JPH02500637A

JPH02500637A - ラミニンレセプターをコード化する組換えｄｎａクローン

Info

Publication number: JPH02500637A
Application number: JP62506395A
Authority: JP
Inventors: ソベル，マーク　イー．; リオッタ，ランス　エー．; ウイワー，ウルラ　エム．; ジェイ，マイケル　シー．; ドロハン，ウイリアム　エヌ．
Original assignee: US Department of Commerce; Rorer International Holdings Inc
Current assignee: US Department of Commerce; Rorer International Holdings Inc
Priority date: 1986-09-26
Filing date: 1987-09-23
Publication date: 1990-03-08
Anticipated expiration: 2011-09-11
Also published as: DE3750180T2; JP2825780B2; WO1988002407A1; CA1305678C; JPH0880200A; EP0324788A4; EP0324788B1; ATE108188T1; DE3750180D1; US4861710A; JPH06107691A; EP0324788A1; JP2533595B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ラミニンレセプターをコード化する組換えＤＮＡクローン本発明は一般的に組換えＤＮＡに関する。より詳細には、本発明はラミニンの高親和性（約１０−８〜１Ｏ−１０ｋｄ）細胞表面レセプターをコード化する組換えＣＤＮＡクローンに関する。

技術状況ラミニンは表皮細胞及び新生細胞の両者の基底膜への結合を媒介する基底膜の主たる糖タンパク質成分である。

基底膜は器官柔組織細胞を間質性コラーゲン様ストロマから分離する至る所に存在する特殊化されたタイプの外細胞マトリックスである。細胞とこのマトリックスの相互作用は正常及び新生細胞過程の両者の重要な側面である。正常な細胞は外細胞マトリックスを生存、増殖及び分化のために必要とするように思われるのに対し、移動性細胞は正常細胞及び新生細胞共に一つの組織から他の組織に移動するに際して基底膜を横切らなければならない。特に扁平或いは小線表皮細胞に生ずる転移癌細胞は循環及びリンパ系に入るためには基底膜を横切らな１少ればならず（血管内異物侵入）、又循環新生細胞は器官の毛細管床に典型的に捕えられ、血管壁を冒し、及び基底膜を侵入して血管外組織に至り（管外遊出）、そこで二次的新生物を次いで確立する。ラミニンレセプターは表皮及び新生細胞の両者の基底膜への結合を媒介することにより特に転移過程を制御することにおいて極めて重要な役割をはたす。米国特許４，５６５．７８９号明細書はラミニンレセプターの単離及びある種の側面の特性化を記載している。しかしながら、ラミニンの細胞表面レセプターをコード化するクローン化ＤＮＡ配列はこれ迄知られていない。

発明の概要従って、本発明の目的はラミニンの高親和性（約１０〜１０”　ｋ　（Ｙ）細胞表面レセプターをコード化することのできる組換えｃＤＮＡクローンを提供することである。

更に、本発明の目的は、転移を抑制するラミニンレでブタ−の合成断片を提供することである。

更に本発明の目的は、多量の合成ラミニンレセプターの製造方法を提供することである。

更に本発明の目的は膜張渡し領域及びリガンド結合領域などの特定の領域をコード化するラミニンレセプターの合成断片を提供することである。

更に本発明の目的は異った腫瘍細胞及び正常な組繊細胞集合体におけるラミニンレセプターｍＲＮＡの含量を評価する診断方法を提供するものである。

更に本発明の目的は異った組織及び腫瘍細胞集合体におけるラミニンレセプター遺伝子のパターンを決定する診断方法を提供することである。

図面の簡単な説明本発明のこれら及びその他の目的を付随する利点の多くは添付図面に関連して考慮するとき以下の詳細な既述を読んでよりよく理解されるであろう。

第１図は精製ラミニンレセプターの均質性を示す。

ＴＯＰは大腸癌からの及び正常ヒト胎盤組織からの精製ラミニンレセプターの比較を示す。ラミニン−５ｅｐｈａｒｏｓｅアフイニテイカラムからｌＮｉＮａＣ１で溶８された物質をジチオスレイトールの存在下においてＮ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７％）により分析し、銀染色により可視化した。パネルはラミニンレセプターの調製物間の分子量の僅かな可変性を例示する（６８．０００〜７２，０００）。レーンＰ１：　ヒト胎盤組織から単離されたラミニンレセプター（１μｇ）。レーンＣａ：　ヒト大腸癌から単離されたラミニンレセプター（３μｇ）。レーンＭ：　分子量マーカー：　ホスホリラーゼｂ　（９４，０００）　、ウシ血清アルブミン（６７，０００）及びオバルブミン（４３，０００）。

ＢＯＴＴＯＭは精製ラミニンレセプターの等電果中及び二次元ゲル電気泳動を示す。上記大腸癌ラミニンレセプタータンパク質試料（０，１μｇ）は１１２５で放射線標識され、等電果中（ｐＨ範囲５〜７）及び１０９６Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４−ポリアクリルアミドゲル上の二次元ゲル電気泳動に付された。分子量マーカー：　ホスホリラーゼｂ　（９３，０００）　、ウシ血清アルブミン（６６、Ｏ○０）、グリセラルアルデヒド３−ホスフニートデヒドロゲナーゼ（３６，０００）。

第２図は精製ラミニンレセプターのＥＬ　Ｉ　ＳＡを示す。

各マイクロタイターウェルを精製腫瘍ラミニンレセプターで被覆し、ＬＲＩモノクローナル抗体２Ｈ５（ロ）、抗アルブミン（０）或いは抗−α・アミラーゼモノクローナル抗体（・）に対して２時間反応させた。抗体をペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＭ或いはペルオキシダーゼ複合ブタ抗ウサギＩｇＧを用いて検出した。

第３図は抗ラミニンレセプターモノクローナル抗体のλＥＬＲ６に対する特異性を示す。約５０〜１００個の精製λＥＬＲ６ブラークを含有するフィルターを抗ラミニンレセプターモノクローナル抗体、抗−ａ−アミラーゼモノクローナル抗体、抗アルブミン抗体或いは抗ラミニン抗体のいずれかと反応された。抗体結合はペルオキシダーゼ複合第二抗体を用いて検出した。

第４図はλＥＬＲＩ〜６の重畳ラミニンレセプターｃＤＮＡインサートを示す。

頂部の線はｃ　Ｄ　Ｎ−Ａインサートの左側への２個のＫｐｎ１部位（Ｋ）を示す原型λＥＬＲ組換えλｇｔ１１ファージの図である。囲いはｃ　Ｄ　Ｎ　Ａインサートを表わす。各インサート内の左のＥｃｏ１１部位は存在しなかった。右のＥｃｏＲ１部位（Ｅ）を示す。λｇｔｌｌの１ａｃＺ遺伝子からの転写はファージの右腕からＥを介して左側に進む。Ｋｐｎ１部位（ｃＤＮＡインサートに最も近接した）から最大のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａインサート（λＮＬＲ４）のＥｃｏＲ１部位に延在する領域は拡大されて下に示される。ｃＤＮＡインサート囲い内の斜線領域はニックトランスレーションされハイブリダイゼーシヨンプローブとして用いられたλＥＬＲ４のサブクローン（第５図参照）から単離されたＰｓτｌ− ５ｐｈｌ制限断片を示す。明細書に説明される共通５ａｃｌ（Ｓ）及びＨｉｎｄｍ（Ｈ）部位が示される。ＥＬＲ組換えファージの各々からのファージＤＮＡはＫｐｎｌ及びＥｃｏＲＩで制限され、１％アガロースゲルを通して電気泳動され、ニトロセルロースに移され、及び上記Ｐｓｔｌ−５ｐｈＩ制限断片にストリンジエントにハイブリダイズされる。プローブにハイブリダイズした各λＥＬＲ組換えファージからのＫｐｎｌ−ＥｃｏＲＩ制限断片の長さをプロットのラジオオートグラフ上に図示し、標準λ／Ｈｉｎｄｍ消化物と対比して決定した。

第５図はλＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートの配列決定の術策を図示する。λＥＬＲ４のサブクローン化インサートの制限地図をトップに示す。Ｅはインサートの５′）：ｃｏＲ１部位である。Ｈ：Ｈｉｎｆ　Ｉ％Ｓ　：　５ｐｈｌ。

Ｒ：Ｒｓａ１％Ｐ：ＰｓｔＩ、　ニオ−カー集結コドン。

矢印１ｋ　５　’末端において（γ−Ｐ３２）ＡＴＰによるキナーゼ化により（・）或いは３′末端において（α−ｐ３２）ジデオキシＡＴＰによるテーリングにより（０）或いはジデオキシ合成法（ｒ）のいずれかにより標識化された断片の配列方向を示す。配列決定に用いられたサブクローンはｐＬＲ４−１、ｐＬＲ４−２、及びｐＬＫ４−４であった。

第６図は下記に得られたタンパク質配列のλＥＬＲｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を提供する。各線の右側には人工ＥｃｏＲ１部位からの塩基対の数が示される（塩基１〜６）。

第７図は、合成ラミニンレセプターペプチドのＥＬＩＳＡ決定を示す。合成ラミニンレセプターペプチドＲＴＬＲ２は第６図におけるｃＤＮＡ配列から精製され、異った稀釈率のウサギ抗うミニンレセプター抗血清或いは前免疫血清を用いてＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａによりアッセイされた。

Ｎ８図はＲＮＡゲルプロットハイブリダイゼーションを示す。全細胞ＲＮＡを数個の乳癌細胞系から抽出し、メチル水銀アガロースゲル上で分離し、及びジアゾベンジルオキシメチルセルロース紙に移した。このフィルターをｐＬＲ４−１からのニックトランスレーションされた（３２Ｐ）　−標識化ＥｃｏＲ１−Ｐｓ　ｔ　Ｉインサートにハイブリダイズした。ハイブリダイズされたｍ　ＲＮ　Ａ種の長さは知られた大きさのｒＲＮＡ及びＨｉｎｄｍで制限されたλＤＮＡの大きさと対比することによりめられた。レーンｌ：ＭｃＦ−７（親）；レーン２＋ＭＣＦ７−３Ｅ５　；レーン３　：　ＭＣＦ７−５Ｈ７；レーン４：ＺＲ７５゜第９図はラミニンレセプターｍＲＮＡレベルと６個のヒト癌細胞系のラミニンに結合する能力との相関関係を示す。第８図に示されるような異った時間のラジオオートグラフの曝露を濃度測定により測定して線形応答範囲を決定した。一連のハイブリダイズされたＲＮＡの最低量に数値１．０を与え、全てのその他の値はその値に対して計算した。各細胞系に対する細胞当りのラミニン量でブタ−の数は対数成長期細胞に対する特異的結合（１１２５）ラミニンの５ｅａｔ−ｅｈａｒｄプロットから計算した。

