EA029503B1 - Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток - Google Patents

Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток Download PDF

Info

Publication number
EA029503B1
EA029503B1 EA201390082A EA201390082A EA029503B1 EA 029503 B1 EA029503 B1 EA 029503B1 EA 201390082 A EA201390082 A EA 201390082A EA 201390082 A EA201390082 A EA 201390082A EA 029503 B1 EA029503 B1 EA 029503B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
var
copper
cell culture
cells
cell
Prior art date
Application number
EA201390082A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201390082A1 (ru
Inventor
Леопольд Грилльбергер
Манфред Райтер
Даниель Фляйшандерль
Грегор Брамбергер
Original Assignee
Баксалта Инкорпорейтид
Баксалта Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44514323&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA029503(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Баксалта Инкорпорейтид, Баксалта Гмбх filed Critical Баксалта Инкорпорейтид
Publication of EA201390082A1 publication Critical patent/EA201390082A1/ru
Publication of EA029503B1 publication Critical patent/EA029503B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24087—ADAMTS13 endopeptidase (3.4.24.87)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится, среди прочих аспектов, к условиям культивирования клеток для получения высокомолекулярного vWF, в частности WF, состоящего из большого количества мультимеров, с высокой удельной активностью и ADAMTS13 с высокой удельной активностью. Условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать, например, среду для клеточной культуры с повышенной концентрацией меди и/или супернатант культуры клеток с низкой концентрацией аммония (NH). Настоящее изобретение также обеспечивает способы культивирования клеток в условиях клеточной культуры для экспрессии высокомолекулярных vWF и rA13, обладающих высокой удельной активностью.

