HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Technisches Feld
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Die Erfindung betrifft Laminin bindende Peptidfragmente.
Stand der Technik
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Laminin ist ein Hauptglycoproteinbestandteil der Basismembranen
und vermittelt das Binden sowohl von epithelialen als auch
neoplastischen Zellen an die Basismembran. Die Basismembran ist
ein allgegenwärtiger spezialisierter Typ einer extrazellulären
Matrix, die Organparenchymzellen von dazwischen liegendem
kollagenartigem Stroma trennt. Die Wechselwirkung von Zellen mit
dieser Matrix ist ein wichtiger Aspekt sowohl von normalen als
auch von neoplastischen zellulären Vorgängen. Normale Zellen
scheinen die extrazelluläre Matrix zum Überleben, zur
Proliferation und zur Differenzierung zu benötigen, wohingegen
wandernde Zellen, sowohl normale als auch neoplastische, die
Basismembran bei der Bewegung von einem Gewebe zu einem anderen
durchqueren müssen. Insbesondere metastasierende Krebszellen, die
in schuppenartigem oder drüsenartigem Epithel auftreten, müssen
die Basismembran durchqueren, um in das Kreislaufsystem oder das
lymphatische System einzutreten (Intravasation). Die
zirkulierenden neoplastischen Zellen werden typischerweise in den
Kapillarbetten eines Organs festgehalten, dringen in die
Blutgefäßwände ein und penetrieren in die Basismembran zum
extravaskulären Gewebe (Extravasation), wo ein sekundärer Tumor
etabliert wird. Durch Vermittlung der Bindung sowohl von
epithelialen als auch neoplastischen Zellen an die Basismembran
spielt der Lamininrezeptor eine kritische Rolle unter anderem bei
Metastaseprozessen. Die US-PS 4 565 789 beschreibt die
Isolierung und die Charakterisierung einiger Aspekte des
Lamininrezeptors. Eine geklonte DNA-Sequenz zum Aufschlüsseln des
Zelloberflächenrezeptors für Laminin ist bisher nicht
bekannt.
Zusammenfassung der Erfindung
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Es ist deshalb ein Ziel der Erfindung, ein synthetisches Fragment
oder Fragmente des Lamininrezeptors bereitzustellen, welche die
Metastasenbildung hemmen.
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Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren
zur Herstellung großer Mengen synthetischer Lamininrezeptoren
bereitzustellen.
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Es ist ein zusätzliches Ziel der Erfindung, synthetische
Lamininrezeptor-Fragmente bereitzustellen, die bestimmte Bereiche,
wie die membranüberspannenden und Liganden bindenden Bereiche
aufschlüsseln.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Diese und andere Ziele, Merkmale und viele der zu erwartenden
Vorteile der Erfindung werden nach der Literatur der folgenden
detaillierten Beschreibung im Zusammenhang mit den begleitenden
Figuren besser verständlich.
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Fig. 1 zeigt die Homogenität des gereinigten Lamininrezeptors.
Der obere Teil zeigt den Vergleich des gereinigten
Lamininrezeptors aus einem Darmkarzinom und aus normalem
menschlichem Plazentagewebe. Die mit 1 M NaCl aus der Laminin-
Sepharose-Affinitätssäule eluierten Materialien wurden mittels
NaDodSO&sub4;-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (7%) in Gegenwart von
Dithiothreitol untersucht und durch Silberfärbung sichtbar
gemacht. Die Tafel verdeutlicht die geringfügige Variabilität des
Molekulargewichts (68.000-72.000) zwischen den Präparationen
des Lamininrezeptors. Bahn P1: Lamininrezeptor (1 ug),
isoliert
aus menschlichem Plazentagewebe. Bahn Ca: Lamininrezeptor (3 ug),
isoliert aus einem menschlichen Darmkarzinom. Bahn M:
Molekulargewicht-Marker: Phosphorylase b
(94.000), Rinderserumalbumin (67.000) und Ovalbumin (43.000).
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Der untere Teil zeigt die isoelektrische Fokussierung und
zweidimensionale Gelelektrophorese des gereinigten
Lamininrezeptors. Die Probe des Darmkarzinom-
Lamininrezeptorproteins (0,1 ug), die oben gezeigt wurde, war mit
J¹²&sup5; radioaktiv markiert und wurde einer isoelektrischen
Fokussierung (pH-Bereich 5-7) und einer zweidimensionalen
Gelelektrophorese auf einem 10% NaDodSO&sub4;-Polyacrylamidgel
unterzogen. Molekulargewicht-Marker: Phosphorylase b (93.000),
Rinderserumalbumin (66.000), Glyceraldehyd 3-
Phosphatdehydrogenase (36.000).
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Fig. 2 zeigt ein ELISA des gereinigten Lamininrezeptors. Jeder
Mikrotiternapf wurde mit einem gereinigten Tumor-Lamininrezeptor
beschichtet und zwei Stunden lang mit LR1-monoklonalem Antikörper
2H5 ( ), Antialbumin ( ) oder monoklonaler Anti-α-Amylase
Antikörper ( ) umgesetzt. Die Antikörper wurden nachgewiesen
unter Verwendung von peroxidasegebundenem Ziegenantimaus-IgM oder
peroxidasegebundenem Schweineantikaninchen-IgG.
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Fig. 3 zeigt die Spezifität des monoklonalen Antilamininrezeptor-
Antikörpers für λ ELR6-Plaques. Filter, die etwa 50 bis 100
gereinigte λ ELR6 Plaque enthielten, wurden entweder mit einem
monoklonalem Antikörper gegen den Lamininrezeptor, einem
monoklonalem Antikörper gegen Anti-α-Amylase, einem Antialbumin-
Antikörper oder einem Antilaminin-Antikörper umgesetzt. Das
Binden der Antikörper wurde unter Verwendung eines
peroxidasegebundenen zweiten Antikörpers nachgewiesen.
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Fig. 4 zeigt die überlappenden Lamininrezeptor-cDNA-Insertionen
von λ ELR1-6. Die obere Linie ist ein Diagramm des Model λ ELR
rekombinierten λgt11-Phagen, welches die zwei KpnI-Stellen (K) an
der linken Seite der cDNA-Insertionen zeigt. Die Box zeigt die
cDNA-Insertion. Die linke EcoR1-Stelle lag in keiner Insertion
vor. Die rechte EcoRI-Stelle (E) ist gezeigt. Die Transkription
von lacZ-Gen von λgt11 verläuft vom rechten Arm des Phagen zu dem
linken durch E. Der Bereich, der sich von der KpnI-Stelle (am
nächsten zu der cDNA-Insertion) zur EcoR1-Stelle der größten
cDNA-Einfügung (λELR4) erstreckt, ist vergrößert und unten
gezeigt. Der gestrichelte Bereich in der cDNA-Insertionsbox
zeigt das PstI-SphI-Restriktionsfragment, das aus einem Subklon
von λELR4 (siehe Fig. 5) isoliert, nicktranslatiert und als
Hybridisierungsprobe benutzt worden war. Die gemeinsamen SacI (S)
und HindIII (H)-Stellen, die im Text beschrieben sind, sind
angezeigt. Phagen-DNA von jedem der λELR-rekombinierten Phagen
wurden mit KpnI und EcoRI hydrolisiert und elektrophoretisch über
ein 1% Agarosegel getrennt, auf Nitrocellulose überführt und
energisch mit dem beschriebenen pstI-SphI-Restriktionsfragment
hybridisiert. Die Länge des KpnI-EcoRI-Restriktionsfragments
jedes λElR-rekombinierten Phagen, der mit der Probe hybridisiert
worden war, wurde über der Radioautographie des Blots
aufgezeichnet und durch Vergleich mit Standard λ/HindIII
Verdauungen bestimmt.
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Fig. 5 zeigt die Vorgehensweise bei der Sequenzierung des cDNA-
Insertion von λELR4. Das Restriktionsmuster der subklonierten
Insertion von λELR4 ist oben gezeigt. E ist das 5' EcoRI-Ende der
Insertion. H:HinfI, S: SphI, R:RsaI, P:PstI, *: Ochre-
Terminationscodon. Die Pfeile zeigen die Sequenzierungsrichtung
der markierten Fragmente entweder durch Phosphorylierung am 5'
Ende mit (γ-P³²)-ATP ( ) oder durch Schneiden am 3' Ende mit (α-
P³²)-Didesoxy ATP ( ) oder durch das Didesoxy-Syntheseverfahren
(r). Die zur Sequenzierung verwendeten Subklone waren pLR4-1,
pLR4-2 und pLR4-4.
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Fig. 6 liefert die Nukleotidsequenz der λELR cDNA-Insertion mit
der davon abgeleiteten Proteinsequenz unten. An der rechten Seite
jeder Linie wird die Anzahl der Basenpaare jedes künstlichen
EcoRI-Endes (Basen 1-6) gezeigt.
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Fig. 7 zeigt die ELISA-Bestimmung des synthetischen
Lamininrezeptorpeptids. Das synthetische Lamininrezeptorpeptid
RTLR2 wurde erzeugt aus der cDNA-Sequenz in Fig. 6 und unter
Verwendung verschiedener Verdünnungen von Kaninchen-
Antilamininrezeptor-Antiserum oder Perimunserum mittels ELISA
untersucht.
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Fig. 8 zeigt eine Blot-Hybridisierung eines RNA-Gels. Die
zelluläre Gesamt-RNA wurde aus verschiedenen Brustkarzinom-
Zellinien extrahiert, getrennt auf Methylquecksilberagarosegel
und auf ein Diazobenzyloxymethylcellulosepapier übertragen. Der
Filter wurde mit der nicktranslatierten (³²P) markierten EcoRI-
PstI-Insertion von pLR4-1 hybridisiert. Die Länge der
hybridisierten mRNA-Arten wurde durch Vergleich mit bekannten
Größen von rRNA und mit den Größen von λDNA, die mit HindIII
hydrolysiert worden waren, verglichen. Bahn 1: MCF-7 (Eltern);
Bahn 2: MCF7-3E5; Bahn 3: MCF7-5H7; Bahn 4: ZR75.
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Fig. 9 zeigt die Korrelation der Lamininrezeptor mRNA-Mengen mit
der Fähigkeit von sechs menschlichen Karzinomzellinien, Laminin
zu binden. Zu verschiedenen Zeitpunkten vorgenommene
Radioautographien, wie gezeigt in Fig. 8, wurden densitometrisch
gemessen, um einen linearen Antwortbereich zu bestimmen. Die
geringste Menge hybridisierter RNA in dieser Reihe wurde mit der
Nr. 1,0 bezeichnet und alle anderen Werte, relativ auf diesen
Wert bezogen, berechnet. Die Anzahl der Lamininrezeptoren je
Zelle für jede Zellinie wurde durch Scatchardplots von
spezifischen an Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase
gebundenen (J¹²&sup5;)-Laminin berechnet. Eine lineare
Regressionsanalyse ergab einen Korrelationskoeffizienten von
0,97. MCF-7 Eltern , MCF-7 Klon 5H7 Δ, MCF-7 Klon 3E5 ,
ZR-75 , Nierenkarzinom A-704 , Panc-1 ;
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Fig. 10 zeigt, daß das synthetische Lamininrezeptorpeptid das
Binden von Laminin an die Zellen hemmt. Die Fähigkeit von A2058,
menschliche Melanomazellen spezifisch an Laminin zu binden,
wurde in Gegenwart verschiedener Mengen RTLR2- oder RTLR2-
Kontroll -Fragmenten getestet, die aus der cDNA-Sequenz der
Fig. 6 erzeugt worden waren. Die Werte wurden bezogen auf die
Menge gebundenen Laminins in Abwesenheit der hinzugefügten
Fragmente ausgedrückt.
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Fig. 11 zeigt die Identifizierung der synthetischen
Peptidlamininrezeptorfragmente, die bei der Bindung der Liganden
beteiligt waren. Peptidfragmente, die aus einer cDNA-Sequenz mit
vorhergesagter reverser Umkehrkonformation (RTLR2, RTLR3)
erzeugt worden waren, wurden ebenso wie Kontrollpeptide an
Glaskügelchen gebunden und mit (I¹²&sup5;) Laminin inkubiert. Die
gezeigten Werte sind die Anzahl von cpm · 10&supmin;³, gebunden an die
Kügelchen nach Substraktion der cpm, die an die Kügelchen ohne
Fragment gebunden worden waren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die obigen und verschiedene andere Ziele und Vorteile der
Erfindung werden erreicht, durch Peptidfragmente mit einer
Aminosäuresequenz nach Anspruch 1.
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Sofern anderes nicht angegeben ist, haben alle hier verwendeten
wissenschaftlichen und technischen Fachbegriffe dieselbe
Bedeutung wie sie im allgemeinen durch einen einschlägigen
Fachmann verstanden werden. Obwohl, verglichen mit den hier
beschriebenen Verfahren und Materialien, ähnliche oder
äquivalente zur Durchführung oder zum Testen der Erfindung
verwendet werden können, werden nun die bevorzugten Verfahren und
Materialien beschrieben. Alle hier erwähnten Veröffentlichungen
werden durch Bezugnahme darauf in die Offenbarung eingeschlossen.
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Das Verfahren zur Herstellung und zum Isolieren des
rekombinierten cDNA Klons, der in Fig. 6 gezeigt ist, ist ferner
detailliert in Beispiel II beschrieben und schließt die folgenden
allgemeinen Stufen, die gut bekannte Standardtechniken betreffen,
ein:
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a) cDNA wird unter Verwendung einer mRNA-Schablone aus
menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelialzellen synthetisiert.
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b) Die Endothelialzellen-cDNA wird in den λgt11 Vektor
(ATCC 37194) eingefügt.
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c) Der rekombinierte λgt11 wird verpackt und verwendet, um
Escherichia coli 1090-Zellen (ATCC 37197) zu infizieren.
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d) Die erhaltene λgt11 Expressionsbibliothek der Expression der
endothelialen menschlichen cDNA wurde mit einem monoklonalen
Antikörper durchmustert, der einen Bereich, des bei der
Bindung von Laminin involvierten menschlichen Lamininrezeptors
erkennt.
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e) Sechs Kollonien, bezeichnet als λELR1-6, werden auf diese
Weise isoliert und gereinigt (Fig. 3) und die cDNA-Insertionen
durch Kartierungen mittels Restriktionsendonuklease
analysiert, wobei ein gemeinsamer Bereich festgestellt wurde,
der anzeigt, daß dieser für das Epitop des Lamininrezeptors,
welches durch den monoklonalen Antikörper erkannt worden ist,
kodiert (Fig. 4).
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f) Die größte cDNA-Insertion der sechs gereinigten Phagen wurde
in Plasmidvektoren subkloniert, um die weitere Analyse und
DNA-Sequenzierung zu erleichtern. Die EcoRI-Stelle, die die
cDNA-Insertion mit dem linken Arm von λgt11 verbindet, fehlt
in allen sechs Klonen. Eine PvuII-Stelle 11 bp wird deshalb
zur Reinigung der cDNA-Insertion des größten rekombinierten
Phagen, ELR4, verwendet. Das EcoRI-PvuII-Restriktionsfragment
von ELR4 wird in die EcoRI-PvuII-Stellen von pBR322 zur
Herstellung von pLR4-1 subkloniert.
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Der rekombinierte cDNA-Klon pLR4-1, überführt in den Wirt E. coli
Zellinie C600r&supmin;m&supmin; (ATCC 33525), wie er erfindungsgemäß erhalten
wurde, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC),
Rockville, MD unter der Accession Number 67199 hinterlegt. Auf
Nachfrage wird der Kommissionär des PTO Zugang zu der
Hinterlegung haben und nach Herausgabe des Patents wird die
Hinterlegung wenigstens 5 Jahre nach der letzten Nachfrage oder
wenigstens 30 Jahre oder während der Lebensdauer des Patents in
Kraft sein und der Öffentlichkeit ohne Beschränkung,
selbstverständlich im Rahmen der gesetzlichen Vorgaben, verfügbar
sein.
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Das Verfahren zur endgültigen Identifizierung der Erfindung
basiert auf dem Vergleich der cDNA-Sequenz des rekombinierten
Plasmids (Fig. 6) mit der Aminosäuresequenz eines durch
Bromcyanspaltung erzeugten Oktapeptids des gereinigten
Plazentalamininrezeptors. Die Verfahrensweise zum Erhalt der Oktapeptid-
Aminosäuresequenz ist detaillierter in Beispiel I beschrieben und
schließt die folgenden allgemeinen Stufen, einschließlich
bekannter Standardtechniken ein.
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a) Mikrosomale Membranen aus menschlichem Plazentagewebe werden
aufbereitet und solubilisiert.
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b) Die solubilisierte Mikrosomenmembran enthaltende Präparation
wird über eine Affinitätsmatrix gereinigter Lamininsepharose
4B gegeben und nach intensivem Waschen wurde das
Lamininrezeptorprotein mit hoher Affinität von den Liganden
durch eine Lösung einer hohen Salzkonzentration (1M NaCl)
eluiert.
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c) Die Homogenität des menschlichen Plazentalamininrezeptors wird
durch zweidimensionale Gelelektrophorese (Fig. 1) und einen
enzymgebundenen Immunoadsorptionstest (ELISA) (Fig. 2)
untersucht.
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d) Der menschliche Plazentalamininrezeptor wird mit Bromcyan
gespalten und die erhaltenen Peptide fraktioniert durch
Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (HPLC).
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e) Die Mikrosequenzanalyse eines Plazentaoligopeptids ergab ein
Oktapeptid mit der einzigen Sequenz Met-Leu-Ala-Arg-Glu-Val-
Leu-Arg.
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Ein anderes Verfahren zur Identifizierung der Erfindung
basierte auf der Fähigkeit von Kaninchenantiserum, das gegen den
Lamininrezeptor von menschlichem methastasierendem Brustkarzinom
gerichtet ist, ein synthetisches Peptid (durch ELISA), das aus
der cDNA-Sequenz von pLR4-1 (Fig. 7) erzeugt worden ist, zu
erkennen. Die Verfahrensweise zum Erhalt des Antilamininrezeptor-
Antiserums ist detaillierter in Beispiel 4 beschrieben und
schließt die folgenden allgemeinen Verfahrensstufen,
einschließlich bekannter Standardtechniken ein:
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a) Der Lamininrezeptor eines menschlichen methastasierenden
Brustkarzioms wird gereinigt, wie oben für den
Plazentalamininrezeptor beschrieben ist.
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b) Die Homogenität des Tumorlamininrezeptors wird untersucht,
wie es oben für den Plazentalamininrezeptor beschrieben ist.
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c) Kaninchen werden durch subkutane Injektionen des
Tumorlamininrezeptors, der aus NaDodSo&sub4;-Polyacrylamidgelen ausgeschnitten
worden ist, immunisiert.
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Aus der cDNA-Sequenz von pLR4-1 erzeugte synthetische Peptide
sind nützlich zur Behandlung von Krebs, um die Bildung von
Metastasen zu hemmen. Die hier beschriebenen Verfahren basieren
auf der Beobachtung, daß die Basismembran in gutartigen Tumoren
eine kontinuierliche Struktur ist und daß Lamininrezeptoren
gutartiger Zellen durch Bindung an die Basismembran besetzt sind.
Im Gegensatz dazu ist die Basismembran angrenzend an eindringende
Tumorzellen nicht kontinuierlich. Eindringende Tumorzellen
könnten somit die Anzahl von Lamininrezeptoren auf der
Zelloberfläche, die nicht an Liganden gebunden sind, erhöht
haben. Es ist die Verfügbarkeit der Lamininrezeptorstellen auf
metastasierendem Karzinomzellen, die ein wichtiges Konzept bei
der Handhabung und Diagnose von Krebs ist. Die Aggressivität
eines Karzinoms, die definiert ist als die Neigung einer
Tumorzelle dieses Karzinoms, aus dem primären Tumor in
angrenzendes normales Gewebe zu wandern und seine Neigung, sich
zu entfernten Stellen des Körpers auszubreiten, um
metastasierende Klone zu iniziieren, ist dann teilweise ein
Ausdruck der Anzahl invasiver Zellen mit mehr verfügbaren
Lamininrezeptoren.
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Synthetisch, aus der cDNA-Sequenz von pLR4-1 erzeugte
Peptide binden spezifisch an radiomarkiertes Laminin (Fig. 11).
Die Gegenwart des synthetischen Peptids in Lamininbindungsstudien
hemmte die Fähigkeit dieser Zellen, an Laminin zu binden
(Fig. 10). Folglich können synthetische Peptide kompetitieren und
die Fähigkeit der Lamininrezeptoren, an der Zelloberfläche
Laminin zu binden, blockieren. Wenn das Peptid mit BL6-
Melanomazellen vermischt und intravenös in eine Maus injiziert
wird, verringert sich die Anzahl der Metastasen von BL6-Zellen
(Tabelle 1). Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird
angenommen, daß die synthetischen Lamininrezeptorfragmente mit
Zellen zum sofortigen Binden an der Basismembranen kompetitieren
und so metastasierende Zellen von der Koloniebildung abhalten.
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Darauf basierend ist es einleuchtend, daß die Erfindung in einer
Vielzahl von Therapiewegen für Krebs ebenso wie bei anderen
Krankheiten, die sich aus der anormalen Erkennung von Laminin
durch Zellen ergeben, verwendet werden kann. Besondere Beispiele
zur Erläuterung der Erfindung werden nun beschrieben.
BEISPIEL I
Identifizierung eines einzigen menschlichen
Plazentolamininrezeptor-Oktapeptids
A. Materialien und Verfahren
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1. Gewebe - Gewebe von Lebermetastasen aus einem menschlichen
Brust- und Darmkarzinom wurden vom Pathologielabor des
National Cancer Instituts und vom Department of Pathology,
Glostrup Hospital, Kopenhagen erhalten. Menschliche Plazenten,
erhalten von normalen Entbindungen, wurden durch das National
Naval Medical Center, Bethesda, MD bereitgestellt.
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2. Reinigung des Lamininrezeptors - Tumorgewebe (100-300g) oder
Plazentagewebe (500g) wurde in einem Waringmischer in 5 Vol.
(Gew.-Vol.) phosphatgepufferter Salzlösung (137 mM NaCl/1,7 mM
KCl/8,1 mM Na&sub2;HPO&sub4;/1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;, pH 7,2) homogenisiert. In
diesen und die anderen Puffer wurden die folgenden
Proteaseinhibitoren gegeben: 50 ug/ml
Phenylmethylsulfonylfluorid, 5 mM Benzamidin, 10 ug/ml Aprotinin, 50 ug/ml
Sojabohnentrypsin-Inhibitor und 5 mM
beta-Hydroxyquecksilberbenzoat. Nach zehnminütigem Zentrifugieren bei 500 · g
wurden die Homogenate 1 : 1 (Vol/Vol) in 0,3 M Saccharose/25 mM
Tris-HCl, pH 7,3 verdünnt, auf Eis mit einem Brinkmanpolytron
beschallt, 20 Minuten bei 4ºC bei 15.000 · g zentrifugiert und
schließlich der Überstand 90 Minuten lang bei 4ºC und 143.000 · g
ultrazentrifugiert. Die mikrosomalen Membranen in den erhaltenen
Pellets wurden resuspendiert bei 10mg Protein/ml in 25 mM Tris-
HCl, pH 7,3/150 mM NaCl/1 mM CaCl&sub2;/3 mM MgCl&sub2; und im gleichen
Volumen von 1%igem Octylphenoxypolyethoxyethanol (Nonidet P-40,
Sigma)/25 mM Tris-HCl, pH 7,2/150 mM NaCl/1 mM CaCl&sub2;/3 mM MgCl&sub2;
und sechs Stunden lang bei 4ºC bei End-over-end-Rotation
extrahiert.
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Die Präparation wurde eine Stunde lang bei 4ºC und 200.000 · g
ultrazentrifugiert und der Überstand anschließend 10 Stunden lang
bei 4ºC mit 2 ml Sepharose-Lamininaffinitätsmatrix inkubiert,
welche hergestellt wurde durch Kuppeln von 2 mg Laminin
(gereinigt wie durch Timpl et al., J. Biol. Chem., 254 : 9933-9937
(1979), beschrieben) je ml CBrN-aktivierter Sepharose 4B®
(Pharmazia). Die Sepharoselamininmatrix wurde anschließend 10 mal
in 25 mM Tris-HCl, pH 7,3/150 mM NaCl/1 mM CaCl&sub2;/1 mM MgCl&sub2;/0,05%
Nonidet P-40 und einmal im selben Puffer, der 400 mM NaCl
enthielt, gewaschen. Laminin-Sepharosematrix wurde dann in eine
2 ml Säule gepackt. Die Proteinfraktionen wurden bei
Raumtemperatur mit 1 M NaCl/50 mM Tris-HCl, pH 7,3 eluiert,
sofort auf Eis gelagert, gegen kaltes destilliertes H&sub2;O
dialysiert und durch Lyophilisation konzentriert.
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3. Bromcyan-Verdauung und Mikrosequenzierung - Gereinigter
Lamininrezeptor wurde mit Bromcyan, wie durch Ozols et al., J.
Biol. Chem., 252 : 5986-5989 (1977), beschrieben, verdaut in 400 ul
0,1% Trifludressigsäure/Acetonitril gelöst und in Form von 2, 200
ul Injektionen auf eine Umkehrphasensäule 25 cm · 4, 1 mm PRP-1
(Hamilton) bei einer Flußgeschwindigkeit von 2 ml/Minute
aufgegeben. Die Aminosäure-Sequenzierung der durch
Bromcyan erzeugten Fragmente wurde unter Verwendung eines Modell
470 A Gasphasen-Proteinsequenzers (bereitgestellt von Bio
Systems, Foster City, CA) mit einen daran angeschlossenen Modell
120A PTH-Analyser unter Verwendung des Programms des Herstellers
03RPTH durchgeführt.
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4. Enzymgebundener Immunoadsorptionstest (ELISA) - Die
ELISAS wurden gemäß Engvall, Methods Enzymol., 70 : 419-439 (1980)
durchgeführt. Die eingesetzten Antikörper schlossen ein einen
monoklonalen IgM Maus-Antikörper 2H5 (LR-1) gegen den
Humanlamininrezeptor, wie durch Liotta et al., Exp. Cell Res.
156 : 117-126 (1985), Kaninchen-Antihumanalbumin (Miles) und
monoklonaler Maus-IgM-Antikörper gegen -Amylase (erhalten von R.
Siraganian, National Institue of Dental Research). Die
gebundenen Antikörper wurden nachgewiesen unter Verwendung von
peroxidasegebundenem Kaninchen-Antimaus-IgM (Kierkegaard and
Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) oder peroxidasegebundenem
Ziegen-Antikaninchen-IgG (Kierkegaard and Perry Laboratories).
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5. Gelelektrophorese - Proteinproben wurden durch
NaDodSO&sub4;-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von
Dithiothreitol nach dem Verfahren von Laemmli, Nature (London),
227 : 680-685 (1970) analysiert. Isoelektrische Fokussierung und
zweidimensionale NaDodSO&sub4;-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurden
durchgeführt wie durch O'Farrell, J. Biol. Chem., 250 : 4007-4021
(1975) und Wirth et al., Cancer Res., 46 : 400-413 (1986)
beschrieben. Immunoblotting wurde mit einem monoklonalen
Antilamininrezeptor-Antikörper 2H5, wie oben beschrieben durch
Liotta et al. (1985), durchgeführt.
B. Ergebnisse
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1. Reinigung des menschlichen Lamininrezeptors -
Isolierung präparativer Mengen des gereinigten Lamininrezeptors
wurde vervollständigt durch Aufgabe solubilisierter mikrosomale
Membranen enthaltenden Präparationen aus menschlichem
metastasierendem Brust- und Darmkarzinomen und von menschlichem
Plazentagewebe auf eine Affinitätsmatrix für Laminin-Sepharose
4B, anschließendes intensives Waschen der Affinitätsmatrix und
Eluierung des Rezeptorproteins von den Liganden durch eine Lösung
mit einer hohen Salzkonzentration (1 M NaCl). Bei der Analyse
mittels NaDodSO&sub4;-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Fig. 1A), hatte
das gereinigte Protein aus dem Brustkarzinom und dasjenige aus
dem Darmkarzinom ein ungefähres scheinbares Molekulargewicht MR =
68.000-72.000, wie zuvor für den
Humanbrustkarzinomlamininrezeptor berichtet worden war, der unter weniger genauen
Bedingungen isoliert wurde. Die Reinigungsprozedur führte zu
einer Rezeptorprotein-Ausbeute von etwa 20 ug/100 g Tumorgewebe
und 2 ug/100 g Plazentagewebe (etwa 0,02% des Proteins) in den
solubilisierten mikrosomalen Membranpräparationen)
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Die gereinigten Lamininrezeptor-Präparationen aus Brustkarzinom,
Kolonkarzinom und Plazenta wurden, Standardverfahren
folgend, jodiert und mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese
untersucht, um die Homogenität der Präparationen zu untersuchen.
Eine repräsentative Autoradiographie des Tumorlamininrezeptors
wird in Fig. 1B gezeigt. Der scheinbare pI des Lamininrezeptors
ist 6,4 ± 0,2. Obwohl Fig. 1B einen gezogenen Spot zeigt,
stimmen andere Gele bei verschiedenen pH-Bereichen und
Immunoblotting (wie durch Liotta et al. (1985) oben beschrieben)
mit einer einzigen Polypeptidkette überein.
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Die gereinigten Lamininrezeptor-Präparationen aus drei Quellen
wurden in Mikrotiter-Vertiefungen immobilisiert und mit einer
Vielzahl von Antikörpern umgesetzt, um zusätzlich die Reinheit
der Präparationen und den Mangel an Kontamination mit Laminin
oder Albumin zu zeigen. In allen Fällen reagierten
monoklonale IgM Maus-Antikörper gegen den Humanlamininrezeptor-
LR-1 (2H5), wohingegen Kaninchen-Antihumanalbumin und eine Klasse
dazu passender monoklonaler gegen α-Amylase gerichteter IgM
Maus-Antikörper nicht reagierten. Ein repräsentatives ELISA ist
in Fig. 2 gezeigt.
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2. Mikrosequenzanalyse von Bromcyan-Peptiden des Plazenta-
Lamininrezeptors - Wiederholte Versuche der direkten
Sequenzierung des intakten Lamininrezeptormoleküls waren nicht
erfolgreich, wahrscheinlich wegen der Blockierung des Aminoendes.
Deshalb wurde das Rezeptorprotein mit Bromcyan gespalten und die
erhaltenen Peptide mittels Umkehrphasen-HPLC fraktioniert. Die
Mikrosequenz-Analyse eines Placenta-Oligopeptids gab ein
Oktapeptid der Sequenz Met-Leu-Ala-Arg-Glu-Val-Leu-Arg. Eine
Computer gestützte Suche nach Homologien (Wilbur und Lipman,
Proc. Natl. Acad. Sci., 80 : 726-730 (1983)) ergab, daß das
Oktapeptid einzigartig war.
BEISPIEL II
Isolierung von Humanlemininrezeptor cDNA-Klonen
A. Materialien und Verfahren
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1. Zellkultur - Einschichtkulturen menschlicher
Endothelialzellen der Nabelschnur wurden gezogen wie durch Jaye
et al., Science, 228 : 882-885 (1985) beschrieben.
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2. Präparation der RNA - Die gesamte zelluläre RNA wurde aus
den Zellschichten in Kultur extrahiert nach dem
Guanidinisothiocyanat-Cäsiumchlorid-Dichteverfahren,
beschrieben durch Chirgwin et al., Biochemistry, 18 : 5294-5299
(1979). Poly(A)-enthaltende RNA wurde isoliert durch
Chromatographie über oligo(dT)-Zellulose (Typ 3, Collaborative
Research) entsprechend dem Verfahren von Aviv und Leder, Proc.
Natl. Acad. Sci., 69 : 1408-1412 (1972).
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3. Synthese der cDNA - Oligo(dt) - selektierte menschliche
endotheliale RNA wurde als Schablone zur Synthese der cDNA
nach dem Verfahren von Buell, et al., J. Biol. Chem.,
253 : 2471-2482 (1973) verwendet und doppelsträngige cDNA
hergestellt wie es durch Wickens et al., J. Biol. Chem. 253 : 2483-
2495 (1978) beschrieben ist. Die cDNA wurde mittels S1-Nuklease
wie durch Ullrich et al., Science, 196 : 1313-1319 (1977)
beschrieben, abgestumpft und anschließend mit dem Klenow-Fragment
von E. coli DNA Polymerase I, wie durch Wartell und Resnikoff,
Gene, 9 : 309-319 (1980) beschrieben, behandelt. Die cDNA wurde
dann mittels EcoRI-Methylase modifiziert, an EcoR1-Linkern
gebunden und intensiv mit EcoR1, wie durch Huynh et al., DNA
Clonin Volume 1:a practical approach, ed., D.M. Glover, IRL
Press Ltd. Oxford, England, pp. 49-78 (1985) beschrieben,
verdaut.
-
4. Bildung und Durchmusterung einer Humanendothelial- gt11
cDNA-Bibliothek - EcoRI-gebundene cDNA wurde mit EcoRI-verdautem
und phosphathasebehandeltem λgt11 verbunden, wie durch Huynh
(1985) oben beschrieben. Die rekombinierte Phase wurde gemäß
Enquist und Sternberg, Methods Enlzymol., 68 : 281-298 (1979)
verpackt und verstärkt in E.coli Y1088 (ATCC 37195) gemäß Huynh
(1985) oben. E. coli Y1090 (ATCC 3/19) Zellen wurden infiziert
mit der endothelialen Zell-λgt11-cDNA-Bibliothek und 1,5
Millionen Kolonien mittels Antikörpererkennung des
Lamininrezeptor-β-Galaktosidasefusionsproteins durchmustert gemäß
Young and Davis, Science, 222 : 778-782 (1983), unter Verwendung
des monoklonalen Antikörpers gegen den Lamininrezeptor 2H5
(Liotta et. al., Exp. Cell Res., 156 : 117-126 (1985). Dieser
Antikörper erkennt oder steht in Wechselwirkung mit dem Binden
der Liganden des Lamininrezeptors (Liotta, et al. (1985) oben und
Togo et al., Basement Membranes ed. Shibata, S., Elsevier, New
York pp. 325-333 (1985)). Das Binden der Antikörper wurde
detektiert unter Verwendung von peroxidasekonjugierten,
affinitätsgereinigten Hasen-Antimaus IgM, wie oben in Beispiel
1A4 beschrieben. Positive Kolonien wurden identifiziert,
verstärkt und wiederum durchmustert bis zu einer Reinheit wie sie
von Benton and Davis, Science, 196 : 180-182 beschrieben wurde.
Filterpapiere, die Kolonien enthielten, wurden umgesetzt mit
Kontrollantikörpern, einschließlich Antihuman-α-Amylase und
Antihuman-Albumin (wie oben in Beispiel 1A4 beschrieben) ebenso
wie Antiratten-Laminin (Albrechtsen et al., Cancer Res., 41 : 5076-
5081 (1981)
-
5. Southern Blot-Hybridisierung - Phagen DNA wurde gemäß
Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp 77-85
(1982) isoliert. Durch Restriktionsendonuklease verdaute DNA
wurde elektrophoretisch über Agarosegele getrennt, auf
Nitrocellulosepapier überführt und hybridisiert nach dem
Verfahren von Southern, Methods Enzymol., 68 : 152-176 (1979). ³²P-
markierte Proben wurden durch Nicktranslation gemäß Maniatis et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 72 : 1184-1188 (1975) hergestellt.
-
6. Subklonieren und Präparation von Plasmiden und einer cDNA-
Insertion - Die EcoRI-Stelle, welche die cDNA-Insertion an den
linken Arm des λ gt11 bindet, fehlte in allen sechs Klonen. Eine
PvuII-Stelle, 11 Basenpaare abwärts, wurde deshalb zur Reinigung
der cDNA-Insertion aus den größten rekombinierten Phagen ELR4
verwendet. Das EcoRI-PvuII-Restriktionsfragment von XELR4 wurde
subkloniert in die EcoRI-PvuII-Stellen von pBR322 zur Herstellung
von pLR4-1 und in die EcoRI-HindII-Polylinkerstellen von pUC8 zur
Herstellung von pLR4-2. Anschließend wurde zur Erleichterung der
cDNA-Sequenzierung fort vom langen Poly(A)Schwanz das EcoRI-PstI-
Restriktionsfragment von pLR4-1 in die EcoRI-PstI-Stellen von
pBR322 zur Herstellung von pLR4-4 subkloniert. Rekombinanten von
pBR322 wurden in E. coli C600r m (ATCC 33525) transformiert und
pUC-Rekombinanten wurden in E. coli JM 103 transformiert (Messing
et al., Nucleic Acids Res., 9 : 309-321 mittels des Calciumchlorid-
Verfahrens von Mandel und Higa, J. Mol. Biol., 53 : 159-162 (1970).
Überspiralisierte Plasmid-DNA wurde durch Alkalilyse nach
Dichtegradienten-Zentrifugation in Ethidiumbromid-Cäsiumchlorid
gemäß dem Verfahren von Birnboin und Doly, Nucleic Acids Res.,
7 : 1513-1523 (1979) gewonnen. Die cDNA-Insertionen wurden aus
verdauter DNA isoliert und von Acrylamidgelen gemäß Sobel et al.
Proc. Natl. Sci., 75 : 5846-5850 (1978) eluiert.
B. Ergebnisse
-
1. Auswahl der Lamininrezeptor cDNA durch Antikörpererkennung
Die gt11-cDNA Bibliothek menschlicher Endothelialzellen wurde
durchmustert unter Verwendung des monoklonalen
Antilamininrezeptor-Antikörpers 2H5. Wie bei den Materialien und Methoden, oben
beschrieben, erkennt dieser Antikörper (a) spezifisch den
Lamininrezeptor auf Immunoblots, (b) erkennt den gereinigten
Lamininrezeptor mittels ELISA (Fig. 2), (c) blockiert das Binden
von Laminin sowohl an Plasmamembranen oder Zellen und (d)
blockiert das Anheften von Zellen an die Amnionbasismembran.
Diese Eigenschaften zeigen deutlich, daß der monoklonale
Antikörper mit dem Laminin-Bindungsbereich des Lamininrezeptors
interagiert oder diesen erkennt. Sechs Kolonien wurden anfänglich
ausgesucht. Nach der Kolonienreinigung zeigten alle sechs
Phagenklone, die als ELR-6 bezeichnet wurden, eine heftige
Reaktion mit dem monoklonalen Antilamininrezeptor-Antikörper,
zeigten aber keine Reaktivität gegenüber einer gemischten Klasse
monoklonaler Antikörper (IgM), die gegen menschliche α-Amylase
gerichtet waren, noch gegenüber Antikörpern, die gegen Laminin
oder gegen in der Größe dem Lamininrezeptor vergleichbare
Proteine wie Albumin gerichtet waren (Fig. 3).
-
2. Gemeinsamer Bereich von λELR1-6 - Die
Restriktionsendonuklease-Verdauung von 6 Phagen λ ELR1-6, ergab,
daß die EcoRI-Seite, die das 3' Ende der cDNA-Insertion mit dem
linken Arm von gt11 verbindet, in allen sechs Phagen fehlte.
Einsträngige, doppelsträngige und dreisträngige Endonuklease-
Verdauungen unter Verwendung von SacI, KpI, HindIII und EcoRI
wurden zur Kartierung von λELR1-6 vorgenommen. Diese
Experimente, zusammengefaßt in Fig. 4, zeigen, daß (a) die Größe
der cDNA-Insertionen im Bereich von 450-975 Basenpaaren liegt,
(b) alle Klone eine interne SacI-Stelle etwa 450 bis 500
Basenpaare vom 3' Ende der Klone teilen, (c) die Insertion von
ELR6, die sich nur auf etwa 20 Basenpaare von 5' internen SacI-
Stelle erstreckt und (d) die Insertionen von λELR1 und λELR4,
die eine HindIII-Stelle etwa 30 bis 40 Basenpaare jeweils von der
5' EcoRI-Stelle teilen. Die sechs rekombinierten Phagen haben
somit eine gemeinsame Region im Bereich der Basenpaare 450-500,
die sich direkt vom 5, bis zur SacI-Stelle und weiter bis zum
3'Ende jeder cDNA-Insertion erstreckt, und schlagen vor, daß
diese Region für den Bereich kodiert, der durch den monoklonalen
Antikörper 2H5 erkannt wurde. Diese Beobachtung wurde überprüft
durch Southern-Blotexperimente, in denen KpnI-EcoRI- und KpnI-
SacI-Doppelverdauungen der DNA von jedem der sechs rekombinierten
Phagen streng mit einem aus λELR4 isolierten PstI-Sphi-
Restriktionsfragment hybridisiert wurden. Ein repräsentatives
Hybridisierexperiment zeigt in Fig. 4, daß die gemeinsame Region
im Bereich von 450 bis 500 Basenpaare aller sechs rekombinierten
Phagen den antigenen Bereich, der durch den monoklonalen
Antikörper 2H5 erkannt wird, kodiert.
BEISPIEL III
cDNA-Sequenzbestimmung
A. Materialien und Verfahren
-
1. DNA-Sequenzierung - cDNA von ELR4 wurde gemäß der in Fig. 5
gezeigten Verfahrensweise sequenziert. Beide Verfahren der
chemischen Modifizierung von Gilbert und Maxam, Proc. Natl. Acad.
Sci., 70 : 3581-3584 (1973) wurden verwendet. Im ersten Fall wurden
die cDNA-Restriktionsfragmente der Subklone pLR4-1, pLR4-2 und
pLR4-4, beschrieben in Beispiel IIA6, oben, markiert durch
Behandlung des 5' Endes mit T4-Polynukleotidkinase (Boehringer-
Mannheim) und (α-P³²)ATP nach Gilbert und Maxam (1973), oben oder
durch Anhängen an das 3' Ende von (P³²)-Didesoxy-ATP unter
Verwendung eines 3' Tailingkits (Amersham). Im Falle des
Didesoxy-Syntheseverfahrens wurde das EcoRI-SacI-Restriktions-
Fragment von ELR4 in M13mp18 und M13mp19 subkloniert (Yanisch-
Perran, et al., Gene, 33 : 103-119 (1981)).
B. Ergebnisse
-
1. Nukleotide und abgeleitete Aminosäuresequenz der cDNA-
Insertion von λELR4 - Die Sequenz der gesamten cDNA-Insertion
von ELR4 ergab eine Tafel mit 253 Aminosäuren, die mit dem
rechten Arm der EcoRI'-Insertionsstelle des λgt11 Vektor (Fig.
6) übereinstimmt. Die Sequenz ihres "gemeinsamen Bereichs", die
durch das 2H5-Epitop (siehe Beispiel II, B2 oben) erkannt
wurde, erstreckt sich vom Nukleotid 361 bis zum Nukleotid 765 in
Fig. 6. Es enthält die für ein Oktapeptid kodierende Sequenz
(Nukleotide 409-432), die identisch mit derjenigen ist, die für
das durch Bromcyanspaltung erzeugte Oligopeptid des Plazenta-
Lamininrezeptors von Beispiel I b2 oben, beschrieben ist.
Bemerkenswert in dieser Sequenz ist eine Wiederholung von sechs
Aminosäuren, die durch drei Aminosäuren zum Carboxy-Ende des
Lamininrezeptors begrenzt sind. Die cDNA-Sequenzen, die für die
wiederholt auftretenden Aminosäuren kodieren, sind nicht
identisch (Nukleotide 670-687 und 697-714). Einem Ochrestopkodon
folgend, schließt die ELR4-cDNA-Insertion einen
nichtranslatierten 3' Bereich von 66 Basenpaaren ein, der ein
kanonisches Polyadenylsignal AATAAA 17 Basenpaare aufwärts von
einem langen Poly(A)Schwanz enthält. Nach Abziehen der Länge des
nichttranslatierten 3' Bereichs und des Poly(A)Schwanzes kann die
größtmögliche Erstreckung des 2H5-Epitops, wie es durch den
gemeinsamen cDNA-Bereich von ELR1-6 definiert ist, auf 393
Basenpaare oder 131 Aminosäuren eingegrenzt werden. Die
Computeranalyse nach dem Verfahren von Wilbur und Lipman, Proc.
Natl. Acad. Sci, 80 : 726-730 (1983) zeigten keine signifikanten
Homologien zu bekannten Proteinsequenzen.
-
Es ist festzustellen, daß ein möglicher membranüberspannender
Bereich des Lamininrezeptors ein hydrophobes Polypeptid aus 11
Aminosäuren enthalten könnte, das durch die Nukleotide 52-84 der
Fig. 6 kodiert wird.
BEISPIEL IV
Antikörpererkennung des von der cDNA abgeleiteten
synthetischen Lamininrezeptorpeptids
A. Materialien und Verfahren
-
1. Herstellung des Antiserums - Der Lamininrezeptor wurde aus
einem menschlichen metastasierenden Brustkarzinom, wie in
Beispiel I A1, oben beschrieben, gereinigt. 20 ug des gereinigten
Lamininrezeptors wurden auf ein NaDodSO&sub4;-Polyacrylamidgel, wie in
Beispiel I AS, oben beschrieben,gegeben, in diesem
elekrotphoretisch aufgetrennt und aus dem Gel ausgeschnitten.
Kaninchen wurden mit dem Protein gemäß Albrechtsen et al., Cancer
Res., 41 : 5076-5081 (1981) immunisiert. Serum wurde vor den
Antigeninjektionen gesammelt (Präimmun Serum) und 10 Tage nach
jeder Auffrischungsinjektion.
-
2. ELISA - ELISAS wurden gemäß Beispiel I A4 oben vorgenommen
unter Verwendung des Präimmun- und Immunserums, das gemäß
Beispiel IV A1 oben erhalten worden ist.
-
3. Synthetisches Peptid RTLR2 - Ein synthetisches Peptid,
bezeichnet RTLR2, welches die Sequenz Pro-Thr-Glu-Asp-Trp-Ser-
Ala-Gln-Pro-Ala-Thr-Glu-Asp-Trp-Ser-Ala-Ala-Pro-Thr-Ala enthält,
wurde durch die Penninsula Laboratories Inc. (Blemont, CA)
entsprechend den einschlägigen Standardverfahren bereitgestellt.
Diese Sequenz wurde aus den Nukleotiden 667-726 in Fig. 6
ausgewählt.
B. Ergebnisse
-
1. Erkennung des synthetischen Peptids durch
Antilamininrezeptor-Antiserum - Die Nukleotidsequenz 667-726 (Fig. 6) der λELR4
cDNA wurde zur Vorhersage einer Peptidsequenz verwendet. Das
synthetische Peptid RTLR2 (Beispiel IV A3) wurde im ELISA durch
Kaninchen-Antiserum erkannt, das gegen den Tumorlamininrezeptor
aber nicht gegen das Präimmunserum (Fig. 7) gerichtet war. Diese
Peptide schließen zwei Wiederholungen von sechs Aminosäuren ein,
beschrieben in Beispiel III B2, und hatten eine vorhergesagte
reverse Umkehrkonfiguration.
VERGLEICHSBEISPIEL V
Hybridisierung des Lamininrezeptors cDNA mit RNA
A. Materialien und Verfahren
-
1. Zellinien - Die MCF-7 Humanbrustkrebszellinie (Eltern)
wurde durch die Michigan Cancer Foundation bereitgestellt. Zwei
Klone MCF-7 Zellinien, MCF7-5H& und MCF7-3E5 wurden von P. Horan
Hand (National Cancer Institute) erhalten und wurden beschrieben
durch Greiner et al., Int. J. Cancer, 36 : 159-166 (1985). Die ZR-
75 Humanbrustkarzinom-Zellinie ist durch Engel und Young, Cancer
Res., 38 : 4327-4339 (1978) beschrieben worden und wurde erhalten
von L. Engel (National Cancer Institute) und die
Humannierenkarzinom-Zellinie A-704 wurde von S. Aaronson
(National Cancer Institute) erhalten und ist beschrieben worden
durch Giard et al., J. Natl. Cancer Inst., 51 : 1417-1423 (1973).
Menschliche Panc-1 Zellinien wurde von der American Type Culture
Collection erhalten. Murine NIH-3T3-Zellen und ihre
kirstenvirustransformierten Abkömmlinge auf (KNIH) wurden von M. Gottesman
(National Cancer Institute) erhalten und ihr Wachstum wurde
beschrieben von Gottesman, Proc. Natl. Acad. Sci., 75 : 27657-2771
(1978). Murine F9 Teratokarzinomzellen und ihre durch
Dibutyrylcyclo-AMP und Retinsäure differenzierten Abkömmlinge
(Strickland et al., Cell, 21 : 347-355 (1980)) waren von W.
Anderson (National Cancer Institute). Die Ratten L2-Zellinie
wurde durch Wewer, Dev. Biol., 93 : 416-421 (1982) beschrieben.
-
2. Herstellung von RNA - RNA wurde aus Zellkulturen, wie in
Beispiel II A2 oben beschrieben, oder nach dem
Guanidinhydrochloridverfahren gemäß Strohman et al., Cell, 10 : 265-273
(1977) hergestellt.
-
3. Northern Hybridisierung - 5 ug Gesamtzell-RNA wurde auf
Methylquecksilber/Agarosegelen getrennt und auf
Diazobenzyloxymethylcellulosepapier (Schleicher und Schuell) nach
dem Verfahren von Alwin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74 : 5350-
5354 (1977), beschrieben von Sobel et al., Biochemistry, 20 : 2678-
2684 (1981), überführt. Die Filter wurden mit nicktranslatierten
cDNA-Insertionen, wie in Beispiel II AS oben beschrieben,
hybridisiert. Radioautographien zu verschiedenen Zeiten wurden
densitometrisch gemessen, um den linearen Antwortbereich zu
bestimmen. Die Blots wurden gegen eine Actin-cDNA-Probe
geprüft (beschrieben durch Cleveland et al., Cell, 20 : 95-
105 (1980) und gegen eine mit Wärme abgeschreckte cDNA-Sonde, um
gleiche Mengen transferierte RNA zu sichern, geprüft.
-
4. Laminin-Bindeversuche - Die Anzahl der Lamininrezeptoren je
Zelle in jeder Zellinie wurde aus Scatchard Plots von spezifisch
gebundenem (¹²&sup5;I)-markiertem Laminin von Zellen in der
logarithmischen Wachstumsphase berechnet, beschrieben durch
Liotta et al., Exp. Cell Res., 156 : 117-126 (1985).
B. Ergebnisse
-
1. Expression der Humanlamininrezeptor-mRNA - Es wurde zuvor
berichtet, daß die Menge und die Oberflächenverteilung von
Lamininrezeptoren in menschlichen Krebsgeweben unterschiedlich
ist (Horan Hand et al., Cancer Res., 45 : 2713-2719 (1985). Im
allgemeinen haben bösartige Gewebe mehr nichtbesetzte
Lamininrezeptoren auf ihren Zelloberflächen und binden mehr
Laminin als die gutartigen Varianten. Zur Bestimmung, ob die
Lamininrezeptor-mRNA Mengen eine Rolle spielen bei der Bestimmung
der Menge der Zelloberflächen-Lamininrezeptoren, die zum Binden
von Liganden verfügbar sind, wurde ein Northern Blot Experiment
durchgeführt (Fig. 8). Die Lamininrezeptor cDNA-Insertion
erkannte eine mRNA von etwa 1700 Basen, die ausreichend lang ist,
um für ein Protein mit der geschätzten Größe des Lamininrezeptors
zu kodieren. Die Menge hybridisierter RNA aus einer Vielzahl von
menschlichen Epithelial-Zellinien variierte. Insbesondere gab es
eine größere Hybridisierung mit der RNA aus der metastasierenden
Brustkarzinom-Zellinie MCF-7 als mit der RNA der
nichtmetastasierenden Brustkarzinom-Zellinie ZR-75. Im
allgemeinen korellieren die Spiegel hybridisierter RNA direkt mit
den Lamininbindetests (Fig. 9), was vorschlägt, daß die Menge der
für die Biosynthese von Rezeptor verfügbaren Lamininrezeptor-mRNA
eine geschwindigkeitsbegrenzende Kontrollstufe bei der Regulation
der zellulären Bindung der Basismembran an Laminin ist. Somit
kann die Bestimmung der Lamininrezeptor-mRNA-Spiegel im
menschlichen Tumorgewebe diagnostisch verwendet werden, um die
relative Aggressivität des Tumors oder Empfindlichkeit für
verschiedene Therapieformen, die auf dem Lamininrezeptorgehalt
basieren, vorherzusagen. Wie zuvor erwähnt wurde, kann dies
durch Northern Blot-Hybridisierung oder in situ-Hybridisierung
herausgeschnittenen Tumormaterials erfolgen unter Verwendung von
Lamininrezeptor-cDNA als Sonde. Lamininrezeptor-cDNA kann als
Sonde für die oben genannten Verfahren durch eine Vielzahl von
einschlägigen bekannten Standardtechniken hergestellt werden. Das
Nicktranslationsverfahren, welches in Beispiel II AS beschrieben
ist, kann verwendet werden, um die cDNA-Insertion mit (³²P),
(³&sup5;S), oder (³H) radioaktiv zu markieren. Alternativ kann die
Lamininrezeptor-cDNA-Insertion in Plasmide subkloniert werden,
die die Transkription von radiomarkierter RNA, beschrieben von
Melton et al., Nucleic Acids Res., 12 : 7035-7036 (1984), erlauben.
Biotinylierte umgesetzte RNA und DNA-Hybridisierungssonden in
Verbindung mit Farbdetektionssystemen wurden ebenfalls
beschrieben, beispielsweise durch Langer et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., 78 : 6633-6637 (1981) und durch Leary et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., 80 : 4045-4049 (1983).
-
2. Detektion der Lamininrezeptor-mRNA in anderen Spezies -
Northern Blots, die RNA aus L2-Zellen aus Ratten von Murinzellen
wie NIH 3T3 und F9 Teratokarzinom und ihren Derivaten enthielt,
ergaben auch eine mRNA von etwa 1700 Basen. Somit kann die
menschliche Lamininrezeptor-cDNA-Insertion mit RNA von anderen
Wirbeltierarten kreuzhybridisieren (Daten sind nicht gezeigt).
BEISPIEL VI
Synthetische Lamininrezeptorpeptide
A. Materialien und Verfahren
-
1. Synthetische Lamininrezeptorpeptide - Das synthetische
Peptid RTLR2-20 wurde aus den Nukleotiden 667-726 von Fig. 6
abgeleitet und ist beschrieben in Beispiel IV A3. Ein
Kontrollpeptid, in dem zuerst Prolin eliminiert und dann die
Threonin- und Glutamatreste jeweils durch Lysin und Leuzin
ersetzt wurden, wird als RTLR2-Kontrolle bezeichnet. Das
synthetische Peptid RTLR3 enthält die Sequenz Asn-Lys-Gly-Ala-
His-Ser-Val-Gly-Leu-Met-Trp-Trp-Met-Leu-Ala-Arg-GLu-Val-Leu-Arg
und wurde aus den Nukleotiden 373-432 in Fig. 6 abgeleitet. Die
Kontrollpeptide, die die vorhergesagten reversen Sequenzen nicht
enthielten, wurden ebenfalls synthetisiert. Das Kontrollpeptid
RTC1 enthält die Sequenz Ser-Ser-Gln-Asn-Ser-Ser-Gly-Ser-Glu-Ala-
Ser-Glu-Thr-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Lys-Ser-Gly. Das Kontrollpeptid
RTC2 enthält die Sequenz Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-His-Gly-Lys-Arg. Das
Kontrollpeptid RTC3 enthält die Sequenz Leu-Met-Trp-Trp-Met-Leu-
Ala-Arg (abgeleitet aus den Nukleotiden 397-420 in Fig. 6). Alle
synthetischen Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt,
wie im Beispiel I A3 beschrieben, und wurden durch die Penninsula
Laboratories, Inc. (Belmont CA) entsprechend den bekannten
einschlägigen Standardverfahren geliefert.
-
Selbstverständlich kann der erfindungsgemäße Klon verwendet
werden, um das Peptid oder die Peptide entsprechend den
einschlägigen Standardtechniken zu synthetisieren. Die ELR1-6
Klone wurden ausgewählt durch ihre Fähigkeit, hybride
β-Galaktosidase-Lamininrezeptorpeptide zu exprimieren.
-
Die cDNA-Insertionen oder Fragmente davon können in anderen
Vektoren subkloniert werden, um andere Fusionsproteine und
Nichtfusionsproteine zu bilden, wie beispielsweise zusammengefaßt
durch Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, S.
404-430 (1982).
-
2. Bindestudien - Die Fähigkeit der menschlichen Melanomzellen
A2058, bereitgestellt durch G. Todaro, National Cancer Institute,
spezifisch an Laminin in Gegenwart der synthetischen
Lamininpeptide zu binden wurde untersucht, wie in Beispiel V A4
beschrieben.
-
Synthetische Peptide RTLR2 und RTLR3 ebenso wie die
Kontrollpeptide wurden auf einem festen Träger durch Inkubieren
mit p-Nitrophenylester-Glaskügelchen gebunden nach dem Verfahren
von Brown et al., Biochemistry, 18 : 4901-4906 (1979). Die
Kügelchen wurden erhalten von A. Day (Medical College of
Virginia). Die Peptide wurden dann mit (I¹²&sup5;)-Laminin inkubiert
und die Menge von gebundenem (I¹²&sup5;)-Laminin bestimmt.
-
3. Metastaseversuche - Metastasierende BL6-
Murinmelanomzellen wurden von Dr. I. Hart, Frederick Cancer
Research Center, Frederick MD erhalten. Frisch trypsinisierte
Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen des synthetischen
Peptids RTLR2 (oben beschrieben) vermischt und etwa 5·10&sup4; Zellen
intravenös (i.v.) in ein Volumen von 0,1 je Nacktmaus nach dem
Verfahren von Liotta et al., Nature, 284 : 682-688 (1980)
injiziert. In jeder Gruppe waren 10 Mäuse. Die Tiere wurden nach
dreieinhalb Wochen getötet und die Anzahl von Metastasen
bestimmt. Die synthetischen Kontrollpeptide wie RTC1 mit gleicher
Änderung der Hydrophobizität hatte keinen Wirkung auf die Anzahl
der Metastasen.
B. Ergebnisse
-
1. Bindungsstudien - Synthetische Peptide wurden auf der Basis
der cDNA-Sequenz (Fig. 6) hergestellt und wurden zur Untersuchung
der Lamininrezeptor-Liganden-Bindungsmechanismen verwendet. Die
Gegenwart des synthetischen Peptids RTLR2, nicht jedoch die
Kontrolle (RTLR2-Kontrolle), hemmt die Fähigkeit menschlicher
A2058 Melanomazellen, Laminin zu binden (Fig. 10). Das schlägt
vor, daß wenigstens ein Bindungsbereich des Rezeptors für seine
Liganden innerhalb der RTLR2-Sequenz vorhanden ist. Ferner, wenn
eine Vielzahl synthetischer Peptide mit (I¹²&sup5;)-Laminin inkubiert
worden war und die Menge der markierten Liganden, die zur
Bindung befähigt war, gemessen wurde, zeigte das RTLR2-Peptid
mehr Bindeaktivität als RTLR3 oder drei andere Kontrollpeptide
(Fig. 11). Solche Studien zeigen, daß von der cDNA abgeleitete
Lamininrezeptorpeptide verwendet werden können, um spezifische
Bereiche im Lamininrezeptor, die in verschiedene biologische
Funktionen involviert sind, zu bestimmen.
-
2. Metastase - Die synthetischen aus der cDNA-Sequenz
erzeugten Peptide können zur Hemmung von Krebsmetastasen
verwendet werden. Die Anzahl der Metastasen von BL6-
Melanomzellen wurde vermindert, wenn das synthetische RTLR2-
Fragment mit den Zellen gemeinsam in eine Maus injiziert wurde
(Tabelle 1). Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird
postuliert, daß die synthetischen Lamininrezeptor-Fragmente mit
den Zellen zum sofortigen Binden an den Basismembranen
kompetitieren und so Metastasen von der Koloniebildung abhalten.
Solche Ergebnisse zeigen, daß synthetische aus cDNA-erzeugte
Lamininrezeptor-Fragmente nützlich zur Hemmung von Metastasen
bei der Krebsbehandlung sind.
TABELLE 1
Fähigkeit des synthetischen Lamininrezeptorpeptids
zur Hemmung von BL6-Melanommetastasen
Menge des injizierten Peptids
-
0
-
0,01 ug
-
0,1 ug
-
1,0 ug
-
10,0 ug
Mittelwert # Metastasen
-
41,3 ± 10,9
-
31,0 ± 14,4
-
31,8 ± 14,0
-
29,4 ± 10,8
-
7,9 ± 6,7 (Mann-
Whitney U Test p(0.001)
-
5 · 10&sup4; BL6-Melanomzellen wurden mit verschiedenen
Konzentrationen synthetischen RTLR2 Lamininrezeptorpeptiden
vermischt und i.v. in einem Volumen von 0,1 ml in jede Nacktmaus
(10 Mäuse pro Gruppe) injiziert. Die Tiere wurden nach
dreieinhalb Wochen getötet und die Anzahl der Metastasen in den
Lungen bestimmt.