線形回帰分析は０．９７の相関係数を示した。ｋｉＣＦ−７親口、ＭＣＦ−７クローン５Ｈ７△、ＭＣＦ−７クローン３Ｅ５■、ＺＲ−７５０，腎癌Ａ−７０４争、Ｐａｎｃ−１ム。

第１０図は合成ラミニンレセプターペプチドが細胞へのラミニン結合を抑制することを示す。Ａ２０５ｇヒトメラノーマ細胞のラミニンに特異的に結合する能力を、第６図のｃＤＮＡ配列から精製する各種量のＲＴＬＲ２の口或いはＲＴＬＲ２−コントロール◆の存在下において試験した。値は添加断片の存在下において結合したラミニン量に対して表わされている。及び第１１図はリガンド結合に含まれる合成ペプチドラミニンレセプターの同定を示す。予測された逆転立体配置を有するｃＤＮＡ配列から精製されたペプチド断片（ＲＴＬＲ２、ＲＴＬＲ３）並びにコントロールペプチドはグラスビーズに結合され（１１２５）ラミニンとインキユベートした。示された数値は断片なしにビーズに結合されたｅｐｍを差引いた後のビーズに結合したｃｐｍ×１″０−３の数である。

発明の詳細な説明本発明の上記及び各種のその他の目的及び利点は細胞表面ラミニンレセプターをコード化するヌクレオチド配列を全部或いは部分的に（第６図に示す如く）有する組換えｃＤＮＡクローン及び合成ラミニンレセプター或いはその断片の製造方法により達成される。

特に断りのない限り、本発明において用いる全ての技術的或いは化学的用語は本発明の属する技術における当業者により普通に理解されるものと同一！味を有する。

本発明の実施或いは試験において、本発明において説明されるものと同様或いは等価の如何なる方法及び材料を用いることもできるが、好ましい方法及び材料を以下に説明する。以下に述べる全ての刊行物は本発明において準用する。

本発明の組換えＣＤＮＡクローンを造築及び単離するだめの方法論は更に詳細に例■において説明されており、周知の標準的技術を含む以下の一般的工程を含むものである；ａ）　ヒｈｉ帯静脈内皮細胞からのｍＲＮＡ鋳型を用いてＣＤＮＡを合成する。

ｂ）　内皮細胞ｃＤＮＡをλｇｔｌｌベクター（ＡＴＣＣ３７１９４）中に挿入する。

Ｃ）　二の組換えλｇｔｌｌをパッケージし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｊｅｈｌａ　ｃｏｌｉ）　１０９０細胞（ＡＴＣＣ３７１９７）を感染するために用いる。

ｄ）　得られるλｇｔｌｌヒト内皮細胞ｃＤＮＡ発現ライブラリーをラミニンの結合に含まれるヒトラミニンレセプターの領域を認識するモノクローナル抗体を用いてスクリーニングする。

ｅ）　λＥＬＲＩ〜６と命名される６個のプラークがこのようにして単離及び精製される（第３図）。これらのｃＤＮＡインサートを制限エンドヌクレアーゼマツピングにより分析し、共通領域を有することが判明し、それらがモノクローナル抗体により認識されるラミニンレセブターのエピトープをニード化することを示す（第４図）。

ｆ）　６個の精製相の最も大きいｃＤＮＡインサートをプラスミドベクター中にサブクローン化して更に分析及びＤＮＡ配列決定を容易にする。λｇｔｌｌの左腕にｃＤＮＡインサートを連結するＥｃｏＲ１部位は全ての六つのクローンに存在しない。従ってｐｖｕｎ部位１１ｂｐ下流を利用して、最も大きい組換えファージλＥＬＲ４からｃＤＮＡインサートを精製する。

λＥＬＲ４のＥｃｏＲｌ−ＰｖｕＩｌ制限断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲｌ−Ｐｖｕｎ部位中にサブクローン化してｐＬＲ４−１を作成する。

本発明に従って得られた宿主Ｅ、コリ株Ｃ６００ｒ−ｍ−（ＡＴＣＣ３３５２５）中に形質転換された組換えｃＤＮＡクローンｐＬＲ４−１の寄託は受理番号６７１９９号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　（ＡＴＣＣ）、メリーランド州ロックビル）になされた。要求によりＰＴＯの長官はこの寄託物を入手でき、特許発効時にはこの寄託物は最後の要求後少なくとも５年間或いは少なくとも３０年間、或いは特許の有効期間生育可能に維持され、勿論、法律の規定に従って制限なしに公衆に利用可能とされる。

本発明の確定的に同定する方法は組換えプラスミドのｃＤＮＡ配列（第６図）を精製胎盤ラミニンレセプターのシアノーゲンブロマイド・生成オクタペプチドのアミノ酸配列との比較に基づく。オクタペプチドアミノ酸配列を得るための方法論はより詳細に例１に説明され、周知の標準的技術を含む次の一般工程を包合する：ａ）　ヒト胎盤組織からのミクロゾーム膜を調製し、可溶化する。

ｂ）　可溶化されたミクロソーム膜含を調製物を精製ラミニン−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂのアフィニティマトリックスを通過させ、十分洗浄後高アフィニティラミニンレでブタ−タンパク質を高ａ度塩水（１λＩ　ＮａＣ］）によりリガンドからｆ日出する。

Ｃ）　ヒト胎盤ラミニンレセプターの均質性を二次元ゲル電気泳動（第１図）及び酵素結合免疫固着剤アツてイ（ＥＬＩＳＡ）（第２図）によりアッセイする。

ｄ）　ヒト胎盤ラミニンレセプターをシアノーゲンブロマイドで切断し、得られたペプチド類を逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）により分画する。

ｅ）　胎盤オリゴペプチドのミクロ配列分析は独特の配列ｋｉｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを有するγクタペプチドを露わす。

本発明の別の同定方法はヒト転移乳癌ラミニンレセプターに向けられたウサギ抗血清のｐＬＲ４−１のｃＤＮＡ配列から生成した合成ペプチド（第７図）を同定（ＥＬＩＳＡにより）する能力をめる。この抗ラミニンレセプター抗血清を得る方法論は更に詳細に例■において説明されており、周知の標準的技術を含む次の一般的工程を包合する：ａ）　ラミニンレセプターを胎盤ラミニンレセプターに対して上記に説明したようにヒト転移乳癌から精製する。

ｂ）　腫瘍ラミニンレセプターの均質性を胎盤ラミニンレセプターに対して上記説明の如く評価する。

ｃ）　ＮａＤｏｄＳＯ４−ポリアクリルアミドゲルから切出した腫瘍ラミニンレセプターの皮下注射によりウサギを免疫化する。

ヒト癌細胞などのラミニンレセプターｍＲＮＡを含む細胞の診断アッセイが癌の診断及び予知における有用な道具として開発されてきた。ラミニンレセプターｍ　ＲＮ　Ａ含量のアッセイ方法は更に詳細に例■において説明され、周知の標準的技術に従う次の一般的工程を包合する：ａ）　全細胞ＲＮＡをａ織標本或いは細胞から単離する。

ｂ）　ＲＮＡを変性アガロースゲルを通して変性及び電気泳動させ、濾紙に移す。

ｃ）　ＲＮＡを含む濾紙を放射線標識化ラミニンレセプターｃＤＮＡにハイブリダイズさせる。

ｄ）　洗浄後、フィルターを十分な時間Ｘ−線フィルムに曝露し、放射線活性プローブのイメージを得る。

ｅ）　フィルム上のバンドの相対的強度がラミニンレセプターｍＲＮＡの目安である（第８図）。

ｆ）　或いは又上記工程（ｂ）の代りに変性ＲＮ　Ａの小アリコートを直接に濾紙に結合した後工程（Ｃ）〜（ｅ）を行う。

ｇ）　放射線標識化ラミニンレセプターｃＤＮＡは又ｊｎ　ｓＨυで組織断片及び細胞にハイブリダイズさせてラミニンレセプターｍＲＮＡを発現する特定細胞集団を決定することもできる。

転移細胞におけるラミニンレでブタ−ｍＲＮＡの増加した含量は変化したラミニンレセプターＤＮＡを含有する細胞の診断アッセイの開発に役立つ。二の方法論は各種遺伝病に対して見出だされてきた制限断片長の多形性の可能性のある存在に基づく。腫瘍のゲノム或いは転移細胞におけるラミニンレセプター遺伝子の増幅も又評価されてよい。ラミニンレセプターゲノムＤＮＡの分析方法は周知の標準的技術に従って、次の一般的工程を包合する：ａ）　高分子量ゲノムＤＮＡを例■に説明するように組織標本或いは細胞から単離する。

ｂ）　ＤＮＡを各種制限エンドヌクレアーゼにより消化し、アガロースゲルを通して電気泳動させ濾紙に移す。

ｃ）　ＤＮＡを含有するフィルターを放射線標識化ラミニンレセプターｃＤＮＡにハイブリダイズさせる。

ｄ）　洗浄後、フづルターをＸ−線フィルムに曝露し、フィルム上のバンドのパターンを正常組織からのそれと比較する。

ｐＬＲ４−１のｃＤＮＡ配列から生成した合成ペプチド類は転移の形成を抑制する癌の治療において有用である。本発明において説明される方法は基底膜は良性新生物における連続構造であり、又、良性細胞上のラミニンレセプターは基底膜への結合により占められているという観察に基づくものである。これに対して、侵略腫瘍細胞に隣接した基底膜は連続的ではない。侵略腫瘍細胞はこのようにリガンドに結合していない細胞表面上に発現された増大した数のラミニンレセプターを有する。癌の管理及び診断において重要な概念であるのは転移癌細胞上のラミニンレセプター部位の利用可能性である。εの腫瘍細胞が一次腫瘍部位から隣接正常組織に移動する傾向及びその体の遠方部位に広がり、転移クローンを開始する性向と定義される癌の攻撃性は、次いで部分的により多くの利用可能なラミニンレセプターを有する侵略性細胞の数の一つの反映である。