Description

изобретение относится, среди прочих аспектов, к условиям культивирования клеток для получения высокомолекулярного ννΕ, в частности νΕ, состоящего из большого количества мультимеров, с высокой удельной активностью и ΑΌΑΜΤδ13 с высокой удельной активностью. Условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать, например, среду для клеточной культуры с повышенной концентрацией меди и/или супернатант культуры клеток с низкой концентрацией аммония (ΝΗ4+). Настоящее изобретение также обеспечивает способы культивирования клеток в условиях клеточной культуры для экспрессии высокомолекулярных νΥΡ и τΑ13, обладающих высокой удельной активностью.
029503
Перекрестные ссылки на заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 61/362635, поданной 8 июля 2010 г., описание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Область техники
Рекомбинантная экспрессия терапевтических белков в культуре клеток (в частности, крупномасштабных культурах клеток), включая культуры эукариотических клеток и, конкретнее, культуры клеток млекопитающих, требует применения специальных культуральных сред, обеспечивающих питательные вещества для эффективного роста клеток. В составы сред для клеточных культур часто входят различные добавки, включая эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), животные белки и/или гидролизаты белков крупного рогатого скота, а также белковые гидролизаты, полученные из растений или дрожжей. Одна из проблем, связанных с такими культурами, состоит в том, что количество получаемого белка, а также общая и удельная активность указанного белка, часто варьируют в разных культурах клеток, даже в случае, когда состав среды для культуры клеток неизменен. Эта вариабельность особенно очевидна в случае крупномасштабных производственных процессов с применением объемов клеточных культур от 10 до более чем 20000 л. Вариабельность для разных культур клеток особенно часто наблюдают для сред для клеточных культур, содержащих гидролизаты, что приводит к уменьшению продукции общего продуцируемого количества белка, а также уменьшению общей и удельной активности.
Одной из возможных причин вариабельности, наблюдаемой в разных культурах клеток, является то, что загрязняющие примеси в добавках, таких как гидролизаты, варьируют от партии к партии. Как правило, сыворотка или полученные из сыворотки вещества, такие как, например, альбумин, трансферрин или инсулин, могут содержать нежелательные агенты, которые могут загрязнять культуры клеток и получаемые из них биологические продукты. Кроме того, получаемые из сыворотки крови человека добавки должны быть проверены на все известные вирусы, включая вирусы гепатита и ВИЧ, которые могут передаваться через сыворотку крови. Более того, бычья сыворотка и получаемые из нее продукты несут риск заражения КГЭ. Помимо этого, все полученные из сыворотки продукты могут быть загрязнены неизвестными веществами. При применении для культуры клеток сыворотки или белковых добавок, полученных от человека или животных, возникают многочисленные проблемы (например, варьирующие качество и свойства составов из разных партий и риск загрязнения микоплазмой, вирусами или КГЭ), в частности, если указанные клетки применяют для производства лекарственных средств или вакцин для введения человеку. Поэтому было предпринято множество попыток получения эффективной системы хозяина и условий культивирования, для которых не требуется сыворотка или другие белковые вещества животного происхождения.
Такие бессывороточные среды разрабатывались на основе белковых экстрактов, получаемых из растений или дрожжей. Например, известно, что гидролизаты сои подходят для процессов ферментации и могут усиливать рост многих микроорганизмов со сложными питательными потребностями, дрожжей и грибов. В \νϋ 96/26266 указано, что папаиновые гидролизаты соевой муки являются источником углеводов и азота, и многие ее компоненты могут применяться для тканевых культур. Ртаиек е! а1. (Вю1есйио1оду Ртодте88 (2000) 16, 688-692) описывают эффекты стимуляции роста и продуктивности определенных пептидных фракций гидролизатов сои и пшеницы.
В νθ 96/15231 описана бессывороточная среда, состоящая из синтетической минимальной питательной среды и дрожжевого экстракта, для размножения клеток позвоночных животных и процесса воспроизводства вирусов. Состав среды, состоящей из основной среды для культур клеток, содержащей пептид риса, экстракт дрожжей и их ферментативный гидролизат, и/или растительные липиды для роста животных клеток, описан в νθ 98/15614. Содержащая очищенный соевый гидролизат среда для культивирования рекомбинантных клеток описана в νθ 01/23527. В νθ 00/03000 описана среда, которая содержит соевый гидролизат и дрожжевой экстракт, но также требует и присутствия рекомбинантных форм животных белков, таких как факторы роста.
В ЕР-А-0481791 описана культуральная среда с заданным биохимическим составом для культивирования сконструированных клеток СНО, не содержащая белков, липидов и углеводов, выделенных из животных источников, содержащая также рекомбинантный инсулин или аналог инсулина, 1% к 0,025% (мас./об.) пептона расщепленной папаином сои, и путресцин. В νθ 98/08934 описана бессывороточная культура эукариотических клеток, содержащая гидролизованные соевые пептиды (1-1000 мг/л), от 0,01 до 1 мг/л путресцина и разнообразные компоненты животного происхождения, включая альбумин, фетуин, различные гормоны и другие белки. В этом контексте следует отметить, что, как известно, путресцин входит также в стандартные среды, например в среду ΌΜΕΜ/Хэма Р12 в концентрации 0,08 мг/л.
Растительные и/или дрожжевые гидролизаты, однако, представляют собой неопределенные смеси олигопептидов и других неизвестных компонентов и загрязнителей. При этом свойства коммерчески доступных партий гидролизатов существенно варьируют. В результате выход рекомбинантных белков или вирусных продуктов значительно различается (разница составляет до троекратной) в зависимости от партии используемого гидролизата ("разброс от партии к партии"). Этот недостаток влияет на пролиферацию клеток, а также экспрессию белков в каждой клетке. В И8 2007/0212770 описаны различные не
- 1 029503
содержащие животных белков и олигопептидов культуральные среды с заданным химическим составом, подходящие для крупномасштабного производства рекомбинантных белковых биофармацевтических средств.
Г емостаз включает взаимодействие различных путей гемостатических реакций, в итоге приводящих к образованию тромба. Тромбы представляют собой отложения компонентов крови на поверхности стенок сосудов, состоящие в основном из агрегированных тромбоцитов крови и нерастворимого перекрестно-сшитого фибрина. Образование фибрина происходит в результате сдерживания протеолиза фибриногена под действием тромбина, фермента свертывания. Тромбин представляет собой конечный продукт каскада свертывания, последовательной активации зимогена на поверхности активированных тромбоцитов и лейкоцитов, и различных клеток сосудов (для ознакомления см. К.О. Мапп е! а1., В1ооб, 1990, Уо1. 76, рр. 1-16).
Важной функцией каскада свертывания является активация фактора X комплексом активированного фактора IX (фактора 1Ха) и активированного фактора VIII (фактора УШа). Дефицит или дисфункция компонентов этого комплекса связаны с заболеванием крови, известным как гемофилия (ΙΕ. §аб1ег & Ε.ν. ОаУе: НеторЫЬа А., НеторЫЬа В., апб νοη УП1еЬгапб'8 Экеазе ("Гемофилия А, гемофилия В и болезнь Виллебранда"), в О. 81аша1оуаппорои1о5 е! а1., (Еб8.): ТЬе шо1ееи1аг Ьа818 о! Ь1ооб Фзеазез ("Молекулярные основы заболеваний крови"). ν.Β. §аипбег8 Со., РЫ1абе1рЫа, 1987, рр. 576-602). Гемофилия А связана с дефицитом активности фактора VIII, в то время как гемофилия В связана с дефицитом фактора IX. Современное лечение представляет собой заместительную терапию с применением фармацевтических препаратов, содержащих нормальный фактор свертывания. Из указанных тромбопатий гемофилия А встречается чаще, поражая примерно одного человека из 10000. Заместительная терапия у пациентов с гемофилией А включает повторяющееся введение препаратов, содержащих нормальный фактор VIII, путем внутривенной инфузии. Интервал между инфузиями представляет собой функцию от снижения активности фактора VIII в кровотоке. Полупериод активности фактора VIII после инфузии различен у разных индивидуумов, варьируя от 10 до 30 ч. Таким образом, профилактическая терапия требует инфузий каждые 2-3 дня. Это является тяжелым бременем для пациентов с гемофилией, в частности, в случаях, когда венозный доступ затруднен в результате местной карбонизации после частых проколов иглой для внутривенных инфузий.
Снижение частоты инфузий за счет применения фактора VIII с продленным периодом полужизни было бы очень благоприятно. В данной области техники хорошо известно, что время полураспада неактивированного гетеродимера фактора VIII сильно зависит от присутствия фактора фон Виллебранда, проявляющего высокое сродство к фактору VIII (но не к фактору ^^) и служащего белкомпереносчиком (ЕЕ. §аб1ег апб Ε.ν. Эа\ае: НеторЫЬа А, НешорЫНа В апб уоп УШеЬгапб'з Ызеазе. в О. 81аша1оуппорои1о8 е! а1. (Еб8.): ТЬе шо1ееи1аг Ьа818 о! Ь1ооб б18еазе8. ν.Β. §аипбег8 Со., РЫ1абе1рЫа, 1987, рр. 576-602). Известно, что пациенты, страдающие от болезни Виллебранда типа 3, не имеющие детектируемого уровня фактора фон Виллебранда в кровотоке, страдают также от вторичного дефицита фактора VIII. Кроме того, период полураспада введенного внутривенно фактора VIII у таких пациентов составляет от 2 до 4 ч, что заметно меньше 10-30 ч, наблюдаемых у пациентов с гемофилией А. Из полученных результатов следует, что фактору VIII свойственна тенденция к быстрому выведению из кровотока, и что этот процесс до некоторой степени подавляется комплексообразованием с его естественным переносчиком - фактором фон Виллебранда.
Фактор фон Виллебранда (ννΡ) представляет собой гликопротеин, циркулирующий в плазме в виде ряда мультимеров, размер которых варьирует, как правило, от приблизительно 500 до 20 000 кДа (или 2-40 димеров ννΡ). Димерные и мультимерные формы ν\νΡ составлены 250 кДа полипептидными субъединицами, связанными друг с другом дисульфидными связями. ν\νΡ опосредует первичную адгезию тромбоцитов к субэндотелию поврежденной стенки сосуда; только мультимеры большего размера проявляют также гемостатическую активность. Мультимеризованный "ΥνΕ связывается с поверхностным гликопротеином тромбоцитов Ор1Ьа посредством взаимодействия в домене А1 У\VΡ. содействуя адгезии тромбоцитов. Предполагается, что эндотелиальные клетки секретируют крупные полимерные формы ν\νΕ а те формы ννΡ, которые имеют низкие молекулярные массы (низкомолекулярный ννΡ), возникают за счет протеолитического расщепления. Мультимеры с большими молекулярными массами накапливаются в тельцах Вейбеля-Палада эндотелиальных клеток и высвобождаются при стимуляции.
Снижение связывающей активности Ρ^Π благодаря сниженным уровням белка ν\νΡ или уменьшению связывающей способности Ρ^Π приводит к одному из трех типов болезни Виллебранда. Дополнительно или альтернативно, определенные типы болезни Виллебранда характеризуются повышением или снижением уровня Ор1Ьа-опосредованного связывания тромбоцитов, а именно типы 2А, 2В и 2М (обобщенные данные см. у Са8!атап е! а1., Э|8огбег8 о! Нето81а818 88(1):94-108 (2003)). Соответственно, модулирование взаимодействия ν\νΡ как с ЕVШ, так и с Ор1Ьа представляет собой целесообразную стратегию для лечения как гемофилии, так и болезни Виллебранда.
Учитывая биологическую важность ννΡ, существует постоянная необходимость в совершенствовании техники способов получения ν\νΡ для терапевтического применения. Общеизвестно, что ν\νΡ мо- 2 029503
жет быть выделен из эндогенных источников, таких как плазма крови человека. Выделенный νΥΡ обладает таким преимуществом, как высокая удельная активность в отношении выполнения его биологической функции и может, таким образом, эффективно применяться в качестве терапевтического белка для лечения соответствующих заболеваний, таких как болезнь Виллебранда. Как правило, νΥΡ плазмы обладает удельной ристоцетиновой активностью, составляющей приблизительно 100 мЕ/мкг, однако выделение из плазмы крови человека имеет недостатки, так как, например, такая плазма может содержать различные вирусы, такие как ВИЧ и/или вирусы гепатита, которые могут переноситься пациенту. Кроме того, плазма представляет собой ограниченный ресурс и, таким образом, дефицит плазмы может приводить к проблематичности получения достаточного количества νΥΡ для лечения. Соответственно, рекомбинантные способы получения νΥΡ обладают преимуществами, разрешая некоторые проблемы, связанные с зависимостью от плазмы в качестве источника νΥΡ. Для рекомбинантного получения была клонирована полноразмерная кДНК νΥΡ; указанный прополипептид соответствует аминокислотным остаткам 23-764 полноразмерного препро-νΥΡ (Е1кепЬоош е! а1. (1995) НаеторЬШа 1, 77 90).
К сожалению, νΥΡ представляет собой молекулу, подвергающуюся сложным посттрансляционным модификациям. Кроме того, мультимеризация димеров νΥΡ в большие и ультрабольшие мультимеры в аппарате Гольджи представляет собой сложную задачу при экспрессии в клетках млекопитающих. Так, экспрессия высокомолекулярного νΥΡ в культуре клеток, например эндотелиальных клетках человека (первичных), зависит от специфического накопления ультрабольших молекул νΥΡ в тельцах ВейбеляПалада. Такие культуры клеток не подходят для получения терапевтических белков. Описаны и другие способы культивирования клеток; известно, что условия культивирования клеток могут влиять на продуцирование νΥΡ различным образом. Например, показано, что высокие концентрации аммония (ΝΗ4+) нарушают посттрансляционную модификацию. Мауабак е! а1. (I. Βίο1. СЬет., 264(23): 13498-13503, 1989) показали, что уровень аммония 25 мМ приводил к снижению мультимеризации νΥΡ в эндотелиальных клетках, что также негативно влияет на удельную ристоцетиновую активность рекомбинантного νΥΡ.
Снижение мультимеризации, как правило, связано со снижением активности, в частности удельной ристоцетиновой активности, рекомбинантного νΥΡ.
До сих пор трудно предсказать, какие параметры могут положительно или отрицательно влиять на продуцирование того или иного белка, в особенности - сложных гликопротеинов, таких как фактор VIII и νΥΡ. Например, показано, что определенные компоненты среды для клеточной культуры влияют на продуцирование фактора VIII. Согласно описанию в патенте США № 5804420 добавление полиола, меди и других следовых металлов может положительно влиять на выход фактора VIII. Также, согласно описанию в ΥΟ 2009/086309, показано, что применение меди в процессе культивирования клеток повышает выработку фактора VIII. У Мфпо1 е! а1. (1989) описано также осуществление экспрессии νΥΡ в рекомбинантных клетках СНО. Однако ни в одном из указанных примеров не содержится информации относительно удельной активности νΥΡ или уровня его мультимеризации.
Белки ΑΌΑΜΤδ (дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина I типа) представляют собой семейство металлопротеиназ, содержащих ряд консервативных доменов, включая цинкзависимый каталитический домен, цистеинбогатый домен, дезинтегринподобный домен и по меньшей мере один, а в большинстве случаев множество повторов тромбоспондина типа I (для ознакомления см. №сЬо1коп е! а1., ВМС Еνο1. Вю1. 2005 ΡеЬ 4; 5(1):11). Указанные белки, эволюционно родственные семействам металлопротеиназ ΑΌΑΜ и ММР (1опе8 ОС, Сигг РЬагт Вю!есЬпо1. 2006 ΡеЬ; 7(1):25-31), являются секретируемыми ферментами, для которых установлена связь с рядом заболеваний и состояний, включая тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТП) (Моаке 1Ь, 8етш Нета!о1. 2004 1ап; 41(1):4-14), соединительнотканные расстройства, раковые заболевания, воспаление (№сЬоКоп е! а1.) и тяжелую плазмодийную тропическую малярию (Ьагкш е! а1., РЬо8 Ра!Ьод. 2009 Маг; 5(3):е1000349). Из-за этих связей ферменты Α^ΑΜΤδ были признаны потенциальными мишенями для терапии ряда патологий (1опе8 ОС, Сигг РЬагт Вю!есЬпо1. 2006 ΡеЬ; 7(1):25-31). Соответственно, существует потребность в способах получения больших количеств белков Α^ΑΜΤδ, обладающих высокой удельной активностью, не содержащих загрязнителей, таких как вирусы, КГЭ и патогены типа бактерий Мусор1акта.
Один из представителей семейства Α^ΑΜΤδ, Α^ΑΜΤδ13, расщепляет фактор фон Виллебранда (νΥΡ) между остатками Туг 1605 и Ме! 1606; эта функция отвечает за разложение больших мультимеров νΥΡ ш νί\Ό. Установлена связь потери активности Α^ΑΜΤδ 13 с некоторыми состояниями, такими как ТТП (Моаке 1Ь, 8етш Нета!о1. 2004 1ап; 41(1):4-14), острое и хроническое воспаление (СЬаиЬап е! а1., I. Ехр Меб. 2008 8ер 1; 205(9):2065-74), и, совсем недавно, с тяжелой плазмодийной тропической малярией (Ьагкш е! а1., РЬо8 Ра!Ьод. 2009 Маг; 5(3):е1000349).
Протеаза Α^ΑΜΤδ13 представляет собой гликозилированный белок массой 190 кДа, синтезируемый преимущественно в печени (Ьеуу е! а1., №Диге. 2001; 413:488-494; ЬиЦкахуа е! а1., В1ооб. 2001; 98:1662-1666; 2Ьеп§ е! а1., I. Вю1 СЬет. 2001; 276:41059-41063; Зоефта е! а1., I. ВюсЬет (Токуо). 2001; 130:475-480 и ОеггЪкеп е! а1., В1ооб. 2001; 98:1654-1661). В значительной степени кА и в случае с мультимерами γΥΥΡ высшего порядка, рекомбинантная экспрессия больших Α^ΑΜΤδ 13 в культурах клеток млекопитающих сопряжена с множеством трудностей.
Таким образом, существует необходимость в условиях культивирования клеток, в частности усло- 3 029503
виях культивирования при крупномасштабном производстве, обеспечивающих стабильный общий выход белка и/или стабильную общую и удельную активность продуцируемых белков в различных культурах клеток. Стабильность в культурах при крупномасштабных производственных процессах важна для производства терапевтических белков. Существует также необходимость в условиях культивирования клеток для крупномасштабного производства гУ\Р с уровнями мультимеризации и удельной ристоцетиновой активностью, сравнимыми или превышающими таковые У\Е, присутствующего в нормальной плазме человека. Сходным образом, так как белки ΑΌΑΜΤ8 вовлечены в ряд заболеваний и состояний, в данной области техники существует потребность в способах крупномасштабного производства рекомбинантных белков ΑΌΑΜΤ8, обладающих высокой удельной активностью, которые подходят для получения фармацевтических средств и для фармацевтического введения. Настоящее изобретение удовлетворяет указанные и другие потребности данной области техники в получении рекомбинантного фактора фон Виллебранда и рекомбинантного ΑΌΑΜΤ813.
Краткое описание изобретения
Согласно определенным аспектам настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, заключающемся в том, что введение добавок в среды для клеточных культур, применяемые для экспрессии рекомбинантного фактора фон Виллебранда (гУ\Р) и рекомбинантного ΑΒΑΜΤ813 (γΑ13), приводит к значительному повышению экспрессии белков и ферментативной активности.
Согласно своему первому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (гУ\Р); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (Ь) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,4 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок гУ\Р; (й) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция гУ\Р из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем указанный отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\Р, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг гУ\Е.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный способ дополнительно включает этап добавления в указанную основную среду для клеточных культур гидролизата перед культивированием указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный гидролизат представляет собой растительный гидролизат. Согласно конкретному варианту реализации указанный гидролизат представляет собой соевый гидролизат.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основная среда для клеточных культур представляет собой не содержащую животных белков культуральную среду.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой не содержащие белков культуральные среды.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанные основные среды для клеточных культур представляют собой культуральные среды с заданным химическим составом.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в основной среде для клеточных культур с добавлением меди составляет по меньшей мере 4 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в основной среде для клеточных культур с добавлением меди составляет от 2,4 до 20 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов медь добавляют в основные среды для клеточных культур в виде соли меди, хелата меди или их комбинации.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанная одна или более клетка представляет собой клетку млекопитающего. Согласно конкретному варианту реализации указанные клетки млекопитающих представляют собой клетки СНО.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает периодическое культивирование указанных клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает непрерывное культивирование указанных клеток. Согласно конкретному варианту реализации непрерывное культивирование клеток производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации непрерывное культивирование клеток производится в режиме перфузии.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанную одну или более клетку культивируют по меньшей мере в 100 л дополненной основной среды для клеточных культур.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток под- 4 029503
держивают на уровне менее чем 2,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,0х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 1,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов этап отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта включает фильтрацию или центрифугирование для удаления клеток из части культурального супернатанта.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\УЕ. составляющей по меньшей мере 40 мЕ/мкг гУ\УР. Согласно конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\УЕ составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ\УР. Согласно более конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью гУ\УЕ составляющей по меньшей мере 60 мЕ/мкг гУ\УР. Согласно более конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\УЕ составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУ\УР. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\УЕ составляющей по меньшей мере 80 мЕ/мкг гУ\УР.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов по меньшей мере 10% гУ\УР в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного мультимера У\УР из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% гУ\УР присутствует в виде высокомолекулярного мультимера У\УР из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% гУ\УР присутствует в виде высокомолекулярного мультимера У\УР из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% гУ\УР присутствует в виде высокомолекулярного мультимера У\УР из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% гУ\УР присутствует в виде высокомолекулярного мультимера У\УР из более чем 10 димеров.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный супернатант содержит высокомолекулярные мультимеры У\УР из 14-22 димеров.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание ΝΗ4+ в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне концентрации ниже 10 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание ΝΗ4+ в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов гУ\УР коэкспрессируется с рекомбинантным фактором УШ (гРУШ). Согласно конкретному варианту реализации указанный способ дополнительно включает этап очистки гУ\УР от по меньшей мере 50% гРУШ, присутствующего в отделенном супернатанте. Согласно одному из вариантов реализации отношение гУ\УР к гРУШ после этапа очистки составляет по меньшей мере 10:1.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный способ дополнительно включает этап обогащения гУ\УР.
Согласно второму аспекту настоящее изобретение обеспечивает композицию рекомбинантного фактора фон Виллебранда (гУ^Р), полученную описанным в настоящей заявке способом.
Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанная композиция также содержит рекомбинантный фактор УШ (гРУШ). Согласно конкретному варианту реализации отношение гУ\УР к гРУШ составляет по меньшей мере 10:1.
Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного введения.
Согласно третьему аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (гУ^Р), отличающийся тем, что указанный супернатант получают описанным в настоящей заявке способом.
Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (гУ^Р), при этом по меньшей мере 10% гУ\УР в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного У\УР мультимера из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% гУ\УР в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного У\УР мультимера из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% гУ\УР в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного У\УР мультимера из более чем 10 димеров. Согласно другому
- 5 029503
конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% гУ\УР в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного У\УР мультимера из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% гУ\УР в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного У\УР мультимера из более чем 10 димеров. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов указанный супернатант получают согласно описанному в настоящей заявке способу.
Согласно пятому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (тУ^Р), отличающийся тем, что указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,4 МЕ ристоцетин-кофакторной активности на 1 мл. Согласно конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,5 МЕ ристоцетинкофакторной активности на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,6 МЕ ристоцетин-кофакторной активности на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,7 МЕ ристоцетин-кофакторной активности на 1 мл. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов супернатант получают согласно описанному в настоящей заявке способу.
Согласно шестому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного АОАМТ§13 (гА13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (Ь) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 1,0 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок гА13; (ά) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция гА13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности РКЕТ8-У\УР73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой не содержащие животных белков культуральные среды.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой не содержащие белков культуральные среды.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой культуральные среды с заданным химическим составом.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет по меньшей мере 1 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет по меньшей мере 2 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет по меньшей мере 4 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет от 1 до 6 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет от 2 до 4 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов медь добавляют в основные среды для клеточных культур в виде соли меди, хелата меди или их комбинаций. Согласно конкретному варианту реализации указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанная одна или более клетка представляет собой клетку млекопитающего. Согласно конкретному варианту реализации указанные клетки млекопитающих представляют собой клетки СНО.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает периодическое культивирование указанных клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает непрерывное культивирование указанных клеток. Согласно конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование клеток производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование клеток производится в режиме перфузии.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанную одну или более клетку культивируют по меньшей мере в 100 л дополненной основной среды для клеточных культур.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 4,0х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток под- 6 029503
держивают на уровне менее чем 3,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 3,0 х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,0х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 1,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов этап отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта включает фильтрацию или центрифугирование для удаления клеток из указанной части культурального супернатанта.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов отделенный супернатант обладает удельной ΡΚΕΤδ-ννΡ73 активностью гА13, составляющей по меньшей мере 800 мЕ/мкг.
Согласно предпочтительному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант обладает удельной ΡΚΕΤδ-ννΡ73 активностью гА13, составляющей по меньшей мере 1200 мЕ/мкг.
Согласно более предпочтительному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант обладает удельной ΡΚΕΤδ-ννΡ73 активностью гА13, составляющей по меньшей мере 1600 мЕ/мкг.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание ΝΗ4+ в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне ниже 10 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание ΝΗ4+ в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне ниже 5 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание ΝΗ4+ в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный способ дополнительно включает этап обогащения гА13.
Согласно седьмому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный А^АΜΤ§13 (гА13), отличающийся тем, что указанный супернатант получают описанным в настоящей заявке способом.
Согласно восьмому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный А^АΜΤ§13 (гА13), отличающийся тем, что указанный супернатант содержит по меньшей мере 5 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 мл. Согласно конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 6 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 7 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 8 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 9 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 10 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 мл. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов супернатант получают согласно описанному в настоящей заявке способу.
Согласно девятому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный А^АΜΤ§13 (гА13), при этом указанный супернатант содержит по меньшей мере 2 мкг гА13 на 1 мл. Согласно конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 3 мкг гА13 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 4 мкг гА13 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 5 мкг гА13 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 6 мкг гА13 на 1 мл. Согласно еще одному конкретному варианту
- 7 029503
реализации вышеописанных супернатантов супернатант получают согласно описанному в настоящей заявке способу.
Согласно десятому аспекту в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция рекомбинантного ΆΌΆΜΤ§13 (гА13), полученная согласно любому из вышеописанных способов.
Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного введения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. (1А) - электрофорез в агарозном геле низкого разрешения (1%) гУ\УР экспрессируемого в культурах клеток млекопитающих в присутствии низкой (1,0 мкг/л) и высокой (4,3 мкг/л) концентраций меди, согласно описанию в примере 2. Отметим, что день культивирования 3 эквивалентен дню периодической культуры 1 из табл. 7 и 8; (1В) - относительное содержание мультимеров ννΡ, содержащих от 1 до 10 димеров (зона № 1) и более чем 10 димеров (зона № 2) согласно оценке зон, приведенных на фиг. 1А, количественно определяли денситометрическим анализом.
Фиг. 2. (2А) - интервальный график средней удельной активности гУ^Е в супернатантах клеточных культур τννΡ, выращенных при высокой и низкой плотности клеток в присутствии высоких или низких уровней меди; (2В) - интервальный график средней концентрации ΝΗ4+, обнаруживаемой в супернатантах клеточных культур гУ^Е, выращенных при высокой и низкой плотности клеток в присутствии высоких или низких уровней меди.
Фиг. 3. Супернатанты культур клеток, экспрессирующих рекомбинантный ΛΌΛΜΤ813 в присутствии возрастающих уровней меди, исследовали с применением анализа ДСН-ПААГ. После ДСН-ПААГ гА13 визуализировали с помощью (3А) окрашивания серебром и (3В) анти-А13 вестерн-блоттинга.
Фиг. 4. График зависимости объемной продуктивности (Р ЕгсЬ) от концентрации меди, показывающий экстраполированный (сплошная линия) эффект оптимальной концентрации меди на выработку гА13.
Фиг. 5А-К. Ступенчатые диаграммы при непрерывном суспензионном (хемостатическом) культивировании клеток, экспрессирующих гА13 на протяжении времени культивирования 8 недель, сравнивающие эффекты основных уровней меди (0,66 мкг/л) с таковыми в культурах, дополненных до конечной концентрации меди 2 мкг/л. Каждый столбец представляет среднее значение за неделю хемостатической культуры. Легенда относится к конкретным неделям, для которых представлены данные.
Фиг. 6. (6А) - электрофорез в агарозном геле низкого разрешения (1%) гУ^Р, экспрессируемого в культурах клеток млекопитающих в присутствии низкой (1,0 мкг/л) и высокой (4,3 мкг/л) концентраций меди при высокой и низкой плотности клеток согласно описанию в примере 3. Следует отметить, что дни культивирования 8 и 17 ("С8Т8" и "С8Т17") эквивалентны дню 8 и дню 17 в табл. 10-13; (6В) - относительное содержание мультимеров УХУЕ, содержащих от 1 до 10 димеров, и более чем 10 димеров согласно оценке зон, приведенных на фиг. 6А, количественно определяли денситометрическим анализом.
Подробное описание изобретения
Введение.
Рекомбинантный у\УЕ (гУ\УЕ) и рекомбинантный ΛΌΆΜΤ§13 (гА13) могут быть получены посредством экспрессии в крупномасштабных культурах клеток млекопитающих. Однако активность указанных белков при получении с применением стандартных условий культивирования клеток часто варьирует от культуры к культуре клеток, даже в тех случаях, когда общий состав сред неизменен; удельная активность рекомбинантных белков часто отличается от таковой у\УЕ и гА13, полученных из плазмы крови. Кроме того, гУ\УР экспрессируемый в культурах клеток млекопитающих, склонен образовывать белковые составы с низким (менее 10%) процентным содержанием мультимеров высшего порядка (мультимеры высшего порядка включают молекулы, содержащие более чем 10 димеров ννΡ). Эти недостатки стандартных способов получения гУ\УЕ и гА13 представляют особенные сложности при создании культур для крупномасштабного производства (т.е. от 10 до более чем 20000-литровых культур).
Одним из потенциальных источников вариабельности, часто наблюдаемой в разных партиях клеточной культур, является присутствие загрязнителей в компонентах сред для клеточных культур. Указанные загрязнители могут присутствовать в различном количестве в разных партиях, что приводит к варьирующим результатам при получении гУ\УЕ и гА13. После изучения различных загрязнителей, обнаруживаемых в различных добавках для клеточных культуральных сред, авторы настоящего изобретения обнаружили, что присутствие гидролизатов приводит к варьированию концентраций меди в таких культуральных средах. Дальнейшие исследования дали неожиданный результат: добавление меди в культуральные среды до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере от приблизительно 1 до приблизительно 20 мкг/л, стабильно увеличивало общую и удельную активность гУ\УЕ и гА13 и/или также могло приводить к увеличению общего выхода белка. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предложены способы и композиции для высокопродуктивного получения τννΡ и белков гА13 с высокой удельной активностью.
Согласно одному из аспектов в соответствии с настоящим изобретением предложены способы культивирования клеток и композиции для получения больших количеств гУ\УЕ и гА13, обладающих
- 8 029503
