JPS61501168A - 生長因子における改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生長因子における改良 本発明は、＠乳動物の細胞生長の異常の検出および哺乳動物の細胞生長の制御に おいて主要な新規なポリペプチドに関する。

培養における細胞の増殖の：Ａ節は、１系列のポリペプチドの生長因子を包含す るある数のミドケンにより影響を受けることがある。前記生長因子は、＠独であ るいは他のミトゲンと協働的に作用して、ＤＮＡの合成および特定の標的細胞の ｋｆｇ殖を誘導することができる。（最近の概説は参考文献ｌを参照）。表皮の 生長因子（ＥＧＦ）および血小板誘導生長因子（ＦＤＧＦ）は多分最も特徴づけ られている生長因子であるが、これらのポリペプチドの生体内の精確な機能は不 明確である。ＥＧＦは新しく産まれたマウスにおけるまぶたの開きおよび９Ｊ歯 の発生を早期に誘導するであろうから、細胞の増殖および分化においである役割 をなしうる（２）、ＰＤＧＦは他方において、傷を受けた部位における凝血の形 成の間に血小板から放出され、補修の過程におけるある役割を有しうる（３）。

これらおよび他の生長因子は、生体外において、種々の形態学的および生化学的 変化を開始させ、それらの変化は形質転換された細胞の特性に類似し、そしてま た形質転換および腫瘍誘導細胞系統により示される増殖の異常な調節において関 係づけられた（（４，５）において概説されている）。こうして、形質転換され た細胞は生長因子を合成しかつそれに対して応答することができ、結局「オート クリン（ａｕｔｃｒｉｎｅ）」の分泌を経て独立に増殖することができることが 示唆された（６）。異常な細胞増殖の制御における異常に発現された生長因子に ついてのこのようなオートタリンの役割についての直接の支持は、サルの肉腫ウ ィルス（ＳＳＶ）の推定上の形質転換性タンパク質（Ｐ２８また培五にいて細胞 のための生長因子とじてＰＤＧＦに似た機能をなしうる（１０）という発見から 最近得られた。形質転換された細胞により生産される他の生長因子、例えば、イ ンシュリン様生長因子（ＩＧＦ）（１１，１２）、線維芽細胞誘導生長因子（１ ３，１４）および形質転換性生長因子（ＴＧＦｓ）（１５〜２０）は、増殖のオ ートタリン調節体として作用しうる。生長因子の生産の：Ａ節により仲介ξれる 特毘性のほかに、細胞の＃異性はまたいくつかの他のレベルにおいて制御されう るであろう一最も明らかなものは標的細胞上にのみ存在する特定の受容体への配 位子の結合によるものである。さらに、１つの生長因子のその特定の受容体への 結合は、また、他の生長因子のその受容体への現相性により変更されうる（例え ば、ＰＤＧＦおよびＥＧＦ受容体（２１，２２））。逆に、２つの生長因子は、 αＴＧＦｓおよびＥＧＦｉ用いる場合に現われるように、同一の受容体へ結合す ることができる（２３．２４）。

異る生長因子のそれらの特定の受容体への結合は、イオン運動および細胞内のｐ Ｈの急速な変化、チロシン特異性蛋白質キナーゼの刺激およびＤＮＡおよびある 種の標的細胞の増殖を最高にすることができるいくつかの他の変化を包含する生 化学的事象のカスケー）’　（（ａｓｃａｄｅ）を誘導できることは明らかであ る（１．４〜６）。少なくともＥＧＦ受容体の場合において、ＥＧＦの主要な機 部は受容体の架橋または配座の変化を誘導することであり、そしてこのような活 性化に引き統いて、増殖の応答を開始させるために必要な「情報」のすべては受 容体自体中に存在しうるように思われる（参考文献ｌ中の概観参照）、ＥＧＦ受 容体に固有な１つの既知の機能はチロシン残基をホスホリル化（ｐｈｏｓｐｈｏ ｒｙｌａｔｅ）する能力であり、これは腫瘍遺伝子が王工至に関係づけられるレ トロウィルス（ｒｅｔ　ｒｏｖｉ　ｒｕｓ）の族の推定上の形質転換性蛋白質の うちの５つと共有するが、２つの他のものと共有しない性質であり、前記蛋白質 は匹且旦およびｅｒｂ−Ｂにより暗号化（ｅｎｃｏｄｅ）されている（２９）、 現在、このチロシンキナーゼ活性は、レトロウィルスのこのサブセット（ｓ　ｕ 　ｂ　ｓ　ｅ　ｔ）の肺癌遺伝Ｆに関連する唯一・の機能的活性を提供する。腫 瘍のこの族は、従来、生長因子受容体として機能する細胞の同族体を有するもの として同定されなかっｔ−６ われわれは、Ａ４３１細胞および胎盤からモノクローナル免疫親和性精製により 単離されたヒトＥＧＦ受容体からの６つの明確なペプチドのアミノ酸配列分析を 決定し、そして配列された残基の８３のうちの７４がトリ赤−！Ｆ珪症ウィルス （Ａ　Ｅ　Ｖ）のｖ−ｅｒｂ−Ｂ腫瘍遺伝子により暗号化される形質転換性蛋白 質のそれと同一であることを示す（３ｏ）引き続く研究（ウルリンヒら（７６） ：ｌは、ｖ−ｅｒｂ−Ｂ腫瘍遺伝子とと）ＥＧＦ受容体との間の相同性を確証し 、そしてＡＥＶがトリＥＧＦ受容体の一部分のみを暗号化する獲得された細胞配 列を有することを示す残りの相同配夕１を記載する。証拠のいくつかの系統は、 ｖ−ｅｒｂ二互腫瘍遺伝子がＥＧＦ受容体の膜内外領域、チロシンキナーゼ活性 に関連する領域およびＥＧＦ結合部位を含まない受容体の短い区域のみをｒｂ− Ｂを含む腫瘍遺伝子の且工至関連サブセットは、生長因子受容体を暗号化しかつ 制御されない受容体機能の発現による形質転換を生成する細胞配列から誘導され る。

ｖ−ｅｒｂ−Ｂ腫瘍遺伝子はヒトＥＧＦ受容体との有意の相同性を含有すること を、われわれは発見した。ヒトＥＧＦ受容体およびその遺伝子の構造的変更ある いはヒ）ＥＧＦ受容体遺伝子の転写および発現の変更は、人間における腫瘍形成 に統合的に含まれうろこと、およびそれゆえヒトＥＧＦ受容体を含むアッセイお よび治療が人間における腫瘍の測度としであるいは腫瘍の抑制について保証され ることが今回明らかであると、われわれは結論する。

このような人間におけるアッセイは、体液または組織などの中の、生長因子受容 体類およびそれらを暗号化するｍ　ＲＮ　Ａ転写体および遺伝子の構造的変更ま たは異常な発現の検出を含むことができる。このような構造的変更の例は、少な くともＮ−末端における受容体の裁断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）である、治療は 反応物質（ｒｅａｇｅｎｔ）、例えば、異常な受容体を認識する抗体の使用を含 むことができる。アッセイは調製レベル、ＲＮＡレベルまたはＤＮＡレベルで実 施することができる。最初に、受容体のアミノ酸配列の部分のわれわれの知識は 診断において価値ある反応物質の発生を可能とし、そして受容体の完全なアミノ 酸配列のわれわれの後の決定はこの分野におけるわれわれの知識を拡大した。

このような反応物質の例は、次の配列のあるいは配列を含む合成ボリ〆プチドエ である： Ｅ　Ｌ　Ｖ　Ｅ　Ｐ　Ｌ　Ｔ　Ｐ　Ｓ　Ｇ　Ｅ　Ａ　Ｐ　Ｎ　Ｑ　Ａ　Ｌ　Ｌ　 ＲＩ　ａｔたは　ＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫ　Ｉ　ｂまたは　ＧＬＷＩ　ＰＥＧ ＥＫ　Ｉ　Ｃまたは　ＹＬＶＩＱＧＤＥＲＩｄ ！たは　ＤＶＶＤＡＤＥＹＬｒ　ＰＱＱＧＦＦ　Ｉ　ｅマタは　ＧＳＨＱＩ　５ ＬＤＮＰＤＹＱＱＤＦＦ　Ｉ　ｆ配列Ｉａ−Ｉｆを含むポリペプチドはＥＧＦ受 容体の截断の例であり、そして以下においてポリペプチドエと呼ぶとき、上の配 列１ａ〜工ｆを含むポリペプチドのみならず、また少なくともＮ末端において截 断された他のＥＧＦ受容体断片を呼ぶことを意味する。

「合成」とは、化学的に１例えば、固相技術により、合成されたこと、あるいは 、上に定義したポリペプチドエを、自然でない状態において、生合成しない細胞 により生化学的に合成されたことを意味する。

明細３において、アトラス・オブ・プロティン・シークエンシズ（Ａｔ　ｌａｓ 　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）（１９７２）に記載されている ような自然に産出するＬ−アミノ酸についての国際的に認識された略号を使用す る。

詳しくは２次の略号を使用する： Ｃ＝システィン　Ｎ＝アスパラギン Ｄ＝アスパラギン酸　Ｐ＝プロリン Ｅ＝グルタミンｍ　Ｑ＝グルタミン Ｆ＝フェニルアラニン　Ｒ＝アルギニンＧ；グリシン　Ｓ＝セリン Ｈ：ヒスチジン　Ｔ＝スレ不ニン ■＝イソロイシフ　ｙ＝バリン ポリペプチドエは新生物および他の病気におけるＥＧＦ受容体を含む異常の診断 において重要である。この目的で、重要性はポリペプチドエそれら自体ばかりで なく、かつまたそれらの類似体、例えば、ポスボリル化類似体および脂質基のよ うな基が分子中に導入されて薬物の標的化（ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ）を促進され ている類似体に集中される。

ポリペプチド■は、また、癌細胞中の正常または異常のＥＧＦ受容体の活性を阻 害するうえで重要である。この目的に、重要性はポリペプチド■ばかりでなく、 かつまた変異型がアミノ酸配列中に生じうるが、類似体が宿主において実質的に 同一の抗原の応答をなお誘発するであろうポリペプチド■の類似体に集中される 。

ポリペプチド■は、ポリペプチドＩを暗号化する合成オリゴヌクレオチド■の構 成の基準を提供し、このようなオリゴヌクレオチド■は異常な受容体の発現の診 断において価値をもつ０合成オリゴヌクレオチド■は、また、■のヌクレオチド 配列およびその延長部を含有するｃＤＮＡのクローンの同定において価値をもち 、延長されたオリゴヌクレオチドそれら自体は病気における異常な受容体の診断 においてとくに価値をもつ、これらの合成オリゴヌクレオチド■は本発明お他の 面を形成する。

本発明の他の面によれば、上に定義した式１のポリペプチドを化学的に合成する ことからなる上に定義した式■の合成ポリペプチドを生産する方法が提供される 。ここで末端アミ７基および末端カルボキシ基および中間のアミノ基またはカル ボキシ基は、ペプチド合成において普通に使用される保Ｍ基で保護されており、 次いで保護基は除去される。この合成において、本発明のポリペプチドは、例え ば、一度に１つのアミノ酸単位、あるいは合成の各工程においていくつかのアミ ノ酸単位のプロ、りを使用して所望のアミノ酸配列を構成するメリフィールド（ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）の技術に従い固相法により合成することができる。

ペプチドの合成の慣用法に従い、反応性の末端のアミン基およびカルボキシ基な らびにペプチド鎖中の中間位置の位置する潜在的に反応性の基を保護して、反応 が所望の生長点においてのみ起こるようにし、そして最終工程において１種々の 保１基を慣用法により除去することができる。

本発明のなお他の面によれば、−ヒに定義した合成ポリペプチドＩを製薬学的希 釈剤または担体と関連した含む製剤が提供される。

本発明にさらに他の面によれば、マウスに上に定義した合成ポリペプチドＩを注 入し、注入したマウスの牌細胞を骨髄腫細胞と交雑してハイブリドーマを形成し 、モしてハイブリドーマにより発現されたモノクローナル抗体を回収することか らなるモノクローナル抗体を調製する方法が提供される。

本発明にさらになお他の面によれば、前述のハイブリドーマから得られるモノク ローナル抗体およびこのようなモノクローナル抗体を製薬学的希釈剤または担体 と関連した含む製剤が提供される。

図面の説明 第１図は、Ａ４３１細胞およびヒト胎盤からのＥＧＦ受容体の免疫精製を示す。

第２図は、ＥＧＦ受容体からのトリプシンのペプチドの逆相ＨＰＬＣ分析におけ る、アセトニトリル濃度に対してプロットした２０６ｎｍにおける溶離液の光学 濃度を示す。

第３図は、配列分析のためのＥＧＦ受容体からのペプチドの精製において生成さ れる、アセトニトリル濃度に対してプロ７．トシた２０６ｎｍにおける溶離液の 光学濃度を示す。

第４図は、ＥＧＦ受容体からのペプチドの配列分析を示す。

第５図は、ＥＧＦ受容体ペプチドのアミノ酸配列とＶ−王工至およびＶ−１工に 旦の推定上の形質転換性蛋白質の予測されたアミノ酸配列との間の関係を示す。

第６図は１種々の正常組織および腫瘍組織からのＤＮＡのサウザーンψプｏ、ト （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）交雑分析を示す。

第７図は、受容体遺伝子およびＲＮＡレベルにおけるその発現を分析するために 使用した核酸プローブを示す。

第８図は、正常組織腫瘍組織におけるｍ　ＲＮ　Ａの発現の分析を示す。

ＥＧＦ受容体の精製 ＥＧＦ受容体は、種々の細胞において、標識ＥＧＦをその受容体へ架橋すること （３２において概説されている）により、ＥＧＦＭ合を測定すること（３１にお いて概説されている）にって、あるいはモノクローナル抗体の使用（３３〜３８ ）によって検出されうる。この研究において、受容体は２つの源から精製された ：他の細胞の大部分よりも約５０倍程度に多くの受容体を発現するヒト類表皮の 癌細胞系統Ａ４３Ｌ（３９．４０）および正常組織から入手容易であるヒト胎盤 （４１）。ヒトＥＧＦ受容体を認識するモノクローナル抗体の最近の＠＠（３４ ，３８）は、受容体の精製のために免疫親和性クロマトグラフィーの使用を可能 とした。ここで、われわれは、免疫親和性クロマトグラフィーまたはＥＧＦ親和 性クロマトグラフィー（２６）により精製されたＥＧＦ受容体蛋白質のペプチド のマツピング（ｍａｐｐｉｎｇ）により比較し、亡してまたＡ４３１および胎盤 の受容体の構造を比較する。

モノクローナル抗体（Ｒ１）を使用する放射線免疫アンセイ（ＲＩＡ）か種々の 調製技術を定量化するために使用された（４２）、Ａ４３１ｉ胞および胎盤から の両者の受容体は、多分細胞のリソロームの隔室からプロテアーゼが放出される 結果、洗浄剤可溶化全細胞または組織のリヤイト中において不安定であることが わかった。この問題は、シンジチオトロホブラスト（ｓｙｎｃｙｔｉ、：＋ｔｒ ｏｐｈｏｂｌａｓｔ）ミクロウィルスの血漿膜の調製により胎盤について克服さ れ、そしＣ５０倍の精製の結果として、受容体の３０％の収率が達成された。不 都合なことには、Ａ４３１細胞では、血漿脱調製物中の受容体の収率は実際的で はないほどに低かった。しかしながら、受容体ＲＩＡを用いる定量的研究により 、リゼイトのｐＨの８．５への急速な調節、および引き続く細胞リゼイト全体の 急速な免疫親和性クロマトグラフィーはプロテアーゼの影慄を最小にすることが 示された。