ｐＬＲ４−１のｃ　Ｄ　Ｎ−Ａ配列から生成する合成ペプチド類は放射線標識化ラミニンに特異的に結合する（第１１図）。ラミニン結合アッセイにおけるこの合成ペプチドの存在は細胞がラミニンに結合する能力を阻害した（第１０図）。

このように、合成ペプチドは細胞表面ラミニンレセプターがラミニンに結合する能力と拮抗及び妨害する。ペプチドが混合ＢＬ６メラノーマ細胞であり、マウスに静脈内注射した場合にＢＬ６細胞からの転移の数は減少した（表１）。如何なる理論にも拘束されるものではないか、合成ラミニンレセプター断片は基底膜に対して直ちに結合することに対して細胞と拮抗して転移細胞のコロニー化を防止するものと思われる。

上記に基づき、本発明が各種方法で癌の診断及び治療並びに細胞によるラミニンの異常な認識から生ずるその他の病気において用いることができることは明らかである。

以下に、本発明を例示する具体例を説明する。

例　Ｉ独特なヒト胎盤ラミニンレセプタ− １りタベブチドの同定ヒト乳癌及び大腸癌に由来する肝臓転移からの組織を国立癌研究所病理学実験室（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ。

Ｎａｔｊｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｊｔｕｔ）及びグロストラップ病院病理学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、　Ｇ］０５ｔｒｕｌ）　）Ｉｏｓｐｊｔａｌ、コペンハーゲン）から得た。正常期間出産から得られたヒト胎盤は国立海軍医療センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＮａｖａｌＭｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ、メリーランド州、ベセスダ）により提供された。

２、ラミニンレセプターの精製腫瘍組織（１００〜３００ｇ）或いは胎盤組織（５００ｇ）を５容（ｗｔ／ｖｏｌ）のリン酸緩衝化塩水（１３７ｍＭ　ＮａＣ１／１．７ｍＭ　Ｋｃｌ／８．１ｍＭ　Ｎ　ａ　２ＨＰ　Ｏ４／　１　、５　ｍＭ　ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４、ｐＨ７，２）中において、　Ｗａｒｉｎｇブレンダー内においてホモジナイズした。この緩衝液及び以下の緩衝液に対して次のプロテアーゼ阻害剤を添加した＝５０μｇ　／　ｍｌｌユニルメチルスルホニルフルオライド、５ｍＭベンズアミジン、１０μｇ　／　ｍ＋アプロチニン、５０μｇ　／　ｍ１大豆トリプシン阻害剤及び５　ｍ　Ｍベーターヒドロキシ水銀安息香酸。５００Ｘｇで１０分間遠心分離後、ホモジネートを０．３Ｍスクロース／２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，３中で１　：　１　（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）に希釈し、氷上でブリンクマンポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ）で超音波処理し、１５．０００Ｘｇで４℃において２０分間遠心分離し、更に上澄液を１４３０００ｘｇで４℃ において９０分間超遠心分離した。得られたベレット内のミクロゾーム膜を２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，３１０１％オクチルフエノリポリエトキシエタノール（Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０，Ｓｉｇｌｌｇ）／２５ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｌ、ｐＨ７，２／１５０ｍＭ　ＮａＣ１／１ｍＭ　ＣａＣｌ２／３ｍＭ　ＭｇＣｌ２中に希釈し、４℃で６時間エンド−オーバー・エンド（ｅｎｄ −ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）回転で抽出した。

この調製物を２００，０００Ｘｇで４℃において１時間超遠心分離し、次いて上澄液を２■のラミニン（ティンプル等Ｔｆｐｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５４：　９９３３−９９３７（１９７９）に説明されたように精製された）をｍｌのＣＢ　ｒＮ−活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）にカップリングさせることにより調製された２ｍ１の５ｅｐｈａｒｏｓｅラミニンアフイニテイマトリツクスと共に４℃で１０時間インキュベートした。５ｅｐｈａｒｏｓｅ　−ラミニンマトリックスを次いで１０回　２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，３／１５０ｍｔ−ｉ　ＮａＣ１／１ｍｈｉ　ＣａＣｌ２／１ｍＭＭＧＣＩ２１０．０５％　Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ　− ４０中で洗浄し、及び１回４００ｍＩ　ＮａＣ１を含有する緩衝液中で洗浄した。このラミニン−５ｅｐｈａｒｏｓｅマトリツクスを次いで２ｍｌカラム中に充填した。タンパク質画分を室温でＩ　ＭＮａＣ１１５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，３で溶出し、直ちに氷上に置き、冷蒸留Ｈ２０に対して透析し、凍結乾燥により濃縮した。

３、シアノーゲンブロマイド消化及びマイクロ配列法精製ラミニンレセプターをシアノーゲンブロマイドでオーゾールス等［０ｚｏｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、、　２５２：５９８６−５９８９　（１９７７））により説明されるように消化し、４００μｍ００．　１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルに溶解し、逆相２５ｃｍＸ４．１ｍｍ　ＰＲＰ　−１カラム（）ｌａｍｌ　Ｉｔｏｎ）上で２００μｌの二つの注入として２ｍ１／分の流速で運転した。シアノーゲンブロマイドー発生断片のアミノ酸配列決定を製造者のプログラムｏ３ＲＰＴＨを用いる付属モデル１２０Ａ　ＰＴＨ−アナライザーを有するモデル４７０Ａ気相タンパク質シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　、）γスターシテー、カリフγルニア州）を用いて行った。

４、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）ＥＬ、ＩＳＡはニングバル（Ｅｎｇｖａｌｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、。

７０：　４１９−４３９　（１９８０））に従って行った。アッセイされた抗体はりオッタ等（Ｌｌｏｔｔａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、。

１５６：　１１７−１２６　（１９８５）　）により説明されたようなヒトラミニンレセプターに対するＩ　ｇ　ｈ、１マウスモノクローナル抗体２Ｈ５（ＬＲ −１）　、ウサギ抗−ヒトアルブミン（Ｍｉｌｅｓ　）及び−アミラーゼに対するＩｇＭマウスモノクロナール抗体（国立歯科研究所＋−ａｔｉＯｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｏｆ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈのＲ，シラガニアンＲ，５ｊｒＲ：ａｎｉａｎから得られた）を包含した。結合抗体はペルオキシダーゼ −複合ウサギ−抗マウスＩｇＭ（キエルヶガード・アンド・ぺり−・ラボラトリーズＫｉｅｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　ＰｅｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州、ガイザースバーグ）或いはペルオキシダーゼ−複合ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｈｅｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて険＝した。

５、ゲル電気泳動タンパク質資料はレムリ（Ｌａｅ＋ｎｍ１ｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｏンヘン）　、２２７：　Ｂε０−６ε５　（１９７０）　）の方法によりジチオスレイトールの存在下においてＮ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。等電果中及二゛二次元Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４− ポリアクリルアミドゲル電気泳動はオフ７レス（０’Ｆａｒｒｅ１１．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５０４００７−４０２１　（１９７５））及びビルス等（Ｗｉｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４６：　４００〜４１３　（１９ε６））により説明されココように行われた。免疫プロッティングはりオッタ等（Ｌｉｏｌｔａ、　ｅｔ　ａｔ、　＜１９８５）　、前掲）によ１り説明されたように抗うミニンレでブタ−モノクローナル抗体を用いて調製量の精製ラミニンレセプターの単離はヒト転移乳癌及び大腸癌及びヒト胎盤組織からの可溶化ミクロゾーム膜含有調製物をラミニン−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂのアフィニティマトリックスにかけ、次いでアフィニティマトリックスの十分な洗浄及び高濃度塩水（１Ｍ　Ｎ２Ｃ１）によるリガンドからのレセプタータンパク質の溶出により達成された。Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（第１Ａ図）により分析すると、乳癌及び大腸癌からの精製タンパク質はより厳密性の少ない条件下で単離されたヒト乳癌ラミニンレセプターについて、先に報告されたように、約みかけＭｒ−６８，０００〜７２．０００を有した。この精製操作の結果藁２０μｇ、／　１００　ｇの腫瘍組織及び２μｇ／１００ｇの胎盤組織のレセプタータンパク質収率が得られたく可溶化ミクロゾーム膜調製物中約０．０２％のタンパク質）。

これらの乳癌、大腸癌及び胎盤からの精製ラミニンレセプター調製物を標準的操作に従ってヨード化し、二次元ゲル電気泳動により分析して調製物の均質性を評価した。代表的な腫瘍ラミニンレでブタ−のオートラジオグラフを第１Ｂ図に示す。ラミニンレセプターのみかけｐｌは６．４＝０．２である。第１Ｂ図は延伸スポットを示すが、異ったｐＨ範囲及び免疫プロッティング（前記Ｌｉ０１ｔａ等（１９８５）らにより説明されるような）におけるその他のゲルは単一ポリペプチド鎖と一致する。

これらの三つの源泉からの精製ラミニンレセプター調製物をマイクロタイターウニル内で固定し、一群の抗体と反応させて更に調製物の純度及びアミニン或いはアルブミンによる汚染の欠乏を示した。全ての場合において、ヒトラミニンレセプターＬＲ−１（２Ｈ５）に対するＩｇｈ１マウスモノクローナル抗体は陽性に反応したのに対し、ウサギ抗−ヒトアルブミン及びα−アミラーゼに向けられたクラス適合１ｇＭマウスモノクローナル抗−は反応しなかった。代表的ＥＬＩＳＡを第２図に示す。

そのままのラミニンレセプター分子を直接に配列法こするための繰返された試みは、おそらくアミノ末端の保護により成功しなかった。従って、レセプタータンパ、７質をシアノーゲンブロマイドで切断し、得られたベブ子トヲ逆相ＨＰＬＣにより分画した。胎盤オリゴベプチさのマイクロ配列分析は、配列Ｍｅｔ−Ｌｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ’ｃをするペプチドを現わした。

同族体に対するコンピユータの助１ｆを借りた探索（ウィルバー及びリップマン、Ｗｊｌｂｅｒ　ａｎｄ　１ｊｐＩＩｌａｎ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、　８０：　７２Ｂ−７３０（１９８３）　）はこ、″″′′オクタペプチド特のものであることを示した。