активностью, сравнимой или превышающей активность, проявляемую происходящим из плазмы νΥΡ (ράνΥΡ) или происходящим из плазмы ΆΌΛΜΤ§13 (ράΆ13). Согласно дальнейшим аспектам белки τνΥΡ и гА13, получаемые согласно настоящему изобретению, демонстрируют стабильно более высокую активность по сравнению с белками, получаемыми с применением стандартных способов культивирования клеток в средах без добавления меди или других добавок, подробно описываемых в настоящей заявке. Удачным образом, согласно определенным вариантам реализации описанных в настоящей заявке способов и композиций, белки τνΥΡ и гА13, полученные согласно настоящему изобретению, проявляют стабильно более высокую удельную активность (т.е. Е/мг белка) по сравнению с белками, полученными с применением стандартных способов культивирования клеток в средах без добавления меди или других добавок, подробно описываемых в настоящей заявке. Сходным образом, предложенные в соответствии с настоящим изобретением способы получения τνΥΡ и гА13 дают больший выход активности на объем культуры (т.е. Е/л/день) по сравнению со стандартными способами культивирования клеток с применением сред без добавления меди или других добавок, подробно описываемых в настоящей заявке.
Согласно еще одному аспекту в соответствии с настоящим изобретением предложены способы культивирования клеток, согласно которым в основную среду для клеточной культуры добавляют медь до получения общей концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 1 мкг/л. Согласно другим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют медь до получения общей концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 2 мкг/л. Согласно другим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют медь до получения общей концентрации, составляющей по меньшей мере от приблизительно 1 до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации общая концентрация меди составляет приблизительно 1,5-4,5 мкг/л. Согласно определенным вариантам реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь до получения приблизительно 1; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2; 2,4; 2,6; 2,8; 3; 3,2; 3,4; 3,6; 3,8; 4; 4,2; 4,4; 4,6; 4,8; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20 мкг/л меди или более. Основные среды для клеточных культур как правило, содержат следовые концентрации меди менее 1 мкг/л.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы культивирования клеток, согласно которым в основную среду для клеточной культуры добавляют от приблизительно 1,0 до приблизительно 20 мкг/л меди для продуцирования τνΥΡ. Согласно дальнейшим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют приблизительно 1,5-15; 2,0-10; 2,58; 3,0-6; 4,0-5,0 мкг/л меди для продуцирования τνΥΡ. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры может, помимо добавленной меди, также содержать один или более гидролизат.
Согласно другим вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает способы культивирования клеток, согласно которым в основную среду для клеточной культуры добавляют от приблизительно 1,5 до приблизительно 4 мкг/л меди для продуцирования гА13. Согласно дальнейшим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют приблизительно 1,6-3,8; 1,7-3,6; 1,8-3,4; 1,9-3,2; 2,0-3,0; 2,1-2,8; 2,2-2,6; 2,3-2,4 мкг/л меди для продуцирования гА13. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры может, помимо добавленной меди, также содержать один или более гидролизат. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры включает, помимо меди и/или одного или более гидролизата, от приблизительно 1,0 до приблизительно 30 мкМ цинка. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры также содержит, помимо меди и/или одного или более гидролизата и/или цинка, приблизительно от 0,5 до приблизительно 5,0 мМ кальция.
Согласно дальнейшему аспекту и в соответствии со всеми вышеизложенными, в соответствии с настоящим изобретением предложены способы культивирования клеток, согласно которым уровни аммония в растворе культуры клеток являются низкими (менее 10 мМ). Согласно определенным вариантам реализации в способах культивирования клеток согласно настоящему изобретению применяют среды для клеточных культур, содержащие более 1, 2, 3, 4 или 5 мкг/л меди в комбинации с низкими уровнями аммония.
Одним из преимуществ способов и композиций согласно настоящему изобретению является то, что они подходят для крупномасштабного культивирования клеток. Объем указанных крупномасштабных культур клеток составляет по меньшей мере 10, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000 или 20000 л.
Согласно определенным аспектам способы согласно настоящему изобретению не обязательно приводят к получению большего суммарного количества рекомбинантного белка, однако получаемый рекомбинантный белок (τνΥΡ или гА13) демонстрирует более высокую общую и удельную активность, чем обнаруживаемая у белков, полученных с применением стандартных клеточных культур, в частности по сравнению с белками, полученными в таких культурах клеток, где среда для клеточной культуры не содержит дополнительных добавок меди. Согласно дальнейшим аспектам белки гУ\УР и гА13, полученные из клеток, культивируемых в средах с добавлением меди, демонстрируют стабильно повышенную активность на литр культуры клеток по сравнению с клетками, культивируемыми в основных средах для клеточных культур без добавления меди. Согласно дальнейшим аспектам добавление в среды меди со- 9 029503
гласно настоящему изобретению приводит к повышению выхода белка, увеличению числа клеток в культуре и/или повышению общей активности на литр культуры по сравнению со средами без добавления меди.
Дальнейшие преимущества способов и композиций согласно настоящему изобретению заключаются в получении популяции белков с высоким процентным содержанием (более 10%) высокомультимеризованного гУ\УР.
Хотя значительная часть обсуждения белков ΑΌΑΜΤδ в настоящей заявке относится к ΑΌΑΜΤδ13 (А13), необходимо понимать, что, так как все белки ΑΌΑΜΤδ имеют общую структуру центрального домена и общие структурно-функциональные связи, способы и композиции, описанные в настоящей заявке, применимы для получения любых белков ΑΌΑΜΤδ, не ограничиваясь гА13.
Определения.
Используемый в настоящей заявке термин "рекомбинантный ννΡ" включает ννΡ, полученный с применением технологии рекомбинантной ДНК. Согласно определенным вариантам реализации белки ννΡ согласно настоящему изобретению могут содержать конструкцию, полученную, например, согласно \УО 1986/06096, опубликованной 23 окт. 1986 г., и заявке на патент США сер. № 07/559509, поданной 23 июля 1990 г. от имени СиъЬигд е! а1., включенных в настоящую заявку посредством ссылки в отношении способов получения рекомбинантного ννΡ. ννΡ согласно настоящему изобретению может включать все потенциальные формы, в том числе мономерные и мультимерные формы. Необходимо также понимать, что настоящее изобретение охватывает применение комбинаций разных форм ννΡ. Например, ννΡ согласно настоящему изобретению может включать разные мультимеры, разные производные; как активные биологически производные, так и не активные биологические производные.
Термин "рекомбинантный" при использовании, например, в отношении клетки или нуклеиновой кислоты, белка или вектора, означает, что указанная клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор модифицированы введением гетерологичной(ного) нуклеиновой кислоты или белка, либо изменением нативной(ного) нуклеиновой кислоты или белка, или что указанная клетка получена из модифицированной таким образом клетки. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, не обнаруживаемые в нативных (нерекомбинантных) формах указанных клеток или экспрессируют нативные гены, которые в противном случае экспрессируются аномально, экспрессируются недостаточно или не экспрессируются вообще.
В контексте настоящего изобретения "рекомбинантный ννΡ" охватывает любые члены семейства ννΡ, например от млекопитающих, таких как приматы, человек, обезьяна, кролик, свинья, грызуны, мышь, крыса, хомяк, песчанка, собачьи, кошачьи; и их биологически активные производные. Согласно предпочтительному варианту реализации рекомбинантный ννΡ представляет собой ννΡ человека. Мутантные и вариантные белки ννΡ, обладающие активностью, также включены, как и функциональные фрагменты и гибриды белков ννΡ. Кроме того, ννΡ согласно настоящему изобретению могут также содержать метки, облегчающие очистку или определение, или и то, и другое. ννΡ, описанные в настоящей заявке, могут также быть модифицированы терапевтическим агентом или агентом, подходящим для визуализации ίη νίίτο или ίη νίνο.
Термины "высокомультимерный ννΡ", "высокомолекулярный ννΡ" и "ΗΜν ννΡ" могут использоваться взаимозаменяемо и относятся к ковалентно связанным мультимерам ννΡ, содержащим более чем 10 димеров ννΡ. Согласно определенным вариантам реализации ΗΜν ννΡ содержит по меньшей мере 11 димеров ννΡ или по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или более димеров ννΡ.
Используемый в настоящей заявке термин "белок ΑΌΑΜΤδ" относится к полипептиду - дезинтегрину и металлопротеиназе из семейства металлопротеиназ с мотивами тромбоспондина I типа. Члены указанного семейства включают белки человека ΑΌΑΜΤδ1 (ΝΜ_006988), ΑΌΑΜΤδ2 (ΝΜ_014244; ΝΜ_021599), ΑΌΑΜΤδ3 (ΝΜ_014243), ΑΌΑΜΤδ4 (ΝΜ_005099), ΑΌΑΜΤδ5 (ΝΜ_007038), ΑΌΑΜΤδ6 (ΝΜ_014273), ΑΌΑΜΤδ7 (ΝΜ_0142727), ΑΌΑΜΤδ8 (ΝΜ_007037), ΑΌΑΜΤδ9 (ΝΜ_182920; ΝΜ_182921; ΝΜ_020249), ΑΌΑΜΤδ10 (ΝΜ_030957), ΑΌΑΜΤδ12 (ΝΜ_030955), ΑΌΑΜΤδ13
(ΝΜ_139025; ΝΜ_139026; ΝΜ_139027; ΝΜ_139028), ΑΌΑΜΤδ14 (ΝΜ_139155; ΝΜ_080722),
ΑΌΑΜΤδ15 (ΝΜ_139055), ΑΌΑΜΤδ16 (ΝΜ_139056), ΑΌΑΜΤδ17 (ΝΜ_139057), ΑΌΑΜΤδ18
(ΝΜ_199355; ΝΜ_139054), ΑΌΑΜΤδ19 (ΝΜ_133638) и ΑΌΑΜΤδ20 (ΝΜ_025003, ΝΜ_175851). Белки ΑΌΑΜΤδ включают и полноразмерные белки, и неполные полипептиды, которые проявляют, по меньшей мере, частичную биологическую активность, например по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более от активности, демонстрируемой полноразмерным белком, в частности протеазной активности, демонстрируемой полноразмерным белком. В определенных случаях белок ΑΌΑΜΤδ подвергается посттрансляционной модификации ίη νίνο или ίη νίίτο, например, ферментативным или химическим путем. Понятно, что белки ΑΌΑΜΤδ согласно настоящему изобретению включают изоформы альтернативного сплайсинга, консервативно модифицированные белки, идентичные, по существу, белки, гомологи и т.п.
В контексте настоящего изобретения термин "белок ΑΌΑΜΤδ" охватывает любые члены семейства ΑΌΑΜΤδ, происходящие, например, из млекопитающих, таких как приматы, человек, обезьяна, кролик,
- 10 029503
свинья, грызуны, мышь, крыса, хомяк, песчанка, собачьи, кошачьи и их биологически активные производные. Мутантные и вариантные белки ΛΌΛΜΤδ, обладающие активностью, также включены, как и функциональные фрагменты и гибриды белков ΛΌΛΜΤδ. Кроме того, белки ΛΌΛΜΤδ согласно настоящему изобретению могут также содержать метки, облегчающие очистку или определение, или и то, и другое. Белки ΛΌΛΜΤδ, описанные в настоящей заявке, могут также быть модифицированы терапевтическим агентом или агентом, подходящим для визуализации ίη νίΐτο или ίη νίνο.
Используемый в настоящей заявке термин "белок ΛΌΛΜΤδ 13" относится к любому белку или полипептиду, обладающему активностью ΛΌΛΜΤδ 13, в частности, способностью расщеплять пептидную связь между остатками Τγτ-842 и Мс1-843 в νΥΡ. Согласно типовому варианту реализации "белок ΛΌΛΜΤδ 13" относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, в значительной степени сходную с таковой ΝΡ_620594 (изоформа 1 ΛΌΛΜΤδ13, препробелок) или аминокислотами 75-1427 ΝΡ_620594 (изоформа 1 ΛΌΛΜΤδ13, зрелый полипептид). Согласно другому варианту реализации "белок ΛΌΛΜΤδ13" относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, в значительной степени сходную с таковой ΝΡ_620596 (изоформа 2 ΛΌΛΜΤδ13, препробелок) или аминокислотами 75-1371 ΝΡ_620594 (изоформа 2 ΛΌΛΜΤδ13, зрелый полипептид). Согласно еще одному из вариантов реализации ΛΌΛΜΤδ13 белки включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, в значительной степени сходную с таковой ΝΡ_620595 (изоформа 3 ΛΌΛΜΤδ13, препробелок) или аминокислотами 75-1340 ΝΡ_620595 (изоформа 1 ΛΌΛΜΤδ13, зрелый полипептид). Используемый в настоящей заявке термин "белок ΛΌΛΜΤδ13" включает природные варианты, обладающие νΥΡ-расщепляющей активностью, и искусственные конструкции, обладающие νΥΡрасщепляющей активностью. Согласно применению в настоящем описании "ΛΌΛΜΤδ13" охватывает любые природные варианты, альтернативные последовательности, изоформы или мутантные белки, сохраняющие некоторую степень основной активности. Примеры мутаций ΛΌΛΜΤδ13, обнаруживаемые в популяциях человека, включают без ограничений Κ7Υ, ν88Μ, Η96Ό, К102С, Κ193Υ, Τ196Ι, Н234Р, Λ250ν, К268Р, Υ390Ο К398Н, О448Е. Р456Н, Р457Ь, С508У, К528О, Р618А, К625Н, Ι673Ρ, К692С, Λ732ν, δ903Ε, С908У, С951О, О982К, С1024О, Λ1033Τ, Κ1095Υ, К1123С, С1213У, Τ1226Ι, Ο1239ν, Κ1336Υ, для многих из которых показана связь с тромботической тромбоцитопенической пурпурой (ТТП). Белки ΛΌΛΜΤδ13 также включают полипептиды, содержащие посттрансляционные модификации. Например, показано, что ΛΌΛΜΤδ13 модифицируется Ν-ацетилглюкозамином (ΟΙοΝΛο) по остаткам 614, 667 и 1354, и предсказано, что остатки 142, 146, 552, 579, 707, 828 и 1235 могут также модифицироваться таким образом.
Протеолитически активный рекомбинантный ΛΌΛΜΤδ13 может быть получен посредством осуществления экспрессии в культурах клеток млекопитающих согласно описанию у РЫтаиет с1 а1., (2002, Βίοοά. 15;100(10):3626-32) и в υδ 2005/0266528, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей. Способы экспрессии рекомбинантного ΛΌΛΜΤδ13 в культуре клеток описаны у РЫтаиет В, БсЪеИИпдег Ρ. (8етш НетаЮ! 2004 1ап;41(1):24-33 и в υδ 2011/0086413, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Используемый в настоящей заявке термин "биологически активное производное" при использовании в контексте белка ΛΌΛΜΤδ охватывает также полипептиды, полученные с применением технологии рекомбинантной ДНК, что может включать любые известные в данной области техники способы (ί) получения рекомбинантной ДНК посредством методов генной инженерии, например посредством обратной транскрипции РНК и/или амплификации ДНК, (ίί) введения рекомбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки путем трансфекции, т.е. электропорацией или микроинъекцией, (ίίί) культивирования указанных трансформированных клеток, например, в непрерывном или периодическом режиме, (ίν) экспрессии белка ΛΌΛΜΤδ, например, конститутивного или индуцируемого, и (ν) выделения указанного белка ΛΌΛΜΤδ, например, из культуральной среды или путем сбора трансформированных клеток, (νί) получения существенно очищенного рекомбинантного белка ΛΌΛΜΤδ, например, с помощью ионообменной хроматографии, эксклюзионной хроматографии, аффинной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием и т.п. Термин "биологически активное производное" включает также гибридные молекулы, такие как, например, белок ΛΌΛΜΤδ или его функциональный фрагмент, скомбинированный с вторым полипептидом, например доменом Рс иммуноглобулина или альбуминовым доменом, для улучшения биологических/фармакологических параметров, таких как, например, период полужизни белка ΛΌΛΜΤδ в кровотоке млекопитающего, в частности человека.
Термины "выделенный", "очищенный" или "биологически чистый" относятся к веществу, практически или по существу не содержащему компонентов, обычно сопутствующих ему в естественном состоянии. Чистоту и гомогенность, как правило, определяют с применением техник аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или жидкостная хроматография высокого разрешения. Согласно одному из вариантов реализации τνΥΡ представляет собой преобладающий компонент в существенно очищенном составе. Согласно другому варианту реализации τΛ13 представляет собой преобладающий компонент в существенно очищенном составе. Термин "очищенный" согласно некоторым вариантам реализации означает, что нуклеиновая кислота или белок дают, по существу, одну полосу в
- 11 029503
электрофоретическом геле. Согласно другим вариантам реализации это означает, что чистота указанной(ого) нуклеиновой кислоты или белка составляет по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более. "Чистота" или "очистка" согласно другим вариантам реализации означает удаление по меньшей мере одного загрязнителя из подвергаемой очищению композиции. В этом смысле очистка не подразумевает, что очищенное соединение будет гомогенным, например чистым на 100%.
Биологическая активность у\УР может быть измерена посредством известных методов анализа ίη νί1го. Например, ристоцетин-кофакторный анализ основан на агглютинации свежих или фиксированных формалином тромбоцитов, индуцированной антибиотиком ристоцетином в присутствии у\УР. Степень агглютинации тромбоцитов зависит от концентрации у\УР и может быть измерена турбодиметрическим методом, например, с применением агрегометра (^е1кк с1 а1., 1. С1ш. Ιηνεδΐ. 52: 2708-2716, 1973; МасГаг1апе е! а1., ТЬготЬ. ΌίαΐΗ. НаетоггИ. 34: 306-308, 1975). В настоящей заявке удельную ристоцетинкофакторную активность у\УР согласно настоящему изобретению выражают в мЕ/мкг у\УР согласно оценке с применением методов анализа ίη νίΙΐΌ.
Используемый в настоящей заявке термин "одна единица активности ΑΌΑΜΤδ" означает уровень активности в 1 мл смешанной нормальной плазмы человека, независимо от того, какой метод анализа применяют. Например, в том случае, если белок ΆΌΆΜΤδ представляет собой ΆΌΛΜΤδ13, одна единица активности ΛΌΛΜΤδ13 ΡΚ.ΕΤδ-ν\νΡ73 представляет собой уровень активности, необходимый для расщепления такого же количества субстрата ΡΚΕΤδ-ν^Ρ73 (Кокате е! а1., Вг ί Наета!о1. 2005 Арг; 129(1):93-100), которое расщепляется 1 мл смешанной нормальной плазмы человека. Удобно, что активность ΑΌΑΜΤδ13 может быть определена методами функционального анализа, такими как функциональный анализ с применением модифицированных пептидов фактора фон Виллебранда в качестве субстрата ΑΌΑΜΤδ13 (Мрой е! а1. ί. ΤΙιΐΌΐηό Наеток!. 2008 δер; 6(9): 1534-41). Предпочтительный способ определения активности рекомбинантного ΑΌΑΜΤδ13 человека описан у Сеггйкеп е! а1. (Аккау оГ νοη ^ШеЬгапй Гас!ог (у\УР)-с1еа\апд рго!еаке Ьакей оп йесгеакей со11адеп Ьшйшд аГйпйу оГ йедгайей ν\νΡ: а !оо1 Гог 1Ие Фадпоык оГ ШготЬойс !ЬготЬосу!оретс ригрига (ΤΤΡ) ("Анализ протеазы, расщепляющей фактор фон Виллебранда (ν^Ρ), основанный на понижении коллагенсвязывающей способности деградированного νΨΡ: инструмент для диагностики тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТП)"). ΤΙιΐΌΐηό Наеток! 1999; 82: 1386-1389). Согласно одному из вариантов реализации, чтобы считаться белком ΑΌΑΜΤδ13 согласно приведенному выше определению, полипептид или белок должен обладать по меньшей мере 1% ν^Ρ-расщепляющей активности нативного ΑΌΑΜΤδ13. Согласно другим вариантам реализации белок ΑΌΑΜΤδ13 обладает по меньшей мере 10% активности нативного ΑΌΑΜΤδ13. Согласно другим вариантам реализации белок ΑΌΑΜΤδ13 обладает по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% активности нативного ΑΌΑΜΤδ13. Количество белка ΑΌΑΜΤδ13 также может быть определено измерением антигена ΑΌΑΜΤδ13, например, с применением метода ИФА (ΕΌΙδΑ), описанного у Кгедег е! а1., (2006, ΤΙιΐΌΐηό Наеток!. 2006; 95(2):212-20). В данной области техники общепризнано, что 1 мл смешанной нормальной плазмы человека содержит 1 мкг ΑΌΑΜΤδ13. Таким образом, согласно общепринятому в данной области техники правилу 1 мкг полученного из плазмы ΑΌΑΜΤδ13 обладает одной единицей активности ΑΌΑΜΤδ13.
Термины "раствор культуры клеток", "среда или среды для клеточной культуры" и "супернатант культуры клеток" относятся к аспектам процессов культивирования клеток, как правило, общеизвестным в данной области техники. В контексте настоящего изобретения раствор культуры клеток может включать среды для клеточных культур и супернатант культуры клеток. Указанные среды для клеточных культур вводят в раствор культуры клеток извне, необязательно вместе с добавками, для обеспечения питательных веществ и других компонентов для культивирования клеток, экспрессирующих гУ^Р или γΑ13. Термин "супернатант культуры клеток" относится к раствору культуры клеток, содержащему питательные вещества и другие компоненты из среды для клеточной культуры, а также продукты, высвобождаемые, метаболизируемые и/или экскретируемые клетками во время культивирования, но не сами клетки. Таким образом, согласно одному контексту "супернатант культуры клеток" может относиться к жидкой фазе раствора культуры клеток (т.е. к раствору культуры клеток, исключая клетки). Например, концентрация аммония культурального супернатанта, как правило, относится к концентрации аммония в растворе культуры клеток. Согласно другим контекстам "супернатант культуры клеток" относится к раствору культуры клеток, из которого указанные клетки были извлечены (т.е. отделенному супернатанту культуры клеток).
Используемые в настоящей заявке термины "витамин В3", "никотинамид", "ниацинамид", "ниацин" и "никотиновая кислота" могут использоваться взаимозаменяемо, относясь к любому члену семейства витаминов В3. Соответственно, любой член указанного семейства может быть использован для добавления в среду, применяемую в способах согласно настоящему изобретению.
Используемый в настоящей заявке термин "среда с заданным химическим составом" или "среды с заданным химическим составом" относится к синтетической ростовой среде, все компоненты которой идентифицированы и их концентрации известны. Среды с заданным химическим составом не содержат бактериальных, дрожжевых, животных или растительных экстрактов, хотя они могут включать или не
- 12 029503
включать отдельные компоненты растительного или животного происхождения (например, белки, полипептиды и т.п.). Неограничивающие примеры коммерчески доступных сред с заданным химическим составом включают различные модифицированные по Дульбекко среды Игла (ΏΜΕ) (δί^α-ΑΙάτίΛ Со; δΑΡί'.’ Вю8аеисе8, 1пс.), питательную смесь Хэма (δί^α-ΑΙάτίΛ Со; §ΑΡС Вю8С1еисе8, 1пс.), их комбинации и т.п. Способы получения культуральных сред с заданным химическим составом известны в данной области техники, например, в патентах США № 6171825 и №6936441, \О 2007/077217 и опубликованных заявках на патент США № 2008/0009040 и № 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Используемый в настоящей заявке термин "не содержащая олигопептидов культуральная среда" или "не содержащие олигопептидов культуральные среды" относится к не содержащей белков среде, которая не содержит олигопептиды, такие как, например, олигопептиды, полученные из белкового гидролизата. Согласно одному из вариантов реализации указанная среда не содержит олигопептиды, состоящие из двадцати или более аминокислот. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие пятнадцати или более аминокислот. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие десять или более аминокислот. Согласно одному варианту реализации указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие семь или более аминокислот. Согласно другому варианту реализации указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие пять или более аминокислот. Согласно еще одному варианту реализации указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие три или более аминокислоты. Согласно дальнейшему варианту реализации настоящего изобретения указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие две или более аминокислоты. Способы получения не содержащих олигопептидов культуральных сред известны в данной области техники, например в патентах США № 6171825 и № 6936441, \О 2007/077217 и опубликованных заявках на патент США № 2008/0009040 и № 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Используемый в настоящей заявке термин "бессывороточная культуральная среда" или "бессывороточные культуральные среды" относится к культуральной среде без добавления животной сыворотки. Несмотря на то, что зачастую бессывороточные среды представляют собой среды с заданным химическим составом, в бессывороточные среды могут быть добавлены отдельные животные или растительные белки или белковые фракции. Способы получения бессывороточных культуральных сред известны в данной области техники, например в патентах США № 6171825 и № 6936441, \О 2007/077217 и опубликованных заявках на патент США № 2008/0009040 и № 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Используемый в настоящей заявке термин "не содержащая животных белков культуральная среда" или "не содержащие животных белков культуральные среды" относится к культуральной среде без добавления животной сыворотки, белка или фракции белка. Хотя зачастую не содержащие животных белков культуральные среды представляют собой среды с заданным химическим составом, не содержащие животных белков культуральные среды могут содержать растительные или дрожжевые гидролизаты. Способы получения не содержащих животных белков культуральных сред известны в данной области техники, например в патентах США № 6171825 и № 6936441, \О 2007/077217 и опубликованных заявках на патент США № 2008/0009040 и № 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Используемый в настоящей заявке термины "основная (базовая)среда для клеточной культуры" или "основные (базовые) среды для клеточных культур" относятся к культуральной среде с заданным химическим составом, не содержащей олигопептидов культуральной среде, бессывороточной культуральной среде или не содержащей животных белков культуральной среде, в которую не был добавлен гидролизат, например растительный или дрожжевой гидролизат. Основные среды общеизвестны в данной области техники, например ΌΜΕΜ, Хэма Ρ12, ΌΜΕΜ/Хэма Ρ12, среда 199, МсСоу или ΚΡΜΙ. Указанная основная среда может включать ряд ингредиентов, в том числе аминокислоты, витамины, органические и неорганические соли и источники углеводов. Каждый ингредиент может присутствовать в количестве, обеспечивающем культивирование клетки; такие количества общеизвестны специалистам в данной области техники. Указанная среда может включать вспомогательные вещества, такие как буферные вещества, например бикарбонат натрия, антиоксиданты, стабилизаторы для противодействия механическому напряжению или ингибиторы протеазы. При необходимости, могут быть добавлены неионогенные ПАВ, такие как сополимеры и/или смеси полиэтиленгликолей и полипропиленгликолей.
Среды для клеточных культур и супернатант культуры клеток.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к средам для клеточных культур для получения гУ\Р и/или τΑ13, обладающих повышенной активностью по сравнению с гУ\Р и τΑ13, полученных с применением основных сред для клеточных культур. Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к средам для клеточных культур для получения гУ\Р и/или τΑ13, в которых в основные среды для клеточных культур добавляют одно или более дополнительное вещество. Согласно конкретным вариантам реализации и приведенному ниже более подробному описанию условия культи- 13 029503
вирования клеток согласно настоящему изобретению включают основные среды для клеточных культур, в которые добавлена медь до концентрации по меньшей мере 1,0 мкг/л. Согласно дальнейшим вариантам реализации применяемые среды для клеточных культур и супернатанты, полученные с помощью процессов согласно настоящему изобретению, также содержат низкие уровни (менее 10 мМ) аммония. Согласно конкретному варианту реализации условиями культивирования клеток, применяемыми для экспрессии гУ\УЕ и/или гА13, управляют таким образом, чтобы поддерживать в супернатанте культуры клеток низкий уровень аммония, т.е. менее чем 10 мМ и предпочтительно менее чем 5 мМ.
Культуральная среда согласно настоящему изобретению может быть основана на подходящих основных средах, общеизвестных в данной области техники, таких как ЭМЕМ, Хэма Р12, ЭМЕМ/Хэма Р12, среда 199, МсСоу или КРМ1. Основная среда может включать ряд ингредиентов, включая аминокислоты, витамины, органические и неорганические соли и источники углеводов. Каждый ингредиент может присутствовать в количестве, содействующем культивированию клетки; такие количества, как правило, известны специалистам в данной области техники. Указанная среда может включать вспомогательные вещества, такие как буферные вещества, например бикарбонат натрия, антиоксиданты, стабилизаторы для противодействия механическому стрессу или ингибиторы протеазы. При необходимости может быть добавлено неионогенное ПАВ, например сополимеры и/или смеси полиэтиленгликолей и полипропиленгликолей.
Как правило, основные среды содержат менее чем 1 мкг/л меди - например, среда ЭМЕМ/Хэма Р12 содержит медь в концентрации приблизительно 0,3 мкг/л. Такие концентрации меди не обеспечивают достаточного количества ионов меди для поддержания продуцирования белков гУ\ХЕ и гА13 согласно настоящему изобретению, которые проявляют высокую удельную активность.
Медь может быть введена в среды для клеточных культур согласно настоящему изобретению с помощью различных способов, например введением добавки в среду. Согласно некоторым вариантам реализации указанная добавка в культуральную среду может содержать гидролизат, который можно применять для повышения концентрации меди в указанной среде. Гидролизаты могут включать любой гидролизат из общеизвестных в данной области техники, таких как растительные гидролизаты, соевые гидролизаты и гидролизат пшеничной клейковины. Согласно определенным вариантам реализации добавление гидролизата может способствовать повышенной концентрации меди от приблизительно 0,2 до приблизительно 10 мкг/л Си2+. Согласно некоторым вариантам реализации количество меди, обеспеченное гидролизатом, может зависеть от количества меди в указанном гидролизате, а также количества добавленного гидролизата. Содержание меди в гидролизате может быть определено элементным анализом, например адсорбционной атомной спектроскопией (ОЕАА: атомной абсорбцией в графитовой печи), или массспектрометрическими методами (например, ИСП-МС).
Согласно определенным вариантам реализации медь может вводиться в культуральные среды, сама по себе или вместе с гидролизатом, путем введения средовой добавки, включая подходящую соль меди или хелат меди. Подходящая медь соли может включать, не ограничиваясь перечисленными, сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди и оксид меди. Подходящие хелаторы меди могут включать, не ограничиваясь перечисленными, альбумин, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), полиаминовые хелатирующие агенты, этилендиамин, диэтилентриамин, триэтилентетрамин, триэтилендиамин, тетраэтиленпентамин, аминоэтилэтаноламин, аминоэтилпиперазин, пентаэтиленгексамин, триэтилентетрамин-гидрохлорид, тетраэтиленпентамин-гидрохлорид, пентаэтиленгексамин-гидрохлорид, тетраэтилпентамин, каптоприл, пеницилламин, Ы,№-бис(3-аминопропил)-1,3пропандиамин, Х,Х,бис(2-аминоэтил)-1,3-пропандиамин, 1,7-диокса-4,10-диазациклододекан, 1,4,8,11тетраазациклотетрадекан-5,7-дион, 1,4,7-триазациклононана тригидрохлорид, 1-окса-4,7,10-триазациклододекан, 1,4,8,12-тетраазациклопентадекан и 1,4,7,10-тетраазациклододекан.
Согласно определенным вариантам реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди от приблизительно 1,0 до приблизительно 20 мкг/л. Согласно конкретному варианту реализации в основные клеточные среды добавляют медь до конечной концентрации от приблизительно 1,0 до приблизительно 10 мкг/л. Согласно дальнейшим вариантам реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения конечной концентрации приблизительно 1,0-5,0; 1,2-4,0; 1,3-3,0; 1,4-2,9; 1,5-2,8; 1,6-2,7; 1,7-2,6; 1,8-2,5; 1,9-2,4; 2,0-2,3; 2,1-2,2 мкг/л меди. Согласно дальнейшим вариантам реализации основные среды для клеточных культур, применяемые в способах согласно настоящему изобретению, дополняют до получения концентраций меди приблизительно 1,2-9,5; 1,4-9; 1,6-8,5; 1,8-8; 2,0-7,5; 2,2-7; 2,4-6,5; 2,6-6,0; 2,8-5,5; 3,0-5,0; 3,2-4,5; 3,4-4 и 2-4 мкг/л. Согласно другим вариантам реализации основные среды для клеточных культур, применяемые в способах согласно настоящему изобретению, дополняют до получения концентраций меди приблизительно 1-6, 2-5, 3-4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 1 мкг/л. Согласно другому варианту реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 2 мкг/л. Согласно еще одному из вариантов реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 4 мкг/л. Согласно определенным вариантам реали- 14 029503
зации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 1 мкг/л или по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 мкг/л меди или более. Согласно определенным вариантам реализации и более подробному описанию ниже в настоящей заявке культуры для получения гА13 могут содержать приблизительно 2-4 мкг/л меди, тогда как культуры для получения ΓΥνΗ могут содержать по меньшей мере 2 мкг/л меди.
Вышеуказанные концентрации представляют собой относительные концентрации чистой меди в форме двухвалентного иона меди (Си2+). Если используется производное меди, например гидратированная соль, или соединение, содержащее медь, например хелатор меди, указанное количество производного или хелатора добавляют таким образом, что конечная концентрация меди попадает в указанные в настоящей заявке диапазоны. Например, 2 мкг/л Си8О4-5Н2О эквивалентны концентрации меди, составляющей приблизительно 0,51 мкг/л (без сульфата и 5Н2О).
Удачным образом, было обнаружено, что применение в процессе культивирования клеток среды для клеточной культуры, обеспечивающей низкие концентрации (ХН^) в растворе культуры клеток (т.е. в культуральном супернатанте), приводит к экспрессии рекомбинантного ΧΆΡ и/или гА13 с более высокой удельной активностью. Соответственно, согласно определенным вариантам реализации концентрация ΝΉ4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 10 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации концентрация ΝΉ4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 5 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации концентрация ΝΉ4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 4 мМ. Согласно другим вариантам реализации концентрация ΝΉ4 в указанном супернатанте составляет не более чем 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее.
Соответственно, согласно определенным вариантам реализации способы и композиции, предложенные в соответствии с настоящим изобретением, основаны на применении основных сред для клеточных культур с добавлением меди (например, до конечной концентрации, составляющей по меньшей мере 2 мкг/л) для применения в процессе, который приводит к концентрации ΝΉ4+ в супернатанте, составляющей не более 10 мМ. Согласно другим вариантам реализации основную среду для клеточной культуры дополняют для получения конечных концентраций меди и аммония согласно любому из вариантов 1440, приведенных в табл. 1.
Таблица 1
Типовые варианты концентраций меди и аммония в культуральных средах и супернатанте, подходящих для экспрессии рекомбинантных белков согласно настоящему описанию
IV. Концентрация аммония
но. НБЧ ЮмМ НБЧ 9мМ НБЧ 8мМ НБЧ 7мМ НБЧ 6мМ НБЧ 5мМ НБЧ 4мМ НБЧ ЗмМ НБЧ 2мМ НБЧ 1мМ
Концентрация меди пмм 1 мкг/л Вар. 1 Вар. 41 Вар. 81 Вар. 121 Вар. 161 Вар. 201 Вар. 241 Вар. 281 Вар. 321 Вар. 361 Вар. 401
ПММ 2 мкг/л Вар. 2 Вар. 42 Вар. 82 Вар. 122 Вар. 162 Вар. 202 Вар. 242 Вар. 282 Вар. 322 Вар. 362 Вар. 402
ПММ 3 мкг/л Вар. 3 Вар. 43 Вар. 83 Вар. 123 Вар. 163 Вар. 203 Вар. 243 Вар. 283 Вар. 323 Вар. 363 Вар. 403
ПММ 4 мкг/л Вар. 4 Вар. 44 Вар. 84 Вар. 124 Вар. 164 Вар. 204 Вар. 244 Вар. 284 Вар. 324 Вар. 364 Вар. 404
ПММ 5 мкг/л Вар. 5 Вар. 45 Вар. 85 Вар. 125 Вар. 165 Вар. 205 Вар. 245 Вар. 285 Вар. 325 Вар. 365 Вар. 405
ПММ 6 мкг/л Вар. 6 Вар. 46 Вар. 86 Вар. 126 Вар. 166 Вар. 206 Вар. 246 Вар. 286 Вар. 326 Вар. 366 Вар. 406
ПММ 7 мкг/л Вар. 7 Вар. 47 Вар. 87 Вар. 127 Вар. 167 Вар. 207 Вар. 247 Вар. 287 Вар. 327 Вар. 367 Вар. 407
ПММ 8 мкг/л Вар. 8 Вар. 48 Вар. 88 Вар. 128 Вар. 168 Вар. 208 Вар. 248 Вар. 288 Вар. 328 Вар. 368 Вар. 408
- 15 029503
пмм 9 мкг/л Вар. 9 Вар. 49 Вар. 89 Вар. 129 Вар. 169 Вар. 209 Вар. 249 Вар. 289 Вар. 329 Вар. 369 Вар. 409
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
10 мкг/л 10 50 90 130 170 210 250 290 330 370 410
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
1 мкг/л 11 51 91 131 171 211 251 291 331 371 411
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
1,5 мкг/л 12 52 92 132 172 212 252 292 332 372 412
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
2 мкг/л 13 53 93 133 173 213 253 293 333 373 413
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
