуры с подпиткой во всех других отношениях обрабатывали одинаково, и, следовательно, их можно непосредственно сравнивать друг с другом.
Активность А13 в супернатантах культуры измеряли в анализе ΕΚΡΤδ-ν\νΕ73 после центрифугирования или фильтрования супернатантов, чтобы удалить оставшиеся клетки. Общее количество А13 измеряли методом ЕЫЗХ используя специфичное для А13 антитело (табл. 10). Супернатант из культуры, в которой использовали среду βΑί'Ό-ΑΠ со стандартной для ^ΜΕΜ/Ρ12 концентрацией цинка, имел активность А13 728 и 826 миллиединиц/мл на 3 и 6 день соответственно. Удельные активности культур составляли 482 и 526 миллиединиц/мкг А13 соответственно. Напротив, супернатанты из культур, в которые был дополнительно добавлен Ζιι при наличии только немного повышенных выходов экспрессии А13 (на 7% и на 19% выше на 3 и 6 день, соответственно), имели значительно повышенные общие и удельные активности А13 (табл. 11). Как можно видеть при сравнении результатов, представленных в таблице 10 и таблице 11, общая ΡΚΕΤδ-V^Ρ73-активность А13 была на 118% выше (1589 по сравнению с 728) на 3 день и на 61% выше (1381 по сравнению с 728) на 6 день в случае культур, выращенных в присутствии 1,432 мг/л ΖηδО4·7Н2О, по сравнению с культурами, выращенными в присутствии 0,432 мг/л ΖηδО4·7Н2О. Подобным образом, удельная активность белка А13 в культурах с добавками была на 104% выше (981 по сравнению с 482 миллиединицами/мкг) на 3 день и на 42% выше (739 по сравнению с 526 миллиединицами/мкг) на 6 день.
Из биореакторов отбирали образцы и анализировали в отношении А13 методом ЕЬ^Х активность А13 измеряли в ΡΚΕΤδ-VΨΡ73-анализе. Количество клеток определяли, используя методику Ыис1ео- 56 023193 соиШсг. Скорости разведения измеряли и использовали для вычисления скорости роста и объемной продуктивности.
Таблица 10. Данные ферментации для культивирования с подпиткой 1, осуществляемого в биореакторе объемом 1,5 л с использованием среды ΒΆί'.Ό-Ά13 без добавления цинка
День сбора супер- натанта Концентрация клеток Удельная скорость роста А13 ГКЕТЗ А13 ЕЫЗА Удель- ная актив- ность Выход РКЕТЗ Выход А13
[10* клеток/мл] [1/сут- ки] [миллиединиц/ мл] [мкг/ мл] [миллиединиц/ мкг] [еди- ниц/л/ сутки] [мг/л/ сутки]
3 2,18 0,619 728 1,51 482 228 0,41
6 1,88 0,256 826 1,57 526 178 0,32
Таблица 11. Данные ферментации для эксперимента с подпиткой, осуществляемого в биореакторе объемом 1,5 л с использованием среды ΒΆΟΌ-Ά13 с добавлением цинка
День сбора супер- натанта Концентрация клеток Удельная скорость роста А13 РКЕТЗ А13 ЕЫЗА Удель- ная актив- ность Выход РКЕТЗ Выход А13
[10* клеток/мл] [1/сут- ки] [миллиединиц/ мл] [мкг/ мл] [милли- единиц/ мкг] [еди- ниц/л/ сутки] [мг/л/ сутки]
3 2,48 0,662 1589 1,62 981 515 0,45
6 1,38 0,11 1381 1,87 739 249 0,41
Таблица 12. Состав химически определенной среды для культивирования клеток ΒΆΟΌ-Ά13
Состав среды для культивирования клеток ВАСП-А13 Стандартная концентрация
Аминокислоты мг/л
ь-аланин 13,3500
Ь-аргинин·НС1 147,5000
Ь-аспарагин-Н2О 45,1600
Ь-аспарагиновая кислота 19,9500
Ь-цистеин НС1-Н2О 32,5500
Ь-цистин·2НС1 102,3500
Ь-глутаминовая кислота 22,0500
Глицин 26,2500
Ь-гистидин-Н2О НС1 51,4800
Ь-изолейцик 74,4700
Ь-лейцин 119,0500
Ь-лизин·НС1 146,2500
Ь-метионин 100,0000
Ь-фенилаланин 60,4800
Ь-пролин 63,7400
Ь-серин 36,7500
Ь-треокин 53,4500
Ь-триптофан 29,0100
Ь-тирозин 2Ыа 2Н2О 75,7900
Ь-валин 82,8500
Соли мг/л
Хлорид кальция (СаС12) Переменный {58,3-174,9)
Сульфат меди (СиЗО4-5Н2О) 0,0026
Нитрат железа (Ре (Ν02) з-9Н2О) 0,0500
Сульфат железа (Ре304-7Н20) 1,0170
Хлорид магния (МдС12) 28,6400
Сульфат магния (МдЗО4) 48,8400
Хлорид калия (КС1) 311,8000
Хлорид натрия (НаС1) 5495,5000
Νβ2ΗΡΟ4 безводный 106,5100
КаН2РО4 безводный 54,3500
Гептагидрат сульфата цинка (ΖηδΟ427Н2О) переменный (0,432-3,432)
Селенит натрия безводный 0,0087
Витамины мг/л
Аскорбиновая кислота 3,499
Биотин 0,0035
Хлорид холина 8,980
ϋ-Са-пантотенат 2,240
Фолиевая кислота 2,650
1-инозит 12,600
Никотинамид переменный (2,0-7,0)
Пиридоксин *НС1 2,031
Рибофлавин 0,219
Тиамин-НС1 2,170
Витамин В12 0,680
Прочие мг/л
О-глюкоза 5000,00
Линолевая кислота 0,042
Липоевая кислота 0,105
Путресцин-2НС1 3,681
Тимидин 0,365
Гипоксантин-Ыа 2,390
Пируват натрия 55,000
мг/л
Ь-глутамин 1000,0000
Плюроник Р68 1000,0000
Этаноламин 1,5300
Ыа-бикарбонат 1,5000
- 57 023193
Пример 2
Эксперименты с подпиткой осуществляли с использованием выращиваемых в биореакторе культур рекомбинантной линии клеток СНО #938, экспрессирующих ΆΌΆΜΤδ13, в химически определенной среде ΒΆίΌ-Ά13. Исследовали влияние добавок в культуральную среду дополнительного цинка и/или витамина В3.
Рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие ΆΌΆΜΤδ13 человека, адаптировали к химически определенной среде Βί’δ (среда Βί’δ). Клон #938 из рабочего банка клеток для разработок #01 (Э\СВ#01) размораживали и готовили инокулят клеток в среде Βί',’δ. Клетки переносили в 2 биореактора объемом 1,5 л с лопастными мешалками и выращивали в условиях культуры с подпиткой в специально полученной среде ΒΆί.Ό-Ά13 с поточным контролем рН на уровне рН 7,20 при 37°С с концентрацией растворенного кислорода 20% от полного насыщения воздуха. Две культуры выращивали в средах ΒΆί.Ό-Ά13, приготовленных либо с 0,432 мг/л ΖηδΟ4·7Η2Ο, как в ΌΜΕΜ/Ρ12, либо с дополнительным добавлением 1 мг/л ΖηδΟ4·7Η2Ο с получением конечной концентрации 1,432 мг/л. Две культуры с подпиткой во всех других отношениях обрабатывали одинаково, и, следовательно, их можно непосредственно сравнивать друг с другом. Супернатанты собирали на 4 и 7 день и анализировали в отношении уровня белка А13 и уровня активности. После сбора на 7 день в обе культуры дополнительно добавляли 5 мг/л никотинамида (витамина В3) с получением конечной концентрации 7,02 мг/л и выращивали в идентичных условиях еще в течение 4 суток. Супернатанты снова собирали на 11 день и анализировали уровни белка А13 и уровни активности.