昭盤膜を可溶化し、そしてＳ蛋白質を小麦の麦芽（ＷＧＡ）の親和性クロマトグ ラフィーにより分離して部分的な精製がなされた０次いで、ＥＧＦ受容体を胎盤 の糖蛋白質分画から、あるいはＡ４３１細胞のリゼイトから、それぞれアガロー スまたはセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）丘に固定化されたモノクローナル 抗体Ｒ１（３４）または２９−１（３８）の疫親和性クロマトグラフィーにより 精製された。非特異的に結合した蛋白質は高塩緩衝液で洗浄することにより除去 され、そして受容体はＰＨ３において溶離された。受容体は、さらに、調製用Ｓ ＤＳポリアクリルアミドゲルまたはグアニジン溶液中のゲル透過ＨＰＬＣにより 精製された。用いた方法および精製された受容体の収率は第１図を参照して詳述 される。ＥＧＦ結合および蛋白質キナーゼ活性は精製の間に部分的に破壊される ので、受容体は、また、ＥＧＦ親和性クロマトグラフィーにより精製された（２ ６）、次いで、比較ＨＰＬＣトリプシノペプチドのマツピッグを実施して、Ａ４ ３１細胞および胎盤組織から免疫親和性クロマトグラフィーにより調製された受 容体の純度および構造を確立した。受容体のペプチドのマンプ（第２図参照）は 、受容体がＡ４３１細胞からあるいは胎盤組織から、ＥＧＦ親和性クロマトグラ フィーあるいは免疫親和性クロマトグラフィーのいずれかによって精製かにかか わらず、受容体トリプシンペプチドの溶離のプロフィルは非常に類似することを 示した。

アミノ酸配列の決定 受容体は、還元およびアルキル化（４４）してジサルファイト結合を切離した後 、免疫親和性クロマトグラフィーおよび引き統く調製用ＳＤＳゲル電気泳動また はグアニジン中のゲル透過ＨＰＬＣ（４３）により精製された（第１図参照）。

次いで、精製された受容体をトリプシンまたは臭素化シアンで消化しく第２図お よび第３図参照）そしてペプチドを調製用逆相ＨＰＬＣ（４５，４６）により分 離した（第３図）、アミノ酸配列を気相シークエンサー（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ） （ヘライックら（４７）に記載されるように構成されかつ操作される）を使用し 、ＰＴＨアミノ酸の定１の分析技術（ウォーターフィールドら（４８）に記載さ れる）に従い決定した。６ペプチドの分析についての定量データは第４図に示さ れている。

ｖ−ｅｒｂ−Ｂ形質転換性蛋白質との配列の比較と）ＥＧＦ受容体からの１４、 ＃３盤からの３およびＡ４３１細胞からの１１の異るペプチドのアミノ酸配列を 、腫瘍遺伝子配列のデータ塩基中の配列（発表された配列を使用［、てＩＣＲＦ において構成された）と、ウィルバーおよびリプマンの急速サーチ技術（４９） により比較した。これらのペプチドのうちの６の配列とＡＥＶ−Ｈの推定上の形 質転換性蛋白質ｖ−ｅｒｂ−Ｈの予測された配列の区域との間に著しい同一性か 見い出された。これらの６シークエンスド（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）ペプチドから の８３アミノ酸残基のうちで、それらをｖ−ｅｒｂ−Ｂ暗号（ヒ調製配列と一緒 に整列させたとき、第５図に示すように、７４残基は同一であり、そして４残基 は保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔ　１ｖｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を示し た。ペプチドｌはｖ−ｅｒｂ−Ｂ蛋白質のアミン末端（残基１０７〜１２５）に 付近に位置し、ペプチド６はＣ−末端（残基５８５〜５９９）に位置し、そして 他の４ペプチドはそれらの間に位置した。整列を較適化するために、なんらかの 欠失または挿入を配夕１中に導入することは不必要であった。

ｖ−ｅｒｂ−Ｂ蛋白質とＥＧＦ受容体配列との間の完全な程度の類似性はこれら の制限された配列の研究により明らかにされないが、残基１０７からＣ−末端ま でのｖ−ｅｒｂ−Ｂ蛋白質の区域はＥＧＦ受容体に対する広い相同性を有するよ うに思われる。観察される同一の程度は非常に高く、そしてＡＥＶのｖ−ｅｒｂ −Ｂ配列は多分トリ由来であり（３０）一方ＥＧＦ受容体配列はヒト蛋白質から のものであるので、Ｖ−ｅｒｂ−Ｂ配列はトリＥＧＦ受容体を暗号化する細胞配 列からのＡＥＶにより主として獲得されるように思われる。これはｃ−ｅｒｂ− Ｂ遺伝子座が人間および鳥類におけるＥＧＦ受容体を暗号化することを示唆して いる。

ＥＧＦ受容体から精製された１４ペプチドのうちの８つのアミノ酸配列（データ な示されていない）は、ｖ−ｅｒｂ−Ｂ蛋白質の予測される配列と整列させるこ とができなかった。ＥＧＦ受容体の糖蛋白質のポリペプチドの主鎖は約１２５ア ミノ醜であると考えられ（５０）そして予測されるｖ−ｅｒｂ−Ｂ蛋白質はわず かの６０４アミ／酩である（３０）ので、最ももつともらしい説明はこれらの８ ペプチドがＡＥＶによりＷｃ得されなかったｃ−ｅｒｂ−Ｈの区域により暗号化 されとしλうことである。これはＡＥＶにより獲得されるＥＧＦ受容体の解読配 列の一部分のみを生ずる組み換え事象により生じえたであろう、受容体の解読配 列のＤＮＡの再配置は免疫グロブリンを用いて判明されるものと同様に起コルコ トがアルが、差次的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ｍＲＮＡの切り継ぎはこのよ うなＭｌみ換え事象のいずれかに含まれることはより起こりやすいであろう。九 類の細胞は２つのｃ−ｅｒｂ−Ｂの関連する転写体を含有することが示され（５ １）モしてＡ４３１細胞におけるＥＧＦ受容体の生合成の研究は正常の受容体お よび裁断された受容体の両者が合成可能であることを示唆している（５０）。あ るｌ、Ｘｊ±、ＥＧＦ受容体のアミノ酸配列に非常に類似するアミノ酸配列を有 するポリペプチドを暗号化する２以上の遺伝子座は染色体上に存在する（下を参 照）。トリプ―／ンキアーゼ活性をもつ２つの密接に関連する推定上の形質転換 性蛋白質の例か、トリのレトロウィルスのラウス家鶏肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ）お よびＹ６３の研究（５２）において報告された。王工至およびヱ且により暗号化 される蛋白質の予測されるアミノ酸配列は４３６アミ、ノ酸残基を包含する区域 にわたって８２％で相同である（しかしＤＮＡ配列は全体でわずかに３１９６で 相同である）ことが示された。そして、多分、ニワ）りのゲノムは配列の広範な 区域を共有する別々の蛋白質を暗号化する両者の王工至およびｙｅｓのプロト− 腫瘍遺伝子を含有するであろう。ヒトｃ−ｓｒｃおよびｃ−ｙｅｓが密接に結合 する遺伝子座により暗号化されるかどうかは知られていない。しかしながら、ヒ ト−マウス体細胞の雑種の分析は、ヒトＥＧＦ受容体を暗号化する遺伝子座か染 色体７　（７ｐ１２−７ｑ２２）上の存在すること（５３〜５５）およびｃ−ｅ ｒｂ−Ｂについてこの染色体の同一区域（７ｐｔｅｒ−７ｑ２２）中に存在する こと（５６）を示した。

配列の共有区域 証拠のいくつかの系統は、ＥＧＦ受容体蛋白質を次の３つの主要な領域に分割で きることを示唆している：血漿膜（ｐｌａＳｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）の外側に 横たわるＥＧＦ結合領域、膜内外（ｔ　ｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）領域、およ びキナーゼ活性および自己ホスホリル化（ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉ ｏｎ）部位の両者を有する細胞質キナーゼ領域。

受容体の生合成の研究は、Ａ４３１受容体が見掛は分子量が１７５゜ＯＯＯであ り、そしてほぼ３７，０００の分子量のオリゴサツカリド側鎖およびほぼ１３８ ，０００の分子量のポリペプチド主鎖を有する糖蛋白質（約１．２５０アミノ酸 ）であることを示した。成熟受容体の制限した蛋白質加水分解は、オリゴサツカ リド側鎖およびモノクローナルＲ１のための抗原部位を含有する血漿膜に対して 外部の領域が約１１５゜００の分子ψ（約６４０アミノ酸）を有することを示唆 している（５０）。いくつかの研究は、ＥＲＦ結合部位ＧＡ血漿膜に対して外部 に存在することを示している（２５，３１．３２）。

チロ／ノキナーゼ酵素活性および自己ホスホリル化部位の細胞質上の位置は、Ａ ４３１および胎盤の膜の小胞を用いてなされた研究により支持される。

これらが示すように１人工基質あるいは自己ホスホリル化部位に対して向けられ たＥＧＦをまねたトリプシンキナーゼ活性は膜の透過性化の後においてのみ有意 に活性化される。さらに、トリプシンキナーゼ活性はｐｐ３３−膜の細胞質側に 位置することが知られている蛋白質−をホスホリル化することができる（５７） 、さらに、妓近の研究により示さ−５ｒｃ れるように、ｐｐ６０　からの合成ペプチドに対してレイズ（ｒａｉｓｅ）され た抗体は、ｖ−ｅｒｂ−Ｂの配列に対して相同である配列の区域からのものであ るヒトＥＧＦ受容体を認識する（下参照）、これらの部位は透過性化則胞におい のみて接近可能である。

自己ホスホリル化部位はペプチド５内に位置しく第１図）、そしてこのペプチド は自己ホスホリル化受容体中に存在する３　２Ｆ？！識の７０％を含有する分子 、”　２０　、　ＯＯＯの臭化シアン断片である（第３Ａ図を参照）、ホスホリ ル化された残基の精確な位置は決定されていないが、コンセンサス（ｃｏｎｃｅ ｎｓｕｓ））リプシンホスホリル化配列（５８）はこのペプチドのアミン末端付 近に見い出された。したがって、トリプシンホスホリル化部位は、ｖ−ｅｒｂ− Ｂ蛋白質と共有する配列中に含有されるＥＧＦ受容体の細胞質領域内に横たわる と、われわれは信する。

受容体のアミノ酸配列の基づいて合成された合成オリゴヌクレオチドのプローブ を使用するＡ４３１　ｃＤＮＡのライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）から選択され るｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンの予備的ヌクレオチドの合成は、ＥＧＦ受容体の予測 されるカルボキシル末端が予測されるｖ−ｅｒｂ一旦蛋白質配列の残基６０１（ 第５図参照）に等しいアミノ酸から２５アミノ酸配だけ延びていることを示して いる（ウルリッヒら、７６）、この分析は、完結すると、ＥＧＦ受容体の推定細 胞質領域の精確な大きさおよび配列を示すであろう。この簗域の概算分子量は６ ０．０００　（または５５０アミノｆＩＪ）であろう、なぜなら、膜に対して外 部である部分は１１５，０００の分子量を有すると考えられるからである（上を 参照）（５０）。こうして、細胞質領域は、残基６６〜８８において推定上の膜 内外配列に対してカルボキシ末端であるｖ−ｅｒｂ−Ｂの区域（第５図および（ ３０）参照）に大きさが類似することが推定されるであろう。ｖ−ｅｒｂ−Ｂの このカルボキシ末端は、分子量が５６，０００でありかつ５１０アミノ酸を有す るであろう。

ｖ−ｅｒｂ−Ｈの推定上の１！り内外配列は、Ｍｆｉ挿入のための信号配列にか 精確に先行していない。それにもかかわらず、ＡＥＶ形賀転換細胞の免疫蛍光分 析は、ｖ−ｅｒｂ−Ｂ蛋白質が血漿膜に対して外部の抗原部位を有することを示 した（５９）。この外部の信号区域は、多分、推定上の膜内外配列に先行する６ ５残基のアミノ末端区画に相当し、そしてオリゴサツカリドの結合認識配列ａｓ ｎ−ｘ−ｓｅｒ’ｚたはｔｈｒを有する３つのアスパラギン残基を含有する。こ れらの残基のいくつがあるいは全部はグリコキシル化されていることがある。な ぜなら、ＡＥＶ感染細胞からのｍＲＮＡの生体外翻訳の研究により、形成されつ つあるポリペプチドの後翻訳過程が膜の小胞の存在下に起こることが示されたか らである（５９．６０）。

これらの研究を総合すると示唆されるように、予測されるｖ−ｅｒｂ二五形質転 換性蛋白質はＥＧＦ受容体の膜内性区域および細胞質であると考えられる領域に 密接に類似する。ｖ−ｅｒｂ−Ｂ配列がＥＧＦ受容体を暗号化する遺伝子から獲 得されると、ｖ−ｅｒｂ−Ｂ蛋白質はＥＧＦ結合領域を欠く裁断された受容体を 表わす。Ａ４３１細胞中のＥＧＦ受容体の生合成は、受容体の外部領域（１１５ ，０００の分子量）に等しいポリペプチドが正常の受容体に加えて合成される（ ５ｏ）ことを示唆していることは、とくに興味深いことである。この裁断受容体 の由来を理解するためにさらに研究することが必要であるが、欠陥のある受容体 がこのヒト腫瘍細胞系統により合成されうろことを結果は示している。

生長因子および杉賀転換 最近、サル肉腫ウィルスの形質転換性蛋白質は生長因子ＰＤＧＦに近い構造およ び機能的関係を有することが示され、このことはオートタリン生長凶子の生産が 異常な生長の制御および新形成において含まれうるという仮説を支持する。これ らの観察はここに記載したものと一緒になって、正常の生長の調節の破壊の２つ の明確であるが、関係する機構を説明する。ＳＳＶの場合におし・て、腫瘍遺伝 子は、ＰＤＧＦ受容体を有する標的細胞のためのミトゲンとして作用しうる生長 因イを暗号化する（１０）。ＡＥＶは他方において異る機構を用いたよフに思わ れ、ここでＥＧＦ信号の導入において含まれると考えられる生長因子受容体の部 分が形質転換された細胞中において発現されうる。ＥＧＦ結合領域の不存在は配 位子結合により発生される制御を除去中ることがあり、そしてその結果ＥＧＦに より生成される信号に等しい信号が連続的に発生され、こうして細胞は急速に増 殖することができるであろう。これがＡＥＶ感染造血において観察される分化に おいてブロック（ｂｌｏｃｋ）をどうして生じさせることかできる（６１）かは 明らかではない。しかしながら、ＥＧＦはケラチノサイト（ｋｅｒａｔ　１ａｏ ｃｙｔｅ）の増殖を促進するが、末端の分化を阻止することが示された。

ＡＥＶｔ７）ＥＳ４株は２つの腫瘍遺伝子ｖ−ｅｒｂ−Ａおよびｖ−ｅｒ−【二 重を有し、それらはそれぞれ分子埴７５，０００および６５　、０００の蛋白質 を暗号化すると考えられる（最近の概説６２参照）、生体外および生体内におい てＡＥＶにより形質転換された細胞は後期の赤血球の先駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔ ｏｒ）である赤芽球の性質を有するが、標的細胞それら自体は早期の赤血球の先 駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）細胞であることができる。Ａ、ＥＶは、また、線維 芽細胞を形質転換し、そして肉腫を誘導することができる。欠失突然変異体（６ ３）からおよびＶ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子を欠く単離物（ＡＥＶ−Ｔ（（３０））ｉ ）らの証拠は、ｖ−ｅｒｂ−Ｂは単独で形質転換を誘導できることを示唆する。