例　■ ヒトラミニンレセプターｃＤＮＡクローンの単離ヒト調帯静脈内皮細胞の単層培養物をジェイ等（Ｊａｙｅ、　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２８：　８８２−８８５　（１９８５））により説明されるように生育した。

２、ＲＮＡの調製全細胞ＲＮＡをチルギン等（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１８：　５２９４−５２９９　（１９７９）　）により説明さレルグアニジニウムイソチオシアネートーセシウムクロライド密度法により培養物中の細胞層から抽出した。ポリ（Ａ）　−含有ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース（タイプ３、コラボラティブ・リサーチ　Ｃｏｌ　１ａｂｏｒａｔｊｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ）上のクロマトグラフィによりアヴイブ及びレーダー（Ａｖｉｖ　ａｎｄ　Ｌｅｄｅｒ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　６９：１４０ｇ−１４１２（１９７２））の方法に従って単離した。

３、ｃＤＮＡの合成オリゴ（（ＩＴ）　−選択ヒト内皮ＲＮＡをブエル等（Ｂｕｅｌｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｊｏｌ　Ｃｈｅｗ、　２５３：２４７１−２４８２　（１９７８））。

の方法によりｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの合成のための鋳型として用い、２末鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをウィッケンス等（Ｗｉｃｋｅｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５３：　２４ε３−２４９５　＜１９７１１１）　）により説明されるようにして調製した。二のＣＤＮＡをウルリッチ等（Ｌｌｌｌｒｉｃｈ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８：　１３１３−１３１９　（１９７〕））により説明されるようにしてＳ１ヌクレアーゼで平滑末端にし、引続＜Ｅ、コリ　ＤＮＡポリメラーゼ１のフレノウ断片による処理をウォーテル及びレニコフ（Ｗａｒｔｅｌｌ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｎ４ｋｏｆｆ、　Ｇｅｎｅ、　９：　３０９−３１９　（１９εＯ））により説明されるようにして行った。このｃＤＮＡを次いでＥｃｏＲＩメチラーゼで修飾し、ＥｃｏＲＩリンカ−に連結し、及びヒニイン等（Ｈｕｙｎｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＤＮＡＣＩｏｎｊｒ＋ｇ　Ｖｏｌｕｍｅ　１：　ａ　ｐｒａｃｔｊｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、　Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ、、英国オックスフォード４９ −７８頁（１９８５））により説明されるようにしてＥｃｏＲｌで徹底的に消化した。

ＥｃｏＲＩ一連結ｃＤＮＡを上記ヒニイン（Ｈｕｙｎｈ　）（１９８５）により説明されるようにしてＥｃｏＲＩ消化及びホスファターゼ処理λｇｔｌｌに連結した。この組換え相をニンキスト及びスターンバーブ（ＥｎｑｕｉＳｔａｎｄＳｔｅｒｎｂｅｒｇ　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　６８：　２８１ −２Ｈ（１９７９）により説明されるようにしてパッケージし、上記ヒュイン（Ｈｕｙｒ＋ｈ）　（１９８５）により説明されているようにしてＥ、：ｕ）　Ｙ２Ｏ２Ｓ　（ＡＴＣＣ３７１９５）中で増幅シタ。Ｅ、コリ　Ｙ１０９０　（ＡＴＣＣ３／１９）細胞を内皮細胞λｇτ１１　ｃＤＮＡライブラリーで感染させ、抗−ラミニンレセプターモノクローナル抗体２Ｈ５（リオッタ等Ｌｉｏｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、。

１５８：　１１７−１２８　（１９８５）　）を用いてヤング及びデービス（Ｙｏｕｎｇ　ａｎｄ　Ｄａｖｊｓ　％　５ｃｉｅｎｃｅ、２２２：　）７８−７８２　（１９８３））により説明されるようにしてラミニンレセプターβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の抗体認識により１５０万個のプラークをスクリーニングした。この抗体はラミニンレセプターのリガンド結合を認識するか或いは妨害する（上記リオッタ等１ｊｏｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８５））及びトーゴー等Ｔｏｇｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂａｓｅｍｅｎｔ　Ｍｅｌｌｂｒａｎｓ、　Ｓ、　５ｈｊｂａｔａ編、ニニーヨーク州、ニルセヴイア、３２５〜３３３頁（１９８５））。抗体結合は上記例ＩＡ４で説明したように、ペルオキシダーゼ− 複合アフィニティ精製つサギ抗−マウスＩｇＭを用いて検出した。陽性プラークをベントン及びデービス（Ｂｅｎｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９６　：１８０−１８２　）により説明されるようにして同定、増幅及び再スクリーニングして精製した。プラークを含有するフィルターを抗−ヒトα −アミラーゼ及び抗−ヒトアルブミン（上記例１４Ａに説明された通りのもの）並びに抗−ラットラミニン（アルブレクトセン等Ａｌｂｒｅｃｈｔｓｅｎ。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４１：　５０７Ｂ−５０８１（１９８１）　）を包合するコントロール抗体に対して反応させた。

５、サザーンブロットハイプリダイゼーションファージＤＮＡはマニアチス等（Ｍａｎｉａｔｊｓ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｊｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ）１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、：二− ヨーク州、コールドスプリングハーバ−１７７−８５頁（１９８２））により説明されたようにして単離された。制限エンドヌクレアーゼ−消化ＤＮＡをアガロースゲルを通して電気泳動させ、ニトロセルロース紙に移し、及びサザーンの方法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　６８：　１５２−１７８　（１９７９））によりハイブリダイズさせた。３２Ｐ−標忠化ブローブをマニアチス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、７２：　１１８４−１１８８　（１９７５））に説明されるようにしてニックトラスレージジンにより調製した。

ｃＤＮＡインサートをλｇｔｌｌの左腕に結合するＥｃｏＲＩ部位は全ての６個のクローン中に存在しない。

従って、ｐｖｕＩＩ部位１１ｂｐ下流を利用して最大の組換えファージＥＬＲ４からｃＤＮＡインサートを精製した。λＥＬＲ４のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩ［制限断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ部位にサブクローニングしてｐＬＲ４−１を作成し、及びｐＵＣ８のＥｃｏＲ）−ＨｉｎｄＩＩポリリンカ一部位にサグクローニングしてｐＬＲ４−２を作成した。引続き、長いポリ（Ａ）尾部からｃＤＮＡ配列決定を容易にするためにｐＬＲ４−１のＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ制限断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ１部位にサブクローニングしてｐＬＲ４−４を作成した。ｐＢＲ３２２の組換え体をＥ、コリ　ＣＣ６００ｒ　（ＡＴＣＣ３３５２５）中に形質転換し、及びｐＵｃ組換え体をＥ、コリ　Ｊ　Ｍ２Ｏ３中に形質転換した（メツシング等−）ｌｅｓｓｉｎｇ、　ｅｔａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９：　３０９−３２１　Ｓ７ンデル及びヒガ（Ｍａｎｄｅｌ　ａｎｄ　Ｈ４ｇａ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　５３：　１５９−１６２（１９７０））の塩化カルシウム法による）。スーパーコイル化プラスミドＤＮＡをビルンボイン及びドリー（Ｂｊｒｎｂｏｉｎ　ａｎｄ　Ｄｏｔ＞’、λｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　７：　１５１３ −１５２３　（１９７９）　）による方法に従ったニチジウブロマイドーセシウムクロライド中の平衡遠心分離後にフルカリ溶解により回収した。ｃＤＮＡインサートを制限Ｄ　Ｎ　Ａから単離し、アクリロアミドゲルからソーベル等（Ｓｏｂｅｒ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｓｅｊ、、　７５：　５ｇ４Ｂ−５８５０（１９７ε））により説明されるようにして溶出した。

ヒト内皮細胞λｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーを抗−ラミニンレセプターモノクローナル抗体２Ｈ５を用いてスクリーニングした。上記材料及び方法において説明されるように、この抗体は（ａ）免疫プロット上のラミニンレセプターを特異的に認識し、（ｂ）　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａｔ：より精製ラミニンレセプターを認識しく第２図）、（Ｃ）血漿膜或いは細胞のいづれかへのラミニンの結合を妨害し、及び（ｄ）　′ａ胞の羊膜基底膜への結合を阻害する。

これらの性質は明らかに、二のモノクローナル抗体がラミニンレセプターのラミニン結合領域を認識するか或いは妨害することを示す。６個のプラークを先ず選択した。

プラーク精製後、λＥＬＲＩ−６と命名された全ての６個のファージは抗−ラミニンレセプターモノクローナル抗体と激しい反応を示したが、しかし、ヒトα− アミラーゼに向けられたクラス適合（Ｉｇｋｉ）モノクローナル抗体或いはラミニンに対して向けられた或いはアルブミンなどのラミニンレセプターと大きさの同様なタンパク質に向けられた抗体のいずれにも何等の反応性も示さなかった（第３図）。

２、λＥＬＲＩ〜６の共通領域６個のファージ、λＥＬＲＩ〜６の制限エンドヌクレアーゼ消化はｃＤＮＡインサートの３′末端をλｇｔ１１の左腕に結合するＥｃｏＲＩ部位は全ての６個のファージにはないことを示した。Ｓａｃ　Ｉ％Ｋｐｌ、Ｈｉｎｄｍ及びＥｃｏＲＩを用いる単一、二重及び三重エンドヌクレアーゼ消化を行って、λＥＬＲユ〜６のマツピングを行った。第４図にまとめて示されるこれらの実験は、（ａ）ｃＤＮＡインサートの大きさは約４５０〜９７５ｂｐの範囲であり、（ｂ）全てのクローンはクローンの３′末端から約４５０〜５００ｂｐの内部Ｓａｃ　１部位を共有し、（ｃ）λＥＬＲ６のインサートは内部５ａｃ１部位に僅かに約２０ｂｐ５’延びるにすぎず、及び（ｄ）λＥＬＲＩ及びλＥＬＲ４のインサートは５ ’ＥｃｏＲＪ部位からそれぞれ約３０及び４０ｂｐのＨｉｎｄｍ部位を共有することを示した。これらの６個の組換えファージはこのようにＳａｃ　１部位への丁度５′から各ｃＤＮＡインサートの３′末端までに延圧する共通の４５０〜５００ｂｐ領域を有し、この領域がモノクローナル抗体２Ｈ５により認識される領域をコード化することを示唆する。この観察は６個の組換えファージの各々からＤ　Ｎ　ＡのＫｐｎｌ−ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ−５ａｃｌ二重消化物がλＥＬＲ４から単離されたＰｓｔｌ−８ｐｈｌ制限断片にストリンジエントにハイブリダイズされたサザーンプロット実験により試験された。第４図に示される代表的ハイブリダイゼーション実験は全ての６個の組換えファージの共通４５０〜５００ｂｐ領域がモノクローナル抗体２Ｈ５により認識される抗原領域をコード化することを示す。

例　■ ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列決定 λＥＬＲ４からのｃＤＮＡは第５図に示される術策に従って配列決定された。ギルバート及びマクサム（Ｇｉｌｂｅｒｔ　ａｎｄ　Ｍａｘａｍ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、　７０：３５８１−３５８４　（１９７３））の両方の化学的修正方法が用いられた。前者の場合において、上記例ＵＡ６に説明されるサブクローンｐＬＲ４−１、ｐＬＲ４−２及びｐＬＲ４−４のｃＤＮＡ制限断片は５′末端を、上記ギルバート及びマクサム（１９７Ｂ）により説明されるようにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｃ　）及び（γ−Ｐ”２）ＡＴＰにより処理するか、或いは３′テーリイングキツト（／ｍｅｒｓｈａｍ）を用いて（α−Ｐ３２）ジデオキシＡＴＰで３′末端をテーリングすることにより標識化した。ジデオキシ合成法の場合には、ＥＬＲ４のＥｃｏＲＩ−Ｓｚｃｌ制限断片をＦ１４１３　ｍ　ｐ　１８及びＭ１３ｍｐ１９中にサブクローン化した（ヤニッシニーベラン等Ｙａｎｉｓｃｈ− Ｐｅｒｒａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　３３：　１０３−１１９λＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートの配列はλｇｔｌｌベクターの右腕のＥｃｏＲＩ挿入部位と一致する２５３個のアミノ酸開放読取り枠を示す。２Ｈ５エピトープ（上記例ｌｌＢ２参照）により認識される「共通領域」の配列は第６図のヌクレオチド３６１からヌクレオチド７６５まで延びる。それは上記例１ｂ２に説明される胎盤ラミニンレセプターの精製シアノーゲンブロマイド・発生オリゴペプチドのそれと同一のオクタペプチドコード化配列（ヌクレオチド４０９〜４３２）を包合する。

この配列内にはラミニンレセプターのカルボキシ末端に向かう３個のアミノ酸により分離された６個のアミノ酸繰返しがみられる。このアミノ酸繰返しをコード化するｃＤＮＡ配列は同一ではない（ヌクレオチド６７０〜６８７及び６９７− ７１４）。オーカー停止コドンに引続き、λＥＬＲ４ｃＤＮＡインサートは長いポリ（Ａ）伸長から上流の標準的なポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡ　１７ｂｐを含む６６ｂｐの３′未翻訳領域を含む。３′未翻訳領域及びポリ（Ａ）尾部の長さを差し引いた後、λＥＬＲ１〜６の共通ｃＤＮＡ領域により規定されるような２Ｈ５エピトープの最大の可能性のある程度は３９３ｂｐ即１３１個のアミノ酸まで狭められうる。ウィルパン及びリップマン（Ｗｉｒｂｕｎ　ａｎｄ　Ｌｊｐｍａｎ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ、、　８０：　７２Ｂ−７３０（１９８ｇ））の方法によるコンビ二−タ分析は公知のタンパク質配列への有意な同族性を示さない。

ラミニンレセプターの潜在的膜張渡し領域は第６図の５２〜８４のヌクレオチドによりコード化される１１個のアミノ酸疎水性ポリペプチドを含み得ることが認められる。

例　■ ｃＤＮＡ−由来合成ラミニンレセプターペプチドの抗体認識ラミニンレセプターはヒト転移乳癌から上記例ＩＡＩと同様にして精製した。２０μｇの精製ラミニンレセプターを上記例ＩＡ５と同様にしてＮ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４−ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動し、ゲルから切出した。ウサギをアルブレツクセン等（Ａｌｂｒｅｃｋｔｓｅｎ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４１：　５０７６−５０８１　（１９８１））により説明されるようにしてタンパク質で免疫化した。血清を抗原注射開始前（前免疫血清）及び各ブースター注射後１０日月に集めた。

２、ＩＬＩＳＡＩＬＩＳＡは上記例■ＡＩで説明したようにして得られた前免疫及び免疫血清を用いて、上記例１−ｑ４と同様配列：Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ− Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ− Ｔｈｒ−Ａｌａを含有するＲＴＬＲ２と命名される合成ペプチドは周知の標準的方法に従ってベニンスラ・ラボラトリーズ社（Ｐｅｎｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、カリフォルニア州ベルモント）により提供された。この配列は第６図におけるヌクレオチド６６７−７２６から選ばれた。

λＥＬＲ４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列６６７−７２６（第６図）を用いてペプチド配列を予測した。合成ペプチドＲＴＬＲ２（例ＩＶＡ３）は腫瘍ラミニンレセプターに対して向けられたウサギ抗血清によるＥＬＩＳＡにおいては認識されたが、しかし前免疫血清によっては認識されなかった（第７図）。このペプチドは例ｍＢ２において説明された二つの６個のアミノ酸繰返しを含み、予測された反転立体配置を有する。

例　ＶラミニンレセプターｃＤＮＡのＲＮＡへのＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞系（親）はミシガン癌財団（Ｍｉｃｈｉｇａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）により提供された。二つのクローン化ＭＣＦ−７細胞系ＭＣＦ７−５Ｈ＆及びｈｉｃＦ７−３Ｅ５はＰ、ホランハンド（Ｐ、　Ｈｏｒａｎ　Ｈａｎｄ　。

ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　）から得られ、グライナー等（Ｇｒｅｉｎｅｒ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　３６：　１５９−１６６（１９８５））により説明されている。ＺＲ−７５ヒト乳癌系はエンゲル及びヤング（Ｅｎｇｅｌ　ａｎｃｌ　Ｙｏｕｎｇ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、。

３８：　４３２７−４３３９　（１９７１１１））により説明され、Ｌ、エンゲル（Ｌ、　Ｅｎｇｅｌ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　）から得られ、及びヒト腎癌系Ａ−７０４はＳ、アーロンソン（Ｓ。

Ａａｒｏｎｓｏｎ、　Ｎａｔｊｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　１ｎｓｔｉｔｕｔｅ　）から得られ、ギャード等（Ｇｉａｒｄ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　１ｎｓｔ、。

５１：　１４１７−１４２３　（１９７３））により説明されている。ヒトＰ　ａ　ｎ　ｃ　−１細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャー０コレクシヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から得られた。ネズミＮＩＨ−３Ｔ３細胞及びそのキルステン（Ｋｉｒｓｔｅｎ）ウィルス−形質転換誘導体（ＫＮ　Ｉ　Ｈ）は、Ｍ、ゴッテスマン（Ｌ　Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、　Ｎａｔｊｏｎａｌ　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｌｔｕｔｅ　）から得られ、それらの生育はゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｌｌａｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ、、　７５：２７６５７−２７７１（１９７ｇ））により説明されている。ネズミＦ９奇形癌細胞及びそれらのシフチリル環状Ａ　ＭＰプラスレチン酸分化誘導体（ストリックランド等５ｔｒｉｅｋｌａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｃｅ１ｌ。

２１：　３４７〜３５５　（１９ε０））は、Ｗ、アンダーソン（警。

Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　）から得られた。

ラットＬ２細胞系はユーワー（Ｗｅｗｅｒ、　Ｄｅｖ、　Ｂ４ｏ１．、９３：４１Ｂ−４２１（１９ｇ２））により説明されている。

２．ＲＮＡの調製ＲＮＡは上記例ｌｌＡ２と同様にして細胞培養物から或いはストロ−マン等（Ｓｔｒｏｔ＋ｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１．　ＩＤ：２６５−２７３　（１９７７）　’Ｉにより説明されているグアニジン−塩酸塩法により調製された。

３、ノーザンハイブリダイゼーション５μｇの全細胞ＲＮＡをメチル水銀／アガロースゲル上で分離し、ソーベル等（Ｓｏｂｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｊｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

２０＋　２６７８−２６８４　（１９８１））により説明されているアルウィン等（Ａｌｗｉｎｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　７４：５３５０−５３５４　（１９７７））の方法によりジアゾベンジルオキシメチルセルロース紙（シニライヒヤー及びシニーエル５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）に移した。フィルターを上記例ｎＡ５と同様にしてニックトランスレーションされたｃＤＮＡインサートにハイブリダイズした。ラジオオートグラフの各種時間曝露を濃度測定法により測定して線形応答範囲をめた。プロットをアクチンｃＤＮＡプローブ（クリーブランド等Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１ｌ、　２０：９５−１０５　（１９εＯ）により説明された）を用いて、及び熱衝撃ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブ（ヒラケイ等）１ｊｃｋｅｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ。

４３：　１４７−１５４　（１９８６）により説明された）を用いて逆スクリーニングして等量のＲＮＡが移されたことを確認した。

４、ラミニン結合アッセイ各細胞系の細胞当りのラミニンレセプターの数をリオッタ等（Ｌｉｏｔｔａ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＸＩ）、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、　１５８：　１１７−１２６０９８５））により説明されたように対数生育期細胞に対する特異的結合（１２５１）　−標識化ラミニンの５ｃａｔｃｈａｒｄプロツトから計算した。

ラミニンレセプターの量及び表面分布は各種癌性ヒト組織において異ることが従来報告された（ホランハンド等Ｈｏｒａｎ　Ｈａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４５：　２７１３−２７１９（１９８５））。一般的に、悪性組織はそれらの細胞表面上により多くの未占有ラミニンレセプターを有し、それらのより良性の対照物よりもより多くのラミニンに結合する。