2,5 мкг/л 14 54 94 134 174 214 254 294 334 374 414
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
3 мкг/л 15 55 95 135 175 215 255 295 335 375 415
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
3,5 мкг/л 16 56 96 136 176 216 256 296 336 376 416
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
4 мкг/л 17 57 97 137 177 217 257 297 337 377 417
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
4,5 мкг/л 18 58 98 138 178 218 258 298 338 378 418
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
5 мкг/л 19 59 99 139 179 219 259 299 339 379 419
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
5,5 мкг/л 20 60 100 140 180 220 260 300 340 380 420
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
6 мкг/л 21 61 101 141 181 221 261 301 341 381 421
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
7 мкг/л 22 62 102 142 182 222 262 302 342 382 422
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
8 мкг/л 23 63 103 143 183 223 263 303 343 383 423
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
9 мкг/л 24 64 104 144 184 224 264 304 344 384 424
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
10 мкг/л 25 65 105 145 185 225 265 305 345 385 425
1-20 мкг/л Вар. 26 Вар. 66 Вар. 106 Вар. 146 Вар. 186 Вар. 226 Вар. 266 Вар. 306 Вар. 346 Вар. 386 Вар. 426
2-20 мкг/л Вар. 27 Вар. 67 Вар. 107 Вар. 147 Вар. 187 Вар. 227 Вар. 267 Вар. 307 Вар. 347 Вар. 387 Вар. 427
1-10 мкг/л Вар. 28 Вар. 68 Вар. 108 Вар. 148 Вар. 188 Вар. 228 Вар. 268 Вар. 308 Вар. 348 Вар. 388 Вар. 428
2-10 мкг/л Вар. 29 Вар. 69 Вар. 109 Вар. 149 Вар. 189 Вар. 229 Вар. 269 Вар. 309 Вар. 349 Вар. 389 Вар. 429
1-6 мкг/л Вар. 30 Вар. 70 Вар. по Вар. 150 Вар. 190 Вар. 230 Вар. 270 Вар. 310 Вар. 350 Вар. 390 Вар. 430
2-6 мкг/л Вар. 31 Вар. 71 Вар. 111 Вар. 151 Вар. 191 Вар. 231 Вар. 271 Вар. 311 Вар. 351 Вар. 391 Вар. 431
3-6 мкг/л Вар. 32 Вар. 72 Вар. 112 Вар. 152 Вар. 192 Вар. 232 Вар. 272 Вар. 312 Вар. 352 Вар. 392 Вар. 432
4-6 мкг/л Вар. 33 Вар. 73 Вар. 113 Вар. 153 Вар. 193 Вар. 233 Вар. 273 Вар. 313 Вар. 353 Вар. 393 Вар. 433
1-5 мкг/л Вар. 34 Вар. 74 Вар. 114 Вар. 154 Вар. 194 Вар. 234 Вар. 274 Вар. 314 Вар. 354 Вар. 394 Вар. 434
2-5 мкг/л Вар. 35 Вар. 75 Вар. 115 Вар. 155 Вар. 195 Вар. 235 Вар. 275 Вар. 315 Вар. 355 Вар. 395 Вар. 435
3-5 мкг/л Вар. 36 Вар. 76 Вар. 116 Вар. 156 Вар. 196 Вар. 236 Вар. 276 Вар. 316 Вар. 356 Вар. 396 Вар. 436
4-5 мкг/л Вар. 37 Вар. 77 Вар. 117 Вар. 157 Вар. 197 Вар. 237 Вар. 277 Вар. 317 Вар. 357 Вар. 397 Вар. 437
1-4 мкг/л Вар. 38 Вар. 78 Вар. 118 Вар. 158 Вар. 198 Вар. 238 Вар. 278 Вар. 318 Вар. 358 Вар. 398 Вар. 438
2-4 мкг/л Вар. 39 Вар. 79 Вар. 119 Вар. 159 Вар. 199 Вар. 239 Вар. 279 Вар. 319 Вар. 359 Вар. 399 Вар. 439
3-4 мкг/л Вар. 40 Вар. 80 Вар. 120 Вар. 160 Вар. 200 Вар. 240 Вар. 280 Вар. 320 Вар. 360 Вар. 400 Вар. 440
*Н.О. = не определено, *НБЧ = не более чем, *ПММ = по меньшей мере.
Согласно некоторым вариантам реализации добавление в среды меди согласно настоящему изобретению производится путем дополнения основных сред, не содержащих животных белков и/или сред с заданным химическим составом. Способы получения не содержащих животных белков и культуральных сред с заданным химическим составом известны в данной области техники, например в патентах США
- 16 029503
№ 6171825 и № 6936441, ΥΟ 2007/077217 и в опубликованных заявках на патент США №№ 2008/0009040 и 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Согласно одному из вариантов реализации основная культуральная среда, применяемая в способах, описанных в настоящей заявке, представляет собой не содержащую животных белков или не содержащую олигопептидов среду. Согласно определенным вариантам реализации указанная культуральная среда может быть средой с заданным химическим составом. Согласно определенным вариантам реализации указанные культуральные среды могут содержать по меньшей мере один полиамин в концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 мг/л.
Согласно дальнейшим вариантам реализации и в дополнение к любым описанным выше согласно настоящему изобретению предложены культуральные среды, для получения которых в основную среду добавляют медь и по меньшей мере что-либо одно из кальция, цинка и/или витамина В3. Согласно определенным вариантам реализации указанная среда может не содержать животных белков, не содержать олигопептидов или представлять собой среду с заданным химическим составом. Согласно определенным вариантам реализации указанную не содержащую животных белков или не содержащую олигопептидов среду получают согласно описанию в патентах США № 6171825 и № 6936441, ΥΟ 2007/077217 и опубликованных заявках на патент США №№ 2008/0009040 и 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей; оба источника включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей; и добавлением дополнительной меди и необязательно одного или более из кальция, цинка и витамина В3. Согласно конкретному варианту реализации культуральная среда с заданным химическим составом может быть сходной со смесью (1:1) модифицированной по Дульбекко среды Игла и среды Хэма Ρ12 ЩМЕМ/Хэма Ρ12), куда добавлена дополнительная медь и необязательно кальций, цинк и/или витамин В3 для увеличения удельной активности ΓνΥΡ или γΑ13, экспрессируемых в клетках, культивируемых в указанной среде. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда не содержит животных компонентов. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда содержит белок, например животный белок из сыворотки, такой как эмбриональная телячья сыворотка. Согласно другому варианту реализации указанная культура содержит добавленные экзогенные рекомбинантные белки. Согласно другому варианту реализации указанные белки получены от сертифицированного свободного от патогенов животного.
Согласно определенным вариантам реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации точно или приблизительно от 0,5 до 10 мг/л. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. Согласно определенным вариантам реализации указанный полиамин принадлежит группе из орнитина, путресцина, спермина или спермидина или т.п. Согласно предпочтительному варианту реализации полиамин представляет собой путресцин. Согласно конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л путресцина.
Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л, и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 10 мг/л, и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л, и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно определенным вариантам реализации указанный полиамин входит в группу из орнитина, путресцина, спермина или спермидина или т.п. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный полиамин представляет собой путресцин. Согласно конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л путресцина и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1.
Согласно дальнейшим аспектам помимо меди применяемые согласно настоящему изобретению среды для клеточных культур также могут содержат что-либо одно или более из дополнительного кальция, цинка, одного или более витамина и любых их комбинаций.
Как правило, для добавления в среды согласно настоящему изобретению может применяться любая соль кальция; неограничивающие примеры приемлемых солей включают СаС12, СаС12, СаГРОз^ЩО, Сак СаВг2, (С2Н3О2)2Са, (СНО2)2Са, (С6Н7О6)2Са, (С6Н5О7)2Са3-2Н2О и т.п. Согласно определенным вариантам реализации для добавления в культуральные среды согласно настоящему изобретению применяют фармацевтически приемлемую соль кальция.
- 17 029503
Как правило, для добавления в среды согласно настоящему изобретению может применяться любая соль цинка; неограничивающие примеры приемлемых солей включают ΖηδΟ.·|·7Η2Θ. Ζη§Ο3·2Η2Ο, (Ο6Η5Θ7)2Ζη3·2Η2Θ, ΖηΒτ2, ΖηΒτ2·2Η2Ο, ΖηΟ12, Ζη(ΝΟ3)2·6Η2Ο, Ζη(Η2ΡΟ4)2·Η2Ο, (Ο2Η3Θ2)2Ζη·2Η2Θ и т.п. Согласно определенным вариантам реализации для добавления в культуральные среды согласно настоящему изобретению применяют фармацевтически приемлемую соль цинка. Согласно другим вариантам реализации цинксодержащий пептидный или белковый препарат, например, инсулин, может применяться для добавления в описываемую в настоящей заявке культуру.
Согласно дальнейшим аспектам основные клеточные среды с добавлением меди и одного или более из описанных выше дополнительных веществ можно также применять в культурах с низкими уровнями аммония в супернатанте. Согласно определенным вариантам реализации дополненные среды для клеточных культур для применения согласно настоящему изобретения дают уровни аммония в растворе культуры клеток менее 10 мМ. Согласно дальнейшим вариантам реализации дополненную среду для клеточных культур согласно настоящему изобретению применяют при уровнях аммония в культуре клеток, составляющих приблизительно 0,5-9,5; 1,0-9,0; 1,5-8,5; 2,0-8,0; 2,5-7,5; 3,0-7,0; 3,5-6,5; 4,0-6,0; 4,5-5,5 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации указанные концентрации меди и аммония в среде для клеточных культур и супернатанте культуры клеток поддерживают на протяжении длительного периода времени в течение процесса производства. Согласно конкретному варианту реализации указанные концентрации меди и аммония в культуре клеток поддерживают на протяжении процесса производства, т.е. в течение времени, пока гУ\УР или гА13 экспрессируют и выделяют из крупномасштабной культуры клеток. Согласно определенным вариантам реализации указанные концентрации меди и аммония поддерживают в культуральном растворе на уровне согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные концентрации меди и аммония поддерживают в течение всего периода такого производственного процесса.
Согласно некоторым вариантам реализации культуральная среда, предложенная согласно настоящему изобретению, может быть представлена жидкой, сухой или порошковой формой. Указанная среда может быть предварительно разделена на аликвоты, содержащие количества, подходящие для однократного применения, либо большие количества, подходящие для более чем одной клеточной культуры. Как правило, среда согласно настоящему изобретению представлена в стерильном виде.
Ниже обсуждаются характерные особенности сред для клеточных культур, подходящих для получения гУ\УР или гА13. Несмотря на то, что они описаны применительно либо к гУХУР, либо к КА.13, необходимо понимать, что любые приведенные ниже описания, относящиеся к гУХУР, подходят и для КА13, и наоборот.
А. Среды для клеточных культур для получения рекомбинантного У\УР.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к раствору культуры клеток для получения рекомбинантных уХУР, более конкретно высокомолекулярных уХУР, обладающих высокой удельной активностью, которые описаны ниже в настоящей заявке. Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение предлагает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного уХУР, содержащий среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерные уХУР, содержащие от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающие удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации указанная культура клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другим вариантам реализации указанная культура клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно другим вариантам реализации указанная культура клеток содержит концентрацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно определенным вариантам реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают в течение длительного периода на уровне концентрации согласно описанию выше. Например, согласно одному из вариантов реализации концентрацию аммония поддерживают на низком уровне в течение по меньшей мере 3 дней или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении ко- 18 029503
торого указанная культура используется для получения гУ\УР).
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения среды для клеточных культур могут содержать медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, согласно другому варианту реализации по меньшей мере приблизительно 3 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации по меньшей мере приблизительно 8 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации по меньшей мере приблизительно 10 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации по меньшей мере приблизительно 15 мкг/л и согласно дальнейшему варианту реализации по меньшей мере приблизительно 20 мкг/л.
Согласно другим вариантам реализации концентрация меди в среде для клеточных культур согласно настоящему изобретению может варьировать от приблизительно 2,4 до приблизительно 20 мкг/л, согласно другому варианту реализации от приблизительно 2,4 до приблизительно 15 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации от приблизительно 2,4 до приблизительно 10 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации от приблизительно 2,4 до приблизительно 8 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации от приблизительно 2,4 до приблизительно 6 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации от приблизительно 2,4 до приблизительно 4 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации от приблизительно 4 до приблизительно 20 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации от приблизительно 4 до приблизительно 15 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации от приблизительно 4 до приблизительно 10 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации от приблизительно 4 до приблизительно 8 мкг/л и согласно дальнейшему варианту реализации от приблизительно 4 до приблизительно 6 мкг г/л.
Согласно настоящему изобретению также предложены наборы для экспрессии или получения гУ^Р; указанные наборы содержат культуральную среду, подходящую для экспрессии гУ\УР, обладающего высокой удельной активностью.
В. Среды для клеточных культур для получения ΛΌΛΜΤδ13 (А13).
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение предлагает культуральные среды, подходящие для экспрессии белков ΛΌΛΜΤδ, обладающих высокой удельной активностью. Удачным образом, было обнаружено, что добавление в культуральную среду меди значительно повышает активность рекомбинантных ферментов ΛΌΛΜΤδ (например, ΓΛΌΛΜΤδ13), экспрессируемых в клетках, культивируемых в указанной дополненной среде, в то время как указанные ферменты экспрессируются на уровнях, равных или превышающих таковые для клеток, культивируемых в среде без добавок.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение предлагает среды для клеточных культур с добавлением меди для экспрессии рекомбинантного белка ΛΌΛΜΤδ13 с высокой удельной активностью. Согласно одному из вариантов реализации указанные среды дополняют до получения общей концентрации меди, составляющей от приблизительно 2 до приблизительно 4 мкг/л. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанные среды дополняют до получения общей концентрации меди приблизительно 13, 2-3, 3-4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации указанные среды содержат медь в концентрации по меньшей мере 1 мкг/л. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит от 2 до 20 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит от 1 до 6 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит от 2 до 5 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит от 3 до 4 мкг/л меди. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди или по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 мкг/л либо более высокие концентрации меди.
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит концентрацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно определенным вариантам реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают в течение длительного периода на уровне концентрации согласно приведенному выше описанию. Например, согласно одному из вариантов реализации концентрацию аммония поддерживают на низком уровне в течение по меньшей мере 3 дней или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура ис- 19 029503
пользуется для получения гА13).
Согласно одному из вариантов реализации получают культуральную среду для экспрессии рекомбинантного белка ΑΌΑΜΤ8 (например, гАОАМТ813), содержащую по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мкМ цинка. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере точно или приблизительно 5 мкМ цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда также может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2 мкМ или по меньшей мере точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или более цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2.
Таблица 2
Типовые варианты реализации концентраций меди и цинка в культуральных средах, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка ΑΌΑΜΤ813
VI. Концентрация ι хинка
пмм 2 мкМ ПММ 3 мкМ ПММ 4 мкМ ПММ 5 мкМ ПММ 6 мкМ ПММ 7 мкМ пмм 8 мкМ ПММ 9 мкМ ПММ 10 мкМ 2-12 мкМ 5-12 мкМ
8 пмм Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
1 мкг/л 441 481 521 561 601 641 681 721 761 801 841
2 П ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
8 Я 2 мкг/л 442 482 522 562 602 642 682 722 762 802 842
св О. ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
8 п X 3 мкг/л 443 483 523 563 603 643 683 723 763 803 843
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
О ЬЙ 4 мкг/л 444 484 524 564 604 644 684 724 764 804 844
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
5 мкг/л 445 485 525 565 605 645 685 725 765 805 845
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
6 мкг/л 446 486 526 566 606 646 686 726 766 806 846
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
7 мкг/л 447 487 527 567 607 647 687 727 767 807 847
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
8 мкг/л 448 488 528 568 608 648 688 728 768 808 848
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
9 мкг/л 449 489 529 569 609 649 689 729 769 809 849
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
10 мкг/л 450 490 530 570 610 650 690 730 770 810 850
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
1 мкг/л 451 491 531 571 611 651 691 731 771 811 851
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
1.5 мкг/л 452 492 532 572 612 652 692 732 772 812 852
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
- 20 029503
2 мкг/л 453 493 533 573 613 653 693 733 773 813 853
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
2.5 мкг/л 454 494 534 574 614 654 694 734 774 814 854
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
3 мкг/л 455 495 535 575 615 655 695 735 775 815 855
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
3,5 мкг/л 456 496 536 576 616 656 696 736 776 816 856
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
4 мкг/л 457 497 537 577 617 657 697 737 777 817 857
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
4.5 мкг/л 458 498 538 578 618 658 698 738 778 818 858
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
5 мкг/л 459 499 539 579 619 659 699 739 779 819 859
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
5.5 мкг/л 460 500 540 580 620 660 700 740 780 820 860
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
6 мкг/л 461 501 541 581 621 661 701 741 781 821 861
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
7 мкг/л 462 502 542 582 622 662 702 742 782 822 862
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
8 мкг/л 463 503 543 583 623 663 703 743 783 823 863
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
9 мкг/л 464 504 544 584 624 664 704 744 784 824 864
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
10 мкг/л 465 505 545 585 625 665 705 745 785 825 865
1-20 мкг/л Вар. 466 Вар. 506 Вар. 546 Вар. 586 Вар. 626 Вар. 666 Вар. 706 Вар. 746 Вар. 786 Вар. 826 Вар. 866
2-20 мкг/л Вар. 467 Вар. 507 Вар. 547 Вар. 587 Вар. 627 Вар. 667 Вар. 707 Вар. 747 Вар. 787 Вар. 827 Вар. 867
1-10 мкг/л Вар. 468 Вар. 508 Вар. 548 Вар. 588 Вар. 628 Вар. 668 Вар. 708 Вар. 748 Вар. 788 Вар. 828 Вар. 868
2-10 мкг/л Вар. 469 Вар. 509 Вар. 549 Вар. 589 Вар. 629 Вар. 669 Вар. 709 Вар. 749 Вар. 789 Вар. 829 Вар. 869
1-6 мкг/л Вар. 470 Вар. 510 Вар. 550 Вар. 590 Вар. 630 Вар. 670 Вар. 710 Вар. 750 Вар. 790 Вар. 830 Вар. 870
2-6 мкг/л Вар. 471 Вар. 511 Вар. 551 Вар. 591 Вар. 631 Вар. 671 Вар. 711 Вар. 751 Вар. 791 Вар. 831 Вар. 871
3-6 мкг/л Вар. 472 Вар. 512 Вар. 552 Вар. 592 Вар. 632 Вар. 672 Вар. 712 Вар. 752 Вар. 792 Вар. 832 Вар. 872
4-6 мкг/л Вар. 473 Вар. 513 Вар. 553 Вар. 593 Вар. 633 Вар. 673 Вар. 713 Вар. 753 Вар. 793 Вар. 833 Вар. 873
1-5 мкг/л Вар. 474 Вар. 514 Вар. 554 Вар. 594 Вар. 634 Вар. 674 Вар. 714 Вар. 754 Вар. 794 Вар. 834 Вар. 874
2-5 мкг/л Вар. 475 Вар. 515 Вар. 555 Вар. 595 Вар. 635 Вар. 675 Вар. 715 Вар. 755 Вар. 795 Вар. 835 Вар. 875
3-5 мкг/л Вар. 476 Вар. 516 Вар. 556 Вар. 596 Вар. 636 Вар. 676 Вар. 716 Вар. 756 Вар. 796 Вар. 836 Вар. 876
4-5 мкг/л Вар. 477 Вар. 517 Вар. 557 Вар. 597 Вар. 637 Вар. 677 Вар. 717 Вар. 757 Вар. 797 Вар. 837 Вар. 877
1-4 мкг/л Вар. 478 Вар. 518 Вар. 558 Вар. 598 Вар. 638 Вар. 678 Вар. 718 Вар. 758 Вар. 798 Вар. 838 Вар. 878
2-4 мкг/л Вар. 479 Вар. 519 Вар. 559 Вар. 599 Вар. 639 Вар. 679 Вар. 719 Вар. 759 Вар. 799 Вар. 839 Вар. 879
3-4 мкг/л Вар. 480 Вар. 520 Вар. 560 Вар. 600 Вар. 640 Вар. 680 Вар. 720 Вар. 760 Вар. 800 Вар. 840 Вар. 880
*ПММ = по меньшей мере
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит низкую концентрацию аммония. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 6 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 6 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний
- 21 029503
в концентрации не выше 4 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно еще одному конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения гА13).
Согласно одному из вариантов реализации получают культуральную среду для экспрессии рекомбинантного белка ΆΟΆΜΤ8 (например, гАОЛМТ813), содержащую по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 1,5 мМ кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 0,5 мМ или по меньшей мере точно или приблизительно 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,25; 2,5; 2,75; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 мМ или более, кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и кальция в концентрации согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3.
Таблица 3
Типовые варианты реализации концентраций меди и кальция в культуральных средах, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка АОАМТ813
λ VIII. Концентрация кальция
пмм 0,5 мМ ПММ 0,75 мМ ПММ 1,0 мМ ПММ 1,25 мМ пмм 1,5 мМ ПММ 2,0 мМ ПММ 2,5 мМ пмм 3,0 мМ ПММ 4 мМ ПММ 5 мМ 0,51,5 мМ
Концентрация меди пмм 1 мкг/л Вар. 881 Вар. 921 Вар. 961 Вар. 1001 Вар. 1041 Вар. 1081 Вар. 1121 Вар. 1161 Вар. 1201 Вар. 1241 Вар. 1281
ПММ 2 мкг/л Вар. 882 Вар. 922 Вар. 962 Вар. 1002 Вар. 1042 Вар. 1082 Вар. 1122 Вар. 1162 Вар. 1202 Вар. 1242 Вар. 1282
ПММ 3 мкг/л Вар. 883 Вар. 923 Вар. 963 Вар. 1003 Вар. 1043 Вар. 1083 Вар. 1123 Вар. 1163 Вар. 1203 Вар. 1243 Вар. 1283
ПММ 4 мкг/л Вар. 884 Вар. 924 Вар. 964 Вар. 1004 Вар. 1044 Вар. 1084 Вар. 1124 Вар. 1164 Вар. 1204 Вар. 1244 Вар. 1284
ПММ 5 мкг/л Вар. 885 Вар. 925 Вар. 965 Вар. 1005 Вар. 1045 Вар. 1085 Вар. 1125 Вар. 1165 Вар. 1205 Вар. 1245 Вар. 1285
ПММ 6 мкг/л Вар. 886 Вар. 926 Вар. 966 Вар. 1006 Вар. 1046 Вар. 1086 Вар. 1126 Вар. 1166 Вар. 1206 Вар. 1246 Вар. 1286
ПММ 7 мкг/л Вар. 887 Вар. 927 Вар. 967 Вар. 1007 Вар. 1047 Вар. 1087 Вар. 1127 Вар. 1167 Вар. 1207 Вар. 1247 Вар. 1287
ПММ 8 мкг/л Вар. 888 Вар. 928 Вар. 968 Вар. 1008 Вар. 1048 Вар. 1088 Вар. 1128 Вар. 1168 Вар. 1208 Вар. 1248 Вар. 1288
ПММ 9 мкг/л Вар. 889 Вар. 929 Вар. 969 Вар. 1009 Вар. 1049 Вар. 1089 Вар. 1129 Вар. 1169 Вар. 1209 Вар. 1249 Вар. 1289
ПММ 10 мкг/л Вар. 890 Вар. 930 Вар. 970 Вар. 1010 Вар. 1050 Вар. 1090 Вар. ИЗО Вар. 1170 Вар. 1210 Вар. 1250 Вар. 1290
Приблизительно 1 мкг/л Вар. 891 Вар. 931 Вар. 971 Вар. 1011 Вар. 1051 Вар. 1091 Вар. 1131 Вар. 1171 Вар. 1211 Вар. 1251 Вар. 1291
Приблизительно 1,5 мкг/л Вар. 892 Вар. 932 Вар. 972 Вар. 1012 Вар. 1052 Вар. 1092 Вар. 1132 Вар. 1172 Вар. 1212 Вар. 1252 Вар. 1292
Приблизительно 2 мкг/л Вар. 893 Вар. 933 Вар. 973 Вар. 1013 Вар. 1053 Вар. 1093 Вар. 1133 Вар. 1173 Вар. 1213 Вар. 1253 Вар. 1293
- 22 029503
Приблизительно 2,5 мкг/л Вар. 894 Вар. 934 Вар. 974 Вар. 1014 Вар. 1054 Вар. 1094 Вар. 1134 Вар. 1174 Вар. 1214 Вар. 1254 Вар. 1294
Приблизительно 3 мкг/л Вар. 895 Вар. 935 Вар. 975 Вар. 1015 Вар. 1055 Вар. 1095 Вар. 1135 Вар. 1175 Вар. 1215 Вар. 1255 Вар. 1295
Приблизите льно 3,5 мкг/л Вар. 896 Вар. 936 Вар. 976 Вар. 1016 Вар. 1056 Вар. 1096 Вар. 1136 Вар. 1176 Вар. 1216 Вар. 1256 Вар. 1296
Приблизительно 4 мкг/л Вар. 897 Вар. 937 Вар. 977 Вар. 1017 Вар. 1057 Вар. 1097 Вар. 1137 Вар. 1177 Вар. 1217 Вар. 1257 Вар. 1297
Приблизительно 4,5 мкг/л Вар. 898 Вар. 938 Вар. 978 Вар. 1018 Вар. 1058 Вар. 1098 Вар. 1138 Вар. 1178 Вар. 1218 Вар. 1258 Вар. 1298
Приблизительно 5 мкг/л Вар. 899 Вар. 939 Вар. 979 Вар. 1019 Вар. 1059 Вар. 1099 Вар. 1139 Вар. 1179 Вар. 1219 Вар. 1259 Вар. 1299
Приблизительно 5,5 мкг/л Вар. 900 Вар. 940 Вар. 980 Вар. 1020 Вар. 1060 Вар. 1100 Вар. 1140 Вар. 1180 Вар. 1220 Вар. 1260 Вар. 1300
Приблизительно 6 мкг/л Вар. 901 Вар. 941 Вар. 981 Вар. 1021 Вар. 1061 Вар. 1101 Вар. 1141 Вар. 1181 Вар. 1221 Вар. 1261 Вар. 1301
Приблизительно 7 мкг/л Вар. 902 Вар. 942 Вар. 982 Вар. 1022 Вар. 1062 Вар. 1102 Вар. 1142 Вар. 1182 Вар. 1222 Вар. 1262 Вар. 1302
Приблизительно 8 мкг/л Вар. 903 Вар. 943 Вар. 983 Вар. 1023 Вар. 1063 Вар. 1103 Вар. 1143 Вар. 1183 Вар. 1223 Вар. 1263 Вар. 1303
Приблизительно 9 мкг/л Вар. 904 Вар. 944 Вар. 984 Вар. 1024 Вар. 1064 Вар. 1104 Вар. 1144 Вар. 1184 Вар. 1224 Вар. 1264 Вар. 1304
Приблизительно 10 мкг/л Вар. 905 Вар. 945 Вар. 985 Вар. 1025 Вар. 1065 Вар. 1105 Вар. 1145 Вар. 1185 Вар. 1225 Вар. 1265 Вар. 1305
1-20 мкг/л Вар. 906 Вар. 946 Вар. 986 Вар. 1026 Вар. 1066 Вар. 1106 Вар. 1146 Вар. 1186 Вар. 1226 Вар. 1266 Вар. 1306
2-20 мкг/л Вар. 907 Вар. 947 Вар. 987 Вар. 1027 Вар. 1067 Вар. 1107 Вар. 1147 Вар. 1187 Вар. 1227 Вар. 1267 Вар. 1307
1-10 мкг/л Вар. 908 Вар. 948 Вар. 988 Вар. 1028 Вар. 1068 Вар. 1108 Вар. 1148 Вар. 1188 Вар. 1228 Вар. 1268 Вар. 1308
2-10 мкг/л Вар. 909 Вар. 949 Вар. 989 Вар. 1029 Вар. 1069 Вар. 1109 Вар. 1149 Вар. 1189 Вар. 1229 Вар. 1269 Вар. 1309
1-6 мкг/л Вар. 910 Вар. 950 Вар. 990 Вар. 1030 Вар. 1070 Вар. 1110 Вар. 1150 Вар. 1190 Вар. 1230 Вар. 1270 Вар. 1310
2-6 мкг/л Вар. 911 Вар. 951 Вар. 991 Вар. 1031 Вар. 1071 Вар. 1111 Вар. 1151 Вар. 1191 Вар. 1231 Вар. 1271 Вар. 1311
3-6 мкг/л Вар. 912 Вар. 952 Вар. 992 Вар. 1032 Вар. 1072 Вар. 1112 Вар. 1152 Вар. 1192 Вар. 1232 Вар. 1272 Вар. 1312
4-6 мкг/л Вар. 913 Вар. 953 Вар. 993 Вар. 1033 Вар. 1073 Вар. 1113 Вар. 1153 Вар. 1193 Вар. 1233 Вар. 1273 Вар. 1313
1-5 мкг/л Вар. 914 Вар. 954 Вар. 994 Вар. 1034 Вар. 1074 Вар. 1114 Вар. 1154 Вар. 1194 Вар. 1234 Вар. 1274 Вар. 1314
2-5 мкг/л Вар. 915 Вар. 955 Вар. 995 Вар. 1035 Вар. 1075 Вар. 1115 Вар. 1155 Вар. 1195 Вар. 1235 Вар. 1275 Вар. 1315
3-5 мкг/л Вар. 916 Вар. 956 Вар. 996 Вар. 1036 Вар. 1076 Вар. 1116 Вар. 1156 Вар. 1196 Вар. 1236 Вар. 1276 Вар. 1316
4-5 мкг/л Вар. 917 Вар. 957 Вар. 997 Вар. 1037 Вар. 1077 Вар. 1117 Вар. 1157 Вар. 1197 Вар. 1237 Вар. 1277 Вар. 1317
1-4 мкг/л Вар. 918 Вар. 958 Вар. 998 Вар. 1038 Вар. 1078 Вар. 1118 Вар. 1158 Вар. 1198 Вар. 1238 Вар. 1278 Вар. 1318
2-4 мкг/л Вар. 919 Вар. 959 Вар. 999 Вар. 1039 Вар. 1079 Вар. 1119 Вар. 1159 Вар. 1199 Вар. 1239 Вар. 1279 Вар. 1319
3-4 мкг/л Вар. 920 Вар. 960 Вар. 1000 Вар. 1040 Вар. 1080 Вар. 1120 Вар. 1160 Вар. 1200 Вар. 1240 Вар. 1280 Вар. 1320
*ПММ = по меньшей мере
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит низкую концентрацию аммония. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне, не превышающем 10 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 6 мМ и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 6 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 4 мМ в тече- 23 029503
ние по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно еще одному конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения гА13).
Согласно одному из вариантов реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь, цинк и кальций. Согласно конкретному варианту реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 1,5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит кальций в концентрации от 0,5 и 1,5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,25; 2,5; 2,75; 3,0 мМ; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 мМ или более и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2.
Согласно одному из вариантов реализации получают культуральную среду для экспрессии рекомбинантного белка ΑΌΑΜΤδ (например, τΑΌΑΜΤδ13), содержащую по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамин В3). Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 7 мг/л никотинамида (витамина В3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина В3). Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4.
- 24 029503
Таблица 4
Типовые варианты реализации концентраций меди и никотинамида в культуральных средах,
подходящих для экспрессии рекомбинантного белка АРАМТ813
X. Концентрация кальция
пмм ПММ ПММ ПММ ПММ ПММ ПММ ПММ ПММ ПММ 2-10
2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 мг/мл
мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл
5 пмм 1 мкг/л Вар. 1321 Вар. 1361 Вар. 1401 Вар. 1441 Вар. 1481 Вар. 1521 Вар. 1561 Вар. 1601 Вар. 1641 Вар. 1681 Вар. 1721
Я 5 ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
Я" Л 2 мкг/л 1322 1362 1402 1442 1482 1522 1562 1602 1642 1682 1722
О. н ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
Я" 3 мкг/л 1323 1363 1403 1443 1483 1523 1563 1603 1643 1683 1723
я о ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
4 мкг/л 1324 1364 1404 1444 1484 1524 1564 1604 1644 1684 1724
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
5 мкг/л 1325 1365 1405 1445 1485 1525 1565 1605 1645 1685 1725
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
6 мкг/л 1326 1366 1406 1446 1486 1526 1566 1606 1646 1686 1726
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
7 мкг/л 1327 1367 1407 1447 1487 1527 1567 1607 1647 1687 1727
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
8 мкг/л 1328 1368 1408 1448 1488 1528 1568 1608 1648 1688 1728
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
9 мкг/л 1329 1369 1409 1449 1489 1529 1569 1609 1649 1689 1729
ПММ Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
10 мкг/л 1330 1370 1410 1450 1490 1530 1570 1610 1650 1690 1730
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
1 мкг/л 1331 1371 1411 1451 1491 1531 1571 1611 1651 1691 1731
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
1,5 мкг/л 1332 1372 1412 1452 1492 1532 1572 1612 1652 1692 1732
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
2 мкг/л 1333 1373 1413 1453 1493 1533 1573 1613 1653 1693 1733
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
2,5 мкг/л 1334 1374 1414 1454 1494 1534 1574 1614 1654 1694 1734
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
3 мкг/л 1335 1375 1415 1455 1495 1535 1575 1615 1655 1695 1735
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
3,5 мкг/л 1336 1376 1416 1456 1496 1536 1576 1616 1656 1696 1736
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
4 мкг/л 1337 1377 1417 1457 1497 1537 1577 1617 1657 1697 1737
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
4,5 мкг/л 1338 1378 1418 1458 1498 1538 1578 1618 1658 1698 1738
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
5 мкг/л 1339 1379 1419 1459 1499 1539 1579 1619 1659 1699 1739
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
5,5 мкг/л 1340 1380 1420 1460 1500 1540 1580 1620 1660 1700 1740
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
6 мкг/л 1341 1381 1421 1461 1501 1541 1581 1621 1661 1701 1741
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
7 мкг/л 1342 1382 1422 1462 1502 1542 1582 1622 1662 1702 1742
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
8 мкг/л 1343 1383 1423 1463 1503 1543 1583 1623 1663 1703 1743
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
9 мкг/л 1344 1384 1424 1464 1504 1544 1584 1624 1664 1704 1744
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар.
10 мкг/л 1345 1385 1425 1465 1505 1545 1585 1625 1665 1705 1745
1-20 мкг/л Вар. 1346 Вар. 1386 Вар. 1426 Вар. 1466 Вар. 1506 Вар. 1546 Вар. 1586 Вар. 1626 Вар. 1666 Вар. 1706 Вар. 1746
2-20 мкг/л Вар. 1347 Вар. 1387 Вар. 1427 Вар. 1467 Вар. 1507 Вар. 1547 Вар. 1587 Вар. 1627 Вар. 1667 Вар. 1707 Вар. 1747
- 25 029503
1-10 мкг/л Вар. 1348 Вар. 1388 Вар. 1428 Вар. 1468 Вар. 1508 Вар. 1548 Вар. 1588 Вар. 1628 Вар. 1668 Вар. 1708 Вар. 1748
2-10 мкг/л Вар. 1349 Вар. 1389 Вар. 1429 Вар. 1469 Вар. 1509 Вар. 1549 Вар. 1589 Вар. 1629 Вар. 1669 Вар. 1709 Вар. 1749
1-6 мкг/л Вар. 1350 Вар. 1390 Вар. 1430 Вар. 1470 Вар. 1510 Вар. 1550 Вар. 1590 Вар. 1630 Вар. 1670 Вар. 1710 Вар. 1750
2-6 мкг/л Вар. 1351 Вар. 1391 Вар. 1431 Вар. 1471 Вар. 1511 Вар. 1551 Вар. 1591 Вар. 1631 Вар. 1671 Вар. 1711 Вар. 1751
3-6 мкг/л Вар. 1352 Вар. 1392 Вар. 1432 Вар. 1472 Вар. 1512 Вар. 1552 Вар. 1592 Вар. 1632 Вар. 1672 Вар. 1712 Вар. 1752
4-6 мкг/л Вар. 1353 Вар. 1393 Вар. 1433 Вар. 1473 Вар. 1513 Вар. 1553 Вар. 1593 Вар. 1633 Вар. 1673 Вар. 1713 Вар. 1753
1-5 мкг/л Вар. 1354 Вар. 1394 Вар. 1434 Вар. 1474 Вар. 1514 Вар. 1554 Вар. 1594 Вар. 1634 Вар. 1674 Вар. 1714 Вар. 1754
2-5 мкг/л Вар. 1355 Вар. 1395 Вар. 1435 Вар. 1475 Вар. 1515 Вар. 1555 Вар. 1595 Вар. 1635 Вар. 1675 Вар. 1715 Вар. 1755
3-5 мкг/л Вар. 1356 Вар. 1396 Вар. 1436 Вар. 1476 Вар. 1516 Вар. 1556 Вар. 1596 Вар. 1636 Вар. 1676 Вар. 1716 Вар. 1756
4-5 мкг/л Вар. 1357 Вар. 1397 Вар. 1437 Вар. 1477 Вар. 1517 Вар. 1557 Вар. 1597 Вар. 1637 Вар. 1677 Вар. 1717 Вар. 1757
1-4 мкг/л Вар. 1358 Вар. 1398 Вар. 1438 Вар. 1478 Вар. 1518 Вар. 1558 Вар. 1598 Вар. 1638 Вар. 1678 Вар. 1718 Вар. 1758
2-4 мкг/л Вар. 1359 Вар. 1399 Вар. 1439 Вар. 1479 Вар. 1519 Вар. 1559 Вар. 1599 Вар. 1639 Вар. 1679 Вар. 1719 Вар. 1759
3-4 мкг/л Вар. 1360 Вар. 1400 Вар. 1440 Вар. 1480 Вар. 1520 Вар. 1560 Вар. 1600 Вар. 1640 Вар. 1680 Вар. 1720 Вар. 1760
*ПММ = по меньшей мере
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит низкую концентрацию аммония. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 6 мМ и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 6 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4. Согласно еще одному конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения γΑ13).
Согласно одному из вариантов реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь, цинк и никотинамид. Согласно конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441- 880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 и 10 мг/мл и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 мг/мл или более и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2.
Согласно одному из вариантов реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь, кальций и никотинамид. Согласно конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл и медь и кальций в
- 26 029503
концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 до 10 мг/мл и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 мг/мл или более и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3.
Способы получения факторов крови с высокой удельной активностью.
А. Способы культивирования клеток.
Настоящее изобретение обеспечивает способы крупномасштабного производства рекомбинантных белков (таких как гУ\УЕ и гА13). Согласно определенным вариантам реализации в таких способах крупномасштабного производства применяют реакторы с мешалкой/перемешиванием для получения указанных терапевтических рекомбинантных белков.
Согласно определенным вариантам реализации способы согласно настоящему изобретению могут включать применение систем культивирования клеток в периодическом или непрерывном режиме. Например, в случае использования периодических культур клеток к ним может применяться режим однократного периодического культивирования, подпитываемого культивирования или повторного периодического культивирования. Сходным образом, к непрерывным культурам клеток может применяться, например, перфузионный, турбидостатический или хемостатический режим. Периодическое и непрерывное культивирование клеток может проводиться в условиях суспензионной или адгезионной культуры. В условиях суспензионного культивирования клетки свободно суспендированы и распределены в культуральной среде. Альтернативно, в условиях адгезионного культивирования клетки связаны с твердой фазой, например, микроносителем, пористым микроносителем, дисковым носителем, керамическим картриджем, полым волокном, плоской пластиной, гель-матрицей и т.п.
