JPH06107691A - ラミニンレセプターをコード化する組換えｄｎａクローンのヌクレオチド配列から誘導される合成ペプチド - Google Patents

ラミニンレセプターをコード化する組換えｄｎａクローンのヌクレオチド配列から誘導される合成ペプチド

Info

Publication number
JPH06107691A
JPH06107691A JP5116331A JP11633193A JPH06107691A JP H06107691 A JPH06107691 A JP H06107691A JP 5116331 A JP5116331 A JP 5116331A JP 11633193 A JP11633193 A JP 11633193A JP H06107691 A JPH06107691 A JP H06107691A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
laminin receptor
laminin
dna
cdna
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP5116331A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark E Sobel
イー． ソベル，マーク
Lance A Liotta
エー． リオッタ，ランス
Ulla M Wewer
エム． ウイワー，ウルラ
Michael C Jaye
シー． ジェイ，マイケル
William N Drohan
エヌ． ドロハン，ウイリアム
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ROARAA INTERNATL HOORUDEINGUZU Inc
US Department of Commerce
Rorer International Holdings Inc
Original Assignee
ROARAA INTERNATL HOORUDEINGUZU Inc
US Department of Commerce
Rorer International Holdings Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ROARAA INTERNATL HOORUDEINGUZU Inc, US Department of Commerce, Rorer International Holdings Inc filed Critical ROARAA INTERNATL HOORUDEINGUZU Inc
Publication of JPH06107691A publication Critical patent/JPH06107691A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y10S436/813—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 転移を抑制するラミニンレセプターの合成断
片を提供することを目的とする。 【構成】 ラミニンレセプターをコード化するＤＮＡク
ローンの特定ヌクレオチド配列から誘導される特定配列
の合成ペプチドが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は一般的に合成ペプチドに
関する。より詳細には、本発明はラミニンの高親和性
（約１０-8〜１０-10 ｋｄ）細胞表面レセプターをコー
ド化する組換えｃＤＮＡクローンの配列から誘導される
合成ペプチドおよびその断片に関する。
【０００２】
【従来の技術と解決しようとする課題】ラミニンは表皮
細胞及び新生細胞の両者の基底膜への結合を媒介する基
底膜の主たる糖タンパク質成分である。基底膜は器官柔
組織細胞を間質性コラーゲン様ストロマから分離する至
る所に存在する特殊化されたタイプの外細胞マトリック
スである。細胞とこのマトリックスの相互作用は正常及
び新生細胞過程の両者の重要な側面である。正常な細胞
は外細胞マトリックスを生存、増殖及び分化のために必
要とするように思われるのに対し、移動性細胞は正常細
胞及び新生細胞共に一つの組織から他の組織に移動する
に際して基底膜を横切らなければならない。特に扁平或
いは小腺表皮細胞に生ずる転移癌細胞は循環及びリンパ
系に入るためには基底膜を横切らなければならず（血管
内異物侵入）、又循環新生細胞は器官の毛細管床に典型
的に捕えられ、血管壁を冒し、及び基底膜を侵入して血
管外組織に至り（管外遊出）、そこで二次的新生物を次
いで確立する。ラミニンレセプターは表皮及び新生細胞
の両者の基底膜への結合を媒介することにより特に転移
過程を制御することにおいて極めて重要な役割をはた
す。米国特許４，５６５，７８９号明細書はラミニンレ
セプターの単離及びある種の側面の特性化を記載してい
る。しかしながら、ラミニンの細胞表面レセプターをコ
ード化するクローン化ＤＮＡ配列はこれ迄知られていな
い。
【０００３】
【課題を解決するための手段】それ故、本発明の目的
は、転移を抑制するラミニンレセプターの合成断片を提
供することである。
【０００４】更に本発明の目的は、多量の合成ラミニン
レセプターの製造方法を提供することである。
【０００５】更に本発明の目的は膜張渡し領域及びリガ
ンド結合領域などの特定の領域をコード化するラミニン
レセプターの合成断片を提供することである。
【０００６】本発明のこれら及びその他の目的を付随す
る利点の多くは添付図面に関連して考慮するとき以下の
詳細な既述を読んでよりよく理解されるであろう。
【０００７】図１は精製ラミニンレセプターの均質性を
示す。ＴＯＰは大腸癌からの及び正常ヒト胎盤組織から
の精製ラミニンレセプターの比較を示す。ラミニン-Sep
haroseアフィニティカラムから１Ｍ ＮａＣｌで溶出さ
れた物質をジチオスレイトールの存在下においてＮａＤ
ｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７％）
により分析し、銀染色により可視化した。パネルはラミ
ニンレセプターの調製物間の分子量の僅かな可変性を例
示する（６８，０００〜７２，０００）。レーンＰ１：
ヒト胎盤組織から単離されたラミニンレセプター（１
μｇ）。レーンＣａ： ヒト大腸癌から単離されたラミ
ニンレセプター（３μｇ）。レーンＭ： 分子量マーカ
ー：ホスホリラーゼｂ（９４，０００）、ウシ血清アル
ブミン（６７，０００）及びオバルブミン（４３，００
０）。
【０００８】BOTTOMは精製ラミニンレセプターの等電集
中及び二次元ゲル電気泳動を示す。上記大腸癌ラミニン
レセプタータンパク質試料（０．１μｇ）はＩ125 で放
射線標識され、等電集中（ｐＨ範囲５〜７）及び１０％
ＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミドゲル上の二次
元ゲル電気泳動に付された。分子量マーカー： ホスホ
リラーゼｂ（９３，０００）、ウシ血清アルブミン（６
６，０００）、グリセラルアルデヒド３‐ホスフェート
デヒドロゲナーゼ（３６，０００）。
【０００９】図２は精製ラミニンレセプターのＥＬＩＳ
Ａを示す。各マイクロタイターウェルを精製腫瘍ラミニ
ンレセプターで被覆し、ＬＲ１モノクローナル抗体２Ｈ
５（□）、抗アルブミン（○）或いは抗‐α‐アミラー
ゼモノクローナル抗体（●）に対して２時間反応させ
た。抗体をペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＭ或
いはペルオキシダーゼ複合ブタ抗ウサギＩｇＧを用いて
検出した。
【００１０】図３と図４は抗ラミニンレセプターモノク
ローナル抗体のλＥＬＲ６に対する特異性を示す。約５
０〜１００個の精製λＥＬＲ６プラークを含有するフィ
ルターを抗ラミニンレセプターモノクローナル抗体、抗
‐α‐アミラーゼモノクローナル抗体、抗アルブミン抗
体或いは抗ラミニン抗体のいずれかと反応された。抗体
結合はペルオキシダーゼ複合第二抗体を用いて検出し
た。
【００１１】図５はλＥＬＲ１〜６の重畳ラミニンレセ
プターｃＤＮＡインサートを示す。頂部の線はｃＤＮＡ
インサートの左側への２個のＫｐｎＩ部位（Ｋ）を示す
原型λＥＬＲ組換えλｇｔ１１ファージの図である。囲
いはｃＤＮＡインサートを表わす。各インサート内の左
のＥｃｏＲＩ部位は存在しなかった。右のＥｃｏＲＩ部
位（Ｅ）を示す。λｇｔ１１のｌａｃＺ遺伝子からの転
写はファージの右腕からＥを介して左側に進む。Ｋｐｎ
Ｉ部位（ｃＤＮＡインサートに最も近接した）から最大
のｃＤＮＡインサート（λＮＬＲ４）のＥｃｏＲＩ部位
に延在する領域は拡大されて下に示される。ｃＤＮＡイ
ンサート囲い内の斜線領域はニックトランスレーション
されハイブリダイゼーションプローブとして用いられた
λＥＬＲ４のサブクローン（図６参照）から単離された
ＰｓｔＩ‐ＳｐｈＩ制限断片を示す。明細書に説明され
る共通ＳａｃＩ（Ｓ）及びＨｉｎｄIII （Ｈ）部位が示
される。ＥＬＲ組換えファージの各々からのファージＤ
ＮＡはＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで制限され、１％アガロ
ースゲルを通して電気泳動され、ニトロセルロースに移
され、及び上記ＰｓｔＩ‐ＳｐｈＩ制限断片にストリン
ジェントにハイブリダイズされる。プローブにハイブリ
ダイズした各λＥＬＲ組換えファージからのＫｐｎＩ‐
ＥｃｏＲＩ制限断片の長さをブロットのラジオオートグ
ラフ上に図示し、標準λ／ＨｉｎｄIII 消化物と対比し
て決定した。
【００１２】図６はλＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートの
配列決定の術策を図示する。λＥＬＲ４のサブクローン
化インサートの制限地図をトップに示す。Ｅはインサー
トの５′ＥｃｏＲＩ部位である。Ｈ：ＨｉｎｆＩ、Ｓ：
ＳｐｈＩ、Ｒ：ＲｓａＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、＊：オーカー
集結コドン。矢印は５′末端において（γ‐Ｐ32）ＡＴ
Ｐによるキナーゼ化により（●）或いは３′末端におい
て（α‐Ｐ32）ジデオキシＡＴＰによるテーリングによ
り（○）或いはジデオキシ合成法（ｒ）のいずれかによ
り標識化された断片の配列方向を示す。配列決定に用い
られたサブクローンはｐＬＲ４−１、ｐＬＲ４−２、及
びｐＬＫ４−４であった。
【００１３】図７と図８は下記に得られたタンパク質配
列のλＥＬＲｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を
提供する。各線の右側には人工ＥｃｏＲＩ部位からの塩
基対の数が示される（塩基１〜６）。
【００１４】図９は、合成ラミニンレセプターペプチド
のＥＬＩＳＡ決定を示す。合成ラミニンレセプターペプ
チドＲＴＬＲ２は図７と図８におけるｃＤＮＡ配列から
精製され、異った稀釈率のウサギ抗ラミニンレセプター
抗血清或いは前免疫血清を用いてＥＬＩＳＡによりアッ
セイされた。
【００１５】図１０はＲＮＡゲルブロットハイブリダイ
ゼーションを示す。全細胞ＲＮＡを数個の乳癌細胞系か
ら抽出し、メチル水銀アガロースゲル上で分離し、及び
ジアゾベンジルオキシメチルセルロース紙に移した。こ
のフィルターをｐＬＲ４−１からのニックトランスレー
ションされた（32Ｐ）‐標識化ＥｃｏＲＩ‐ＰｓｔＩイ
ンサートにハイブリダイズした。ハイブリダイズされた
ｍＲＮＡ種の長さは知られた大きさのｒＲＮＡ及びＨｉ
ｎｄIII で制限されたλＤＮＡの大きさと対比すること
により求められた。レーン１：ＭＣＦ‐７（親）；レー
ン２：ＭＣＦ７‐３Ｅ５；レーン３：ＭＣＦ７‐５Ｈ
７；レーン４：ＺＲ７５。
【００１６】図１１はラミニンレセプターｍＲＮＡレベ
ルと６個のヒト癌細胞系のラミニンに結合する能力との
相関関係を示す。図１０に示されるような異った時間の
ラジオオートグラフの曝露を濃度測定により測定して線
形応答範囲を決定した。一連のハイブリダイズされたＲ
ＮＡの最低量に数値１．０を与え、全てのその他の値は
その値に対して計算した。各細胞系に対する細胞当りの
ラミニンレセプターの数は対数成長期細胞に対する特異
的結合（Ｉ125 ）ラミニンのScat-chardプロットから計
算した。線形回帰分析は０．９７の相関係数を示した。
ＭＣＦ‐７親□、ＭＣＦ‐７クローン５Ｈ７△、ＭＣＦ
‐７クローン３Ｅ５■、ＺＲ‐７５○、腎癌Ａ‐７０４
●、Panc‐１▲。
【００１７】図１２は合成ラミニンレセプターペプチド
が細胞へのラミニン結合を抑制することを示す。Ａ２０
５８ヒトメラノーマ細胞のラミニンに特異的に結合する
能力を、図７〜８のｃＤＮＡ配列から精製する各種量の
ＲＴＬＲ２の□或いはＲＴＬＲ２‐コントロール◆の存
在下において試験した。値は添加断片の存在下において
結合したラミニン量に対して表わされている。及び図１
３はリガンド結合に含まれる合成ペプチドラミニンレセ
プターの同定を示す。予測された逆転立体配置を有する
ｃＤＮＡ配列から精製されたペプチド断片（ＲＴＬＲ
２、ＲＴＬＲ３）並びにコントロールペプチドはグラス
ビーズに結合され（Ｉ125 ）ラミニンとインキュベート
した。示された数値は断片なしにビーズに結合されたｃ
ｐｍを差引いた後のビーズに結合したｃｐｍ×１０-3の
数である。
【００１８】特に断りのない限り、本発明において用い
る全ての技術的或いは化学的用語は本発明の属する技術
における当業者により普通に理解されるものと同一意味
を有する。本発明の実施或いは試験において、本発明に
おいて説明されるものと同様或いは等価の如何なる方法
及び材料を用いることもできるが、好ましい方法及び材
料を以下に説明する。以下に述べる全ての刊行物は本発
明において準用する。
【００１９】本発明の合成ペプチドが誘導されるヌクレ
オチド配列を有する組換えｃＤＮＡクローンを造築及び
単離するための方法論は更に詳細に例IIにおいて説明さ
れており、周知の標準的技術を含む以下の一般的工程を
含むものである： ａ） ヒト臍帯静脈内皮細胞からのｍＲＮＡ鋳型を用い
てｃＤＮＡを合成する。
【００２０】ｂ） 内皮細胞ｃＤＮＡをλｇｔ１１ベク
ター（ＡＴＣＣ ３７１９４）中に挿入する。
【００２１】ｃ） この組換えλｇｔ１１をパッケージ
し、大腸菌（Escherichia coli）１０９０細胞（ＡＴＣ
Ｃ３７１９７）を感染するために用いる。
【００２２】ｄ） 得られるλｇｔ１１ヒト内皮細胞ｃ
ＤＮＡ発現ライブラリーをラミニンの結合に含まれるヒ
トラミニンレセプターの領域を認識するモノクローナル
抗体を用いてスクリーニングする。
【００２３】ｅ） λＥＬＲ１〜６と命名される６個の
プラークがこのようにして単離及び精製される（図３乃
至図４）。これらのｃＤＮＡインサートを制限エンドヌ
クレアーゼマッピングにより分析し、共通領域を有する
ことが判明し、それらがモノクローナル抗体により認識
されるラミニンレセプターのエピトープをコード化する
ことを示す（図５）。
【００２４】ｆ） ６個の精製相の最も大きいｃＤＮＡ
インサートをプラスミドベクター中にサブクローン化し
て更に分析及びＤＮＡ配列決定を容易にする。λｇｔ１
１の左腕にｃＤＮＡインサートを連結するＥｃｏＲＩ部
位は全ての六つのクローンに存在しない。従ってＰｖｕ
II部位１１ｂｐ下流を利用して、最も大きい組換えファ
ージλＥＬＲ４からｃＤＮＡインサートを精製する。λ
ＥＬＲ４のＥｃｏＲＩ‐ＰｖｕII制限断片をｐＢＲ３２
２のＥｃｏＲＩ‐ＰｖｕII部位中にサブクローン化して
ｐＬＲ４−１を作成する。
【００２５】宿主Ｅ．コリ株Ｃ６００ｒ- ｍ- （ＡＴＣ
Ｃ３３５２５）中に形質転換された組換えｃＤＮＡクロ
ーンｐＬＲ４−１の寄託は受理番号６７１９９号でアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American
Type Culture Collection,(ATCC)、メリーランド州ロ
ックビル）になされた。要求によりＰＴＯの長官はこの
寄託物を入手でき、特許発効時にはこの寄託物は最後の
要求後少なくとも５年間或いは少なくとも３０年間、或
いは特許の有効期間生育可能に維持され、勿論、法律の
規定に従って制限なしに公衆に利用可能とされる。
【００２６】ラミニンレセプターをコード化する組換え
ｃＤＮＡを確定的に同定する方法は組換えプラスミドの
ｃＤＮＡ配列（図７と図８）を精製胎盤ラミニンレセプ
ターのシアノーゲンブロマイド‐生成オクタペプチドの
アミノ酸配列との比較に基づく。オクタペプチドアミノ
酸配列を得るための方法論はより詳細に例Ｉに説明さ
れ、周知の標準的技術を含む次の一般工程を包合する： ａ） ヒト胎盤組織からのミクロゾーム膜を調製し、可
溶化する。
【００２７】ｂ） 可溶化されたミクロソーム膜含有調
製物を精製ラミニン‐Sepharose ４Ｂのアフィニティマ
トリックスを通過させ、十分洗浄後高アフィニティラミ
ニンレセプタータンパク質を高濃度塩水（１Ｍ ＮａＣ
ｌ）によりリガンドから溶出する。
【００２８】ｃ） ヒト胎盤ラミニンレセプターの均質
性を二次元ゲル電気泳動（図１）及び酵素結合免疫吸着
剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（図２）によりアッセイす
る。
【００２９】ｄ） ヒト胎盤ラミニンレセプターをシア
ノーゲンブロマイドで切断し、得られたペプチド類を逆
相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分画す
る。
【００３０】ｅ） 胎盤オリゴペプチドのミクロ配列分
析は独特の配列Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを有するオクタペプチドを
露わす。
【００３１】ラミニンレセプターをコード化する組換え
ＣＤＮＡクローンの別の同定方法はヒト転移乳癌ラミニ
ンレセプターに向けられたウサギ抗血清のｐＬＲ４−１
のｃＤＮＡ配列から生成した合成ペプチド（図９）を同
定（ＥＬＩＳＡにより）する能力を求める。この抗ラミ
ニンレセプター抗血清を得る方法論は更に詳細に例IVに
おいて説明されており、周知の標準的技術を含む次の一
般的工程を包合する： ａ） ラミニンレセプターを胎盤ラミニンレセプターに
対して上記に説明したようにヒト転移乳癌から精製す
る。
【００３２】ｂ） 腫瘍ラミニンレセプターの均質性を
胎盤ラミニンレセプターに対して上記説明の如く評価す
る。
【００３３】ｃ） ＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルア
ミドゲルから切出した腫瘍ラミニンレセプターの皮下注
射によりウサギを免疫化する。
【００３４】ヒト癌細胞などのラミニンレセプターｍＲ
ＮＡを含む細胞の診断アッセイが癌の診断及び予知にお
ける有用な道具として開発されてきた。ラミニンレセプ
ターｍＲＮＡ含量のアッセイ方法は更に詳細に例Ｖにお
いて説明され、周知の標準的技術に従う次の一般的工程
を包合する： ａ） 全細胞ＲＮＡを組織標本或いは細胞から単離す
る。
【００３５】ｂ） ＲＮＡを変性アガロースゲルを通し
て変性及び電気泳動させ、濾紙に移す。
【００３６】ｃ） ＲＮＡを含む濾紙を放射線標識化ラ
ミニンレセプターｃＤＮＡにハイブリダイズさせる。
【００３７】ｄ） 洗浄後、フィルターを十分な時間Ｘ
‐線フィルムに曝露し、放射線活性プローブのイメージ
を得る。
【００３８】ｅ） フィルム上のバンドの相対的強度が
ラミニンレセプターｍＲＮＡの目安である（図１０）。
【００３９】ｆ） 或いは又上記工程（ｂ）の代りに変
性ＲＮＡの小アリコートを直接に濾紙に結合した後工程
（ｃ）〜（ｅ）を行う。
【００４０】ｇ） 放射線標識化ラミニンレセプターｃ
ＤＮＡは又in situ で組織断片及び細胞にハイブリダイ
ズさせてラミニンレセプターｍＲＮＡを発現する特定細
胞集団を決定することもできる。
【００４１】転移細胞におけるラミニンレセプターｍＲ
ＮＡの増加した含量は変化したラミニンレセプターＤＮ
Ａを含有する細胞の診断アッセイの開発に役立つ。この
方法論は各種遺伝病に対して見出だされてきた制限断片
長の多形性の可能性のある存在に基づく。腫瘍のゲノム
或いは転移細胞におけるラミニンレセプター遺伝子の増
幅も又評価されてよい。ラミニンレセプターゲノムＤＮ
Ａの分析方法は周知の標準的技術に従って、次の一般的
工程を包合する： ａ） 高分子量ゲノムＤＮＡを例VIに説明するように組
織標本或いは細胞から単離する。
【００４２】ｂ） ＤＮＡを各種制限エンドヌクレアー
ゼにより消化し、アガロースゲルを通して電気泳動させ
濾紙に移す。
【００４３】ｃ） ＤＮＡを含有するフィルターを放射
線標識化ラミニンレセプターｃＤＮＡにハイブリダイズ
させる。
【００４４】ｄ） 洗浄後、フィルターをＸ‐線フィル
ムに曝露し、フィルム上のバンドのパターンを正常組織
からのそれと比較する。
【００４５】ｐＬＲ４−１のｃＤＮＡ配列から生成した
合成ペプチド類は転移の形成を抑制する癌の治療におい
て有用である。本発明において説明される方法は基底膜
は良性新生物における連続構造であり、又、良性細胞上
のラミニンレセプターは基底膜への結合により占められ
ているという観察に基づくものである。これに対して、
侵略腫瘍細胞に隣接した基底膜は連続的ではない。侵略
腫瘍細胞はこのようにリガンドに結合していない細胞表
面上に発現された増大した数のラミニンレセプターを有
する。癌の管理及び診断において重要な概念であるのは
転移癌細胞上のラミニンレセプター部位の利用可能性で
ある。癌の腫瘍細胞が一次腫瘍部位から隣接正常組織に
移動する傾向及びその体の遠方部位に広がり、転移クロ
ーンを開始する性向と定義される癌の攻撃性は、次いで
部分的により多くの利用可能なラミニンレセプターを有
する侵略性細胞の数の一つの反映である。
【００４６】ｐＬＲ４−１のｃＤＮＡ配列から生成する
合成ペプチド類は放射線標識化ラミニンに特異的に結合
する（図１３）。ラミニン結合アッセイにおけるこの合
成ペプチドの存在は細胞がラミニンに結合する能力を阻
害した（図１２）。このように、合成ペプチドは細胞表
面ラミニンレセプターがラミニンに結合する能力と拮抗
及び妨害する。ペプチドが混合ＢＬ６メラノーマ細胞で
あり、マウスに静脈内注射した場合にＢＬ６細胞からの
転移の数は減少した（表１）。如何なる理論にも拘束さ
れるものではないが、合成ラミニンレセプター断片は基
底膜に対して直ちに結合することに対して細胞と拮抗し
て転移細胞のコロニー化を防止するものと思われる。
【００４７】上記に基づき、本発明が各種方法で癌の診
断及び治療並びに細胞によるラミニンの異常な認識から
生ずるその他の病気において用いることができることは
明らかである。
【００４８】
【実施例】以下に、本発明を例示する具体例を説明す
る。
【００４９】例 Ｉ 独特なヒト胎盤ラミニンレセプターオクタペプチドの同
定 Ａ．材料及び方法 １．組 織 ヒト乳癌及び大腸癌に由来する肝臓転移からの組織を国
立癌研究所病理学実験室（Laboratory of Pathology,Na
tional Cancer Institut）及びグロストラップ病院病理
学部（Department of Pathology, Glostrup Hospital、
コペンハーゲン）から得た。正常期間出産から得られた
ヒト胎盤は国立海軍医療センター（National Naval Med
ical Center,メリーランド州、ベセスダ）により提供さ
れた。
【００５０】２．ラミニンレセプターの精製 腫瘍組織（１００〜３００ｇ）或いは胎盤組織 （５００ｇ）を５容（wt/vol）のリン酸緩衝化塩水（１
３７ｍＭ ＮａＣｌ／１．７ｍＭ Ｋｃｌ／８．１ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４／１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ
７．２）中において、Waringブレンダー内においてホモ
ジナイズした。この緩衝液及び以下の緩衝液に対して次
のプロテアーゼ阻害剤を添加した：５０μｇ／mlフェニ
ルメチルスルホニルフルオライド、５ｍＭベンズアミジ
ン、１０μｇ／mlアプロチニン、５０μｇ／ml大豆トリ
プシン阻害剤及び５ｍＭベーターヒドロキシ水銀安息香
酸。５００×ｇで１０分間遠心分離後、ホモジネートを
０．３Ｍスクロース／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．３中で１：１（vol ／vol ）に希釈し、氷上でブ
リンクマンポリトロン（Brinkman Polytron)で超音波処
理し、１５，０００×ｇで４℃において２０分間遠心分
離し、更に上澄液を１４３０００ｘｇで４℃において９
０分間超遠心分離した。得られたペレット内のミクロゾ
ーム膜を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．３／１
５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＣａＣｌ２／３ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２中１０mgタンパク質／mlで再懸濁し、等容量の
１％オクチルフェノリポリエトキシエタノール（Nonide
t P-40, Sigma)／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ
７．２／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＣａＣｌ２／
３ｍＭ ＭｇＣｌ２中に希釈し、４℃で６時間エンド‐
オーバー・エンド(end-over-end)回転で抽出した。この
調製物を２００，０００×ｇで４℃において１時間超遠
心分離し、次いで上澄液を２mgのラミニン（ティンプル
等Timpl, et al., J.Biol. Chem., 254: 9933-9937(197
9)に説明されたように精製された）をmlのＣＢｒＮ‐活
性化Sepharose４Ｂ（Pharmacia ）にカップリングさせ
ることにより調製された２mlのSepharose ラミニンアフ
ィニティマトリックスと共に４℃で１０時間インキュベ
ートした。Sepharose ‐ラミニンマトリックスを次いで
１０回 ２５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．３／１
５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＣａＣｌ２／１ｍＭＭＧ
Ｃｌ２／０．０５％ Nonidet Ｐ‐４０中で洗浄し、及
び１回４００mlＮａＣｌを含有する緩衝液中で洗浄し
た。このラミニン‐Sepharose マトリックスを次いで２
mlカラム中に充填した。タンパク質画分を室温で１ＭＮ
ａＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．３で溶
出し、直ちに氷上に置き、冷蒸留Ｈ２Ｏに対して透析
し、凍結乾燥により濃縮した。
【００５１】３．シアノーゲンブロマイド消化及びマイ
クロ配列決定 精製ラミニンレセプターをシアノーゲンブロマイドでオ
ーゾールス等〔Ozolset al., J. Biol, Chem., 252:598
6-5989 (1977)〕により説明されるように消化し、４０
０μｌの０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルに
溶解し、逆相２５cm×４．１mm ＰＲＰ‐１カラム（Ha
milton）上で２００μｌの二つの注入として２ml／分の
流速で運転した。シアノーゲンブロマイド‐発生断片の
アミノ酸配列決定を製造者のプログラム０３ＲＰＴＨを
用いる付属モデル１２０Ａ ＰＴＨ‐アナライザーを有
するモデル４７０Ａ気相タンパク質シークエンサー（Ap
plied Bio Systems 、フォスターシテー、カリフォルニ
ア州）を用いて行った。
【００５２】４．酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ） ＥＬＩＳＡはエングバル(Engvall、Methods Enzymol.，
70: 419-439 (1980)）に従って行った。アッセイされた
抗体はリオッタ等（Liotta, et al., Exp.CellRes., 15
6: 117-126 (1985)）により説明されたようなヒトラミ
ニンレセプターに対するＩｇＭマウスモノクローナル抗
体２Ｈ５（ＬＲ‐１）、ウサギ抗‐ヒトアルブミン（Mi
les ）及び‐アミラーゼに対するＩｇＭマウスモノクロ
ナール抗体（国立歯科研究所 National Institute of D
ental ResearchのＲ．シラガニアン R. Siraganianから
得られた）を包含した。結合抗体はペルオキシダーゼ‐
複合ウサギ‐抗マウスＩｇＭ（キエルケガード・アンド
・ペリー・ラボラトリーズKierkegaard and Pery Labor
atories,メリーランド州、ガイザースバーグ）或いはペ
ルオキシダーゼ‐複合ヤギ抗‐ウサギＩｇＧ（Kierkega
ard and Perry Laboratories）を用いて検出した。
【００５３】５．ゲル電気泳動 タンパク質資料はレムリ（Laemmli, Nature （ロンド
ン）、227: 680-685(1970)）の方法によりジチオスレイ
トールの存在下においてＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により分析した。等電集中及び二
次元ＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミドゲル電気泳
動はオファレス（O'Farrell, J. Biol. Chem., 250: 40
07-4021 (1975)）及びビルス等（Wirth et al.,Cancer
Res., 46:400 〜413 (1986)）により説明されたように
行われた。免疫ブロッティングはリオッタ等（Liotta,
et al. (1985) 、前掲）により説明されたように抗ラミ
ニンレセプターモノクローナル抗体を用いて行われた。 Ｂ．結 果 １．ヒトラミニンレセプターの精製 調製量の精製ラミニンレセプターの単離はヒト転移乳癌
及び大腸癌及びヒト胎盤組織からの可溶化ミクロゾーム
膜含有調製物をラミニン‐Sepharose ４Ｂのアフィニテ
ィマトリックスにかけ、次いでアフィニティマトリック
スの十分な洗浄及び高濃度塩水（１Ｍ ＮａＣｌ）によ
るリガンドからのレセプタータンパク質の溶出により達
成された。ＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（図１Ａ）により分析すると、乳癌及び大腸癌
からの精製タンパク質はより厳密性の少ない条件下で単
離されたヒト乳癌ラミニンレセプターについて、先に報
告されたように、約みかけＭｒ＝６８，０００〜７２，
０００を有した。この精製操作の結果薬２０μｇ／１０
０ｇの腫瘍組織及び２μｇ／１００ｇの胎盤組織のレセ
プタータンパク質収率が得られた（可溶化ミクロゾーム
膜調製物中約０．０２％のタンパク質）。
【００５４】これらの乳癌、大腸癌及び胎盤からの精製
ラミニンレセプター調製物を標準的操作に従ってヨード
化し、二次元ゲル電気泳動により分析して調製物の均質
性を評価した。代表的な腫瘍ラミニンレセプターのオー
トラジオグラフを第１Ｂ図に示す。ラミニンレセプター
のみかけｐＩは６．４±０．２である。第１Ｂ図は延伸
スポットを示すが、異ったｐＨ範囲及び免疫ブロッティ
ング（前記Liotta等（1985）らにより説明されるよう
な）におけるその他のゲルは単一ポリペプチド鎖と一致
する。
【００５５】これらの三つの源泉からの精製ラミニンレ
セプター調製物をマイクロタイターウエル内で固定し、
一群の抗体と反応させて更に調製物の純度及びアミニン
或いはアルブミンによる汚染の欠乏を示した。全ての場
合において、ヒトラミニンレセプターＬＲ‐１（２Ｈ
５）に対するＩｇＭマウスモノクローナル抗体は陽性に
反応したのに対し、ウサギ抗‐ヒトアルブミン及びα‐
アミラーゼに向けられたクラス適合ＩｇＭマウスモノク
ローナル抗体は反応しなかった。代表的ＥＬＩＳＡを図
２に示す。
【００５６】２．胎盤ラミニンレセプターのシアノーゲ
ンブロマイドペプチドのマイクロ配列分析 そのままのラミニンレセプター分子を直接に配列決定す
るための繰返された試みは、おそらくアミノ末端の保護
により成功しなかった。従って、レセプタータンパク質
をシアノーゲンブロマイドで切断し、得られたペプチド
を逆相ＨＰＬＣにより分画した。胎盤オリゴペプチドの
マイクロ配列分析は、配列Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを有するペプチ
ドを現わした。同族体に対するコンピュータの助けを借
りた探索（ウィルバー及びリップマン、Wilber and Lip
man, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 726-730 (1983)）は
このオクタペプチドが独特のものであることを示した。
【００５７】例 II ヒトラミニンレセプターｃＤＮＡクローンの単離 Ａ．材料及び方法 １．細胞培養 ヒト臍帯静脈内皮細胞の単層培養物をジェイ等（Jaye,
et al. Science 228:882-885 (1985)）により説明され
るように生育した。
【００５８】２．ＲＮＡの調製 全細胞ＲＮＡをチルギン等（Chirgwin, et al., Bio-ch
emistry, 18: 5294-5299 (1979) ）により説明されるグ
アニジニウムイソチオシアネート‐セシウムクロライド
密度法により培養物中の細胞層から抽出した。ポリ
（Ａ）‐含有ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース（タイ
プ３、コラボラティブ・リサーチCollaborative Resear
ch）上のクロマトグラフィによりアヴィブ及びレーダー
(Aviv andLeder, Proc. Natl. Acad. Sci., 69:1408-14
12 (1972)）の方法に従って単離した。
【００５９】３．ｃＤＮＡの合成 オリゴ（ｄＴ）‐選択ヒト内皮ＲＮＡをブェル等(Buel
l, et al., J. Biol Chem. 253:2471-2482 (1978)）の
方法によりｃＤＮＡの合成のための鋳型として用い、２
本鎖ｃＤＮＡをウィッケンス等（Wickens, et al., J．
Biol. Chem. 253:2483-2495 (1978) ）により説明され
るようにして調製した。このｃＤＮＡをウルリッチ等
（Ullrich, et al., Science, 196: 1313-1319 (1977))
により説明されるようにしてＳ１ヌクレアーゼで平滑末
端にし、引続くＥ．コリ ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノウ断片による処理をウォーテル及びレニコフ（Wartel
l andResnikoff, Gene, 9: 309-319 (1980)）により説
明されるようにして行った。このｃＤＮＡを次いでＥｃ
ｏＲＩメチラーゼで修飾し、ＥｃｏＲＩリンカーに連結
し、及びヒュイン等（Huynh, et al., DNA Cloning Vol
ume 1: a practical approach, D.M.Glover 編、IRL Pr
ess Ltd., 英国オックスフォード４９−７８頁（１９８
５））により説明されるようにしてＥｃｏＲＩで徹底的
に消化した。
【００６０】４．ヒト内皮λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブ
ラリーの造築及びスクリーニング ＥｃｏＲＩ‐連結ｃＤＮＡを上記ヒュイン（Huynh ）
（１９８５）により説明されるようにしてＥｃｏＲＩ消
化及びホスファターゼ処理λｇｔ１１に連結した。この
組換え相をエンキスト及びスターンバーグ（Enquist an
d Sternberg 、Methods Enzymol., 68: 281-298(1979）
により説明されるようにしてパッケージし、上記ヒュイ
ン（Huynh)（１９８５）により説明されているようにし
てＥ．コリＹ１０８８（ＡＴＣＣ ３７１９５）中で増
幅した。Ｅ．コリ Ｙ１０９０（ＡＴＣＣ ３／１９）
細胞を内皮細胞λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーで感
染させ、抗‐ラミニンレセプターモノクローナル抗体２
Ｈ５（リオッタ等 Liottaet al., Exp. Cell Res., 15
6: 117-126 (1985) ）を用いてヤング及びデービス（Yo
ung and Davis 、Science, 222: 778-782 (1983)）によ
り説明されるようにしてラミニンレセプターβ‐ガラク
トシダーゼ融合タンパク質の抗体認識により１５０万個
のプラークをスクリーニングした。この抗体はラミニン
レセプターのリガンド結合を認識するか或いは妨害する
（上記リオッタ等 Liotta et al., (1985)）及びトーゴ
ー等 Togo et al, Basement Membrans, S. Shibata編、
ニューヨーク州、エルセヴィア、３２５〜３３３頁（１
９８５））。抗体結合は上記例１Ａ４で説明したよう
に、ペルオキシダーゼ‐複合アフィニティ精製ウサギ抗
‐マウスＩｇＭを用いて検出した。陽性プラークをベン
トン及びデービス（Bentonand Davis, Science, 196：1
80-182 ）により説明されるようにして同定、増幅及び
再スクリーニングして精製した。プラークを含有するフ
ィルターを抗‐ヒトα‐アミラーゼ及び抗‐ヒトアルブ
ミン（上記例１４Ａに説明された通りのもの）並びに抗
‐ラットラミニン（アルブレクトセン等 Albrechtsen,
et al., Cancer Res., 41: 5076-5081 (1981) ）を包合
するコントロール抗体に対して反応させた。
【００６１】５．サザーンブロットハイブリダイゼーシ
ョン ファージＤＮＡはマニアチス等（Maniatis, et al., Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHa
rbor Laboratory 、ニューヨーク州、コールドスプリン
グハーバー、７７−８５頁（１９８２））により説明さ
れたようにして単離された。制限エンドヌクレアーゼ‐
消化ＤＮＡをアガロースゲルを通して電気泳動させ、ニ
トロセルロース紙に移し、及びサザーンの方法（Southe
rn, Methods Enzymol., 68: 152-176 (1979)）によりハ
イブリダイズさせた。32Ｐ‐標識化プローブをマニアチ
ス等（Maniatis, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.、7
2:1184-1188 (1975)）に説明されるようにしてニックト
ラスレーションにより調製した。
【００６２】６．プラスミド及びｃＤＮＡインサートの
サブクローニング及び調製 ｃＤＮＡインサートをλｇｔ１１の左腕に結合するＥｃ
ｏＲＩ部位は全ての６個のクローン中に存在しない。従
って、ＰｖｕII部位１１ｂｐ下流を利用して最大の組換
えファージＥＬＲ４からｃＤＮＡインサートを精製し
た。λＥＬＲ４のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕII制限断片をｐＢ
Ｒ３２２のＥｃｏＲＩ‐ＰｖｕII部位にサブクローニン
グしてｐＬＲ４−１を作成し、及びｐＵＣ８のＥｃｏＲ
Ｉ‐ＨｉｎｄIIポリリンカー部位にサグクローニングし
てｐＬＲ４−２を作成した。引続き、長いポリ（Ａ）尾
部からｃＤＮＡ配列決定を容易にするためにｐＬＲ４−
１のＥｃｏＲＩ‐ＰｓｔＩ制限断片をｐＢＲ３２２のＥ
ｃｏＲＩ‐ＰｓｔＩ部位にサブクローニングしてｐＬＲ
４−４を作成した。ｐＢＲ３２２の組換え体をＥ．コリ
Ｃ６００ｒｍ（ＡＴＣＣ ３３５２５）中に形質転換
し、及びｐＵＣ組換え体をＥ．コリ ＪＭ１０３中に形
質転換した（メッシング等、Messing, et al., Nucleic
Acids Res., 9: 309-321 、マンデル及びヒガ（Mandel
and Higa, J. Mol. Biol., 53: 159-162 (1970)）の塩
化カルシウム法による）。スーパーコイル化プラスミド
ＤＮＡをビルンボイン及びドリー（Birnboin and Doly,
Nucleic Acids Res., 7: 1513- 1523 (1979) ）による
方法に従ったエチジウブロマイド‐セシウムクロライド
中の平衡遠心分離後にフルカリ溶解により回収した。ｃ
ＤＮＡインサートを制限ＤＮＡから単離し、アクリロア
ミドゲルからソーベル等（Sobel,et al., Proc. Sci.,
75:5846-5850 (1978)）により説明されるようにして溶
出した。 Ｂ．結 果 １．抗体認識によるラミニンレセプターｃＤＮＡの選択 ヒト内皮細胞λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーを抗‐
ラミニンレセプターモノクローナル抗体２Ｈ５を用いて
スクリーニングした。上記材料及び方法において説明さ
れるように、この抗体は（ａ）免疫ブロット上のラミニ
ンレセプターを特異的に認識し、（ｂ）ＥＬＩＳＡによ
り精製ラミニンレセプターを認識し（図２）、（ｃ）血
漿膜或いは細胞のいづれかへのラミニンの結合を妨害
し、及び（ｄ）細胞の羊膜基底膜への結合を阻害する。
これらの性質は明らかに、このモノクローナル抗体がラ
ミニンレセプターのラミニン結合領域を認識するか或い
は妨害することを示す。６個のプラークを先ず選択し
た。プラーク精製後、λＥＬＲ１−６と命名された全て
の６個のファージは抗‐ラミニンレセプターモノクロー
ナル抗体と激しい反応を示したが、しかし、ヒトα‐ア
ミラーゼに向けられたクラス適合（ＩｇＭ）モノクロー
ナル抗体或いはラミニンに対して向けられた或いはアル
ブミンなどのラミニンレセプターと大きさの同様なタン
パク質に向けられた抗体のいずれにも何等の反応性も示
さなかった（図３乃至図４）。
【００６３】２．λＥＬＲ１〜６の共通領域 ６個のファージ、λＥＬＲ１〜６の制限エンドヌクレア
ーゼ消化はｃＤＮＡインサートの３′末端をλｇｔ１１
の左腕に結合するＥｃｏＲＩ部位は全ての６個のファー
ジにはないことを示した。ＳａｃＩ、ＫｐＩ、Ｈｉｎｄ
III 及びＥｃｏＲＩを用いる単一、二重及び三重エンド
ヌクレアーゼ消化を行って、λＥＬＲ１〜６のマッピン
グを行った。図５にまとめて示されるこれらの実験は、
（ａ）ｃＤＮＡインサートの大きさは約４５０〜９７５
ｂｐの範囲であり、（ｂ）全てのクローンはクローンの
３′末端から約４５０〜５００ｂｐの内部ＳａｃＩ部位
を共有し、（ｃ）λＥＬＲ６のインサートは内部Ｓａｃ
Ｉ部位に僅かに約２０ｂｐ５′延びるにすぎず、及び
（ｄ）λＥＬＲ１及びλＥＬＲ４のインサートは５′Ｅ
ｃｏＲＩ部位からそれぞれ約３０及び４０ｂｐのＨｉｎ
ｄIII 部位を共有することを示した。これらの６個の組
換えファージはこのようにＳａｃＩ部位への丁度５′か
ら各ｃＤＮＡインサートの３′末端までに延圧する共通
の４５０〜５００ｂｐ領域を有し、この領域がモノクロ
ーナル抗体２Ｈ５により認識される領域をコード化する
ことを示唆する。この観察は６個の組換えファージの各
々からＤＮＡのＫｐｎＩ‐ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ‐Ｓ
ａｃＩ二重消化物がλＥＬＲ４から単離されたＰｓｔＩ
‐ＳｐｈＩ制限断片にストリンジェントにハイブリダイ
ズされたサザーンブロット実験により試験された。図５
に示される代表的ハイブリダイゼーション実験は全ての
６個の組換えファージの共通４５０〜５００ｂｐ領域が
モノクローナル抗体２Ｈ５により認識される抗原領域を
コード化することを示す。
【００６４】例 III ｃＤＮＡ配列決定 Ａ．材料及び方法 １．ＤＮＡ配列決定 λＥＬＲ４からのｃＤＮＡは図６に示される術策に従っ
て配列決定された。ギルバート及びマクサム（Gilbert
and Maxam, Proc. Natl. Acad. Sci., 70:3581-3584 (1
973)）の両方の化学的修正方法が用いられた。前者の場
合において、上記例IIＡ６に説明されるサブクローンｐ
ＬＲ４−１、ｐＬＲ４−２及びｐＬＲ４−４のｃＤＮＡ
制限断片は５′末端を、上記ギルバート及びマクサム
（１９７３）により説明されるようにＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（Boehringer-Mannheim ）及び（γ‐
Ｐ32）ＡＴＰにより処理するか、或いは３′テーリィン
グキット（Amersham）を用いて（α‐Ｐ32）ジデオキシ
ＡＴＰで３′末端をテーリングすることにより標識化し
た。ジデオキシ合成法の場合には、ＥＬＲ４のＥｃｏＲ
Ｉ‐ＳａｃＩ制限断片をＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ
１９中にサブクローン化した（ヤニッシュ‐ペラン等 Y
anisch-Perran, et al., Gene, 33: 103-119(1981)）。 Ｂ．結 果 １．λＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートのヌクレオチド及
び演繹アミノ酸配列 λＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートの配列はλｇｔ１１ベ
クターの右腕のＥｃｏＲＩ挿入部位と一致する２５３個
のアミノ酸開放読取り枠を示す。２Ｈ５エピトープ（上
記例IIＢ２参照）により認識される「共通領域」の配列
は図７乃至図８のヌクレオチド３６１からヌクレオチド
７６５まで延びる。それは上記例Ｉｂ２に説明される
胎盤ラミニンレセプターの精製シアノーゲンブロマイド
‐発生オリゴペプチドのそれと同一のオクタペプチドコ
ード化配列（ヌクレオチド４０９〜４３２）を包合す
る。この配列内にはラミニンレセプターのカルボキシ末
端に向かう３個のアミノ酸により分離された６個のアミ
ノ酸繰返しがみられる。このアミノ酸繰返しをコード化
するｃＤＮＡ配列は同一ではない（ヌクレオチド６７０
〜６８７及び６９７−７１４）。オーカー停止コドンに
引続き、λＥＬＲ４ｃＤＮＡインサートは長いポリ
（Ａ）伸長から上流の標準的なポリアデニル化シグナル
ＡＡＴＡＡＡ １７ｂｐを含む６６ｂｐの３′未翻訳領
域を含む。３′未翻訳領域及びポリ（Ａ）尾部の長さを
差し引いた後、λＥＬＲ１〜６の共通ｃＤＮＡ領域によ
り規定されるような２Ｈ５エピトープの最大の可能性の
ある程度は３９３ｂｐ即１３１個のアミノ酸まで狭めら
れうる。ウィルバン及びリップマン(Wirbun and Lipma
n，Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 726-730 (1983)）の
方法によるコンピュータ分析は公知のタンパク質配列へ
の有意な同族性を示さない。
【００６５】ラミニンレセプターの潜在的膜張渡し領域
は図７乃至図８の５２〜８４のヌクレオチドによりコー
ド化される１１個のアミノ酸疎水性ポリペプチドを含み
得ることが認められる。
【００６６】例 IV ｃＤＮＡ‐由来合成ラミニンレセプターペプチドの抗体
認識 Ａ．材料及び方法 １．抗血清の調製 ラミニンレセプターはヒト転移乳癌から上記例ＩＡ１と
同様にして精製した。２０μｇの精製ラミニンレセプタ
ーを上記例ＩＡ５と同様にしてＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリ
アクリルアミドゲルを通して電気泳動し、ゲルから切出
した。ウサギをアルブレックセン等（Albrecktsen,et a
l., Cancer Res. 41: 5076-5081 (1981)）により説明さ
れるようにしてタンパク質で免疫化した。血清を抗原注
射開始前（前免疫血清）及び各ブースター注射後１０日
目に集めた。
【００６７】２．ＩＬＩＳＡ ＩＬＩＳＡは上記例IVＡ１で説明したようにして得られ
た前免疫及び免疫血清を用いて、上記例ＩＡ４と同様に
行った。
【００６８】３．合成ペプチドＲＴＬＲ２ 配列： Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
−Ａｌａ を含有するＲＴＬＲ２と命名される合成ペプチドは周知
の標準的方法に従ってペニンスラ・ラボラトリーズ社
（Penninsula Laboratories, Inc. カリフォルニア州ベ
ルモント）により提供された。この配列は図７乃至図８
におけるヌクレオチド６６７−７２６から選ばれた。 Ｂ．結 果 １．抗‐ラミニンレセプター抗血清による合成ペプチド
の認識 λＥＬＲ４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列６６７−７２
６（図７〜８）を用いてペプチド配列を予測した。合成
ペプチドＲＴＬＲ２（例IVＡ３）は腫瘍ラミニンレセプ
ターに対して向けられたウサギ抗血清によるＥＬＩＳＡ
においては認識されたが、しかし前免疫血清によっては
認識されなかった（図９）。このペプチドは例III Ｂ２
において説明された二つの６個のアミノ酸繰返しを含
み、予測された反転立体配置を有する。
【００６９】例 Ｖ ラミニンレセプターｃＤＮＡのＲＮＡへのハイブリダイ
ゼーション Ａ．材料及び方法 １．細胞系 ＭＣＦ‐７ヒト乳癌細胞系（親）はミシガン癌財団（Mi
chigan Cancer Foundation）により提供された。二つの
クローン化ＭＣＦ‐７細胞系ＭＣＦ７‐５Ｈ＆及びＭＣ
Ｆ７‐３Ｅ５はＰ．ホランハンド（P. Horan Hand ，Na
tional CancerInstitute ）から得られ、グライナー等
（Greiner, et al., Int. J. Cancer, 36: 159-166(198
5)）により説明されている。ＺＲ‐７５ヒト乳癌系はエ
ンゲル及びヤング（Engel and Young, Cancer Res.，3
8: 4327-4339 (1978)）により説明され、Ｌ．エンゲル
（L. Engel, National Cancer Institute ）から得ら
れ、及びヒト腎癌系Ａ‐７０４はＳ．アーロンソン（S.
Aaronson, National Cancer Institute ）から得られ、
ギャード等（Giard, et al., J. Natl. Cancer Inst.,5
1: 1417-1423 (1973)）により説明されている。ヒトＰ
ａｎｃ‐１細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（American Type Culture Collection）か
ら得られた。ネズミＮＩＨ‐３Ｔ３細胞及びそのキルス
テン（Kirsten)ウイルス‐形質転換誘導体（ＫＮＩＨ）
は、Ｍ．ゴッテスマン(M. Gottesman, National Cancer
Institute ）から得られ、それらの生育はゴッテスマン
（Gottesman, Proc. Natl. Acad. Sci., 75:27657-2771
(1978)）により説明されている。ネズミＦ９奇形癌細胞
及びそれらのジフチリル環状ＡＭＰプラスレチン酸分化
誘導体（ストリックランド等Strickland, et al., Cel
l，21: 347 〜355 (1980)）は、Ｗ．アンダーソン（W.A
nderson, National Cancer Institute ）から得られ
た。ラットＬ２細胞系はユーワー（Wewer, Dev. Biol.,
93:416-421 (1982)）により説明されている。
【００７０】２．ＲＮＡの調製 ＲＮＡは上記例IIＡ２と同様にして細胞培養物から或い
はストローマン等（Strohman, et al., Cell, 10:265-2
73 (1977) ）により説明されているグアニジン‐塩酸塩
法により調製された。
【００７１】３．ノーザンハイブリダイゼーション ５μｇの全細胞ＲＮＡをメチル水銀／アガロースゲル上
で分離し、ソーベル等(Sobel, et al., Biochemistry，
20: 2678-2684 (1981)）により説明されているアルウィ
ン等（Alwine, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74:
5350-5354 (1977)）の方法によりジアゾベンジルオキシ
メチルセルロース紙（シュライヒャー及びシューエルSc
hleicher and Schuell）に移した。フィルターを上記例
IIＡ５と同様にしてニックトランスレーションされたｃ
ＤＮＡインサートにハイブリダイズした。ラジオオート
グラフの各種時間曝露を濃度測定法により測定して線形
応答範囲を求めた。ブロットをアクチンｃＤＮＡプロー
ブ（クリーブランド等 Cleveland, et al., Cell, 20：
95-105 (1980) により説明された）を用いて、及び熱衝
撃ｃＤＮＡプローブ（ヒッケイ等Hickey, et al., Gen
e，43: 147-154 (1986)により説明された）を用いて逆
スクリーニングして等量のＲＮＡが移されたことを確認
した。
【００７２】４．ラミニン結合アッセイ 各細胞系の細胞当りのラミニンレセプターの数をリオッ
タ等(Liotta, et al.,Exp. Cell Res. 156: 117-126(19
85)）により説明されたように対数生育期細胞に対する
特異的結合（ 125Ｉ）‐標識化ラミニンのScatchard プ
ロットから計算した。 Ｂ．結 果 １．ヒトラミニンレセプターｍＲＮＡの発現 ラミニンレセプターの量及び表面分布は各種癌性ヒト組
織において異ることが従来報告された（ホランハンド等
Horan Hand et al., Cancer Res., 45: 2713-2719(198
5)）。一般的に、悪性組織はそれらの細胞表面上により
多くの未占有ラミニンレセプターを有し、それらのより
良性の対照物よりもより多くのラミニンに結合する。ラ
ミニンレセプターｍＲＮＡレベルがリガンド結合に利用
可能な細胞表面ラミニンレセプターの量の決定に役割を
果たすか否かを決定するためにノーザンブロット実験が
行われた（図１０）。ラミニンレセプターｃＤＮＡイン
サートは推定された大きさのラミニンレセプターを有す
るタンパク質をコード化するのに十分な長さの約１７０
０ベースのｍＲＮＡを認識する。各種ヒト表皮細胞系か
らのハイブリダイズされたＲＮＡのレベルは異った。特
に、転移乳癌細胞系ＭＣＦ‐７からのＲＮＡに対して
は、非転移乳癌細胞系ＺＲ‐７５からのＲＮＡに対する
よりも大きなハイブリダイゼーションがあった。一般的
にハイブリダイズしたＲＮＡのレベルは直接ラミニン結
合アッセイと相関関係があり（図１１）、レセプターの
生合成に利用可能なラミニンレセプターｍＲＮＡの量は
ラミニン基底膜への細胞結合の調節における律速制御工
程であることを示唆する。よって、ヒト腫瘍組織におけ
るラミニンレセプターｍＲＮＡレベルの決定を診断的に
用いてラミニンレセプター含量に基づき腫瘍の相対的攻
撃性或いは治療処法に対する感受性を予測することがで
きる。上記の如く、これは、ラミニンレセプターｃＤＮ
Ａをプローブとして用いる切断された腫瘍物質のノーザ
ンブロットハイブリダイゼーション或いはin situ ハイ
ブリダイゼーションにより達成することができる。ラミ
ニンレセプターｃＤＮＡは周知の次の標準的技術に従う
各種手段により上記操作のためのプローブとして調製さ
れる。例IIＡ５において説明したニックトランスレーシ
ョン操作を用いて（32Ｐ）、（35Ｓ）、或いは（ 3Ｈ）
のいずれかでｃＤＮＡインサートを放射線認識すること
ができる。或いは又、ラミニンレセプターｃＤＮＡイン
サートをプラスミドにサブクローン化してメルトン等
（Melton, et al., Nucleic Acids Res., 12: 7035-705
6 (1984)）により説明される方法により放射線認識ＲＮ
Ａの転写を行うことが可能である。発色検出計を組合わ
されたビオチニル化ＲＮＡ及びＤＮＡハイブリダイゼー
ションプローブも又例えばランガー等（Langer，et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:6633-6637 (1981)）及
びレアリー等（Leary, et al., Proc. Natl. Acad.Sci.
80: 4045-4049(1983) ）により説明されている。
【００７３】２．ラミニンレセプターｍＲＮＡの他の種
における検出 ラットＬ２細胞及びＮＩＨ ３Ｔ３及びＦ９奇形癌など
のネズミ細胞からのＲＮＡ及びそれらの誘導体を含有す
るノーザンブロットも又約１７００塩基のｍＲＮＡを検
出した。このように、ヒトラミニンレセプターｃＤＮＡ
インサートは他の脊椎動物種からのＲＮＡに交差ハイブ
リダイズすることができる（データは示さず）。
【００７４】例 VI ラミニンレセプターの多形性 Ａ．材料及び方法 １．交差ハイブリダイジングラミニンレセプター ｃＤＮＡの同定 例IIＡ４において説明したヒト内皮細胞λｇｔ１１ｃＤ
ＮＡライブリーを用いてＥ．コリ Ｙ１０８８細胞（Ａ
ＴＣＣ ３７１９５）を感染させ、ベントン及びデービ
ス（Benton and Davis, Science, 196: 180-182 (197
7)）のプラークハイブリダイゼーション操作によりλＥ
ＬＲ４からの32Ｐ‐標識化ｃＤＮＡインサートを用いて
スクリーニングした。陽性プラークを上記ベントン及び
デービスに説明されるように、同定及び増幅及び再スク
リーニングして生成した。
【００７５】２．ＤＮＡ配列決定 陽性ファージのｃＤＮＡインサートを例IIＡ６と同様に
してｐＵＣベクターのＥｃｏＲＩ部位中にサブクローン
化し、ｃＤＮＡ配列をギルバート及びマクサム（Gilber
t and Maxam, Proc. Natl. Acad. Sci., 70:3581-3584
(1973)）の方法により決定した。
【００７６】３．ヒトゲノムＤＮＡの単離 ゲノムＤＮＡをブリン等（Blin, et al., Nucleic Acid
s Res., 3: 2303-2308(1976) ）により説明されるよう
にしてドデシル硫酸ナトリウム及びプロティナーゼＫに
よるおだやかな消化により上記例ＶＡ１において説明さ
れたヒト細胞系から単離した。
【００７７】４．サザーンハイブリダイゼーション 上記細胞系並びにヒト肝臓（Ｍ．ヤング M. Young, Na
tional Institute ofD ental Research から取得）
からのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｔIII 、Ｂａ
ｍＨＩ或いはＸｂａＩで徹底的に消化し、アガロースゲ
ル上で電気泳動させニトロセルロース上に移し、上記例
IIＡ５と同様にλＥＬＲ４ ｃＤＮＡにハイブリダイズ
させた。 Ｂ．結 果 １．ｃＤＮＡ配列比較 部分的ｃＤＮＡ配列を組換えファージλＥＬＲ１０、λ
ＥＬＲ１４、λＥＬＲ１０６、λＥＬＲ１１２に対して
決定した。５′ＥｃｏＲｉ部位からλＥＬＲ１４の内部
ＳａｃＩ部位までの配列は図７乃至図８のヌクレオチド
７‐３８１に完全に対応し、λＥＬＲ４からの上流の９
６個の追加の塩基を含む。他の分析されたクローンはλ
ＥＬＲ４配列に対する高い同族性を示すが、しかし、多
数の点突然変異を含有する。他のクローンのそれぞれに
対しては開放翻訳読取り枠はなく、それらが擬ラミニン
レセプター遺伝子のｃＤＮＡであることを示唆する。
【００７８】２．ゲノムＤＮＡ分析 ヒト肝臓及び各種ヒト細胞系からの高分子量ゲノムＤＮ
Ａのサザーンブロット分析は多数のハイブリダイズ化Ｄ
ＮＡバンドを示す。これはヒトゲノム中にその全てが交
差ハイブリダイズする多数のラミニンレセプター遺伝子
があることを示唆する。加えて、各々独特のＤＮＡを含
有する多数のプラークが部分的にＡｌｕＩ／ＨａｅIII
で消化されたヒトゲノムＤＮＡのλシャロン４Ａライブ
ラリー（Ｔ．マニアチス、T. Maniatis ，ハーバード大
学から取得）から上記プラークハイブリダイゼーション
法により単離された。これらの知見は多数の交差ハイブ
リダイズ化ラミニンレセプター遺伝子が同一でないこと
を示唆する。一つの可能性はヒトゲノムが一つの活性ラ
ミニンレセプター遺伝子及び数個の擬遺伝子を含有する
ことである。擬遺伝子から転写されたｍＲＮＡは細胞質
に到達するのに十分安定であり、又、in vitroで転写さ
れてｃＤＮＡを作り、及びそれらの対応するｃＤＮＡは
λＥＬＲ１〜６などの真正ラミニンレセプターｃＤＮＡ
と交差ハイブリダイズし、ノーザンブロットにおける代
替的ハイブリダイゼーションプローブとして用いること
ができる。しかしながら、擬遺伝子の５′末端における
多数の翻訳停止コドンにより、ラミニンレセプタータン
パク質はそれから合成されない。全ての単離ラミニンレ
セプターｃＤＮＡ（開放読取り枠中）が真正のラミニン
レセプターｃＤＮＡとしての資格を有するためにはλＥ
ＬＲ４ ｃＤＮＡ配列により予測されるアミノ酸をコー
ド化する必要がある。
【００７９】例 VII 合成ラミニンレセプターペプチド類 Ａ．材料及び方法 １．合成ラミニンレセプターペプチド類 合成ペプチドＲＴＬＲ２‐２０は図７乃至図８のヌクレ
オチド６６７−７２６から得られ、上記系IVＡ３におい
て説明されている。第一のプロリンが欠失し、スレオニ
ン及びグルタメート残基がそれぞれリジン及びロイシン
により置換されているコントロールペプチドはＲＴＬＲ
２‐コントロールと命名される。合成ペプチドＲＴＬＲ
３は配列Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｓ
ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｔｒ
ｐ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ
−Ｌｅｕ−Ａｒｇを含有し、図７乃至図８におけるヌク
レオチド３７３−４３２から得られた。予測された逆転
を含まないコントロールペプチドも又合成された。コン
トロールペプチドＲＴＣ１は配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ
−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙを含
有する。コントロールペプチドＲＴＣ２は配列Ｇｌｕ−
Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｓ−Ａｒｇを含有する。コントロールペプチドＲＴＣ
３は配列Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇを含有する（図７乃至図８のヌク
レオチド３９７〜４２０から得られる）。全ての合成ペ
プチド類は例ＩＡ３と同様にして逆相ＨＰＬＣにおいて
精製され、周知の標準的方法に従ってペニンシュラ・ラ
ボラトリーズ社（Penninsula Laboratories, Inc.,カリ
フォルニア州、ベルモント）より提供された。
【００８０】勿論、以上に記載されたコード化ラミニン
レセプターのクローンを用いて周知の標準的技術に従っ
てペプチドを合成すすることができる。λＥＬＲ１〜６
クローンはそれらのハイブリッドβ‐ガラクトシダーゼ
ラミニンレセプターペプチド類を発現する能力により選
ばれた。このｃＤＮＡインサート或いはその断片は例え
ばマニアティス等（Maniatis, et al., Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lobo
ratory, ニューヨーク州、コールドスプリングハーバ
ー、４０４〜４３０頁（１９８２））により総括されて
いるように、その他のベクターにサブクローン化して他
の融合タンパク質或いは非融合タンパク質を製造するこ
とができる。
【００８１】２．結合アッセイ Ｇ．トダロ（G. Todaro, National Cancer Institute）
により供給されるＡ２０５８ヒトメラノーマ細胞の、合
成ラミニンレセプターレセプターペプチドの存在下で
の、ラミニンに特異的に結合する能力を例IVＡ４と同様
にして試験した。
【００８２】合成ペプチドＲＴＬＲ２及びＲＴＬＲ３並
びにコントロールペプチドをブラウン等（Brown, et a
l., Bio-chemistry, 18:4901 〜4906 (1979) ）による
ｐ‐ニトロフェニルエステルガラスビーズを用いて、イ
ンキュベーションにより固体支持体に結合した。このビ
ーズはＡ．デイ（A. Day, Medical College of Virgine
a ）から得られた。ペプチドを次いで（Ｉ125 ）ラミニ
ンとインキュベートし、結合（Ｉ125 ）ラミニンの量を
求めた。
【００８３】３．転移アッセイ 転移ＢＬ６ネズミメラノーマ細胞はＩ．ハート博士（D
r. I. Hart, FrederickCancer Research Center,メリー
ランド州、フレデリック）から得た。新たにトリプシン
化した細胞を各種濃度の合成ペプチドＲＴＬＲ２（前
記）と混合し、約５×１０4 個の細胞をリオッタ等（Li
otta et al., Nature, 284: 682-688 (1980)の方法によ
りヌードマウス当り０．１の容量で静脈内（i.v.）注射
した。マウスは各群１０匹であった。動物を３1/2 週に
おいて殺し、転移の数を求めた。同様な疎水性変化のＲ
ＴＣ１などのコントロール合成ペプチドは転移の数に何
等の影響を及ぼさなかった。 Ｂ．結 果 １．結合研究 合成ペプチド類をｃＤＮＡ配列に基づいて製造し（図７
乃至図８）、ラミニンレセプター‐リガンド結合機構を
研究するために用いた。合成ペプチドＲＴＬＲ２の存在
はヒトＡ２０５８メラノーマ細胞のラミニンに結合する
能力を抑制したが、そのコントロール対照物（ＲＴＬＲ
２‐コントロール）は抑制しなかった（図１２）。これ
はそのリガンドに対するレセプターの少なくとも一つの
結合領域がＲＴＬＲ２配列内に含有されていることを示
唆する。更に、各種合成ペプチドを（Ｉ125 ）のラミニ
ンとインキュベートし、結合することのできる標識化リ
ガンドの量を測定したところ、ＲＴＬＲ２‐ペプチドは
ＲＴＬＲ３或いは３個のその他のコントロールペプチド
よりもより多い結合活性を有した（図１３）。そのよう
な研究はｃＤＮＡ‐由来ラミニンレセプターペプチドを
用いて各種生物学的機能に含まれるラミニンレセプター
の特異的領域を求めることができることを示唆する。
【００８４】２．転 移 ｃＤＮＡ配列から発生した合成ペプチド類を用いて癌転
移を抑制することができる。ＢＬ６メラノーマ細胞から
の転移の数は合成ＲＴＬ２断片を細胞と共にマウス中に
共注射した際に減少した（表１）。如何なる理論にも拘
束されるものではないが、合成ラミニンレセプター断片
は転移のコロニー化を防止するものと想定される。その
ような結果は、ｃＤＮＡ発生合成ラミニンレセプター断
片が癌治療における転移の抑制に有用であることを示唆
する。
【００８５】 表１ 合成ラミニンレセプターのＢＬ６メラノーマ 転移を抑制する能力 注射ペプチド量 平均転移数 ０ ４１．３±１０．９ ０．０１μｇ ３１．０±１４．４ ０．１ μｇ ３１．８±１４．０ １．０ μｇ ２９．４±１０．８ １０．０ μｇ ７．９± ６．７（Mann- Whitney U 試験 p<0.001 ） ５×１０4 のＢＬ６メラノーマ細胞を各種濃度の合成ラ
ミニンレセプターＲＴＬＲ２と混合し、各ヌードマウス
（群当り１０匹）に０．１mlの容量で静脈内注射した。
動物を３1/2 週間後に殺し、肺における転移の数を求め
た。
【００８６】ここに説明した具体例及び実施態様は例示
を目的とするのみであり、それに照した各種修正或いは
変化が当業者に示唆され、本願の精神及び趣旨及び冒頭
に掲げた特許請求の範囲に含まれるべきことが了解され
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】精製ラミニンレセプターの均質性を示す。
【図２】精製ラミニンレセプターのＥＬＩＳＡを示す。
【図３】抗ラミニンレセプターモノクローナル抗体のλ
ＥＬＲ６に対する特異性を示す。
【図４】抗ラミニンレセプターモノクローナル抗体のλ
ＥＬＲ６に対する特異性を示す。
【図５】λＥＬＲ１〜６の重畳ラミニンレセプターｃＤ
ＮＡインサートを示す。
【図６】λＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートの配列決定の
術策を図示する。
【図７】得られたタンパク質配列のλＥＬＲｃＤＮＡイ
ンサートのヌクレオチド配列を提供する。
【図８】得られたタンパク質配列のλＥＬＲｃＤＮＡイ
ンサートのヌクレオチド配列を提供する。
【図９】合成ラミニンレセプターペプチドのＥＬＩＳＡ
決定を示す。
【図１０】ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーション
を示す。
【図１１】ラミニンレセプターｍＲＮＡレベルと６個の
ヒト癌細胞系のラミニンに結合する能力との相関関係を
示す。
【図１２】合成ラミニンレセプターペプチドが細胞への
ラミニン結合を抑制することを示す。
【図１３】リガンド結合に含まれる合成ペプチドラミニ
ンレセプターの同定を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/10 7537−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/12 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 7055−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 99:00 (71)出願人 593094257 ロアラー、インターナショナル（ホールデ ィングズ）インコーポレーテッド ＲＯＲＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ （ＨＯＬＤＩＮＧＳ）ＩＮＣ. アメリカ合衆国デラウエアー州、ルイス、 ケープ ヘンローペン ドライブ、40 (72)発明者 ソベル，マーク イー. アメリカ合衆国メリーランド州、ベセス ダ、ブルス、ラン、パークウエイ、9401 (72)発明者 リオッタ，ランス エー. アメリカ合衆国メリーランド州、ポトマッ ク、ミストウッド、ドライブ、9027 (72)発明者 ウイワー，ウルラ エム. アメリカ合衆国メリーランド州、ロックビ ル、グロブナー、プレイス、ナンバー、 1404、1201 (72)発明者 ジェイ，マイケル シー. アメリカ合衆国バージニア州、アーリント ン、エス、セカンド、ストリート、3017 (72)発明者 ドロハン，ウイリアム エヌ. アメリカ合衆国バージニア州、スプリング フィールド、オークフォード、ドライブ、 8417

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記ヌクレオチド配列 【化１】 から得られる下記配列の合成ペプチド： 【化２】
  2. 【請求項２】次のアミノ酸配列を含んでなることを特徴
    とする合成ペプチド： Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａ
    ｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓ
    ｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
    −Ａｌａ。
  3. 【請求項３】次のアミノ酸配列を含んでなることを特徴
    とする合成ペプチド： Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌ
    ｅｕ−Ａｒｇ。
  4. 【請求項４】次のアミノ酸配列を含んでなることを特徴
    とする合成ペプチド： Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａ
    ｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｉｌｅ。
  5. 【請求項５】薬学的に許容可能な担体及び生育抑制量の
    ラミニンに対する結合に対して癌細胞と拮抗する能力を
    有する請求項２に記載のペプチドを含んでなることを特
    徴とする癌細胞の転移を抑制するための治療組成物。
  6. 【請求項６】薬学的に許容可能な担体及び生育抑制量の
    ラミニンに対する結合に対して癌細胞と拮抗する能力を
    有する請求項３に記載のペプチドを含んでなることを特
    徴とする癌細胞の転移を抑制するための治療組成物。
  7. 【請求項７】薬学的に許容可能な担体及び生育抑制量の
    ラミニンに対する結合に対して癌細胞と拮抗する能力を
    有する請求項４に記載のペプチドを含んでなることを特
    徴とする癌細胞の転移を抑制するための治療組成物。
JP5116331A 1986-09-26 1993-04-20 ラミニンレセプターをコード化する組換えｄｎａクローンのヌクレオチド配列から誘導される合成ペプチド Pending JPH06107691A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/911,863 US4861710A (en) 1986-09-26 1986-09-26 Recombinant DNA clone encoding laminin receptor
US911863 1986-09-26