ラミニンレセプターｍ　ＲＮ　Ａレベルがリガンド結合に利用可能な細胞表面ラミニンレセプターの量の決定に役割を果たすか否かを決定するためにノーザンプロット実験が行われた（第８図）。ラミニンレセプターｃ　Ｄ　Ｎ　Ａインサートは推定された大きさのラミニンレセプターを有するタンパク質を＝−ド化するのに十分な長さの約１７００ベースのｍ　ＲＮ　Ａを彫工する。各種ヒト表皮細胞系からのハイブリダイズされたＲＮＡのレベルは異った。特に、転移乳癌細胞系ｋｉｃＦ−７からのＲＮＡに対しては、非転移乳癌細胞系ＺＲ−７５からのＲＮＡに対するよりも大きなハイブリダイゼーションがあった。一般的にハイブリダイズしたＲＮＡのレベルは直接ラミニン結合アッセイと相関関係があり（第９図）、レセプターの生合成に利用可能なラミニンレセプターｍＲＮＡの量はラミニン基底膜への細胞結合の調節における律速制御工程であることを示唆する。よって、ヒト腫瘍組織におけるラミニンレセプターｍＲＮＡレベルの決定を診断的に用いてラミニンレでブタ−含量に基づき腫瘍の相対的攻撃性或いは治療処決に対する感受性を予測することができる。上記の如く、これは、ラミニンレセプターｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをプローブとして用いる切断された腫瘍物質のノーサンプロットハイブリダイゼーション或いは１ｎＳｉｔυハイブリダイゼーシヨンにより達成することができる。ラミニンレセプターｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは周知の次の標準的技術に従う各種手段により上記操作のためのプローブとして調製される。例ＩＩ　、４．５において説明したニックトランスレーション操作を用いて（Ｐ）、（３５Ｓ）、或いは（３Ｈ）のいずれかでｃ　Ｄ　Ｎ　Ａインサートを放射線彫工することかできる。或いは又、ラミニンレセプター　ＣＤ　Ｎ　Ａインサートをプラスミドにサブクローン化してメルトン等（河ｅｌｔｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２ニア０３５−７０５６　（１９ｇ４））により説明される方法により放射線認ｍ　ＲＮ　Ａの転写を行うことが可能である。発色検出計を組合わされたビオチニル化ＲＮＡ及びＤＮＡハイブリダイゼーションプローブも又例えばランガー等（Ｌａｎｇｅｒ。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　７８：６６３３−６６３７　（１９８１））及びレアリー等（Ｌｅａｒｙ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｊ、ε０：　４０４５−４０４９　（１９Ｓ３）　）により説明されている。

ラット上２細胞及びＮＩＨ３Ｔ３及びＦ９奇形癌などのネズミ細胞からのＲＮ　Ａ及びそれらの誘導体を含有するノーザンプロットも又約１７００塩基のｍ　ＲＮ　Ａを検出した。このように、ヒトラミニンレセプターｃＤＮＡインサートは他のを椎動物種からのＲＮＡに交差ハイブリダイズすることかできる（データは示さず）。

例　■ ラミニンレセプターの多形性例ｎ　Ａ　４において説明したヒト内皮細胞λｇｔｌｌｃＤＮＡライブリーを用いてＥ、コリ　Ｙ１０８８細胞（ＡＴＣＣ３７１９５）を感染させ、ベントン及びデービス（Ｂｅｎｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９６：　１ε０−１８２（１９７７））のプラークハイブリダイゼーション操作によりλＥＬＲ４からの３２Ｐ−標識化ｃＤＮＡインサートを用いてスクリーニングした。陽性プラークを上記ペントン及びデービスに説明されるように、同定及び増幅及び再スクリーニングして生成した。

２、ＤＮＡ配列決定陽性ファージのｃＤＮＡインサートを例ＩＩＡ６と同様にしてｐＵＣベクターのＥｃｏＲ１部位中にサブクローン化し、ｃＤＮＡ配列をギルバート及びマクサム（Ｇｉｌｂｅｒｔ　ａｎｄ　Ｍａｘａｍ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　７０：３５８１−３５８４　（１９７３））の方法により決定した。

３、ヒトゲノムＤＮＡの単離ゲノムＤＮＡをプリン等（Ｂｌｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、＋　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　３：　２３０３−２３０８　（１９７Ｂ）　）により説明されるようにしてドデシル硫酸ナトリウム及びブロティナーゼＫによるおだやかな消化により上記例ＶＡＩにおいて説明されたヒト細胞系から単離した。

４、サザーンハイプリダイゼーション上記細胞系並びにヒト肝臓（Ｎ１．ヤング　Ｍ、　Ｙｏｕｎｇ。

Ｎａａｔｊｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｒ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈから取得）からのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｔｍ、Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ１或いはＸｂａｌで徹底的に消化し、アガロースゲル上で電気泳動させニトロセルロース上に移し、上記例ＩＩ　Ａ５と同様にλＥＬＲ４ｃＤＮＡにハイブリダイズさせた。

Ｂ、結　果部分的ｃＤＮＡ配列を組換えファージλＥＬＲＩＯ１λＥＬＲ１４、λＥＬＲ１０６、λＥＬＲ１１２に対して決定した。５’ＥｃｏＲｉ部位からλＥＬＲ１４の内部Ｓａｃ　Ｉ部位までの配列は第６図のヌクレオチド７−３８１に完全に対応し、λＥＬＲ４からの上流の９６個の追加の塩基を含む。他の分析されたクローンはλＥＬＲ４配列に対する高い同族性を示すが、しかし、多数の点突然変異を含有する。他のクローンのそれぞれに対しては開放翻訳読取り枠はなく、それらが擬ラミニンレセプター遺伝子のｃＤＮＡであることを示唆する。

２、ゲノムＤ　Ｎ　Ａ分析ヒト肝臓及び各種ヒト細胞系からの高分子量ゲノムＤＮＡのサザーンプロット分析は多数のハイブリダイズ化ＤＮＡバンドを示す。これはヒトゲノム中にその全てが交差ハイブリダイズする多数のラミニンレセプター遺伝子があることを示唆する。加えて、各々独特のＤ　Ｎ　Ａを含有する多数のプラークか部分的にＡｌｕｌ／Ｈａｅ■で消化されたヒトゲノムＤＮＡのλシャロン４Ａライブラリー（Ｔ、　マ＝アチス、Ｔ、　Ｍａｎｊａｔｊｓ　、　バーバード大学から取得）から上記プラークハイブリダイゼーション法により単離された。これらの知見は多数の交差ハイブリダイズ化ラミニンレセプター遺伝子が同一でないことを示唆する。一つの可能性はヒトゲノムが一つの活性ラミニンレセプター遺伝子及び数個の擬遺伝子を含有することである。擬遺伝子から転写されたｍＲＮＡは細胞質に到達するのに十分安定であり、又、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで転写されてｃＤＮＡを作り、及びそれらの対応するｃ　ＤＮＡはλＥＬＲＩ〜６などの真正ラミニンレセプターｃ　Ｄ　Ｎ　Ａと交差ハイブリダイズし、ノーザンプロットにおける代替的ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。しかしながら、擬遺伝子の５′末端における多数の翻訳停止コドンにより、ラミニンレセプタータンパク質はそれから合成されない。全ての単離ラミニンレセプターｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（開放読取り枠中）か真正のラミニンレセプターｃＤＮＡとしての資格を有するためにはλＥＬＲ４ｃＤＮＡ配列により予測されるアミノ酸をコード化する必要がある。

例　■ 合成ラミニンレセプターペプチド類合成ペプチドＲＴＬＲ２−２０は第６図のヌクレオチド６６７−７２６から得られ、上記系ＩＶＡ３において説明されている。第一のプロリンが欠失し、スレオニン及びグルタメート残基がそれぞれリジン及びロイシンにより置換されているコントロールペプチドはＲＴＬＲ２−コントロールと命名される。合成ペプチドＲＴＬＲ３は配列Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｉ　ｓ−３ｅｒ−Ｖａｌ −Ｇｌｙ−５−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ｔ−Ｌｅｕ−−Ａｌｇ−−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ａｒｇを含有し、第６図におけるヌクレオチド３７Ｂ−４３２から得られた。予測された逆転を含まないコントロールペプチドも又合成された。コントロールペプチドＲＴＣ１は配列Ｓｅ　ｒ−５ｅ　ｒ− Ｇｌｎ　−Ａｓｎ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−５ｅｒ −Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　−Ｌ３７Ｓ−−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ− ３ｅｒ−Ｇｌｙを含有する。コントロールペプチドＲＴＣ２は配列Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを含有する。コントロールペプチドＲＴＣ３は配列Ｌｅｕ−Ｍｅ　ｔ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ −Ｌｅｕ−−Ａｌａ−Ａｒｇを含有する（第６図のヌクレオチド３９７〜４２０から得られる）。全ての合成ペプチド類は例Ｉ　Ａ　３と同様にして逆相ＨＰＬＣにおいて精製され、周知の標準的方法に従ってベニンシニラ・ラボラトリーズ社（Ｐｅｎｎｊｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、。

カリフォルニア州、ベルモント）より提供された。

勿論、本発明のクローンを用いて周知の標準的技術に従ってペプチドを合成すすることができる。λＥＬＲＩ〜６クローンはそれらのハイブリッドβ−ガラクトシダ−ゼラミニンレセブターベブチド類を発現する能力により選ばれた。このｃＤＮＡインサート或いはその断片は例えばマニアティス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒＬｏｂｏｒａｔｏｒｙ、ニニーヨーク州、コールドスプリングハーバ−１４０４〜４３０頁（１９８２））により総括されているように、その他のベクターにサブクローン化して他の融合タンパク質或いは非融合タンパク質を製造することができる。

２、結合アッセイＧ、トダｏ　（Ｇ、　Ｔｏｄａｒｏ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ１ｔｕｔｅ）により供給されるＡ２０５８ヒトメラノーマ細胞の、合成ラミニンレセプターレセプターペプチドの存在下での、ラミニンに特異的に結合する能力を例ＩＶＡ４と同様にして試験した。

合成ペプチドＲＴＬＲ２及びＲＴＬＲ３並びにコントロールペプチドをブラウン等（Ｂｒｏｗｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｊｏ−ｃｈｅｍｊｓｔｒｙ、　１８：４９０１〜４９０Ｂ　（１９７９）　）によるｐ−ニトロフェニルエステルガラスピーズを用いて、インキユベーションにより固体支持体に結合した。このビーズはＡ。

ディ（Ａ、　Ｄａｙ、　Ｍｅｄｉｃａｌ　ＣｏＣｏ１１ｅ　ｏｆＶｉｒｇｉｎｅａ　）から得られた。ペプチドを次いでｃ　Ｉ　１２５　）ラミニンとインキユベートし、結合＜　１１２５　＞ラミニンの量をめた。

３、転移アッセイ転移ＢＬ６ネズミメラノーマ細胞は１．ハート博士（Ｄｒ、１．　Ｈａｒｔ、　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ、メリーランド州、フレデリック）から得た。新たにトリプシン化した細胞を各種濃度の合成ペプチドＲＴＬＲ２（前記）と混合し、約５Ｘ１０’個の細胞をリオッタ等（Ｌｉｏｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８４：　６８２−６８８　（１９８０）の方法によりヌードマウス当り０．　１の容量で静脈内（ｊ、ν 、）注射した。マウスは各群１０匹であった。動物を３１ノ２週において殺し、転移の数をめた。同様な疎水性変化のＲＴＣＩなどのコントロール合成ペプチドは転移の数に何等の影響を及ぼさなかった。

合成ペプチド類をｃＤＮＡ配列に基づいて製造しく第６図）、ラミニンレセプター−リガンド結合機構を研究するために用いた。合成ペプチドＲＴＬＲ２の存在はヒ）Ａ２０５８メラノーマ細胞のラミニンに結合する能力を抑制したが、そのコントロール対照物（ＲＴＬＲ２−コントロール）は抑制しなかった（第１０図）。これはそのリガンドに対するレセプターの少なくとも一つの結合領域がＲＴＬＲ２配列内に含有されていることを示唆する。更に、各種合成ペプチドを（１１２５）のラミニンとインキユベートし、結合することのできる標識化リガンドの量を測定したところ、ＲＴＬＲ２−ペプチドはＲＴＬＲ３或いは３個のその他のコントロールペプチドよりもより多い結合活性を有した（第１１図）。そのような研究はｃＤＮＡ−由来ラミニンレセプターペプチドを用いて各種生物学的機能に含まれるラミニンレセプタｃＤＮＡ配列から発生した合成ペプチド類を用いて癌転移を抑制することができる。ＢＬ６メラノーマ細胞からの転移の数は合成ＲＴＬ２断片を細胞と共にマウス中に共注射した際に減少した（表１）。如何なる理論にも拘束されるものではないが、合成ラミニンレセプター断片は転移のコロニー化を防止するものと想定される。そのような結果は、ｃＤＮＡ発生合成ラミニンレセプター断片が癌治療における転移の抑制に有用であることを示唆する。

表１　合成ラミニンレセプターのＢＬ６メラノーマ転移を抑制する能力注射ペプチド量　平均転移数０　４１．３±１０．９０．０１μｇ　３１．０±１４．４０．１　μｇ　３１．８±１４．０１、０　μｇ　２９．４土１０．８１０．０μｇ　７．９±　６．７　（Ｍａｎｎ−５Ｘ１０’のＢＬ６メラノーマ細胞を各種濃度の合成ラミニンレセプターＲＴＬＲ２と混合し、各ヌードマウス（群当り１０匹）に０．１ｍｌの容量で静脈内注射した。

動物を３１ノ２週間後に殺し、肺における転移の数をめた。

ここに説明した具体例及び実施態様は例示を目的とするのみであり、それに照した各種修正酸いは変化が当業者に示唆され、本願の精神及び趣旨及び冒頭に掲げた特許請求の範囲に含まれるべきことが了解される。

仄４１隼！八干唱　秦ヌ丁ダ久んＥＬＲ６グｙ−２を二）アＴ’：）ｆ：汐Ｄ−７４７？′Ｌ４発２Ｈ５−符」王Ｆ　Ｉ　Ｇ、　３−１ＦＩＧ、３−２ＦＩＧ、　４＋２３４５６！に　呵　ＯＴ　−−偽τ　−論　人π　ｍ　偽τＦＩＧ、　６−１ＦＩＧ、８ＦＩＧ、　ｇ。

ｈａｔへめ〉ミニ２９合の江ｒ繁り０　２０　４０　６０　８０　＊００　４２０へ１７゛テｌ゛フじぺｆｐ−ｕｇ ’ｍ１ＦＩＧ、１ｇ２Ｓ二Ｊでンンート百４しぐ１５阪ＦｒＣｌ　Ｒ″ｒＣ２ＲＴＣ３ＲＴＬＲ２ＲＴＬＲ３沿厖公７′７Ｆ−２２λ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、特許出願の表示ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０２４１１、発明の名称ラミニンレセプターをコード化する組換えＤＮＡクローン３、特許出願人住　所　アメリカｈＲ国バージニア州、スプリングフィールド、４、代　理　人（郵便番号１００）東京都千代田区丸の内三丁目２番３号５、　補正書の提出年月日１９８８年１０月１９日６、　添付書類の目録（１）　補正書の翻訳文　１　通請求の範囲１、　下記ヌクレオチド配列を有するラミニンの細胞表面レセプターをコード化する組換えｃＤＮＡクローンを含んでなることを特徴とするクローン：ＣＴ　ＣＡＴ　ＧＧＣＪＬＴＣ：ム：Ａｒｃ　Ｊ’Ａ　）Ｊ：　ＣＴＣＡＡＧ　ＡＣＧ　ＡＣＣＴＣＩ：　ＧＡ（：　ＡＡＧＣＴＴ　Ｃ’：に　ＣＴＧ　ＧＩ：ｊ　（Ｊ、−α；’Ｔ　ＧＣＡ　ＡＴｒ　ｃｉゴＧＣＣＡＴＴＧＡＡ　ＡＡＣα７ＧＣＴＣＡ：σ’：Ｃ人（７にＴτＡ：λτＣＣｒＣＣＡＧＧ　ＡＡτ　ＡＣＴ　Ｇ（、ＣＣＡＧ　人ｃｓｃｃτ　ＧＴＣＣ：ＣＡＡに　ＴＴＴ　ＧＣＴ　ＣＣＴＧＣＣ人ＣτにＧＡ　ＧＣＣＡＣＴ　ＣＣＡ　ＡＴＴＧＣＴ　ににＣＣＧＣ＝ＣＡＣＴ　ＣＣＴ　（：ＣＡ　Ａｃｅ　ＴｒＣＡＣＴ　Ａ）、ＣＣ−”−Ｃｆｉ−ＴＣＣＪ−Ｇ　ＧＣＡ　ＧＣＣττｃ　ｃｃｃＡＡＧ　ＣＣＡ　（ＧＣＣ７ｘＣＴＴ　ＧＴＧ　の７ＡＣ？　にＡＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴ　ＩａＣ（Ａ（ＣＡにＣＣＴ　ＣＴＣＡＣＧ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＴＣＴ　Ｔ１．Ｔ　Ｃ；Ｔ’ｒ　ＡＡＣＣＴＡ　ＣＣＴ　ＡＣＣＩ−＝＝　ＧＣに　Ｃ０ＧＴＧ？　ＡＡＣＡＣＡ　ＣＡ−７ＴＣ：　Ｃ１：Ｔ　Ｃ：に　ＣＧＣＴｋＴ　ＣＴＧ　ＧＡＣＡ＝ｉ　ＧＣ’：、Ｊ−ｒｃ　ＣＣＡτＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧ　ＧＧＡ　ＣＣＴ　ＣＡＣτｃｈｃ τＣＣＣＴ　τ］ＧＡτＣτＧＣ丁ＣＣＡτＧ（ＴＧ　ＧＣ’：　ＣＧ；　ＧＡＡ　Ｃ７：　ＣＴに　ＣＣＣＡＴＣＣ１１ｌ；Ｔ　ＧＧＣＡＣＣＡＴＴ　ＴＣＣＣＣＴ　ＧＡＡＣＡＣＣＣＡ　ＴＧＣ−にＡＧ　ＧＴＣＡＴＣＣｃＴ　ＣＡＴ　ＣＴに　ＴＡＣＡＬＣＴＡＣＡＣＡ　にＡτ　ＣＣＴＧＡＡ　ｃＡｃ　Ａｒｒ　Ｇ）Ｊ−ＡＡＡ　ＧＡＡ　Ｇ届ＣＡＩ：　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣＡＡＧ　ＧＣＡ　ＧＴＧＡＣＣＡＡＣＧＡＣＧＡＡ　ＴＴＴ　ＣＡＧ　Ｇ−’Ｔ　ＧｋＡ　ＴＧＣ；　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＣＧＣＴ　ＣＣＴ　Ｃ７ＣＴＴ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　σＴＴ　ＧＣＡ　にＡＣ’ＴＧＧ　ＴＣｒ　ＣＡＡ　ＣＣＴ　ＣＴＡＣＡＧ　Ｃ７°Ｇ　ＣＣＣＴＣＴ　ＧＴに　ＣＣＴ　Ａ：Ｔ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　Ｔ’ｒｃ　ＣＣＴ　ＡＣＴ　にＡＡ　ＧＡＣ τＣＣＡＧＣＣＣ′：　ｃＡｃ　ＣＣＴ　ＧＣＣＡＣＧ　にＡＡ　（ＡＣＴＣｉ：　ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＧＣ）　ＣＣＣＡＣＴ　ＣＣＴＣＡに　ＣＣＣＡＣＴ　ＧＡＡ　ＴＧＣＣＴａ　ＧＣＡ　ｃＣＡＡＣＣＡＣＴ　ＧＡＣＴＣに　τロτＡ人Ｇ−Ｃ７：　’：’：’：　（：ＣＡ　”ｊ＋　Ｃ＋τａ＝ｊ＆Ｆ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＧＩＧＡ　、％Ｑ　ｉτ１；　ｉ　ＧＩＴ　ＧＧＡ人人人＝人Ａ人ｃ人τ ０人σ７ττＣτ。