Периодическая культура представляет собой, как правило, крупномасштабную культуру клеток, в которой клеточный инокулят культивируют до максимальной плотности в реакторе или ферментере и собирают и обрабатывают, как при однократном периодическом культивировании. Подпитываемая культура представляет собой, как правило, периодическую культуру, получающую либо свежие питательные вещества (например, ограничивающие рост субстраты), либо добавки (например, предшественники продуктов). Питательный раствор, как правило, является высококонцентрированным, чтобы избежать разбавления в биореакторе. В повторно-периодической культуре клетки помещают в культуральную среду и выращивают до требуемой плотности клеток. Затем, чтобы избежать наступления фазы спада и гибели клеток, культуру разбавляют полной ростовой средой до того, как клетки достигают максимальной концентрации. Количество и частота разведений широко варьирует и зависит от характеристик роста клеточной линии и удобства процесса культивирования. Указанный процесс может повторяться столько раз, сколько потребуется и, если клетки и среда не отбрасываются при пересеве, объем культуры будет увеличиваться ступенчато, по мере каждого следующего разведения. Вопрос увеличивающегося объема может быть решен использованием реактора, имеющего достаточный размер для разбавлений внутри указанного сосуда, либо распределением разбавленной культуры по нескольким сосудам. Принцип указанного типа культивирования состоит в поддержании клеток в экспоненциальной фазе роста. Серийно пересеваемая культура характеризуется тем, что объем указанной культуры всегда постепенно возрастает, может быть несколько сборов, клетки продолжают расти и указанный процесс может продолжаться так долго, как это необходимо. Согласно определенным вариантам реализации рекомбинантный белок АЭАМТ8 (например, гАЭАМТ813) может быть выделен после сбора супернатанта периодической культуры. Согласно другим вариантам реализации рекомбинантный У\УЕ может быть выделен после сбора супернатанта периодической культуры.
Непрерывная культура может представлять собой суспензионную культуру, непрерывно получающую питательные вещества за счет притока свежей среды, где, как правило, поддерживается постоянный объем культуры за счет сопутствующего удаления отработанной среды. Согласно хемостатическому и турбидостатическому методам извлеченная среда содержит клетки. Таким образом, клетки, остающиеся в сосуде для культивирования клеток, должны расти для поддержания стационарного состояния. Согласно хемостатическому способу скоростью роста, как правило, управляют посредством контроля степени разбавления, т.е. скорости добавления свежей среды. Скорость роста клеток в культуре может поддерживаться, например, на субмаксимальном уровне, изменением степени разбавления. Напротив, при турбидостатическом способе степень разбавления устанавливают таким образом, чтобы обеспечить максимальную скорость роста, которой могут достигнуть клетки при заданных технологических условиях, таких как рН и температура. Согласно определенным вариантам реализации гУ\УЕ или гА13 выделяют после сбора супернатанта непрерывной культуры. Типовой способ непрерывного культивирования клеток описан в \УО 2011/012725 (ОтШЬетдет е1 а1.), содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
При перфузионном культивировании извлеченная среда бедна клетками, которые остаются в культуральном сосуде, например, за счет применения способов фильтрации или центрифугирования, приводящих к повторному внесению клеток в культуру. Однако, как правило, используемые для фильтрации
- 27 029503
задерживают не 100% клеток, и таким образом часть их удаляется при извлечении среды. Очень высокие скорости роста для культивирования в режиме перфузии не критичны, так как большая часть клеток остается в культуральном сосуде. Согласно определенным вариантам реализации гУ\УЕ или гА13 выделяют после сбора супернатанта перфузионной культуры.
Реакционная система с баком-мешалкой может применяться для периодического и непрерывного культивирования клеток в суспензионном или адгезионном режимах. Как правило, указанная реакционная система с баком-мешалкой может эксплуатироваться так, как любой стандартный реактор с мешалкой с любым типом перемешивающего устройства, например, Ки8Й1оп, гидравлический, с наклонными лопастями или типа гребного винта.
Согласно определенным вариантам реализации способы культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать применение микроносителя. Согласно некоторым вариантам реализации культивирование клеток согласно вариантам реализации изобретения может проводиться в больших биореакторах в условиях, подходящих для получения высоких удельных значений площадей поверхности относительно объема культуры для достижения высоких плотностей клеток и экспрессии белка. Один из способов обеспечения таких условий роста заключается в применении микроносителей для культивирования клеток в биореакторах с мешалкой. Принцип роста клеток на микроносителях впервые был описан у уап \Ус/с1 (уап \Ус/с1. А.Ь., Ыа1иге 216:64-5 (1967)); он обеспечивает прикрепление клеток к поверхности небольших твердых частиц, взвешенных в ростовой среде. Указанные способы обеспечивают высокое соотношение поверхность-объем и таким образом обеспечивают эффективную утилизацию питательных веществ. Кроме того, при экспрессии секретируемых белков в эукариотических клеточных линиях повышение соотношения поверхность-объем обеспечивает более высокие уровни секреции и таким образом более высокий выход белка в супернатанте культуры. Наконец, указанные способы позволяют легко увеличивать масштаб эукариотических экспрессионных культур.
Клетки, экспрессирующие у\УЕ и/или гА13, могут быть связаны со сферическим или пористым микроносителем во время роста культуры клеток. Указанный микроноситель может представлять собой микроноситель, выбранный из группы микроносителей на основе декстрана, коллагена, пластика, желатина, целлюлозы и других, согласно описанию у Ви11ег (1988. 1п: §р1ег & ОггНИЬз, Ашта1 Се11 Вю1еейио1оду 3:283-303). Также возможно доращивать клетки до некоторой биомассы на сферических микроносителях, и пересевать указанные клетки при достижении ими конечной для ферментера биомассы, перед получением экспрессированного белка, на пористый микроноситель, или наоборот. Подходящие сферические микроносители могут включать микроносители с гладкой поверхностью, такие как Су1обех™ 1, СуЮйех™ 2, и Су1обех™ 3 (ОЕ НеаНйеаге) и крупнопористые микроносители такие как СуЮроге™ 1, Су1ороге™ 2, СуЮПпе™ 1 и Су1о1ше™ 2 (ОЕ НеаИйеаге).
Согласно приведенному выше описанию настоящее изобретение включает среды для клеточных культур, содержащие повышенную концентрацию меди. Понятно, что все варианты реализации изобретения и концентрации, описанные выше в разделе "Среды для клеточных культур", применимы к способам согласно настоящему изобретению, описываемых в настоящей заявке.
Согласно определенным вариантам реализации указанная культура может поддерживаться в течение по меньшей мере приблизительно 7 дней или по меньшей мере приблизительно 14 дней, 21 дня, 28 дней, или по меньшей мере приблизительно 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, или по меньшей мере приблизительно 2 месяцев или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. Плотность клеток, которая поддерживается в культуре клеток для получения рекомбинантного белка у\УЕ или рекомбинантного белка гА13, зависит от условий культивирования и среды, применяемых для экспрессии белка. Специалист в данной области техники легко сможет определить оптимальную плотность клеток для культивирования клеток с получением гУ\УЕ или гА13. Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток в указанной культуре поддерживают на уровне от приблизительно 0,5х06 до 4х107 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне концентрации от приблизительно 1,0 х106 до приблизительно 1,0х107 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне концентрации от приблизительно 1,0 х106 до приблизительно 4,0х106 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне концентрации от приблизительно 1,0 х106 до приблизительно 4,0х106 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток может поддерживаться на уровне концентрации от приблизительно 2,0х106 до приблизительно 4,0х106 клеток/мл, или от приблизительно 1,0х106 до приблизительно 2,5х106 клеток/мл, или от приблизительно 1,5х106 до приблизительно 3,5х106 клеток/мл, или в любом сходном диапазоне в течение длительного периода времени.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с на- 28 029503
стоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии настоящем изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной согласно настоящему изобретению, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х 106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5 х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5 х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкрет- 29 029503
ному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.
Согласно другому варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х 106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концен- 30 029503
трации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5 х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5 х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.
Ниже приведены характерные детали способов получения гУ\УР и гА13. Следует понимать, что, хотя условия представлены конкретно для гУ\УР или гА13, указанные условия для гУ\УР могут применяться для получения гА13, и наоборот.
В. Способы получения высокомолекулярного рекомбинантного ννΡ.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится также к способам получения ννΡ в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую повышенную концентрацию меди. Согласно определенным вариантам реализации указанная культура также содержит низкую концентрацию аммония. Используемый в настоящей заявке термины "культура клеток (клеточная культура)" и "раствор культуры клеток" применяют взаимозаменяемо.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения высокомолекулярного рекомбинантного ννΡ, включающий: а) обеспечение культуры клеток; Ь) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ννΡ; с) отбор клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и б) осуществление экспрессии ννΡ в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем приблизительно 10 мМ, причем указанный ννΡ представляет собой высокомультимерный ννΡ, содержащий от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно дальнейшим вариантам реализации мультимерные τννΡ, получаемые с применением способов согласно настоящему изобретению, содержат приблизительно 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 димеров. Согласно дальнейшим вариантам реализации τννΡ, получаемый согласно настоящему изобретению, обладает удельной активностью по меньшей мере приблизительно 20; 22,5; 25; 27,5; 30; 32,5; 35; 37,5; 40; 42,5; 45; 47,5; 50; 52,5; 55; 57,5; 60; 62,5; 65; 67,5; 70; 72,5; 75; 77,5; 80 или более мЕ/мкг. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в непрерывной клеточной культуре для получения τννΡ поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл в течение длительного периода. Согласно другим конкретным вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне не выше 2,0х106 клеток/мл, 1,5х106 клеток/мл, 1,0х106 клеток/мл, 0,5х106 клеток/мл или менее. Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток поддерживают в диапазоне от 1,5х106 клеток/мл и 2,5х 106 клеток/мл.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (τννΡ); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (Ь) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,0 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок τννΡ; (б) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происхо- 31 029503
дит экспрессия и экскреция τνΥΡ из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем указанный отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью τνΥΡ, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг τνΥΡ. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрация аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония, не превышающей 10 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации, не превышающей 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония, не превышающей 5 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации, не превышающей 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации аммония, не превышающей 4 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения τνΥΡ). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью τνΥΡ, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг τνΥΡ. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью τνΥΡ, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг τνΥΡ.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения τνΥΡ). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью τνΥΡ, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг τνΥΡ. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью τνΥΡ, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг τνΥΡ.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 3 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения τνΥΡ). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью τνΥΡ, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг τνΥΡ. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью τνΥΡ, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг τνΥΡ.
- 32 029503
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации среды для клеточных культур содержат аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения τννΡ). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью τννΡ, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг τννΡ. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью τννΡ, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг τννΡ.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди, составляющей приблизительно 4,3 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения τννΡ). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью τννΡ, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг τννΡ. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью τννΡ, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг τννΡ.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди от 2 до 20 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения τννΡ). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью τννΡ, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг τννΡ. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью τννΡ, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг τννΡ.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди от 3 до 10 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10
- 33 029503
мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения гУ\Р). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\Р, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ\Р. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\Р, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУ\Р.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди от 4 до 7,5 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения гУ\Р). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\Р, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ\Р. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\Р, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУ\Р.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (гУ\Р); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (Ь) добавления в основные среды для клеточных культур меди; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок гУ\Р; (4) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция гУ\Р из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем концентрацию ΝΗ4+ в указанном супернатанте поддерживают на низком уровне в течение по меньшей мере 7 дней, и при этом указанный отделенный супернатант также обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью гУ\Р, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг гУ\Р. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию меди и концентрацию ΝΗ4+ в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентраций согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\Р, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ\Р. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью гУ\Р, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУ\Р.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию ΝΗ4+ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\Р, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ\Р. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\Р, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУ\Р.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию ΝΗ4+ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно предпочтительному вари- 34 029503
анту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ\УР. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУ\УР.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию ΝΗ4+ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ^Р. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУУР.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию ΝΗ4+ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ^Р. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУУР.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию ΝΗ4+ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ^Р. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУУР.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию ΝΗ4+ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ^Р. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУУР.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию ΝΗ4+ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ^Р. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУУР.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию ΝΗ4+ в культуре клеток поддерживают на уровне концентраций согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 9 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ^Р. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУУР.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (гУУР); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (Ь) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 2,0 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок гУ^Р; (ά) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция гУУР из клеток в культуральный супернатант; (е) мониторинга концентрации аммония в указанном культуральном супернатанте; и (Р) отделения по меньшей мере части культурального супернатанта, причем указанный культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 10 мМ, не используют для получения композиции гУ^Р, и при этом указанный отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ^Р, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг гУ^Р. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20, 2-10, 3-8 или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин- 35 029503
кофакторной активностью гУ\УР, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ\УР. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью гУ\УР. составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУ\УР.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 6 мМ, не используют для получения композиции гУ\УР. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20, 2-10, 3-8 или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\УР, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ\УР. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\УР, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУ\УР.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 5 мМ, не используют для получения композиции гУ\УР. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20, 2-10, 3-8 или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\УР, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ\УР. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\УР, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУ\УР.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 4 мМ, не используют для получения композиции гУ\УР. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20, 2-10, 3-8 или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\УР, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг гУ\УР. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью гУ\УР, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг гУ\УР.
Рекомбинантный νΨΡ может быть получен посредством осуществления экспрессии в подходящей эукариотической системе-хозяине. Примеры эукариотических клеток включают, без ограничения, клетки млекопитающих, такие как СНО, ΟΌδ, НЕК 293, ВНК, δΚ-Нер и НерС2; клетки насекомых, например клетки δΡ9, клетки δΡ21, клетки δ2 и клетки Н|дИ Р|уе; и дрожжевые клетки, например клетки δ;·ι^1ι;·ιΐΌтусек или δсЬ^ζοкассЬа^οтусек. Согласно одному из вариантов реализации можно осуществлять экспрессию указанного νΨΡ в дрожжевых клетках, клетках насекомых, клетках птиц, клетках млекопитающих и т.п. Например, в линии клеток человека, линии клеток хомяка или линии клеток мыши. Согласно одному из конкретных вариантов реализации указанная клеточная линия представляет собой клеточную линию СНО, ВНК или НЕК. Как правило, для экспрессии νΨΡ согласно настоящему изобретению применяют клетки млекопитающих, например, клетки СНО из непрерывной клеточной линии.
Согласно определенным вариантам реализации последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, кодирующую у\УР, может представлять собой вектор. Указанный вектор может доставляться вирусом или может представлять собой плазмиду. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный белок, может представлять собой конкретный ген или его биологически функциональную часть. Согласно одному из вариантов реализации указанный белок представляет собой, по меньшей мере, биологически активную часть у\УР.
Для экспрессии указанного νΨΡ могут применяться разнообразные векторы; они могут быть выбраны из эукариотических экспрессионных векторов. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (ί) векторы для экспрессии в дрожжах, такие как рΑО, рР1С, рΥΕδ, рМЕТ, с применением таких промоторов, как ΑΟΧ1, СΑΡ, СΑ^1, Αυ^ и т.п.; (ίί) векторы для экспрессии в клетках насекомых, такие как рΜΤ, рΑс5, р1В, рΜIВ, рВΑС и т.п., с применением таких промоторов, как РН, р10, ΜΤ, Αс5, Ор1Е2, §р64, ро1И и т.п., и (ίίί) векторы для экспрессии в клетках млекопитающих, такие как рδУ^. рСΜV, рКс/К5У, ркДНК3, рВРУ и т.п., и векторы, происходящие из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы, ретровирусы и т.п., с применением таких промоторов, как СΜV, δV40, ЕР-1, иЬС, К5У, Α^У. ВРУ и β-актин. Типовой вектор для экспрессии гУ\УР описан у КаиГтап е! а1. ^о1 Се11 Вю1. 1989 Μπγ; 9(3): 1233-42); содержание указанного источника включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, указанная последовательность нуклеиновой кислоты также содержит другие последовательности, подходящие для контролируемой
- 36 029503
экспрессии белка, такие как промоторные последовательности, энхансеры, ТАТА-боксы, сайты инициации транскрипции, полилинкеры, сайты рестрикции, поли-А-последовательности, последовательности процессинга белков, маркеры отбора и т.п., которые общеизвестны специалистам в данной области техники.
Помимо сред для клеточных культур, содержащих повышенную концентрацию меди, условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать концентрацию аммония менее чем приблизительно 25 мМ на протяжении всего подготовительного процесса ("ир81геат!-процесса) в системах культивирования. Согласно одному из вариантов реализации условия культивирования клеток включают концентрацию аммония менее чем приблизительно 25 мМ, согласно другому варианту реализации менее чем приблизительно 20 мМ, согласно еще одному варианту реализации менее чем приблизительно 15 мМ, согласно еще одному варианту реализации менее чем приблизительно 10 мМ и согласно дальнейшему варианту реализации менее чем приблизительно 5 мМ.
Согласно некоторым вариантам реализации концентрации аммония согласно настоящему изобретению поддерживают на постоянном уровне на протяжении всего подготовительного процесса в системе культивирования клеток. Клетки, применяемые согласно настоящему изобретению, могут культивироваться, например, способами, модифицированными относительно стандартных периодического культивирования и непрерывного культивирования, общеизвестных в данной области техники. При этом такие стандартные техники могут приводить к образованию высоких концентраций аммония в конце культивирования. В способах согласно настоящему изобретению эта проблема преодолена за счет применения систем производства, которые могут обеспечить постоянное поступление культуральной среды с помощью таких техник, как, например, перфузионное или хемостатическое культивирование. После культивирования клеток-хозяев ν\νΡ может быть выделен из отработанной среды с применением стандартных методик, таких как ультрафильтрация или центрифугирование. При необходимости ννΡ может быть очищен, например, ионообменной и/или эксклюзионной хроматографией и т.п.
Непрерывная культура (например, перфузионная или хемостатическая культура) может представлять собой суспензионную культуру, непрерывно получающую питательные вещества за счет притока свежей среды, при этом объем культуры, как правило, неизменен. Сходным образом, непрерывная ферментация может подразумевать процесс, при котором клетки или микроорганизмы в культуре поддерживают в экспоненциальной фазе роста за счет постоянного добавления свежей среды, точно компенсируемом удалением суспензии клеток из биореактора. Кроме того, реакционная система с баком-мешалкой может применяться для суспензионного, перфузионного, хемостатического культивирования и/или культивирования на микроносителях. Как правило, в качестве указанной реакционной системы с бакоммешалкой может работать любой стандартный реактор с баком-мешалкой с любым типом перемешивающего устройства, например типа Ки8Ь!оп, гидравлическим, с наклонными лопастями, или типа гребного винта.
С. Способы получения рекомбинантного АОАМТ§13 (А13).
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится также к способам получения гА13 в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую повышенную концентрацию меди. Согласно определенным вариантам реализации указанная культура также содержит низкую концентрацию аммония.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного АОАМТ§13 (гА13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (Ь) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 1,0 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок гА13; (б) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция гА13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности ΡΚΕТ§-VVΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день (т.е. 1500 единиц ΡΚΕТ§-VVΡ73 активности в день на литр культуры клеток; Р РРЕТ8). Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 1-6, 2-5, 2-4 или 3-4 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности ΡΚ.ΕТδ-У\VΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности ΡΚ.ΕТδ-У\VΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности ΡΚ.ΕТδ-У\VΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение объемной продуктивности ΡΚΕТ§-VVΡ73 (Р
- 37 029503
РКЕТ§). Например, согласно определенным вариантам реализации выделяют по меньшей мере 1500 единиц активности РРЕТ§-У^Е73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации по меньшей мере 2000 единиц активности РКЕТ8У\УР73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации по меньшей мере 2500 единиц активности РКЕТ§-У^Р73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации по меньшей мере 3000 единиц активности РКЕТ§-У^Е73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в непрерывной клеточной культуре для продуцирования гА13 поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х 106 клеток/мл в течение длительного периода. Согласно другим конкретным вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне не выше 3,5х106 клеток/мл, 3,0х106 клеток/мл, 2,5х106 клеток/мл, 2,0х106 клеток/мл, 1,5х106 клеток/мл, 1,0х106 клеток/мл или менее. Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток поддерживают на уровне от 3,0х106 до 4,0х106 клеток/мл.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант содержит по меньшей мере 4 единиц активности РКЕТ§-У^Е73 на 1 мл супернатанта (РКЕТ8). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 6 единиц активности РКЕТ§-У^Е73 на 1 мл супернатанта. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 8 единиц активности РКЕТ§-У^Е73 на 1 мл супернатанта. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 10 единиц активности РРЕТ8-У\УР73 на 1 мл супернатанта. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение продуктивности РКЕТ8. Например, согласно определенным вариантам реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 4 единицами активности РКЕТ§-У^Р73 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 6 единицами активности РКЕТ§-У^Е73 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 8 единицами активности РКЕТ§-У^Е73 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 10 единицами активности ЕРЕТ8-У\УЕ73 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 800 мЕ ЕРЕТ8-У\УЕ73 активности на 106 клеток культуры в день (т.е. с| Егс1з). Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1Е ЕРЕТ8-У\УЕ73 активности на 106 клеток культуры в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,2 Е ЕРЕТ8-У\УЕ73 активности на 106 клеток культуры в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,4 Е ЕРЕТ8-У\УЕ73 активности на 106 клеток культуры в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение удельной продуктивности ЕРЕТ8-У\УЕ73 на клетку (с| ЕгсЛ). Например, согласно определенным вариантам реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 800 мЕ ЕРЕТ8-У\УЕ73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 Е РРЕТ§-У^Р73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,2 Е ЕРЕТ8-У\УЕ73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,4 Е ЕРЕТ8-У\УЕ73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 мг гА13 согласно ИФА-анализу на 1 л культуры в день (Р ЕЬ1§А). Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по мень- 38 029503
шей мере 1,5 мг гА13 согласно ИФА-анализу на 1 л культуры в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 2 мг гА13 согласно ИФА-анализу на 1 л культуры в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение выработки гА13. Например, согласно определенным вариантам реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 мг гА13 согласно ИФАанализу на 1 л культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,5 мг гА13 согласно ИФА-анализу на 1 л культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 2 мг гА13 согласно ИФА-анализу на 1 литр культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,5 мкг гА13 согласно ИФА-анализу на 106 клеток культуры в день (т.е. с| ЕЫ8А). Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,7 мкг гА13 согласно ИФА-анализу на 106 клеток культуры в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,9 мкг гА13 согласно ИФА-анализу на 106 клеток культуры в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение выработки согласно с| ЕЫ8А. Например, согласно определенным вариантам реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,5 мкг гА13 согласно ИФА-анализу на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,7 мкг гА13 согласно ИФА-анализу на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,9 мкг гА13 согласно ИФА-анализу на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант содержит по меньшей мере 3 мкг гА13 согласно ИФА-анализу на 1 мл супернатанта. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 4 мкг гА13 согласно ИФА-анализу на 1 мл супернатанта. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 5 мкг гА13 согласно ИФА-анализу на 1 мл супернатанта. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 6 мкг гА13 согласно ИФА-анализу на 1 мл супернатанта. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение выработки гА13. Например, согласно определенным вариантам реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 3 мкг гА13 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 4 мкг гА13 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 5 мкг гА13 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 6 мкг гА13 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения гА13). Согласно конкретному варианту реализации культуральный раствор содержит медь и аммоний в концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения
- 39 029503
композиции рекомбинантного ΑΌΑΜΤδΠ (γΑ13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (Ь) добавления в основные среды для клеточных культур меди и цинка; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок γΑ13; (й) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция γΑ13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности ΡΚ.ΕΤδ-ν\νΡ73 на 1л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мкМ цинка. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно одному варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере точно или приблизительно 5 мкМ цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда также может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2 мкМ или по меньшей мере точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или более цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности ΡΚΕΤδ-ν\Ρ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности ΡΚΕΤδ-ν\Ρ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ΑΌΑΜΤδΠ (τΑ13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (Ь) добавления в основные среды для клеточных культур меди и кальция; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок τΑ13; (й) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция τΑ13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 0,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 1,5 мМ кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 0,5 мМ или по меньшей мере точно или приблизительно 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,25; 2,5; 2,75; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 мМ или более кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и кальция в концентрации согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности ΡΚΕΤ§-ν\Ρ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности ΡΚΕΤδ-ν\Ρ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ΑΌΑΜΤδΠ (τΑ13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (Ь) добавления в основные среды для клеточных культур меди, цинка и кальция; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок τΑ13; (й) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция τΑ13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности
- 40 029503
ΡΚΕΤδ-νΥΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 1,5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит кальций в концентрации от 0,5 мМ и 1,5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,25; 2,5; 2,75; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 мМ или более и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности ΡΚΕΤδ-νΥΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности ΡΚΕΤδ-νΥΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности ΡΚΕΤδ-νΥΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ΛΌΛΜΤδ13 (τΛ13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (Ь) добавления в основные среды для клеточных культур меди и никотинамида; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок γΛ13; (ά) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция τΛ13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности ΡΚΕΤδ-νΥΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина Β3). Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 7 мг/л никотинамида (витамина Β3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина Β3). Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина Β3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности ΡΚΕΤδ-νΥΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности ΡΚΕΤδ-νΥΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности ΡΚΕΤδ-νΥΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ΛΌΛΜΤδ13 (τΛ13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (Ь) добавления в основные среды для клеточных культур меди, цинка и никотинамида; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок τΛ13; (ά) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция τΛ13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности ΡΚΕΤδ-νΥΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная среда для клеточной культуры содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 мг/мл и 10 мг/мл и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 мг/мл или более и медь и цинк в кон- 41 029503
центрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности ΡΡΕΤδ-ν\νΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности ΡΚΕΤδννΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ΑΌΑΜΤδ13 (гА13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (Ь) добавления в основные среды для клеточных культур меди, кальция и никотинамида; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок гА13; (б) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция гА13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации среда для клеточной культуры содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 мг/мл и 10 мг/мл и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 мг/мл или более и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности ΡΚΕΤδ-ννΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности ΡΚΕΤδννΡ73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Рекомбинантные белки Α^ΑΜΤδ могут быть получены посредством осуществления экспрессии в любой подходящей прокариотической или эукариотической системе-хозяине. Примеры эукариотических клеток включают, без ограничения, клетки млекопитающих, такие как СНО, ί'.Όδ, ΗΕΚ293, ΒΗΚ, δΚНер и НерС2; клетки насекомых, например δΡ9 клетки, δΡ21 клетки, δ2 клетки и НщН Ρί+е клетки; и дрожжевые клетки, например клетки δассЬа^отусеδ или δсЬ^ζо8ассЬа^отусе8. Согласно одному из вариантов реализации указанные белки Α^ΑΜΤδ можно экспрессировать в бактериальных клетках, дрожжевых клетках, клетках насекомых, клетках птиц, клетках млекопитающих и т.п. Например, в линии клеток человека, линии клеток хомяка или линии клеток мыши. Согласно одному из конкретных вариантов реализации указанная клеточная линия представляет собой клеточную линию СНО, ΒΗΚ или ΗΕΚ. Согласно предпочтительному варианту реализации клеточная линия представляет собой клеточную линию СНО. Согласно конкретному варианту реализации клоны СНО, способные к стабильной экспрессии гА13, получают котрансфекцией клетки СНО кодирующими последовательностями гА13 и дигидрофолатредуктазы (например, мышиного гена бЫг) и отбором при росте в присутствии возрастающих уровней метотрексата.
Согласно одному из вариантов реализации указанные клетки могут представлять собой любые клетки млекопитающих, пригодные для культивирования, предпочтительно в ходе производственного процесса (т.е. по меньшей мере в 10 л, предпочтительно по меньшей мере в 100 л), для получения требуемого белка Α^ΑΜΤδ, такого как Α^ΑΜΤδ13. Примеры включают линию клеток почки обезьяны СУ1, трансформированную δν40 (ί.Όδ-7, АТСС СКЬ 1651); линию эмбриональных клеток почек человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, СгаЬат е1 а1., 1. Сеп У1го1., 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (ВНП, ΑΤСС ССЬ 10); клетки яичника китайского хомячка/ГОНРК, такие как субклон ΌΠΚΧ-Β11 (СНО, ИпаиЬ апб СЬазш, Ргос. Νηΐΐ. Асаб. δα. ^А, 77:4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (ΤΜ4, МаШег, Βΐοΐ. Кергоб, 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (СУ1 АТСС ССЬ 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (УЕКО-76, АТСС СКЬ-1587); клетки карциномы шейки матки человека (НеЬа, АТСС ССЬ 2); клетки почки собаки (ΜΌΟΚ, АТСС ССЬ 34); клетки печени крыс Буффало (ВКЬ 3А, АТСС СКЬ 1442); клетки легкого человека (ν138, АТСС ССЬ 75); клетки печени человека (Нер С2, НВ 8065); опухоли молочной железы мышей (ΜΜΤ 060562, АТСС ССЬ51 ); клетки ΤΚΙ (МаШег е1 а1., АппаП Ν. Υ. Асаб. 8ά., 383:44-68 (1982)); клетки МКС
- 42 029503
5; клетки Ρδ4; и линию гепатомы человека (Нер 02). Предпочтительно клеточная линия представляет собой линию клеток грызунов, в частности линию клеток хомяка, такую как СНО или ВНК.
Значительное число векторов может применяться для экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ 13) и может быть выбрано из эукариотических и прокариотических экспрессионных векторов. Согласно определенным вариантам реализации плазмидный вектор предназначен для применения в экспрессии белка ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13). Как правило, плазмидные векторы, содержащие репликон и управляющие последовательности, полученные из видов, совместимых с клеткой-хозяином, применяют в соединении с указанными хозяевами. Указанный вектор может нести сайт репликации, а также маркерные последовательности, способные обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ 13), функционально связанную с одной или более контрольной последовательностью, например, промотором.
Предпочтительный способ получения стабильных клонов клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный белок ΑΌΑΜΤδ, следующий.
Дефицитную по ΌΗΡΚ клеточную линию СНО ΌΌΚΧ-Β11 трансфицируют ΌΗΡΚ-экспрессионным вектором, чтобы обеспечить экспрессию соответствующего рекомбинантного белка. Типовой способ описан у РЫтаиег е! а1. (В1оой. 2002 Νον 15; 100(10):3626-32. ЕриЬ 2002 ίιιΐ 12), содержание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей. Отбор проводят культивированием в не содержащих гипоксантин/тимидин (ΗΤ) средах; амплификации соответствующей области, кодирующей экспрессию рекомбинантного белка ΑΌΑΜΤδ и ΌΗΡΚ гена, достигают размножением клеток в возрастающих концентрациях метотрексата. При необходимости клеточные линии ΟΗΟ могут быть адаптированы для роста в не содержащей сыворотки и/или белков среде, по существу согласно описанию в υδ 6100061 (Кейег е! а1., Ιιηιηιιηο Αкι^еηде8е118сΗаΓι).
Согласно другому предпочтительному варианту реализации стабильные ΗΕΚ293 клетки получают, трансфицируя их конструкцией, содержащей селектируемый маркер устойчивости к гигромицину, и отбирая трансформанты по устойчивости к антибиотику.
Способность определенных вирусов инфицировать клетки или проникать в клетки посредством опосредованного рецепторами эндоцитоза, встраиваться в геном клетки-хозяина и стабильно и эффективно экспрессировать вирусные гены, делает их привлекательными кандидатами для переноса чужеродных нуклеиновых кислот в клетки (например, клетки млекопитающих). Соответственно, согласно определенным вариантам реализации вирусный вектор применяют для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13) в клетку-хозяина для экспрессии. Указанный вирусный вектор должен содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ13), функционально связанную с одной или более контрольной последовательностью, например, промотором. Как вариант, указанный вирусный вектор может не содержать контрольную последовательность, вместо этого используя контрольную последовательность клеткихозяина для управления экспрессией белка ΑΌΑΜΤδ. Неограничивающие примеры вирусных векторов, которые могут применяться для доставки нуклеиновой кислоты, включают аденовирусные векторы, ΑΑν-векторы и ретровирусные векторы.
Согласно одному из вариантов реализации аденовирусный экспрессионный вектор включают конструкции, содержащие аденовирусные последовательности, достаточные для осуществления упаковки указанной конструкции и гарантированной экспрессии клонированной в нее конструкции ΑΌΑΜΤδ. Аденовирусные векторы позволяют вводить чужеродные последовательности размером до 7 т.п.н. (ОптНаик е! а1., δет^ηа^ ίη νίτο1ο§γ, 200(2):535-546, 1992)).
Согласно другому варианту реализации аденоассоциированный вирус (ΑΑν) может применяться для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ 13), в клетку-хозяина для экспрессии. ΑΑν-системы описывались ранее и, как правило, общеизвестны в данной области техники (КеПейег аий Уок, Вю!есЬшдиек, 17(6):1110-7, 1994; СоНци е! а1., Ргос Ν;·ι11 Αсаά δοί υδΑ, 89(13):6094-6098, 1992; Сште1, №! 1ттищ 13(2-3): 141-64, 1994; Μϋζ^ζΗ Сигг Τορ ΜκγοΜόΙ 1тιηιιηοΐ, 158:97-129, 1992). Детали получения и применения τΑΑν-векторов описаны, например, в патентах США №№ 5139941 и 4797368, включенных в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте и для любых целей.
Согласно одному из вариантов реализации ретровирусный экспрессионный вектор может применяться для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ΑΌΑΜΤδ (например, ΑΌΑΜΤδ 13), в клетку-хозяина для экспрессии. Указанные системы были описаны ранее и в целом общеизвестны в данной области техники (Μаηη е! а1., Се11, 33:153-159, 1983; №со1ак аий КиЬшк!еш, в: Vес!огк: Α кигуеу οί то1еси1аг αίοηίηβ уесЮгк ;·ιηά (Ней икек, Βοάπβίκζ ;·ιηά ОеиНа^, ейк., δ!οиеЬат: Ви!!ег\\όγ11ι, рр. 494-513, 1988; Τет^и. в: 0еие ΤΐΉηκίεΓ, КисЬег1арай (ей.), Νιν Υόγ1<: Р1едот Ргекк, рр. 149-188, 1986). Согласно конкретному варианту реализации ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор (см., например, Νηΐάίηί е! а1., δ^ιη^, 272(5259):263-267, 1996; 2ийегеу е! а1., ΝηΙ Вю!есЬηοΐ, 15(9):871-875, 1997; В1отег е! а1., 1. νίτοί., 71(9):6641-6649, 1997; патенты США №№ 6013516 и 5994136).
- 43 029503
Неограничивающие примеры векторов для прокариотической экспрессии включают плазмиды, такие как рК8ЕТ, рЕТ, ρΒΛΌ и т.п, при этом промоторы, применяемые в прокариотических экспрессионных векторах, включают 1ас, 1гс. 1гр. гесА, агаВЛЭ и т.п. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (ί) векторы для экспрессии в дрожжах, такие как рАО, рР1С, рУЕ8, рМЕТ, с применением таких промоторов, как АОХ1, САР, САЬ1, АИС1 и т.п.; (ίί) векторы для экспрессии в клетках насекомых, такие как рМТ, рАс5, ρΙΒ, ρΜΙΒ, рВАС и т.п., с применением таких промоторов, как РН, р10, МТ, Ас5, Ор1Е2, др64, роШ и т.п., и (ίίί) векторы для экспрессии в клетках млекопитающих, такие как р8УЪ, рСМУ, рКс/КЗУ, ркДНКЗ, рВРУ и т.п., и векторы, происходящие из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы, ретровирусы и т.п., с применением таких промоторов, как СМУ, 8У40, ЕР-1, ИЬС, К8У, АНУ, ВРУ и β-актина. Типовой вектор для экспрессии гА13 описан у РЫтаиет е! а1. (В1ооб. 2002 Νον 15; 100(10):3626-32. ЕриЬ 2002 1н1 12); содержание указанного источника включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Согласно определенным вариантам реализации способы культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать применение микроносителя. Настоящее изобретение обеспечивает, наряду с прочими аспектами, способы крупномасштабной экспрессии белка АЭАМТЗ. Согласно некоторым вариантам реализации культивирование клеток согласно вариантам реализации изобретения может проводиться в больших биореакторах в условиях, подходящих для получения высокого отношения поверхности к объему в культуре для достижения высокой плотности клеток и экспрессии белка. Одним из способов обеспечения таких условий роста является применение микроносителей для культивирования клеток в биореакторах с мешалкой. Согласно другому варианту реализации указанные ростовые потребности удовлетворяются посредством применения суспензионной культуры клеток.
Конкретные варианты реализации.
А. Рекомбинантный фактор фон Виллебранда (гУ^Р).
Рекомбинантный ννΡ можно экспрессировать в клетках млекопитающих, но удельная активность ννΡ может широко варьировать в зависимости от условий культивирования клеток; не было показано, что она сравнима или равна таковой ννΡ, выделенного из плазмы крови. Настоящее изобретение основано частично на неожиданном открытии, что среды для клеточных культур, содержащие по меньшей мере 2,4 мкг/л меди, обеспечивают благоприятный эффект, способствую экспрессии высокомолекулярного ννΡ, имеющего высокую удельную активность. В частности, высокомолекулярный рекомбинантный ννΡ согласно настоящему изобретению может включать высокомультимерную форму, содержащую от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающую удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Процессы культивирования клеток согласно настоящему изобретению также позволяют поддерживать низкие уровни ΝΗ4+ (например, менее чем 10 мМ) во время подготовительного процесса в системах культивирования клеток, уменьшая таким образом пагубные эффекты на посттрансляционные модификации. Предполагается, что согласно настоящему изобретению впервые предложены условия клеточных культур, включающие среду с подходящей концентрацией меди в комбинации с подходящими уровнями аммония в супернатанте, для экспрессии высокомультимерных ννΡ с высокой удельной активностью.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к условиям культивирования клеток для получения рекомбинантного высокомолекулярного ννΡ с высокой удельной активностью. Условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать, например, среду для клеточной культуры с повышенной концентрацией меди и/или супернатант культуры клеток с низкой концентрацией аммония (ΝΗ4+). Согласно настоящему изобретению также предложены способы культивирования клеток в условиях клеточной культуры для экспрессии высокомолекулярного ννΡ с высокой удельной активностью.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение обеспечивает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного белка ννΡ; указанный раствор культуры клеток содержит среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л; супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ; и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерный белок ννΡ, причем указанный белок ννΡ обладает удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток раствор культуры клеток содержит средовую добавку, содержащую медь.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток указанная средовая добавка содержит гидролизат, необязательно соевый гидролизат.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток указанная средовая добавка содержит соль меди, хелат меди или их комбинации.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.
- 44 029503
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток концентрация меди составляет по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток концентрация меди составляет от приблизительно 2,4 до приблизительно 20 мкг/л.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток белок ν\νΡ содержит от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения высокомолекулярного рекомбинантного белка ν\νΡ; указанный способ включает этапы: а) обеспечения культуры клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок ν\νΡ; Ь) экспрессии белка ν\νΡ в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем приблизительно 10 мМ, причем указанный белок ν\νΡ представляет собой высокомультимерный белок ν\νΡ и имеет удельную ристоцетиновую активность, составляющую по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов указанные клетки представляют собой клетки млекопитающих.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов указанные клетки взяты из непрерывной клеточной линии.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов указанные клетки представляют собой клетки СНО.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов концентрация меди составляет по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов концентрация меди составляет от приблизительно от 2,4 до приблизительно 20 мкг/л.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов рекомбинантный белок ν\νΡ обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов рекомбинантный белок ν\νΡ обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов рекомбинантный белок ν\νΡ содержит от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение обеспечивает высокомолекулярный рекомбинантный белок ννΡ, получаемый при помощи процесса, включающего этапы: а) обеспечения культуры клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок ν\νΡ; и Ь) экспрессии белка ν\νΕ в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, причем указанный белок ν\νΡ представляет собой высокомультимерный белок ν\νΡ и обладает удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации вышеописанных композиций гУ^Е рекомбинантный белок ν\νΡ обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации вышеописанных композиций гУ^Е рекомбинантный белок ν\νΕ обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей от приблизительно 30 до приблизительно 100 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации вышеописанных композиций гУ^Е рекомбинантный белок ν\νΡ содержит приблизительно от 14 до приблизительно 22 димеров.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение обеспечивает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного белка ν\νΡ, при этом указанный раствор культуры клеток включает среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л; супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ; и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерный белок ν\νΡ, причем указанный белок ν\νΡ содержит от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладает удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к условиям культивирования клеток для получения рекомбинантного высокомолекулярного ννΡ, находящегося в высокомультимерной форме с высокой удельной активностью. Условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать, например, среду для клеточной культуры с повышенной концентрацией меди и супернатант культуры клеток с низкой концентрацией аммония (ΝΗ4+). Согласно настоящему изобретению также предложены способы культивирования клеток в условиях клеточной культуры для экспрессии высокомолекулярного ννΡ с высокой удельной активностью.
- 45 029503
Согласно одному аспекту настоящее изобретение включает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного у\Р, содержащего среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л; супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ; и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерные у\Р, содержащие от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров, и обладающие удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно одному из вариантов реализации описанных выше растворов культур клеток по меньшей мере 10% гУ\Р присутствует в виде высокомолекулярного У\Р мультимера из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% гУ\Р присутствует в виде высоко молекулярного мультимера У\Р из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% гУ\Р присутствует в виде высокомолекулярного мультимера У\Р из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% гУ\Р присутствует в виде высокомолекулярного мультимера У\Р из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% гУ\Р присутствует в виде высокомолекулярного мультимера У\Р из более чем 10 димеров. Согласно определенным вариантам реализации концентрация меди может составлять по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, либо концентрация меди может варьировать от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации среды для клеточных культур содержат средовую добавку, содержащую медь. Согласно определенным вариантам реализации указанная средовая добавка может содержать гидролизат или соль меди, хелат меди или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная соль меди может включать сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди или оксид меди. Согласно определенным вариантам реализации клетки могут быть взяты из непрерывной клеточной линии и могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки СНО. Согласно некоторым вариантам реализации указанный рекомбинантный у\Р обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг, либо удельная ристоцетинкофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение включает способ получения высокомолекулярного рекомбинантного у\Р, включающий: а) обеспечение культуры клеток; Ь) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей у\Р; с) отбор клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и 4) осуществление экспрессии у\Р в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем приблизительно 10 мМ, причем указанный у\Р представляет собой высокомультимерный у\Р, содержащий от приблизительной до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно одному варианту реализации супернатанта культуры клеток, описанной выше, по меньшей мере 10% гУ\Р присутствует в виде высокомолекулярного мультимера У\Р из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% гУ\Р присутствует в виде высокомолекулярного мультимера У\Р из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% гУ\Р присутствует в виде высокомолекулярного мультимера У\Р из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% гУ\Р присутствует в виде высокомолекулярного мультимера У\Р из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% гУ\Р присутствует в виде высокомолекулярного мультимера У\Р из более чем 10 димеров. Согласно некоторым вариантам реализации клетки, которые могут быть взяты из непрерывной клеточной линии, могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки СНО. Согласно определенным вариантам реализации концентрация меди может составлять по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, либо концентрация меди может варьировать от приблизительно 2,4 до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации среды для клеточных культур содержат средовую добавку, содержащую медь. Согласно определенным вариантам реализации указанная средовая добавка может содержать гидролизат или соль меди, хелат меди или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная соль меди может включать сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди или оксид меди.
Согласно некоторым вариантам реализации указанный рекомбинантный у\Р обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг, либо удельная ристоцетин-кофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 до приблизительно 100 мЕ/мкг.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение охватывает высокомолекулярный рекомбинантный у\Р, получаемый с помощью процесса, включающего этапы: а) обеспечения культуры клеток; Ь) введения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей у\Р; с) отбора клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и 4) экспрессии у\Р в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентра- 46 029503
ции по меньшей мере 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, причем указанный ννΡ представляет собой высокомультимерный ν\νΡ, содержащий от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно одному варианту реализации описанного выше супернатанта культуры клеток по меньшей мере 10% ΓννΡ присутствует в виде высокомолекулярного мультимера ννΡ из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% ΓννΡ присутствует в виде высокомолекулярного мультимера ννΡ из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% ΓννΡ присутствует в виде высокомолекулярного мультимера ννΡ из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% ιννΡ присутствует в виде высокомолекулярного мультимера ννΡ из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% ιννΡ присутствует в виде высокомолекулярного мультимера ννΡ из более чем 10 димеров. Согласно некоторым вариантам реализации клетки могут быть из непрерывной клеточной линии и могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки СНО. Согласно определенным вариантам реализации концентрация меди может составлять по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, либо концентрация меди может варьировать от приблизительно 2,4 до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации среды для клеточных культур содержат средовую добавку, содержащую медь. Согласно определенным вариантам реализации указанная средовая добавка может содержать гидролизат или соль меди, хелат меди или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная соль меди может включать сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди или оксид меди. Согласно некоторым вариантам реализации указанный рекомбинантный ννΡ обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг, либо указанная удельная ристоцетин-кофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 до приблизительно 100 мЕ/мкг.
Согласно одному из аспектов в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция, содержащая рекомбинантный фактор фон Виллебранда (ΓννΡ), обладающий удельной ристоцетинкофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг. Согласно предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 40 мЕ/мкг. Согласно более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг. Согласно более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 60 мЕ/мкг. Согласно более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг. согласно еще более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 80 мЕ/мкг.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций по меньшей мере 10% ΓννΡ в указанной композиции присутствует в виде высокомолекулярного мультимера ννΡ из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% ΓννΡ присутствует в виде высокомолекулярного мультимера ννΡ из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% ΓννΡ присутствует в виде высокомолекулярного мультимера ννΡ из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% τννΡ присутствует в виде высокомолекулярного мультимера ννΡ из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% ΓννΡ присутствует в виде высокомолекулярного мультимера ννΡ из более чем 10 димеров.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная композиция содержит культуральный супернатант. Согласно одному из конкретных вариантов реализации указанный культуральный супернатант представляет собой супернатант культуры клеток млекопитающих. Согласно более конкретному варианту реализации указанный супернатант культуры клеток млекопитающих представляет собой супернатант клеток СНО.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций, ΓννΡ экспрессируется в культуре клеток, содержащей по меньшей мере 2,4 мкг/л меди. Согласно конкретному варианту реализации указанная культура клеток содержит по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно более конкретному варианту реализации указанная культура содержит от 2,4 до 20 мкг/л меди. Согласно одному из вариантов реализации медь представлена в виде соли меди, хелата меди или их комбинации. Согласно конкретному варианту реализации указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой периодическую культуру.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой непрерывную культуру. Согласно конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному
- 47 029503
варианту реализации указанное непрерывное культивирование производится в режиме перфузии.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций уровень ΝΗ4+ в указанной культуре поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 2,5 х 106 клеток/мл.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 2,0х 106 клеток/мл.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную культуру поддерживают на уровне менее чем 1,5х 106 клеток/мл.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций гУ^Р коэкспрессируется с рекомбинантным фактором УШ (гРУШ). Согласно конкретному варианту реализации большую часть коэкспрессируемого гРУШ удаляют. Согласно более конкретному варианту реализации отношение гУ\УР к гРУШ в указанной композиции составляет по меньшей мере 10:1.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного, подкожного или внутримышечного введения.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию лиофилизируют.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение включает высокомолекулярный рекомбинантный у^Р, получаемый с помощью процесса, включающего этапы: а) обеспечения культуры клеток; Ь) введения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей у^Р; с) отбора клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и ά) осуществление экспрессии у\УР в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, причем указанный у\УР представляет собой высокомультимерный уХУР, содержащий от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Очевидно, что здесь могут применяться все варианты реализации и концентрации, описанные в разделах "Среды для клеточных культур" и "Способы получения рекомбинантного у\УР" выше.
Рекомбинантный у^Р согласно настоящему изобретению может включать высокомолекулярный рекомбинантный белок уХУР, обладающий высокой удельной активностью. Согласно одному из вариантов реализации у\УР согласно настоящему изобретению представляет собой высокомультимерную форму у\УР. Согласно некоторым вариантам реализации указанная высокомультимерная форма у\УР содержит по меньшей мере до приблизительно 14 димеров, а согласно другим вариантам реализации по меньшей мере до приблизительно 22 димера. Согласно другим вариантам реализации высокомультимерная форма у\УР может варьировать от приблизительно 10 до приблизительно 20 димеров, или от приблизительно 15 до приблизительно 25 димеров, или от приблизительно 20 до приблизительно 40 димеров. Согласно определенным вариантам реализации рекомбинантный у^Р сопоставим с у\УР плазмы.
Согласно приведенному в настоящей заявке описанию в соответствии с настоящим изобретением получен неожиданный результат, состоящий в том, что повышенная концентрация меди в культуре клеток среды позволяет получать высокомолекулярный у\УР с высокой удельной активностью. Среды для клеточных культур, содержащие медь в концентрации, например, выше чем приблизительно 2,4 мкг/л, могут повышать выход рекомбинантного мультимерного у^Р по сравнению с не содержащими медь средами. Согласно определенным вариантам реализации процент мультимерного у\УР (т.е. гУУР, содержащего по меньшей мере 2 димера) может быть выше чем приблизительно 50%, или выше чем приблизительно 75%, или выше чем приблизительно 90%. Уровень мультимеризации у^Р может быть проанализирован с применением стандартных техник, таких как, например, электрофорез в агарозе в невосстанавливающих условиях.
Согласно настоящей заявке рекомбинантный у^Р, полученный при помощи способов согласно настоящему изобретению, может обладать высокой удельной активностью, например высокой удельной ристоцетин-кофакторной активностью. Согласно одному из вариантов реализации рекомбинантный у^Р, полученный при помощи способов согласно настоящему изобретению, может обладать удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг, а согласно другому варианту реализации по меньшей мере 50 мЕ/мкг. Согласно другим вариантам реализации удельная ристоцетин-кофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 до приблизительно 100 мЕ/мкг или от приблизительно 50 до приблизительно 100 мЕ/мкг.
В. Рекомбинантный АЭАМТ§13 (гА13).
Белки АЭАМТ§ (т.е. АОАМТ§-1-АОАМТ§-20) представляют собой семейство секретируемых цинковых металлопротеиназ, имеющих общую модулярную доменную организацию (для ознакомления см. Р^и^ту С.К., Ргои1 Вюзсг 2006 Ριη 1; 11:544-69). Все белки АОАМТ§ имеют общее строение центрального домена, состоящего из сигнального пептида, за которым следует продомен, цинкзависимый
- 48 029503
металлопротеиназный каталитический домен, дезинтегрин-подобный домен, повтор тромбоспондина типа I, цистеин-богатый домен и спейсерный домен (Ар1е 8.8., 1. ΒίοΙ. СЬет. 2009 Νον 13; 284(46):314937). Помимо этого, все они, кроме АОАМТ8-4, содержат по меньшей мере еще один домен повтора тромбоспондина типа I, и многие из белков АОАМТ8 содержат один или более дополнительный вспомогательный домен. В частности, сообщалось, что все белки АЭАМТ8, по всей видимости, содержат по меньшей мере один кальций-связывающий сайт и по меньшей мере один цинк-связывающий сайт, расположенные внутри металлопротеиназного каталитического домена (ΛηάΐΌίηί е1 а1., 1. Рго1еоте Кек., 2005, 4(3), рр 881-888).
Описана биологическая роль белков АПАМТ8 при различных заболеваниях и состояниях, включая антиангиогенез, интерстициальный фиброз почек, перестройку костной ткани, фолликулогенез в яичниках, атеросклероз, развитие мочеполовой системы и рост/ремоделирование опухолей (АПАМТ8-1); синдром Элерса-Данлоса типа 7С и бычий дерматоспараксис (АПАМТ8-2); артрит, атеросклероз и тендинопатия (АПАМТ8-4); артрит и глиобластома (АПАМТ8-5); артрит (АПАМТ8-7); антиангиогенез, злокачественные новообразования мозга, артрит и атеросклероз (АПАМТ8-8); артрит (АПАМТ8-9, -12); тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (АПАМТ8-13) и антитромбоз/инсульт (АПАМТ8 18) (для ознакомления см. Πη αηά Пи, Ореп Ассекк КЬеита1о1о§у КекеагсЬ αηά Ре\зе\ук 2009:1 121-131).
Рекомбинантный АПАМТ813 (А13) экспрессировали в клетках млекопитающих и прежде, однако удельная активность широко варьирует в зависимости от условий культивирования клеток. Было обнаружено, что многие коммерчески доступные культуральные среды непригодны для экспрессии гА13 с высокой удельной активностью, выражаемой как отношение активности, измеренной посредством анализа ЕРЕТ8-У\УЕ73, к содержанию антигена, согласно оценке с применением ЕЫ8А. Согласно одному аспекту способы, предложенные согласно настоящему изобретению, основаны на нескольких полезных открытиях, позволяющих осуществлять экспрессию в культуре клеток белка гА13, обладающего повышенными уровнями общей и удельной активности.
Соответственно, благодаря общим структурно-функциональным связям семейства АПАМТ8 секретируемых металлопротеиназ, предлагаемые согласно настоящему изобретению способы позволяют экспрессировать в культуре клеток и выделять из клеточной среды все белки АПАМТ8.
Согласно одному из аспектов в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция, содержащая рекомбинантный АПАМТ8 13 (гА13), обладающий удельной ЕРЕТ8-У\УЕ активностью, составляющей по меньшей мере 1600 мЕ/мкг.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанный гА13 обладает удельной ЕРЕТ8-У\УЕ активностью, составляющей по меньшей мере 800 мЕ/мкг.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная композиция содержит культуральный супернатант. Согласно конкретному варианту реализации указанный культуральный супернатант представляет собой супернатант культуры клеток млекопитающих. Согласно более конкретному варианту реализации указанный супернатант культуры клеток млекопитающих представляет собой супернатант клеток СНО.
Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанный гА13 экспрессируется в культуре клеток, содержащей по меньшей мере 1 мкг/л меди. Согласно конкретному варианту реализации указанная культура клеток содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди. Согласно более конкретному варианту реализации указанная культура содержит от 2 до 20 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций медь представлена в виде соли меди, хелата меди или их комбинации. Согласно конкретному варианту реализации указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрата меди и оксида меди.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой периодическую культуру.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой непрерывную культуру. Согласно конкретному варианту реализации непрерывное культивирование производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации непрерывное культивирование производится в режиме перфузии.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций уровень ΝΗ4+ в указанной культуре поддерживают на уровне концентрации ниже 5 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций уровень ΝΗ4+ в указанной культуре поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 4,0х106 клеток/мл. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 3,0х106 клеток/мл. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 2,0х106 клеток/мл. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 1,5х106 клеток/мл.
- 49 029503
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного, подкожного или внутримышечного введения.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию лиофилизируют.
Составы.