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62506395A Division JP2533595B2 (ja) 1986-09-26 1987-09-23 ラミニンレセプタ―をコ―ド化する組換えｄｎａクロ―ン

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH06107691A true JPH06107691A (ja) 1994-04-19

Family

ID=25431000

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62506395A Expired - Lifetime JP2533595B2 (ja) 1986-09-26 1987-09-23 ラミニンレセプタ―をコ―ド化する組換えｄｎａクロ―ン
JP5116331A Pending JPH06107691A (ja) 1986-09-26 1993-04-20 ラミニンレセプターをコード化する組換えｄｎａクローンのヌクレオチド配列から誘導される合成ペプチド
JP7248671A Expired - Lifetime JP2825780B2 (ja) 1986-09-26 1995-09-01 ラミニンレセプターをコードする組換えｄｎａクローン由来のプローブ

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62506395A Expired - Lifetime JP2533595B2 (ja) 1986-09-26 1987-09-23 ラミニンレセプタ―をコ―ド化する組換えｄｎａクロ―ン

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7248671A Expired - Lifetime JP2825780B2 (ja) 1986-09-26 1995-09-01 ラミニンレセプターをコードする組換えｄｎａクローン由来のプローブ

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4861710A (ja)
EP (1) EP0324788B1 (ja)
JP (3) JP2533595B2 (ja)
AT (1) ATE108188T1 (ja)
CA (1) CA1305678C (ja)
DE (1) DE3750180T2 (ja)
WO (1) WO1988002407A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020505064A (ja) * 2017-01-12 2020-02-20 ロジャース アルピ 治療用ペプチド

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04502101A (ja) * 1988-08-31 1992-04-16 ダナーファーバー・キャンサー・インスティテュート ヒト・ラミニン結合タンパク質をコードする完全な長さのｃＤＮＡ
US5175251A (en) * 1989-05-04 1992-12-29 Sri International Antimetastatic peptides with laminin activity
CA2040099A1 (en) * 1990-05-01 1991-11-02 Mariano Barbacid Tyrosine kinase negative trkb
AU5544500A (en) * 1999-06-15 2001-01-02 Astrazeneca Ab Livin; inhibitor-of-apoptosis protein-3 (iap-3)
AU2001285568A1 (en) * 2000-07-28 2002-03-22 Michael Andrew Mcguckin Mucin
US20030118585A1 (en) * 2001-10-17 2003-06-26 Agy Therapeutics Use of protein biomolecular targets in the treatment and visualization of brain tumors
CA2502479A1 (en) * 2004-12-01 2006-06-01 Procyon Biopharma Inc. Laminin receptor binding molecule
EP2330122A1 (en) 2009-12-02 2011-06-08 Asklepios Kliniken Hamburg Gmbh OFA/iLRP derived modified peptide

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60500974A (ja) * 1983-04-04 1985-06-27 アメリカ合衆国 結合分析法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4628027A (en) * 1982-05-19 1986-12-09 Molecular Engineering Associates, Ltd. Vitro diagnostic methods using monoclonal antibodies against connective tissue proteins
US4589881A (en) * 1982-08-04 1986-05-20 La Jolla Cancer Research Foundation Polypeptide
US4699877A (en) * 1982-11-04 1987-10-13 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detecting human tumors

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60500974A (ja) * 1983-04-04 1985-06-27 アメリカ合衆国 結合分析法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020505064A (ja) * 2017-01-12 2020-02-20 ロジャース アルピ 治療用ペプチド

Also Published As

Publication number Publication date
DE3750180T2 (de) 1994-11-03
EP0324788A4 (en) 1990-03-28
JPH02500637A (ja) 1990-03-08
EP0324788B1 (en) 1994-07-06
CA1305678C (en) 1992-07-28
JPH0880200A (ja) 1996-03-26
DE3750180D1 (de) 1994-08-11
JP2533595B2 (ja) 1996-09-11
ATE108188T1 (de) 1994-07-15
WO1988002407A1 (en) 1988-04-07
EP0324788A1 (en) 1989-07-26
JP2825780B2 (ja) 1998-11-18
US4861710A (en) 1989-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3051894B2 (ja) ヒト網膜芽腫ポリペプチドに対する抗体及び網膜芽腫ポリペプチドの検出方法
JP3844366B2 (ja) 前立腺ガンの免疫診断のための化合物およびそれらの使用方法
US5258288A (en) Vector containing DNA encoding mature human protein S
US5122599A (en) CDNAS coding for members of the carcinoembryonic antigen family
KR19990087802A (ko) 전립선암의 면역치료 및 면역진단을 위한 화합물 및 방법
JP2002533056A (ja) 肺癌の治療および診断のための化合物および方法
JP4201057B2 (ja) ヒト転移サプレッサー遺伝子ｋａｉｉに由来する試薬を使用する診断方法及び遺伝子療法
US5698439A (en) Novel malignant cell type markers of the interior nuclear matrix
JPH09511910A (ja) 腫瘍サプレッサ遺伝子、並びに癌の検出、腫瘍進行のモニタおよび癌処理のための方法
WO1999028459A1 (en) Examination method, examination reagent and remedy for diseases caused by variation in lkb1 gene
JPH06107691A (ja) ラミニンレセプターをコード化する組換えｄｎａクローンのヌクレオチド配列から誘導される合成ペプチド
US5753437A (en) Method of diagnosing cancer susceptibility or metastatic potential
EP0206200B1 (en) Human cholinesterase-type proteins and their production
WO1989001773A1 (en) Synovial phospholipases
US5426044A (en) Minactivin compositions and antibodies to minactivin
JPH03164179A (ja) Ｔｎｆレセプター、ｔｎｆ結合たん白質およびこれらをコードするｄｎａ
US6379951B1 (en) Compounds for immunotherapy of breast cancer and methods for their use
EP0561172A1 (en) Recombinant DNA Clone Encoding Laminin Receptor
JPH07289297A (ja) 癌抑制遺伝子
JP3729924B2 (ja) ｐ５３ 標的蛋白質ＧＭＬ
US6284241B1 (en) Compounds for immunotherapy and diagnosis of colon cancer and methods for their use
US7008772B1 (en) Compounds for immunodiagnosis of prostate cancer and methods for their use
JP2009195236A (ja) 乳癌の免疫療法および診断のための化合物ならびにそれらの使用のための方法
EP0714981A2 (en) PRLTS proteins and DNA&#39;s encoding the same
JPH09252788A (ja) ヒトムチン（ｍｕｃ８）