２、　寄託物ＡＴＣＣ６７１９９の細胞であるラミニンの細胞表面レセプターをコード化する組換えｃＤＮＡクローンを含んでなることを特徴とするクローン。

３、　下記配列よりなる請求項１のヌクレオチド配列から得られる合成ペプチド：ａｒｇ　ＪＬ＄Ｐ　ｇａｙ　Ｌｉｅ　ｔｙｌ：Ｌｉｔ　ｉｃｅ’　ｈｓｒｓ　ｌｅｕ　ｌｙｅ　ａｒｇ　ｔｈｒ　ｔｑ　ｇｌｕ　）ｙｓｌｅｕ　ｌｅｕ　、ｌｅｕ　ＪＬＬＪＬ　ＪＬＩＪＩ　４：ｇ　ＪＬＩＪＬ　ｉｌｅ　ＹＪＬｌ　ａｉｍ　Ｌｉｅ　ｇｌｕ　ａｓｎ　ｐｒｏ@ａｉｍａｓｐ　Ｗｉｎ　ｓｅ：　ｖａｌ、ｉｌｅ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　ｅｒｇ　ａｓｎ　：ｈｒ　ｇｌｙ　ｇｉｎ　ａｒｇ　ＪＬＩＪ　ＶＪＬｌｌｙｓ　ｐ：ｏ　ａｒｇ　ｌｅｕ　ｌｅｕ　ｖａｌ　ｖｔＬ　ｃｈｒ　ａｓｐ　ｐｒｏ　ａｒｇ　ｔｈｒ　ａｓｐ　ｈｉｓ　ｇｉｎｐｒｏ　工ｅｕ　ｃｈｒ　ｇｌｕ　ａｈａ　ｈｅｒ　ｔｙｒ　ｖａｎ　ｍａｎ　ｌｅｕ　ｐｒｏ　ｃｈｒ　ｉｔ　１工ＪＬ　１ｅｕｅｙｓ　ｈｓｒｓ　ｃｈｒ　ａｓｐ　ｓｅｒ　ｐｒｏ　１ｗ　ａ：ｇ　ｔｙｒｖａｌ　ａｓｐ　Ｌｉｅ　ａｌａ　ｉｌｅ　ｐｒ。

ｅｙｓ　ａｓｎ　ａｓｎ　ｌｙｓ　ｇｌｙ　ＪＬＩＪＬ　ｈｉｓ　ｓξτ　マｍｌ　ｇｌｙ　ｌｅｕ　ｎｅｔ　ｔｑ　ｔｒｐ　＋ｎｅｃＬｅ＊　ＪＬＬＪＬ　ｉｒｇ　ｇＬｕ　ｖｄ　ｌｅｕ　ａｒｇ　ｓｅｔ　ａ：ｇ　ｇａｙ　ｔｂｒ　Ｈｅ　ｓｅｒ　ａｒｇ　ｇｌｕｈ１客　ｐ：ｏ　ｔｒｐ　ｇｌｕ　ｖａｌ　ｅｅｌ：　ｐｒｏ　ａｓｐ　ｌｅｕ　ｔｙ：　ｐｈｅ　ｔｙ：　ａ：ｇ　Ｌｉｐ　ｐｒ。

ｐｈｔ　ｔｈｒ　ａｌａ　ｔｂｒ　９ａ　ｐｒｏ　ｇｌｕ　ｖａｌ　ａｕ　ａｓｐ　ｔｑ　ｓｅ：　ｇｌｕ　ｇａｙ　ｖａｌｇｉｎ　ｖｉＬ　ｐｒｏ　ｓｅｔ　Ｖｌｌｌ　ｐｒｏ　ｕｅ　ｇｉｎ　ｇｉｎ　ｐｈｅ　ｐｒｏ　ｔｈ：　ｇｉｕ　ａｓｐ　ｔ＝ｐｓｅｒ　ａｈａ　ｇｌｕ　ｐｒｏ　ａｌａ　ｃｈｒ　３１ｕ　ａｓｐ　ｔｒｐ　ｓｔ：　直上１　直重ｈ　ｐｒｏ　ｔｈｒ　ａｌａｇｉｎ　ｉｉａ　ｃｈｒ　ｇＬｕ　ｔｒｐ　ｖａｌ　ｇｌｙ　＊Ｌｈ　ｃｂｒ　ｔｂｒ　ａｓｐ　ｔｒｐ　５ｅｒ−４、次のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする合成ペプチド：Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ− Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｈａ−Ｐｒｏ　 −Ｔｈ　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ。

５、次のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする合成ペプチド：Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａ　１−Ｌ　ｅ　ｕ　−Ａ　ｒ　ｇ　。

６、　次のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする合成ペプチド：Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌｇ−−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａ　１　ａ　Ｉ　１　ｅ　Ｖ　ａ　ｌ　−Ａ　１　ａ　−Ｉ　ｌ　ｅ　。

７、ラミニンレセプターｍＲＮＡにハイブリダイズする能力を有する請求項１のクローンから得られるプローブ。

８、ラミニンレセプター遺伝子にハイブリダイズする能力を有する請求項１のクローンから得られるプローブ。

９、　癌の攻撃性或いは癌細胞治療剤の有効性を診断する方法であって、該癌細胞を有する疑いをもたれた組織の試料を請求項７のプローブと反応させ、それらの間のハイブリダイゼーションの程度を決定し、及びハイブリダイゼーションの程度を標準と比較することを特徴とする方法。

１０、癌の攻撃性或いは癌細胞治療剤の有効性を診断する方法であって、該癌細胞を有する疑いをもたれた組織の試料を請求項８のプローブと反応させ、それらの間のハイブリダイゼーションの程度を決定し、及びハイブリダイゼーションの程度を標準と比較することを特徴とする方法。

１１、癌の攻撃性の診断方法であって、該癌からの精製ＲＮ　Ａを請求項１のプローブと反応させ、それらの間のハイブリダイゼーションの程度を決定し、及びハイブリダイゼーションの程度を標準と比較することを特徴とする方法。

１２、該プローブが放射線標識化されている請求項９に記載の方法。

１３、該プローブが放射線標識化されている請求項１０に記載の方法。

１４、　該プローブが放射線標識化されている請求項１１に記載の方法。

１５、該プローブが発色的に検出される請求項９１；記載の方法。

１６、　該プローブが発色的に検出される請求項１０に記載の方法。

１７、該プローブが発色的に検出される請求項ユ１に記載の方法。

１８、薬学的に許容可能な担体及び生育抑制量のラミニンに対する結合に対して癌細胞と拮抗する能力を有する請求項４に記載のペプチドを含んでなることを＠徴とする癌細胞の転移を抑制するための治療組成物。

１９、薬学的に許容可能な担体及び生育抑制量のラミニンに対する結合に対して癌細胞と拮抗する能力を有する請求項５に記載のペプチドを含んでなることを特徴とする癌細胞の転移を抑制するための治療組成物。

２０、　薬学的に許容可能な担体及び生育抑制量のラミニンに対する結合に対して癌細胞と拮抗する能力を有する請求項６に記載のペプチドを含んでなることを特徴とする癌細胞の転移を抑制するための治療組成物。

国際調査報告１ｍｍａｌｌＩＩＪ−ム紗−−（−一１１１Ｎ嘲−”’５ｒ−＝’ｅＯ−＾’！Ｉ”ｐｃτ）′υ５８７７’０２４ニュＡｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ＺＯＦＣｔ：Ｉ　Ｐロ／工５Ａ／２１０：　Ｐａｒｔ　ＶＸ。

Claims

【特許請求の範囲】

１．ラミニンの細胞表面レセプターをコード化する組換えｃＤＮＡクローン。
２．ＡＴＣＣ　６７１９９の性質を有する請求項１に記載のクローン。
３．次のヌクレオチド配列を全部又は部分的に有する請求項１に記載のクローン：【配列があります】
４．全部又は部分的に下記配列よりなる請求項３のヌクレオチド配列由来の合成ペプチド：【配列があります】
５．次のアミノ酸配列を全部又は部分的に有することを特徴とする合成ペプチド：【配列があります】
６．次のアミノ酸配列を全部又は部分的に有することを特徴とする合成ペプチド：【配列があります】
７．次のアミノ酸配列を全部或いは一部に有することを特徴とする合成ペプチド：【配列があります】
８．転移を抑制する性質を有する全部或いは一部の請求項４に記載のペプチド。
９．転移を抑制する性質を有する請求項５に記載の合成ペプチド。
１０．転移を抑制する性質を有する請求項７に記載の合成ペプチド。
１１．ラミニンレセプターｍＲＮＡにハイプリダイズする能力を有する請求項１に記載のクローンから得られるプローブ。
１２．ラミニンレセプター遺伝子にハイブリダイズする能力を有する請求項１に記載のクローンから得られるプローブ。
１３．癌腫の攻撃性を診断する方法であって、該癌腫を有する疑いのある組織の試料を請求項１１に記載のプローブと反応させ、それらの間のハイブリダイゼーションの程度を決定することを特徴とする方法。
１４．癌腫の攻撃性を診断する方法であって、該癌腫を有する疑いのある組織の試料を請求項１２に記載のプローブと反応させ、それらの間のハイブリダイゼーションの程度を決定することを特徴とする方法。
１５．癌腫の攻撃性を診断する方法であって、該癌腫からの精製ＲＮＡを請求項１１のプローブと反応させそれらの間のハイブリダイゼーションの程度を決定することを特徴とする方法。
１６．癌細胞の治療剤の有効性を診断する方法であって、該癌細胞を有する疑いのある組織の試料を請求項１１のプローブと反応させ、それらの間のハイブリダイゼーションの程度を決定することを特徴とする方法。
１７．癌細胞の治療剤の有効性を診断する方法であって、該癌細胞を有する疑いのある組織の詫足試料を請求項１２のプローブと反応させ、それらの間のハイブリダイゼーションの程度を決定することを特徴とする方法。
１８．該プローブが放射線標識化されている請求項１３に記載の方法。
１９．該プローブが放射線標識化されている請求項１４に記載の方法。
２０．該プローブが放射線標識化されている請求項１５に記載の方法。
２１．該プローブが放射線標識化されている請求項１６に記載の方法。
２２．該プローブが放射線標識化されている請求項１７に記載の方法。
２３．該プローブが発色的に検出される請求項１３に記載の方法。
２４．該プローブが発色的に検出される請求項１４に記載の方法。
２５．該プローブが発色的に検出される請求項１５に記載の方法。
２６．該プローブが発色性に検出される請求項１６に記載の方法。
２７．該プローブが発色性に検出される請求項１７に記載の方法。
２８．癌細胞の転移を抑制するための治療組成物であって、薬学的に許容可能な担体及び生育抑制量のラミニンに結合するために癌細胞と競争する能力を有する請求項８のペプチドを含んでなることを特徴とする組成物。
２９．癌細胞の転移を抑制するための治療組成物であって、薬学的に許容可能な担体及び生育抑制量のラミニンに結合するために癌細胞と競争する能力を有する請求項９のペプチドを含んでなることを特徴とする組成物。
３０．癌細胞の転移を抑制するための治療組成物であって、薬学的に許容可能な担体及び生育抑制量のラミニンに結合するために癌細胞と競争する能力を有する請求項１０のペプチドを含んでなることを特徴とする組成物。