これは次の事実を示す研究により支持される。すなわち、腫瘍遺伝子をもたない 鶏白血病ウィルスＲＡＶ−１は、現在ｃ−ｍヱ至の活性化（６５〜６７）につい て解明されているものに類似すると思われるプロモーグーの挿入機構（６４）に よりｃ−ｅｒｂ−Ｂ遺伝子を活性化できる。

ＲＡＭ−１は正常受容体または裁断受容体の発現を誘導することが可能である。

ＥＧＦ受容体は造血細胞上においてＥＧＦの結合の研究により一般に検出されて きていないが、これらの研究は範囲および感度において制限されるので、異る造 血細胞のタイプにおける正常の受容体の発現についての結論をなすことができる 前により厳密な調査を必要とする。

多くの正常細胞は１０〜１００．０００のＥＧＦ受容体を発現する（３１）が、 非常の低いレベルのｃｅｒｂ−Ｂ転写体が正常のヒヨコ線維芽細胞中に見い出さ れた（５１）だけであり、しかしながら、正常および新生のヒトリンパ球の最近 の研究は、両者のタイプの細胞がｃ−ｅニーに旦関係転写体を含有することを示 唆している。

以前の報告が示すように、腫瘍遺伝子ｅｒｂ−Ｂ、王ＩＣ，ｙｅｓ、１且ユ、１ ヱユ、ｍｏｓおよび１互ユにより暗号化される推定上のウィルスの形質転換性蛋 白質は、相同性をもつ区域を示す（２９，３０，６９）・１工至、Ｌ１至、ｆｅ ｓ、ｆ上」−１および１互ユの場合において、推定上の形質転換性蛋白質はトリ プシンキナーゼ活性をもつことがびαＴＧＦ、ＦＤＣＦ、インシュリンおよびＩ ＧＦ−１は、また、関連するチロシンキナーゼ、ｖ−ｅｒｂ−Ｂ形質転換性蛋白 質とここで観察するＥＧＦ受容体との間の構造的関係を有するが、レトロウィル スのこのサブセットからの他の腫瘍遺伝子はこれらを暗号化する配列または他の 生長因子受容体から一部分誘導されるとわれわれは信する。

ＥＧＦ受容体、その裁断およびそれに対する抗体のアッセイにおいて使用される 診断法は普通のものである。これらは競争的（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）、サン ドインチおよび無菌的阻害の技術を包含する。最初に２つの方法はこの方法の統 合された部分として相分離工程を用いるか、無菌的阻害のアッセイは単一の反応 混合物中で実施される。一方においてＥＧＦ受容体またはその裁断体のアッセイ についての方法学および他方において受容体およびその裁断体を結合する物質に ついての方法学は未質的に同一であるが、ある方法はアッセイされる物質の大き ざに依存して好適であろう。したがって、試験すべき物質をここでは分析物（ａ ｎａｌｙｔｅ）と呼び、そして分析物に結合する蛋白質を、それが抗体、受容体 または抗原のいかんにかかわらず、結合蛋相手（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐａｒｔｎｅ ｒ）と称する。

ここにおいて用いる分析法はすべて次の反応物質の１種または２Ｍｉ以上を使用 する：標識分析物類似体、固定化分析物類似体、標識結合相手、固定化結合相手 および立体接合体（ｓｔｅｒｉｃ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、標識反応物質は、ま た、「トレーサー」として知られている。

使用する標識は１分析物およびその結合相手の結合を妨害しない検出可能な官能 性である。多数の標識が特定の結合アッセイにおける使用のために知られており 、例は酵素、例えば、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ　ラジオアイソトープ 、例えば、′４Ｃおよび１３１１、蛍光団、例えば、希土類のキレートまたはフ ルオレセイン、スピン標識などを包含する。慣用法はこれらの標識を蛋白質また はポリペプチドへ共有結合するために利用できる。このような結合方法はＥＧＦ 受容体、その裁断体およびそれに対する抗体（これらはすべて蛋白質である）と ともに使用するために適する。

反応物質の固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ）は、あるアッセイ法にとっ て必要である。固定化は、溶液中に自由に残留する分析物からの結合相手の分離 を伴う。これは従来アッセイ手順の前に、例えば。

不溶性マトリックスまたは表面への吸着（ベンニヒらの米国特許第３゜７２０． ７６０号）によりあるいは共有結合（例えば、グルタルアルデヒドの架橋を使用 する）により、結合相手または分析物類似体を不溶化することにより、あるいは 後に、例えば、免疫沈殿により、前記相手または類似体を不溶化することによっ て達成される。

立体接合体を、均質アッセイのための立体ｖＸＸ性法おいて使用する。

これらの接合体は低分子量のハプテンを小さい分析物に共有結合させ、こうして ハプテンに対する抗体を実質的に抗分析物と同時に接合体を結合するために使用 できるようにすることにより合成される。このアッセイ手順のもとで、試験試料 中に存在する分析物は抗分析物に結合し、これにより抗ハプテンは接合体に結合 することが可能となり、接合体ハプテンの特性の変化、例えば、ハプテンが蛍光 団であるとき蛍光の変化を生ずる。

他のアッセイは、競争的またはサンドイッチアッセイとして知られており、商業 的診断工業においてよく確立されておりかつ広く使用されている。

競争的アッセイは、共通の結合相手上の制限された結合部位について試験試料の 分析物と競争する標識類似体（「トレーサー」）の能力に頼る。結合相手は、− ９一般に、競争の前または後に不溶化され、次いで結合相手に結合したトレーサ ーおよび分析物は結合しないトレーサーおよび分析物から分層される。この分離 はデカンテーションにより（結合相手が前もって不溶化されている場合）あるい は遠心分離により（結合相手を競争反応の後に沈殿させる場合）達成される。試 験試料の分析物の篭は、マーカー（ｍａｒｋｅｒ）物質により測定して、結合し たトレーサーの峻に逆比例する。既知の量の分析物を用いて投与一応答の曲線を 作成し、そして試験結果と比較して、試験試料中に存在する分析物の量を定置的 に決定する。これらに不均質アッセイは、酵素を検出可鋤なマーカーとして使用 するとき、ＥＬＩＳＡ系と呼ばれる。

他の種の競争的アｙセ仁均質アッセ仁は相分離を必要としない。

ここで、酵素と分析物との接合体を調製し、こうして抗分析物が分析物に結合す るとき、抗分析物の存在は酵素活性を変更する。この場合において、受容体また はその免疫学的に活性な断片は酵素、例えば、〆ルオキシダーゼへの二官能性有 機架橋と接合される。抗受容体の結合が酵素活性を阻害または増強するように、 抗受容体とともに使用する接合体を選択する。この方法自体は名称ＥＭＩＴのも とに広〈実施されている。

サンドイッチアッセイは、ここにおける分析物の決定のためにとくに有用である 。順次のサンドイッチアッセイにおいて、固定化された結合相手を使用して試験 試料を吸着し、試験試料を洗浄により除去し、結合した分析物を使用して標識結 合相手を吸着し１次いで結合した物質を残留するトレーサーから分離する。結合 したトレーサーの量は試験試料の分析物に直接比例する。「同時の」サンドイッ チアッセイにおいて、試験試料を標識の結合相手の鰯加の前に分離しない。

以上は本発明における分析物のための単なる例示のアッセイである。

これらの分析物の決定に現在または後に開発される他の方法は、本発明の範囲内 に包含される。

第１図〜第５図に関する図面 第１図、Ａ４３１細胞およびヒト胎盤からのＥＧＦ受容体の固定化はぼ２Ｘ１０ ”のＡ４３１細胞をカルシウムおよびマグネシウム不合リン酸塩＃！衝生理的食 塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして４００ｍ１のり二／ス＃衝液（５０ミｌＪモル ｃ７））ｌＪスＨＣ１ｐＨ７，４、Ｏ，１５モルのＮａＣ１，５ミリモルのＥＧ ＴＡ、０．１％のウシ血清アルブミン、１％のＮＰ４０．２５ミリモルのベンズ アミジン、０．２ミリモルのＰＭ　Ｓ　Ｆ　、１０　ｋ　ｇ　／　ｍ　ｌのロイ ペプチン）中に可溶化した。モスリンを通して濾過した後、リゼイトをＰＨ８， ５に調節し、そして最高１００．０００ｇで３０分間遠心した。Ｌ′ｔｃｋみを 、１５ｍ１の７フイーゲルＩ　Ｑ　（Ａｆ　ｆ　ｉ　Ｇｅ　ｌ）　［／＜イオラ ド（Ｂ　ｉ　ｏＲａｄ）］に結合した１　５ｍｇのモノクローナル抗体Ｒ１（３ ４）から成る免疫親和性マトリックスとともに４℃において２時間インキュベー ションした。結合しないリゼイトを０．４ミクロンのフィルターを通す吸引によ り除去した。次いで、マトリックスを、０．６５モルのＮａＣ１および０．１％ のＮＰ４０を含有する５００ｍ１（７）ＰＢＳで、次いでｏ、１％のＮＰ４０を 含有する５００ｍ１のＰＢＳで、おだやかに攪拌しかつ濾過することにより洗浄 した。２Ｘ　１０ｍ　ｌの７リコートの５０ミリモルの０，０５％のＮＰ４０を 含有するクエン酸ナトリウム　Ｐ）１３で各回２分間マトリックスのおだやかな 攪拌および濾過により、ＥＧＦ受容体を溶離した。溶離液をＰＨ７に３ｊ８１節 した。受容体の収量はほぼ２５０ルｇであった（ブラッドフォートの技術（７０ ）またはゲル透過ＨＰＬＣ後のアミノ酸分析による（下参照））。あるいは、Ｃ ＮＢｒ活性化セファ０−ス［ファーマシア（Ｐｈａ　ｒｍａｃ　ｉ　ａ）］に結 合したモノクローナル抗体２９−１　（３８）を５〜１０ｍｇ、／ｎｌで使用し て、ＥＧＦ受容体をＡ４３１細胞から精製した。用いた精製手順はＲ１について 前述したものに類似したが、ただしＥＧＦ受容体をホスホリル化したが、３ミリ モルのＭｎＣｌ２の存在下に５０　μｃ　ｉ　（γ−３２Ｆ）　−−ＡＴＰ　（ ３、０トリツクスへ結合した。溶離した受容体をさらに調製用ＳＤＳゲル電気泳 動により、次いで１０％のメタノールに対して４℃において透析することにより 精製した。胎盤ＥＧＦ受容体を精製するため、小胞（ｙｅｓｉ　ｃ　Ｉ　ｅ）を シンンチオトロホブラストのミクロウィルスからスミスらの方法（７１）の変更 により、２ミリモルのＥＧＴＡをすべての緩衝液中において使用して作った。小 胞を等体積の１００ミリモルのへペス（Ｈｅｐｅｓ）ｐＨ７，４，０，１５モル のＮａＣ１および５％のトリトンＸ−１００の添加により安定化した。最高１０ ０，０００ｇにおいて３０分間遠心した後、上澄みを１０ｇの７フイーゲル（バ イオラド）に結合した２００ｍｇの小麦の麦芽のアグリチニンとともに室温にお いて１時間インキュベーションした。レクチンマトリックスを、１００ｍ１の０ ．１％のトリトンｘ−ｉｏｏを含有するＰＢＳで０．４ミクロンのフェイルター を通す濾過により洗浄した。１０ミリモルのヘペス　ｐＨ７，４，０，１％のト リトンＸ−１ｏｏ中の０．２５モルのＮ−アセチルグルコースアミンの２Ｘ１５ ｍｌのアリコートで各回１５分子ｔ＋’１Ｍ拌および濾過することにより、結合 した蛋白質を溶離した。溶離をＲ１免疫親和性マトリックス（１５ｍｇ／助盤の 抗体）とともに２０℃において２時間インキュベーションし、次いでＡ４３１細 胞からの受容体の精製について前述したようによく洗浄および溶才した。ＥＧＦ 受容体／胎盤の収量は２５℃ｇであった（ブラッドフォードの技＃ｊ（７０）ま たはゲル透過ＨＰＬＣ後のアミノ酸分析による（下参照））。

ＥＧＦ受容体を含有する溶液を凍結乾燥し、そして０．５モルのトリスＨＣＩ　 ｐＨ８，５，６モルのグアニジン塩酸塩（シュヮルッーマ〉′）中に０．５〜１ ｍｇ／ｍｌで再Ｑｉさせだ、１０ミリモルのンチオスレイトールとともに３７° Ｃで１６時間インキュベーションした後、システィン残基を［１４Ｃ］　−ヨウ ドアセタミド（４０〜６０Ｃｉ／ミリモル、７マーシヤム・インターナショナル ）で前述ように（４４）アルキル化した。

（Ａ）　ゲル透過による精製： 二元５ｉａｋｔｕフルキル化した受容体をＴＳＫ４０００カラムＣｏ　、５Ｘ６ ０ｃｍ、ＬＫＢ）　で、６モルのグアニジ７ＨＣ１を含有するお０．１モルのリ ン酸二水素カリウムを０．５ｍｌ／分の流速で使用して精製した（４３）。溶離 液の吸収を２８０ｎｍにおいて監視しく蛋白質の標準の分子量が示される）そし て、２５ｍ１の分画を集めた。ＥＧＦ受容体を含有する分画を１０ミリモルの重 炭酸アンモニウムに対して透析した。パネルＢ−Ｄは精製を監視するために使用 した７％のボリアクリルアＥ　トｓＤｓゲル（７２）を示す（蛋白質の標準の分 子ｆｉ（Ｘ１０−３が示される）。

（Ｂ）　享゛製されたＡ４３１　ＥＧＦ受容体：トラ、り１．Ｒ１免疫現和性マ トリックスからのｐＨ３の溶離液；トラック２、ＴＳＫ４０００Ｅラムからの溶 離液。

（Ｃ）　２９−１　精製されたＡ４３１　ＥＧＦ受容体：トラ、り１．Ｒ１２９ −１免疫親和性マトリツクスからのｐＨ３の溶離液ニドランク２、ＳＤＳ：Ａ装 用ゲル電気泳動からのｆ：ｆ！ｌ液。

トラックｌ、胎盤の小胞ニドラック２、レクチ／親和性マトリ５クスからの溶離 液ニドラック３、ＴＳＫ４０００カラムからの溶離液。

第２図、３つの異る親和　方法により精製されたＥＧＦ受容体からのト隻ヱｙｙ ニヱ土上五虚狙旦ヱ１旦 Ａ、話　和　精製されたＡ４３１”容体：ＥＧＦ受容体を、Ａ４３１細胞から、 第１図において記載したように、モノクローナル抗体Ｒ１を使用し、次いでグア ニジン溶液中のゲル透過クロマトグラフィーにより精製した。１７５，０００の 分子量のＥＧＦ受容体を含有するプールした分画を、１０ミリモルの重炭酸アン モニウムに対して透析し、凍結乾燥し、そして５００ｇ１の１００ミリモルの重 炭酸アンモニウム、１０ミリモルのＣａＣｌ２中に再懸濁させた０次いで、ＴＰ ＣＫ処理したトリプシン［シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）］を添加した（Ｚｏｏ：１ 、受容体ニトリプシン、ｗ／ｗ）。この混合物を３７℃において１２時間インキ ュベーションし、さらに同一アリコートのトリプシンを添加し、そしてインキュ ベーションをさらに１２時間続けた０次いで、ペプチドを０．１％のトリフルオ ロ酢酸で平衡化したシンクロバク（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ）ＲＦＰ　Ｃ１８逆相 ＨＰＬＣカラム［ジンクロム（Ｓｙｎｃｈｒｏｍ）、リンデン、−（７ジアナ、 ４．６Ｘ　７５　ｍｍ）　ｆに１ｍｌ／分で４５分かけて挿入し、そして１ｍｌ の分画を集めた（４６）、２台のＭ６０００Ａポンプ、Ｕ６に手動インゼクター 、６００溶々某プログラマ−および２　ＬＫＢ　２１３８　ウビコード（Ｕｖｉ ｃａｒｄ）Ｓ吸収検出器（２０６ｎｍおよび２８０ｎｍのフィルターを有する） を含む水ＨＰＬＣシステムを使用した（４５）。

この図面はアセトニトリル濃度に対してしてプロットした２０６ｎｍにおける？ ８敲液の光学濃度を示す。

Ｂ、ＥＧＦ親和　精製された受容体： ＥＧＦ受容体を、Ａ４３１細胞から、小麦の麦芽のアグリチニンの親和性クロマ トグラフィー、次いでＥＧＦ親和性クロマトグラフィー（２６）を用いて精製し た。Ａ４３１細胞を第１図を参照して説明したようにして溶解（ｌ　ｙ　ｓ　ｅ ）　した。ＷＧＡ親和性カラム上のこのリゼイトの精製は、胎盤の調製について 説明したものと同一であった（第１図）。

ＷＧＡ親和性カラムからの溶離液を、１ｍｇの結合したＥＧＦを有する５１１ｎ ｌのアフィーゲル１０（バイオラド）と混合した。この混合物を室温において４ 時間混転した後、固定化されたＥＧＦ受容体を１００ｍ１のＰＨ１，０，１％の トリトンＸ−１００で洗浄した。次いで、受容体を１０ミリモルのエタノールア ミン、ｐＨ９，０，１％のトリトンＸ−１００で溶はした。この溶離液を、第１ 図について説明したように、ＴＳＫ４０００ゲル透過カラムでさらに精製した。

ＥＧＦ受容体を含有する分画を、上のＡについて説明したように、プールし、透 析し、凍結乾燥し、そしてトリプシン処理した。得られるトリシンのペプチドを 、前述と同一条件下で、逆相ＨＰＬＣにより精製した。

Ｃ１親和　製された胎盤受容体： ＥＧＦ受容体を、第１図について説明したように、新鮮な状態ヒト胎盤から精製 した。受容体をトリプシンで消化し、そしてペプチドを逆相ＨＰＬＣで前述のよ うに分離した。

第３図、配列分析のためのＥＧＦ受容体からのペプチドの精製Ａ、え似Ｚ乙乙Δ 列１し゛よび　きさによるペプチドの分画重炭斂アンモニウム溶液中の３２ｐ標 識ＥＧＦ受容体を凍結乾燥し。

そして７０％のギ酸中に再懸濁させた。臭化シアンを窒素のもとに添加し、管を シールし、および室温において暗所で２４時間インキュベーションした。ギ酸お よび過剰の臭化シアンを、スピード−７ヘク濃縮器（Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ　ｃｏ ｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）［す／゛・ント（Ｓａｖａｎｔ）］　’に使用して、乾 燥および水中の再ＱＭの反復サイクルにより除去した。乾燥試料を６モルのグア ニジンＭＣＩを含有する０、１モルのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ４中に再懸濁さ せ、そしてペプチドを同一・緩衝液中で”ｆ衡化させたＴＳＫ３０００カラム（ ０，７Ｘ６０ｃｍ、ＬＫＢ）で０．３ｍｌ／分の流速でゲル透過ＨＰＬＣにより 分離した（４３）。溶離液の吸収を２８０　ｎ　ｍ　Ｃ−）において監視し、０ ．３ｍｌの分画を集め、そして３２ｐにつ・いて計数（−・・−）した。蛋白質 桧準の分子量（ＸＩＯ−３）を示した。

Ｂ、−化シアン断片の細分分画化 ３２ｐ標識のほとんどを合力するＴＳＫ３０００カラムからのピークをプールし 、そして１０８９モルのＮＨ４ＨＣＯ３に対して透析した。

凍結乾燥後、試料を０．１％のＴＦＡ中に再溶解し、そしてペプチドを０１％の ＴＦＡ、１０％のアセトニトリル中で平衡化したシンクロバクＲＰＰ　Ｃｌ８（ 第２図参照）カラムの逆相ＨＰＬＣにより分離した。６０分にわたる１０〜４０ ％のアセトニトリルの展開の勾配をｉｎｌ／分の流速で用いてペプチドを溶離し た。溶離液の吸収を２８０ｎｍ（−一）において監視し、０．３ｍｌの分画を集 め、そして３２ｐについて計数（−−拳−）した。

Ｃ−Ｆ、トリプシンのペプチドの分離 Ｃ，Ａ４３１　ＥＧＦ受容体のトリプシンのペプチドのＨＰＬＣ分析からの２３ 〜２４％のアセトニトリルに相農する分画をプールした。ペプチドを１０ミリモ ルの酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ６，５中で平衡化したシンクロバクＲＰＰ　Ｃ １８カラムの逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。０〜４５％のアセトニトリル の直線の勾配を、１ｍｌ／分の流速で４５分間展開させた。溶離液の吸収を２０ ６ｎｍにおいて監視し、そして０．５ｍｌの分画を集めた。

Ｄ、（第２　Ａ　ｉｌＪ　）のＡ４３１　ＥＧＦ受容体のトリプシンのペプチド の逆相ＨＰＬＣの精製からの１９〜２０％のアセトニトリルに相当する分画をプ ールした。ペプチドをＣに記載するように分離した。

Ｅ、Ｄにおいて矢印を付したピークの分画をプールし、そして０．１％のＴＦＡ 中で平衡化した１ルポンダパク（Ｂ　ｏ　ｎ　ｄ　ａ　ｐ　ａ　ｋ）フェニルカ ラム［４，６Ｘ２５ｃｍ、ウォーターズ・アソシエーション（Ｗａｔｅｒｓ　Ａ ｓ５ｏｃ、）］の逆相ＨＰＬＣによりペプチドを細分分画化（ｓｕｂｆｒａｃｔ ｉｒ＋ａｔｅ）した。４５分にわたる０〜４５％のアセトニトリルの直線の勾配 を、Ｉｎ／分の流速で、用いてペプチドをな離した。溶離液の吸収を２０６ｎｍ において監視し、そして０．２ｍｌの分画を集めた。

Ｆ、（第２ＣＵＡ）の胎盤ＥＧＦ受容体のトリプシンのペプチドの逆相ＨＰＬＣ の精製からの２７〜２８％のアセトニトリルの濃度に相当する分画をプールした 。ペプチドをＣに記載するように細分分画化した。

Ｇ、（ｍＺＡ図）のＡ４３１　ＥＧＦ受容体のトリプシンのペプチドの逆相ＨＰ ＬＣの精製からの２５〜２６タ６のアセトニトリルに相当する分画をプールした 。ペプチドをＣに記載するように細分分画化した。

Ｈ，（第２Ａ図）のＡ４３１　ＥＧＦ受容体のトリプシンのペプチドの逆相ＨＰ ＬＣの分析からの２１〜２２％のアセトニトリルに相当する分画をプールした。

ペプチドをＣに記載するように細分分画化した。

第４図、ＥＧＦ受容体からのペプチドの配列の　析ペプチドを第３図について説 明したように精製した。各ペプチドの配列の決定を、ヘライックらに記載される ように（４７）の組立てられかつ操作される気相シークエンサーを使用して実施 した。ＰＴＨアミノ酸をＨＰＬＣにより分析し、ここでゾルバクス（Ｚｏ　ｒｂ ａｘ）Ｃａカラム（４，６Ｘ１５０ｍｍ、デュポン）を４３℃において使用し、 ９ミリモルの酢酸ナトリウムの緩衝液ｐ）（４，１を使用して１ｍ１／分の流速 において２４〜３８％のアセトニトリルの８分にわたる直線勾配を用いた。２台 のＭ６０００Ａポンプ、ＷＩＳ自動自動インヌクターびシステムコ／トローラ− およびベックマン１６０型検出器を含む水ＨＰＬＣシステムを使用した。各分解 的サイクルにおけるＰＴＨアミノ酸の回収を、積分記録器（ウォーターズのデー タ舎モジュール）により測定した。分析される各ペプチドの量を、アミノ酸のシ ーフェンシングの間に工程ｌにおける回収により測定した。セリンおよびスレオ ニンの分析は、ＰＴＨアミ、ノ酸の分析の間に得られる多数のピークの存在のた め、精確に測定することができなかった。こうして、これらのアミノ酸の存在は 定９−的データを用いないで示す；これらの残基は面積よりはむしろピークの高 さに基づく半定量的回収のデータを用いて配列に帰属させる。ペプチドの装入前 に、ガラス繊維のディスクをポリブレン（ｐｏ１７ｂｒｅｎｅ）およびグリシル グリシンで処理し、そして１０サイクルのために予備サイクル化した。各ペプチ ドを２回シークエツジングした：ペプチドＥＧＲＣ，１の：ｆＳ２の展開のとき 、フィルターをポリブレンおよびシスティン酸で処理し、そして１０回予備サイ クル化してアミノ末端のグリシン残基の帰属を明瞭にしたが、工程１におけるバ ックグラウンドのグリシンはなお有意であり、そしてこの残基は不精確でありう る。

第５図、ＥＧＦ受容体ペプチドのアミノ酸配列とｖ−ｓｒｃおよびＶ−ｅｒｂ− Ｂの推−上の形質転換性蛋白質の予測されるアミノ酸配列との間の関係 −５ｒＣ Ｖ−Ｓ工至遺伝子生産物（ｐｐ６０　）の予測されるアミノ酸配列を、推定開始 コドンからラウス置局肉腫ウィルス（ＲＳ　Ｖ）のプラム（Ｐｒａｇｕｅ）Ｃ株 のヌクレオチド７．１２９において翻訳する（７３）。ｖ−ｅ　ｒ　ｂ−Ｂｉｉ ｔ伝子生産物の予測されるアミノ酸配列を。

ＡＥＶ−Ｈ中のｖ−ｅｒｂ−Ｂ遺伝子のヌクレオチド１５５において推定開始コ ドンから翻訳する。ＥＧＦ受容体から精製された６ペプチドの部分的アミノ酸配 夕１を示す（下線部分）：１、ＥＧＲＴ、１．２、ＰＴＥＲ，１，３、ＥＧＲＴ 、１０；４、ＥＧＲＴ、２　：　５、ＥＧＲＣ，１−５ｒｃ ：６、ＥＧＲＴ、９゜肉太のタイプの文字は、ｐｐ６０　とＶ−ｅｒｂ−Ｂ蛋白 質との間の相同性残基を表わす。ＥＧＦ受容体ペプチ−５ｒｃ ドとｖ−ｅｒｂ−Ｂ蛋白質またはｐｐ６０　との間の残基の相同性は肉太のタイ プで示されている。・はｖ−ｅｒｂ−Ｂ、ｖ−ｓｒ旦、ｖ−ｆ且至、ｖ−ｆヱユ 、ｖ−ｙ且」およびｖ−ａ上ユの推定上の形質転換性蛋白質に共通であるアミノ 酸残基を示す。÷　はｐｐ６０ｖ−ｓｒｃのホスホ受容体のチロシンを示す（７ ４）。矢じりは、Ｖ　−ｅｒｂ−Ｂ蛋白質のアミン末端における可能なＮ−結合 グリコキシル化部位を示す。−はｖ−ｅｒｂ−Ｂ蛋白質中の推定上の膜内外記タ ゴを示す。矢　は、酵素または臭化シアンの切離しを生産して観測されるペプチ ドを発生させるアミノ酸残基を示す。配列の左の数値は、両者の場合において１ におけるように推定ヒの開始メチオニンを取る残基の数である。配夕ｑはコンピ ュータープログラムを用いて相同性を最適化した。

本発明は次の実施例の範囲に限定されると解釈すべきでなく、むしろ請求の範囲 により規定される。

藷烈ユ 前もって決定したＥＧＦ受容体のアミノ酸配列に対する抗血清の発翌−−−−− − ＥＧＦ受容体のアミノ酸残基９８４〜９９６に相当するポリペプチド（ＤＤＶＶ ＤＡＤＥＹＬＩ　ＰＱ）　を、メ’）フィーＪＬ／ドの固相合成技術［Ｒ，メリ フィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）　１９６３．”ジャーナル・オプ・アメリ カン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）８５，２１４９−２１５４］に従い、多少の変更［Ｒ，ブ チタ（Ｂｕｃ）＋ｔａ）、１９８２．ポリペプチドの提案されたカルシウム結合 部位についての化学的研究（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｐｒｏ ｐｏｓｅｄ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｐ ｅｐｔｉｄｅｓ）、Ｍ−３ｃ。

ゼーシス（Ｔｈｅｓｉｓ）、ファイン・曳−グΦグラデュエイ１噂スクール（Ｆ ｉｎｅｂｅｒｇ　Ｇｒａｄｕａｔｅ　５ｃｈｏｏｊ）、ウニイスマン・インスチ チュート・才ブ。サイエンス（Ｗｅｉｚｍａｎｎ　Ｘｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　 ５ｃｉｅｎｃｅ）、＋ｚホボット　（Ｒｅｈｏｖ。

Ｌ）、イスラエル］を用いて合成した。これらの残基は５ｖｃｉｌ仏子の族の推 定上のキナーゼ活性により共有（ｓｈａｒｅ）されるＥＧＦ受容体の相同性の区 域に対してちょうどＣ−末端に位置するポリペプチド配列を表わす。ＨＦを使用 する切離しにより完成されたペプチドを樹脂から分離した後、このペプチドはＧ −１５（セフアゾ７クス）を使用するゲル濾過により部分的に精製した。この配 列は気相シーフェンシングにより確証された。

象癒進 このペプチドをＫＬＨ［キーホール自リンペット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏ　 Ｉｅ　ｌ　１ｒｎｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉ　ｎ）、　カルバイオケム（Ｃａ ｌ　ｂｉ　ｏｃｈｅｍ）］に］ｌ−ｘチルー３−３’−ジメチルアミ／プロピル ）カーポジイミド：ＨＣｌ　（ＥＤＣＩ）を使用して接合した。ＫＬＨをＰＢＳ 、ｐＨ７，２に対してして透析し、４０倍モル過剰のＰＲ中に溶解したペプチド と混合した。室温において５分間混合した後、Ｈ２Ｏ中のＥＤＣＩ　（ペプチド よりｌＯ×モル過剰）を出発反応物質に添加し、これを−夜室温で混合した。得 られる複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）をＰＢＳに対して透析した。この接合体（ｃｏ ｎｊｕｇａｔｅ）の１ｍｌを完全フロインドアジュバントで乳化し、そして２匹 のウサギの多数の部位に皮下注射した。不完全フロインドアジュバント中のブー スト（ｂ　ｏ　ｏ　ｓ　ｔ）を２週の間隔で２回、また、皮下注射した。最後の 注射から２遍間後、ウサギを放血し、およびＰＫ−２抗血清を回収した。

この抗血清は受容体のキナーゼ活性を妨害しないことがわかった。

一般に長さ約５〜２０残基のＥＧＦ受容体のポリペプチドをＫＬＨまたは他の適 当な免疫原、例えば、ウシ血清アルブミンへ接合し、そしてウサキ、マウスまた は他の動物を免疫化ことにより、異る特異性を有する他の抗血清を得た。この接 合は、一般に、ポリペプチドおよび蛋白質上に存在するアミノ、ヒドロキシフェ ニル、カルボキシルまたはスルフヒドリルを介して、よく知られた二官能性架橋 基、例えば、下表に記載するものを使用して実施されるであろう。

−五一 ペプチジルまたは調製　ペプチジルまたは調製の反応１−　結合基　の反区性ユ ーーー−ＮＨ２グルグルアルデヒド　−ＮＨ２：ＯＨ Ｎ　Ｈ２スクシンアルデヒド　−ＮＨ２Ｏ−ＮＨ２； ｕＨ２Ｎ−ＮＨ２、−５Ｈ； −Ｃ−ＮＨ２ＨＮＯ２−０Ｈ −ＮＨ２；　Ｒ’Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ−ＣＯＯＨＨ −ＣＯＯＨＳＯＣ１２−ＣＯＯＨ −ＣＯＯＨＮ−ヒドロキシスクシ　−ＮＨ２ンイミド 次いで、免疫化でレイズした抗血清を、自然ＥＧＦ受容体との交差反応する能力 についてスクリーニングする。免疫化マウスからの碑細胞を収穫し、腫瘍細胞と 融合し、そして慣用の方式で培養してモノクローナル抗体を生産する。

実施＠２ 二Σ囚狭ス社兜府旦亙旦旦旦叉皇体メ２と工五逸諺ｌニーｔ４腫瘍細胞をＰＢＳ （リン酸塩緩衝液生理的食塩水）で２回洗浄し、そして次の成分を含有する可溶 化緩衝液の１ｍｌ中で可溶化した：２０ミリモルのＭｇＣｌ２．１，０ミリモル のＥＤＴＡ、１％のアプロチニン。可溶化した細胞をエッペンドルフ遠心機で４ °Ｃにおいて１０分間遠心した。上澄λ液を０．１％のトリトンＸ−１００の最 締Ｃ度に希釈し、そしてこの可溶化した細胞調製物の３００ｐｌを過剰免疫複合 体とともに一夜４°Ｃにおいてインキュベーションした。前記免疫複合体は、セ ファロース−蛋白質Ａ上に吸着されたポリクローナルウサキ抗ヒ）ＥＧＦ抗血消 に、ヒ）ＥＧＦを吸着させることによって調製した。ちなみに、ＥＧＦ受容体の 最初の約５００残基内（またはそのすべて）の配列に対してレイズした抗体を、 固定化あＥＧＦの代わりに、使用することは好ましい。その主な理由は、生物学 的試料中の受容体のあるものはＥＧＦへすでに詰合しており、それゆえ利用可部 なＥＧＦ結合部位をもたないことが期待できることにある。ＥＧＦより過剰の抗 ヒ）ＥＧＦ抗血清は受容体結合ＥＧＦを結合する能力を有するであろうが、この 反応の速度論は望ましくないであろう。適当な抗体は、受容体の結合についてＥ ＧＦによる競争に対するその抵抗により容易に同定されるであろう。

この抗体の使用は、より感度の高いアッセイを生ずるであろう。

上澄みの細胞Ｊ！ｌ製を遠心により回収し１次いでセファ０一スー蛋白質Ａ吸着 ＲＫ−２抗血清とともに４℃において３０分間インキュベーションし２て裁断Ｅ ＧＦ受容体を結合した。次いで、セファロース免疫吸着剤ＩＲＫ−２抗血清の放 射性ヨウ素化Ｆａｂ断片とともにインキュベーションした。前記断片は、普通の 方式で、酵素消化抗血清を精製し、そして断片を１２５工でクロラミｙ（ｃｈｌ ｏｒａｍｉｎｓ）Ｔ手順に従いヨウ素化することによって調製した。吸着された トレーサーのＦａｂ断片をセファロースから洗浄し、そして残留する放射箭を商 用カンマカウンターにより、存在するかも知れない、裁断受容体の測度として決 定した。胎盤細胞を対照として使用した。

癌をもつことが疑われる患者からの血液血清中の裁断ＥＧＦ受容体の決′定ニつ いての変更を用いて、この実施例を反復した。ポリクローナルウサギ抗ヒト血清 ＥＧＦ抗血清およびヒトＥＧＦのセファロース吸着免疫複合体を詰めたカラムに 、患者の血清を通過させた。あるいは、前述のように、成熟ＥＧＦ受容体の最初 の約５００残基内またはすべてからのポリペプチドに対してレイズした抗血清は 、有用でありかつ好ましい０次いで、溶離した血清を競争的免疫アッセイにおい てアッセイする。ここで、放射性ヨウ素化ＥＧＦ受容体を試験試料中の存在する かもしれない裁断ＥＧＦ受容体とセファロース−蛋白質Ａ吸着ＲＫ−２抗血ｍに ついて競争させ、セファロースを洗浄し、次いで溶離液中またはセファコース中 の放射能を決定する。ＡＥＶ−Ｈのｖ−ｅｒＢ蛋白質、ｐｌ−７８］は、ＰＫ− ２がｖ−ｅｒＢと交差反応するので、適当な陽性の対照である。

癌をもつことが疑われる患者からのヒト血清の緩衝化希釈液を調製した。吸着さ れたＰＫ−２、プールした正常血清および可溶化Ａ４３１ＥＧＦ受容体を、それ ぞれ陰性および陽性の対照として利用した。腫瘍細胞により血清中に流し出され たＥＧＦ受容体を、普通の方法でヤギ抗ウサギＩｇＧで、次いでＲＫ−２抗血清 で順次に被覆されであるポリスチレン試験管またはマイクロタイターのウェル（ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）中で血清希釈液をインキュベーションすることにより検 出した。あるいは、これらの抗体の免疫沈殿物を、ポリスチレン試験管上への固 定化の代わりに使用することができる。−夜のインキュベーション後、試験管を 洗浄して吸着されない試料を除去し、次いで過剰の放射性ヨウ素化Ｒ１モノクロ ーナル抗体の緩衝化溶液を試験管へ添加した。Ｒ１は、Ｍ、ウォーターフィール ドら、゛ジャーナル・オブ・セル拳バイオケミストリー（Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｂｉ ｏｃｈｍ、）″１旦：　７５３−７５７（１９８２）に記載されているように、 ＥＧＦ受容体の外側のグリコジル化部分を認識する抗体であるｓｌ’ｌｌの特性 を有する抗血清または抗体は好ましい、なぜなら、それはＰＫ−２が向けられる 細胞質領域から空間的に分離されているＥＧＦ受容体部位へ結合し、そして受容 体への結合においてＥＧＦにより競争的に阻害されるとは信じられないからであ る。このような抗血清は、上に記載した既知の手順に従って調製される。

結合しないトレーサーを試験管からデカンテーションおよび洗浄により除去する 。デカンテーションした溶液中の放射能または試験管中に残留する放射能を、既 知の可溶化ＥＧＦ受容体の濃度のプロットの結果に対してして比較し、次いで血 清濃度を計算する。対照と比較して、絶えず増大した受容体の濃度は、潜在的な 未知の新生物、または未知の新生物のそれ以上の生長または転移の指示である。

抗体−毒素接合跡 ＡＨＹ　Ｉ　ＮＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨ ＶＣＨＬＣＨＰＡＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩ　ＰＳ　（ＲＫ− ３）に対するＫＨＬ接合体を使用する免疫化によりウサギにおいてレイズした抗 受容体ＩｇＧを１分別硫酸アンモニウム沈殿、ＰＨ１、ｐＨ７中に再可溶化、臭 化シアン活性化セファロース上に固定化されたＡ４３１細胞からの可溶化ＥＧＦ 受容体五の吸着およびｐＨ４、８における溶離により精製した。′ｗ４製された 抗血清またはＲ１モノクローナル抗体（上を参照）を、ＥＰ　５６３２２Ａの手 順に従いビンデシン（Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）へ結合した。あるいは、抗体はりチ ンのサブユニットＡ　（ＥＰ　６３９８８ＡまたはＥＰ　２３４０１Ａ）、ジフ テリアの！素（Ｗｏ　８３０４０２６Ａ）：ｌｌｉ毒素の酵素（ＥＰ　８９８、 　８０Ａ）へ接合した。また、次を参照：ＥＰ　４４１６Ａ、ＥＰ　５５１１５ Ａ、米国特許第４．３７９，１４５号、ＥＰ　７４２７９ＡまたはＥＰ　９４８ １５Ａ。同様な技術を用いて放＃４線不透過性色素を抗体に接合した。フルオレ セイン標識Ｒ１抗体を用いる細胞免疫蛍光により多数の表面ＥＧＦ受容体を含有 することが示されたヒト腫瘍確立細胞系統のパネルを、Ａ４３１癌細胞と一緒に 、選択した。腫瘍細胞はヌードマウス中で確立し、変化する濃度の毒素または放 射線不透過性接合体を無菌の生理的食塩水または他の製薬学的担体と組み合わせ て尾の静脈に注射した。

候補の細胞中の多数の受容体の存在を、次のようにして決定した。等ｆｆｌ（２ ５ｍｇ）の候補の細胞または組織からの組織を、リーパーマン（Ｌｉ　ｂｅ　ｒ ｍａｎｎ）ら、°゛キ’Ｗフサーリヒューズ（ＣａｎｃｅｒＲｅ　ｓ　、）４４ 　：　７５３−７６０　（１９８４）に記載されているようにして可溶化した。

プラットフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）［アナリティカル・バイオケミストリー （Ａｎａｌ、ＢｉＯｃｈｅｍ、）”ヱ２　：　２４８−２５４］の方法により決 定した等硼の蛋白質を、Ａ４３１細胞系統からのＥＧＦ受容体を用いて濃縮した 膜に対して発生されたポリクローナルウサギ抗体（リーバ−マン、上を参照）を 用いて、あるいは前述のポリクローナルウサギ抗体ＲＫ−２を用いて、免疫沈殿 に使用した０機能的ＥＧＦ受容体キナーゼを免疫沈殿させ、そして前述のり−パ ーマンの方法に従い（ガンマ−３２Ｐ）ＡＴＰを使用する免疫沈殿物のホスホリ ル化により検出した。免疫沈殿物を電気泳動の試料の緩衝液中に溶解し、そして ５〜１５％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動させた。このゲルを 乾煙し、室温において１２時間オートラジオグリフイーにかけた。Ａ４３１細胞 をＥＧＦ受容体のための標準の源として使用した。矢じりはＥＧＦ受容体の位置 を示す、使用した高分子量のマーカーは次の通りであった：ＩｇＧの軽鎖（２５ ｋｄ）、ＩｇＧの重鎖（５０ｋｄ）、ウシ血清アルブミン（６６，２ｋｄ）、ホ スホリラーゼＢ　（９４ｋｄ）、−ガラクトシダーゼ（１１６ｋｂ）およびミオ モノ重Ｍ（２００ｋｄ）（バイオラド）、高いレベルのＥＧＦ受容体の発現は、 ≧２０．ＯＯＯｃｐｍにより示された。

ＥＧＦ受容体のポリペプチド断片ＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＥＡＰＮＱＡＬＬＲ，Ｖ ＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫ、ＧＬＷＩＰＥＧＥＫ、ＶＬＶＩＱＧＤＥＲ，ＤＶＶＤ ＡＤＥＹＬＩＰＱ、ＤＶＶＤＡＤＥＹＬＩＰＱＱＧＦＦ、ＡＥＥＫＥＹＨＡＥＧ 、（ＥＡＹ）ｎここテｎ　＞　１、またはＧＳＨＱＩ　５ＬＤＮＰＤＹＱＱＤＦ Ｆを、実施例１に記載する方法に従い台数した。これらの断片を慣用の担体中に 変化する希釈度で溶解し、滅菌濾過し、標準のマイクロ技術によりＡ４３１細胞 中に注入し、そして細胞の生長および形態への影響を観察した。

ＥＧＦ受容体を暗号化するＤＮＡ配列は、ウルリヒ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）ら、°“ ネイチャー　（Ｎａｔ　ｕ　ｒｅ）”３０９　：　４１８−４２５　（１９８４ ）中に記載された。ヒトグリオプラスドブ（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）および Ａ４３１　ＤＮＡ中のＥＧＦ受容体遺伝子の増幅は、−次ヒト脳腫瘍、Ａ４３１ 類表皮癌細胞およびヒト胎笈からのＤＮＡのサウザーン・ブロク）　（Ｓｏｕｔ ｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）分析により検出した。これらの腫瘍からのＤＮＡをＥｃｏ ＲＩで消化し、そして３２　Ｐａ識ｐ８．４ＤＮＡで精査した。第６図を参照す ると、ＧＭＩおよびＧＭ２は異る一次ヒトグリオブラストマであり、ＭＥＮＩは 髄膜種であり、Ａ４３１はヒト類表皮癌細胞系統であり、そして）（ＰＬは対照 組織として使用するヒト胎盤である。

方法： ａ、ＥＧＦ受容体ｃＤＮＡクローンｐ８は次のようにして得た：Ａ４３１細胞か らのｍＲＮＡをグアニジンチオシアネート／塩化セシウム法２］　、ｃＤＮＡ合 成、ｐＵＣ９へのクローニングおよびコロニーのスクリーニングは発表されたプ ロトコールに従い実施した［Ｄ、ヘフマン（Ｈｅｆｍａｎ）、１９８３．“プロ シーディンゲス・オブ◆ナショナル・アカデミ−参才ブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｋ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）″且：３１−３５コ。簡単に述べると、１ ７−！−（７）プローブを、Ａ４３１　ＥＧＦ受容受容体トリジンペプチドのア ミノ酸配列に基づく２５６オリゴヌクレオチドの混合物（３°ＡＴＡ／Ｇ　ＴＴ Ａ、／Ｇ　ＧＧＸ　ＴＧＸ　ＴＧＸＡＴ５°）として、Ｔ４ポリｙｔｙレ−ｒラ ドキナーゼ［ニュー・イングラ〉′ド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ 　Ｂｉｏｌａｂｓ）］および（］ガンーｙ−３２ＰＡＴＰ　（７−マクサム、３ ０００Ｃｉ／ミリモル）で末端標識付けした。コロニーのスクリーニング交雑を 、６ＸＳＳＣ１５Ｘデンハルト（Ｄｅｃｈａｒｄｌ）、０．１％（７）ＳＤＳ、 １１００ｐ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で室温において３６時間実施した。フィル ターを４５℃において３ＸＳＳＣ１０，１％のＳＤＳで洗詐した。ヌクレオチド 配夕号の分析をマクサム（Ｍ（１８０）に従い実施した。ｐ８は＋ｉｉｉ述のウ ルリヒに記載されるＡ４３１細胞からの２．８ｋｂの変異型ｍＲＮＡから誘導さ れる２、５ｋｂのｃＤＮＡクローンである。ｐ８．４はクローンｐ８から誘導さ れるＰｓＥ断片（３９９ｂｐ）である。ＥＧＦ受容体の他のＤＮＡ断片もプロー ブとして適当である。

旦、試験細胞からの高分子量の染色体のＤＮＡを記載されるようにして単離した （マニアチス、上を参照）、ＤＮＡ　（１５ミクログラム）を過剰のＥｃｏＲＩ またはＨｉｎｄｌｌ＋にニュー・イングランド−バイオラプス）で完全に消化し 、０，７％の７ガロースゲルを通す電気泳動により分画化し、そしてニトロセル ロース紙へ移した。ｐ８．４　（ｐ８）のＰｓｔインサートを（ガン−２−：Ｉ 　２　Ｐ）ｄＡＴＰおよび（ガンマ−３２Ｐ）ｄｃＴＰ　（アーマジャム）で、 タイラー（Ｔａｙ　ｌ　ｏ　ｒ）ら、“バイオラプス・エト・バイオフィン力号 アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）４：３２４−３３０　（ １９７６）の手順により放射性標識付けした。１０’　ｃ、ｐ、ｍ、の３２ｐ標 識プローブとの交雑を６ＸＳＳＣ１５Ｘデニ／ハルト、１０％のデキストランサ ルフェート、５０ミリモルの硫酸ナトリウム、ｐＨ６，５および１００７４ｇ／ ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で６５℃において１６時間実施した。フィルターを０． ２ＸＳＳＣ，０，１％のＳＤＳ中で６５℃で洗浄し、そして−７０℃において増 強スクリーン（ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ　５ｃｒｅ　ｅ　ｎ）を使用して１日間 オートランオグラフィーにかけた。標準として制限エンドヌクレアーゼＨｉ　ｎ 　ｄ　ＩＩ＋で切離したαファージＤＮＡを使用して、大きさを計算した。