В первой культуре, выращиваемой без добавки цинка, уровни активности А13 в собранном супернатанте составляли 642 и 488 миллиединиц/мл на 4 и 7 день соответственно (табл. 13). Удельные активности таких супернатантов составляли 371 и 273 миллиединиц/мкг на 4 и 7 день соответственно. Как показано ранее в примере 1, общая и удельная активности А13 в супернатанте культуры с добавлением дополнительного цинка были значимо повышены (сравн. данные в табл. 13 и 14 в отношении сбора на 4 и 7 день). Как и ранее, общие уровни А13, полученные в обеих культурах, были сходными, однако А13 из супернатанта второй культуры, в которую дополнительно добавляли цинк, обладал на 40 и 104% более высокой общей активностью на 4 и 7 день соответственно, а также на 78 и 75% более высокой удельной активностью на 4 и 7 день (табл. 14 по сравнению с табл. 13). Другие параметры, включая общий выход А13 и скорость роста клеток, по-видимому, не изменялись под влиянием дополнительного добавления цинка.
После сбора супернатантов на 7 день в обе культуры добавляли дополнительно 5 мг/л никотинамида (витамина В3) и выращивали в идентичных условиях дополнительно еще в течение 4 суток. Супернатанты собирали, как и ранее на 11 день. Добавка витамина В3 приводила к увеличению общей ΡΡΕΤδУ^Р73-активности и удельной активности А13 в супернатантах обеих культур (табл. 13 и 14, 11 день). Причем такие значения почти удваивались в обеих культурах. На 11 день в супернатанте из культуры 2, в которую добавляли цинк и витамин В3, наблюдали почти на 200% более высокую (2366 по сравнению с 791 миллиединиц/мл) общую активность и на 174% более высокую (1189 по сравнению с 432 миллиединиц/мкг) удельную активность, чем в супернатанте, собранном из культуры 1.
Дополнение среды только одним никотинамидом приводило приблизительно к 60% повышению общей активности (791 миллиединиц/мл по сравнению с 488 миллиединиц/мл; сравн. данные в табл. 13 для 7 и 11 дня) и удельной активности (432 миллиединиц/мкг по сравнению с 273 миллиединиц/мкг; сравн. данные в таблице 13 для 7 и 11 дня) А13. Подобным образом, дополнение среды только одним цинком приводило к повышению приблизительно на 70-80% общей активности и удельной активности А13 (сравн. табл. 13 и 14, данные для 4 и 7 дня). Неожиданно, дополнение культуральной среды и никотинамидом и цинком приводило к синергетическому повышению приблизительно на 300-400% общей активности (сравн. табл. 14, 11 день) и табл. 13, 4 и 7 дни) и приблизительно на 200-300% удельной активности (сравн. табл. 14, 11 день) и табл. 13, 4 и 7 дни) А13, что свидетельствует о неожиданном синергетическом взаимодействии эффектов цинка и никотинамида.
Таблица 13. Данные эксперимента по периодической ферментации СР 07/18 Μ04: ΡΆ13 СНО, клон #985/1 938 Э\СВ#01
День сбора супернатанта Концентрация клеток Удельная скорость роста А13 РЕЕТЕ А13 ЕЫБА Удель- ная актив- ность Выход РЕЕТ5 Выход А13
[106 клеток/мл] [1/сутки] [ми л лиединиц/ мл] (мкг/ мл] [миллиединиц/ мкг] [еди- ниц/л/ сутки] [мг/л/ сутки]
4* 2,33 0,539 642 1,73 371 161 0,43
7* 1,58 0,407 4Э8 1,79 273 120 0,48
II1 1,65 0,413 791 1, 83 432 173 0,37
*ΒΆν-ί.Ί)-ΆΙ3; 0,432 мг/л ΖηδΟ|·7112О; 2 мг/л никотинамида, ΤΒΆΥ-ίϋ-Ά13; 0,432 мг/л /.ηδΟ^Ι Ι2Ο; 7 мг/л никотинамида.
- 58 023193
Таблица 14. Данные эксперимента по периодической ферментации СР 07/18 М07: НА13 СНО, клон #985/1 985 ЭУСВ#01
День сбора супер- натанта Концентрация клеток Удельная скорость роста А13 РКЕТЗ А13 ЕЫ5А Удель- ная актив- ность Выход РКЕТЗ Выход А13
[10е клеток/мл] [1/сутки] [миллиединиц/ мл] [мкг/ мл] [миллиединиц/ мкг] [еди- ниц/л/ сутки] [мг/л/ сутки]
4* 1,73 0,527 898 1,36 660 224 0,34
7* 2,10 0,505 ээе 2,08 479 252 0,57
11' 1,88 0,420 2366 1,99 1189 550* 0,41
*ВΑV-С^-Α13; 1,432 мг/л /,п8О|-7112О; 2 мг/л никотинамида; ΤВΑV-С^-Α13; 1,432 мг/л 7пЗО4-7Н2О; 7 мг/л никотинамида.
Пример 3
Хемостатную клеточную культуру рекомбинантной линии клеток СНО #640-2, экспрессирующих АЭАМТ813 человека, выращивали в химически определенной среде ВАСЭ-А13, дополненной дополнительным цинком и витамином В3. Культуру объемом 10 л поддерживали в течение 53 суток и продукцию белка А13 и активность измеряли с течением времени.
Рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие АЭАМТ813 человека, адаптировали к химически определенной специально приготовленной среде (среде ВС8). Флакон из банка клеток размораживали и готовили инокулят клеток в среде ВС8. Клетки, размноженные из экспрессирующего А13 клона #640-2, переносили в биореактор объемом 10 л с мешалкой Раштона и культивировали в культурах с многократным получением партий в специальной среде ВАСЭ-А13 с поточным контролем рН на уровне рН 7,157,20 при 37°С с концентрацией растворенного кислорода 20% от полного насыщения воздуха. После выращивания 2 периодических культур до конечного рабочего объема 10 л биореактор переводили в режим непрерывной подачи среды на 5 день и осуществляли его работу еще в течение 48 суток в режиме хемостата.
Образцы супернатанта из биореакторов брали еженедельно и анализировали в отношении продуцирования белка А13 методом ЕЫ8А и в отношении активности А13 в РКЕТ8-'УУР'73-анализе. Количество клеток определяли с использованием методики №.1с1еосоип(ег. Измеряли скорости разведения и использовали для вычисления скоростей роста и объемной продуктивности.
В условиях непрерывной культуры с использованием химически определенной среды ВАСИ-А13, дополненной цинком и никотинамидом в конечной концентрации 1,432 мг/л 2п8О4-7Н2О и 7,02 мг/л никотинамида, получали высокие уровни продукции белка А13, от 0,9 до 1,3 мг/л/сутки, и высокие удельные активности, приблизительно от 800 до 1100 миллиединиц/мкг А13 (табл. 15). Полученные результаты были сопоставимы с продукцией белка и удельными активностями белка в случае клона СНО #938, представленными в примере 2. Причем объемная продуктивность и специфичная для клеток продуктивность возрастали с течением времени в долговременной культуре, вероятно, вследствие возрастания скорости роста и скорости разведения с течением времени. Высокую удельную активность экспрессированного А13 можно поддерживать, по меньшей мере, на постоянно высоком уровне в течение по меньшей мере всех 7 недель выращивания культуры в условиях хемостата. В действительности, удельная активность А13, полученного в культуре, на самом деле возрастала приблизительно от 800 миллиединиц/мкг А13 на 2 неделе до приблизительно 1100 миллиединиц/мкг А13 на 7 неделе.