Согласно одному аспекту составы, содержащие рекомбинантные терапевтические белки τνΥΡ или τΛ13 согласно настоящему изобретению, лиофилизируют перед введением. Лиофилизация проводится с применением общеизвестных в данной области техники методик и должна быть оптимизирована для разрабатываемой композиции [Лапд е1 а1., Рйагт Ке8. 21:191-200, (2004) и Сйапд е1 а1., Рйагт Кек. 13:2439 (1996)].
Способы получения фармацевтических составов может включать один или более следующий этап: добавление стабилизирующего агента согласно описанию в настоящей заявке к указанной смеси перед лиофилизацией, добавление по меньшей мере одного агента, выбранного из объемообразующего агента, регулирующего осмолярность агента и ПАВ, каждый из которых соответствует приведенному в настоящей заявке описанию, к указанной смеси перед лиофилизацией. Лиофилизированный состав состоит согласно одному аспекту по меньшей мере из чего-либо одного или более из буфера, объемообразующего агента и стабилизатора. Согласно этому аспекту оценивают полезность поверхностно-активного вещества и используют его в случаях, когда слипание на этапе процесса лиофилизации или восстановления представляет собой проблему. Для поддержания стабильности рН состава во время лиофилизации вводят подходящий буферизирующий агент.
Стандартный способ восстановления лиофилизированного материала заключается в повторном добавлении объема чистой воды или стерильной воды для инъекций (ΥΡΙ) (как правило, эквивалентного объему, удаленному во время лиофилизации), хотя при получении фармацевтиков для парентерального введения иногда применяют разбавленные растворы антибактериальных агентов [СЛеп. Эгид Оеуе^ртеп1 ;·ιηά Ιηάιικίπηί Рйагтасу, 18:1311-1354 (1992)]. Соответственно, предложены способы получения восстановленных композиций рекомбинантного νΥΡ, включающие этап добавления разбавителя к лиофилизированной композиции рекомбинантного νΥΡ согласно настоящему изобретению.
Лиофилизированный материал может быть восстановлен в виде водного раствора. Различные водные носители, например, стерильная вода для инъекций, вода с консервантами для многодозового применения или вода с подходящим количеством поверхностно-активных веществ (например, водная суспензия, которая содержит активное соединение в смеси с вспомогательными веществами, подходящими для получения водных суспензий). Согласно различным аспектам такие вспомогательные вещества представляют собой суспендирующие агенты, например, и без ограничения, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовую камедь и аравийскую камедь; диспергирующие или смачивающие агенты представляют собой встречающиеся в природе фосфатиды, например, и без ограничения, лецитин или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, и без ограничения, полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, и без ограничения, гептадекаэтиленоксицетанолом, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такими как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гексита, например, и без ограничения, такими как полиэтиленсорбитанмоноолеат. Согласно различным аспектам указанные водные суспензии также содержат один или более консервант, например, и без ограничения, этил или н-пропил, п-гидроксибензоат.
Для введения композиций человеку или экспериментальным животным, согласно одному аспекту, указанные композиции содержат один или более фармацевтически приемлемый носитель. Выражения "фармацевтически" или "фармакологически" приемлемый относятся к молекулярным субстанциям и композициям, которые стабильны, подавляют разложение белков, например агрегацию и продукты расщепления, и, кроме того, не вызывают аллергических или другие нежелательные реакции при введении с применением путей, общеизвестных в данной области техники, согласно приведенному ниже описанию. "Фармацевтически приемлемые носители" включают любые и все из клинически полезных растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических и задерживающих абсорбцию агентов и т.п., включая агенты, описанные выше.
Указанные фармацевтические составы вводят внутривенно, перорально, местно, трансдермально, парентерально, путем ингаляции, вагинально, ректально или путем внутричерепной инъекции. Используемый в настоящей заявке термин "парентеральный" включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрацистернальные инъекции или инфузионные техники. Также включено введение путем внутривенной, внутрикожной, внутримышечной, интрамаммарной, внутрибрюшинной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилегочной инъекции и/или хирургической имплантации в конкретный участок. Как правило, композиции, по существу, не содержат пирогенов, а также других примесей, которые могут быть вредными для реципиента.
- 50 029503
Однократное или многократное введение указанных композиций выполняют с применением дозировок и схем, выбранных лечащим врачом. Подходящая для предотвращения или лечения заболевания дозировка зависит от типа заболевания, лечение которого проводят, тяжести и течения заболевания, от того, вводится ли лекарственное средство с профилактической или терапевтической целью, от предшествующей терапии, истории болезни пациента и реакции на лекарственное средство, и на основании выбора лечащего врача.
Согласно одному аспекту составы согласно настоящему изобретению вводят сначала в виде болюса, а затем следует непрерывная инфузия для поддержания терапевтических циркулирующих уровней лекарственного продукта. В другом примере соединение согласно настоящему изобретению вводят в виде однократной дозы. Специалисты в данной области техники смогут легко оптимизировать эффективные дозировки и схемы введения в соответствии с надлежащей медицинской практикой и клиническим состоянием пациента. Частота введения доз зависит от фармакокинетических параметров агентов и пути введения. Оптимальный фармацевтический состав определяет специалист в данной области техники в зависимости от пути введения и требуемой дозировки. См., например, РепипдЮп'з РНагтасси11са1 8с1еисе5, 18ΐΠ Εά. (1990, Маск РиЫЫйпд Со., ЕазЮц Ра. 18042), стр. 1435-1712, включенные в настоящую заявку посредством ссылки. Такие составы влияют на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ίη νίνο и скорость клиренса ίη νίνο введенных агентов. В зависимости от пути введения подходящую дозу вычисляют в соответствии с массой тела, площадью поверхности тела или размером органа. Подходящие дозировки могут быть уточнены посредством стандартных способов определения уровней дозы в крови в сочетании с подходящими данными о зависимости доза-эффект. Окончательный режим дозирования определяет лечащий врач с учетом различных факторов, модифицирующих действие лекарственных средств, например удельной активности лекарственного средства, тяжести поражения и отклика пациента, возраста, состояния, массы тела, пола и рациона питания пациента, тяжести любой инфекции, времени введения и других клинических факторов. Например, типичная доза рекомбинантного у\УР согласно настоящему изобретению составляет приблизительно 50 Е/кг, что равно 500 мкг/кг. По мере проведения исследований появляется дополнительная информация относительно подходящих уровней дозировок и продолжительности лечения различных заболеваний и состояний.
Способы лечения.
Настоящее изобретение также охватывает способы лечения пациента, нуждающегося в гУ\УР или гА13, полученных согласно способам, описанным в настоящей заявке. Такие способы лечения могут включать введение фармацевтических составов, содержащих рекомбинантный гА13 или высокомолекулярный рекомбинантный ν^Ε согласно настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способы терапевтического или профилактического лечения, включающие введение композиции гУ\УР или гА13, предложенной в настоящем изобретении. Как правило, для терапевтического применения составы вводят пациенту с заболеванием или состоянием, связанным с дисфункцией АЭАМТ813 или У\УЕ или нуждающемуся в этом по иной причинам, в "терапевтически эффективной дозе". Составы и количества, эффективные для указанного применения, зависят от тяжести указанного заболевания или состояния и от общего состояния здоровья пациента. В зависимости от дозировки и частоты, требуемых и переносимых пациентом, может осуществляться однократное или многократное введение указанных составов.
Согласно одному из вариантов реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены способы лечения или предотвращения заболеваний или состояний, связанных с дисфункцией АОАМТ813 или У\УР. Согласно дальнейшему варианту реализации фармацевтические составы, содержащие рекомбинантный ν^Τ, могут вводиться для лечения заболеваний, связанных с ν^Ε, таких как болезнь Виллебранда или гемофилия. Согласно другому варианту реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены способы лечения или предотвращения заболеваний или состояний, связанных с образованием и/или присутствием одного или более тромба, включающие введение композиции гА13, предложенной в настоящей заявке. Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает способы разрушения одного или более тромба у нуждающегося в этом пациента. Согласно другим вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает способы лечения или предотвращения инфаркта у нуждающегося в этом пациента. Как правило, предложенные в соответствии с настоящим изобретением способы включают введение композиции тАЭАМТ813 согласно настоящему изобретению нуждающемуся в этом пациенту.
Неограничивающими примерами расстройств, связанных с образованием и/или присутствием одного или более тромба, являются наследственная тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТП), приобретенная ТТП, артериальный тромбоз, острый инфаркт миокарда (ОИМ), инсульт, сепсис и диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС).
Неограничивающие примеры расстройств, связанных с инфарктом, включают без ограничения инфаркт миокарда (сердечный приступ), эмболию легких, цереброваскулярные нарушения, такие как инсульт, окклюзионная болезнь периферических артерий (например, гангрена), антифосфолипидный синдром, сепсис, гигантоклеточный артериит (ГКА), грыжа и заворот кишок.
- 51 029503
Примеры
Настоящее изобретение будет также проиллюстрировано следующими примерами, не ограничиваясь ими.
Пример 1.
Эксперименты с непрерывной культурой клеток проводили с применением культуры рекомбинантной клеточной линии СНО, экспрессирующей νΥΡ. Основная среда представляла собой ОМЕМ/Е12, содержащую приблизительно 0,3 мкг/л Си2'. В указанную среду был добавлен соевый гидролизат и сульфат меди (Си8О4-5Н2О) с получением конечной концентрации меди в среде выше чем по меньшей мере 2,4 мкг/л.
Рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие νΥΡ, культивировали в непрерывной клеточной культуре таким образом, что уровни аммония (ΝΉ4 +) находились на уровне концентрации менее чем приблизительно 10 мМ. Было обнаружено, что системы производства, обеспечивающие непрерывное поступление среды (например, перфузионные или хемостатические культуры) предпочтительны, так как стандартные техники периодических или подпитываемых культур приводят к высоким концентрациям ΝΉ4 + в конце культивирования. В конце культивирования выделяли высокомультимерный νΥΡ и измеряли удельную ристоцетин-кофакторную активность νΥΡ.
Пример 2.
Рекомбинантный фактор VIII (гЕАШ) и фактор фон Виллебранда (τνΥΡ) коэкспрессировали в периодических культурах клеток ΟΌ8/6 для определения эффекта состава культуральной среды на экспрессию и активность νΥΡ. Вкратце, клетки ΟΌ8/6 культивировали в непрерывном режиме в среде ΒΑV-δР, состоящей из порошка модифицированной основной среды ОМЕМ/Е12 (табл. 5) и дополнительных добавок, также содержащих 4 г/л соевого гидролизата, см. табл. 6, с добавлением или без добавления дополнительной меди. Для исследования эффекта низких концентраций меди на экспрессию и активность τνΥΡ использовали основные ΒΑV-δР среды. Указанные основные среды содержали 0,3 мкг/л меди и добавленный соевый гидролизат, что добавляло еще 0,7 мкг/л меди, как было установлено экспериментально, с получением конечной концентрации меди 1,0 мкг/л. Для сравнения в среды ΒΑV-δР, используемые для периодических культур, также добавляли дополнительно 3,3 мкг/л Си2', что давало конечную концентрацию меди 4,3 мкг/л, для определения действия высоких концентраций меди на экспрессию и активность νΥΡ.
- 52 029503
Таблица 5
Состав культуральных сред ВАУ-БР
: VI. Среда ВАУ-8Р
Компоненты мг/л
Аминокислоты
Ь-Аланин 4,45
Ь-Аргинин НС1 147,50
Ь-Аспарагин-НгО 30,21
Ь-Аспарагиновая кислота 6,65
Ь-Цистеин НС1-Н2О 32,55
Ь-Цистин 2НС1 57,35
Ь-Г лутаминовая кислота 7,35
Г лицин 18,75
Ь-Гистидин-Н2О НС1 31,48
Г идрокси-Ь-Пролин
Ь-Изолейцин 54,47
Ь-Лейцин 59,05
Ь-Лизин НС1 91,25
Ь-Метионин 17,24
Ь-Фенилаланин 35,48
Ь-Пролин 52,24
Ь-Серин 26,25
Ь-Треонин 53,45
Ь-Триптофан 29,01
Ь-Тирозин 2Νη 2Н2О 55,79
Ь-Валин 52,85
Витамин
Аскорбиновая кислота 3,499
Биотин 0,0035
Холинхлорид 8,980
ϋ-Са-Пантотенат 2,240
Фолиевая кислота 2,650
1-Инозитол 12,600
Никотинамид 2,020
Пиридоксин НС1 2,031
Рибофлавин 0,219
Тиамин НС1 2,170
Витамин В12 0,680
Неорганические соли
Кальция хлорид (СаС12) 116,600
Сульфат меди (Си8О4.5Н2О) 0,0013
Нитрат железа (Ρε(ΝΟ3)3-9Η2Ο) 0,050
Сульфат железа (Ре8О4-7Н2О) 0,417
Хлорид магния (МдС12) 28,640
Сульфат магния (Мд8О4) 48,840
Хлорид калия (КС1) 311,800
Хлорид натрия (ЫаС1) 6995,500
Фосфат натрия (Ыа2НРО4) 71,020
Фосфат натрия (ЫаН2РО4) 62,500
Гептагидрат сульфата цинка (ΖηδΟ4-7Η2Ο) 0,432
Селенит натрия 0,0131
Другие
ϋ-Глюкоза 3151
Линолевая кислота 0,042
Липоевая кислота 0,105
Путресцин 2НС1 0,081
Тимидин 0,365
Гипо ксантин № 2,390
Пируват натрия 55,000
Таблица 6
Состав добавки для ВАУ-БР
Компоненты конечного состава
Ь-Глутамин 600,00
Этаноламин 1,530
Зуиретошс Р68 250,000
Бикарбонат натрия (ЧаНСОЗ) 2000,000
Соевый пептон 4000,00
Общий состав 18596,8
Клетки 01)8/6, экспрессирующие гУ^Р, культивировали либо в среде с низким содержанием меди (табл. 7), либо в среде с высоким содержанием меди (табл. 8) в течение 7 дней. Через 2 дня культуры пересевали для проведения периодического культивирования на протяжении 5 дней. Образцы указанного
- 53 029503
культурального супернатанта ежедневно исследовали на содержание гУ\УР (ν^Ρ ΕΟδΑ), общую (ристоцетин) и удельную (удельную активность) с применением ристоцетин-кофакторного анализа. Различные параметры культивирования, включая количество клеток, жизнеспособность клеток и концентрацию аммония также отслеживали ежедневно (кроме дней периодического культивирования 3 и 4).
Неожиданно было обнаружено, что культуры клеток, росшие при высоких концентрациях меди, давали супернатанты, имеющие значительно более высокую общую и удельную гУ\УР-активность (ср. результаты в табл. 7 и 8). Например, на 4 день периодического культивирования культура клеток, росшая при высоких концентрациях меди, имела 1,52 ΜΕ гУ\УР активности/мл по сравнению с 0,2 ΜΕ гУ\УР активности/мл для культуры с низким содержанием меди, несмотря на тот факт, что культура с низким содержанием меди клеток давала почти в два раза большее количество гУ\УР по сравнению с культурой клеток с высоким содержанием меди. Кроме того, удельная активность супернатанта, полученного из культуры с высоким содержанием меди, была более чем в 13 раз выше, чем у супернатанта культуры с низким содержанием меди (831 мЕ/10 мкг гУ\УР к 62 мЕ/10 мкг гУ\УР).
Как видно из табл. 7 и 8, общая и удельная ристоцетин-кофакторная активность культуры с высоким содержанием меди была в два раза выше таковой культуры с низким содержанием меди на 1 день периодического культивирования. Кроме того, в отличие от последующего увеличения активности, наблюдаемого в культуре с высоким содержанием меди, в культуре клеток с низким содержанием меди не было отмечено увеличения ристоцетин-кофакторной активности после 1 дня периодического культивирования. В соответствии с этим результатом анализ мультимерного статуса гУ\УР электрофорезом в агарозном геле показал, что в супернатанте культуры клеток с низким содержанием меди в 1 день периодического культивирования присутствовала низкая относительно концентрации низкомолекулярных видов гУ\УР концентрация высокомолекулярного гУ\УР, и также что указанная относительная концентрация снижалась с течением времени (фиг. 1Α и 1В). Напротив, добавление в культуральную среду Си2+ стабильно приводило к образованию антигена с ристоцетин-кофакторной (КгСоР) активностью на протяжении четвертого дня. В соответствии с этим, уменьшения количества стабильных высокомолекулярных мультимеров гУ\УР в течение дня 4 периодической культуры не происходило (фиг. 1Α и 1В). Результаты денситометрии агарозного электрофоретического геля, приведенные на фиг. 1В, показали, что при условии низкого уровня меди культура способна продуцировать только популяцию гУ\УР, более чем 10% гУ\УР которой (т.е. 16,3%) представлено молекулами из более чем 10 димеров, в течение одного дня периодического культивирования (т.е. образец "дня 3" в 2 полосе агарозного геля на фиг. 1Α); примечательно, что эта популяция опускалась до всего лишь 4% на день 5 периодического культивирования (образец "дня 7" в полосе 6). Напротив, в условиях высокого содержания меди относительное количество мультимеров У\УР, состоящих из более чем 10 димеров, стабильно составляет около 30% на протяжении дня 4 в периодической культуре ("день 3" - "день 6" в полосах 7-10; 28-31,4%).
Примечательно, что начиная с 5-го дня периодического культивирования культуры с высоким содержанием меди, когда уровни ΝΉ4 + превышали 100 мг/л (выше чем приблизительно 5,0 мМ), экспрессия дополнительного антигена (18,3-35,4 мкг/л; ср. дни периодического культивирования 4 и 5 в табл. 8) не приводила к сопутствующему увеличению КгСоР-активности в супернатанте. В соответствии с этим результатом уровень высокомолекулярных мультимеров гУ\УР на 5 день периодического культивирования (7 день культивирования) снижался относительно концентрации низкомолекулярных мультимеров гУ\УР. Также только на 5 день периодического культивирования (образец "дня 7" культуры в полосе 11) относительное количество у\УР, состоящего из более чем 10 димеров, снижается до 21,4%.
В совокупности приведенные выше данные показывают, что дополнительная концентрация меди в культурах клеток, экспрессирующих гУ\УР, существенно увеличивает общую и удельную ристоцетинкофакторную активность гУ\УР, а также стабильную выработку высокомолекулярных мультимеров гУ\УР. Кроме того, эти данные выявляют корреляцию между высокими концентрациями ΝΉ4 + в культуре клеток и снижением ристоцетин-кофакторной активности гУ\УР и выработки высокомолекулярного мультимерного гУ\УР.
- 54 029503
Таблица 7
Экспрессия гУ\Р в культурах клеток млекопитающих при периодическом режиме культивирования с применением сред ΒΑν-δΡ с низкой концентрацией меди (1,0 мкг/л)
день периодического культивирования Количество клеток [10Е6 клеток/мл] νη4 + [мг/л] Жизнеспособность [%] νλΥΕ ЕЫ5А [мкг/мл] Ристоцетин [МЕ/мл] Удельная активность мЕ/10мкг
0 0,42 21 98,8 и.о. н.о. н.о.
1 0,78 43 и.о. 6,3 0,23 365
2 1,24 64 99,1 12,8 0,23 180
3 1,86 и.о. и.о. 22,7 0,21 93
4 2,49 и.о. и.о. 32,2 0,20 62
5 3,11 106 98,3 44,4 0,20 45
Таблица 8
Экспрессия гУ\Г' в культурах клеток млекопитающих, культивируемых в периодическом режиме с применением ΒΑν-δΡ сред с высокой концентрацией меди (4,3 мкг/л)
день периодического культивирования Количество клеток [10Е6 клеток/мл] νη4 + [мг/л] Жизнеспособность [%] ν\¥Ρ ЕЫ8А [мкг/мл] Ристоцетин [МЕ/мл] Удельная активность мЕ/10мкг
0 0,40 21 99,3 н.о. н.о. н.о.
1 0,71 42 н.о. 4,8 0,40 833
2 1,23 63 99,5 8,7 0,62 713
3 1,85 н.о. н.о. 15,0 1,07 713
4 2,54 н.о. н.о. 18,3 1,52 831
|5 |3,32 |109 |98,9 |35,4 |ΐ,55 |438 |
Пример 3.
Рекомбинантный фактор VIII (ΐ'ΡνίΙΙ) и фактор фон Виллебранда (Γν\Ρ) коэкспрессировали в непрерывных культурах клеток ΘΌ8/6, эксплуатируемых в хемостатических условиях, для определения эффекта состава культуральной среды на экспрессию и активность ν\Ρ. Вкратце, клетки ΘΌ8/6 культивировали в среде ΒΑν-δΡ, содержащей 4 г/л соевого гидролизата с добавлением и без добавления меди согласно описанию в примере 2. Для исследования эффекта низких концентраций меди на экспрессию и активность применяли основные среды ΒΑν-δΡ. Указанные основные среды содержали 0,3 мкг/л
меди и добавленный соевый гидролизат, что давало дополнительные 0,7 мкг/л меди с получением конечной концентрации меди 1,0 мкг/л. Для сравнения в периодических культурах применяли среды ΒΑν-δΡ также с добавлением дополнительных 3,3 мкг/л Си2+, с получением конечной концентрации меди 4,3 мкг/л, для определения эффекта высоких концентраций меди на экспрессию и активность ν\Ρ. Культуры, растущие в присутствии высоких и низких концентраций меди, культивировали как при высокой (2,8х 106 клеток/мл), так и при низкой (прибл. 1,4х10Е06 клеток/мл) плотности клеток.
Как и ранее, образцы указанного культурального супернатанта исследовали на γϋΑΡ содержание (ν\Ρ ΕΡΙδΑρ общую (ристоцетиновую) и удельную (удельную активность) активность посредством ристоцетин-кофакторного анализа. Также отслеживали различные параметры культуры, включая количество клеток, жизнеспособность клеток и концентрацию аммония. Данные получали на основании фазы стационарного состояния недель 2 и 3 хемостатической культуры (табл. 9-13).
Таблица 9
Средние данные по экспрессии ΐ'ννΡ в хемостатической культуре клеток на протяжении недель 2 и 3
Количество клеток Концентрация меди Количестве клеток [ЮЕ6 . , клеток/мл] 1 νη4 + |м\1| Жизнеспособность [%] у\УР ЕЫ8А [мкг/мл] Ристоцетин [МЕ/мл] удельная активность [мЕ/10мкг]
1о\л/ 2.88 3.88 97.74 44.56 0.10 21.62
ЫёН ЫёН 2.79 4.04 98.25 38.38 0.19 53.11
Ιονν Ιονν 1.55 3.33 98.63 18.96 0.10 50.16
Ιονν 1.43 3.17 98.59 11.76 0.70 598.76
- 55 029503
Таблица 10
Экспрессия ιΎ\\Τ в хемостатической культуре клеток в условиях большого количества клеток и низкого уровня меди на протяжении недель 2 и 3
День Количество клеток [10Е6 клеток/мл] νη4 + {мМ1 7--Жизнеспособность [%] ν\ΥΓ ЕЫ8А [мкг/мл] Ристоцетин [МЕ/мл1 удельная активность ]мЕ/10мкг]
8 2.54 3.7 98.20 39.8 0.095 23.86934673
9 3.02 4.2 97.40
10 2.97 3.9 97.90 41.3 0.095 23.00242131
11 2.78
13 2.91 3.8 97.60 41.7 0.095 22.78177458
14 2.90 3.8 97.40
15 3.05 3.9 97.70 44.7 0.095 21.25279642
16 2.99 3.8 98.30
17 2.76 3.9 97.40 55.3 0.095 17.17902351
2.88 3.88 97.74 44.56 0.10 21.62
Таблица 11
Экспрессия ιΎ\·ΥΊ; в хемостатической культуре клеток в условиях большого количества клеток и высоких уровней меди на протяжении недель 2 и 3
День Количество клеток [10Е6 клеток/мл] νη4 + (мМ| Жизнеспособность [%] νννΡ ЕЫЗА ]мкг/мл] Ристоцетин [МЕ/мл] удельная активность [мЕ/14)мкг]
8 2.52 3.9 98.30 31.8 0.35 110.0628931
9 2.92 4.3 98.50
10 2.80 4.2 98.60 37.4 0.32 85.56149733
11 2.57
13 2.81 3.9 98.50 37.6 0.095 25.26595745
14 2.92 3.9 97.80
15 2.77 3.9 97.80 43.0 0.095 22.09302326
16 2.72 4.0 98.30
17 3.04 4.1 98.20 42.1 0.095 22.56532067
2.79 4.04 98.25 38.38 0.19 53.11
низкого уровня меди на протяжении недель 2 и 3
Таблица 12
Экспрессия гУ^Р в хемостатической культуре клеток в условиях маленького количества клеток,
День Количество клеток [10Е6 клеток/мл] νη4 + ΙμΜΙ Жизнеспособность [%] νλ¥Ρ ЕЫ8А ]мкг/мл] Ристоцетин [МЕ/мл] удельная активность [мЕ/10мкг]
8 1,61 3,3 99,10 19,3 0,095 49,22279793
9 1,65 3,3 98,00
10 1,49 3,3 98,90 18,6 0,095 51,07526882
11 1,58
13 1,58 3,4 98,10 18,1 0,095 52,48618785
14 1,56 3,3 99,30
15 1,52 3,3 98,50 18,9 0,095 50,26455026
16 1,50 3,3 98,40
17 1,50 3,4 98,70 19,9 0,095 47,73869347
1,55 | 3,33 |98,63| 18,96 | 0,10 | 50,16
- 56 029503
Таблица 13
Экспрессия ΓννΡ в хемостатической культуре клеток в условиях маленького количества клеток, высокого уровня меди на протяжении недель 2 и 3
День Количество клеток [10Е6 клеток/мл] ΝΗ4+ [мМ] Жизнеспособность [%] ν\ΥΙ ЕЫ8А [мкг/мл] Ристоцетин [МЕ/мл] удельная активность [мЕ/10мкг]
8 1,46 3,2 98,80 11,6 0,73 629,3103448
9 1,45 3,2 98,20
10 1,37 3,1 98,90 11,0 0,7 636,3636364
11 1,43
13 1,33 3,2 98,10 11,1 0,68 612,6126126
14 1,39 3,2 97,20
15 1,51 3,2 99,70 12,4 0,69 556,4516129
16 1,49 3,2 98,60
17 1,43 3,2 99,20 12,7 0,71 559,0551181
1,43 3,17 98,59 11,76 0,70 598,76
Как показано на фиг. 2А, супернатант, собранный из непрерывной ΓννΡ-культуры клеток, выращенной при низкой плотности клеток и высоких концентрациях меди, имел высокую удельную активность (в среднем 600 мЕ/10 мкг), в то время как супернатанты, собранные из ΓννΡ-культур клеток, выращенных при высокой плотности клеток в присутствии высоких или низких концентраций меди, и ΓννΡ-культур клеток, выращенных при низкой плотности клеток в присутствии низкой концентрации меди, имели низкие удельные активности (менее чем 100 мЕ/10 мкг). В соответствии с результатами, полученными для периодических культур, как видно из фиг. 2В, непрерывные культуры клеток млекопитающих, экспрессирующие ΓννΡ с высокой удельной активностью, содержат более низкие ΝΉ4+ концентрации, чем культуры, продуцирующие ΓννΡ с низкой удельной активностью. Эти данные также подтверждают корреляцию между концентрацией N1./ в культуре клеток и удельной активностью ΓννΡ, продуцируемого указанной культурой. Примечательно, что комбинация высокой концентрации меди и низкой концентрации аммония в культуре клеток позволяла добиться значительного повышения активности ΓννΡ.
В соответствии с этим результатом, анализ мультимерного статуса ΓννΡ в хемостатических культурах с помощью электрофореза в агарозном геле (фиг. 6) показал, что только супернатанты культур, эксплуатируемых при высоком содержании меди и низкой плотности клеток и, таким образом, низком содержании аммония, обеспечивали устойчивую экспрессию высокомультимерного ννΡ (приблизительно 23-27% в дни С8Т 8, 17 и 24, полосы 4, 8 и 12 соответственно). Все прочие условия не обеспечивали устойчивого достижения большого количества - более чем 10% ννΡ, содержащего более чем 10 димеров, на протяжении длительного периода культивирования.
Пример 4.
Для определения эффекта концентрации меди в культуральной среде на экспрессию и удельную активность гА13 культуры клеток млекопитающих для экспрессии гА13 культивировали в течение 4 недель в условиях хемостатической непрерывной культуры в среде Л1)Л\1Т813, включающей модифицированные основные среды ΏΜΕΜ/Ρ12 ВЕ8Р845 и дополнительные добавки (табл. 14), содержащие медь в диапазоне концентраций от 0,66 мкг/л (без дополнительного добавления меди) и с дополнительным добавлением меди до 4 мкг/л. Как видно из табл. 15, возрастающая концентрация меди в среде для клеточных культур приводила к значительному увеличению объемной (Р) и удельной (ц) продуктивности, выражаемой в виде общей активности гА13, полученного на 1 л культуры в день, и общей активности полученного гА13 на клетку в день соответственно.
- 57 029503
Таблица 14
Состав среды для получения ЛОЛМТ813
1)МЕМ/Г12 ВЕ8Р845
Аминокислоты мг/л
Ь-Аланин 13,3500
Ь-Аргинин НС1 147,5000
Ь-Аспарагин-Н2О 45,1600
Ь-Аспарагиновая кислота 19,9500
Ь-Цистеин НС1-Н2О 32,5500
Ь-Цистин 2НС1 102,3500
Ь-Глутаминовая кислота 22,0500
Г лицин 26,2500
Ь-Гистидин-Н2О НС1 51,4800
Ь-Изолейцин 74,4700
Ь-Лейцин 119,0500
Ь-Лизин НС1 146,2500
Ь-Метионин 100,0000
Ь-Фенилаланин 60,4800
Ь-Пролин 63,7400
Ь-Серин 36,7500
Ь-Треонин 53,4500
Ь-Триптофан 29,0100
Ь-Тирозин 2№ 2Н2О 75,7900
Ь-Валин 82,8500
соли мг/л
Кальция хлорид (СаС12) 116,6000
Сульфат меди (Си8О4.5Н2О) 0,0026
Нитрат железа (Ре(ЫОз)3-9Н2О) 0,0500
Сульфат железа (Ре8О4-7Н2О) 1,0170
Хлорид магния (МдС12) 28,6400
Сульфат магния (Мд8О4) 48,8400
Хлорид калия (КС1) 311,8000
Хлорид натрия (ЫаС1) 5495,5000
№2НРО4 Безводный 213,0200
№Н2РО4 Безводный 54,3500
Гептагидрат сульфата цинка (ΖηδΟ4-27Η2Ο) 0,4320
Селенит натрия, безводный 0,0087
Витамин мг/л
Аскорбиновая кислота 3,4990
Биотин 0,2035
Холинхлорид 26,9800
ϋ-Са-Пантотенат 6,2400
Фолиевая кислота 6,6500
1-Инозитол 36,6000
Никотинамид 7,0200
Пиридоксин НС1 6,0310
Рибофлавин 0,6590
Тиамин НС1 6,5100
Витамин В12 2,6800
другое мг/л
ϋ-Глюкоза 5000,0000
Линолевая кислота 0,0420
Липоевая кислота 1,0050
Путресцин 2НС1 3,6810
Тимидин 0,3650
Гипо ксантин Ыа 2,3900
Пируват натрия 55,0000
ϋΜΕΜ/Ε12 ВЕ8Р845: всего 12738,3
ΑϋΑΜΤδ-13 Средовые добавки мг/л
Ь-Г лутамин 1300,0000
Р1игошс Р68 1000,0000
Этаноламин 1,5300
Ζηδο4*7 Н2О 1,0000
\'а-Г идрокарбонат 1500,0000
Всего добавок 3802,5
Общее количество ингредиентов 16540,8
Чтобы определить, влияют ли повышенные концентрации меди на сохранность экспрессируемого гА13, супернатант, собранный от гА13-культур клеток, выращенных в среде, содержащей 0,66, 1 и 4 мкг/л меди, исследовали с помощью анализа ДСН-ПААГ. Как видно из фиг. 3А (окрашивание серебром) и фиг. 3В (анти-А13 вестерн-блоттинг), очевидных изменений в качестве продукта при гель- 58 029503
электрофорезе не наблюдается. Так, экспрессия гА13 в присутствии повышенных концентраций меди не приводит к повышению уровня усеченного 170 кДа или других низкомолекулярных вариантов гА13, и к появлению дополнительных или увеличению полос, соответствующих НСР (белкам клеток-хозяев).
При расчете оптимальной концентрации меди для активности гА13 экстраполирование данных из табл. 15 о зависимости Р Рге18 от концентрации меди (фиг. 4) показывает, что оптимальный эффект, очевидно, достигается при приблизительно 2 мкг/л, с негативным влиянием по консервативной оценке при более чем приблизительно 4 мкг/л.
Таблица 15
Экспрессия гА13 в культурах клеток млекопитающих при хемостатическом режиме непрерывного культивирования с применением среды содержащей различные концентрации меди
Объем 10 л Κ&ϋ (НИР) эксперимент Среднее за 4 недели С8Т ΖΖ-ΝΟ Р РгеЪ (1 ГгеП Уд. активность
[10Е6 клеток/мл] [Е/(л*д)1 [Е/(10Е9 клетки* д)1 Е/мг
0,66 мкг/л Си2+ 1,35 1322 1028 1759
1 мкг/л Си2+ 1,64 1962 1247 1690
4 мкг/л Си2+ 2,26 2960 1338 1768
На основании полученных результатов, описанных выше, был проведен дополнительный эксперимент для сравнения экспрессии гА13 в среде для клеточных культур, содержащей 0,66 мкг/л меди и содержащей 2,0 мкг/л меди. Как видно из табл. 16, добавление в основные клеточные среды меди до конечной концентрации 2,0 мкг/л меди приводило к значительному повышению объемной (Р) и удельной (ц) продуктивности, выраженной в виде общей активности гА13, полученного на 1 л культуры в день, и общей активности гА13, полученного на клетку в день, соответственно, на протяжении 8 недель. Конкретные данные для каждой недели выработки гА13 в двух указанных культурах приведены на фиг. 5. Из этих данных очевидно следует, что добавление меди оказывает измеряемый благоприятный эффект на метаболизм клеток, удельную скорость роста и выработку гА13.
Таблица 16
Экспрессия гА13 в культурах клеток млекопитающих при хемостатическом режиме непрерывного культивирования с применением среды, содержащей различные концентрации меди
Объем 10 л ΖΖ-ΝΟ Р Гге18 ц Рге18 Уд. активность
Среднее за 8 недель С8Т [10Е6 кл./мл] [Е/(л*д)] [Е/(10Е9 кл.*д)] Е/мг
0,66 мкг/л Си2+ 1,29 1049 821 1862
2 мкг/л Си2+ 2,17 2470 1146 1749
Понятно, что примеры и варианты реализации, описанные в настоящей заявке, приведены исключительно для наглядности, и что различные модификации или изменения с учетом таковых будут понятны специалистам в данной области техники, подлежат включению в суть и объем настоящей заявки и подпадают под действие прилагаемой формулы изобретения. Все упоминаемые в настоящей заявке публикации, патенты и патентные заявки включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения композиции рекомбинантного АПАМТ313 (гА13), включающий следующие стадии:
    a) обеспечение основной среды для культуры клеток;
    b) добавление в указанную основную среду для клеточных культур меди для обеспечения конечной концентрации меди от 1,0 до 20 мкг/л;
    c) обеспечение популяции клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок гА13;
    б) культивирование указанной популяции клеток в указанной среде для клеточных культур с добав- 59 029503
    лением меди таким образом, что происходит экспрессия и секреция γΑ13 из указанных клеток в культуральную среду, где содержание ΝΉ4 + в указанной культуре клеток поддерживают на уровне концентрации ниже 10 мМ;
    е) отделение по меньшей мере части указанной культуральной среды,
    причем в указанной отделенной культуральной среде присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности ΡΚΕΤδ-νΥΡ73 на 1 л дополненной основной среды для клеточных культур в день.
    2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная основная среда для культуры клеток представляет собой не содержащую животных белков культуральную среду, не содержащую белков культуральную среду или культуральную среду с заданным химическим составом.
    3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что конечная концентрация меди в указанной дополненной основной среде для культуры клеток составляет:
    a) по меньшей мере 2 мкг/л меди или
    b) по меньшей мере 4 мкг/л меди.
    4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что конечная концентрация меди в указанной дополненной основной среде для клеточных культур составляет от 1 до 6 мкг/л меди.
    5. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что конечная концентрация меди в указанной дополненной основной среде для клеточных культур составляет от 2 до 4 мкг/л меди.
    6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что клетки представляют собой клетки млекопитающего, в частности СНО.
    7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что культивирование клеток включает непрерывное культивирование указанных клеток.
    8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанное непрерывное культивирование клеток осуществляют в хемостатическом режиме или в режиме перфузии.
    9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что клетки культивируют по меньшей мере в 100 л указанной дополненной основной среды для клеточных культур.
    10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что плотность клеток поддерживают на протяжении этапа культивирования клеток на уровне:
    a) менее чем 4,0χ 106 клеток/мл;
    b) менее чем 3,5 χ 106 клеток/мл или
    c) менее чем 3,0χ 106 клеток/мл.
    11. Способ по п.10, отличающийся тем, что плотность клеток поддерживают на уровне от 3,0χ106 до 4,0χ106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования клеток.
    12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что
    a) в указанном отделенном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности ΡΚΕΤδ-νΥΡ73 на 1 л дополненной основной среды для клеточных культур в день или
    b) в указанном отделенном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности ΡΚΕΤδ-νΥΡ73 на 1 л дополненной основной среды для клеточных культур в день.
    13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что отделенный супернатант обладает удельной ΡΚΕΤδ-νΥΡ73 активностью γΑ13, составляющей:
    a) по меньшей мере 800 мЕ/мкг;
    b) по меньшей мере 1200 мЕ/мкг или
    c) по меньшей мере 1600 мЕ/мкг.
    14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что содержание МН4 + в указанном супернатанте культуры клеток поддерживают на уровне концентрации ниже 5 мМ.
    15. Способ по любому из пп.1-14, дополнительно включающий этап обогащения γΑ13.
    16. Супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный Α^ΑΜΤ§13 (γΑ13), отличающийся тем, что указанный супернатант получают способом по любому из предшествующих пунктов.
    17. Композиция рекомбинантного Α^ΑΜΤ§13 (γΑ13) для лечения нарушения, связанного с формированием и/или присутствием тромба, где композицию получают способом по любому из пп.1-15.
    18. Композиция по п.17, где нарушением является тромботическая тромбоцитопеническая пурпура.
    19. Композиция по п.17, где нарушением является инфаркт.
    20. Композиция по п.17, где нарушением является инсульт.
    21. Композиция по любому из пп.17-20, отличающаяся тем, что указанную композицию получают в форме для внутривенного введения.
    - 60 029503
    Номер полосы Номер зоны Примеси Ιηί хщш Относит, кол-во 1 1 809715,2 74,5 1 2 277519,7 25,5 2 1 681110,1 83,7 2 2 132376,5 16,3 3 1 568177 90,2 3 2 61619,3 9,8 4 1 500725,4 94,0 4 2 31815,3 6,0 5 1 433194,4 95,9 5 4 18307,3 4,1 6 1 412190,2 95,9 6 2 17441 4,1 7 1 842215,1 72,0 7 2 327960,1 28,0 8 1 723836,4 70,5 8 2 303095,4 29,5 9 1 739912,7 68,7 9 2 337575,1 31,3 10 1 929848,4 68,6 10 2 425784,2 31,4 11 1 684679,9 78,6 11 2 185964,5 21,4 12 3 512298,6 66,7 12 4 256326,7 33,3
EA201390082A 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток EA029503B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36263510P 2010-07-08 2010-07-08
PCT/US2011/043459 WO2012006594A1 (en) 2010-07-08 2011-07-08 Method of producing recombinant adamts13 in cell culture