第６ａ図および第６ｂ図は、種々のヒト脳腫瘍、Ａ４３１細胞およびヒト胎盤中 のＥＧＦ受容体配列のサウザーン・プロット分析を示す。Ａ４３１細胞（Ａ４３ １）、ヒト胎盤（ＨＰＬ）、グリオブラストマ（ＧＭｌ、ＧＭ２）および髄膜種 （ＭＥＮＩ）の１５ルｇの高分子量のＤＮＡをＥｃｏＲＩ（ａ）またはＨｉｎｄ ｍ（ｂ）で消化した。不児全な消化による技術的人工物を排除するために、消化 を大過剰の制限酵素で数回反復し、同一の結果を明らかにした。ＤＮＡを電気泳 動させ、モしてＢにおいて前述したようにプロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ） した。

−ＬのＢについて記載したような条件下で第７図および第６図に示すｃＤＮＡク ローンから？ｌｉ雛されたニック翻訳ＥＧＦ受容体特異性ｃＤＮＡインサートに 、プロブ）（ｂｌｏｔ’）を交雑した。同一・プロットを薬物の損失の検出なし に異るプローブについて再利用した。再利用のためにＣＤＮＡ−ゲノムのＤＮＡ 雑種の変性のため、フィルター＠０．５モルのＮａＯＨ，１，５モルのＮａＣ１ 中でおだやかに攪拌しながら室温において１０分間ンーキングし、水でＴすぎ、 ０．５モルのトリス−ＨＣｌｐＨ７，０，１，５モクレのＮａ細胞中で２×１０ 分間中和し、モして３ＸＳＳＣ中で洗浄した。フィルターをサランラップ中で湿 潤状態に保持し、交雑緩衝液中で予備インモユベーションし、そして前述のよう に再使用した０図面において破線は、示した交オパターンを生ずる概略的に描い たｃＤＮＡの区域を示す（第７図も参照）、矢じりは、グリオブラストマ腫瘍の 増偏したＥＧＦ受容体遺伝子中のＤＮＡ断片の位置を示すが、他の’Ｄ　Ｎ　Ａ において検出不可能であった。ローマ数字は、交雑プローブとして使用したｃＤ ＮＡ断片を表わす（ｒ　＝　ｐ　６４　、４　；　ＩＩ　＝　Ｐ８．４：ＩＩ＋ ＝ｐ６４．３；Ｖ＝ｐ６２．３）。

Ａ４３１細胞、ヒト胎盤およびグリオブラストマからのｍＲＮＡのノウザーン・ プロットｃＮｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）分析を次のようにした実施した。１０ ％の胎児子牛血清を含有するグルベツコ変更イーグル培地中で５％のＣ０２−９ ５％の空気中で３７°Ｃにおいて、Ａ４３１細胞を生長させた。ＲＮＡをヒトｖ ３盤およびグリオブラストマＧＭＩの凍結組織から液体Ｎ２中で粉砕後、および 前述のように（マニアデス、上を参照）グアニジンチオシアネート／塩化セシウ ム法に従い新鮮なＡ４３１細胞から単離した。ポリ（Ａ）選択ｍ　ＲＮ　Ａのア リコート（１０マイクログラム）を、５０％のホルムアミド、６％のホルムアル デヒドおよび流れる緩衝液（２０ミリモルのＭＯＰＳ　ｐＨ７，０，５ミリモル のＮａＡｃ、１ミリモルのＥＤＴＡ）を含有する溶液中で１０分間６０℃に加熱 した。試料を１ｏｏｖにおいて６％のホルムアルデヒドおよび１×淀れる緩衝液 を含有する１％のアガロースゲル中で４峙間電気泳動させた。ＲＮＡをｌ０ＸＳ ＳＣでニトロセルロースフィルターに移し、８０℃で２時間加熱することにより 固定し、そして５０％のホルムアミド、５ＸＳＳＣ１１０％のデキストランサル フェート、■×デンハルトの混合物、ｌＯミリモルの硫酸ナトリウム、ｐＨ６， ８および１００マイクログラム／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で２× １０’ｃ、ｐ、ｍ、のニック翻訳ｐ６４．３プローブと４２℃において？日間交 雑させた。６５℃において０　、　ｌＸ５ＳＣ１０，１％のＳＤＳで洗浄した後 、フィルターを一７０℃において２日間増強スクリーンを使用してオートラジオ グラフィーにかけた。結果を第８図に示す。Ａ４３１細胞または正常ヒト胎盤中 に見られない独特の３８ｋｂのｍＲＮＡ種が矢印により示される。この種はＥＧ Ｆ受容体の外部の領域および細胞質領域の少なくとも一部分を暗号化するように 思われる。

蚕４文歓 １、クロ７（ＧｕｒｏｆＴ）＋Ｇ、　（纒）生長および成熟因子（Ｇｒｏｗｔｈ 　ａｎｄＭａｆｕｒａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒｓ）［ウィリー（Ｗ　ｉ　Ｉｅｙ ）ｗ　二”−ヨーク、１９８３］。

２、コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）、　Ｓ　、ジャーナル・オブ・バイオロンカル・ケ ミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ！６．）２３’７．１５５５−１５６２（１ ９６２）。

３、ロス（Ｒｏｓｓ）、Ｒ，組織の成長因子（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆ ａｃｔｏｒｓ）［バセルｆｆ（Ｂａｓｅｒｇａ）ｔ　Ｒ，ｉ！、　１３３−１５ ９　スプリンデル・７エルラーグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ）＋ベルリ ン、１９８１３＞４、ローゼングルト（Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ）ｗ　Ｅ、モレキュ ラー・バイオロジー・アンド・メゾシン（Ｍｏ１．　ＢｉｏｌｏＭｅｄ、）［イ ン・ザ・ブレＸ（ｉｎ　ｔｈｅｐｒｅｓｓ月。

５、ジエイムス（Ｊ　ａｌＩＩｅｓ）、Ｒ，およびプラトショウ（Ｂｒａｄｓｈ ａｗ）、Ｒ。

Ａ、アニアル・リビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｂ　 ｉｏｃｈｅｍ、　）（イン・ザ・プレス）。

６、入ポーン（Ｓｐｏｒｎ）＋Ｍ、　Ｂ、　＋およびＦダｏ（Ｔｏｄａｒｏ）＋ Ｇ、Ｊ、　（二ニー・イングランド・ジャーナル・オブ・メデイシン（Ｎｅ＋ｓ 　ＥｎＦｉ、　Ｊ。

Ｍｅｄ、）３０３．８７８−８８０．（１９８０）。

７、ウォーターフィールド（Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ）、Ｍ、　Ｄ、　Ｔスクシイ ス（Ｓｅｒａｃｅ）、Ｇ、　Ｔ、　、ウィットル（Ｗｈｉｔｔｌｅ）＋Ｎ、＋ス トルーハント（Ｓ　ｔｒｏｏｂａｎｔ）ＩＰ、、：）ヨンソン（Ｊ　ｏｈｎｓｓ ｏｎ）、　Ａ、　、ワステソン（Ｗａｓｔｅｓｏｎ）＋Ａ、　＋ウニＸ　ｙ　− ？−り（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ）、Ｂ、　、ヘルノン（Ｈｅｌｄｉｎ）、Ｃ−Ｈ ６，（Ｈｕａｎｇ）＋Ｊ、　Ｓ、オよびデウエル（Ｄｅｕｅｌ）、Ｔ、　Ｆ、ネ イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０４．３５−３９（１９８３）。

８、ドーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、Ｒ９Ｆ、　＋７ンカビラー（Ｈｕｎｋ ａｐｉｌｌｅｒ）＋Ｍ、Ｗ、、７ツド（Ｈｏｏｄ）、Ｌ、　Ｅ、　、デベアー（ Ｄｅｖａｒｅ）、Ｓ、　Ｇ、　、ｏビンＸ（Ｒｏｂｂｉｎｓ）ｖＫ、　ｃ、　＋ ７０ンソン（Ａａｒｏｎｓｏｎ）、Ｓ、　Ａ、お上びアントニアデス（Ａｎｔｏ ｎｉａｄｅｓ）、ＨｏＮ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ＞　２２１　、２７５− ２７７（１９８３）。

９、ロビンス（Ｒｏｂｂｉｎｓ）、　Ｋ、　Ｃ，アントニアデス（Ａｎｔｏｎｉ ａｄｅｓ）＋Ｈ。

Ｎ、、デベアー（Ｄｅｖａｒｅ）ｗｓ、　Ｇ、　７ンカピラー（Ｈｕｎｋａｐｏ ｌｌｅｒ）、Ｍ、　Ｗ。

アーロンソン（Ａａｒｏｎｓｏｎ）、Ｓ、　Ａ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　 ３０５　、６０　Ｓ−６０８，（１９８３）。

１０、デウエル（Ｄｅｕｅｌ）＋Ｔ、Ｆ、＋Ｊ、Ｓ、７アング（ＨｕａｎＨ）＋ Ｓ。

Ｓ、、ストロ−７＜ン）（Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ）ｔＰ、およびウォーターフィー ルド（Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ）＋Ｍ、Ｄ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２１ ．１３４８−１３５０（１９８３）。

１１、ヅラク（Ｄｕｌａｋ）、Ｎ、　Ｃ，およびチミン（Ｔｅｍｉｎ）、Ｈ，Ｍ 、　ジャーナル・オプ・セル・フイジオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏ ｌ）８１．１６１−１７０（１９７３）。

１２、デ・タル：７（Ｄｅ　Ｌａｒｅｏ）、Ｊ、Ｅ、およびトゲａ（Ｔｏｄａｒ ｏ）、Ｇ。

Ｊ、ネイチャー（ＮａＬｕｒｅ）２７２．３５６　３５８（１９７８）。

１３、パーク（Ｂｕｒｋ）、Ｒ，Ｒ，エクスベリメンタル・セル・リサーチ（Ｅ ｘｐｌ、Ｃｅ１１．Ｒｅｓ、）１０１，１９３−２９８（１９７６）。

１４、ボールン（Ｂｏｕｒｎｅ）、　Ｈ，およびローゼングルト（Ｒｏｚｅｎｇ ｕｒｔＬＥ、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイ エンシズ（Ｐｒｏｅ、　ｎａｔｎ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）Ｕ、　Ｓ、　Ａ 、７３＋４５５５−４５５９（１９７６）。

１５、デ・タル：＋　（Ｄｅ　Ｌａｒｃｏ）、　Ｊ　、　Ｅ、およびトゲｏ（Ｔ ｏｄａｒｏ）、Ｇ。

Ｊ、プロシイ−ディンゲス・オプ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ ズ（Ｐｒｏｃ、　ｎａｔｎ、　Ａｃａｃｌ、　Ｓｃｉ、　）Ｕ、　Ｓ、　Ａ、７ ５＋４００１−４００５（１９７８）。

１６、ｔｙ、＜−ト（ＲｏｂｅｒｔｓＬＡ、Ｂ、＋７０リク（Ｆｒｏｌｉｋ）、 Ｃ，Ａ、　。

アンザノ（Ａｎｚａｎｏ）、Ｍ、　Ａ、およびスボーン（Ｓｐｏｒｎ）＋Ｍ、　 ８．７エグレーシヨン・プロシーディンゲス（Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、　）４２．２ ６２１−２６２６（１９８３）。

１７、オザンネ（Ｏｚａｎｎｅ）ｔＢ、　＋フルトン（Ｆｕｌｔｏｎ）、ＲｏＪ 、およびカブラン（Ｋａｐｌａｎ）、Ｐ、　Ｌ、ツヤ−ナル・オブ・セル・フイ ノオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）１０５，１６３−１８０（１９ ８０）。

１８、カブラン（Ｋａｐｌａｎ）ｔＰ、　Ｌ、　＋アンダーラン（Ａｎｄｅｒｓ ｏｎ）ｖＭ。

およびオザンネ（Ｏｚａｎｎｅ）＋　Ｂ　、プロシイ−ディンゲス・オブ・ナシ ョナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏａ、　ｎａｔｎ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　）Ｕ。

Ｓ、Ａ、７９，４８５−４８９（１９８２）。

１９、カブラン（Ｋａｐｌａｎ）、Ｐ、　Ｌ、およびオザンネ（○ｚａｎｎｅＬ 　Ｂ、セル（Ｃｅｌｌ）３３．９３１　９３８（１９８３）。

２０、マークアルド（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）、Ｈ，＋７ンカピラー（Ｈｕｎｋａ ｐｏｌ　１ｅｒ）。

Ｍ、Ｗ、７ツド（Ｈｏｏｄ）、Ｌ、Ｅ、　、ツワルノク（Ｔｗａｒｄｚｌｋ）、 Ｄ、　Ｒ，、デ・タルフ（Ｄｅ、　Ｌａｒｃｏ）、Ｊ、　Ｅ、　、ステ７アンソ ン（Ｓ　ｔｅｐｈｅｎｓｏｎ）＋　Ｊ　。

Ｒｏおよびトクロ（Ｔｏｄａｒｏ）、Ｇ、Ｊ、プロシイ−ディンゲス・オブ・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、ｎａｔｎ、Ａｃａｄ、 　Ｓｅｉ、）ｕ、ｓ、Ａ、８０．４６８４−４６８８（１９８３）。

２１、ボウウエンーポーブ（Ｂｏｉｌｅｎ−Ｐｏｐｅ）、Ｄ、Ｆ、　ｒノ・コル レツ）　（Ｄｉ　Ｃｏｒｌｅｔｔｏ）、Ｐ、　Ｅ、およびロス（Ｒｏｓｓ）、Ｒ ，ツヤ−ナル・オプ・セル・バイオロジ（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　）９６ ．６７９−６８３（１９８３）。

２２、フリンス（Ｃｏｆｆｉｎｓ）、Ｍ、　Ｋ、　Ｌ、　、シンネット−スミス （Ｓｉｎｎｅｔｔ−８ｍｉｔｈ）ｖＪ、Ｗ、およびローゼングルト（Ｒｏｚｅｎ ｇｕｒｔ）Ｅ、クヤーナル・オプ・セル・バイロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅａ＋、　）２５７．５２２２０−５２２５（１９８２）。

２４、カーベンター（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ）、Ｇ、　＋ストスチェック（Ｓ　ｔ ｏｓｃｈｅｃｋ）＋Ｃ，Ｍ、、ブレストン（Ｐｒｅｓｔｏｎ）ｗＹ、　Ａ、およ びデ・タル：＋（Ｄｅ、Ｌａｒｃｏ）ｖＪ、　Ｅ、　、プロシーディンゲス・オ プ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ　（Ｐｒｏｅ、　ｎａｔｎ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）Ｕ、　Ｓ、　Ａ、８０゜５６２７−５６３０（１９ ８３）。

２５、：）−ヘン（Ｃｏｈｅｎ）、Ｓ、、ウスヒｏ（Ｕｓｈｉｒｏ）、Ｈ，、ス トスチェック（Ｓｔｏｓｃｈｅｃｋ）、Ｃ６およびチンケース（Ｃｈｉｎｋｅｒ ｓ）、Ｍ、ツヤ−ナル・オプａバイロッカルーケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２５７．１５２３−１５３１（１９８２）。

２６、プ７０−（Ｂｕｈｒｏｗ）ｗｓ、　Ａ、　＋）−ヘン（Ｃｏｈｅｎ）、Ｓ 、、およびスフロス（Ｓｔａｒｏｓ）、Ｊ、　Ｖ、ジャーナル・オブ・バイロジ カル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａｓ、）２５７．４０１９−４０２ ２（１９８２）。

２７、ニア−ヘン（Ｃｏｈｅｎ）、　Ｓ、　ｔ　７アパ（Ｆａｖａ）、ＲｏＡ、 およびサライア（Ｓａｕ＋ｙｅｒＬＳ、Ｔ、プロシーディンゲス・オプ・ナショ ナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｅ、ｎａｔｎ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｅｉ、　）Ｕ、　Ｓ、　Ａ。

７９．６２３７−６２４１（１９８２）。

２８、プ７０−（Ｂｕｈｒｏｗ）＋Ｓ、　Ａ、　ｔ：＋−ヘン（Ｃｏｈｅｎ）、 Ｓ、　、Ｗ−パース（Ｇａｒｂｅｒｓ）ＩＤ、　Ｌ、およびスフロス（Ｓｔａｒ ｏｓ）、Ｊ、Ｖ、ジャーナル・オブ・バイロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、）２５８゜７８２４−７８２７（１９８３）。

２つ、ビショップ（ＢｉｓｈｏｐＬＪ８Ｍ、ｔアニュアル・リビュー、オプ・バ イオケミストリー（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）５２，３０１−３５ ４（１９８３）。

３０、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）４．−ニシグ（Ｎｉｓｈｉｄｉ）、Ｔ、　 、ミヤノ？（Ｍｉｙａｊｉｍａ）＋Ｎ、　＋カワイ（Ｋａｗａｉ）、Ｓ、オオイ （○ｏｉ）、Ｔ、およびトヨシマ（Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ）、　Ｋ、セル（Ｃｅｌ ｌ）３５．７ｌ−７８（１９８３）。

３１．７グムソン（Ａｄａｍｓｏｎ）、Ｅ、　Ｄ、およびリース（Ｒｅｅｓ）、 Ａ、　Ｒ。

モレキュラー・セル＋／＜イオケミストリー（Ｍｏ１．　Ｃｅｌ　ｌ　Ｂ　１ｏ ｃｈｅＩ１１．　）３４．１２９−１５２（１９８１）６ ３２、リンスレー（Ｌｉｎｓｌｅｙ）ｔＰ、　Ｓ、　＋ゲス（Ｄａｓ）、Ｍ、お よびフォックス（Ｆａｘ）、Ｃ，Ｆ、　、メンブレン・リセブターズ（Ｍｅｍｂ ｒａｎｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）［ノヤコプス（Ｊ　ａｃｏｂｓ）、Ｓ　、およ びクアトレカサス（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）＋Ｐ、！ｉｌ（チャプマン・アン ド・ホール、ロンドンおよびニューヨーク）ｖｏｌ。

Ｂｌｌ、ｐｐ８７−１１３（１９８１）。

３３、シュフイベル（Ｓｅｈｒｅｉｂｅｒ）、Ａ、　Ｂ、　、フクス（Ｌａｘ） 、　１．　、ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）、、ニジユバ−（Ｅｓｈｈａｒ）＋　Ｚ 、およびシュレシンＷ−（Ｓｅｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ）ｙ　Ｊ　、プロシーディ ンゲス・オプ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　ｎ ａｔｎ、　Ａｃａｃｌ、　Ｓｃｉ、　）Ｕ、　Ｓ、　Ａ、７８゜７５３５−７５ ３９（１９８１）。

３４、クォーターフィールド（Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ）ｖＭ、　Ｄ、　メイアー （Ｍａｙｅｓ）、Ｅ、Ｌ、Ｖ、、ストルーバント（Ｓ　ｔｒｏｏｂａｎｔ）＋　 Ｐ、　ｔベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）、Ｐ、Ｌ、Ｐ、＋ヤング（ＹｏｕｎｇＬＳ 、　、グツド７　工ａ　−（Ｇｏｏｄｆｅｌ　ｌｏｗ）ｔＰ、Ｎ、、パンチング （Ｂａｎｔｉｎｇ）＋Ｇ、　Ｓ、およびオザンネ（○ｚａｎｎｅＬ　Ｂ。

ツヤ−ナル・オブ・バイロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅ ａ＋。

）２０．１４９−１６１（１９８２）。

３５、カワモト（Ｋａｗａｍｏｔｏ）、Ｔ、　Ｔサトウ（Ｓａｔｏ）、Ｊ、　Ｄ 、　、シー（Ｌｅ）、Ａ、、ポリ）７（ＰｏｌｉｋｏｆＴ）、Ｊ、　ｖサトー（ Ｓａｔｏ）、Ｇ、　Ｈ，およびメンデルソーン（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ）、　、 Ｉ　、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシ ズ（Ｐｒｏｃ、　ｎａｔｎ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）Ｕ。

Ｓ、Ａ、８０．１３３７−１３４１（１９８３）。

３６、リチャート（Ｒｉｃｈｅｒｔ）＋Ｎ、　Ｄ、ワイリングハム（Ｗｉｌｌｉ ｎｇｈａｍ）ｖＭ、Ｃ，およびパスタン（ＰａｓｔａｎＬ　ｒ　、ツヤ−ナル・ オブ・バイロッカルーケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩｏ、）２５８．８ ９０２−８９０７（１９８３）。

３７、グレゴリオウ（ＧｒｅＨｏｒｉｏｕ）＋　Ｍ、およびリース（Ｒｅｅｓ） 、Ａ、Ｒ。

セル゛バイオロノー・インターナショナル・リボーツ（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ。

Ｉｎｔ、　Ｒｅｐｏｒｔｓ）７，５３９−５４０（１９８３）。

３８、シュレシンガー（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ）＋Ｊ、　＋ラクス（Ｌａｘ ）、　Ｉ　、　、ヤーデン（Ｙａｒ＋（ｅｎ）、Ｙ、　、カネテイー（Ｋａｎｅ ｔｙ）＋　Ｈ，およびリバーマン（Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ）＋Ｔ、　Ａ、　＋受容 体および認Ｒ＝受容体に対する抗体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｇ ｎｉｔｉｏｎ：ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ） ［グリーゲス（Ｇｒｅａｖｅ＋＝）Ｍ、　Ｆ、　！］（チャプマン・アンドφホ ’−ルーａンド／）＜１９８５）。

３９．７アプリガンド（Ｆａｂｒｉｃａｎｔ）、Ｒ，Ｎ、　、デ・フル：１７（ Ｄｅ　Ｌａｒｃｏ）、Ｌ、　Ｅ、およびトゲｏ（Ｔｏｄａｒｏ）、Ｇ、Ｊ、プロ シーディンゲス−ｒブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ ｅ、　ｎａｔｎ、　Ａｃａｒ、Ｓｃｉ、）Ｕ、Ｓ、Ａ、７４．５６５−５６９（ １９７７）。

４０、ウラン（Ｗｒａｎｎ）、Ｍ、　Ｍ、お７オクス（Ｆｏｘ）、Ｃ，Ｆ、ツヤ −ナル・オプＨバイオロッカ／Ｌ、−ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、　）２５４゜８０８３−８０８６（１９７９）。

４１、オ′キー７！（０’Ｋｅｅｆｅ）、Ｅ、　、ホレンバーク（Ｈｏｌ　ｌｅ ｎｂｅｒｇ）＋Ｍ、Ｄ、およびクアトレカサス（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）ｖ　 Ｐ、アーチーゲス・オブ・バイオケミストリー・アンド・フィジックス（Ａｒｃ ｈ、　Ｂ　１ｏｃｈｅｓ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、）１６４，５１８−５２６（１ ９７４）。

４２゜グリツク（Ｇｕｌｌｉｃｋ）、Ｗ、、グランワード（Ｄｏｗｎｗａｒｄ） 、Ｄ、Ｊ　。

Ｈ，、−ｐ−スデン（Ｍａｒｓｄｅｎ）、Ｊ　、Ｊ、およびウォーターフィルド （Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ）１Ｍ、　Ｄ、　、７ナリテイカル・バイオケミストリ ー（Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）（イン・ザ・プレス）。

４３、クイ−（Ｕｉ）、Ｎ、アナリテイカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙ ｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、９７．６５−７１　（１，９７９）。

４４、スケヘル（Ｓｋｅｈｅｌ）、Ｊ、Ｊ、およびウォーターフィルド（Ｗａｔ ｅｒｆｉｅｌｄ）、Ｍ、　Ｄ、　、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・ア カデミ−・オブφサイエンシズ　（Ｐｒｏｃ、　ｎａｔｎ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ ｉ、　）Ｕ、Ｓ、　Ａ。

７２．９３−９７（１９７５）。

４５、ウォーターフィルド（Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ）＋Ｈ，Ｄ、　＋およびスフ レイス（Ｓｃｒａｃｅ）、Ｇ、Ｔ、　ｌ（ｉ体りロマトグラフィーの生物学的／ 生医学的応用（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏａｌｅｄｉｃａｌ　ＡｐｐＨ１ｃ ａｔｉｏｎｓ　ｏｒ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ハウク Ｇ、Ｌ、祠）（ｖ−セル・デツカ−、ニューヨーク）ｖｏｌ。

１８、ｐｐ１３５　１５？（１９８１）。

４６、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）＋Ｈ，Ｐ、Ｊ、　＋プロラン（Ｂｒｏｗｎｅ ）、Ｃ，Ａ。

およびソロモン（Ｓｏｌｏｍｏｎ）、Ｓ、Ｊ、液体クロマトグラフィー（Ｌ　ｉ ｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｔｒ）、３．１３５３−１３６５（１９８０）。

４７、ヘライック（）ｌｅｗｉｃｈ）、　Ｒ，Ｍ、　＋　７ンカピラー（Ｈｕｎ ｋａｐｉｌｌｅｒ）＋Ｍ、Ｗ０．７ツド（Ｈｏｏｄ）−Ｌ、　Ｅ、およびドレイ ア−（Ｄｒｅｙｅｒ）ｖＷ、Ｊ。

ジャーナル・オプ・バイオロノカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ＩＩ。

）２５６．７９９０−７９９７（１９８１）。

４８、ウォーターフィルド（Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ）ｔＭ、　Ｄ、　＋スフレイ ス（Ｓｃｒａｃｅ）、Ｇ、およびトラティ（Ｔｏｔｔｙ）＋Ｈ，＋実際的タンパ ク質の生化学（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ（グルプレＩＡＩおよびウォーターフィルドＭ、Ｄ、　ｌｌ）（ウィリー、ニ ューヨーク）（イン・ザ・プレス）。

４９、ウルハ−（Ｗｉｌｂｕｒ）、Ｗ、Ｊ、およびリブマン（Ｌｉｐａ＋ａｎ） 、Ｄｏ、ｒ。

プロシーディンゲス・オプ・ナショナル・７カダミー・オブ・サイエンシズ（Ｐ ｒｏｃ、ｎａｔｎ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）Ｕ、　Ｓ、　Ａ、８　（Ｌ７２ ６−７３０（１９８３）。

５０、メイエス（Ｍａｙｅｓ）＋Ｅ、　Ｌ、　Ｖ、およびウォーターフィルド（ Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ）、Ｍ、　Ｄ、　＋ＥＭＢＯＪ、　（イン・ザ・プレス） 。

５１、ペンストレム（Ｖｅｎｎｓｔｒ６ｍ）＋Ｂ、およびビショップ（Ｂｉｓｈ ｏｐ）＋Ｊ、Ｍ、セル（Ｃｅｌｌ）２８，１３５−１４３（１９８３）。

５２、キタムラ、Ｎ、、キタムラ、Ａ、、）ヨシマ、に、、ヒラヤマ、Ｙ。

およびヨシグ１Ｍ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９７，２０５−２０８（１９ ８２）。

５３、グツド７エ０−（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ）、Ｐ、　Ｎ、　、ｔ＜ンチング （Ｂａｎｋｉｎｇ）、Ｇ、、７オーターフイルド（Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ）、Ｍ 、　Ｄ、　、オザンネ（○ｚａｎｎｅＬＢ、サイトデネチツクス・アンド・セル ・ジエネチツクス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ。

Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、　）３２，２８２（１９８２）。

５４、シミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ）、Ｎ、　ｌベーザーノアン（Ｂｅｈｚａｄｉａ ｎ）、Ｍ、　Ａ。

およびシミズ（Ｓ　ｈｉｍｉｚｕ）、Ｙ、プロシーディンゲス・オブ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　ｎａｔｎ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、）Ｕ。

Ｓ、Ａ、７７．３６００−３６０４（１９８０）。

５５、フンドー、■、およびシミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ）、Ｎ、、サイトデネチツ クス・アンド・セルージエネチツクス（ＣｙｔｏＦｉｅｎｅｔ、　Ｃｅ１ｌ、　 Ｇｅｎｅｔ、　）＋３５．９−１４（１９８３）。

５６、スパー（Ｓｐｕｒｒ）＋Ｈ，ｔソロモン（Ｓｏｌｏｍｏｎ）＋　Ｅ、　＋ シャンソン（ＪａｎｎｓｓｏｎＬＭ、　シー７　（Ｓ　ｂｅｅｒ）−Ｄ、　、グ ツド７！Ｏ−（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ）、Ｐ。

Ｎ、、ボドｖ−（Ｂｏｄｍｅｒ）＋Ｗ、　Ｆ、およびペンストロム（Ｖ　ｅｎｎ ｓｔｒｏｗ　）＋　Ｅ。

ＥＭＢＯＪ、３，１５９−１６３（１９８４）。

５７、グリーンバーブ（ＧｒｅｅｎｂｅｒＩ？）＋Ｈ，Ｅ、およびニブルマン（ Ｅｄｅｌｍａｎ）、Ｇ、　Ｍ、セル（Ｃｅｌｌ）３３，７６７−７７９（１９８ ３）。

５８、クロ７エン（ＧｒｏｆＴｅｎ）、　Ｊ　、　、ヘイステルカンプ（Ｈｅｉ ｓｔｅｒｋａｍｐ）＋Ｎ、、レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）、Ｆ、ＨｏＪｒ、 　、およびステ７エンソン（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ）＋　Ｊ　、　Ｒ，ネイチャ ー（Ｎａｔｕｒｅ）３０４，１６７−１６９（１，９８３）ａ ５９、ハイマン（Ｈａｙｍａｎ）、Ｍ、Ｊ、　＋ラムセイ（Ｒａｍｓａｙ）＋Ｇ 、　Ｍ、　＋サビン（Ｓａｖｉｎ）、に、　、キツチェナー（Ｋｉｔｃｈｅｎｅ ｒ）、Ｇ、　、グラフ（Ｇｒｄ）４゜お上びベウグ（Ｂｅｕｇ）ｔＨ，セル（Ｃ ｅｌｌ）３２，５７９−５８８（１９８３）。

６０、ブリパルスキー 、ビショップ（Ｂｉｓｈｏｐ）＋Ｊ．　Ｍ．ｖフグラス（ＭｃＧｒａｔｈ）、　 Ｊ　、Ｐ，およびレビンソン（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ）、Ａ．　Ｄ．セル（Ｃｅｌｌ ）３　２．１　２　５　７−１　２　６７（１９８３）。

６１、ベウグ（Ｂｅｕｇ）ｔＨ，　／＜ルミエリ（Ｐａｌｍｉｅｒｉ）＋Ｓ．　 ＋７レウデンナステイン（Ｆｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ）＋Ｃ．　＋ゼントグラ７ （Ｚｅｎｔｇｒａｆ）、Ｈ．お上びグラフ（ＧｒａｆＬ　Ｔ、セル（Ｃｅｌｌ） ２８，９０７−９１９（１９８２）。

６２．グラフ（Ｇｒａｆ）、Ｔ、およびベウグ（ＢｅｕｇＬＨ，セル（Ｃｅｌｌ ）３４．７−９（１９８３）。

６３６７ライクバーク（Ｆｒｙｋｂｅｒｇ）＋Ｌ、　＋パルミエリ（Ｐａｌｍｉ ｅｒｉ）、Ｓ。

ｔベツグ（Ｂｅｕｇ）ｙＨ＋ＧｒａＬＴ、　＋Ｈａｙｍａｎ＋Ｍ、Ｊ、　＆　Ｖ ｅｎｎｓｔｒｏｍ＋Ｂ＋セル（Ｃｅｌｌ）３２，２２７−２３８（１９８３）。

６４．７ング（ＦｕｎＨ）ｙＹ　Ｋ、　Ｔ、　＋レウイス（Ｌｅｗｉｓ）、Ｗ、 Ｇ、　、クリツテンデン（Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ）、Ｌ、　Ｂ、およびクング（ Ｋ　ｕｎｇ）＋　ＨＪ、セル（Ｃｅｌｌ）３３．３５７　３６８（１９８３）。

６５、フビツツ（Ｒａｂｂｉｔｔｓ）、Ｔ、Ｈ，，７オルスター（Ｆｏｒｓｔｅ ｒＬ　Ｒ。

Ａ　Ｈ＋ハ！ル（Ｂａｅｒ）、　Ｒ，およびハムリン（Ｈａ＋＊１ｙｎ）、Ｐ、 　Ｈ，ネイチ６６、フビツツ（Ｒａｂｂｉｔｔｓ）＋Ｔ、　Ｈ，＋ハムリン（Ｈ ａｍｌｙｎＬ　Ｐ、　Ｈ。

およびハエル（Ｂａｅｒ）、Ｒ，、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０６，７６０ −７６５（１９８３）。

６７、デルマン（Ｇｅｌｍａｎｎ）ｔＥ、　ｐ、　＋７サリド・ボウロス（Ｐｓ ａｌｌｉｄ。

Ｐｏｕｌｏｓ）Ｊｉ、　Ｃ１，ハ／＜ス（Ｐａｐａｓ）ｔＴ、　Ｓ、および７ア ベラ（Ｆ　ａｖｅｒａ）、ＲｏＤ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０６．７９９ 　８０３（１９８３）。

６８、ロイ−バーマン（Ｒｏｙ−Ｂｕｒｍａｎ）＋Ｐ、　＋デビ（Ｄｅｖｉ）、 Ｂ、　Ｇ、　。

バーカー（Ｐａｒｋｅｒ）、　Ｊ　、Ｗ、インター・ナショナル・オプ・キャン クー（Ｉｎｔ、Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）３２，１８５−１９１（１９８３）。

６９、レディー（Ｒｅｄｄｙ）＋　Ｅ、　Ｐ、　ｌスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｍ、 Ｊ　、およびスリニバサン（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ）＋Ａ、プロシーティンゲス ・オプ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　ｎａｔｎ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）Ｕ。

Ｓ、Ａ、８０．３６２３−３６２７（１９８３）。

７０、プラト７オード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、Ｍ、　Ｍ、アナリティヵル・バイ オケミトリー（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）７２．２４８　２５４（１９ ７６）。

７１、スミス（Ｓｗｉｔｈ）＋Ｃ，Ｍ、、ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）、Ｄ、　Ｍ 、　、キング（Ｋｉｎｇ）、Ｂ、Ｆ、　ｌドナヒユー（Ｄｏｎａｈｕｅ）、Ｔ、 　Ｍ、　、ルジクキー（Ｒｕｚｙｃｋｉ）＋Ｓ、　Ｍ、およびケリー（Ｋｅｌｌ ｅｙ）、Ｌ、に、アメリカン・ジャーナル・オプ・オゲステットリクス・アンド ・ノネコロン−（Ａｍ、Ｊ、　０ｂｓｔｅｔ、Ｇｙｎｅｃｏｌ、）１２８，１９ ０−１９６（１９７７）。

７２、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、Ｕ、　Ｋ、ネイチャー（Ｎ　ａｔｕｒｅ） 　２２７　ｖ　６８０−６８５（１９７０）。

７３、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）ｖＤ、　＋チザード（Ｔ　１ｚｚａｒｄ ）、　Ｒ，およびギルバート（Ｇ　１ｌｂｅｒｔ）、Ｗ、セル（Ｃｅｌｌ）３２ ，８５３　８６９（１９８３）７４、Ｘｖ−ト（Ｓｍａｒｔ）、　Ｊ　、’　Ｅ 、　＋オッパーマン（○ｐｐｅｒｍａｎ）＋　Ｈ，＋ツエルニロアスキー（Ｃｚ ｅｒｎｉｌｏｆｓｋｙＬＡ、　ｐ、　ｌプルチオ（Ｐｕｒｃｈｉｏ）−Ａ。

Ｆ、、エリクソン（Ｅｒｉｋｓｏｎ）、　Ｒ，Ｌ、およびとショップ（Ｂ　１ｓ ｈｏｐ）、　Ｊ。

Ｍ、プロシーティンゲス・オプ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ （Ｐｒｏｅ、　ｎａｔｎ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　）Ｕ、　Ｓ、　Ａ、７８． ６０１３−６０１７（１９８１）。

７５、オル（Ｏｒｒ）、Ｈ，Ｔ、、ランセル（Ｌａｎｃｅｔ）、Ｄ、、　ａツブ （Ｒｏｂｂ）。

Ｒｏ、ロベズ・デ・カストｏ（Ｌｏｐｅｚ　ｄｅ　Ｃａ５ｔｒｏ）＋Ｊ、　Ａ、 およびストロミンガ−（Ｓ　ｔｒｏｍｉｎｇｅｒ）、　Ｊ　、　Ｌ。ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ）　２８２　、２６６−２７０（１９７９）。

７６、ウルリツビ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）、Ａ、クーセンス（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）＋ Ｌ、　ハイ７リツク（Ｈａｙｆｌｉｃｋ）、Ｊ、　ｓ、　ｌグル（Ｄｕｌｌ）、 Ｔ、Ｊ、　、グレイ（Ｇｒａｙ）＋Ａ、タム（Ｔａｎ）、Ａ、Ｗ、、クー（Ｌｅ ｅ）、　Ｊ、ヤルデン（Ｙａｒｄｅｎ）、Ｙ、リバーマン（Ｌｉｂｅｒｗｉｎｎ ）ｗＴ、　Ａ、　＋シュレシンｆｆ−（ＳｃｈｌｅｓｓｉｎＨｅｒ）ｖ　Ｊ、　 ｅグランワード（Ｄｏｗｎｗａｒｄ）、Ｊ、、メイエス（Ｍａｙｅｓ）＊Ｅ、Ｌ 、Ｖ、ｔウィットル（Ｗｈｉｔｔｌｅ）、Ｎ、　＋ウォーターフィールド（Ｗａ ｔｅｒｆｉｅｌｄ）、Ｍ、　Ｄ、　。

シーバーブ（Ｓｅｅｂｕｒｇ）＋Ｐ、　Ｈ，＋ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０ ９，４１８−光菅濃度 ？七トニトソルの　・ｈ ｔｒｈ−７４１１ｊ　ＬＰＳＰＴＤＳＫｒＹＲＴＬＭＣ仁ＣＤＭ仁ｆｌｌＸＶ口 Ａｎ（ＹＬＶＰＩ−１０ＧＦｒＮＳＰＳＴＳＲＴＰＬＬＳＳk ＤＶｖＤＡＤＣＹＬＩＰＱＯＧｒ 〜・５ −〜 ｆ”ｔ　ｘ仕 ０　１．０　２０　Ｂ、０　４．０　５．ＯｋｂＦｉｇ、　７゜ Ｆ勾・８・ 国際調査報告 ｌｎｌ・マν一一１−−１１ｅｌＡ＆ｌＮ４ｔｊＶｅｌ１１＋１１．ＰＣτ／Ｇ １８５１０００４５１１Ｉｌａｍｊ＋Ｉ＠−＾−ｅ’＝−”−”ｏＰＣＴ／ＧＢ 　８５１０００４５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．人間から試験試料を採取し、そして前記試料を構造的に変更されたあるいは 異常に発現された生長因子受容体について、あるいはそれらを暗号化するｍＲＮ Ａ転写体または遺伝子についてアッセイすることをことを特徴とする診断法。 ２．欠失されたその成熟アミノ末端の少なくとも一部分を有する裁断生長因子受 容体についてアッセイする請求の範囲１に記載の方法。 ３．欠失されたアミノ末端の一部分は受容体の生長因子結合領域を含有している 請求の範囲２に記載の方法。 ４．裁断されていない生長因子受容体はＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−１またはイ ンシュリンの群から選択される生長因子を結合する請求の範囲２または２に記載 の方法。 ５．試験試料は体液、組織の試料または培養した腫瘍移植細胞である請求の範囲 １〜４のいずれかに記載の方法。 ６．試験試料を機能的生長因子結合領域の欠失により暴露される生長因子受容体 エピトープを決定することによりアッセイする請求の範囲１〜５のいずれかに記 載の方法。 ７．裁断生長因子受容体はその生長因子により調節されない蛋白質ホスホキナー ゼ活性を示す請求の範囲１〜６のいずれかに記載の方法。 ８．生長因子受容体の生長因子結合領域またはそのフランキング区域に直接的に あるいは間接的に特異的に結合することのできる物質を固定化し、生長因子受容 体の試験試料からの吸着を可能とする条件下に前記試験試料を前記固定化物質と 接触させ、その後試験試料中に残留する裁断生長因子受容体を決定することによ り、試験試料をアッセイする請求の範囲１〜７のいずれかに記載の方法。 ９．結合領域およびそのフランキング区域は成熟受容体の最初の約５００アミノ 酸残基である請求の範囲８に記載の方法。 １０．前記物質は、生長因子、生長因子受容体の生長因子結合領域へ結合するこ とのできる抗体、または生長因子が受容体へ結合されているとき生長因子に結合 することのできる抗体である請求の範囲８または９に記載の方法。 １１．試験試料は、 （１）生長因子受容体へ生長因子結合領域以外の部位において結合することので きる第１物質を固定化し、 （２）固定化された物質を裁断されかつ無傷の生長因子受容体を含有すると思わ れる試験試料と接触させ、 （３）吸着されない試験試料を除去し、そして吸着された試験試料を（ａ）第１ 物質または生長因子結合領域以外の部位において生長因子受容体へ結合すること のできる第２物質および（ｂ）生長因子結合領域において生長因子受容体と結合 することのできる第３物質と、前記第２物質および前記第３物質が吸着された受 容体へ特異的に吸着するのに好適な条件下に接触させ、ただし前記第２物質およ び前記第３物質は検出可能に異る部分で標識されており、 （４）吸着されない第２物質および第３物質を除去し、そして（５）第２物質お よび第３物質の比を決定する、ことによってアッセイされる請求の範囲８または ９に記載の方法。 １２、第１物質、第２物質および第３物質は抗体またはそのＦａｂ断片である請 求の範囲１１に記載の方法。 １３．第３物質は生長因子である請求の範囲１１に記載の方法。 １４．検出可能に異る部分は異る蛍光基または発色基または放射性同位元素であ る請求の範囲１１、１２または１３に記載の方法。 １５．生長因子はＥＧＦであり、そして試験試料は血液血清である請求の範囲１ 〜１４のいずれかに記載の方法。 １６．ＥＧＦ受容体内の前もって決定したアミノ脾配列に結合することのできる 抗体。 １７．前記配列は膜内外配列とＥＧＦ受容体のＥＧＦ結合領域との間に位置する 請求の範囲１６に記載の抗体。 １８．前記配列は膜内外配列から最初の６０残基のアミノ末端内に位置する請求 の範囲１７に記載の抗体。 １９．前記抗体はモノクローナル抗体である請求の範囲１６〜１８のいずれかに 記載の抗体。 ２０．製薬学的担体をさらに含む請求の範囲１６〜１９のいずれかに記載の抗体 。 ２１．検出可能な部分により標識されている請求の範囲１６〜２０のいずれかに 記載の抗体。 ２２．放射線不透過性物質で標識されている請求の範囲１６〜２１のいずれかに 記載の抗体。 ２３．毒素へ接合されている請求の範囲１６〜２２のいずれかに記載の抗体。 ２４．毒素はジフテリアの毒素またはリチンのサブユニットＡである請求の範囲 ２３に記載の抗体。 ２５．毒素への接合はジサルファイドまたはアミドの結合による請求の範囲２３ または２４に記載の抗体。 ２６．アミノ酸配列は【配列があります】，【配列があります】，【配列があり ます】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】または 【配列があります】の群から選択される請求の範囲１６〜２５のいずれかに記載 の抗体。 ２７．アミノ酸配列は【配列があります】であり、ここでＥはＱ、またはこのよ うな配列の断片であることもできる請求の範囲１６〜２５のいずれかに記載の抗 体。 ２８．請求の範囲１６〜２７のいずれかに記載の抗体を人間に投与することを特 徴とする生体内診断法。 ２９．請求の範囲１６〜２７のいずれかに記載の抗体を癌をもつことが疑われる 動物へ投与することを特徴とする方法。 ３０．ＥＧＦ受容体のポリペプチド断片へ結合した免疫原のポリマーからなるこ とを特徴とする抗体類似体。 ３１．断片は配列【配列があります】を有する請求の範囲３０に記載の類似体。 ３２．ポリマーはポリペプチドへ共有結合によリ結合されいる蛋白質である請求 の範囲３０または３１に記載の類似体。 ３３．結合はアミド結合である請求の範囲３２に記載の類似体。 ３４．請求の範囲３０〜３３のいずれかに記載の類似体を動物へ投与することを 特徴とする方法。 ３５．癌細胞へＥＧＦ受容体のポリペプチド断片を含有する組成物を投与するこ とを特徴とする方法。 ３６．断片は配列【配列があります】，【配列があります】，【配列があります 】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列が あります】，【配列があります】，（ＥＡＹ）ｎここでｎ＞１、または【配列が あります】を有する請求の範囲３５に記載の方法。 ３７．ポリペプチド断片は製薬学的担体を含む組成物と組み合わされている請求 の範囲３５または３６に記載の方法。 ３８．前記組成物は無菌である請求の範囲３７に記載の方法。 ３９．ＥＧＦ受容体またはその断片を暗号化するＤＮＡまたはＲＮＡ。 ４０．配列【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【 配列があります】，【配列があります】，または【配列があります】 を暗号化する請求の範囲３９に記載のＤＮＡまたはＲＮＡ。 ４１．ＥＧＦ受容体またはその断片を暗号化するＤＮＡまたはＲＮＡと交雑する ことができるＤＮＡまたはＲＮＡ。 ４２．ｖ−ｅｒｂ−ｂＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそれらの断片ではない請求の 範囲４１に記載のＤＮＡまたはＲＮＡ。 ４３．検出可能な部分で標識された請求の範囲４２に記載のＤＮＡまたはＲＮＡ 。 ４４．人間から得られたヒト試験試料からＤＮＡまたはＲＮＡを単離し、そして 試験試料のＤＮＡまたはＲＮＡを請求の範囲４２または４３に記載のＤＮＡまた はＲＮＡと交雑を誘導する条件下で接触させることを特徴とする方法。 ４５．試験試料はＤＮＡであり、そしてざらに試験試料のＤＮＡをＥＧＦ受容体 またはその断片の増幅コピーについて観測することを含む請求の範囲４４に記載 の方法。 ４６．人間の体液試料をＥＧＦ受容体についてアッセイすることを特徴とする人 間の診断法。 ４７．アッセイは定量的である請求の範囲４６に記載の方法。 ４８．試料は癌をもつことが疑われる患者からのものである請求の範囲４６また は４７に記載の方法。 ４９．実施例２または３を参照してここに実質的に記載した請求の範囲１に記載 の診断法。 ５０．実施例１または４を参照してここに実質的に記載した請求の範囲１６に記 載の抗体。 ５１．実施例６を参照してここに実質的に記載した請求の範囲３９に記載のＤＮ ＡまたはＲＮＡ。