Таблица 15. Данные эксперимента по непрерывной ферментации СР 07/30 Р02: НА13 СНО клон #987/1 640-2
№ недели культивирования Концен- трация клеток Удель- ная скорость роста Ско- рость разве- дения А13 РВЕТ8 А13 ЕЫЗА Удель- ная актив- ность Выход РКЕТЗ Выход А13
в хемостате [106 клеток/ мл] [1/сут- ки] [1/сут- ки] [МИЛЛИ- единиц/ мл] [мкг/ мл] [милли- единиц/ мкг] единиц/л/ сутки] [мг/л/ сутки]
2 1,43 0,36 0,36 1954 2,48 788 713 0,91
3 1, 56 0,41 0,40 2254 2,32 972 913 0, 94
4 1,46 0,38 0,40 2244 2,41 931 889 0, 95
5 1, 58 0,43 0,43 2514 2,88 873 1086 1,24
6 1, 70 0,51 0,46 2737 2,71 1010 1270 1,26
7 1, 76 0,53 0,52 2322 2,18 1065 1200 1,13
Пример 4
Эксперименты по культивированию клеток с подпиткой и культивированию клеток в хемостате осуществляли, используя биореакторные культуры рекомбинантных линий клеток СНО #640-2, экспрессирующих АЭАМТ813 человека, в химически определенной среде ВАСЭ-А13. Исследовали влияние добавки в культуральную среду разных уровней цинка.
Рекомбинантные клетки СНО, зкспрессирующие АЭАМТ813 человека, адаптировали к химически определенной специально приготовленной среде, среде ВС8, в режиме с подпиткой. В кратком изложении, Э\УСВ#05 размораживали и готовили инокулят клеток в среде ВС8. Клетки переносили в биореакторы объемом 1,5 л с лопастной мешалкой и специально приготовленной средой ВАСЭ-А13, дополненной никотинамидом в конечной концентрации 7 мг/л, но без добавления цинка, с поточным контролем
- 59 023193 рН на уровне 7,20 при 37°С с концентрацией растворенного кислорода 20% от полного насыщения воздуха. Затем суспензию периодической культуры разделяли и помещали в три идентичных биореактора, содержащих среду ВΑС^-Α13, дополненную никотинамидом в конечной концентрации 7 мг/л с разными добавками Ζπ (0, 0,5 и 1,0 мг/л ΖηδΟ4·7Η2Ο до конечной концентрации 0,432, 0,932 и 1,432 мг/л ΖпδΟ4·7Η2Ο).
Среды ВΑС^-Α13 содержали 0,432 мг/л ΖпδΟ4·7Η2Ο с добавлением или без добавления дополнительного цинка. В остальном культуры и среда были одинаковыми и, следовательно, их можно непосредственно сравнивать друг с другом. Культуры выращивали в режиме с подпиткой в течение приблизительно одной недели и супернатант анализировали в отношении продукции белка А13 и ΕΡΕΤδ'У^Р73-активности. Затем все три биореактора переводили в режим хемостатного культивирования, и они функционировали в течение приблизительно 2 недель в условиях непрерывной культуры с использованием среды с разными добавками цинка, как описано выше.
В условиях культивирования с подпиткой, в соответствии с результатами, наблюдаемыми в примерах 1 и 2, добавка в среду либо 0,5 мг/л, либо 1,0 мг/л ΖηδΟ4·7Η2Ο значимо повышала удельную активность белка А13 в супернатанте (785 и 876 миллиединиц/мкг соответственно) по сравнению со средой без дополнительной добавки цинка (437 миллиединиц/мкг) (табл. 16). Как указано выше, добавка дополнительного цинка не оказывала влияния на другие параметры, включая общую продукцию белка А13 и удельную скорость роста.
Таблица 16. Данные экспериментов по ферментации с подпиткой для экспрессии А13 человека в среде с дополнительным добавлением и без дополнительного добавления цинка
Дополни- тельный цинк Концентрация клеток Удельная скорость роста А13 РЕЕТЕ А13 ЕЫ£А Удель- ная актив- ность Выход РКЕТ8 Выход А13
[106 клеток/мл] [1/сутки] [миллиединиц/ мл] [мкг/ мл] [миллиединиц/ мкг] [единиц/ л/сутки] (мг/л/ сутки]
0 1,44 0,420 853,0 1,952 437 230,3 0,506
0,5 мг/л 1,73 0,502 1687,7 2,151 785 470,0 0,563
1,0 мг/л 1,44 0,441 1589,2 1,814 876 430,8 0,472
После перевода биореакторов в режим хемостата культуры выращивали в условиях непрерывной культуры в течение приблизительно одной недели (неделя 2), используя среды с разными добавками цинка, как описано выше. Образцы супернатанта из биореакторов брали еженедельно и анализировали в отношении продукции белка А13 методом ΕΌΙδΑ и в отношении активности А13 в ΕΚ.ΕΤδ-ν\νΕ73анализе. Подобно результатам, наблюдаемым в случае культур, выращиваемых в режиме с подпиткой, добавка в ростовую среду, используемую для непрерывного роста культуры, дополнительного цинка приводила к значимому повышению удельной активности А13 (697 и 729 миллиединиц/мкг в случае добавки 0,5 и 1,0 мг/л ΖηδΟ4·7Η2Ο соответственно) через неделю по сравнению с выращиванием в среде без добавки (553 миллиединиц/мкг) (табл. 17, 18 и 19).
Ранее было показано, что удельная активность А13, экспрессированного в условиях непрерывного культивирования клеток, действительно повышается в течение длительного периода времени (см. пример 3). Чтобы исследовать, можно ли повторить такой результат, культуры, выращиваемые в среде, дополненной дополнительным количеством цинка, продолжали культивировать дополнительно в течение недели. Как видно в табл. 18 и 19, удельная активность А13 в супернатантах обеих культур снова возрастала с течением времени. Удельная активность А13, выявленная в супернатанте среды, дополненной 0,5 мг/л ΖηδΟ4·7Η2Ο, возрастала от 697 миллиединиц/мг на 2 неделе до 759 миллиединиц/мг на 3 неделе (табл. 18). Подобным образом, удельная активность А13, выявленная в супернатанте среды, дополненной 1,0 мг/л ΖηδΟ4·7Η2Ο, возрастала с 729 миллиединиц/мг на 2 неделе до 812 миллиединиц/мг на 3 неделе (табл. 19). Как указано выше, добавка дополнительного цинка не влияла на удельный рост клеток. Однако примечательно, что продукция белка А13, по-видимому, возрастала в обеих культурах с добавлением дополнительного цинка по сравнению с продукцией в культурах без добавления цинка.
Таблица 17. Результаты ферментации в случае экспериментов по культивированию клеток в хемостате без дополнительного добавления цинка
№ недели куль- тиви- рования в хемо- стате Кон- цент- рация клеток Удельная скорость роста Ско- рость разве- дения А13 РКЕТ5 А13 ЕЫ8А Удель- ная актив- ность Выход РЕЕТ5 Выход А13
[106 клеток/ мл] [1/сутки) (1/сут- ки] [милли- единиц/ мл] [мкг/ мл] [миллиединиц/ мкг] [единиц/л/ сутки] [мг/л/ сут- ки]
2 1,25 0,340 0,339 1091,8 1,973 553 370,1 0,669
- 60 023193
Таблица 18. Результаты ферментации в случае экспериментов по культивированию клеток в хемостате с добавлением дополнительно 0,5 мг/л цинка
№ недели куль- тиви- рова- ния в хемо- стате Кон- цент- рация клеток Удельная скорость роста Ско- рость разве- дения А13 РЕЕТ5 А13 ЕЫЗА Удель- ная актив- ность Выход РЕЕТЕ Выход А13
[10е клеток/ мл] [1/сут- ки] [1/сут- ки] [миллиединиц/ мл] [мкг/ мл] [миллиединиц/ мкг] [еди- ниц/л/ сут- ки} [мг/л/ сут- ки]
2 1,37 0,350 0,341 1725,5 2,476 697 588,4 0,844
3 1,37 0,362 0,353 1971,7 2, 597 759 696,0 0,917
Таблица 19. Результаты ферментации в случае экспериментов по культивированию клеток в хемостате с добавлением дополнительно 1,0 мг/л цинка
В! недели культи ви- рова- ния в хемо- стате Кон- цент- рация клеток Удель- ная ско- рость роста Ско- рость разве- дения А13 РЕЕТ5 А13 ЕЫ5А Удель- ная актив- ность Выход РЕЕТЕ Выход А13
[106 клеток/ мл] [1/сут- ки] [1/сут- ки] [миллиединиц/ мл] [мкг/ мл] [миллиединиц/ мкг] [еди- ниц/л/ сут- ки] [мг/л/ сут- ки]
2 1,21 0,327 0,340 1681,7 2,307 729 571,8 0,784
3 1,21 0,330 0,353 1892,2 2,331 812 667, 9 0,823
Пример 5
Эксперименты по культивированию клеток с подпиткой и культивированию клеток в хемостате осуществляли с использованием биореакторных культур рекомбинантной линии клеток СНО #Е6, экспрессирующих ΑΌΑΜΤδ13 человека, в химически определенной среде βΑί^Ό-ΑΕΤ. Исследовали влияние добавки в культуральную среду высоких уровней цинка.
Рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие ΑΌΑΜΤδ13 человека, адаптировали к химически определенной специально приготовленной среде, среде ВСδ, в режиме с подпиткой. Адаптированные популяции субклонировали и получали клон #Е6.
В кратком изложении, О\УСВ#19 размораживали и готовили инокулят клеток в среде ВСδ. Клетки переносили в три биореактора объемом 1,5 л с лопастной мешалкой и специально приготовленной средой ВΆС^-Ά13, которую дополняли 1,0, 2,0 и 3,0 мг/л Ζ^Θ^Η^ с получением конечных концентраций 1,432, 2,432 и 3,432 мг/л Ζ^Θ^Η^ соответственно. Культуры выращивали с поточным контролем рН на уровне 7,15 при 36°С с концентрацией растворенного кислорода 20% от полного насыщения воздуха.
Культуры выращивали в режиме многократного получения партий (3 партии) в течение приблизительно одной недели и супернатант анализировали в отношении продукции белка А13 и ΕΡ.ΕΤδ-ν\νΕ73активности. Затем все три биореактора переводили в режим хемостатного культивирования, и они функционировали в течение 10 суток в условиях непрерывной культуры, при этом использовали среды с разными добавками цинка, как описано выше. В условиях культивирования с подпиткой добавка в культуральные среды возрастающих количеств цинка дополнительно повышала удельную активность А13, секретированного в супернатанты культуры. В соответствии с предыдущими результатами, представленными выше, добавление в среду дополнительно 1,0 мг/л Ζ^Θ^^Θ приводило к высокой удельной активности, составляющей 806 миллиединиц/мкг. Дальнейшее увеличение концентрации цинка, т.е. добавление 2,0 и 3,0 мг/л приводило в еще более высоким уровням удельной активности А13 (880 и 889 миллиединиц/мкг соответственно) (табл. 20). Как и ранее, добавление дополнительного цинка не оказывало влияния на другие параметры, включая общую продукцию А13 и удельную скорость роста.
Таблица 20. Результаты ферментации в случае экспериментов по периодическому культивированию с дополнительным добавлением цинка (средние данные для 3 партий)
Дополни- тельный цинк Концент- рация клеток Удельная скорость роста А13 РЕЕТЕ А13 ЕЫЗА Удель- ная актив- ность Выход РЕЕТЕ Выход А13
[Ю6 клеток/мл] [1/сутки] [милли единиц/ мл] [мкг/ мл] [миллиединиц/ мкг] [единиц/ л/сутки] [мг/л/ сутки]
1,0 мг/л 1,78 0,592 1666,6 2,074 806 633,8 0,637
2,0 мг/л 1,68 0,596 1678,0 1,883 880 621,8 0,619
3,0 мг/л 1,55 0,589 1670,1 1, 844 389 580,8 0,625
После перевода биореакторов в режим хемостата культуры выращивали в условиях непрерывной культуры в течение 10 суток, используя среды с разными добавками цинка, как описано выше. Образцы супернатанта из биореакторов анализировали в отношении продукции белка А13 методом ΕΠδΑ и в отношении активности А13 в ΕΚΕΤδ-VΨΕ73-анализе. В отличие от результатов, наблюдаемых в случае культур, выращиваемых в режиме с подпиткой, добавление в ростовую среду, используемую для непрерывного роста культуры, более высоких уровней цинка приводило к снижению удельной скорости роста
- 61 023193 и общей жизнеспособности клеток. Хемостатная культура, выращиваемая в среде с добавлением дополнительно 1,0 мг/л ΖηδΟ4·7Н2Ο, продолжала проявлять высокую жизнеспособность клеток (88,6%) и высокую удельную скорость роста (0,256 в сутки) (табл. 21), что согласуется с предыдущими результатами, описанными выше.
Напротив, в культурах, выращиваемых в средах, дополненных более высокими уровнями Ζπδ( )|·7Ι Ι2(), 2,0 и 3,0 мг/л, наблюдали значимое снижение уровней жизнеспособности клеток (72,1 и 80,4% соответственно) и удельных скоростей роста (0,091 и 0,134 в сутки соответственно). Однако при этом удельная активность А13 в супернатантах двух культур оставалась высокой (863 и 771 миллиединиц/мкг соответственно) (табл. 21).
Таблица 21. Результаты ферментации в случае экспериментов по культивированию клеток в хемостате с дополнительным добавлением цинка
До- пол- ни- тель- иый цинк Кон- цент- рация клеток Удель- ная ско- рость роста Ско- рость разве- дения Жиэ- несло- соб- ность клеток А13 РЕЕТЗ А13 ВЫ5А Удель- ная актив- ность Выход РНЕТЗ Выход А13 Пот- реб- ление глю- козы
[ϊό* клеток/ мл] [1/сут- ки] [1/сут- ки] [%] (милли- еди- ниц/мл) [мкг/ мл] [миллиединиц/ мкг] [еди- ниц/л/ сутки] 1мг/л/ сутки] г/л/ сутки
1,0 мг/л 1, 23 0, 256 0,336 38,6 2716,0 3,127 868 911, 5 1, 050 1, 21
2(0 мг/л 0,55 0,091 0, 321 72,1 1403,9 1,632 363 452,7 0,524 0,58
3,0 мг/л 0,56 0,134 0,321 80,4 1359,8 1,763 771 436, 5 0,566 0,64
Пример 6
Белок А13 человека экспрессировали в рекомбинантной линии клеток СНО #640-2 в химически определенной среде ВАСО-А13, в которую добавляли дополнительное количество цинка и никотинамида, в биореакторах объемом 50 л. После сбора супернатантов культур осуществляли сравнение стадий ультра/диафильтрации (50 кД), используя буферы с добавлением и без добавления цинка и кальция.
Рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие Α^ΑΜΤδ13 человека, адаптировали к химически определенной специально приготовленной среде, среде ВСδ. В кратком изложении, ^VСВ размораживали и готовили инокулят клеток в среде ВСδ. Клетки переносили через биореактор объемом 10 л в реактор объемом 50 л с мешалкой Раштона и культивировали в режиме хемостата в специально приготовленной среде ВАСО-А13 с поточным контролем рН на уровне 7,15-7,20 при 37°С с концентрацией растворенного кислорода 20% от полного насыщения воздуха.
Супернатанты из биореакторов фильтровали и собранный бесклеточный материал подвергали ультрафильтрации, используя мембрану ΡЕδ 50 кД (коэффициент концентрирования приблизительно 1:10), и затем подвергали диафильтрации с использованием 5 объемов буфера, содержащего 50 мМ №С1 и 20 мМ трис, рН 7,7. Сравнивали буферы для диафильтрации с добавлением или без добавления 2 мМ Са и 5 мкМ Ζ^ чтобы определить влияние на потерю активности при диафильтрации и хроматографической очистке.
Удельные активности, регистрируемые в миллиединицах ΡΕΉΤδ-ννΡ73 на мкг А13, выявленного методом ЕЬ^А, определяли сразу после диафильтрации и перед загрузкой образца для дальнейшей очистки. Образцы хранили при температуре приблизительно от 2 до 8°С максимум в течение 3 суток (менее чем приблизительно 80 часов). Когда образцы хранили в течение более длительных периодов времени, их хранили при температуре менее чем -15°С после окончания диафильтрации и до начала хроматографии. Образцы измеряли и сравнивали сразу после диафильтрации и перед загрузкой на хроматографическую колонку.
Несмотря на относительно короткое время хранения от стадий ультра/диафильтрации до стадий дополнительной очистки, происходит значимая потеря удельной активности А13 (23,3%) в том случае, когда в буфере для диафильтрации отсутствуют цинк и кальций. Напротив, когда использовали буфер для диафильтрации, содержащий 2 мМ Са и 5 мкМ Ζ^ потеря удельной активности А13 (7,3%) была сильно уменьшена (табл. 22).
Таблица 22. Результаты экспериментов по диафильтрации с использованием буфера для диафильтрации с добавлением и без добавления кальция и цинка
Образец Диафильтрация Удельная активность после фильтрации Удельная активность загружаемого для очистки материала % потери активности
1 без Са/Ζη 999 740 25,9
2 без Са/Ζη 924 734 20,6
Среднее без Са/Ζη 962 737 23,3
Стандартное отклонение без Са/Ζη 53 4,2 не анализировали
3 с Са/Ζη 849 835 1,6
4 с Са/Ζη 951 985 -3,6
5 с Са/Ζη 929 877 5,6
6 с Са/Ζη 1131 844 25,4
Среднее с Са/Ζη 965 885 7,3
Стандартное отклонение с Са/Ζη 119 68,9 не анализировали
- 62 023193
Пример 7
Сравнивали способы непрерывного культивирования в хемостате и с перфузией, чтобы определить относительную продукцию и удельную активность А13, зкспрессированного в нескольких рекомбинантных линиях клеток СНО.
В кратком изложении, разные клоны рекомбинантных клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный А13 человека, адаптировали к химически определенной специально приготовленной среде (ВС8), которую использовали для приготовления инокулятов. Затем клетки культивировали в биореакторе в специально приготовленной среде βΑΟΌ-ΑΠ, дополненной цинком и никотинамидом в конечных концентрациях 1,432 мг/л Ζ^Ο^^Ο и 7,02 мг/л никотинамида. Затем инокуляты из каждого клона переносили в два биореактора, в одном из которых осуществляли культивирование в хемостатных условиях (08^, а в другом в условиях перфузии, как указано в табл. 23. Клетки культивировали при плотности, составляющей приблизительно от 2х106 до 4х106 клеток/мл, на микроносителях СуГороге™ II (СЕ Вю8с1епсе8).
Культуры выращивали в условиях непрерывной культуры в течение 3-4 недель и периодически анализировали образцы супернатантов из биореакторов в отношении продукции белка А13 методом ΒΡΙ8Α и в отношении активности А13 в РКΕΤ8-VУР73-анализе. Значения, приведенные в табл. 23, представляют собой средние значения для 3-4-недельного периода. В соответствии с результатами, полученными в примерах 1-6, описанных выше, культуры, выращенные в условиях хемостата, давали приблизительно от 1 мг/л/сутки до приблизительно 2 мг/л/сутки белка А13, обладающего высокой удельной активностью приблизительно от 700 миллиединиц/мкг до приблизительно 1000 миллиединиц/мкг (табл. 23). Удивительно, что в культурах, выращиваемых в условиях культивирования с перфузией, каждый раз выявляли более высокий уровень продукции белка и более высокий уровень активности А13 в супернатанте культуры, чем в случае идентичных клонов, выращиваемых в условиях хемостата. Удельные активности в случае А13, продуцируемого в культурах с перфузией, были очень высокими, при этом в трех из четырех клонов выявлено по меньшей мере приблизительно 1000 миллиединиц/мкг.
Таблица 23. Сравнение результатов экспериментов по культивированию клеток в хемостате и культивированию клеток с перфузией
Клон Объем Режим Удельная активность Выход РЕ.ЕТ5 Выход А13
[л] [миллиединиц/ мкг] [единид/л/ сутки] [мг/л/сутки]
Рб 50,0 С8Т 800 800 1,0
Р6 10,0 Перфузия 1000 1600 1,6
Ώ6 1,5 С5Т 690 900 1,3
Ώ6 1,5 Перфузия 890 1700 1,9
XI 1,5 С8Т 1040 2400 2,3
XI 1,5 Перфузия 1000 2600 2,6
Е2 1,5 С5Т 710 500 0,7
Е2 1,5 Перфузия 1000 1600 1,6
Пример 8
Чтобы определить влияние температуры и рН на продукцию рекомбинантного белка ΑΌΑΜΤ813 человека при выращивании культуры эукариотических клеток с использованием химически определенной не содержащей животных белков культуральной среды, культуры выращивали при температурах от 35,0 до 38,0°С при рН от 7,05 до 7,30.
В кратком изложении, рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие А13 человека, переносили в биореакторы объемом 1,5 л с лопастными мешалками в специально приготовленную среду ΕΑΡΌ-ΑΡΙ. Культуры выращивали с поточным контролем рН на уровне от 7,05 до 7,30 при температурах в диапазоне от 35 до 38°С с концентрацией растворенного кислорода 20% от полного насыщения воздуха. Эксперименты планировали и проводили с использованием методики поверхности отклика. Статистический анализ осуществляли, используя пакет статистических компьютерных программ Μίηί(;·ιό® 15.1.0.0.
Из биореакторов брали образцы и анализировали в отношении А13 методом ΒΡΙ8Α, активность А13 измеряли в РКΕΤ8-VУР73-анализе. Количество клеток определяли, используя методику №.1с1еосоип(ег. Измеряли скорости разведения и использовали для вычисления скоростей роста и объемной продуктивности.
Как можно видеть на фиг. 1 и 2, и температура и рН оказывали значимое влияние на объемную продуктивность А13 (измеренную с использованием РКΕΤ8-VУР73, фиг. 1) и удельную активность (активность РКΕΤ8-VУР73/антиген в ΒΡΙ8Α, фиг. 2). В частности, максимальная объемная РКΕΤ8продуктивность была достигнута в культурах, выращиваемых в более низком диапазоне рН, приблизительно от 7,05 до 7,2, особенно при рН приблизительно 7,10 и температурах приблизительно от 35,0 до 37,0°С, особенно при температуре приблизительно 36°С. В частности, максимальная удельная активность (РКΕΤ8-V\УР73 к количеству антигена в ΒΡΙ8Α) была достигнута в культурах, выращиваемых в более низком диапазоне рН, приблизительно от 7,05 до 7,2, особенно ниже 7,10, и при температурах приблизительно от 35,0 до 37,0°С, особенно ниже 36°С. В частности, оптимальные условия для продуцирования А13 были достигнуты при сочетании температуры приблизительно 36°С и рН приблизительно 7,10 в отношении оптимального выхода и качества продукта.
- 63 023193
Следует понимать, что примеры и варианты, описанные в настоящей публикации, приведены только с целью иллюстрации и что различные модификации или изменения в свете приведенного описания могут быть предложены специалистами в данной области, и такие модификации или изменения должны быть включены в сущность и объем настоящей заявки и в объем прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты и заявки на выдачу патентов, цитированные в настоящей публикации, включены в настоящее описание путем ссылки в полном объеме для всех целей.

Claims (42)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ экспрессии белка дезинтегрина и металлопротеиназы с мотивами тромбоспондина 13 (ΑΒΑΜ^^Η), причем способ включает культивирование клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΒΑΜΤ813, в культуральной среде, содержащей от 3 до 12 мкМ цинка.
  2. 2. Способ по п.1, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 5 мкМ цинка.
  3. 3. Способ по п.1 или 2, в котором культуральная среда содержит:
    (a) по меньшей мере 0,5 мМ кальция или (b) между 0,5 и 1,5 мМ кальция.
  4. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором культуральная среда дополнительно содержит:
    (a) по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина В3) или (b) между 2 и 10 мг/л никотинамида.
  5. 5. Способ по любому из пп.1-4, в котором культуральная среда дополнительно содержит по меньшей мере 0,5 мг/л полиамина.
  6. 6. Способ по п.5, в котором полиамин представляет собой путресцин.
  7. 7. Способ по п.6, в котором культуральная среда содержит между 2 и 8 мг/л путресцина.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-7, в котором культуральная среда не содержит животных белков или является химически определенной.
  9. 9. Способ по любому из пп.1-8, в котором клетка выбрана из группы, состоящей из бактериальной клетки, дрожжевой клетки, клетки насекомого, клетки птицы и клетки млекопитающего.
  10. 10. Способ по п.9, в котором клеткой млекопитающего является линия клеток, выбранная из группы, состоящей из линии клеток человека, линии клеток хомячка и линии клеток мыши.
  11. 11. Способ по п.10, в котором линия клеток выбрана из группы, состоящей из линии клеток СНО, линии клеток ΒΗΚ и линии клеток ΗΕΚ.
  12. 12. Способ по любому из пп.1-11, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая белок ΑΒΑΜΤ8, дополнительно содержит индуцируемый промотор.
  13. 13. Способ по любому из пп.1-12, в котором способ включает периодическое культивирование клеток.
  14. 14. Способ по п.13, в котором периодическое культивирование клеток представляет собой культивирование с многократным получением партий или культивирование клеток с подпиткой.
  15. 15. Способ по любому из пп.1-12 и 14, в котором способ включает непрерывное культивирование клеток.
  16. 16. Способ по п.15, в котором непрерывное культивирование клеток включает непрерывное культивирование клеток в суспензии или непрерывное культивирование прикрепленных клеток.
  17. 17. Способ по п.16, в котором:
    (a) непрерывное культивирование клеток в суспензии осуществляют в режиме хемостата или (b) непрерывное культивирование прикрепленных клеток осуществляют в режиме перфузии.
  18. 18. Способ по п.16 или 17, в котором для культивирования клетки используют микроноситель.
  19. 19. Способ по п.18, в котором микроносителем является пористый микроноситель.
  20. 20. Способ по любому из пп.14-19, в котором:
    (a) культуру поддерживают в течение по меньшей мере 7 суток;
    (b) культуру поддерживают в течение по меньшей мере одного месяца или (c) культуру поддерживают в течение по меньшей мере двух месяцев.
  21. 21. Способ по любому из пп.1-20, в котором культуру поддерживают при температуре между 35 и
    37°С.
  22. 22. Способ по любому из пп.1-21, в котором:
    (a) культуру поддерживают при рН между 6,9 и 7,3 или (b) культуру поддерживают при рН между 7,05 и 7,15.
  23. 23. Способ по любому из пп.1-22, в котором культуральная среда дополнительно содержит по меньшей мере 7 мг/л никотинамида.
  24. 24. Способ по любому из пп.1-23, в котором удельная активность белка ΑΒΑΜΤ813 в культуральной среде:
    (a) составляет по меньшей мере 600 единиц на миллиграмм белка ΑΒΑΜΤ813 или (b) составляет по меньшей мере 800 единиц на миллиграмм белка ΑΒΑΜΤ813.
  25. 25. Способ по любому из пп.1-24, в котором культура дает:
    - 64 023193 (a) по меньшей мере 400 единиц активности Λ^ΛΜΤδ13 на 1 л культуры в сутки (единиц/л/сутки) или (b) по меньшей мере 800 единиц активности Λ^ΛΜΤδ13 на 1 л культуры в сутки (единиц/л/сутки).
  26. 26. Способ получения композиции ΑΟΑΜΥδ, причем способ включает стадии:
    (a) культивирования клетки, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ΑΟΑΜΎδ, в культуральной среде, не содержащей животных белков;
    (b) извлечения фракции супернатанта из культуры;
    (c) осуществления стадии фильтрования или центрифугирования, чтобы удалить любые оставшиеся клетки;
    (ά) осуществления стадии ультрафильтрации для концентрирования белка ΑΟΑΜΥδ и (е) осуществления стадии диафильтрации с использованием буфера, содержащего по меньшей мере
    0,5 мкМ цинка и по меньшей мере 0,1 мМ кальция; с получением, таким образом, композиции ΑΟΑΜΥδ.
  27. 27. Способ по п.26, в котором стадия культивирования (а) включает периодическое культивирование клеток.
  28. 28. Способ по п.26, в котором стадия культивирования (а) включает непрерывное культивирование клеток.
  29. 29. Способ по любому из пп.26-28, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 0,5 мМ кальция.
  30. 30. Способ по любому из пп.26-29, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 3 мкМ цинка.
  31. 31. Способ по любому из пп.26-30, в котором культуральная среда содержит от 3 до 12 мкМ цинка.
  32. 32. Способ по любому из пп.26-31, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 5 мМ цинка.
  33. 33. Способ по любому из пп.26-32, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина В3).
  34. 34. Способ по любому из пп.26-33, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 7 мг/л никотинамида (витамина В3).
  35. 35. Способ по любому из пп.26-34, в котором буфер для диафильтрации содержит по меньшей мере 5 мкМ цинка и по меньшей мере 2 мМ кальция.
  36. 36. Способ по любому из пп.26-35, в котором белок ΑΟΑΜΥδ представляет собой Λ^ΛΜΤδ13.
  37. 37. Способ по п.36, в котором потери удельной активности ΑΠΑΜΥδΟ составляют менее чем 20% в период с конца стадии (с) до конца стадии (е).
  38. 38. Способ по п.36, в котором потери удельной активности Λ^ΛΜΤδ13 составляют менее чем 10% в период с конца стадии (с) до конца стадии (е).
  39. 39. Способ по любому из пп.36-38, в котором композиция Λ^ΛΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1000 единиц/мг белка Λ^ΛΜΤδ13.
  40. 40. Способ по любому из пп.36-38, в котором композиция Λ^ΛΜΤδ13 имеет удельную активность, составляющую по меньшей мере 1500 единиц/мг белка Λ^ΛΜΤδ13.
  41. 41. Способ по любому из пп.1-25, в котором белок Λ^ΛΜΤδ13 представляет собой белок Λ^ΛΜΤδ13 человека.
  42. 42. Способ по любому из пп.26-40, в котором белок Λ^ΛΜΤδ13 представляет собой белок Λ^ΛΜΤδ13 человека.
EA201270224A 2009-07-31 2010-07-30 Среда для культивирования клеток для экспрессии белков adamts EA023193B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23047709P 2009-07-31 2009-07-31
PCT/US2010/044020 WO2011014838A1 (en) 2009-07-31 2010-07-30 Cell culture medium for adamts protein expression

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201270224A1 EA201270224A1 (ru) 2012-09-28
EA023193B1 true EA023193B1 (ru) 2016-05-31

Family

ID=42668009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201270224A EA023193B1 (ru) 2009-07-31 2010-07-30 Среда для культивирования клеток для экспрессии белков adamts

Country Status (22)

Country Link
US (7) US8313926B2 (ru)
EP (1) EP2459702B1 (ru)
JP (5) JP5451884B2 (ru)
KR (5) KR101573972B1 (ru)
CN (2) CN104962539B (ru)
AU (1) AU2010278751B2 (ru)
BR (2) BR122021005965B1 (ru)
CA (1) CA2769361A1 (ru)
CO (1) CO6501191A2 (ru)
EA (1) EA023193B1 (ru)
ES (1) ES2583258T3 (ru)
HK (1) HK1171790A1 (ru)
HR (1) HRP20160783T1 (ru)
HU (1) HUE029110T2 (ru)
IN (1) IN2012DN00801A (ru)
MX (2) MX2012001261A (ru)
NZ (1) NZ597727A (ru)
PL (1) PL2459702T3 (ru)
PT (1) PT2459702T (ru)
SG (1) SG178194A1 (ru)
SI (1) SI2459702T1 (ru)
WO (1) WO2011014838A1 (ru)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR122021005965B1 (pt) * 2009-07-31 2022-01-25 Baxalta Incorporated Método para produzir uma composição de desintegrina e metaloproteinase com motivo trombospondina (adamts)
IL286298B (en) 2010-07-08 2022-08-01 Baxalta Inc A method to generate high molecular weight substituted vwf in cell culture
LT2837680T (lt) 2011-07-01 2020-07-10 Amgen Inc. Žinduolių ląstelių kultūra
EP2906683B1 (en) 2012-10-15 2017-05-31 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
EP2970916B1 (en) 2013-03-13 2021-04-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Adapted lepidopteran insect cells for the production of recombinant proteins
US9217168B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
AR095196A1 (es) * 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
KR102418824B1 (ko) * 2013-10-14 2022-07-11 아레스 트레이딩 에스.아. 포유동물의 고성능 유가식 배양을 위한 신규 배지
US11384378B2 (en) 2014-06-04 2022-07-12 Amgen Inc. Methods for harvesting mammalian cell cultures
KR101867134B1 (ko) * 2015-03-23 2018-06-12 한양대학교 산학협력단 포유류 세포를 이용하여 목적 물질을 고효율로 생산하기 위한 세포 배양 배지, 이를 이용한 세포 배양 방법 및 목적 물질의 생산 방법
WO2016191169A1 (en) * 2015-05-22 2016-12-01 Dupont Nutrition Biosciences Aps Acetolactate decarboxylase
TW202330904A (zh) 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
SG11201900853SA (en) 2016-08-04 2019-02-27 Baxalta Inc Use of adamts13 for treating, ameliorating and/or preventing vaso-occlusive crisis in sickle cell disease, acute lung injury and/or acute respiratory distress syndrome
EP3535388B1 (en) * 2016-11-04 2023-05-31 Takeda Pharmaceutical Company Limited Adeno-associated virus purification methods
CN114075269A (zh) * 2017-07-06 2022-02-22 菲仕兰坎皮纳荷兰私人有限公司 用于制备糖蛋白的细胞培养工艺
US11391725B2 (en) * 2018-03-16 2022-07-19 Genzyme Corporation Methods for improving cell viability in a production bioreactor
CA3103443A1 (en) * 2018-06-18 2019-12-26 Synthetic Biologics, Inc. Methods of making alkaline phosphatase agents
IL302538A (en) 2019-12-06 2023-07-01 Regeneron Pharma Anti-VEGF protein preparations and methods for their production
WO2021198781A2 (en) 2020-04-02 2021-10-07 Takeda Pharmaceutical Company Limited Adamts13 variant, compositions, and uses thereof
MX2022013812A (es) 2020-05-08 2022-12-15 Regeneron Pharma Trampas y mini-trampas de vegf y metodos para el tratamiento de trastornos oculares y cancer.
US20230201319A1 (en) 2020-05-22 2023-06-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Adamts13 compositions and methods for treating and diagnosing complications of coronavirus disease
US20230020297A1 (en) * 2020-06-05 2023-01-19 Proabtech Co., Ltd. Uox-albumin conjugate with certain numbers of albumin conjugated thereto, and manufacturing method thereof
CN111808822B (zh) * 2020-07-02 2024-01-12 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 细胞培养用补料液及提高重组hek293细胞蛋白表达量的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002042441A2 (en) * 2000-11-22 2002-05-30 Baxter Aktiengesellschaft VON WILLEBRAND FACTOR (vWF) CLEAVING PROTEASE POLYPEPTIDE, NUCLEIC ACID ENCODING THE POLYPEPTIDE AND USE OF POLYPEPTIDE

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5250421A (en) 1986-01-03 1993-10-05 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C-type proteins
JPH0753104B2 (ja) * 1989-02-28 1995-06-07 秀明 山田 細菌の培養法
CZ280901B6 (cs) 1988-10-06 1996-05-15 Hideaki Yamada Způsob kultivace bakterií
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
DE69535940D1 (de) 1994-11-10 2009-06-04 Baxter Healthcare Sa Verfahren zur Herstellung von biologischen Produkten in Protein-freiem Kultur
AU703484B2 (en) 1995-02-23 1999-03-25 Quest International Services B.V. Peptides for tissue and cell culture media
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
WO1998008934A1 (en) 1996-08-30 1998-03-05 Life Technologies, Inc. Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
IT1285158B1 (it) 1996-09-17 1998-06-03 Angeletti P Ist Richerche Bio Polipeptidi solubili con l'attivita' di serino-proteasi di ns3 del virus dell'epatite c, e procedimento per la loro preparazione e il
WO1998015514A1 (en) 1996-10-07 1998-04-16 Solutia Inc. Process for the hydroxylation of benzene
AU4751697A (en) 1996-10-10 1998-05-05 Douglas Danner Animal cell culture media comprising plant-derived nutrients
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
AT407255B (de) 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
US6406909B1 (en) 1998-07-10 2002-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Serum-free medium for culturing animal cells
AT409379B (de) 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
WO2004056976A2 (en) 2002-12-23 2004-07-08 Fuji Photo Film B.V. Process for coating cell-culture support
JP2007534675A (ja) * 2004-04-16 2007-11-29 ワイス Ａｄａｍｔｓ−８タンパク質およびその使用
US20060094104A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
JP2007174948A (ja) * 2005-12-27 2007-07-12 Noritsu Koki Co Ltd 酵素水製造装置
JP4880997B2 (ja) * 2005-12-28 2012-02-22 アルフレッサファーマ株式会社 Ａｄａｍｔｓ１３の安定化方法
KR101423344B1 (ko) 2006-01-04 2014-07-30 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 올리고펩티드-무함유 세포 배양 배지를 이용하여 단백질을 발현시키는 방법
BRPI0622214A2 (pt) * 2006-12-22 2012-01-03 Springer Carrier Ltda unidade de condicionamento de ar e mÉtodo de misturar ar em uma unidade de condicionamento de ar
US20090067805A1 (en) 2007-09-10 2009-03-12 Victor Company Of Japan, Limited Recording and reproducing device
PT2235197T (pt) * 2007-12-27 2017-10-11 Baxalta Inc Processos para cultura de células
BR122021005965B1 (pt) * 2009-07-31 2022-01-25 Baxalta Incorporated Método para produzir uma composição de desintegrina e metaloproteinase com motivo trombospondina (adamts)

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002042441A2 (en) * 2000-11-22 2002-05-30 Baxter Aktiengesellschaft VON WILLEBRAND FACTOR (vWF) CLEAVING PROTEASE POLYPEPTIDE, NUCLEIC ACID ENCODING THE POLYPEPTIDE AND USE OF POLYPEPTIDE

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Technical Resources - Media Formulations D-MEM/F-12 (1X) liquid 1:1". [Online] 2010, XP002599526, Invitrogen by Life Technologies Retrieved from the Internet: URL:http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Product-Technical-Resources/media_formulation.214.html> [retrieved on 2010-09-07] *
BEVITT D.J. ET AL.: "Expression of ADAMTS metalloproteinases in the retinal pigment epithelium derived cell line ARPE-19: transcriptional regulation by TNFalpha", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA. GENE STRUCTURE AND EXPRESSION, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL LNKD-DOI:10.1016/S0167-4781(03)00047-2, vol. 1626, no. 1-3, 15 April 2003 (2003-04-15), pages 83-91, XP004420599, ISSN: 0167-4781, page 84, column 2, paragraph 1 *
DATABASE BIOSIS [Online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 16 November 2002 (2002-11-16), SCHEIFLINGER FRIEDRICH ET AL.: "Recombinant Expression and Functional Characterization of the von Willebrand Factor-Cleaving Protease (ADAMTS13)." XP002599525, Database accession no. PREV200300356456, abstract & BLOOD, vol. 100, no. 11, 16 November 2002 (2002-11-16), page, Abstract No. 475, 44TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY OF HEMATOLOGY; PHILADELPHIA, PA, USA; DECEMBER 06-10, 2002, ISSN: 0006-4971 *
PLAIMAUER B. ET AL.: "Cloning, expression, and functional characterization of the von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13)", BLOOD, AMERICAN SOCIETY OF HEMATOLOGY, US, LNKD-DOI:10.1182/BLOOD-2002-05-1397, vol. 100, no. 10, 15 November 2002 (2002-11-15), pages 3626-3632, XP002979372, ISSN: 0006-4971, cited in the application, page 3628, column 1, paragraph 4 - column 2, paragraph 1 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL2459702T3 (pl) 2016-12-30
KR20170140411A (ko) 2017-12-20
JP2016144471A (ja) 2016-08-12
US8313926B2 (en) 2012-11-20
US20110086413A1 (en) 2011-04-14
JP2014061005A (ja) 2014-04-10
JP6567707B2 (ja) 2019-08-28
US20140329294A1 (en) 2014-11-06
KR20120046301A (ko) 2012-05-09
CN104962539A (zh) 2015-10-07
KR20150138425A (ko) 2015-12-09
CA2769361A1 (en) 2011-02-03
KR101808496B1 (ko) 2017-12-12
US8759026B2 (en) 2014-06-24
EP2459702B1 (en) 2016-05-04
JP5936232B2 (ja) 2016-06-22
CN104962539B (zh) 2019-09-17
KR101756354B1 (ko) 2017-07-26
JP7083059B2 (ja) 2022-06-09
KR101574056B1 (ko) 2015-12-02
KR20170081747A (ko) 2017-07-12
KR20150044981A (ko) 2015-04-27
US11254921B2 (en) 2022-02-22
HK1171790A1 (zh) 2013-04-05
BR112012002151B1 (pt) 2021-07-06
JP5451884B2 (ja) 2014-03-26
AU2010278751A1 (en) 2012-02-09
ES2583258T3 (es) 2016-09-20
IN2012DN00801A (ru) 2015-06-26
KR101573972B1 (ko) 2015-12-02
JP2019201661A (ja) 2019-11-28
BR112012002151A2 (pt) 2020-03-03
JP2013500724A (ja) 2013-01-10
MX2012001261A (es) 2012-05-22
US20130071906A1 (en) 2013-03-21
US20150329848A1 (en) 2015-11-19
US20170051270A1 (en) 2017-02-23
US10072254B2 (en) 2018-09-11
US9441216B2 (en) 2016-09-13
US20190071660A1 (en) 2019-03-07
JP2018093881A (ja) 2018-06-21
SI2459702T1 (sl) 2016-11-30
US10724024B2 (en) 2020-07-28
CN102549145A (zh) 2012-07-04
JP6511007B2 (ja) 2019-05-08
JP2021112210A (ja) 2021-08-05
PT2459702T (pt) 2016-08-02
NZ597727A (en) 2013-08-30
EA201270224A1 (ru) 2012-09-28
US20200308566A1 (en) 2020-10-01
HUE029110T2 (en) 2017-02-28
AU2010278751B2 (en) 2014-05-15
BR122021005965B1 (pt) 2022-01-25
HRP20160783T1 (hr) 2016-08-12
KR101912552B1 (ko) 2018-10-26
JP6883071B2 (ja) 2021-06-09
WO2011014838A1 (en) 2011-02-03
CO6501191A2 (es) 2012-08-15
SG178194A1 (en) 2012-03-29
MX344970B (es) 2017-01-12
CN102549145B (zh) 2015-05-20
EP2459702A1 (en) 2012-06-06
US9127265B2 (en) 2015-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA023193B1 (ru) Среда для культивирования клеток для экспрессии белков adamts
EA029503B1 (ru) Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
AU2017261523B2 (en) Cell culture medium for adamts protein expression
AU2019279943B2 (en) Cell culture medium for adamts protein expression
JP5936232B6 (ja) Ａｄａｍｔｓタンパク質発現のための細胞培養培地

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG TJ TM