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201390082A1 EA201390082A1 (ru) 2013-06-28
EA029503B1 true EA029503B1 (ru) 2018-04-30

Family

ID=44514323

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202090067A EA202090067A3 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
EA202090220A EA202090220A3 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного высокомолекулярного vwf в культуре клеток
EA201792340A EA035147B1 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
EA201390082A EA029503B1 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
EA201390080A EA035066B1 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩЕГО, СОДЕРЖАЩЕЙ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР ФОН ВИЛЛЕБРАНДА (rVWF)

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202090067A EA202090067A3 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
EA202090220A EA202090220A3 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного высокомолекулярного vwf в культуре клеток
EA201792340A EA035147B1 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390080A EA035066B1 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩЕГО, СОДЕРЖАЩЕЙ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР ФОН ВИЛЛЕБРАНДА (rVWF)

Country Status (25)

Country Link
US (8) US8852888B2 (ru)
EP (6) EP3392271B8 (ru)
JP (3) JP6138683B2 (ru)
KR (4) KR102007773B1 (ru)
CN (4) CN107286235A (ru)
AU (6) AU2011274470B2 (ru)
BR (2) BR112013000515B1 (ru)
CA (2) CA2804275A1 (ru)
CO (2) CO6690745A2 (ru)
DK (3) DK2590998T3 (ru)
EA (5) EA202090067A3 (ru)
ES (4) ES2761692T5 (ru)
FI (1) FI3064508T4 (ru)
HR (3) HRP20192089T4 (ru)
HU (3) HUE046443T2 (ru)
IL (5) IL286298B (ru)
MX (3) MX353409B (ru)
NZ (2) NZ605403A (ru)
PL (4) PL2591094T3 (ru)
PT (3) PT2591094T (ru)
SG (3) SG186935A1 (ru)
SI (3) SI3064508T2 (ru)
TR (1) TR201815211T4 (ru)
TW (4) TWI617575B (ru)
WO (2) WO2012006591A1 (ru)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2009322367B2 (en) * 2008-12-05 2015-03-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of measuring ADAMTS13-mediated in vivo cleavage of von Willebrand factor and uses thereof
AU2010202125B1 (en) 2010-05-26 2010-09-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
WO2011150284A2 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Baxter International Inc. Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide
TR201815211T4 (tr) 2010-07-08 2018-11-21 Baxalta GmbH Hücre kültüründe rekombinant adamts13 üretmeye yönelik yöntem.
KR102319868B1 (ko) * 2011-06-10 2021-11-01 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 재조합 vwf의 투여에 의한 응고 질환의 치료
US9030963B2 (en) * 2012-12-03 2015-05-12 Honeywell International Inc. Analyzing a network topology
UY35343A (es) * 2013-02-26 2014-09-30 Bayer Healthcare Llc Formulaciones y procedimientos para la producción de proteína recombinante aumentada
US20140271622A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US9677105B2 (en) 2013-03-14 2017-06-13 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US8956830B2 (en) 2013-03-14 2015-02-17 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US9217168B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
AR095196A1 (es) * 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
AU2013203062C1 (en) * 2013-03-15 2018-06-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Subcutaneous administration of adamts13
WO2015158851A1 (en) * 2014-04-16 2015-10-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies for the prevention or the treatment of bleeding episodes
WO2015188224A1 (en) * 2014-06-13 2015-12-17 Csl Limited Improved production of recombinant von willebrand factor in a bioreactor
MA41685A (fr) 2014-10-17 2017-08-22 Biogen Ma Inc Supplémentation en cuivre pour la régulation de la glycosylation dans un procédé de culture cellulaire de mammifère
CA2973343C (en) * 2015-02-05 2023-08-08 R.P. Scherer Technologies, Llc Activated formylglycine-generating enzymes and methods of producing and using the same
AR104050A1 (es) * 2015-03-26 2017-06-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Proceso de producción con iones de cobre controlados
TWI797060B (zh) 2015-08-04 2023-04-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
BR112019002194A2 (pt) 2016-08-04 2019-05-21 Baxalta GmbH uso de adamts13 para tratar, melhorar e/ou prevenir a crise vaso-oclusiva na doença falciforme, lesão pulmonar aguda e/ou síndrome da insuficiência respiratória aguda
CN106957815B (zh) * 2017-03-16 2021-05-07 杨涛 一种用于人类多潜能干细胞的无血清培养基的配方
RU2766118C2 (ru) 2017-07-07 2022-02-08 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Лечение пациентов с тяжелой формой болезни фон виллебранда, подвергающихся плановому хирургическому вмешательству, путем введения рекомбинантного ффв
WO2019010497A1 (en) 2017-07-07 2019-01-10 Baxalta Incorporated TREATMENT OF GASTROINTESTINAL BLEEDING IN PATIENTS WITH A SEVERE FORM OF VON WILLEBRAND'S DISEASE BY RECOMBINANT VWF ADMINISTRATION
WO2019183290A1 (en) 2018-03-21 2019-09-26 Baxalta Incorporated Separation of vwf and vwf propeptide by chromatographic methods
JP2022524291A (ja) 2019-02-01 2022-05-02 武田薬品工業株式会社 組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）を使用する予防治療法
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
US10961500B1 (en) 2019-04-23 2021-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium for eukaryotic cells
US20220401524A1 (en) 2019-09-11 2022-12-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of treatment related to complexes of von willebrand factor and complement c1q
EP4100048A1 (en) 2020-02-04 2022-12-14 Takeda Pharmaceutical Company Limited Treatment of menorrhagia in patients with severe von willebrand disease by administration of recombinant vwf
WO2021234458A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 Takeda Pharmaceutical Company Limited Adamts13 compositions and methods for treating and diagnosing complications of coronavirus disease

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4767704A (en) * 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
WO2008109410A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Wyeth Use of copper and glutamate in cell culture for production of polypeptides
WO2009086309A2 (en) * 2007-12-27 2009-07-09 Baxter International Inc. Cell culture processes

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
NL8500961A (nl) 1985-04-01 1986-11-03 Stichting Vrienden Van De Stic Cdna-codering voor de humane von willebrand-factor, plasmiden met een dergelijke cdna-codering respektievelijk fragmenten ervan, alsmede micro-organismen, welke dergelijke plasmiden bevatten.
JPS62502589A (ja) 1985-04-11 1987-10-08 ザ・チヤイルドレンズ・メデイカル・センタ−・コ−ポレ−シヨン フオン・ビルブラント因子
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
WO1996015231A2 (en) 1994-11-10 1996-05-23 Immuno Aktiengesellschaft Method for producing biologicals in protein-free culture
JP3649249B2 (ja) 1995-02-23 2005-05-18 クエスト・インターナショナル・サービシーズ・ビー・ブイ 組織および細胞培養用ペプチド
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
AU4330597A (en) 1996-08-30 1998-03-19 Life Technologies, Inc. Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
US6458574B1 (en) * 1996-09-12 2002-10-01 Transkaryotic Therapies, Inc. Treatment of a α-galactosidase a deficiency
US6103529A (en) 1996-10-10 2000-08-15 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising peptides derived from rice
WO1998041611A1 (en) 1997-03-20 1998-09-24 Regents Of The University Of Minnesota Process for the continuous culture of cells
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AT407255B (de) 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
US6531577B1 (en) 1997-12-15 2003-03-11 Hemasure Denmark A/S von Willebrand factor (vWF)-containing preparation, process for preparing vWF-containing preparations, and use of such preparations
US6528286B1 (en) 1998-05-29 2003-03-04 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing glycoproteins
US6406909B1 (en) 1998-07-10 2002-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Serum-free medium for culturing animal cells
AT409379B (de) 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
JP2001120262A (ja) * 1999-10-26 2001-05-08 Welfide Corp 生理活性物質の産生増強方法
US6926894B2 (en) * 2000-11-22 2005-08-09 Baxter Aktiengesellschaft Composition exhibiting a von willebrand factor (vWF) protease activity comprising a polypeptide chain with the amino acid sequence AAGGILHLELLV
KR20040065231A (ko) * 2001-11-28 2004-07-21 산도즈 게엠베하 세포 배양 방법
WO2003054172A2 (en) * 2002-01-17 2003-07-03 Lonza Biologics Plc. Glutamine-auxothrophic human cells capable of producing proteins and capable of growing in a glutamine-free medium
US20050084828A1 (en) 2003-10-21 2005-04-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Apparatus and method for braille instruction
EP1593388A1 (en) 2004-05-05 2005-11-09 ZLB Behring GmbH Therapeutic plasma protein-concentrates containing von willebrand factor as high molecular weight multimers
TWI384069B (zh) * 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法
US20060094104A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
US8273553B2 (en) 2004-11-02 2012-09-25 Ares Trading S.A. Production of growth hormone in serum-free cell culture medium for mammalian cells
JP4833991B2 (ja) * 2004-11-02 2011-12-07 アレス トレーディング ソシエテ アノニム 哺乳動物細胞のための無血清細胞培養培地
US20070049557A1 (en) 2005-08-24 2007-03-01 Hashim Ahmed Solid pharmaceutical dosage forms comprising bisphosphonates and modified amino acid carriers
EP2522717B1 (en) 2006-01-04 2014-04-02 Baxter International Inc Oligopeptide-free cell culture media
US20070190057A1 (en) * 2006-01-23 2007-08-16 Jian Wu Methods for modulating mannose content of recombinant proteins
CN101490239A (zh) * 2006-07-14 2009-07-22 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 改进的细胞培养方法
TW201516149A (zh) * 2006-09-13 2015-05-01 Abbvie Inc 細胞培養改良
US7960869B2 (en) 2006-09-22 2011-06-14 Siemens Industry, Inc. Internal intelligence for remote operated relay
EP2114458B1 (en) * 2006-12-27 2014-02-26 Nektar Therapeutics Von willebrand factor- and factor viii-polymer conjugates having a releasable linkage
DE102007046611A1 (de) * 2007-09-28 2009-04-02 Osram Opto Semiconductors Gmbh Lichtquelle mit Konversionselement und Lichtwellenleiter, Verfahren zur Herstellung der Lichtquelle und deren Verwendung
HUE043863T2 (hu) 2007-12-31 2019-09-30 Baxalta GmbH Lényegében állati fehérjétõl mentes rekombináns furin és eljárás elõállítására
JP4458167B2 (ja) * 2008-01-11 2010-04-28 住友金属工業株式会社 熱間塑性加工用潤滑剤を用いる継目無管製造における外面潤滑方法
WO2009116044A2 (en) 2008-03-19 2009-09-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Compounds for treating bacterial infections
WO2009129379A1 (en) * 2008-04-17 2009-10-22 Wyeth Methods for enhanced production of bone morphogenetic proteins
US8486699B2 (en) * 2008-05-23 2013-07-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Immortal unipotent porcine PICM-19H and PICM-19B stem cell lines
US8580554B2 (en) 2009-07-31 2013-11-12 Baxter International Inc. Method of producing a polypeptide or virus of interest in a continuous cell culture
BR122021005965B1 (pt) * 2009-07-31 2022-01-25 Baxalta Incorporated Método para produzir uma composição de desintegrina e metaloproteinase com motivo trombospondina (adamts)
TR201815211T4 (tr) 2010-07-08 2018-11-21 Baxalta GmbH Hücre kültüründe rekombinant adamts13 üretmeye yönelik yöntem.
TWI408228B (zh) 2010-10-29 2013-09-11 Univ Nat Chunghsing 用於生產一標的蛋白質的核酸建構物、重組型載體以及方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4767704A (en) * 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
WO2008109410A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Wyeth Use of copper and glutamate in cell culture for production of polypeptides
WO2009086309A2 (en) * 2007-12-27 2009-07-09 Baxter International Inc. Cell culture processes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PLAIMAUER BARBARA ET AL: "Cloning, expression, and functional characterization of the von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13)", BLOOD, AMERICAN SOCIETY OF HEMATOLOGY, US, vol. 100, no. 10, 15 November 2002 (2002-11-15), US, pages 3626 - 3632, XP002292631, ISSN: 0006-4971, DOI: 10.1182/blood-2002-05-1397 *

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20180136T1 (hr) 2018-04-06
EP3909977A1 (en) 2021-11-17
EA035147B1 (ru) 2020-05-06
ES2694518T3 (es) 2018-12-21
US9409971B2 (en) 2016-08-09
DK3064508T3 (da) 2019-11-25
US20180044405A1 (en) 2018-02-15
US20150056657A1 (en) 2015-02-26
CA2804275A1 (en) 2012-01-12
ES2875772T3 (es) 2021-11-11
TW201204744A (en) 2012-02-01
US9834591B2 (en) 2017-12-05
IL223929A (en) 2017-11-30
PL3392271T3 (pl) 2021-11-15
AU2018200206B2 (en) 2020-05-28
KR101924120B1 (ko) 2018-11-30
EA202090067A3 (ru) 2020-07-31
NZ605404A (en) 2014-08-29
EP3064508B2 (en) 2023-03-15
EA201390080A1 (ru) 2013-06-28
KR20180099922A (ko) 2018-09-05
JP2013533748A (ja) 2013-08-29
JP5953502B2 (ja) 2016-07-20
EP3392271B8 (en) 2021-06-16
BR112013000515B1 (pt) 2021-11-03
EP3064508A1 (en) 2016-09-07
EP3064508B1 (en) 2019-08-28
PL3064508T3 (pl) 2020-02-28
JP2013538046A (ja) 2013-10-10
SI3064508T1 (sl) 2019-12-31
HUE038193T2 (hu) 2018-09-28
WO2012006594A1 (en) 2012-01-12
EP3626736A1 (en) 2020-03-25
AU2015207811B2 (en) 2017-10-19
CO6680636A2 (es) 2013-05-31
ES2664392T3 (es) 2018-04-19
MX2013000165A (es) 2013-06-05
US10822394B2 (en) 2020-11-03
US9458222B2 (en) 2016-10-04
EA202090220A3 (ru) 2020-08-31
TW201637665A (zh) 2016-11-01
HUE11738351T2 (hu) 2019-03-28
EP3392271A1 (en) 2018-10-24
JP6138683B2 (ja) 2017-05-31
CN108060154A (zh) 2018-05-22
PL2590998T3 (pl) 2018-05-30
AU2020203565A1 (en) 2020-06-18
BR112013000515A2 (pt) 2016-05-17
US20170008948A1 (en) 2017-01-12
KR101894604B1 (ko) 2018-09-03
SG10201809632XA (en) 2018-12-28
MX339632B (es) 2016-06-02
CN103097522A (zh) 2013-05-08
TWI617575B (zh) 2018-03-11
EA201792340A2 (ru) 2018-02-28
MX353409B (es) 2018-01-11
AU2020203565B2 (en) 2021-09-30
IL223930A (en) 2017-01-31
EP3392271B1 (en) 2021-05-05
AU2011274470A1 (en) 2013-01-24
AU2018200206A1 (en) 2018-04-05
KR102027991B1 (ko) 2019-10-02
JP6284919B2 (ja) 2018-02-28
CO6690745A2 (es) 2013-06-17
EA201390082A1 (ru) 2013-06-28
US20120035110A1 (en) 2012-02-09
HUE046443T2 (hu) 2020-03-30
CN103097409A (zh) 2013-05-08
PT2590998T (pt) 2018-02-13
AU2011274467B2 (en) 2015-01-15
NZ605403A (en) 2014-10-31
EP2590998A1 (en) 2013-05-15
AU2011274467A1 (en) 2013-01-24
US20150018525A1 (en) 2015-01-15
TR201815211T4 (tr) 2018-11-21
IL273304B (en) 2021-09-30
US20210115110A1 (en) 2021-04-22
EP2590998B1 (en) 2017-11-15
AU2015207811A1 (en) 2015-08-20
HRP20181657T1 (hr) 2019-03-08
PL3064508T5 (pl) 2024-04-08
KR20130091329A (ko) 2013-08-16
TW201900207A (zh) 2019-01-01
IL286298B (en) 2022-08-01
EA201792340A3 (ru) 2018-07-31
DK3064508T4 (da) 2023-04-11
KR102007773B1 (ko) 2019-08-06
SG186936A1 (en) 2013-02-28
US10100099B2 (en) 2018-10-16
SI2590998T1 (en) 2018-06-29
IL286298A (en) 2021-10-31
MX2013000166A (es) 2013-06-05
BR112013000512A2 (pt) 2016-05-17
ES2761692T5 (es) 2023-07-05
HRP20192089T1 (hr) 2020-03-20
CA2805557A1 (en) 2012-01-12
JP2016025873A (ja) 2016-02-12
TWI670073B (zh) 2019-09-01
PT3064508T (pt) 2019-12-05
KR20130091328A (ko) 2013-08-16
SG186935A1 (en) 2013-02-28
PT2591094T (pt) 2018-11-20
IL255327A0 (en) 2017-12-31
EA202090220A2 (ru) 2020-05-31
DK2591094T3 (en) 2018-11-26
JP2017217004A (ja) 2017-12-14
PL2591094T3 (pl) 2019-02-28
WO2012006591A1 (en) 2012-01-12
EP2591094A1 (en) 2013-05-15
KR20180130587A (ko) 2018-12-07
SI3064508T2 (sl) 2023-05-31
TWI609890B (zh) 2018-01-01
EA202090067A2 (ru) 2020-04-30
DK2590998T3 (en) 2018-02-12
TWI646972B (zh) 2019-01-11
IL255327B (en) 2020-04-30
CN107286235A (zh) 2017-10-24
EP2591094B1 (en) 2018-09-05
US20190085052A1 (en) 2019-03-21
US8852888B2 (en) 2014-10-07
AU2022200035A1 (en) 2022-01-20
FI3064508T4 (fi) 2023-04-25
SI2591094T1 (sl) 2018-12-31
AU2011274470B2 (en) 2015-08-13
IL273304A (en) 2020-04-30
US20120034674A1 (en) 2012-02-09
TW201206953A (en) 2012-02-16
EA035066B1 (ru) 2020-04-23
ES2761692T3 (es) 2020-05-20
HRP20192089T4 (hr) 2023-04-28
US11780904B2 (en) 2023-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA029503B1 (ru) Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
EA023193B1 (ru) Среда для культивирования клеток для экспрессии белков adamts
JP6284919B6 (ja) 細胞培養による組換え型高分子量ｖＷＦ産生方法
EA041947B1 (ru) Способ получения рекомбинантного высокомолекулярного vwf в культуре клеток

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM