JPS62502589A

JPS62502589A - フオン・ビルブラント因子

Info

Publication number: JPS62502589A
Application number: JP50233086A
Authority: JP
Inventors: ギンスバーグ，デービツド; オーキン，スチユアート・エツチ; カウフマン，ランダール・ジエイ
Original assignee: ザ・チヤイルドレンズ・メデイカル・センタ−・コ−ポレ−シヨン
Priority date: 1985-04-11
Filing date: 1986-04-10
Publication date: 1987-10-08
Also published as: EP0218692A1; AU591671B2; WO1986006096A1; AU5776186A; EP0218692A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】フォノ・ビルプラント因子ｌ１二１遣本発明は■Ｒ因子として知られる哺乳類のフォノ・ビルプラント因子（ＶＷＦ）、およびＶＷＦを得てこれを使用する方法、ならびにＶＷＦ遺伝子の存在について哺乳類のＤＮＡ試料を分析する方法に関する。

哺乳類の血液凝固は多数のタンパク質因子と組織成分との相互作用を伴う、１つの凝固因子複合体は■Ｃ因子と呼ばれ、少なくとも２つの別個のクンバク質：すなわち■因子（血友病Ａとして知られる凝固障害を治すタンパク質、抗血友病因子）とＶＷＦとから成っている。ＶＷＦは血小板に結合するタンパク質であり、凝固過程の血小板−血管壁の相互作用において不可欠の成分である。ツインメルマン（Ｚ　ｉｍｎｅｒｌａｎ）らのｐｒｏ　ｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｈｅ１ａｔＯＩＯ、ｖｏｌｔ　、　ＸＩ、“■因子／フォン・ビルプラント因子”　（グルネ＆スストラットン１９８３）を参照されたい、低下したまたは異常なＶＷＦ活性は、割合よく発生する複雑な遺伝的出血性疾患であるフォノ・ビルランド病（ＶＷＤ）をもたらす、提供血液がら低温沈澱物として得られる■因子複合体はＶＷＤの治療のために投与される。ミトラ（Ｈｉｔｒａ）の米国特許第４３８６０６８号を参照されたい、他の凝固タンパク質（例えば■Ｃ因子）は特異的なｃＤＮＡはすでにクローン化されて、宿主系により発現されている〔ウッド（Ｗｏｏｄ　）らのＮａｔｕｒｅ、３１２：　３３０〜３３７１（１９８４）を参照〕。

ＶＷＦは非常に大きく、しかも利用し得る配列データが今まで（存在するにしても）非常に少なかったので分析および生産がとりわけ困難である。その上に、実質的量のＶＷＦを生産する細胞（例えば内皮細胞や巨核球）は培養下に増殖させることが難しい。

１囲Ｊとｉ力本発明の一面は一般に（１）哺乳類の機能的ＶＷＦタンパク質をコードするＤＮＡ配列；および（２）ベクターにより形質転換された宿主細胞中で該ＤＮＡ配列を発現させ得る調節ＤＮＡ：を含む発現ベクターの使用によりＶＷＦを生産することに関する。Ｖ乳類の機能的ＶＷＦタンパク質とは、天然に存在するフォノ・ビルプラント因子の機能を有するか又はその機能を有するようにプロセッシングされる、天然に存在する哺乳類ＶＷＦタンパク質に十分対応するタンパク質を意味する（プロセッシングとしてはグリコジル化および／またはマルチマーの形成が含まれる）、宿主細胞とは哺乳類の細胞のような適当な宿主細胞を意味する０発現ベクターの少なくとも一部はＶＷＦをコードするＤＮＡ配列に対して外因性であり、そのＤＮＡ配列と同じ分子中に自然界において存在しない。

好適な実施態様において、ＶＷＦはヒトＶＷＦであり、機能的ＶＷＦ生産用の宿主細胞は真核細胞、最も好ましくは哺乳動物細胞である。

本発明の第二の面は一般に、検出可能な標識で標識された、ＶＷＦタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡから成るプローブを使って、哺乳類ＤＮＡ試料を分析することに関する。プローブはそれが試料とハイブリダイズするかどうかを調べるために試料と接触させる。

第三の面において、分析されるべき哺乳類ＤＮＡ、は制限酵素消化により断片化し、そのＤＮＡ断片を大きさに基づいて分離し、その断片を上記のプローブと接触させ、そしてプローブとハイブリダイズするＤＮＡフラグメントの相対的長さを調べる。

第二および第三の両面の好適な実施態様において、プローブおよび被分析ＤＮＡは双方ともヒトＤＮＡである。

従って、本発明は例えばＶＷＤの患者にＶＷＦを；血友病Ａの患者に■Ｃ因子との安定な複合体としてＶＷＦを；または腎不全と関連した出血性疾患の患者にＶＷＦを：投与することにより出血性疾患を治療するための比較的豊富で純粋なＶＷＦ源を提供する１本発明はまたＶＷＦ遺伝子またはその断片から成る標識プローブを使って、ＶＷＦ遺伝子およびそれらの欠損を評価するための診断用器具ならびに検索用器具を提供する１例えば、哺乳類ＤＮＡ試料はＶＷＦｒＩＩＪ連遺伝子と特に関係がある制限断片長多形性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｌｅｎｇｔｈｆｒａｇＩｌｅｎｔ　ｐｏｌｙｎｏｒｐｈｉｓｒａ；　ＲＦ　ＬＰと略す）を検出するためにＤＮＡプローブを用いて分析される。ＶＷＦ関連遺伝子とは正常ＶＷＦ遺伝子、またはＶＷＦ遺伝子の一部もしくは全部の不在によっであるいは突然変異ＶＷＦ遺伝子によって特徴づけられるＤＮＡを意味する。制限断片長多形性とはＶＷＦ関連遺伝子と関係がある同定可能なりＮＡ配列を意味し、そしてＶＷＦ関連遺伝子と共に保存される。ＲＦＬＰは例えば多種多様のＶＷＤの１つについて危険な状態にある胎児のＶＷＦ遺伝子の遺伝パターンを調べるために使用される。

本発明の他の特徴および利点は次の好適な実施態様の説明および請求の範囲から明らかになるであろう。

ｔ　のＢ今や本発明の好適な実施Ｒ様を説明するが、まず初めに図面について簡単に説明する。

■０区−−画第１Ａ図はＶＷＦＤＮＡの制限酵素地図を示す、第１Ｂ図はＩ）ＶＷｄと称するプラスミドに由来するＶＷＦ　ｃＤＮＡの３′部分および重複するクローンｐＶＷＥ６の３′末端の制限酵素地図を示す、第２図はｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンにより決定したヒトＶＷＦ遺伝子の染色体局在化を示す模式図である。

■、１遺旦よ１皿２下記のセクションＡは初めにｃＤＮＡフラグメントを集成して機能的ヒトＶＷＦタンパク質をコードするＣＤＮＡを得、次いでそのｃＤＮＡを宿主細胞中で発現させることによる機能的ヒトＶＷＦの生産方法を示す。

セクションＢは、ＶＷＦタンパク質をコードするＣＤＮＡを使用して、例えばヒト遺伝子と関係がある制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）を検出することによるＤＮＡ試料の分析を示す、その後検定がヒトＤＮＡ試料（例えばそれぞれの親の対立遺伝子が遺伝したもの）中のＶＷＦ遺伝遺伝子側べるために実施される。

Ａ、　ｖＷＦ　ンパク機能的ＶＷＦタンパク質の生産方法は（ａ）ヒト１ＲＮＡを採取し；（ｂ）該［ＬＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製し且つＶＷＦをコードするＣＤＮＡ断片を同定し；（Ｃ）これらの断片を機能的ＶＷＦタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子に集成し；そして（ｄ）該ｃＤＮＡ分子を、真核宿主細胞の形質転換に使用し得る発現ベクターにクローニングすることよにＶＷＦを生産させる；各工程を包含する。

１、ｎＲＮＡの” ＶＷＦ　１ＲＮＡ源として、ヒト誇静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の１次項獲物をマシア（Ｈａｃｉａｇ）らの方法（Ｊ、　ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、９１：　４２０〜４２６　（１９８１）；Ｊ、　ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ。

９４：　５１１〜５２０（１９８２）を参照〕に従ってウシ内皮細胞成長因子およびフィブロネクチンの存在下に２０％ウシ胎児血清を含む培地１９９中で増殖させ、そして継代培養する。増殖はトーントン（Ｔｈ０ｒｎｔＯｎ　）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２２　：　６２３〜６２５　（１９８３）を参照〕によって示唆されたようにヘパリンの添加により著しく高められる。ＶＷＦ　１ＩＲＮＡの存在を証明するために、培養細胞と調整培地の両方を、標準技法によって得られた抗ＶＷＦ抗体を用いてＶＷＦの存在について試験する。この目的のためにそれぞれ標準免疫蛍光法およびＥＬＩＳＡ検定法を使用する。４回の追加継代の後、細胞を収穫して、全ＲＮＡを標準技法によりグアニジンＨＣＪＩ中で調製する。

２　、ｃＤ　Ｎ　Ａ−イフ−１−＋７）ポリＡ“ｒｔ　ＲＮＡはオリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィーにより全内皮細胞ＲＮＡがら単離する。２つの異なるｃＤＮＡライブラリーの作製のために２つのｃＤＮＡブールをｎＲＮＡから標準技法により合成する。第１のｃＤＮＡブロールのために、第１鎖合成用プライマーとしてオリゴｄｔを使用する。ｃＤＮＡブールはＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端とし、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）メチラーゼで内部ＥｃｏＲ工部位を保護した後にＴ４ＤＮＡリガーゼによりＥＣ０ＲＩリンカ−へ連結させる１次にリンカ一連結ｃＤＮＡを過剰のＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、セファロースＣＬ４Ｂカラムを通過させることにより遊離のリンカ−から分離する。

ＶＷＦ　ｃＤＮＡを細菌宿主内仁運ぶために選ばれたファージベクターはバクテリオファージラムダの誘導体であるラムダｇｔｌｌであり、このラムダ９ｔ１１はβ−ガラクトシダーゼタンパク質のＣ末端部分に相当するその３′末端近くに単一のＥｃｏＲ４クローニング部位を有するβ−ガラクトシダーゼの細菌遺伝子を含む、ｃＤＮＡ分子をこの部位に挿入してＣＤＮＡライブラリーを作製する。

既知方法によってこのファージを適当な細菌株番；感染させることにより、そのアミン末端に大部分のβ−ガラクトシダーゼを含み且つそのカルボキシ末端に対象となるタンパク質のペプチドフラグメントを含む融合タンパク質が生産されるであろう、このｃＤＮＡコード化ペプチドがＶＷＦの抗原決定基のうちの１つを含むならば、それは抗ＶＷＦ抗体を用いるスクリーニングにより検出できる。非常に多くのファージ粒子を細菌平板上で増殖させ、タンパク質生産物をニトロセルロースフィルターに移して特異的抗体によりスクリーニングし、それにより対象のタンパク質を生産する組撓え体ファージの位置を同定する。

詳細には、ＶＷＦ　ＣＤＮＡをＥ　ｃｏＲＩ消化、ホスファターゼ処理ラムダｇｔ１１ベクターＤＮＡに連結させ、そして３〜４Ｘ１０６個の組換え体クローン中に含まれる２つのライブラリーをそれぞれ平板培養して増幅させる。ＩＴＰＧ／ＸＧａＪｌ平板上での増殖により評価した弁組換え体バックグラウンドは約３０％である。約１〜３キロ塩基（Ｋｂ）の長さのＣＤＮＡ挿入物を含む組換え体クローンが得られる。

ヒト■−ＶＷＦ因子に対して作られたアフィニティ精製ウサギ異種抗血清は標準方法を使って得られる。この抗血清はゼラチン−セファロースを通過し、ＶＷＦ −セファロースのカラムに吸着されてそれから溶離される。

上記のラムダ９ｔ１１内皮細胞のｃＤＮＡラプイラリーからの組換え体クローンは、１　：　１０００の希釈度でこの抗体を用いることにより大腸菌宿主菌株Ｙ１０９０のファージプラークとしてスクリーニングされる。陽性と思われるプラークは精製し、再度平板培養しそして再度スクリーニングする０例えば、抗ヒトＶＷＦ抗体によりスクリーニングされた１つの１次フィルターはＬＶＷｄと称する陽性プラークを示した。陽性対象として、精製ＶＷＦタンパク質がフィルター１におがれ、１００〜０．１ナノグラム（ｎ９）の全タンパク質量で検出される。

再スクリーニングからの陽性プラークは精製して、ファージＤＮＡを標準方法により調製する。上記ＬＶＷｄプラーク中のＣＤＮＡ挿入物の精製および同定を以下に示す。

Ｌ　ＶＷｄ　ノ５５３ｂｐ　ｃＤ　Ｎ　ＡハＥ　ｃｏＲＩ消化後にアガロースゲル電気泳動により精製し、そして上記のように調製した内皮細胞からの全ｍＲＮＡのノザンプロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）を試験するためのプローブとして使用する。ノザンプロット分析はハイブリダイゼーション用プローブとしてＬＶＷｄＣＤＮＡ挿入物を用いてＨＰＢ−ＡＬＬ（Ｔ細胞株）、内皮細胞（）ｆＵＶＥｃ）、線維芽細胞およびＨｅＬａ細胞からの全細胞ＲＮＡに対して実施された。ＬＶＷｄ　ｃＤＮＡプローブは８〜１０ｋｂの長さの１つのｌｌＲＮＡバンドとハイブリダイズした。このｎＲＮＡ種は分子量が２５０にダルトン程度のタンパク質をコードするのに十分な大きさである。このｎＲＮＡ種は内皮細胞にのみ検出され、対照すなわち線維芽細胞、Ｈｅ　Ｌａ細胞またはヒトＴｉ１ｌ胞株（ＨＰＢ−ＡＬＬ）に由来するＲＮＡにはハイブリダイゼーションが全く観察されなかった。こうして、クローンＬＶＷｄのｃＤＮＡ挿入物は内皮細胞にのみ存在し且つＶＷＦをコードするのに十分な大きさであるｍＲＮＡ分子のセグメントに対応する。このクローンはアフィニティ精製抗ＶＷＦ抗体と反応するポリペプチドエピト−１を含む。

ＬＶＷｄのｃＤＮＡ挿入物はプラスミドｐＵＣ−１３（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社）にサブクローニングされてプラスミドｐＶＷｄをもたらす、第１Ａ図はＶＷＦタンパク質をコードするｃＤＮＡの制限酵素地図である。第１Ｂ図はｐＶＷｄに由来するＶＷＦ　ｃＤＮＡの３′部分および重複するクローンＥ）ＶＷＥ６の３′末端からのＤＮＡの制限酵素地図および塩基配列決定計画を示す（第１Ａ図参照）、第１Ａ図および第１Ｂ図の両方において、ＤＶＷＤと称するＤＮＡフラグメントはプラスミドｐＶＷＤの上記ｃＤＮＡフラグメントである。第１Ｂ図の英綴と矢印はマクサム−ギルバート法〔祖肋、堕α赳旦、並：４９９〜５６０（１９８０）を参照〕により塩基配列が決定された領域を示し、黒い円は末端標識された制限部位を示す０点線と矢印はＭ２Ｓ　ｎｐ［にサブクローニングされたＰｓｔＩ断片を使用して、サンガーらの方法（Ｐｒ０Ｃ。

Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　７４：　５４６３〜５４６７（１９７７）を参照〕により塩基配列が決定された領域を示す。

表１は第１Ｂ図のｃＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列を示す、このｃＤＮＡ配列はそれに融合されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と同じリーディング・フレームで且つ同じ方向性で単一物が後にＭ＜１９３個のアミノ酸をコードする単一の大きいオーブン・リーディング・フレームを含み、これは融合タンパク質産物の発現と一致する。ＶＷＦのカルボキシ末端の１９３アミノ酸残基のための推定上のアミノ酸配列もまた、標準単一文字のアミノ酸略号を用いて表わされる。このＤＮＡ配列の始めと終わりの６個のヌクレオチドはクローニング法によって導入された合成ＥｃｏＲＩリンカ−に相当する。１個の終止コドン仁はダイヤの印が付けられている。矢印は２つの起こりうるＮ−グリコジル化位置を示す。

ＶＷＦ遺伝子の染色体上の位置は上記のようにして得られたｃＤＮＡの使用により決定される。第２図は染色体１２（１２ｐ）の短いアームへのＶＷＦ遺伝子の局在化を示すハイブリダイゼーションパターンを表わす。

ＬＶＷｄ　、ｐＶＷＨ５およびｐＶ　Ｗ　Ｈ３３はそれぞれ寄託番号５３０８８　、５３０８９および５３０９０としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（米国メリーランド州ロックビル）に寄託された。

３、ｃＤＮＡフラ　メン　の。

ＶＷＦタンパク質に対応するＣＤＮＡセグメントを確立するために、ＬＶＷｄの５３３塩基対挿入物のような陽性プラークからの挿入物をプローブとして使用して、上記の）（ＵＶＥＣライブラリーを再スクリーニングし、それにより第１Ａ図に示すＶＷＦ、ＣＤＮＡの制限酵素地図を作成する。

詳細には、ｃＤＮＡ挿入物をＥ　ｃｏＲＩ消化後に低メルトアガロース（ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）で精製し、ＥｃｏＲＩ消化、ホスファターゼ処理ｐＵ　Ｃ１３プラスミド（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社）にサブクローニングしてｐＶＷｄを得る（第１Ａ図参照）　、　、ｊ’）ＥｃｏＲ工挿入物を放射性標識して、ＨＵＶＥＣｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングするためのプローブとして使用する。陽性組換え体ファージは精製してｐＵ　Ｃ１３にサブクローニングする。

２つのこような組換え体ｐＶＷＥ２およびｐＶＷＥ６を第１Ａ図に示す、制限酵素地図は標準方法により推論される。

ｐＶＷＥ２の５′末端からの２１７ｂｐ　Ｅ　ｃｏＲＩ　／　Ｐ　ｓｔ　Ｉ断片を用いてＨＵＶＥＣｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングし、それにより重複する第３番目のＶＷＦ　ｃＤＮＡクローンを同定し、それらのうち１つのｐＶＷＧ８ｂを第１Ａ図に示す、同じ方法を使って、一連の重複する第４番目のクローンが得られ、それらには表１（こ示す配列と共にヒトＶＷＦタンパク質の全モノマーをコードするのに十分なりＮＡに及ぶｐｖ　Ｗ　Ｈ３３およびｐＶＷＨ５が含まれる。１！！当な制限酵素、試薬および方法を用いることにより、当分野で習熟した者は例えばＶＷＦタンパク質の全モノマーをコードするｃＤＮＡを構築するためにｐＶＷＨ３３，ｐＶＷＨ５および表１の配列のＣＤＮＡ断片類を一緒に連結させることができる。

耳へ　０・　１１・　１：・・計・　Ｏ−１？　（・　１１υ イ・　８−８・　Ｕ・＝、Ｈ，−ｇ、Ｈ，且−１ｕ　ｎ−Ｑｔ−１ｊ−リ←　’Ｊｕ　ｕ＞・　Ｕ・　：（・　ｌｘ　ｌ（ｇ　ｆｊ＞　’（ｓ＜・ト８０■・Ｉ・ｔニー　！ｊ・・　呑へ−民・０・・　母・Ｒａ　＃・ｌ）リ　具・ＩＪＵ　艮・ｌｕ・　ト　訃　１ｕ　３ｃ＝　訃４　イーリｎ　ＩＪ　＜　Ｍ　＞・　Ｕ＝　甲・　リー；？・　Ｕｌ＋Ｉ　’Ｈｊ　＋＜　’；／、＞　’、？、ｔＪ　鰭・　リ’ｄｘ　ｌｉｕ　ｌｉｕ　Ｉｊｒ、　Ｖｌ−’ｆ：、−１ｃＤＮＡの　、お　声より詳細には、９ｋｂ対のＤＮＡにわたり且つｖＷＦの全タンパク質コーディング領域を含むｃＤＮＡクローンｐＶＷＨ３３、ｐＶＷ）（５およびｐＶＷＥ６が全長ＣＤＮＡを構築するために選択された。これらのクローンの両末端のヌクレオチド配列は、それらが−緒になって翻訳開始配列、タンパク質コーディング配列および翻訳停止配列を含むということを確信させた。全長ＣＤＮＡは個々のクローンから誘導された断片を用いて標準技法により構築した。ｐｖ　Ｗ　Ｈ３３の左側ＥｃｏＲＩ部位から唯一のＢａＩＩＨＩ部位までの断片は、Ｂ　ａｍＨ１部位からＳａＣ工部位までのｐＶＷＨ５断片に連結させた。

次に、これをｐＶＷＥ６の５ａＣＩ部位から右側ＥｃｏＲＩ部位までの断片に連結させた。その後、全長ｃＤＮＡはＥＣｏＲＩ断片として、転写がアデノウィルスの後期プロモーターの支配下で起こる発現ベクターｐＭＴ２のＥＣｏＲＩ部位に挿入した。

ｐＭＴ２はアンピシリン耐性マーカーの代わりにテトラサイクリン耐性マーカーを使用した、哺乳類細胞の発現ベクターＥ１９１０２３（Ｂ）　（つオン（Ｗｏｎｇ　）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２８　：　８１０（１９８５）を参照〕の誘導体である。ＶＷＦ発現プラスミドの機能的因子は以前に説明されている〔カウフマン（にａｕｆｌｌａｎ）。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　８２：６Ｊ１９を多照）、ｐＭＴ２−ＶＷＦはＳＶ４０起点およびエンハンサ−因子：第３の３分節リーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ　１ｅａｄｅｒ）ノ第１のもの、第２のものおよび第３のもの２つを有するアデノウィルス後期プロモーター；アデノウィルスの第１後期リーダーからの５′ズブライス部位および免疫グロブリン遺伝子からの３′スプライス部位の間のイントロン（カウフマン＆シャープ“８２）；ＶＷＦ　ｃＤＮＡ；　ＤＨＰＲコーディング領域、およびＳＶ４０初期ポリＡ化部位：アデノウィルスＶＡ遺伝子；をＣ０１Ｅ１複製起点およびアンピシリン耐性を含むｐＢＲ３２２の誘導体中に含有する。

ｐＭＴ２−ＶＷＦはＶＷＦ配列の欠失を防ぐために大腸菌ＤＨ５中で増殖させた。プラスミドＤＮＡはＣ８Ｃｊ勾配により平衡状態へと２回バンド化することにより調製した。

４、ＶＷＦの　および　゛ＶＷＦタンパク質をコードする上記ｃＤＮＡは適当なベクターに挿入して、当分野で知られた多数の哺乳類発現系のい゛ずれかにより例えばウッド（Ｗｏｏｄ　）らの−鍛方法（Ｎａｔｕｒｅ３１２：３３０〜３３７　（１９８４）を参照〕を使って発現させることができる。得られた生産物は必要な翻訳後プロセッシングを有し、成熟フォノ・ビルプラント因子をもたらす、宿主系はＶＷＦ遺伝子産物の適当な翻訳後プロセッシングのために選択され、ＶＷＦの効率のよい回収を不能にする。こうして、活性ＶＷＦは例えば後述するようにＣＯＳサル細胞およびＣＨＯ細胞により発現された。この方法で生産された純粋なＶＷＦはＶＷＤの治療に、および異常な出血回数を粗製の低温沈澱物で治す慢性腎不全患者の治療に有用であるだろう。

純粋なＶＷＦはまた■Ｃ因子の治療効力を支持し、安定化しそして改善するために使用される。

ルＣＯ８によるｖＷＦのＳＶ４０で形質転換されたＣＯＳサル細胞（クローンＭ６）はすでに知られている〔ホロビイッツ（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ）ら。

、Ｌ恒±２五ｌ上−懇■射エ　２：１４７〜１４９　（１９８３）を参照〕。

ｏＭＴ２およびｐＭＴ２−ＶＷＦを用いるＤＮＡトランスフェクションはクロロキン処理を加えたＤＥＡＥ−デキストラン法により、教示されたように〔カウフマン、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　８２：　６８９　（１９８５）を参照〕実施しな〔ソンヘイラック（５ｏｎｐａｙｒａｃ）およびダンナ（Ｄａｎｎａ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８：　７５７５〜７５７８　（１９８１）　：ルースマン（Ｌｕｔｈｎａｎ）およびマグナッソン（Ｈａｇｎｕｓｓｏｎ）、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１１　：　１２９５〜１３０８　（１９８３）を参照〕、トランスフェクトされた細胞には１０％全ウシ血清を含むＤＭＥＭ　（ダルベツコ修飾イーグル培地）を４８時間供給した。その後培地を除き、細胞を洗浄し、阻害ＥＬＩＳＡ検定（精製ＶＷＦをマイクロタイターウェルの表面に吸着させ、続いて抗ＶＷＦ抗体を吸着させる）を使用してＶＷＦを測定するために、血清不含ＤＭＥＭを３ｘｉｏ６，４Ｂ胞あたり４ｍｌ加えた。固定化抗原から抗ＶＷＦ抗体を置換する試験物質の能力は、指示物質としてペルオキシダーゼを結合した抗ウサギＩｇＧを用いて試験した。ＶＷＦ　ｃＤＮＡを含む抗ウサギ１９Ｇを用いて試験した。

ＶＷＦ　ｃＤＮＡを含む発現ベクターｐＭＴ２−ＶＷＦでトランスフェクトされたＣｏＳ細胞からの培地は、３つの別々のトランスフェクションにおいて５０〜３００　ｎｇ／ｍ＋のＶＷＦ抗原をもたらした。ベクターｐＭＴ２のみでトランスフェクトされたＣｏＳ細胞はＥＬＩＳＡ検定で反応するタンパク質を生産しなかった。

ｖＷＦのプロセラシンＣＯ８細胞のトランスフェクションを上記のように実施し、トランスフェクションの７２時間後に培地、を３５Ｓ−システィンを含む新しいシスティン不合培地と取り換えた。さらに１〜−５時間インキュベーション後培地を除き、細胞抽出物を教示されたように調製した〔カウフマンおよびシャープ。

Ｊ、　Ｈｏｔ、　Ｂｉｏｌ、１５９　：　６０１　（１９８２）ヲ？照）　、ソノｔｆｋＨ１ｅｌ抽出物および培地はＶＷＦプロセッシングおよびマルチマーアセンブリー（ｌｌｕｌｔｉｌｌｅｒ　ａｓｓｅｎｂｌｙ）の研究のために使用した。

ＶＷＦはウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体とのインキュベーションにより、続いてプロティンＡセファロースにより免疫沈降させた。免疫沈降物質は０．１％ＳＤＳおよびＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ２Ｏを含むＭ％液液中洗浄して、免疫複合体への他のタンパク質の非特異的吸着を最小限に抑えた。沈降したタンパク質はその後１１ＨＤＴＴの存在下および不在下で４〜６％５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した１組換え体細胞の溶菌液は２６０ｋｄの見掛は分子量と共に泳動するバンドを含んでいた。細胞培地は２６０ｋｄの物質と２２０ｋｄの物質の混合物を含んでいた。非ｍｌ換え体プラスミドでトランスフェクトされたＣｏＳ細胞または培地からの免疫沈降物は、これらの２つのバンドを含んでいなかった。４％５ＤＳｉ−ＰＡＧＥによる非還元物質の分析は、１００万ダルトンから３００万または４００万ダルトンの非常に高分子量のタンパク質を４または５種顕示した。

■ＷＦの　２ＣｏＳ細胞は上記のようにトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に洗浄し、そして血清不合培地を供給した。ＣｏＳ細胞と共に２４時間インキュベーションした後に、血清不含ＣＯ８細胞培地２００ｍ１を集めた。それはＥＬＩＳＡ検定により５０〜２０Ｏｎ（１／　ｍｌのＶＷＦを含んでいた。

この血清不合培地は競合的結合検定で使用するために、５０％フィコールに対する透析により２．２μｇ　／　（Ｉｌｌ　Ｖ　Ｗ　Ｆタンパク質の濃度へと濃縮した。

この組換えＶＷＦのラスカルシ（Ｌｕ５ｃａｌｚｏ、　Ｊ、　）およびハンプイン（Ｈａｎｄｉｎ、　Ｒ，１，）のＢｉｏｃｈｅｎ、２３：　３８８０　（１９８４）に記載の検定において、精製した放射性標識ヒトＶＷＦマルチマーに対する競合リガンドとしているいろな濃度で使用された。１μ２　／　ｍｌの濃度が５０％のコラーゲン結合（ＩＣ５０）について競合した。これは精製しトＶＷＦを競合リガンドとして使用したときのＩＣ５０より１０倍少ながった。ＩＩＭＴ２プラスミドのみでトランスフェクトされた細胞からのＣＯ３培地はコラーゲン結合部位について競合しながった。同様に、血小板の糖タンパク質Ｉｂに対する組換えＶＷＦ結合のＩＣ５０は、新たに単離された血小板を使用したとき２μｇ　／　ｍｌであり、リセプター源としてホルマリン固定血小板を使用したとき５ μｇ　／　ｍｌであった。これらの値は精製ヒトＶＷＦの場合に得られたものと同じである。さらに、弁組換え体プラスミドでトランスフェクトされたＣＯ８細胞がらの培地も結合について競合しながった。これらの結果はＣｏＳ細胞がら誘導されるＶＷＦがコラーゲンおよび血小板結合法により測定したとき機能的であるということを示している。

ＣＨ０４によ　ＶＷＦの哺乳類細胞中でＶＷＦを生産させるために多数の系が利用できるが、高レベル発現を得るのに特に有用な方法は高度増幅の異種ＶＷＦ遺伝子を含む細胞を選択することである。

この方法のために利用し得る１つの増幅可能なマーカーはジしドロ葉酸還元酵素の遺伝子であり、増大した遺伝子コピーを有する細胞は次第に増加する濃度のメトトレキセイト（ＭＴｘ）中での増殖により選択することができる〔カウフマンおよびシャープ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｒｉｏｔ、１５９　：６０１　（１９８２）を参照〕、この方法を用いることによりいろいろ興なる細胞型においてＶＷＦ遺伝子を選択し、増幅させることが可能であり、そしてこの方法を用いてチャイニーズ　ハムスター卵巣細胞中に活性な全長ヒトＶＷＦが発現された。

ＤＨＰＲニーＡ−ムＡス１−１１工皇旦旦上によ　ＶＷＦおよびＤＨＰＲの口　６ｆｒ　びに−児皿ＶＷＦ発現７ラスミＦ　ｐＭＴ２−ＶＷＦおよびＤＨＦＲ発現プラスミドＤＡｄ　Ｄ２６ＳＶ　（Ａ）　３　（カウフマンおよびシャープ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　２　：　１３０４　（１９８２）を参照〕を、リン酸カルシウム共沈およびトランスフェクションによりＤＨＰＲ欠損ＣＨＯＤＵＫＸ−Ｂｎ細胞に導入した。

ＤＨＰＲ′″形質転換細胞を透析ウシ胎児血清を含むアルファ培地での増殖について選択し、その後教示されるように〔カウ７’？ンら、　Ｈｏｔ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、５　：　１７５０　（１９８５）を参照３次第に増加する濃度のＭＴＸ（段階的に０．０２　、　０．２．　１．０および５．０μＭ）中で生育させることにより増幅について選択する。ＸＭＴＶＷＦ−Ｃ１と称する１つの形質転換細胞がアルファ培地において単離され、上記のようにＭＴＸ中で増幅された６次第番４増大するレベルのＭＴＸ耐性の関数としてＥＬＩＳＡ検定により監視されたＶＷＦの発現は次の通りである。

ＶＷＦ発現はＭＴＸ耐性のレベルが増大するにつれて高められた。

ＣＨＯ細胞から誘導されるＶＷＦは、マイクロタイタープレートに固定化されたウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体（カルバイオケム社）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｄ　ａｃｃｏ）に結合された第２抗体を使用する直接ＥＬＩＳＡ検定により検定した。もとのＣＨＯ細胞からの培地には５　ｎ９／　ｍ１未満の活性が認められた。値は１０μｇ　／　ｍｌのＶＷＦを含むと仮定された正常ヒト血漿プールから誘導される標品（１単位／ｍｌ）と比較することによりめた。ＶＷＦの発現はまた細胞の３５８・システィン標識、およびウサギ抗ヒトＶＷＦ抗血清（カルバイオケム社）を用いる免疫沈降による調整培地と細胞抽出物の分析、ならびにトランスフェクトされたＣＯ８細胞から誘導されるＶＷＦについての上記のような５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により証明された。

５、ＶＷＦ　ｒＤＮＡの　し　ドＶＷＦのＤＮＡ配列は全長発現りｃｙ−ンＩＩＭＴ２−　ＶＷＦの構築の際に使用されたものと同じ重複ＣＤＮＡクローンより得られた。ｉ＆も５′側のクローンとして単離されたｐＶＷＫ７に由来する７０ｂｐの５′非翻訳領域をさらに含んでいた。全塩基配列は一本領Ｍ１３サブクローンに対するサンガーらのジデオキシ法を使用して両鎖について決定した〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、）− ニツクレン（Ｎ　ｉｃｋ　ｌｅｎ、　Ｓ、　）およびカールソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ，）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４：　５４６３〜５４６７　（１９７７）　；メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　）。

Ｊ、Ｈｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｎｏｔ、１（ロー：　３０〜７８　（１９８３）を参照〕、塩基配列決定用のサブクローンはヌクレアーゼＢａｊ！３１またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使用してｃＤＮＡクローンＤＶＷＨ３３，ｐＶＷＨ５およびｐＶＷＥ２の挿入物をエキソヌクレアーゼ消化することにより生成された。

ギャップは同じクローンからの適当な制限断片をＭ　１３ｉｐ１０および１ｐ１１にサブクローニングすることにより完成させた。　８５８８塩基対のＤＮＡ配列を表２に示す、それは２８１５個のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする連続したオープン・リーディング・フレーム（読み取り枠）を含む。

ト　υ　ｔｌ）ａ　ｕ＋［（！　＝　ｎ　Ｌｌト・＞（ワ０ＩＡ）り勧」（）σ Ｌ！＋　ω　じ　ト　ＵＱ　ｋｌ　）−←　α ！ｊｕｌ　１＋ＩＵＪ　）−１Ｌ　Ｌ）Ｑωｕ　ｕ　ｕ　トＣｈＵＩ−（！　ＬＩＪ　ｈ　Ｌｌ　Ｌ）　）　ＣＬ　Ｚ　Ｕ　ａリ　−　Ｕ　電」　Ｕ（ＪＣＸＩりＵ１−　＞　１＋１　１４　２　ＬＩ　Ｌ！Ｉ　Ｃ）−ａＩ　（Ｉ　ｌ’ｌ　Ｌｌじ　−　【」ｌｊ　ＬＬＩ　ＣｃｔＣＬ　’！　＋（ｌ　Ｃｍｕ　Ｌ）　０ｔｏＬ３ＩＪ　’　（ｔ　σ　ａ口ｕｎ　ＵＯＬＩＯ−ｎ＝。

ｅ　ｕ３　ｕ　ｕ　Ｌ３Ｌ！ｌ　ｌｄ　Ｌ）　α　（！Ｕ　ａ：　ト　ＬＩＩ　ＯＵ　工　ＯＷり　１５　Ｌ）　−← α　α　１り　ト　Ｏｔ！１　ω　σ　Σ　←　Ｕ　り　←　Ｃ（ｅｌ　Ｌ）　ｊＬＩ　）− ロ　←　−Ｐｕ　ｕト　コ　α　ｒ、　の　じ　σ　α　←ト　ψ　ＯＩ５　）− Ｌｌ　ｌ′ｌ　ｅｌ　）−← Ｕ　α　ト　←　（Ｊ　ＬＩＪ　Ｉ−１を僅つ　σ　ト　−← （ｅｌ　Ｕ　）−ｎｕト　ゴ　←　ｔｌｌ　ＬＩＪ　ｍｕ　α。

ｗａ　ｕ　ｔ５　ｅト　ｕ　Ｌ）　ａ　ａ＊Ｑ　Ｉ−（ＩＩ　（Ｌ　（ＩＩ　ＬＩ　ＯＬ）　Ｗ〇　−υ　ｅｌ　ｕ α　の　、ｊ　ａ　口ｕ　Ｏの　ＨＬＩ　ＬＪ　Ｏ）−Ｌ）Ｕ　ψ　口　ＬＪ　Ｌｌｕ　ｈｕ　＋り　← Ｌｌ（Ｉ　（ＴｈＬｌ（Ｉ　）−ＬＩ　Ｌ））ｔ５　ψ　じ　ト　ｕ α　ｓｈ　ｔ！Ｉ　ｃＨＬＩＬＬＩ　ｍａｒ　Ｌ！ＩＬ）　ｕｘυ　Ｃワ　Ｏα （←　（ｉ　Ｌ！１ト　＞　α　Σ　１０１１３　Ｌ！Ｊ　じ示された翻訳開始部位の確実性を支持する３つの証拠が存在する。第一に、メジャー・オーブン・リーディング・フレームで上流にナンセンスコドン（終結コドン）が存在する。

第二に、上流にあるただ１つの他の出発コドンのほとんどすぐ後にイン・フレーム（ｉｎ　ｆｒａｌｌｅ）停止コドンが続＜４後に、推定上のイニシエーターメチオニンの後に、この分泌糖タンパク質から予期されるごとく基本的なシグナルペプチド配列が続く。

５′非翻訳領域の性状を決定するために、ＶＷＦ　ｃＤＮＡの５′セグメントを含むいくつかの他のクローンの塩基配列が一部決定されたが、２つの独立したクローンは同じ５′末端をもつと認定されなかった。ここに示すようにｐＶＷＫ７が最も遠い５′まで伸長していた。

概算された２６０ＫｄのＶ　Ｗ　Ｆ前駆体（約７ｋｂ）をコードするのに要する長さと８〜９にｂの観察されたＶＷＦ伝達暗号の大きさとの明らかな矛盾は以前から指摘されており、若干の研究者は極端に長い５′非翻訳領域が存在すると仮定した〔リン−ｊ−（Ｌｙｎｃｈ）う、Ｃｅ１ｌ　４１　：　４９（１９８５）を参照）　、８．３Ｋｂノ連続したオーブン・リーディング・フレームの存在は、１次ＶＷＦ転写物がＳＤＳ　−ＰＡＧＥによって提示された２６０Ｋｄよりも相当に大きいことをはっきりと示している。予測された分子量は、グリコジル化からの余分の寄与を考慮する前でも、おおよそ３００Ｋｄである。比較的安定な２６０Ｋｄ中間体の急速な形成を伴う多段１０セツシングが起こることが正式に除外されたわけではないが、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルはこの範囲の分子量を概算する上で不正確な方法であることが知られている。ＶＷＦ″プローピース（ｐｒｏ　−ＤｉｅＣｅ）”は１００にｄ糖タンパク質として循環中にそのまま見られるので、多段プロセッシングは起こりそうもなく、プローＶＷＦは以前に予測されたものよりも明らかに大きく、−膜性でプロセッシングされる。

大きいＶＷＦプローピースの機能が何かしら存在するとしても現在のところ知られていない、トランスメンプラン（経膜）分泌後のその運命も十分には明らかになっていない、しかしながら、１０Ｋｄ、血漿糖タンパク質をもつＶＷＦプローピースの本性は、少なくとも若干のプローピースそれ自体が細胞を去るというように最近になって立証された。プロポリペプチドの予測された配列に対応する１００Ｋｄ糖タンパク質のＮ末端配列は、シグナルペプチドの切断が表２に矢印で示した位置で起こることを意味している。これは通常シグナルペプチダーゼ切断に関係があるコンセンサス配列と一致する〔ワトソン（Ｗａｔｏｓｏｎ）、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１２．１９８４を参照〕。

サドラー（Ｓ　ａｄｌｅｒ）ら、Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、ＵｓＡ　、８２　：６３９４（１９８５）は最近部分的なりｗｐ配列を発表し、反復因子の存在を示した。しかしながら、完全なヌクレオチド配列の分析は先のデータによって示されたものよりも一層広範囲の反復をそのＶＷＦｌｌｉ造中に示す０本発明者らはサドラーらによって“ドメインＡ″と呼ばれた反復の３つの完全なコピーの存在を確信する１本発明者らはこの反復のための専門用語を保持し、そしてサドラーらのクローンでは失われているその第１のコピーの５′ 末端の相同性を確認した。これらの著者らは示唆していないが、著しい特徴はＶＷＦ配列の中心の約６００のアミノ酸を占めるこの領域内にＣｙＳ残基が不足していることである。対照的に、分子の各末端部の領域（本発明者らの配列のヌクレオチド２０８から３８３３”で、およびヌクレオチド５７２９から８５８２まで）は極めてＣｙｓ残基に富んでおり、ＶＷＦの高Ｃｙｓ含量のほとんど全てを占めている。実際にＣｙＳはプレプロ−ＶＷＦ配列中で最も豊富なアミノ酸であり、残基の８．３％を占める。“ドメインＡ′の外側の領域ではＣｙｓはアミノ酸の１０．４％を占める。

これらのＣｙＳに富む領域のその後の分析は、それらがまた４００アミノ酸単位の連続した６つの反復として配列されることを示す、第１の反復はシグナルペプチドのすぐ後から始まる。第２の反復はプローピースと成熟ＶＷＦの間に切断部位を含むこの重複のすぐ前で切断される。第３の反復の後、配列には３通りのＣｙＳに乏しい″Ａドメイン”反復が介在し、その後にＣｙｓに富む反復がこの分子のＣ末端をコードし始める。第５および第６の反復は不完全であるが、サドラーらの短い“Ｂドメイン”反復の領域を含む、これらの著者の“Ｃドメイン“反復が２つのコピーでその後に続く、遊離スルホｂドリル基はマルチマーＶＷＦ中に検出されないので、これらのＣｙＳ残基はすべてタンパク質の３次および４次ｆｉＪ　３’４の重要な決定因子である鎖問および鎖内ジスルフィド結合中に包含される。

Ｂ、　ＤＮＡ：のＤＮＡ配列の多形性（ｐｏｌｙｎｏｒｐｈｉｓｎ）は、制限酵素消化およびプロットハイブリダイゼーション分析によってしばしば検出されるゲノム全体にわたって存在するＤＮＡ配列の中立変異（ｎｅｕｔｒａｌ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ）である、中立とは変異それ自体が表現型の特徴に関係しないことを意味する。しかしながら、多形性の価値は、それらがゲノムの隣接部分と連結または関連しているということであり、それ故にそれらはゲノムの隣接部分のマーカーとして使用することができる。

ＤＮＡ配列多形の２つの型がすでに開示されている。１つの型は特定の制限酵素認識部位の存在またはふぞんもたらす１個のヌクレオチドの変化または小さい挿入変異もしくは欠失変異を含む、もう１つの型の多形では、未知機能のＤＮＡの大きいセグメントの長さが個体間で大きく変化する０両方の型の配列差異はメンデルの法則によって受け継がれる。

ＶＷＦ遺伝子に連結したＲＦＬＰは、ＤＮＡ試料を一連の制限酵素で切断することにより試験された個体由来のゲノムＤＮＡにおいて同定される。得られた制限長断片は分子量に応じて分離する。放射性標識ＶＷＦ　ｃＤＮＡプローブ（例えばクローンｐＶＷＥ６由来のＣＤＮＡ挿入物）によるハイブリダイゼーションは（例えばサザン法を用いることにより）独特なバンドパターンをもたらす０例えば、ＲＦＬＰは制限酵素Ｔａｑｌおよび５ａＣＩならびにｐＶＷＥ６プローブを用いる上記方法により検出される。詳細には、末梢血試料を１０％クエン酸−デキストロース中に採取する。高分子量ＤＮＡはデキストラン沈降白血球またはトリトンＸ　−１００可溶化後に遠心分離された単離様から標準方法により調製する。２〜１６、のＤＮＡを制限酵素Ｔａｑｌおよび５ａＣＩで完全消化する。

次にＤＮＡ断片を０．６〜１．゛０％アガロースゲルによる電気泳動で分画化し、ニトロセルロースフィルターに移行させる。

Ｅ）ＶＷＥ６から作製したプローブは標識後ニトロセルロース上のＤＮＡとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後フィルターを洗ってオートラジオグラフィーにがける。

同定されたＲＦＬＰはヒトＤＮＡ試料を検定し且つその試料中のＶＷＦ遺伝子源を調べるために上記のように使用される。

例えば、親やその他の家族のＤＮＡがこのようなプローブを用いて例えばサザン法□によりスクリーニングされ、その後胎児ＤＮＡがそのＶＷＦ対・立遺伝子の遺伝パターンを調べるためにスクリーニングされる。

ｉａ皿座叉星旦１その他の実施態様は次の請求の範囲内に含まれる０例えば、上記技術は他の哺乳動物系に当てはまる。他のＲＦＬＰを使用することができる。ハイブリダイゼーションプローブは他の検定法や検索法にも使用される。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）昭和６１年１２月１１日特許庁長官　黒　１）明　雄　殿１、特許出願の表示ＰＯＴ／Ｕ３８６１００７６０２、発明の名称フォノ・ビルプラント因子３、特許出願人住　所　アメリカ合衆国マサチューセッツ州０２１１５゜ボストン、シャタック・ストリート　５５４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６号室（１）　補正書の翻訳文　１通補正された請求の範囲１、　莢質的にＡＴＣＣ寄託番号５３０８８　、５３０８９および５３０９０のうち少なくとも１つのＶＷＦ　ｃＤＮＡ配列から成る、機能的ＶＷＦをコードするｃＤＮＡ配列。

２、　実質的に表２に示すタンパク質配列をコードすることによってさらに特徴づけられる、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。

３、　請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列および該ＤＮＡ配列を宿主細胞中で発現させて機能的ＶＷＦを生産しうる調節ＤＮＡを含み、ベクターの少なくとも一部が該ＤＮＡ配列に対して外因性である、宿主細胞を形質転換するためのベクター。

４、　請求の範囲第３項記載のベクターで形質転換された宿主細胞。

５、　宿主細胞は真核宿主細胞である請求の範囲第４項記載の形質転換宿主細胞。

６、　宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である請求の範囲第４項記載の形質転換宿主細胞。

７、　請求の範囲第４項記載の形質転換宿主細胞を培養することから成る機能的ヒトＶＷＦの生産方法。

８、　請求の範囲第５項記載の形質転換宿主細胞を培養することから成る機能的ヒトＶＷＦの生産方法。

９、　請求の範囲第６項記載の形質転換宿主細胞を培養することから成る機能的ヒトＶＷＦの生産方法。

１０、斯く生産されたＶＷＦを精製することからなる請求の範囲第７項記載の方法。

１１、斯く生産されたＶＷＦを精製することからなる請求の範囲第８項記載の方法。

１２、斯く生産されたＶＷＦを精製することからなる請求の範囲第９項記載の方法。

１３、請求の範囲第７項記載の方法によって生産されたＶＷＦ。

１４、請求の範囲第８項記載の方法によって生産されたＶＷＦ。

１５、請求の範囲第９項記載の方法によって生産されたＶＷＦ。

１６、検出可能な標識で標識された、ＶＷＦまたはその断片をコードするＤＮＡから成る哺乳動物ＤＮＡ試料を分析するためのＤＮＡプローブ。

１７、ＶＷＦをコードするＤＮＡはヒトＤＮＡである請求の範囲第１６項記載のプローブ。

１ｇ、ｌｌｉ乳動物ＤＮＡ試料を請求の範囲第１７項記載のプローブと接触させ、該プローブが該試料とハイブリダイズするかどうか調べることから成る、哺乳動物ＤＮＡ試料の分析方法。

１９、該ＤＮＡ試料はヒトＤＮＡである請求の範囲第１８項記載の方法。

２０、哺乳動物ＤＮＡ試料を制限酵素消化により断片化し、該ＤＮＡ断片を大きさに基づいて分離し、該断片を請求の範囲第１７項記載のプローブと接触させ、そして該ＤＮＡ断片の相対的長さを調べることから成る哺乳動物ＤＮＡ試料の分析方法。

２１、該ＤＮＡ試料はヒトＤＮＡである請求の範囲第２０項記載の方法。

国際調査報告１ｍｌｍ−−１ｌ１＾６６１１ｃ＋＋嘗Ｉ開−ＰＣＴ／ＵＳ８６１００７６０１削ｅｍａ＋Ｉ＋ｎｉｌム””””ＯＰＣＴ１０５１１６１００７６０ＰＣＴ１０５８６１００フロ０ＶＬ　０ＢＳＥＲＶＡＴＩＯＮＳ　ＷＦＩＥＲＥ　ＯＮ工ＴＹ　ＯＦ　ＸＮＶＥＮＴ工ＯＮ　ＸＳ　ＬＡＣＫ工ＮＧ

Claims

【特許請求の範囲】

１．実質的に表２に示すアミノ酸配列を有するヒトフォン・ビルブラント因子をコードし且つその他のヒト遺伝子を実質的に含まないＤＮＡ配列。
２．実質的に表２に示すヌクレオチド配列またはそれにハイブリダイズし得る配列によってさらに特徴づけられる請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。
３．請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列と、それに結合された、上記ＤＮＡ配列を宿主細胞内で発現させて活性ＶＷＦを生産しうる調節ＤＮＡを含む発現ベクター。
４．請求の範囲第３項記載の発現ベクターを含む真核細胞を培養することから成る、他のヒトタンパク質を実質的に含まない生物学的に活性なヒトＶＷＦの生産方法。
５．真核細胞は哺乳動物細胞である請求の範囲第４項記載の方法。
６．哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求の範囲第５項記載の方法。
７．哺乳動物細胞はＣＯＳ細胞である請求の範囲第５項記載の方法。
８．請求の範囲第４項記載の方法により生産されたＶＷＦ。
９．請求の範囲第５項記載の方法により生産されたＶＷＦ。
１０．請求の範囲第６項記載の方法により生産されたＶＷＦ。
１１．検出可能な標識で標識された、ＶＷＦまたはその断片をコードするＤＮＡから成る哺乳動物ＤＮＡ試料を分析するためのＤＮＡプローブ。
１２．ＶＷＦをコードするＤＮＡはヒトＤＮＡである、請求の範囲第１１項記載のプローブ。
１３．哺乳動物ＤＮＡを請求の範囲第１２項記載のプローブと接触させ、該プローブが該ＤＮＡ試料とハイブリダイズするかどうか調べることから成る哺乳動物ＤＮＡ試料の分析方法。
１４．該ＤＮＡ試料はヒトＤＮＡである請求の範囲第１３項記載の方法。
１５．哺乳動物ＤＮＡ試料を制限酵素消化によって断片化し、該ＤＮＡ断片を大きさに基づいて分離し、該断片を請求の範囲第１２項記載のプローブと接触させ、そして該ＤＮＡ断片の相対的長さを調べることから成る哺乳動物ＤＮＡ試料の分析方法。
１６．該ＤＮＡ試料はヒトＤＮＡである請求の範囲第１５項記載の方法。